KR100970193B1

KR100970193B1 - 각막 제조용 투명 콜라겐 기질의 제조방법

Info

Publication number: KR100970193B1
Application number: KR1020070069419A
Authority: KR
Inventors: 박정극; 서영권; 정수현; 안재일; 송계용
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2007-07-11
Filing date: 2007-07-11
Publication date: 2010-07-14
Also published as: KR20090006256A

Abstract

본 발명은 각막 제조용 투명 콜라겐 기질의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 1) 인간으로부터 분리·배출된 조직을 콜라게나아제(collagenase), 프로테아제(protease) 또는 이들의 혼합물로 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1에서 효소처리된 조직을 염기 존재 하에 과산화수소(H₂O₂)와 반응시켜 당단백질을 제거하는 단계; 3) 상기 단계 2에서 얻어진 조직을 공기 중에 건조시켜 투명 콜라겐 기질을 수득하는 단계; 및 4) 상기 단계 3에서 얻어진 투명 콜라겐 기질을 가교결합시키는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조된 투명 콜라겐 기질은, 인체의 피부조직 또는 제대조직을 사용하여 이식시 문제시되는 면역반응(immune response)을 거의 일으키지 않아 생착률이 높으면서도 기계적 물성이 우수하므로, 각막이식 및 생인공각막 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

각막 제조용 투명 콜라겐 기질의 제조방법{PROCESS FOR PREPARING TRANSPARENT COLLAGEN SUBSTRATE USED FOR CORNEA PREPARATION}

본 발명은 각막 제조용 생인공각막에 사용되는 투명 콜라겐 기질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 약물 치료의 한계가 있는 질환의 경우, 환부에 건강한 조직을 이식하는 조직이식법이 적용된다. 그러나, 실질적으로 이러한 이식용 조직의 공급이 충분치 않아 기증자의 조직을 대신할 인공조직에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 조직공학(tissue engineering) 분야에서는 이식에 사용될 생체 조직 또는 장기를 재생하기 위해 세포를 생체적합한 기질상에 3차원적으로 배양하는 세포-기질 복합체에 대한 연구가 이루어지고 있다. 이러한 세포-기질 복합체는 이식 후 초기 신생 혈관이 형성되기 전까지 체액의 확산에 의해 산소 및 영양분을 공급받으며, 혈관 형성이 이루어지면 혈액의 공급으로 증식 분화하여 새로운 조직 또는 장기를 형성하면서 고분자 기질이 분해되게 된다. 최근에는 세포-기질 복합체를 이용한 이식 치료법이 이미 인공피부, 인공골, 인공연골, 인공혈관 등의 개발과 함께 임상에 적용되고 있다.

전 세계적으로 약 천만명 이상의 각막손상 환자들이 각막이식을 필요로 하고 있으며, 여러 나라에서 안은행(eye banking)을 설립하여 각막 확보에 노력하고 있다. 그러나, 대부분의 나라에서 이식용 각막의 공급이 수요에 훨씬 못미치고 있어, 인공각막에 대한 요구가 계속적으로 증가되고 있다.

인공각막에 대한 지금까지의 연구들을 살펴보면, 기존 비분해성 폴리머로 제조된 인공각막(최웅산 외, 대한안과학회지, 39, 227-243, 1998)의 경우 각막에 단백질 등이 흡착되어 다시 혼탁이 진행되는 문제점이 있으며, 예를 들면 대한민국 특허공개 제2000-46272호에서는 폴리머로 제조된 인공각막을 제시하고 있으나 세포 및 단백질의 흡착을 해결하지 못하였다. 이러한 흡착 문제를 해결하고자 대한민국 특허공개 제2001-36249호에서는 폴리머의 표면을 친수화시킨 폴리메틸메타크릴레이트를 제시하고 있으나, 일정기간이 지난 후 재이식을 해야하고 외관상 인공 각막이 노출되는 문제점이 있었다.

