CN107754002A - 一种具有干细胞活性的生物材料制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有干细胞活性的生物材料制备方法，涉及生物再生技术领域，本发明提供的生物薄膜的制备方法，包括在干细胞进行培养的过程中加入血浆，继续培养20‑30小时后，得到生物薄膜。本发明提供的生物薄膜的制备方法，采用纯生物细胞技术方法制备，所用原料种类少、易获取，且操作简单易行，普适性强。本发明提供的生物薄膜，应用本发明提供的制备方法制备得到，该生物薄膜能够覆于创面，不产生过敏反应，且无毒、无菌，同时具有消炎作用，能够促进凝血和伤口愈合。

Description

一种具有干细胞活性的生物材料制备方法

技术领域

本发明涉及生物再生技术领域，尤其是涉及一种具有干细胞活性的生物材料制备方法。

背景技术

日常生活和工作中，皮肤常会在外界致伤因子(如外科手术、外力、热、电流、化学物质、低温)以及机体内在因素(如局部血液供应障碍等)的作用下受到损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能受损。造成组织缺失后，局部组织通过再生、修复、重建等创面愈合过程进行修补。

创面愈合是指通过最大程度上复原受损身体组织封闭创面的身体内生过程。这是一种在受伤仅几分钟后就已经开始的自然生物过程，如可通过酶组织化学方法确定。血小板到达受伤区域并尝试封闭创面。在有些情况下通过渗出物(分泌流体)结痂，其通常引起伴随创面愈合的发痒。

创面愈合分为不同的阶段，在创面愈合的过程中会出现肉芽组织的增生以及瘢痕组织的形成，且过程中还会有致病微生物的存在，使皮肤出现感染，创面难以愈合，一旦创面愈合不良会给患者造成较大的伤害。

现代西医外科学对手术造成的创伤伤口的处理方法是，对伤口灭菌、消毒，应用抗生素防止感染，缝合伤口后用医用纱布包扎的方法。缝合具有闭合伤口，促进止血及组织愈合作用，是现代外科最基本的技术，因此手工缝合是目前应用最广泛的方法。另外，现代外科不在伤口上用药，伤口的愈合是靠机体自身的组织来修复的。一般在术后2-3天，患者更换一次敷料，目的是为观察和清洁伤口。由此可见，西医对于术后伤口的愈合完全依靠患者本身的组织修复能力，伤口愈合缓慢，且增加了患者感染的风险。

目前，市场上已经存在用于促进上皮愈合的医用生物薄膜，例如，将一定量的甲壳胺溶液，明胶溶液、聚氧乙烯水溶液、甘油充分混合成凝胶浆作为基质，再加入一定量的中药薄黄药汁或抗菌类药物，在无菌室铺展于平板上，经自然干燥等程序的制备方法制备成的乳黄色薄膜成乳白色薄膜。但该生物薄膜原料复杂，使用过程中容易产生过敏反应等副作用。

因此，开发一种制备方法简单易行，能够覆于创面，不产生过敏反应，且无毒、无菌，同时具有消炎作用，能够促进伤口愈合的生物薄膜尤为重要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种生物薄膜的制备方法，以缓解现有技术中存在的生物薄膜的制备方法中原料复杂，且制备过程繁琐的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供一种应用上述制备方法制备得到的生物薄膜，以缓解现有技术中存在的生物薄膜容易引起过敏反应的技术问题。

本发明的第三个目的在于提供上述的生物薄膜在促进凝血或促进伤口愈合中的应用。

本发明提供了一种生物薄膜的制备方法，所述制备方法包括：

将干细胞置于培养基中进行培养，在所述干细胞密度达到70-85％时，向所述培养基中加入血浆，继续培养20-30小时后，得到所述生物薄膜；

其中，所述血浆与所述培养基的体积比为1:2-1:6。

进一步地，所述干细胞为间充质干细胞。

进一步地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

进一步地，所述血浆为新鲜血浆。

进一步地，所述新鲜血浆为新鲜脐血浆。

进一步地，所述血浆与所述培养基的体积比为1:3-1:5。

进一步地，所述血浆与所述培养基的体积比为1:4。

进一步地，将所述干细胞置于培养基中进行培养至P4代。

本发明还提供了一种生物薄膜，应用上述的制备方法制备得到。

另外，本发明还提供了上述的生物薄膜在促进凝血或促进伤口愈合中的应用。

本发明提供的生物薄膜的制备方法，包括在干细胞进行培养的过程中加入血浆，继续培养20-30小时后，得到生物薄膜。本发明提供的生物薄膜的制备方法，采用纯生物细胞技术方法制备，所用原料种类少、易获取，且操作简单易行，普适性强。本发明提供的生物薄膜，应用本发明提供的制备方法制备得到，该生物薄膜能够覆于创面，不产生过敏反应，且无毒、无菌，同时具有消炎作用，能够促进凝血和伤口愈合。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2提供的间充质干细胞形态图；

