CN114949357B - 一种阴茎脱细胞支架及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阴茎脱细胞支架及其制备方法和应用，所述阴茎脱细胞支架为在脱细胞的阴茎组织中进行肝素化修饰，且肝素化修饰后种植人脐静脉内皮细胞。采用本发明的制备方法可成功地将阴茎组织中的细胞脱去，且细胞外基质保存良好；成功地将肝素交联到阴茎脱细胞支架上，为细胞生存提供了更好的微环境，有利于内皮细胞的黏附与增殖；并将人脐静脉内皮细胞重新植入肝素化脱细胞支架以促进血管化。构建的阴茎脱细胞支架具有良好的组织相容性和血管再生能力，有效的去除细胞成分，降低免疫原性，血管再生能力也为移植组织提供营养成分和氧气，避免了移植物的坏死，可用于在阴茎组织工程中进一步研究。

Description

一种阴茎脱细胞支架及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及阴茎组织工程技术领域，尤其涉及一种阴茎脱细胞支架及其制备方法和应用；具体地，所述阴茎脱细胞支架为在脱细胞的阴茎组织中进行肝素化修饰后，种植人脐静脉内皮细胞。
背景技术
近年来，用于替代缺陷组织的组织工程领域取得了快速进展。在再生医学的不同学科中，包括泌尿外科，组织工程的重要性越来越大。组织工程的生物材料可分为合成聚合物、生物聚合物和支架。合成聚合物，包括聚L-乳酸、聚乙二醇和聚L-乳酸-聚乙二醇，可以用定制的结构来制造。工程化的自体软骨棒已被用作兔子模型的阴茎假体，但这些假体并没有恢复身体功能。
男性生殖器在男性心理上起着重要作用，阴茎缺失的心理影响往往是有害的。肿瘤性疾病、泌尿生殖系统创伤和其他疾病可导致严重的阴茎缺损，需要重建。由于阴茎的解剖和功能的复杂性，以及兼容移植的可用性所带来的限制，这是一个重大挑战。
目前，阴茎重建的主要形式包括带脚皮瓣和自由显微外科皮瓣，这两种皮瓣再现阴茎复杂结构的能力都很有限，而且往往伴有明显的供体部位并发症。尽管传统的整形手术在许多情况下可以产生令人满意的结果，但它仍然充满了明显的供体部位发病率、假体挤出和灾难性的感染。此外，越来越多的外伤性阴茎缺失和伴有肢体损伤的患者，特别是战时受伤的患者，由于缺乏足够的供体部位，不适合进行自体重建。器官异体移植仍然是实现多功能器官最佳恢复的首选治疗方法。然而，患者必须终身服用免疫抑制药物，主要风险包括感染和恶性肿瘤。因此，迫切需要开发替代方法来管理阴茎缺失。
脱细胞支架由经化学和物理的方法去除异体或异种组织中的细胞，形成无免疫原性或低免疫原性的材料构建的组织工程支架。与前面提到的这些材料相比，脱细胞支架具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。而如何在合理的时间内实现再内皮化，以减少支架的血管血栓和炎症压力，是各种脱细胞支架在实际应用中面临的共同问题。另一个问题是移植物在体内的血栓形成。已经采取了不同的措施来改变支架，包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽。最近，由于肝素的药理特性，如抗凝血和抗炎，它在修饰脱细胞支架方面受到越来越多的关注。带有固定化肝素的脱细胞猪小肠粘膜下层(SIS)支架有可能大大改善抗凝血活性。此外，内皮细胞被认为在血管生成中具有生理作用，并已被用于组织工程的许多方面。
基于考虑到阴茎的特点，阴茎支架的血管化和神经化仍然是一个主要障碍，细胞生长需要充足的血液供应，否则可能因缺血而发生坏死。血管化不良仍然是制造人工器官的一个主要挑战。脱细胞过程会损伤内皮细胞，血液与细胞外基质(ECM)直接接触会诱发血栓形成。因此，再内皮化不仅能减少血栓形成的概率，而且还能促进新血管的形成。虽然目前提出了各种细胞再植的方法来促进血管的形成，但关于阴茎组织的肝素化构建及其再内皮化的研究却鲜有报道。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明对阴茎脱细胞支架(DPSs)中肝素的共价结合进行了研究，还探讨了肝素联合脐静脉内皮细胞脱细胞支架(HEP-HUVECs-DPSs)促进血管生成的可能机制，HEP-HUVECs-DPSs显示出明显的细胞粘附能力和血管生成能力，上述HEP-HUVECs-DPSs的构建为克服可移植阴茎组织相关的缺陷以及建立功能性血管提供了新的依据。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种阴茎脱细胞支架，所述阴茎脱细胞支架为在脱细胞的阴茎组织中进行肝素化修饰。
进一步地，所述阴茎脱细胞支架在肝素化修饰后种植人脐静脉内皮细胞。
进一步地，所述脱细胞的阴茎组织为脱细胞的阴茎海绵体。
本发明的第二个方面是提供一种阴茎脱细胞支架的制备方法，其包括：