따라서, 최근에는 폴리머 각막의 문제점을 해결하고자 이식후 생착되어 환자자신의 조직으로 재구성되는 생인공각막에 대한 연구가 이루어지고 있으며, 예를 들면, 미나미 및 그리피스 등(Minami. 등, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 34, 2316-2324, 1993; 및 Griffith. 등, SCIENCE, 286, 2169-2172, 1999)은 각막섬유모세포가 함유된 콜라겐 젤에 각막상피세포 및 각막내피세포를 배양하여 제조한 젤형 생인공각막을 제시하고 있으나, 물성이 약해 전층 각막 이식이 불가능한 단점이 있다. 또한, 코이즈미 등(Koizumi. 등, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 41, 2506-2513, 2000)은 각막상피세포를 양막에 배양하여 제조한 표피층 생인공각막을 제시하고 있으나 역시 각막 상피층의 손상에만 적용될 수 있는 한계가 있으며, 그리피스 등(Griffith 등, Cornea, 21, S54-61, 2002)은 동물로부터 분리시킨 콜라겐을 가교결합시켜 얻어진 필름 상에 각막 상피세포를 배양시켜 제조한 생인공각막을 제시하였으나 역시 기질의 물성 저하로 빨리 분해되는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 생체적합성 및 기계적 물성이 우수한 각막 제조용 기질을 개발하기 위해 예의 연구한 결과, 피부조직 또는 제대조직으로부터 얻어진 콜라겐을 투명하게 처리한 후 가교결합시켜 제조하는 콜라겐 기질의 제조방법이 생체적합성이 높아 이식시 면역반응을 거의 일으키지 않으면서도 기계적 물성이 우수한 투명 콜라겐 기질을 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 이식 후 면역거부 반응이 거의 일어나지 않아 생착율이 높으면서도 기계적 물성이 우수한 각막 제조용 기질의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 각막 제조용 기질을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 1) 인간으로부터 분리·배출된 조직을 콜라게나아제(collagenase), 프로테아제(protease) 또는 이들의 혼합물로 처리하는 단계; 2) 상기 단계 1에서 효소처리된 조직을 염기 존재 하에 과산화수소(H₂O₂)와 반응시켜 당단백질을 제거하는 단계; 3) 상기 단계 2에서 얻어진 조직을 공기 중에 건조시켜 투명 콜라겐 기질을 얻는 단계; 및 4) 상기 단계 3에서 얻어진 투명 콜라겐 기질을 가교결합시키는 단계를 포함하는, 각막 제조용 투명 콜라겐 기질의 제조방법을 제공한다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 각막 제조용 투명 콜라겐 기질을 제공한다.

본 발명에 따라 수술 등에 의해 인간으로부터 분리·배출된 피부조직 또는 제대조직으로부터 제조된 투명 콜라겐 기질은, 생분해성 특성에 따라 이식 후 적절한 시기에 분해되면서도 기존 기질로 사용되고 있는 인공합성기질 또는 천연-인공 복합기질에 비해 면역반응을 거의 일으키지 않아 생체적합성이 높으며, 우수한 물성 및 분해저항성을 가지므로, 생인공 각막 이식 분야 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 단계 1에서는, 인간으로부터 분리·배출된 피부조직 또는 제대조직을 콜라게나아제, 프로테아제 또는 이들의 혼합물로 처리하여 콜라겐의 구조를 재구성한 후 알콜로 세척하여 처리효소를 제거하게 된다.

이때, 상기 피부조직 또는 제대조직으로는 수술 등으로 분리·배출된 인간의 피부조직 또는 제대조직을 사용하게 되며, 피부조직의 경우 이식용 각막상피세포의 부착 및 증식을 방해할 수 있는 상피층을 제거하기 위해, 분리된 조직을 트립신 또는 디스파아제 등의 프로테아제(protease)로 처리하여 진피만을 분리해내어 사용할 수 있고, 제대조직의 경우에는 튜브형태를 반으로 자른 뒤 표면에서 약 1 mm 두께로 얇게 잘라내어(포를 떠서) 사용할 수 있다. 또한, 조직 공여자의 나이가 많은 경우에는 디스파아제 및 콜라게나아제를 1:1로 혼합한 것을 처리하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 콜라게나아제, 프로테아제 또는 이들의 혼합물로는 미생물발효 또는 동물유래효소를 분리정제하여 얻어낸 것이나 시판되고 있는 것으로, 예를 들면 트립신, 디스파아제 또는 아큐타아제 등을 사용할 수 있으며, 트립신 또는 아큐타아제의 경우 0.05 내지 0.25%(w/v) 농도로, 그리고 디스파아제의 경우 0.1 내지 0.4%(w/v) 농도로 사용할 수 있다. 이러한 효소 처리는 효소특성에 따라 4℃에서 24 내지 48시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

본 발명의 단계 2에서는, 콜라겐 기질의 생착률을 높이기 위해, 세척된 조직을 염기 존재 하에 과산화수소와 반응시켜 당단백질을 제거하게 된다.

