CN102631706A

CN102631706A - 低免疫原性猪真皮支架的制备方法

Info

Publication number: CN102631706A
Application number: CN2012101073034A
Authority: CN
Inventors: 武岩; 宋国栋; 邵阳; 姜金珠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-04-13
Filing date: 2012-04-13
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2032-04-13
Also published as: CN102631706B

Abstract

本发明公开了一种低免疫原性猪真皮支架的制备方法，包括如下步骤：①制备“双断层”真皮、②脱细胞处理、③基质金属蛋白酶-7处理和④真空冷冻干燥处理。它是以猪皮肤为原料，以保留猪真皮胶原纤维等低免疫原性成分及其为基础的天然三维结构、去（脱）除细胞和层粘连蛋白、纤维连接蛋白等基质蛋白等高免疫原性成分为目标要求，通过改进皮肤取材及处理、优选脱细胞方法、建立脱基质蛋白技术、优选交联剂、真空冷冻干燥技术等手段，制备低免疫原性猪真皮支架材料。它可达到降低猪真皮免疫原性至人体能够耐受的水平，同时保留其天然三维结构，以原位构建组织工程化组织方式引导人真皮“有序”再生重建的目的，可解决现有技术存在的问题。

Description

低免疫原性猪真皮支架的制备方法

技术领域

本发明涉及一种低免疫原性猪真皮支架的制备方法。

背景技术

异体脱细胞真皮基质（Allo-ADM）是以包含表皮、基底膜及乳头层真皮的断层人尸体皮片为原材料，采用物理、化学、生物等两种或两种以上脱细胞方法联合处理而制成，保留了免疫原性较弱的胶原蛋白（collagen，Col）以及部分弹性纤维(elastic fiber)、蛋白多糖(proteoglycan)和结构性糖蛋白(structural glycoproteins)等基质成分，亦保留了真皮天然的三维结构和连接表皮与真皮的基底膜。虽然在Allo-ADM的基础研究和临床应用方面有很大进展，并在以烧伤为主的多学科应用中取得较好的移植效果，但仍有许多基础理论与实际应用问题有待研究解决：①异体皮来源有限，由异体皮制作的ADM价格昂贵，限制了其临床应用；②具有传染疾病的潜在危险；③屏障功能不完善，抗感染能力较弱，对移植床要求条件较高；④Allo-ADM移植后渗透性差、血管化速率慢，与自体刃厚皮即时复合移植（一步移植法）成活率低。

异种脱细胞真皮基质（Xeno-ADM）的制备方法与Allo-ADM基本相同，取包含表皮、基底膜及乳头层真皮的新鲜断层猪皮肤，经脱细胞处理制成Xeno-ADM，保留了Col Ⅰ、Ⅲ为主的天然真皮三维网络空间结构及部分Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）、层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白（FN）、细胞外粘连蛋白（VN）、巢蛋白（entactin）、蛋白多糖，亦残留不能完全脱除的细胞相关抗原成分。检索近年有关Allo-ADM和Xeno-ADM基础研究与临床应用方面的文献并综合分析， Xeno-ADM虽然展示了良好的研究与应用前景，但现阶段无论从引发宿主的炎症-免疫反应，还是到包括动物实验和临床试用在内的实际效果，Xeno-ADM移植物都难以与Allo-ADM相媲美，其中较强的免疫原性及其诱发的炎症-免疫反应是Xeno-ADM存在的突出问题。

DeSagun EZ等用抗Xeno-ADM血清进行免疫组化实验，Xeno-ADM内的ColⅠ、Ⅲ不发生反应，而基底膜区域反应最强，Ninomiya亦指出基底膜Col Ⅳ中α( Ⅳ)NCL 结构域有明显的抗血管生成活性。以上均提示富含LN、Col Ⅳ等成分的基底膜亦包括皮肤附属器和血管基膜，可能是Xeno-ADM免疫原的主要来源。另外，任何脱细胞方法都不能完全脱除细胞碎片成分，成为Xeno-ADM免疫原的另一来源。此外，Allo-ADM移植后渗透性差、血管化速率慢，屏障功能不完善等问题同样存在于Xeno-ADM。

Xeno-ADM植入人体后诱发的炎症-免疫反应及由此引发的宿主排斥移植物反应是限制Xeno-ADM在临床上广泛应用的首要问题，如何在Xeno-ADM的制备工艺上加以改良，尽可能的去除导致其高免疫原性的LN、Col Ⅳ等成分，并同时最大限度的保留Col Ⅰ、Ⅲ等低免疫原性成分及其为基础的天然真皮三维网络结构，是值得深入研究的课题。

发明内容

本发明的目的是，提供一种低免疫原性猪真皮支架的制备方法，它是以猪皮肤为原料，以保留猪真皮胶原纤维等低免疫原性成分及其为基础的天然三维结构、去（脱）除细胞和层粘连蛋白(LN)、纤维连接蛋白（FN）等基质蛋白等高免疫原性成分为目标要求，通过改进皮肤取材及处理、优选脱细胞方法、建立脱基质蛋白技术、优选交联剂、真空冷冻干燥技术等手段，制备低免疫原性猪真皮支架材料。它可达到降低猪真皮免疫原性至人体能够耐受的水平，同时保留其天然三维结构，以原位构建组织工程化组织方式引导人真皮“有序”再生重建的目的，从而，可解决现有技术存在的问题。