图2为本发明实施例2提供的成骨诱导条件下P4代间充质干细胞茜素红染色结果图；

图3为本发明实施例2提供的成脂诱导条件下P4代间充质干细胞油红O染色结果图；

图4为本发明实施例4-1提供的生物薄膜的外观图；

图5为本发明实施例4-1提供的生物薄膜的显微镜下结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种生物薄膜的制备方法，包括：

将干细胞置于培养基中进行培养，在干细胞密度达到70-85％时，向培养基中加入血浆，继续培养20-30小时后，得到生物薄膜；

其中，加入血浆与培养基的体积比为1:2-1:6。

本发明提供的生物薄膜的制备方法，采用纯生物细胞技术方法制备，在干细胞培养的过程中加入血浆，加入血浆与培养基的体积比为1:2-1:6，血浆中含有纤维蛋白原，纤维蛋白原会在凝血酶的作用下形成不溶于水的纤维蛋白，纤维蛋白会发生交联反应，而形成不溶的稳定的纤维蛋白薄膜。同时在交联反应过程中纤维蛋白薄膜会与干细胞形成复合物，从而制备出可以用于组织修复的干细胞生物基质薄膜。

本发明提供的生物薄膜的制备方法，具有所用原料种类少、易获取，且操作简单易行，普适性强的优点。

在一个优选的实施方式中，干细胞密度例如可以为，但不限于70％、75％、80％或85％。

在一个更优选的实施方式中，干细胞密度为80％。

在一个优选的实施方式中，血浆与培养基的体积比例如可以为，但不限于1:2、1:3、1:4、1:5或1:6。

在一个更优选的实施方式中，加入的血浆与培养基的体积比为1:4。

继续培养的时间例如可以为，但不限于20小时、22小时、24小时、26小时、28小时或30小时。

在一个优选的实施方式中，继续培养的时间为24小时。

在一个优选的实施方式中，干细胞为间充质干细胞。

在一个更优选的实施方式中，间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

在一个优选的实施方式中，血浆为新鲜血浆。

新鲜血浆为制备时间不超过3小时的血浆。

在一个更优选的实施方式中，新鲜血浆为新鲜脐血浆。

在一个优选的实施方式中，将干细胞置于培养基中进行培养至P4代。

P4代干细胞的生物学性状稳定，细胞活性好，增殖能力强，应用P4代的干细胞制备干细胞生物基质薄膜，在创面修复的应用中能够更快地促进凝血并且促进伤口愈合。

本发明还提供了一种生物薄膜，应用上述的制备方法制备得到。

本发明提供的生物薄膜能够覆于创面，不产生过敏反应，且无毒、无菌，同时具有消炎作用，能够促进凝血和伤口愈合。

另外，本发明还提供了上述的生物薄膜在促进凝血或促进伤口愈合中的应用。

应用本发明提供的生物薄膜辅助创面愈合，能够促进凝血和伤口愈合，同时，本发明提供的生物薄膜所具有的消炎作用也能够减少患者感染的风险。

为了有助于更清楚的理解本发明，下面将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。

实施例1间充质干细胞的体外分离和培养

从健康人的脐带组织中提取间充质干细胞，获取的间充质干细胞进行体外培养、扩增。原代细胞收集后按1：3的比例进行传代培养，当细胞铺满瓶底约80％密度时，利用胰酶进行消化、收集，按相同的比例进行传代，最多传代培养至第4代，收集第4代的细胞，此时收集的细胞生物学性状稳定，细胞活性好，增殖能力强。具体过程如下：

1)采取健康人的脐带；

2)去掉脐带里的血管和外层羊膜，留取沃顿胶质；

3)将脐带组织剪切成1-2cm²的小块；

4)将剪切后的小块接种在加有FASGROW无血清培养基的T25的培养瓶中，置于37摄氏度，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中培养；

5)经过7天后，细胞换液，3-4天后细胞可以传代；

6)利用0.25％的胰酶进行消化，收集细胞，接种在T75的培养瓶中，传代培养；

7)当细胞铺满瓶底约80％密度时，利用0.25％的胰酶进行消化，收集第1代细胞，按照1：3的比例进行传代，置于37摄氏度，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中培养；

