CN105169494B - 一种组织工程皮肤的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种组织工程皮肤的制备方法，本发明是在脱细胞猪胸主动脉血管内膜两侧分别种植成纤维细胞和表皮细胞构建而成的组织工程皮肤。与目前皮肤替代品相比较，原料来源丰富，可显著促进创面愈合并加速受创部位血管生成，减少瘢痕增生，机械性可满足机体要求，提高人工皮肤移植成功率。因此，本发明组织工程皮肤有应用于临床使用的巨大潜能。

Description

一种组织工程皮肤的制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程学生物材料技术领域，尤其是涉及一种以脱细胞猪胸主动脉血管内膜为支架接种表皮细胞和成纤维细胞制备组织工程皮肤的方法。
背景技术
皮肤是覆盖在人体表面具有高级组织结构的器官，具有保护人体、防止细菌侵蚀和感染，调节体温和排泄废液等作用，当皮肤受到创伤、烧伤或其他损害时，会导致组织体液的流失，从而导致人体水、电解质和酸碱平衡失调，影响人体正常吸收和代谢平衡。此外，暴露在空气的伤口极易感染细菌，严重时可导致休克或败血症。因此皮肤的修复必须解决。
理想的人工皮肤应当具备以下特点：(1)能够覆盖并封闭皮肤缺损创面、防止感染；(2)具有柔韧性和一定机械强度、移植后能与创面粘附良好，防止水分和体液从创面蒸发流失；(3)促进皮下血管生长，逐渐形成自体表皮层和真皮层结构；(4)移植存活率高、被受体永久接受并成活、最大程度的接近正常皮肤生理的愈合质量；(5)经济易得、安全不携带病原。
目前在临床中使用的皮肤修复材料可分为两大类：一类是天然皮肤，包括自体皮肤、同种异体皮和异种皮；另一类是人工皮肤，即用天然高分子(胶原、壳聚糖、透明质酸等)和合成高分子(硅橡胶、尼龙、涤纶等)合成的组织工程人工皮肤。天然皮肤虽有类似于受体皮肤的结构和功能，但存在供源不足、制备流程繁琐、免疫排异、创面收缩严重、病毒感染等问题；而人工皮肤虽然可大量供应，并且易保存、无传染疾病、无免疫排斥反应，但还存在各种弊端，如Intergra不如自体移植皮肤具有弹性和柔软度，而Biobrane可能抑制巨噬细胞的作用等。组织工程方法是通过从自体或异体皮肤组织消化分离培养细胞，借助支架重组成皮肤组织再用于患者皮肤创伤的修复。表皮细胞可在相关培养条件下，培养成人工皮片，然而在临床使用过程中，机械性能差，易收缩，不宜临床操作。因此为了解决这一缺陷，需要在皮片下增加支架材料。在人工真皮方面，如Dermagraft是具有两层结构的人工皮肤，内层由尼龙丝构成支架材料，表面采用硅胶膜，起表皮作用。然而理想的皮肤替代品是能够将缺失的真皮和表皮同时修复，即全层复合皮肤。因此全层复合皮肤包含位于表皮的表皮细胞和位于真皮层的成纤维细胞，在体外培养成型后，种植于受创部位，不易变形，可大幅度缩短愈合时间。
尽管组织工程学方法在皮肤研制方面已取得巨大的成果，且有许多产品应用到临床中，然而在机械性能和功能等方面，与正常皮肤相比较，仍有所缺陷，如没有正常皮肤中的血管等组织。
我国作为养猪大户，除了日常可使用部分，目前除了猪皮作为胶原提取原料，小肠作为抗凝血活性药物肝素钠的提取原料外，其余成分均未得到完善的利用。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种组织工程皮肤的制备方法。本发明不仅解决了工业废弃物处理的问题，而且解决了制备组织工程皮肤的来源问题。
本发明的技术方案如下：
一种组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
1、脱细胞猪胸主动脉血管内膜的制备：
(1)取检疫合格月龄大于5个月的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm的血管内膜，再用医用生理盐水清洗，制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，12～24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24～36h后用医用生理盐水漂洗干净，即得脱细胞猪胸主动脉血管内膜，贮存于75％乙醇中备用；
2、组织工程皮肤的制备方法，包括培养基配制以及组织工程皮肤的构建，包括以下步骤：
