CN106635961A - 一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法 - Google Patents

一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，包括：基础培养基：H‑DMEM或者DMEM‑F12；(2)添加组分：维生素C50‑100μg/ml，表皮细胞生长因子(EGF)3‑20ng/ml，(3)血清5‑15％。在成纤维细胞基础培养基中添加其他组分，使培养的成纤维细胞形成膜片。还公开了使用方法。

Description

一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养基，具体涉及一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法，属于生物技术领域。
背景技术
成纤维细胞是构成皮肤真皮层的主要细胞，是真皮层产生胶原蛋白、弹性纤维蛋白以及其他ECM(细胞外基质)的主要细胞，胶原蛋白和弹性蛋白在皮肤组织中的作用就是形成皮肤支架，保持皮肤弹性。吸纳水分，使皮肤细腻、光滑、富有弹性。
所以成纤维细胞的正常增殖、分化维系着皮肤正常的结构和生理功能。随着年龄的增长，皮肤真皮层厚度变薄，真皮层内的成纤维细胞数量减少，从而引发一系列的皮肤问题：皱纹、没有弹性、松弛、干枯没有光泽等。解决这些皮肤问题的根源就是补充皮肤真皮层内的成纤维细胞。
目前批准的唯一一款成纤维细胞产品LIVIV，是将皮肤成纤维细胞经过分离培养注射到皮肤真皮层内，为在成年中改善中度至严重鼻唇沟皱纹(微笑线)的外观。细胞没有支架，注射之后很容易流失，从而失去效果。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基和使用方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。本发明是利用成纤维细胞在培养过程中自身分泌的富含胶原蛋白、弹性纤维蛋白的细胞外基质成分为天然支架成分，制备成成纤维细胞膜片，即保证了成纤维细胞的活性，又解决了单纯成纤维细胞注射易流失的问题。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
作为本发明的第一方面，一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于，包括：
(2)基础培养基：H-DMEM或者DF12；
(2)添加组分：维生素C 50-100μg/ml，
表皮细胞生长因子(EGF)3-20ng/ml，
(3)血清5-15％。
还包括：(4)dispase II(麦约尔CEL078)；
(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)；
(6)0.25％胰蛋白酶；
(7)皮肤保存液。
其中，(1)基础培养基为H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified EagleMedium)、或者DMEM-F12；
形式：干粉(纯水、过滤)、液体；
提供状态：无菌
配置方法：向基础培养基粉末(例如H-DMEM)，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容；
充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装；
然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的血清。
如果是液体H-DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可。
pH调节：使用pH试纸(或者pH电位计)测试培养基pH值，如不符合规定，可用10％的HCl或10％NaOH调节，直到符合配方要求，一般在pH 7.0-7.5之间。
其中，(2)添加组分按照培养基的终体积，配置。
其中，(3)血清的种类选自动物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自体血清(临床使用)，血清的浓度5-15％；
提供状态：无菌、补体灭活
自体血清的制备：
5)血清分离：将血样进行分离；
6)过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤；
7)血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；
8)紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。
(4)dispase II(麦约尔CEL078)配制
用电子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/33ml(24U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至1.5-2.4U/ml的工作液。
(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)配制
用电子天平秤取1g的IV型胶原酶粉末，用100ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至30-50U/ml的工作液。
(6)0.25％胰蛋白酶配制
0.25mg的胶原酶溶解到100ml 0.9％生理盐水中，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；分装置于5ml离心管中，放置在-20℃冻存。
(7)皮肤保存液的配制
将医用青霉素和链霉素配制成100ug/ml，在98ml的0.9％生理盐水中加入1ml的青霉素和链霉素。
作为本发明的第二方面，一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基的使用方法，其特征在于，包括：
1.人皮肤成纤维细胞原代培养
1.1双眼皮手术中切除的皮肤组织，放置在皮肤保存液中(生理盐水+双抗)运至GMP实验室，用含青链霉素的生理盐水冲洗3次；
1.2在皮肤组织中加入dispase II，其浓度为30-50U/ml，37℃消化30分钟，然后在超净工作台内用眼科剪和眼科镊将皮肤的表皮和皮下组织小心剥离，用生理盐水将真皮组织清洗干净至澄清；
1.3将真皮组织剪碎剪小，用IV型胶原酶，其浓度为600-800U/ml，37℃消化2小时；
1.4用生理盐水稀释胶原酶，离心，1000-1500rpm，5分钟。如此重复洗3次；
1.5基础培养基重悬沉淀，接种于100mm培养皿中，放置于5％CO2，37℃的培养箱中培养；