8)若需传代重复第7步骤即可；

9)收集第3代的间充质干细胞，利用流式细胞仪进行细胞表面标志的测定，分析其细胞纯度。

实施例2间充质干细胞的鉴定及分化潜能的检测

鉴定方法：

a)间充质干细胞的形态学分析及细胞计数：将培养至第3代的细胞，在倒置显微镜观察细胞状态，并拍照。取微量细胞悬液，计数细胞数量。

b)流式细胞仪的表型测定：取3代细胞，经0.25％胰蛋白酶消化收集后，生理盐水离心洗涤2次。同型对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE，检测管分别加入鼠抗人CD₁₀₅-PE、CD₉₀-FITC、CD₇₃-PE、CD₄₅-FITC、CD₃₄-PE HLA-DR-PE 5μl。室温避光孵育30min，流式细胞仪检测。

鉴定结果及细胞活性分析：

倒置显微镜下观察第3代间充质干细胞细胞形态较单一，长梭形细胞多见，少量的星形细胞，圆形细胞极少。细胞低密度时长成扁平单层细胞，细胞生长密度增加时，细胞形态变得细长，形态类似成纤维细胞，呈平行排列生长或旋涡状生长，结果如图1所示。经流式细胞仪检测显示，细胞表面抗原CD₁₀₅、CD₉₀、CD₇₃阳性表达率达到90％以上，CD₄₅、CD₃₄、HLA-DR成阴性表达，结果如下表1所示。

表1间充质干细胞表面标志物表达阳性率(％)

Mean±SD，n＝6

间充质干细胞具有分化成骨、软骨、脂肪细胞的能力。

成骨细胞诱导分化及鉴定

将P4的细胞以1x10³/cm²的密度接种于预置有盖玻片的6孔板中，待细胞生长达到70％融合后，培养液改为成骨诱导培养液，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化，每三天更换1次新培养液。培养至第21d，取出盖玻片，进行茜素红染色。

茜素红染色

将取出的盖玻片用PBS冲洗2次后，用95％乙醇固定10min，0.1％茜素红37℃染色30min，弃去染料，蒸馏水充分冲洗，中性树脂封片。倒置显微镜下观察并摄相记录。

茜素红染色结果显示(如图2所示)，在成骨诱导的条件下，P4代间充质干细胞呈阳性，细胞被染成橙红色，表明有矿化结节的形成；对照组着色很浅。

脂肪细胞诱导分化及鉴定

将P4代的间充质干细胞以1x10³/cm²的密度接种于预置有盖玻片的6孔板中，待细胞生长达到70％融合后，培养液改为成脂肪诱导培养液，每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化，每三天更换1次新培养液。培养至第21d时，将盖玻片取出，进行油红O染色。

油红O染色

将成脂肪诱导液诱导21d后的盖玻片取出，用PBS洗涤3次，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤2次，蒸馏水洗涤1次，60％异丙醇1min，将玻片浸入过滤后的油红O染色液中，封口膜密封，避光染色30min，再用60％异丙醇分色至背景清晰，蒸馏水轻轻冲洗，中性树脂封片，摄相记录。

油红O染色结果显示(如图3所示)，在成脂诱导的条件下，P4代间充质干细胞均呈阳性，细胞的胞浆内出现亮红色的颗粒，表明胞浆内容物为脂肪滴；对照组未着色。

综上所述，本发明实施例1制备出的间充质干细胞纯度高，活性好，符合要求。

实施例3新鲜脐血浆的制备

(1)将400mL全血采集于含有腺嗦岭的CPZD三联袋中，采集的全血应无溶血、凝块、脂血。

(2)大容量低温离心机(美国杜帮2817XG)离心10分钟。

(3)将离心后的三联袋挂在分离架上，把上层血浆分离在第一转移袋内。

(4)用HF-B自动高频热合机，热合袋管，再次用2817XG离心10分钟，将第二次离心的血浆转移到第二袋中，此血浆为新鲜血浆。

实施例4生物薄膜的制备

实施例4-1

应用本发明实施例1提供的方法将间充质干细胞培养至P4代，细胞培养体积为8mL。在细胞培养过程中加入本发明实施例3提供的预先制备好的新鲜血浆(制备时间不超过3小时)，加入血浆比例为20％，即加入血浆体积为2mL。置于37摄氏度，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中培养；24小时后得到干细胞生物基质薄膜，即生物薄膜，结果如图4和图5所示。

实施例4-2

应用本发明实施例1提供的方法将间充质干细胞培养至P4代，细胞培养体积为4mL。在细胞培养过程中加入本发明实施例3提供的预先制备好的新鲜血浆(制备时间不超过3小时)，加入血浆比例为50％，即加入血浆体积为2mL。置于37摄氏度，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中培养；24小时后得到干细胞生物基质薄膜，即生物薄膜。

实施例4-3

应用本发明实施例1提供的方法将间充质干细胞培养至P4代，细胞培养体积为12mL。在细胞培养过程中加入本发明实施例3提供的预先制备好的新鲜血浆(制备时间不超过3小时)，加入血浆比例为14.3％，即加入血浆体积为2mL。置于37摄氏度，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中培养；24小时后得到干细胞生物基质薄膜，即生物薄膜。