本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：低免疫原性猪真皮支架的制备方法，包括如下步骤：①制备“双断层”真皮：a.将家猪处死去毛，剥离其皮肤和部分皮下组织，消毒冲洗；b.先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层,保留0.5-0.6mm厚真皮网状层，即为“双断层”真皮；②脱细胞处理：a.配制2.5U/ml中性蛋白酶（Dispase II）溶液及体积分数0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）溶液；b.先将步骤①中所述“双断层”真皮置于2.5U/ml Dispase II溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层”真皮至少需要2.5ml的2.5U/ml Dispase II溶液；再将“双断层”真皮取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”真皮置入体积分数0.5% TritonX-100溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的“双断层”真皮至少需要5ml的体积分数0.5% TritonX-100溶液；取出“双断层”真皮，PBS洗涤5次，每次5min；该工序能脱除“双断层”真皮中的细胞成分，将其制成 “双断层”异种脱细胞真皮基质，即“双断层”Xeno-ADM；③基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)处理：先将步骤②所述“双断层”Xeno-ADM置于0.5 U/ml MMP-7溶液中，于4℃条件下作用12-16h，再于37℃条件下作用8h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层” Xeno-ADM需要至少2.5ml的MMP-7溶液浸泡；再将“双断层”Xeno-ADM取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”Xeno-ADM置入体积分数0.5% TritonX-100溶液内，于25℃下，振荡洗涤24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层”Xeno-ADM至少需要5ml体积分数0.5% TritonX-100溶液进行振荡洗涤；PBS充分洗涤5次，每次10min；该步骤处理能脱除“双断层”Xeno-ADM中层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）及其他高抗原性成分，将“双断层” Xeno-ADM制成网状层真皮支架；④真空冷冻干燥处理：将上一步骤的网状层真皮支架在－40℃条件下冷冻1h，之后抽真空17h，以进一步降低网状层真皮支架免疫原性，扩大其相对空间结构，提高渗透性，从而制成低免疫原性猪真皮支架。

经步骤③处理后得到的网状层真皮支架，在进行步骤④真空冷冻干燥处理前，先应用京尼平（Genipin）处理，以增强网状层真皮支架的韧性、降低其降解速率；京尼平（Genipin）处理操作如下：网状层真皮支架应用0.5%（w/v）的京尼平（Genipin）溶液，在25℃下交联6h；之后，再置入25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中中和多余的京尼平（Genipin），每平方厘米的0.5-0.6mm网状层真皮支架至少需要在2.5ml的25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中进行中和处理。完成步骤①中所述的b工序的设备是用皮革剖层机。所述步骤②的b工序中所述的所有操作过程，都辅以连续振荡。所述步骤④的a工序由真空冷冻干燥机完成。所述步骤①中的“双断层”真皮的切取尺寸为100mm×100mm。步骤①中b工序所述, 先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层；被削除的表皮及真皮乳头层厚度是1-2mm，被削除的皮下组织及与其相连的真皮部分网状层厚度是1.5-2.5mm，确保保留真皮网状层厚度为0.5-0.6mm。步骤①中a工序所述消毒冲洗具体操作如下：将所述的皮肤和部分皮下组织置入0.1%（w/v）新洁尔灭溶液中浸泡消毒10-15min，取出后用等渗盐水冲洗3次，再置抗生素盐水溶液中浸泡10min；抗生素盐水溶液是由每500ml等渗盐水中加庆大霉素32万U而制得的溶液。

本发明的积极效果在于：所述制备方法在皮肤取材时去除表皮、基底膜及真皮乳头层，制备网状层真皮组织，选用适宜浓度的具有降解层粘连蛋白（LN）和Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）等成分作用的基质金属蛋白酶-7（MMP-7）溶液对脱细胞后的“双断层”真皮进行处理。然后选用适宜浓度、条件的京尼平（Genipin）、真空冷冻干燥技术依次对经MMP-7处理的网状层真皮进行再处理。实验研究结果显示，“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7+Genipin+真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架，包括细胞碎片在内的层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）等高抗原性成分明显降低，组织结构保持正常、间隙扩大，无细胞毒性，细胞相容性好。临床应用结果表明，将低免疫原性猪真皮支架与自体刃厚皮复合移植（两步法）于Ⅲ度烧伤削（切）痂创面，在真皮支架移植物中有宿主成纤维细胞浸润、新生血管形成，未见明显免疫排斥反应；移植成活率较高，能够减轻局部瘢痕、改善组织弹性，其效果相当于Allo-ADM与自体刃厚皮复合移植，接近自体薄或中厚皮。

所述制备方法制备的真皮支架，其移植和埋植的效果优于异种脱细胞真皮基质的效果，且可与Allo-ADM相媲美。并且，所述真皮支架相对Allo-ADM而言，具有材料来源充足、造价低廉的优点，并且可大幅降低传染疾病的潜在危险。另外，它的屏障功能完善，抗感染能力较强，对移植床要求条件较低；而且，它还可克服Allo-ADM移植后渗透性差、血管化速率慢，与自体刃厚皮即时复合移植（一步移植法）成活率低的缺陷。

所述制备方法制备的真皮支架相对Xeno-ADM而言，可解决存在的较强的免疫原性及其诱发的炎症-免疫反应的问题

研究进一步发现，“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7+真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架韧性稍差、较易降解，但细胞相容性较好、移植成活率较高，其效果相当于Allo-ADM与自体刃厚皮复合移植，接近自体薄或中厚皮，适于全层皮肤缺损移植作为真皮替代物。而加用Genipin处理，即“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7+Genipin+真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架，韧性较强、较难降解，但细胞相容性、移植成活率似稍差；由于组织缺损需要修补材料相对更强的稳定性，而且在埋植条件下较易成活，如脑膜、疝修补等，因此，加用Genipin处理制备的低免疫原性猪真皮支架，更适于组织缺损埋植作为修补填充物，初步研究观察已获证实。