2.人皮肤成纤维细胞传代培养
2.1待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶在37℃培养箱中消化约3-5min。在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入基础培养液终止消化；
2.2离心，1300rpm，5分钟；
2.3弃去上清液，基础培养液重悬沉淀，用吸管吹打细胞，以1∶4比例接种至新的100mm培养皿中进行传代培养；
2.4待人成纤维细胞培养至4-6代时，用于成纤维细胞膜片制备；
3.成纤维细胞膜片制备
3.1取4-6代的成纤维细胞经过0.25％胰酶消化，1000-1500rpm离心；
3.2分别用基础培养基和添加组分的完全培养基重悬沉淀，吹打均匀；
3.3按照4*104/cm2接种至培养皿中；
3.4间隔2-4天更换基础培养基和完全培养基；
3.5待细胞长至第八天时，可见添加完全培养基的培养皿底层细胞已形成膜片，膜片的边缘翘起来，用镊子可将整张膜片掲起。
而添加基础培养基的培养皿底部无膜片翘起，很难从培养皿底掲下来。
本发明的有益效果：
本发明在成纤维细胞基础培养基中添加其他组分，使培养的成纤维细胞形成膜片。
附图说明
图1为4*104/cm2完全培养液第八天的图片。
图2为4*104/cm2基础培养液第八天的图片。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
一、培养基配制备
1.基础培养基
基础培养基：H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DF12；
形式：干粉(纯水、过滤)、液体；
提供状态：无菌
配置方法：向基础培养基粉末(例如DMEM)，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容。充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装。然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的血清。
如果是液体DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可。
pH调节：使用pH试纸(或者pH电位计)测试培养基pH值，如不符合规定，可用10％的HCl或10％NaOH调节，直到符合配方要求，一般在pH 7.0-7.5之间。
H-DMEM配方见表1，DMEM-F12配方见表2。
表1 H-DMEM配方
表2 DMEM-F12配方
2.添加组分
按照培养基的终体积，配置。详细见表3。
表3添加组分
3.血清
血清种类：动物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自体血清(临床使用)，血清的浓度5-15％；
提供状态：无菌、补体灭活
自体血清的制备：
9)血清分离：将血样进行分离
10)过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤
11)血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用。
12)紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。
4.dispase II(麦约尔CEL078)配制
用电子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌。配制成1g/33ml(24U/ml)的母液。母液放置在-20℃冻存。使用时将母液稀释至1.5-2.4U/ml的工作液。
5.IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)配制
用电子天平秤取1g的IV型胶原酶粉末，用100ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌。配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液。母液放置在-20℃冻存。使用时将母液稀释至30-50U/ml的工作液。
6.0.25％胰蛋白酶配制
0.25mg的胶原酶溶解到100ml 0.9％生理盐水中，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌。分装置于5ml离心管中，放置在-20℃冻存。
7.皮肤保存液的配制
将医用青霉素和链霉素配制成100ug/ml，在99ml的0.9％生理盐水中加入1ml的青霉素和链霉素。
二、成纤维细胞膜片制备
1.人皮肤成纤维细胞原代培养
1.1双眼皮手术中切除的皮肤组织，放置在皮肤保存液中(生理盐水+双抗)运至GMP实验室，用含青链霉素的生理盐水冲洗3次。
1.2在皮肤组织中加入dispase II(30-50U/ml)，37℃消化30分钟，然后在超净工作台内用眼科剪和眼科镊将皮肤的表皮和皮下组织小心剥离，用生理盐水将真皮组织清洗干净至澄清。
1.3将真皮组织剪碎剪小，用IV型胶原酶(600-800U/ml)37℃消化2小时
1.4用生理盐水稀释胶原酶，离心，1000-1500rpm，5分钟。如此重复洗3次。
1.5基础培养基重悬沉淀，接种于100mm培养皿中，放置于5％CO2，37℃的培养箱中培养。
2.人皮肤成纤维细胞传代培养
2.1待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶在37℃培养箱中消化约3-5min。在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入基础培养液终止消化。
2.2离心，1300rpm，5分钟。
2.3弃去上清液，基础培养液重悬沉淀，用吸管吹打细胞，以1∶4比例接种至新的100mm培养皿中进行传代培养。
2.4待人成纤维细胞培养至4-6代时，用于成纤维细胞膜片制备。
3.成纤维细胞膜片制备
3.1取4-6代的成纤维细胞经过0.25％胰酶消化，1000-1500rpm离心
3.2分别用基础培养基和添加组分的完全培养基重悬沉淀，吹打均匀。
3.3按照4*104/cm2接种至培养皿中。
3.4间隔2-4天更换基础培养基和完全培养基。
3.5图1为4*104/cm2完全培养液第八天的图片，如图1所示，待细胞长至第八天时，可见添加完全培养基的培养皿底层细胞已形成膜片，膜片的边缘翘起来，用镊子可将整张膜片掲起。
图2为4*104/cm2基础培养液第八天得图片，如图2所示，而添加基础培养基的培养皿底部无膜片翘起，很难从培养皿底掲下来。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。

