CN106727706A - 一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：取脂肪组织清洗并剪碎，进行消化处理；离心得到脂肪干细胞；将分离的脂肪干细胞加入培养基中重悬后进行分离培养；脂肪干细胞原代培养后进行体外扩增培养；制备明胶水凝胶，并将体外扩增的脂肪干细胞接种于水凝胶中；取新鲜血液离心后得到富血小板血浆，加入包埋干细胞的水凝胶和生理盐水制备细胞制剂。本发明通过对脂肪干细胞体外扩增培养，并将培养后的干细胞接种于水凝胶支架材料上，同时加入富血小板血浆制备细胞制剂，明胶水凝胶作为一种理想的细胞传递介质，可以直接将细胞注射到病变组织，同时富血小板血浆可释放多种生长因子，有效促进创面愈合。

Description

一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别是涉及一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法。
背景技术
皮肤是人体最大的器官，具有保护体内各组织器官免受物理、化学、病原微生物侵袭的能力，是人体内、外环境之间的屏障和分界；临床上常见的大面积烧伤、创伤、肿瘤切除手术等均可以破坏皮肤的完整性，导致皮肤及其软组织缺损。临床上治疗皮肤软组织缺损创面，往往需要取自体皮肤移植或进行局部皮瓣转移手术进行修复；大面积皮肤缺损的患者，由于其自身皮源严重不足，创面的治疗十分困难，因此，寻找促进创面愈合的新方法已成为整形外科医生追逐的热点。
与胚胎干细胞相比，成体干细胞多来自于自体的成熟组织，在临床应用方面不存在伦理学问题，而且，由成体干细胞诱导所得的细胞、组织不存在配型及免疫排斥反应等相关问题，可成为细胞疗法理想的种子细胞。脂肪干细胞是研究较为透彻的成体干细胞，它在体内外均有较强的增殖及自我更新能力，在特殊诱导培养条件下或体内特定环境中表现出其跨越胚层界限的分化能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，通过以明胶水凝胶作为支架材料搭载脂肪干细胞，并加入富血小板血浆支撑细胞制剂，有效修复皮肤损伤。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
S1、取脂肪组织清洗并剪碎，进行消化处理；
S2、取消化后的脂肪组织离心得到脂肪干细胞；
S3、将分离的脂肪干细胞加入培养基中重悬后进行分离培养；
S4、脂肪干细胞原代培养7-9d后进行体外扩增培养；
S5、制备明胶水凝胶，并将体外扩增的脂肪干细胞接种于水凝胶中；
S6、取新鲜血液离心后得到富血小板血浆，加入包埋干细胞的水凝胶和生理盐水制备细胞制剂。
进一步地，S1中所述消化处理的步骤为：将剪碎后的脂肪组织加入至消化液中，置于37℃恒温水浴箱中消化40-60min，消化结束后加入与消化液等体积的高糖DMEM终止消化。
进一步地，所述消化液为0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的胶原酶液以体积比1：1混合，所述高糖DMEM中含有体积分数为10％的胎牛血清。
进一步地，S3中所述分离培养的步骤为：将S2中离心后的脂肪干细胞加入培养基中重悬，以2x106个/L的密度接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每2d换液一次。
进一步地，所述培养基为高糖DMEM培养基，其中含有体积分数为10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素。
进一步地，S4中所述体外扩增培养的步骤为：S3中干细胞培养7-9d后，接种于新的培养瓶中进行体外扩增培养培养，扩增比例为1：3。
进一步地，S5中所述制备明胶水凝胶的步骤为：称取明胶粉末溶解于磷酸缓冲溶液中配置成5％-6％的明胶溶液，将明胶溶液滴入六孔培养板中，每孔2mL，置于恒温培养箱中凝固1-2h。
进一步地，S5中所述接种步骤为：取S4中体外扩增培养的脂肪干细胞以1x106个/mL接种于明胶水凝胶中，置于恒温培养箱中培养68-72h，得到包埋干细胞的水凝胶。
进一步地，S6中所述制备细胞制剂的具体步骤为：将富血小板血浆与生理盐水混合后加入S5中得到的包埋干细胞的水凝胶配制成细胞制剂，其中，所述包埋干细胞的水凝胶浓度为2x106个/mL，富血小板血浆的体积分数为10％。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过对脂肪干细胞体外扩增培养，并将培养后的干细胞接种于水凝胶支架材料上，同时加入富血小板血浆制备细胞制剂，明胶水凝胶作为一种理想的细胞传递介质，可以直接将细胞注射到病变组织，同时富血小板血浆可释放多种生长因子，有效促进创面愈合。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
具体实施方式
本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明为一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，该方法具体步骤如下：
实施例1
S1、取脂肪组织用磷酸缓冲溶液清洗后进行消化处理；
具体的，取脂肪组织用磷酸缓冲溶液清洗2次，剪碎至体积为0.1cm3；