因此，目前，制备的低免疫原性猪真皮支架有2种类型：①“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7 +真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架，韧性稍差、较易降解，适于全层皮肤缺损移植作为真皮替代物；②“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7+Genipin+真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架，韧性较强、较难降解，适于组织缺损埋植作为修补填充物。

关于低免疫原性猪真皮支架细胞相容性评价

目的观察应用基质金属蛋白酶-7（MMP-7）、京尼平（Genipin）及真空冷冻干燥处理对网状层猪脱细胞真皮基质（Xeno-ADM）组织结构及细胞相容性的影响。方法取家猪“双断层”真皮，又称网状层真皮54块，随机分为正常对照组（A1组）、脱细胞组（B组）、脱细胞+MMP-7组（C组）、脱细胞+MMP-7+ Genipin组（D组）和脱细胞+MMP-7+ Genipin +真空冷冻干燥组（E组），A1组6块，其余每组12块；另取同样大小异体脱细胞真皮基质（Allo-ADM）6块作为细胞相容性实验对照组（A2组）。采用HE染色、免疫组化染色、扫描电镜、MTT试验和ELISA法，检查网状层真皮中细胞、波形蛋白（Vimentin）、层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）残留情况，组织结构变化和细胞毒性。接种人真皮成纤维细胞（Fb）于各组网状层真皮和Allo-ADM真皮面培养，动态观察Fb生长情况及上清液中IL-6、IL-8含量变化。结果：B组标本毛囊内毛发、上皮根鞘、细胞核、细胞碎片样结构及Vimentin 、LN、Col Ⅳ仍有少量残留，C、D、E组被完全脱除。D、E较B、C组韧性增加。4组胶原纤维结构完整，排列与A1组相似且胶原纤维之间间隙均有所增大，其中C、D组间隙相近但均大于B组，E组最大。细胞毒性试验显示各组细胞毒性均为0或1级。Fb在各组均能生长增殖并随时间延长而增加，D、E组表面细胞密度较高而A2、C组则组织内部较明显。各组第7天培养液上清中IL-6、IL-8含量明显高于第3天（P＜0.01）；A2、C、D、E组之间含量无显著差异（P＞0.05），但均较B组高（P＜0.05）。结论脱细胞+MMP-7+Genipin+真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架，高抗原性成分明显降低，组织结构保持正常、间隙扩大，无细胞毒性，细胞相容性好。细胞长入组织内部较少可能与京尼平增加组织韧性有关。

研究显示，作为原位构建组织工程化组织尤其是真皮的植入性支架材料，与异体脱细胞真皮基质（Allo-ADM）相比，异种脱细胞真皮基质（Xeno-ADM）仍存在很强的免疫原性，同时二者均存在着结构致密、渗透性差，血管化速率慢等问题。前期研究中，在改进猪皮取材、制作网状层真皮、优选脱细胞方法制备出Xeno-ADM的基础上，应用基质金属蛋白酶-7（MMP-7）处理，能够有效降低包括细胞碎片在内的层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）等高抗原性成分。研究证实，天然交联剂京尼平（Genipin）能够交联组织中多肽、糖脂、脂蛋白、脂多糖等抗原性成分，降低交联组织免疫原性、提高稳定性，同时具有细胞毒性极低、生物相容性良好等特点。此外，真空冷冻干燥处理能够降低Xeno-ADM免疫原性，扩大其空间结构，提高渗透性。本研究选用适宜浓度、条件的京尼平、真空冷冻干燥技术依次对经MMP-7处理的网状层Xeno-ADM进行再处理，以期进一步降低其免疫原性、扩大其三维空间结构，制备出低免疫原性猪真皮支架材料，观察评价这些处理因素对其组织结构、细胞毒性和细胞相容性的影响，为动物埋植、复合皮移植实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 低免疫原性猪真皮支架的制备

1.1.1 猪网状层真皮的制备取白色家猪边腹部皮肤，机械法制作0.5-0.6mm厚网状层真皮（组织学检查证实）。切取10mm×5mm网状层真皮54块备用。

1.1.2 实验分组及处理 54块网状层真皮组织随机分为：正常对照组（A１组）、脱细胞组（B组）、脱细胞+MMP-7组（C组）、脱细胞+MMP-7+ Genipin组（D组）和脱细胞+MMP-7+ Genipin +真空冷冻干燥组（E组），A1组6块，其余每组12块。另购Allo-ADM（北京桀亚莱福生物技术有限公司）取同样大小6块作为细胞相容性实验对照组（A２组)。

B、C、D、E 4组均先用Dispase II（美国Sigma公司）、TritonX-100（美国Sigma公司）溶液进行脱细胞处理，制成网状层Xeno-ADM；之后C、D、E 3组再用MMP-7（美国Millipore公司）溶液处理，同时用PBS代替MMP-7处理B组。在此基础上D组应用0.5% Genipin（日本WaKo公司）溶液室温下交联6h后，于饱和甘氨酸溶液中中和多余的Genipin，同时用PBS代替Genipin处理B、C组。E组先用Genipin处理，再在－40℃条件下冷冻1h后抽真空17h，置4℃密闭保存，使用前用生理盐水复水20min。