Claims (12)

1.一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于，包括：
(1)基础培养基：H-DMEM或者DMEM-F12；
(2)添加组分：维生素C 50-100μg/ml，表皮细胞生长因子(EGF)3-20ng/ml；
(3)血清5-15％。
2.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：
还包括：(4)dispase II(麦约尔CEL078)；
(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)；
(6)0.25％胰蛋白酶；
(7)皮肤保存液。
3.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：其中，(1)基础培养基为H-DMEM(High Glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium)、或者DMEM-F12；
无菌的干粉、液体状态。
4.根据权利要求3所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：基础培养基的配置方法是向基础培养基粉末(H-DMEM)，加入无菌超纯水一部分，进行先溶解，然后根据培养基说明书规定的体积进行定容；
充分溶解后，0.22微米滤膜进行过滤、封装；
然后按照需求，在基础培养液中加入5％-15％的血清。
5.根据权利要求3所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：基础培养基的配置方法是液体DMEM，直接在容器中加入5％-15％的血清，混匀即可，用HCL或者NaOH调整pH为7.0-7.5。
6.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：其中，(2)添加组分按照培养基的终体积，配置。
7.根据权利要求1所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：其中，(3)血清的选自动物血清、胎牛血清、人血清，最佳的自体血清(临床使用)，血清的浓度5-15％；
提供状态：无菌、补体灭活
自体血清的制备：
1)血清分离：将血样进行分离；
2)过滤除菌：将步骤1)得到的样品0.22微米过滤器进行两次过滤；
3)血清灭活：将步骤2)得到的样品56℃水浴灭活热原至少30min，冰箱冷藏室保存待用；
4)紫外线照射：有时，在步骤3)获得的样品在使用或者封装前要紫外线照射。
8.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(4)dispase II(麦约尔CEL078)配制，用电子天平秤取1g的dispase II粉末，用33ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/33ml(24U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至1.5-2.4U/ml的工作液。
9.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(5)IV型胶原酶(GIBCO,17104-019)配制，用电子天平秤取1g的IV型胶原酶粉末，用100ml的0.9％生理盐水完全溶解，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；配制成1g/100ml(2100U/ml)的母液；母液放置在-20℃冻存；使用时将母液稀释至30-50U/ml的工作液。
10.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(6)0.25％胰蛋白酶配制，0.25mg的胶原酶溶解到100ml0.9％生理盐水中，搅拌均匀，在超净工作台用0.22微米过滤器进行过滤除菌；分装置于5ml离心管中，放置在-20℃冻存。
11.根据权利要求2所述的一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基，其特征在于：(7)皮肤保存液的配制，将医用青霉素和链霉素配制成100ug/ml，在98ml的0.9％生理盐水中加入1ml的青霉素和链霉素。
12.一种制备人皮肤成纤维细胞膜片的细胞培养基的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1.人皮肤成纤维细胞原代培养
1.1双眼皮手术中切除的皮肤组织，放置在皮肤保存液中(生理盐水+双抗)运至GMP实验室，用含青链霉素的生理盐水冲洗3次；
1.2在皮肤组织中加入dispase II，其浓度为30-50U/ml，37℃消化30分钟，然后在超净工作台内用眼科剪和眼科镊将皮肤的表皮和皮下组织小心剥离，用生理盐水将真皮组织清洗干净至澄清；
1.3将真皮组织剪碎剪小，用IV型胶原酶，其浓度为600-800U/ml，37℃消化2小时；
1.4用生理盐水稀释胶原酶，离心，1000-1500rpm，5分钟，如此重复洗3次；
1.5基础培养基重悬沉淀，接种于100mm培养皿中，放置于5％CO2，37℃的培养箱中培养；
2.人皮肤成纤维细胞传代培养
2.1待细胞融合度达到90％时，用0.25％胰酶在37℃培养箱中消化约3-5min，在显微镜下观察细胞回缩变圆、细胞间隙增大后，加入基础培养液终止消化；
2.2离心，1300rpm，5分钟；
2.3弃去上清液，基础培养液重悬沉淀，用吸管吹打细胞，以1∶4比例接种至新的100mm培养皿中进行传代培养；
2.4待人成纤维细胞培养至4-6代时，用于成纤维细胞膜片制备；
3.成纤维细胞膜片制备
3.1取4-6代的成纤维细胞经过0.25％胰酶消化，1000-1500rpm离心；
3.2分别用基础培养基和添加组分的完全培养基重悬沉淀，吹打均匀；
3.3按照4*104/cm2接种至培养皿中；
3.4间隔2-4天更换基础培养基和完全培养基；
3.5待细胞长至第八天时，可见添加完全培养基的培养皿底层细胞已形成膜片，膜片的边缘翘起来，用镊子可将整张膜片掲起。
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