步骤1)构建阴茎脱细胞支架：取出大鼠的阴茎海绵体，进行脱细胞处理以去除细胞成分，形成多孔支架，获得细胞外基质完整的阴茎脱细胞支架；
步骤2)对所述阴茎脱细胞支架进行肝素化修饰：对肝素进行预定时间的活化羧基处理后，将阴茎脱细胞支架与活化羧基后的溶液混合以进行肝素的修饰，去除未能结合的肝素，灭菌，获得肝素化修饰的阴茎脱细胞支架。
进一步地，在上述制备方法中，所述步骤1)中，所述阴茎海绵体的取出步骤包括：SD大鼠安乐死后，将抗凝血剂注入下腔静脉，以避免血栓形成；在下腹正中做切口，向下延长暴露阴茎组织，在阴茎脚处剪断，去除多余的脂肪和肌肉组织，取出阴茎海绵体，整个过程保持无菌。
进一步地，在上述制备方法中，所述步骤1)中，所述脱细胞处理的具体步骤包括：将所述阴茎海绵体在磷酸盐缓冲盐水中浸泡预定时间后，换用预定浓度的Triton X-100/氢氧化铵的蒸馏水溶液浸泡预定时间，直到阴茎组织变得半透明，形成多孔支架；用蒸馏水冲洗阴茎组织，用磷酸盐缓冲盐水再浸泡，以清除剩余的细胞碎片并保持等渗性，获得细胞外基质完整的阴茎脱细胞支架。
进一步地，在上述制备方法中，所述步骤2)中，所述肝素化修饰的具体步骤包括：在吗啉乙磺酸缓冲液中加入预定配比的肝素、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应预定时间以激活肝素的羧基；将所述脱细胞阴茎支架放在活化羧基后的缓冲液中，充分混合以进行肝素的结合，预定时间后用磷酸盐缓冲盐水冲洗肝素化的脱细胞阴茎支架，去除未能结合的肝素，用紫外线灭菌，获得肝素化修饰的阴茎脱细胞支架。
进一步地，在上述制备方法中，在所述步骤2)之后，还包括：步骤3)人脐静脉内皮细胞的种植：将人脐静脉内皮细胞与肝素化修饰的阴茎脱细胞支架共培养，采用多点穿刺脱细胞支架进行细胞移植。
进一步地，在上述制备方法中，所述步骤3)中，所述人脐静脉内皮细胞的种植的具体步骤包括：将1×105～1×107人脐静脉内皮细胞与肝素化修饰的阴茎脱细胞支架用内皮培养基进行共培养，定期更换内皮培养基，定期用注射器做多点穿刺脱细胞支架进行细胞移植，预定时间后获得再内皮化肝素化修饰的阴茎脱细胞支架。
进一步地，在一具体实施方案中，上述制备方法具体包括步骤：
步骤A)阴茎脱细胞支架的构建；
SD大鼠安乐死后，将抗凝血剂肝素100IU/kg注入下腔静脉，以避免血栓形成；在下腹正中做切口，向下延长暴露阴茎组织，在阴茎脚处剪断，去除多余的脂肪和肌肉组织，取出阴茎海绵体，整个过程保持无菌；将阴茎海绵体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浸泡1小时，然后换用加入1％w/v Triton X-100/0.1％氢氧化铵的蒸馏水浸泡24小时，直到阴茎组织变得半透明，从而形成多孔支架；用蒸馏水冲洗阴茎组织2小时，用PBS再浸泡4小时，以清除剩余的细胞碎片并保持等渗性，将获得的细胞外基质完整的阴茎脱细胞支架保存在4℃的PBS中；
步骤B)阴茎脱细胞支架的肝素化构建；
在500毫升0.05M吗啉乙磺酸缓冲液中加入1毫克1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺、0.6毫克N-羟基琥珀酰亚胺和1毫克肝素，激活肝素的羧基30分钟；将阴茎脱细胞支架放在所述缓冲液中，放在摇床上充分摇晃6-8小时，以进行肝素的结合；用磷酸盐缓冲盐水冲洗肝素化阴茎脱细胞支架，每次5分钟共3次，去除未能结合的肝素，用紫外线照射2小时以达到灭菌的目的，获得肝素化修饰的阴茎脱细胞支架；
步骤C)人脐静脉内皮细胞的种植；
将1×106人脐静脉内皮细胞与肝素化修饰的阴茎脱细胞支架用内皮培养基进行共培养，每2天一次，用20G注射器做多点穿刺脱细胞支架进行细胞移植。每2天更换一次内皮培养基以确保细胞有足够的营养，两周后获得再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架。
本发明的第三个方面是提供如本发明的第一个方面中任一所述的阴茎脱细胞支架、或由本发明的第二个方面中任一的制备方法制得的阴茎脱细胞支架在制备器官异体移植物中的应用。
进一步地，所述阴茎脱细胞支架在制备降低免疫原性和提高血管再生能力的器官异体移植物中的应用。
进一步地，所述器官异体移植物为泌尿外科相关移植物，具体为阴茎组织移植物，例如阴茎假体等。
与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
本发明使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺对阴茎脱细胞支架(DPSs)中肝素的共价结合进行了研究，通过共价交联肝素并将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)重新植入肝素化脱细胞支架(HEP-DPSs)以促进血管化。