이때, 염기로는 수산화나트륨 등을 0.01 내지 5 M, 바람직하게는 0.1 내지 1 M로 사용할 수 있으며, 과산화수소는 0.01 내지 1%(v/v), 바람직하게는 0.1 내지 0.5%(v/v) 농도 범위로 사용할 수 있다. 또한, 상기 반응은 4 내지 25℃, 바람직하게는 4 내지 8℃에서 6 내지 24시간, 바람직하게는 12 내지 16시간 동안 수행될 수 있다.

또한, 상기 단계 2에서는, 조직내 과산화수소의 침투율을 높이기 위해, 과산 화수소와의 반응 전에 조직을 산처리하는 공정을 추가로 수행할 수 있으며, 이때 산으로는 아세트산, 염산 등을 0.01 내지 5 M, 바람직하게는 0.05 내지 1 M로 사용할 수 있다.

본 발명의 단계 3에서는, 상기 단계 2에서 당단백질이 제거된 조직을 공기중에 건조시켜 투명 콜라겐 기질을 수득하게 된다.

이때, 상기 건조 공정은 4 내지 25℃, 바람직하게는 4℃에서 12 내지 72시간, 바람직하게는 24 내지 48시간 동안 공기 중에서 수행될 수 있다. 이렇게 건조시켜 얻어진 콜라겐 기질은 실제 인체의 각막구조와 유사한 평행한 물결모양 구조를 나타내며 투명성이 우수하다.

단계 4에서는, 단계 3에서 얻어진 투명 콜라겐 기질을 가교결합시키게 된다.

이때, 가교결합은 물리적 또는 화학적으로 수행될 수 있으며, 물리적 가교결합의 경우에는 진공하에 105 내지 110℃에서 열건조(예를 들면, 105℃에서 72시간 동안 수행)시키거나, 4 내지 25℃의 온도 및 10 내지 30 W의 전력조건 하에 UV 조사(예를 들면, 4℃ 및 10 W의 조건에서 254 ㎚의 UV를 4시간 동안 조사)시켜 수행될 수 있고, 화학적 가교결합의 경우에는 4 내지 25℃에서 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드 또는 카보디이미드를 처리하여 수행될 수 있다. 또한, 이러한 가교결합은 6 내지 24시간, 바람직하게는 12 내지 16시간 동안 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인체 피부로부터 진피 분리

중앙대학교 의과대학 병원으로부터 포경수술 환자 3명으로부터 배출된 피부조직을 회수하여 4℃ 조건하에 DMEM 배지(Gibco)에 담아 운반하였으며, 분리된 조직을 70% (v/v) 에탄올로 1분간 세척한 후 항생제가 들어있는 인산염 완충용액(PBS)에 담가 3분간 충분히 세척하였다. 세척된 조직을 2 mg/ml의 디스파아제(dispase(protease), P-3417, Sigma, USA) 또는 0.05%(w/v) 트립신(tripsin, Sigma)으로 처리하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이때, 비교를 위해 상기 각 조직의 일부를 프로테아제 대신 1 M 염화나트륨(NaCl)만으로 37℃에서 8시간 동안 처리하였다.

상기에서 얻어진 조직들을 관찰한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 프로테아제 처리된 조직들은 염화나트륨만으로 처리한 경우와 비교하여 멜라닌과 표피가 완전히 제거된 것을 확인하였다.

실시예 2: 진피로부터 투명 콜라겐 기질의 제조

상기 실시예 1에서 얻어진 각 조직을 대상으로 하기 표 1에 제시된 조건에 따라 2 단계의 당단백질 제거 공정을 수행하였으며, 당단백질이 제거된 조직을 각각 4℃ 공기 중에서 건조시켜 투명 콜라겐 기질을 수득하였다.

상기 표 1에 제시된 각 방법에 따라 수득된 투명 콜라겐 기질을 인쇄용지 상의 알파벳 A위에 놓고 관찰하여, 그 결과를 도 2a에 나타내었다.