(1)按1：9的体积比将DMEM培养基与进口胎牛血清混合后，此基础上每500mL再添加氢化可的松100～500μg，胆固醇5～8mg，转铁蛋白1～5mg，维生素C10～20mg，胰岛素2～5mg配制成基础培养基；再以基础培养基配制以下培养基，其中添加物浓度为终浓度：
成纤维细胞培养基：基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.1ng/mL；
表皮细胞培养基：基础培养基+牛垂体提取液50～100μg/mL+表皮细胞生长因子5～25ng/mL+乙醇胺0.1mM+碱性成纤维细胞生长因子0.01～0.05ng/mL+氯化钙0.05mmol/L；
(2)将步骤2得到的脱细胞猪胸主动脉血管内膜用医用生理盐水漂洗去除酒精后，在其一侧按2×105～5×105个/cm2接种成纤维细胞，加入成纤维细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养7～10天；
(3)将步骤(2)中得到的已接种成纤维细胞的脱细胞猪胸主动脉血管内膜置于培养支架上，在未接种细胞的一侧，按2×105～5×105个/cm2接种表皮细胞，加入表皮细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养12～18天后，扫描电镜观察形成表皮层和真皮层后，即得组织工程皮肤。
步骤1所述溶液的溶剂均为超纯水。
步骤1或2所述溶液中均含有青霉素和链霉素，所述溶液中青霉素与链霉素的浓度分别为100U/mL、100μg/mL。
步骤1或2所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
本发明有益的技术效果在于：
(1)本发明彻底去除猪胸主动脉的内皮细胞层和平滑肌细胞，使血管内膜成为表皮细胞和成纤维细胞的生长支架。
(2)本发明通过SDS溶液清洗和胰蛋白酶清洗步骤去除内膜层中内皮细胞和平滑肌细胞层，降低了免疫原性。
(3)本发明操作过程中，溶液中均添加了青霉素和链霉素两种抗生素，有效降低微生物污染几率。
(4)本发明原材料完整的保留细胞外基质，成纤维细胞和角质细胞可迅速成长，形成真皮层和表皮层，从而避免因真皮层缺损而导致瘢痕形成过重；
(5)本发明成品与创面粘附紧密，含有大量促血管生成物质，因此可大幅加快皮肤新生血管的生长速度，缩短愈合时间。
(6)本发明制备过程简单，保液率、机械强度均可满足使用要求，创面收缩率低；无需用戊二醛等有毒试剂交联提高强度，无需用保湿剂增加成品的湿润性，与已有的人工皮肤相比较，使用化学药品少，降低了使用时的化学毒性。
(7)本发明成品皮肤完整，适用于皮肤缺损或烧伤，使用安全可靠、无毒，避免疾病传播。
(8)本发明人工皮肤原料来源丰富，有可应用于临床使用的巨大潜能。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
1、脱细胞猪胸主动脉血管内膜的制备：
(1)取检疫合格月龄大于5个月的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm的血管内膜，再用医用生理盐水清洗，制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净，即得脱细胞猪胸主动脉血管内膜，贮存于75％乙醇中备用；
2、组织工程皮肤的制备方法，包括培养基配制以及组织工程皮肤的构建，包括以下步骤：
(1)按1：9的体积比将DMEM培养基与进口胎牛血清混合后，此基础上每500mL再添加氢化可的松100μg，胆固醇5mg，转铁蛋白1mg，维生素C10mg，胰岛素2mg配制成基础培养基；再以基础培养基配制以下培养基，其中添加物浓度为终浓度：
成纤维细胞培养基：基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子0.05ng/mL；
表皮细胞培养基：基础培养基+牛垂体提取液50μg/mL+表皮细胞生长因子5ng/mL+乙醇胺0.1mM+碱性成纤维细胞生长因子0.01ng/mL+氯化钙0.05mmol/L；
(2)将步骤2得到的脱细胞猪胸主动脉血管内膜用医用生理盐水漂洗去除酒精后，在其一侧按3×105个/cm2接种成纤维细胞，加入成纤维细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养10天；