1.2 低免疫原性猪真皮支架组织学观察

1.2.1 大体观察观察各组标本颜色、质地、韧性改变和毛发残留等。

1.2.2 HE染色观察 A1、B、C、D、E组各取5块标本10﹪甲醛固定，包埋、切片后HE染色，光镜（日本Olympus，IX71）观察组织结构改变。

1.2.3 免疫组化染色观察取A1、B、C组石蜡切片脱蜡、水化、修复，鼠抗波形蛋白（Vimentin）抗体、兔抗LN抗体、兔抗Col Ⅳ抗体（美国Abcam公司）37℃孵育1h，按照SP法免疫组化试剂盒（福州迈新公司）操作步骤进行，DAB显色，苏木素复染后封片，光镜观察Vimentin、LN、Col Ⅳ阳性染色及分布情况。

1.2.4 扫描电镜观察 A1、B、C、D、E组各取1块标本经过固定、干燥、脱水、镀银后，扫描电镜（日本日立，H-800）观察胶原纤维空间结构。

1.3 细胞毒性试验

将制备好的B、C、D、E组标本用洗必泰消毒5min，无菌PBS冲洗5次后，按每3cm2表面积加入含10%FBS（美国Gibco公司）的DMEM培养液（美国Gibco公司）1ml，37℃浸提24h，制备浸提液。选用2-9代1×104/ml Fb悬液，100μl/孔接种于96孔培养板，B、C、D、E每组复种4孔，置37℃、5％CO2 孵育箱中培养24h。吸弃孔内液体，50%浸提液组每孔加50μl浸提液和50μl 培养液，100%浸提液组每孔加入100μl浸提液，阴性对照组用培养液替换，置37℃、5％CO2 孵育箱中继续培养。分别于2 d、4 d、7 d各取1块培养板，每孔加入20μl MTT(5mg/ml)溶液继续培养4-6h，吸弃孔内液体，每孔加入100μl二甲基亚砜，振荡10min后，用酶标检测仪490nm 波长测定吸光度(A)值，取4孔平均值，计算相对增值率(RGR)，根据GB/T16886.5-2003《医疗器械生物学评价》细胞毒性分级标准评价其细胞毒性。RGR=（试验组吸光值/ 对照组吸光值）×l00%。

1.4 细胞相容性实验

1.4.1 细胞培养 A2组标本用相同方法消毒、浸泡24h后，A2、B、C、D、E 5组各取6块平铺于24孔板中，取2-9代1×l06/ ml Fb悬液加入每孔，置孵育箱中培养，每天观察细胞的生长情况至14d。

1.4.2 HE及免疫组化染色取各组7d、14d标本固定、包埋、切片，HE染色后光镜观察；免疫组化染色后观察Vimentin阳性染色情况。

1.4.3 扫描电镜检查取各组14d标本扫描电镜观察Fb与标本间的结构关系。

1.4.4 细胞因子检测收集3d，7d细胞培养上清液，ELISA检测严格按试剂盒（美国BLUEGEN公司）说明书进行，于全自动酶标仪450 nm处读取A值，并根据其标准曲线计算出各样本的含量。

1.5 统计学处理

数据以

±s表示，采用SPSS13.0统计软件进行t检验和方差分析。

2 结果

2.1 低免疫原性猪真皮支架组织学观察

2.1.1 大体观察 A1、B、C 3组标本呈瓷白色，质地柔软，A1组可见含毛囊浅黄色颗粒状结构，B组毛孔处仍可见少量毛发残留，而C组则毛孔清晰未见毛发。D、E 2组标本均呈蓝黑色，质地明显变硬，韧性增加，毛孔清晰，无毛发残留。

2.1.2 HE染色观察如图1所示，A1组正常猪网状层真皮毛囊丰富，富含细胞及血管，胶原纤维排列规律。B组经脱细胞处理后，部分毛囊内仍可见毛发、上皮根鞘残留，原微血管区域可见蓝染结构，疑似破裂细胞残留成分。再经MMP-7处理后，C、D、E 3组均未见残留；其胶原纤维束及胶原纤维之间间隙均比B组增大，又经Genipin处理的D组与C组相比未见明显差异，而经真空冷冻干燥处理的E组则明显增大，间隙呈明显的空泡样改变。

2.1.3 免疫组化染色观察主要存在于（成）纤维细胞、血管内皮细胞及平滑肌细胞等间充质分化细胞胞质内的Vimentin，在A1组正常猪网状层真皮内阳性染色明显，B组经脱细胞处理后可见少量弱阳性染色，C组再经MMP-7处理后未见阳性染色。主要存在于血管基膜及毛囊玻璃膜的LN及Col Ⅳ染色部位几乎重叠，在A1组毛囊结缔组织鞘层二者阳性染色较明显，B组明显减弱，但在结缔组织鞘层的血管基膜仍可见较强阳性染色，C组仅偶见较弱阳性染色。

2.1.4 扫描电镜观察如图2所示，A1组正常猪网状层真皮可见成纤维细胞、肥大细胞等完整细胞，胶原纤维及胶原原纤维排列规则。B组经脱细胞处理后未见完整细胞，但可观察到形态不规则的碎片状颗粒。再经MMP-7处理后，C、D、E 3组均未见完整细胞及碎片状颗粒；其胶原纤维及胶原原纤维结构完整、规则，无断裂、融合等改变，可见胶原原纤维之间间隙较B组增大，又经Genipin处理的D组与C组相比未见明显差异，而经真空冷冻干燥处理的E组则明显增大。