그 결과, 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이, 모두 우수한 투명성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3: 동물이식 검사

흰쥐(Sprague-Dawley, 일본)의 등 부위 5군데를 1 ㎝로 절개한 후, 포켓을 이용하여 각각 상기 실시예 2의 방법 1 내지 4에 따라 얻어진 본 발명에 따른 투명 콜라겐을 이식하였다. 이식 후 2주에 쥐를 도살하고, 흰쥐의 피부를 절개한 뒤 피부와 근막을 벌리고 이식했던 조직을 분리해낸 후, 분리된 조직을 각각 4%(v/v) 포름알데히드(formaldehyde) 용액으로 고정한 후, 알코올로 탈수, 자일렌으로 청명, 그리고 파라핀(paraffin)에 포매하였으며, 각 포매된 기질을 절단한 후 헤마톡실린/에오신(hematoxlyn/eosin, H/E)으로 염색하여 현미경(니콘현미경, Nikon ECLIPSE TS 100)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 투명 콜라겐 기질을 이식한 경우 모두 염증세포의 침윤이 거의 일어나지 않은 것을 확인하였으며, 특히 0.05 M 아세트산으로 처리한 콜라겐 기질(방법 1 및 2)보다는 1 M 아세트산으로 처리한 콜라겐 기질(방법 3 및 4)을 이식한 경우에 염증세포가 거의 관찰되지 않는 것을 확인하였다.

실시예 4: 제대조직을 이용한 투명 콜라겐 기질의 제조

제왕절개 후 버려진 태반(입수처: 은혜산부인과)으로부터 제대조직을 분리하여 4℃ 조건하에 DMEM 배지(Gibco)에 담아 운반하였으며, 분리된 조직을 항생제 함유 인산염 완충용액(PBS)에 담가 3분간 충분히 세척하였다. 세척된 제대조직을 반달모양으로 절개한 뒤 넓게 펴서 얇게 포를 뜨듯이 편평한 조직을 회수하였다. 회수된 조직을 2 mg/ml의 디스파아제 또는 0.05%(w/v) 트립신 또는 아큐타아제(Accutase, AT104, Innovative Cell Technologies, USA)로 처리하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰으며, 이를 알콜로 세척한 후 다시 0.1%(v/v) H₂O₂/0.1 M NaOH 용액으로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 결과 얻어진 콜라겐을 4℃에서 공기 중에 건조시켜 투명 콜라겐 기질을 수득하였으며, 수득한 투명 콜라겐 기질을 클린벤치 UV에 6시간 노출시켜 본 발명에 따른 투명 콜라겐 기질을 수득하였다.

수득한 콜라겐 기질을 관찰한 결과, 도 4의 (a)에 나타낸 바와 같이, 우수한 투명성을 갖는 것을 확인하였다.

실시예 5: H/E 염색 분석

본 발명에 따른 투명 콜라겐 기질의 조직학적구조 및 세포적합성을 확인하기 위해, 조직검사학(전국임상병리교수협의회, 고려의학, 1992) 및 병리조직특수염색도감(김주호, 신광출판사 1993)에 제시된 방법에 따라 다음과 같이 분석하였다.

상기 실시예 2의 방법 4에서 얻어진 투명 콜라겐 기질을 8시간 동안 UV 조사하여 가교결합시켰다. 이렇게 피부조직으로부터 얻어진 투명 콜라겐 기질과 실시예 4의 제대조직으로부터 얻어진 투명 콜라겐 기질을 각각 4%(v/v) 포름알데히드(formaldehyde) 용액으로 고정한 후, 알코올로 탈수, 자일렌으로 청명, 그리고 파라핀(paraffin)에 포매하였으며, 각 포매된 기질을 절단하여 헤마톡실린/에오신(hematoxlyn/eosin, H/E)으로 염색 후 광학현미경(니콘현미경, Nikon ECLIPSE TS 100)으로 관찰하여 그 결과를 도 3(피부조직) 및 4(제대조직)에 각각 나타내었다.

그 결과, 본 발명에 따라 피부조직 또는 제대조직으로부터 제조된 투명 콜라겐 기질은, 각각 도 3의 (b) 및 도 4의 (a)에서 볼 수 있는 바와 같이, 투명성이 우수한 것을 확인하였으며, 각각 도 3의 (c) 및 (d)와 도 4의 (b) 및 (c)에서 볼 수 있는 바와 같이, 실제 각막(도 4의 (e))과 유사하게 일정한 물결모양의 구조를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 투명 콜라겐 기질은 생체 적합성 및 투명성이 우수하여 각막이식용으로 적합함을 알 수 있다.