将剪碎后的脂肪组织加入至消化液中，置于37℃恒温水浴箱中消化40min，所述消化液为0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的胶原酶液以体积比1：1混合，消化结束后加入与消化液等体积的高糖DMEM终止消化，所述高糖DMEM中含有体积分数为10％的胎牛血清；
S2、取消化后的脂肪组织离心得到脂肪干细胞；
具体的，将S1中消化后的脂肪组织碎片以1000r/min离心10min，取下层沉淀得到脂肪干细胞；
较优的，将离心后的脂肪干细胞加入红细胞裂解液中静置10min去除残留的红细胞，1000r/min离心10min取下层沉淀；
S3、将分离的脂肪干细胞加入培养基重悬后进行分离培养；
具体的，将S2中离心后的脂肪干细胞加入培养基中重悬，以2x106L-1的密度接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每2d换液一次；
所述培养基为高糖DMEM培养基，其中含有体积分数为10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素；
S4、脂肪干细胞原代培养7d后进行体外扩增培养；
具体的，S3中干细胞培养7d后，接种于新的培养瓶中进行体外扩增培养培养，扩增比例为1：3；
较优的，原代培养后的干细胞加入0.25％胰酶液进行消化处理，所述0.25％胰酶液中含有0.1％的EDTA；
S5、制备明胶水凝胶，并将体外扩增的脂肪干细胞接种于水凝胶中；
具体的，称取明胶粉末溶解于磷酸缓冲溶液中配置成5％的明胶溶液，将明胶溶液滴入六孔培养板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2浓度的恒温培养箱中凝固1h；
取S4中体外扩增培养的脂肪干细胞以1x106个/mL接种于明胶水凝胶中，置于37℃，5％CO2浓度的恒温培养箱中培养68h，得到包埋干细胞的水凝胶；
S6、取新鲜血液离心后得到富血小板血浆，加入包埋干细胞的水凝胶和生理盐水制备细胞制剂；
具体的，取人体新鲜血液加入柠檬酸钠0.1mol/L，将该血液置于低温离心机中以1500r/min离心10min，收集上层液即为富血小板血浆；
较优的，于富血小板血浆中加入质量分数为10％的凝血酶，置于20℃水浴中震荡5min；
将所述富血小板血浆与生理盐水混合后加入S5中得到的包埋干细胞的水凝胶配制成细胞制剂，其中，所述包埋干细胞的水凝胶浓度为2x106个/mL，富血小板血浆的体积分数为10％。
实施例2
S1、取脂肪组织用磷酸缓冲溶液清洗后进行消化处理；
具体的，取脂肪组织用磷酸缓冲溶液清洗3次，剪碎至体积为0.15cm3；
将剪碎后的脂肪组织加入至消化液中，置于37℃恒温水浴箱中消化60min，所述消化液为0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的胶原酶液以体积比1：1混合，消化结束后加入与消化液等体积的高糖DMEM终止消化，所述高糖DMEM中含有体积分数为10％的胎牛血清；
S2、取消化后的脂肪组织离心得到脂肪干细胞；
具体的，将S1中消化后的脂肪组织碎片以1500r/min离心10min，取下层沉淀得到脂肪干细胞；
较优的，将离心后的脂肪干细胞加入红细胞裂解液中静置15min去除残留的红细胞，1500r/min离心10min取下层沉淀；
S3、将分离的脂肪干细胞加入培养基重悬后进行分离培养；
具体的，将S2中离心后的脂肪干细胞加入培养基中重悬，以2x106L-1的密度接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每2d换液一次；
所述培养基为高糖DMEM培养基，其中含有体积分数为10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素；
S4、脂肪干细胞原代培养9d后进行体外扩增培养；
具体的，S3中干细胞培养9d后，接种于新的培养瓶中进行体外扩增培养培养，扩增比例为1：3；
较优的，原代培养后的干细胞加入0.25％胰酶液进行消化处理，所述0.25％胰酶液中含有0.1％的EDTA；
S5、制备明胶水凝胶，并将体外扩增的脂肪干细胞接种于水凝胶中；
具体的，称取明胶粉末溶解于磷酸缓冲溶液中配置成6％的明胶溶液，将明胶溶液滴入六孔培养板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2浓度的恒温培养箱中凝固2h；
取S4中体外扩增培养的脂肪干细胞以1x106个/mL接种于明胶水凝胶中，置于37℃，5％CO2浓度的恒温培养箱中培养72h，得到包埋干细胞的水凝胶；
S6、取新鲜血液离心后得到富血小板血浆，加入包埋干细胞的水凝胶和生理盐水制备细胞制剂；
具体的，取人体新鲜血液加入柠檬酸钠0.1mol/L，将该血液置于低温离心机中以1500r/min离心10min，收集上层液即为富血小板血浆；
较优的，于富血小板血浆中加入质量分数为10％的凝血酶，置于20℃水浴中震荡10min；
将所述富血小板血浆与生理盐水混合后加入S5中得到的包埋干细胞的水凝胶配制成细胞制剂，其中，所述包埋干细胞的水凝胶浓度为2x106个/mL，富血小板血浆的体积分数为10％。
实施例3
S1、取脂肪组织用磷酸缓冲溶液清洗后进行消化处理；
具体的，取脂肪组织用磷酸缓冲溶液清洗3次，剪碎至体积为0.12cm3；
将剪碎后的脂肪组织加入至消化液中，置于37℃恒温水浴箱中消化50min，所述消化液为0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的胶原酶液以体积比1：1混合，消化结束后加入与消化液等体积的高糖DMEM终止消化，所述高糖DMEM中含有体积分数为10％的胎牛血清；