2.2 细胞毒性试验结果

B、C、D、E 4组标本浸提液Fb培养后2、4、7d RGR及毒级见表1。根据GB/T16886.5-2003《医疗器械生物学评价》细胞毒性分级标准，4组细胞毒性均为0级或1级。

表1 相对增殖率及及细胞毒级

Figure 2012101073034100002DEST_PATH_IMAGE003

2.3 细胞相容性实验结果

2.3.1 HE染色观察　如图3所示，Fb在A2、B、C、D、E 5组标本表面均能生长增殖，并随时间延长逐渐由单层生长成复层并向标本内部生长。培养后14d，均经Genipin处理的D、E 2组表面细胞密度较高，而未经Genipin处理的C组则组织内部较明显，与A2（对照）组Fb生长情况近似。

2.3.2 免疫组化染色观察　如图4所示，各组均可见Vimentin强阳性染色，且与HE染色观察各组Fb生长分布情况相一致。

2.3.3 扫描电镜观察　如图5所示，各组标本表面均可见Fb生长附着，似分泌胶原与标本融合，D、E组表面细胞数目较A2、C组多。

2.3.4细胞因子检测结果与培养后3d相比，各组培养后7d上清液中IL-6、IL-8含量均明显升高（P＜0.01）。A2、C、D、E组培养上清液中IL-6、IL-8含量无明显差异（P＞0.05）但均高于B组（P＜0.05）。见表2。

表2 各组培养上清液中IL-6、IL-8含量的变化（pg/ml，±s）

Figure 2012101073034100002DEST_PATH_IMAGE005

注：与培养后3d相比，aP＜0.01；与B组相比，bP＜0.05

3 结论

富含抗原成分、移植后免疫原性强，结构致密、渗透性差，血管化速率慢，是Xeno-ADM存在的主要问题。研究证实，猪边腹部皮肤较薄，胶原纤维排列相对疏松；猪皮肤基底膜、乳头层结构致密，且基底膜含有丰富的LN、Col Ⅳ等高免疫原性成分。因此，选取猪边腹部皮肤网状层真皮作为制作材料。本实验结果显示，即使去除了结构致密基底膜、乳头层的网状层真皮，单纯行脱细胞处理后，网状层真皮中仍有毛发、少量细胞碎片和较多LN、Col Ⅳ等高免疫原性成分残留。MMP-7是细胞外基质降解过程中所需要的重要蛋白酶，其作用底物主要包括真皮毛囊玻璃膜及血管基膜中的Col Ⅳ、LN、巢蛋白（entactin）、纤连蛋白（FN）、细胞外粘连蛋白（VN）和蛋白多糖等，但对于Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白无作用。网状层真皮再经MMP-7处理后，免疫组化染色未见高免疫原性成分LN、Col Ⅳ，亦未发现用于检测细胞及细胞碎片的Vimentin，而且毛囊中的毛发、上皮根鞘组织已被脱除，胶原纤维连续、完整。提示MMP-7的应用除了能够脱除LN、Col Ⅳ等作用底物外，还能够脱除细胞碎片、毛发、上皮根鞘等成分，且不破坏胶原纤维及其三维结构。可能是这些成分被脱除的原因，胶原纤维束及胶原纤维之间间隙似有扩大。说明MMP-7的应用有利于进一步降低网状层真皮高免疫原性成分、增加移植后渗透性。

Genipin是天然栀子提取物京尼平苷水解后产生的一种环烯醚萜类杂环化合物，有羟基、羧基等多个活性官能团，与氨基酸或蛋白质发生交联反应后可形成一种多聚体深蓝色无毒色素。作为一种新型天然交联剂与传统交联剂相比，具有细胞毒性及基因毒性低、生物相容性良好等特点。交联后能够增加胶原纤维的张力、稳定性和持久性，具有较好的抗酶解能力，且不会改变胶原纤维原有结构。此外，Genipin交联后可使组织内自由氨基的含量降低90％以上，还可以将组织中的多肽、糖脂、脂蛋白及脂多糖等具有抗原性的成分交联形成不溶性大分子，遮蔽抗原决定簇，降低抗原性。本实验继续经Genipin处理后，与经MMP-7处理后相比，网状层真皮结构未见明显改变。关于Genipin降低抗原性、提高稳定性等作用有待于体内复杂条件下实验观察。真空冷冻干燥能使固体物质中微小冰晶升华而呈现多孔状结构，且有利于制品的长期保存。有文献报道，真空冷冻干燥处理可使ADM抗原性下降，结构变疏松，孔隙率增加，提高移植后渗透性，有利于细胞粘附与增殖。本实验结果显示，在Genipin处理基础上再经真空冷冻干燥处理后，网状层真皮胶原纤维束及胶原纤维之间间隙明显变大，结构更加疏松。提示有利于提高其移植后渗透性。