(3)将步骤(2)中得到的已接种成纤维细胞的脱细胞猪胸主动脉血管内膜置于培养支架上，在未接种细胞的一侧，按5×105个/cm2接种表皮细胞，加入表皮细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养15天后，扫描电镜观察形成表皮层和真皮层后，即得组织工程皮肤。
步骤1所述溶液的溶剂均为超纯水。
步骤1所述溶液中均含有青霉素和链霉素，所述溶液中青霉素与链霉素的浓度分别为100U/mL、100μg/mL。
步骤1或2所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
实施例2
一种组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
1、脱细胞猪胸主动脉血管内膜的制备：
(1)取检疫合格月龄大于5个月的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm的血管内膜，再用医用生理盐水清洗，制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，18h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净，即得脱细胞猪胸主动脉血管内膜，贮存于75％乙醇中备用；
2、组织工程皮肤的制备方法，包括培养基配制以及组织工程皮肤的构建，包括以下步骤：
(1)按1：9的体积比将DMEM培养基与进口胎牛血清混合后，此基础上每500mL再添加氢化可的松300μg，胆固醇8mg，转铁蛋白3mg，维生素C15mg，胰岛素2mg配制成基础培养基；再以基础培养基配制以下培养基，其中添加物浓度为终浓度：
成纤维细胞培养基：基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子0.075ng/mL；
表皮细胞培养基：基础培养基+牛垂体提取液75μg/mL+表皮细胞生长因子10ng/mL+乙醇胺0.1mM+碱性成纤维细胞生长因子0.03ng/mL+氯化钙0.05mmol/L；
(2)将步骤2得到的脱细胞猪胸主动脉血管内膜用医用生理盐水漂洗去除酒精后，在其一侧按4×105个/cm2接种成纤维细胞，加入成纤维细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养10天；
(3)将步骤(2)中得到的已接种成纤维细胞的脱细胞猪胸主动脉血管内膜置于培养支架上，在未接种细胞的一侧，按5×105个/cm2接种表皮细胞，加入表皮细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养12天后，扫描电镜观察形成表皮层和真皮层后，即得组织工程皮肤。
步骤1所述溶液的溶剂均为超纯水。
步骤1所述溶液中均含有青霉素和链霉素，所述溶液中青霉素与链霉素的浓度分别为100U/mL、100μg/mL。
步骤1或2所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
实施例3
一种组织工程皮肤的制备方法，包括如下步骤：
1、脱细胞猪胸主动脉血管内膜的制备：
(1)取检疫合格月龄大于5个月的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm的血管内膜，再用医用生理盐水清洗，制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净，即得脱细胞猪胸主动脉血管内膜，贮存于75％乙醇中备用；
2、组织工程皮肤的制备方法，包括培养基配制以及组织工程皮肤的构建，包括以下步骤：
(1)按1：9的体积比将DMEM培养基与进口胎牛血清混合后，此基础上每500mL再添加氢化可的松500μg，胆固醇8mg，转铁蛋白5mg，维生素C20mg，胰岛素5mg配制成基础培养基；再以基础培养基配制以下培养基，其中添加物浓度为终浓度：
成纤维细胞培养基：基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子0.1ng/mL；
表皮细胞培养基：基础培养基+牛垂体提取液100μg/mL+表皮细胞生长因子25ng/mL+乙醇胺0.1mM+碱性成纤维细胞生长因子0.05ng/mL+氯化钙0.05mmol/L；