실시예 6: 인장강도 측정( tensile strength test )

상기 실시예 5에서 사용된 것과 동일한 피부조직 및 제대조직으로부터 얻어진 투명 콜라겐 기질, 및 비교를 위해 기존 방법(Ronald 등, Journal of biomedical materials research, 25, 267-276, 1991)에 따라 콜라겐 용액으로 제조된 콜라겐 필름을 각각 6×20 ㎜의 크기로 자른 후, 각각을 대상으로 인장강도 측정기(Universal testing machine, HOUSFIELD, 영국)를 이용하여 4 ㎜/분의 속도로 잡아당겼을 때의 인장강도(tensile strength)를 측정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 투명 콜라겐 기질은 콜라겐 필름(콜라겐 필름)과 비교하여 약 30 내지 50배 정도의 높은 인장강도를 나타내었다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 투명 콜라겐 기질은 생체적합성 뿐 아니라 기계적 물성도 우수한 것을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 투명 콜라겐 기질은 기존 생인공각막용 기질과 비교하여 물성 및 투명성이 뛰어날 뿐 아니라 생체적합성이 우수하여 이식수술시 우려되는 면역거부반응의 위험성이 적으므로, 각막이식 및 생인공각막 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 3명의 포경수술 환자로부터 배출된 피부조직을 염화나트륨 또는 디스파아제로 처리 후 관찰한 사진이고,

도 2a는 실시예 2의 방법 1 내지 4에 따라 얻어진 투명 콜라겐을 알파벳 A 위에 올려놓고 투명성을 확인한 사진이고,

도 2b는 실시예 2의 방법 1 내지 4에 따라 얻어진 투명 콜라겐을 흰쥐 피하에 이식 후 2주에 H/E 염색으로 염증정도를 확인한 현미경 사진이고,

도 3은 본 발명에 따라 피부조직으로부터 얻어진 투명 콜라겐 기질의 투명도 및 조직검사결과를 확인한 사진이고,

a: 알파벳 A, b: 알파벳 A위에 놓인 투명 콜라겐 기질,

c: 40배 확대, d: 200배 확대

도 4는 본 발명에 따라 제대조직으로부터 얻어진 투명 콜라겐 기질의 투명도 및 조직검사결과를 확인한 사진이고,

a: 알파벳 A위에 놓은 투명 콜라겐 기질,

b: 40배 확대, c: 200배 확대, d: 토끼각막(100배 확대)

도 5는 본 발명에 따라 각각 피부조직 및 제대조직으로부터 얻어진 투명 콜라겐 기질, 및 기존 방법(Ronald 등, Journal of biomedical materials research, 25, 267-276, 1991)에 따라 제조된 콜라겐 필름의 인장강도를 측정한 결과이다.

Claims

1) 인간으로부터 분리·배출된 조직을 콜라게나아제(collagenase), 프로테아제(protease) 또는 이들의 혼합물로 처리하는 단계;

2) 상기 단계 1에서 효소처리된 조직을 염기 존재 하에 과산화수소(H₂O₂)와 반응시켜 당단백질을 제거하는 단계;

3) 상기 단계 2에서 얻어진 조직을 공기 중에 건조시켜 투명 콜라겐 기질을 수득하는 단계; 및

4) 상기 단계 3에서 얻어진 투명 콜라겐 기질을 가교결합시키는 단계를 포함하는, 각막 제조용 투명 콜라겐 기질의 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 1에서, 상기 인간으로부터 분리·배출된 조직이 피부조직 또는 제대조직인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 2 항에 있어서,

상기 피부조직이 상기 단계 1 전에 프로테아제로 전처리되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 3 항에 있어서,

상기 프로테아제가 트립신 또는 디스파아제인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 콜라게나아제, 프로테아제 또는 이들의 혼합물이 트립신, 디스파아제, 아큐타아제 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 5 항에 있어서,

상기 트립신 또는 아큐타아제가 0.05 내지 0.25%(w/v) 농도로 사용되고, 상기 디스파아제가 0.1 내지 0.4%(w/v) 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 2에서, 염기가 수산화나트륨인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 2에서, 염기가 0.1 내지 1 M로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 2에서, 과산화수소가 0.1 내지 0.5%(v/v) 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 2가 단계 1에서 효소처리된 조직을 과산화수소와 반응시키기 전에 산처리하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 3의 건조 공정이 4 내지 25℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 4의 가교결합이 투명 콜라겐 기질을 진공하에 열건조하거나, UV 조사하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항에 있어서,

상기 단계 4의 가교결합이 투명 콜라겐 기질을 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드 또는 카보디이미드로 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된 각막 제조용 투명 콜라겐 기질.