细胞毒性试验结果表明，MMP-7、Genipin、真空冷冻干燥等各因素处理后的网状层真皮细胞毒级均小于2级，说明这些处理方法是安全的。细胞相容性实验结果显示，人Fb在各组真皮表面均能生长增殖，并随时间延长逐渐由单层生长成复层并向标本内部生长。培养14d后，经Genipin处理的2组表面细胞密度较高，而仅经脱细胞、MMP-7处理组则组织内部较明显，与Allo-ADM组Fb生长情况近似。说明各处理组细胞相容性好，而试验显示同样无细胞毒性的Genipin交联组，可能因使网状层真皮组织韧性增加影响Fb向组织内部生长。有研究表明，IL-6能够促进多种细胞增殖、分化，在皮肤损伤愈合过程中可促进其他细胞因子分泌及损伤皮肤修复；IL-8在促进表皮细胞生长、增殖的同时，还能够促进创面血管化。ELISA结果显示，各组培养上清液中均含有细胞因子IL-6、IL-8，且含量随培养时间的延长、细胞数量的增加呈增长趋势，除B组外均与Allo-ADM组分泌情况近似。进一步说明单独或联合应用旨在降低抗原性、增加渗透性的各因素处理后，网状层真皮均具有良好的细胞相容性。

综上所述，脱细胞+MMP-7处理能够有效脱除网状层真皮中LN、Col Ⅳ和细胞碎片、毛发、上皮根鞘等高免疫原性成分，并可使胶原纤维束及胶原纤维之间间隙相对扩大。在此基础上应用真空冷冻干燥方法能够在保持正常组织结构的同时，进一步扩大其三维空间结构。而加用Genipin处理后可在增加胶原稳定性的同时使真皮组织的韧性增加，但可对细胞生长产生机械性影响。脱细胞+MMP-7+Genipin+真空冷冻干燥方法制备的低免疫原性猪真皮支架，无细胞毒性，细胞相容性好。

以下结合低免疫原性猪真皮支架作为修补填充物的动物实验阐述其效果

目的：观察低免疫原性猪真皮支架（“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7+Genipin+真空冷冻干燥方法制备）作为修补材料应用于腹疝的应用价值。

方法：26只SD雄性大鼠制备腹壁疝模型，随机数字表法分为腹壁疝组：疝模型组（n=6），Marlex网组(n=6)（购自美国巴德公司）和低免疫原性猪真皮支架组(n=14)：疝模型组直接缝合皮肤，其余两组分别应用大小为3.5 cm×4.0 cm的Marlex网片和低免疫原性猪真皮支架缝合皮肤；观察术后1周腹壁疝复发情况，低免疫原性猪真皮支架组修复后1周，5周，6月各取4只，HE染色后光镜下观察。术后第5周Marlex网组和低免疫原性猪真皮支架组各取6只观察腹腔内黏连情况并进行抗张力试验。

结果：术后1周低免疫原性猪真皮支架组与Marlex网组腹壁疝发生率均显著低于腹壁疝组(P < 0.001),低免疫原性猪真皮支架的胶原纤维无明显变化，有少量成纤维细胞迁移入支架边缘区域。术后5周低免疫原性猪真皮支架内部血管密度基本稳定；腹壁疝组有1只发生轻微黏连，其余无粘连（0 级），Marlex网组1 只发生了轻微粘连（1 级），其余无粘连（0 级），低免疫原性猪真皮支架组1只粘连较重（2 级），1 只发生轻微粘连（1 级），其余无粘连（0 级），各组粘连分级比较差异无统计学意义（P>0.05）。术后6 个月，低免疫原性猪真皮支架组补片及周围炎性反应消退，胶原纤维结构发生了改建，低免疫原性猪真支架和肌筋膜层由纤维结缔组织愈合。将单独低免疫原性猪真支架与Marlex网行抗张力试验，Marlex网的抗张力显著高于低免疫原性猪真支架(P<0.001)。但植入体内5周后，低免疫原性猪真支架筋膜组织的抗张力高于Marlex-筋膜组织(P < 0.05)。

结论：低免疫原性猪真皮支架可以作为疝修补材料，应用前景广阔。

低免疫原性猪真皮支架作为真皮替代物的临床试验典型病例：

病例1

患者李××，男，21岁，因天然气爆炸致全身多处烧伤4小时入院。

入院查体：T 36.5℃，P 138次/分，R 25次/分，BW 65kg。患者神志较清楚，痛苦貌，查体合作，主诉口渴明显，轻度咽痛，鼻毛烧焦，无明显声音嘶哑。躯干及四肢可见烧伤创面，头面、双手创面以混合度为主，其他创面以III度为主，呈皮革样变，触痛轻，创面污染重，渗出液多，总面积约83％，其中III约为65％，肢端湿冷，足背动脉搏动不清，可见肉眼血尿。实验室检查：血细胞分析 WBC 48.31×109/L，N 42.56×10⁹/L，M 1.93×10⁹/L，RBC 6.07×10¹²/L，Hb 196g/L，HCT 57.35％，PLT 437×10⁹/L；血离子分析 K+ 3.1mmol/L，GLU 14.5mmol/L；血气分析 pH 7.315，PCO2 39.7％，BE -5.8；尿常规 RBC 73.1个/L，LEU +，PRO +++，UGLU ++，BLD ++++。

入院诊断：1. 煤气火焰烧伤全身，总面积约83％，其中III约为65％；2. 低血容量性休克（中度）；3. 吸入性损伤（中度）。

入院后立即入住重症监护病房，建立静脉通道，快速补液抗休克，急行气管切开，广谱高效抗生素抗感染，保护脏器功能治疗，行心电监测及重症监护，密切观察病情变化。待病情稳定后，于烧伤后第6天行双下肢削痂深筋膜创面植皮术。选取左侧大腿股外侧膝上15cm区域，植入5×5cm大小低免疫原性猪真皮支架（“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7 +真空冷冻干燥方法制备）后用新鲜猪皮覆盖、无菌敷料包扎；于右侧大腿相同区域，植入相同大小异体脱细胞真皮基质(购自北京桀亚莱福生物技术有限公司)，同样用新鲜猪皮覆盖、无菌敷料包扎，作为对照。术后第7天取病理活检，HE染色及免疫组织化学染色结果示：低免疫原性猪真皮支架及异体脱细胞真皮基质内均有成纤维细胞及血管内皮细胞浸润，且有新生血管形成，无明显免疫排斥反应。术后第14天，揭除表层猪皮，取腹部自体刃厚皮覆盖创面。第二次术后2周观察创面基本愈合，皮片成活良好。伤后7月随访时见低免疫原性猪真皮支架与自体刃厚皮复合移植处，局部瘢痕轻、组织弹性好，其效果和异体脱细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植相似。