(2)将步骤2得到的脱细胞猪胸主动脉血管内膜用医用生理盐水漂洗去除酒精后，在其一侧按5×105个/cm2接种成纤维细胞，加入成纤维细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养8天；
(3)将步骤(2)中得到的已接种成纤维细胞的脱细胞猪胸主动脉血管内膜置于培养支架上，在未接种细胞的一侧，按5×105个/cm2接种表皮细胞，加入表皮细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养13天后，扫描电镜观察形成表皮层和真皮层后，即得组织工程皮肤。
步骤1所述溶液的溶剂均为超纯水。
步骤1所述溶液中均含有青霉素和链霉素，所述溶液中青霉素与链霉素的浓度分别为100U/mL、100μg/mL。
步骤1或2所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。

Claims (5)

1.一种组织工程皮肤的制备方法，其特征在于：是由脱细胞猪胸主动脉血管内膜、皮肤成纤维细胞和表皮细胞制成，是在脱细胞猪胸主动脉血管内膜两侧分别种植成纤维细胞和表皮细胞构建而成；
所述的脱细胞猪胸主动脉血管内膜按以下方法制备：
(1)取检疫合格月龄大于5个月的猪，无菌开腔，取胸主动脉，用医用生理盐水漂洗干净后，钝性分离制得厚度为0.3～0.5mm的血管内膜，再用医用生理盐水清洗，制得猪胸主动脉血管内膜；
(2)将步骤(1)所得的猪胸主动脉血管内膜置于1M的氯化钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(3)将步骤(2)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为10mg/mL的十二烷基硫酸钠溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，12～24h后用医用生理盐水漂洗干净；
(4)将步骤(3)得到的猪胸主动脉血管内膜置于浓度为2.5mg/mL的胰酶溶液中，并在37℃恒温摇床中以100～150r/min的转速震荡，每间隔6h以频率为40KHz的超声波震荡5min，24～36h后用医用生理盐水漂洗干净，即得脱细胞猪胸主动脉血管内膜，贮存于75％乙醇中备用。
2.根据权利要求1所述的组织工程皮肤的制备方法，包括培养基配制以及组织工程皮肤的构建，其特征在于包括以下步骤：
a.按1：9的体积比将DMEM培养基与进口胎牛血清混合后，此基础上每500mL再添加氢化可的松100～500μg，胆固醇5～8mg，转铁蛋白1～5mg，维生素C10～20mg，胰岛素2～5mg配制成基础培养基；再以基础培养基配制以下培养基，其中添加物浓度为终浓度：
成纤维细胞培养基：基础培养基+碱性成纤维细胞生长因子0.05～0.1ng/mL；
表皮细胞培养基：基础培养基+牛垂体提取液50～100μg/mL+表皮细胞生长因子5～25ng/mL+乙醇胺0.1mM+碱性成纤维细胞生长因子0.01～0.05ng/mL+氯化钙0.05mmol/L；
b.将所述步骤(4)得到的脱细胞猪胸主动脉血管内膜用医用生理盐水漂洗去除酒精后，在其一侧按2×105～5×105个/cm2接种成纤维细胞，加入成纤维细胞培养基淹没皮肤表面，每天换液，培养7～10天；
c.将步骤b中得到的已接种成纤维细胞的脱细胞猪胸主动脉血管内膜置于培养支架上，在未接种细胞的一侧，按2×105～5×105个/cm2接种表皮细胞，加入表皮细胞培养基淹没材料表面，每天换液，培养12～18天后，扫描电镜观察形成表皮层和真皮层后，即得组织工程皮肤。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶液中的溶剂均为超纯水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述溶液中均含有青霉素和链霉素，所述溶液中青霉素与链霉素的浓度分别为100U/mL、100μg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述医用生理盐水为质量浓度为0.9％的氯化钠溶液。
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