对比例1

应用本发明实施例1提供的方法将间充质干细胞培养至P4代，细胞培养体积为8mL。在细胞培养过程中加入本发明实施例3提供的预先制备好的新鲜血浆(制备时间不超过3小时)，加入血浆比例为100％，即加入血浆体积为8mL。置于37摄氏度，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中培养；24小时后得到干细胞生物基质薄膜，即生物薄膜。

对比例2

应用本发明实施例1提供的方法将间充质干细胞培养至P4代，细胞培养体积为14mL。在细胞培养过程中加入本发明实施例3提供的预先制备好的新鲜血浆(制备时间不超过3小时)，加入血浆比例为12.5％，即加入血浆体积为2mL。置于37摄氏度，饱和湿度，5％二氧化碳培养箱中培养；24小时后得到干细胞生物基质薄膜，即生物薄膜。

对比例3

取30g甲壳胺溶于2％(w/v)的冰醋酸水溶液中，充分搅拌完全溶解，2％(w/v)的明胶水溶液，5％(w/v)的聚乙烯醇水溶液、甘油，上述四种溶液按体积比40:20:15:6混匀，制成凝胶浆为基质，取浓度20％的抗菌药甲硝唑溶液，凝胶浆和甲硝唑溶液按8:1混匀，在无菌室内铺于平板上，在20摄氏度时经56小时自然干燥，得到生物薄膜。

为了进一步验证本发明提供的生物薄膜在促进凝血和创面愈合中的作用，进行如下实验：

选择清洁级健康SD大鼠28只，分为7组，每组4只，7周龄，体重200-220g，适应性饲养1周。1周后，于大鼠背部全层切取皮肤制造2×2cm²创面，并应用特制的塑料框架固定创面。其中，对照组不做任何处理，完全依靠大鼠本身的组织修复能力。余下各组于创面分别覆盖实施例4-1至4-3、对比例1至3提供的生物薄膜。每组分术后1周、2周、3周三个时间点进行观察。

创面愈合率计算

分别在术后1周、2周、3周，观察创面情况，将创面大小描印于无菌透明薄膜上，记录实验各组创面面积值，按以下公式计算大鼠创面愈合率。

创面愈合率＝(原始创面面积-n天后残余创面面积)/原始创面面积×100％。

术后创面愈合率和凝血时间如下表所示：

对创面进行观察，结果如下：

通过创面愈合率的结果可以说明，本发明实施例4-1至实施例4-3均可对创面愈合起到积极的作用，应用本发明实施例4-1至实施例4-3提供的生物薄膜处理创面，创面愈合率在第一周、第二周和第三周均高于对照组和对比例1至3各组。其中，以实施例4-1提供的生物薄膜对创面的愈合促进效果最好。

通过凝血时间的结果可以说明，本发明实施例4-1至实施例4-3均可对创面凝血起到积极的作用，应用本发明实施例4-1至实施例4-3提供的生物薄膜处理创面，凝血时间均短于对照组和对比例1至3各组。其中，以实施例4-1提供的生物薄膜对创面的凝血促进效果最好。

通过对炎症反应的观察结果可以说明，本发明实施例4-1至实施例4-3均可对创面炎症反应起到抑制作用，应用本发明实施例4-1至实施例4-3提供的生物薄膜处理创面，炎症反应均小于对照组和对比例1至3各组。其中，以实施例4-1提供的生物薄膜对创面造成的炎症反应的抑制效果最好，对比例3提供的生物薄膜对创面造成的炎症反应最为严重。

综上所述，本发明提供的生物薄膜的制备方法，采用纯生物细胞技术方法制备，所用原料种类少、易获取，且操作简单易行，普适性强。本发明提供的生物薄膜，应用本发明提供的制备方法制备得到，该生物薄膜能够覆于创面，不产生过敏反应，且无毒、无菌，同时具有消炎作用，能够促进凝血和伤口愈合。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种生物薄膜的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将干细胞置于培养基中进行培养，在所述干细胞密度达到70-85％时，向所述培养基中加入血浆，继续培养20-30小时后，得到所述生物薄膜；

其中，所述血浆与所述培养基的体积比为1:2-1:6。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血浆为新鲜血浆。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述新鲜血浆为新鲜脐血浆。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血浆与所述培养基的体积比为1:3-1:5。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述血浆与所述培养基的体积比为1:4。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述干细胞置于培养基中进行培养至P4代。

9.一种生物薄膜，其特征在于，应用权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到。

10.如权利要求9所述的生物薄膜在促进凝血或促进伤口愈合中的应用。