病例2

患者于××，男，34岁，因双上肢烧伤后瘢痕挛缩畸形1年入院。

入院查体：T 36.5℃，P 80次/分，R 20次/分，BP 126/80mmHg。一般情况可，神志清楚，精神好，营养可。双上肢瘢痕增生，瘢痕明显突出于皮肤表面，质硬，色微红，表面有散在皮肤溃疡，肘关节活动受限。实验室检查：（-）。

入院诊断：双上肢瘢痕挛缩畸形及溃疡。

患者入院后积极完善各项辅助检查，与第3天行双上肢瘢痕切除松解整复术，瘢痕切除后，于右侧上肢创面处植入9cm×6cm大小低免疫原性猪真皮支架（“双断层”真皮+脱细胞+MMP-7 +真空冷冻干燥方法制备）后用新鲜猪皮覆盖、无菌敷料包扎；于左侧上肢相同区域创面处，植入8cm×5cm大小异体脱细胞真皮基质（北京桀亚莱福生物技术有限公司），同样用新鲜猪皮覆盖、无菌敷料包扎，作为对照。术后第14天，揭除表层猪皮，取腹部自体刃厚皮覆盖创面。第二次术后2周观察创面基本愈合，皮片成活良好。伤后6月随访时见低免疫原性猪真皮支架与自体刃厚皮复合移植处，局部瘢痕轻、组织弹性好，其效果和异体脱细胞真皮基质与自体刃厚皮复合移植相似。

附图说明

图1是各组细胞、胶原纤维束及胶原纤维之间间隙变化HE染色观察图（×400，bar=20μm）；图2是各组扫描电镜观察结果图 (×104，bar=3μm)；图3是培养后14d各组Fb生长情况HE染色观察图（×400，bar=20μm）；图4是培养后14d C组Fb Vimentin免疫组化染色观察图(×200，bar=50μm)；图5是培养后14d E组Fb生长情况电镜扫描观察图（2×10³，bar=15μm)。

具体实施方式

本发明所述低免疫原性猪真皮支架的制备方法，包括如下步骤：

①制备“双断层”真皮：a.将家猪处死去毛，剥离其皮肤和部分皮下组织，消毒冲洗；

b.先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层保留0.5-0.6mm厚真皮网状层，即为“双断层”真皮；

②脱细胞处理：a.配制2.5U/ml中性蛋白酶（Dispase II）溶液及体积分数0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）溶液；

b.先将步骤①中所述“双断层”真皮置于2.5U/mlDispase II溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层”真皮至少需要2.5ml的2.5U/mlDispase II溶液；再将“双断层”真皮取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”真皮置入体积分数0.5% TritonX-100溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的“双断层”真皮至少需要5ml的体积分数0.5% TritonX-100溶液；取出“双断层”真皮，PBS洗涤5次，每次5min；该工序能脱除“双断层”真皮中的细胞成分，将其制成 “双断层”异种脱细胞真皮基质，即“双断层” Xeno-ADM；

③基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)处理：先将步骤②所述“双断层” Xeno-ADM置于0.5 U /ml MMP-7溶液中，于4℃条件下作用12-16h，再于37℃条件下作用8h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层” Xeno-ADM需要至少2.5ml的MMP-7浸泡；再将“双断层” Xeno-ADM取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层” Xeno-ADM置入体积分数0.5%TritonX-100溶液内，于25℃下，振荡洗涤24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层” Xeno-ADM至少需要5ml体积分数0.5%TritonX-100溶液进行振荡洗涤；PBS充分洗涤5次，每次10min；该步骤处理能脱除“双断层” Xeno-ADM中层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）及其他高抗原性成分，将“双断层” Xeno-ADM制成网状层真皮支架；所述的其他高抗原性成分还包含同位于真皮毛囊玻璃膜及血管基膜中的巢蛋白，以及细胞外基质中的纤连蛋白、细胞外粘连蛋白和蛋白多糖；

④真空冷冻干燥处理：将上一步骤的网状层真皮支架在－40℃条件下冷冻1h，之后抽真空17h，以进一步降低网状层真皮支架免疫原性，扩大其相对空间结构，提高渗透性，从而制成低免疫原性猪真皮支架。

为提高所述低免疫原性猪真皮支架的韧性、降低其降解速率，使其适于组织缺损埋植作为修补填充物，增加以下处理步骤：经步骤③处理后得到的网状层真皮支架，在进行步骤④真空冷冻干燥处理前，先应用京尼平（Genipin）处理，以增强网状层真皮支架的韧性、降低其降解速率；京尼平（Genipin）处理操作如下：网状层真皮支架应用0.5% （w/v）的京尼平（Genipin）溶液，在25℃下交联6h；之后，再置入25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中中和多余的京尼平（Genipin），每平方厘米的0.5-0.6mm网状层真皮支架至少需要在2.5ml的25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中进行中和处理。