S2、取消化后的脂肪组织离心得到脂肪干细胞；
具体的，将S1中消化后的脂肪组织碎片以1200r/min离心10min，取下层沉淀得到脂肪干细胞；
较优的，将离心后的脂肪干细胞加入红细胞裂解液中静置12min去除残留的红细胞，1300r/min离心10min取下层沉淀；
S3、将分离的脂肪干细胞加入培养基重悬后进行分离培养；
具体的，将S2中离心后的脂肪干细胞加入培养基中重悬，以2x106L-1的密度接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每2d换液一次；
所述培养基为高糖DMEM培养基，其中含有体积分数为10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素；
S4、脂肪干细胞原代培养8d后进行体外扩增培养；
具体的，S3中干细胞培养8d后，接种于新的培养瓶中进行体外扩增培养，扩增比例为1：3；
较优的，原代培养后的干细胞加入0.25％胰酶液进行消化处理，所述0.25％胰酶液中含有0.1％的EDTA；
S5、制备明胶水凝胶，并将体外扩增的脂肪干细胞接种于水凝胶中；
具体的，称取明胶粉末溶解于磷酸缓冲溶液中配置成5.5％的明胶溶液，将明胶溶液滴入六孔培养板中，每孔2mL，置于37℃，5％CO2浓度的恒温培养箱中凝固1.5h；
取S4中体外扩增培养的脂肪干细胞以1x106个/mL接种于明胶水凝胶中，置于37℃，5％CO2浓度的恒温培养箱中培养70h，得到包埋干细胞的水凝胶；
S6、取新鲜血液离心后得到富血小板血浆，加入包埋干细胞的水凝胶和生理盐水制备细胞制剂；
具体的，取人体新鲜血液加入柠檬酸钠0.1mol/L，将该血液置于低温离心机中以1500r/min离心10min，收集上层液即为富血小板血浆；
较优的，于富血小板血浆中加入质量分数为10％的凝血酶，置于20℃水浴中震荡7min；
将所述富血小板血浆与生理盐水混合后加入S5中得到的包埋干细胞的水凝胶配制成细胞制剂，其中，所述包埋干细胞的水凝胶浓度为2x106个/mL，富血小板血浆的体积分数为10％。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
S1、取脂肪组织清洗并剪碎，进行消化处理；
S2、取消化后的脂肪组织离心得到脂肪干细胞；
S3、将分离的脂肪干细胞加入培养基中重悬后进行分离培养；
S4、脂肪干细胞原代培养7-9d后进行体外扩增培养；
S5、制备明胶水凝胶，并将体外扩增的脂肪干细胞接种于水凝胶中得到包埋干细胞的水凝胶；
S6、取新鲜血液离心后得到富血小板血浆，加入包埋干细胞的水凝胶和生理盐水制备细胞制剂。
2.根据权利要求1所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：S1中所述消化处理的步骤为，将剪碎后的脂肪组织加入至消化液中，置于37℃恒温水浴箱中消化40-60min，消化结束后加入与消化液等体积的高糖DMEM终止消化。
3.根据权利要求2所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述消化液为0.25％的胰蛋白酶液和0.1％的胶原酶液以体积比1：1混合，所述高糖DMEM中含有体积分数为10％的胎牛血清。
4.根据权利要求1所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：S3中所述分离培养的步骤为，将S2中离心后的脂肪干细胞加入培养基中重悬，以2x106个/L的密度接种于培养瓶中，置于37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中培养，24h后第一次换液，之后每2d换液一次。
5.根据权利要求4所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述培养基为高糖DMEM培养基，其中含有体积分数为10％的胎牛血清、100U/mL青霉素及100U/mL链霉素。
6.根据权利要求1所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：S4中所述体外扩增培养的步骤为，S3中干细胞培养7-9d后，接种于新的培养瓶中进行体外扩增培养，扩增比例为1：3。
7.根据权利要求1所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：S5中所述制备明胶水凝胶的步骤为，称取明胶粉末溶解于磷酸缓冲溶液中配置成5％-6％的明胶溶液，将明胶溶液滴入六孔培养板中，每孔2mL，置于恒温培养箱中凝固1-2h。
8.根据权利要求1所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：S5中所述接种步骤为，取S4中体外扩增培养的脂肪干细胞以1x106个/mL接种于明胶水凝胶中，置于恒温培养箱中培养68-72h，得到包埋干细胞的水凝胶。
9.根据权利要求1所述的一种用于皮肤损伤修复的细胞制剂的制备方法，其特征在于：S6中所述制备细胞制剂的具体步骤为，将富血小板血浆与生理盐水混合后加入S5中得到的包埋干细胞的水凝胶配制成细胞制剂，其中，所述包埋干细胞的水凝胶浓度为2x106个/mL，富血小板血浆的体积分数为10％。
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