完成步骤①中所述的b工序的设备可以是用皮革剖层机。所述步骤④的a工序可由真空冷冻干燥机完成。

为增强脱细胞的效果，所述步骤②的b工序中所述的所有操作过程，都辅以连续振荡。

所述步骤①中的“双断层”真皮的切取尺寸可为100mm×100mm，以便于实际使用。

所述步骤①中所述的家猪是健康白色家猪，可使所述支架移植后，色泽与周围皮肤相近。

为便于工业化生产过程中实际操作，通常步骤①中a工序所述，剥离其皮肤和部分皮下组织，其剥离总厚度为2-4mm。步骤①中b工序所述, 先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层；被削除的表皮及真皮乳头层厚度是1-2mm，被削除的皮下组织及与其相连的真皮部分网状层厚度是1.5-2.5mm，确保保留真皮网状层厚度为0.5-0.6mm。获得0.5-0.6mm厚真皮网状层后，应进行组织学检查，若发现有残留的真皮乳头层或皮下组织，应对0.5-0.6mm厚真皮网状层再进行一次残留组织的剥离处理，以确保所述支架的制作质量。

步骤①中a工序所述消毒冲洗具体操作如下：将所述的皮肤和部分皮下组织置入0.1%（w/v）新洁尔灭溶液中浸泡消毒10-15min，取出后用等渗盐水冲洗3次，再置抗生素盐水溶液中浸泡10min；抗生素盐水溶液是由每500ml等渗盐水中加庆大霉素32万U而制得的溶液。

Claims

1.低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

①制备“双断层”真皮：a.将家猪处死去毛，剥离其皮肤和部分皮下组织，消毒冲洗；

b.先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层,保留0.5-0.6mm厚真皮网状层，即为“双断层”真皮；

②脱细胞处理：a.配制2.5U/ml中性蛋白酶（Dispase II）溶液及体积分数0.5%聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）溶液；

b.先将步骤①中所述“双断层”真皮置于2.5U/ml Dispase II溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层”真皮至少需要2.5ml的2.5U/ml Dispase II溶液；再将“双断层”真皮取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”真皮置入体积分数0.5% TritonX-100溶液中，于4℃条件下作用24h，每平方厘米的“双断层”真皮至少需要5ml的体积分数0.5% TritonX-100溶液；取出“双断层”真皮，PBS洗涤5次，每次5min；该工序能脱除“双断层”真皮中的细胞成分，将其制成 “双断层”异种脱细胞真皮基质，即“双断层”Xeno-ADM；

③基质金属蛋白酶-7 (MMP-7)处理：先将步骤②所述“双断层”Xeno-ADM置于0.5 U/ml MMP-7溶液中，于4℃条件下作用12-16h，再于37℃条件下作用8h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层” Xeno-ADM需要至少2.5ml的MMP-7溶液浸泡；再将“双断层”Xeno-ADM取出，PBS洗涤3次，每次5min；然后，将“双断层”Xeno-ADM置入体积分数0.5% TritonX-100溶液内，于25℃下，振荡洗涤24h，每平方厘米的0.5-0.6mm“双断层”Xeno-ADM至少需要5ml体积分数0.5% TritonX-100溶液进行振荡洗涤；PBS充分洗涤5次，每次10min；该步骤处理能脱除“双断层”Xeno-ADM中层粘连蛋白（LN）、Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）及其他高抗原性成分，将“双断层” Xeno-ADM制成网状层真皮支架；

④真空冷冻干燥处理：将上一步骤的网状层真皮支架在－40℃条件下冷冻1h，之后抽真空17h，以进一步降低网状层真皮支架免疫原性，扩大其相对空间结构，提高渗透性，从而制成低免疫原性猪真皮支架。

2.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：经步骤③处理后得到的网状层真皮支架，在进行步骤④真空冷冻干燥处理前，先应用京尼平（Genipin）处理，以增强网状层真皮支架的韧性、降低其降解速率；京尼平（Genipin）处理操作如下：网状层真皮支架应用0.5%（w/v）的京尼平（Genipin）溶液，在25℃下交联6h；之后，再置入25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中中和多余的京尼平（Genipin），每平方厘米的0.5-0.6mm网状层真皮支架至少需要在2.5ml的25%（w/v）饱和甘氨酸溶液中进行中和处理。

3.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：完成步骤①中所述的b工序的设备是用皮革剖层机。

4.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤②的b工序中所述的所有操作过程，都辅以连续振荡。

5.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤④的a工序由真空冷冻干燥机完成。

6.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：所述步骤①中的“双断层”真皮的切取尺寸为100mm×100mm。

7.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：步骤①中b工序所述, 先削除皮肤的表皮及真皮乳头层，再削除皮下组织及与其相连的真皮部分网状层；被削除的表皮及真皮乳头层厚度是1-2mm，被削除的皮下组织及与其相连的真皮部分网状层厚度是1.5-2.5mm，确保保留真皮网状层厚度为0.5-0.6mm。

8.根据权利要求1所述的低免疫原性猪真皮支架的制备方法，其特征在于：步骤①中a工序所述消毒冲洗具体操作如下：将所述的皮肤和部分皮下组织置入0.1%（w/v）新洁尔灭溶液中浸泡消毒10-15min，取出后用等渗盐水冲洗3次，再置抗生素盐水溶液中浸泡10min；抗生素盐水溶液是由每500ml等渗盐水中加庆大霉素32万U而制得的溶液。