本发明将再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架(HEP-HUVECs-DPSs)在SD大鼠体内进行初步实验，通过将支架植入大鼠的背部口袋，在体内评估了血管生成，植入后的1、2、3、4周收获了支架，并形成了新的血管。与未修饰的DPSs相比，HEP-DPSs为HUVECs的生长提供了良好的环境，HEP-HUVECs-DPSs中的生长因子含量更高，具有良好的组织相容性和血管再生能力，其能有效的去除细胞成分，降低免疫原性，血管再生能力也为移植组织提供营养成分和氧气，避免了移植物的坏死。
本发明在大鼠体内植入HEP-HUVECs-DPSs后观察到的大量血管，这表明上述制备的HEP-HUVECs-DPSs是有效的，可用于在阴茎组织工程中进一步研究，其为阴茎组织工程提供了一个潜在的解决方案。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明一实施例中用1％Triton X-100/0.1％氢氧化铵溶液浸泡阴茎组织后的细胞支架形态图。
图2是本发明一实施例中H&E染色、DAPI染色和扫描电子显微镜验证阴茎脱细胞支架的脱细胞效果的结果示意图；
图3是本发明一实施例中免疫荧光染色观察阴茎脱细胞支架的胶原保留情况的结果示意图；
图4是本发明一实施例中TB染色和H&E染色验证阴茎脱细胞支架的肝素化修饰的结果示意图；
图5是本发明一实施例中采用EdU染色验证脐静脉内皮细胞活力的的结果示意图；
图6是本发明一实施例中采用H&E染色评估HEP-HUVECs-DPSs处理后大鼠体内血管生成程度的结果示意图；
图7为本发明一实施例中评估HEP-HUVECs-DPSs处理后大鼠体内血管生成程度的直接观察及免疫荧光染色的结果示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1-再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架(HEP-HUVECs-DPSs)的制备本实施例为一较佳形式的HEP-HUVECs-DPSs的制备方法，其包括下述步骤：
步骤(一)、阴茎脱细胞支架(DPSs)的构建；
SD大鼠(年龄为6-7周，体重为300-400克，购自于上海斯莱克实验动物有限公司)安乐死后，将抗凝血剂肝素(100IU/kg，Solarbio公司)注入下腔静脉，以避免血栓形成。在下腹正中做切口，向下延长暴露阴茎组织，在阴茎脚处剪断，去除多余的脂肪和肌肉组织，取出阴茎海绵体，整个过程保持无菌。为了提高生物相容性和降低支架的免疫原性，进行了脱细胞处理以去除细胞成分。将阴茎海绵体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浸泡1小时，然后换用蒸馏水中加入1％(w/v)Triton X-100(Solarbio，中国北京)/0.1％氢氧化铵(Solarbio)浸泡24小时，直到阴茎组织变得半透明，从而形成多孔支架；然后用蒸馏水冲洗阴茎组织2小时，用PBS再浸泡4小时，以清除剩余的细胞碎片并保持等渗性；将细胞外基质完整的阴茎脱细胞支架(DPSs)保存在4℃的PBS中。
上述步骤对脱细胞操作步骤进行了优化，与目前采用的通过双蒸水持续震荡相比，上述脱细胞方法更加温和，阴茎组织结构更易于保存完整，有利于后期进一步修饰，减少体内移植的并发症。
步骤(二)、肝素化修饰的阴茎脱细胞支架(HEP-DPSs)的构建；
用1毫克1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺和0.6毫克N-羟基琥珀酰亚胺在500毫升0.05M吗啉乙磺酸缓冲液中激活肝素(1毫克)的羧基30分钟；然后将阴茎脱细胞支架(DPSs)放在上述溶液中，放在摇床上充分摇晃6-8小时，以便于肝素结合；然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗肝素化DPSs，每次5分钟共3次，去除未能结合的肝素，接着用紫外线照射2小时以达到灭菌的目的。最后，将肝素化修饰的阴茎脱细胞支架(HEP-DPSs)放在Dulbecco's Modified Eagle Medium(Gibco公司)培养基中，48小时后在显微镜下观察以确保无菌。将组织样本放在4℃的多聚甲醛中24小时，随后嵌入石蜡中。将支架切成5μm厚的片状。去石蜡后，将切片放在甲苯胺蓝(TB)液中解离30分钟，然后用去离子水冲洗。密封后，通过显微镜观察图像。
上述肝素化步骤中，通过延长活化羧基时间，可增加肝素激活程度与比例，更好的结合到阴茎脱细胞支架中。
步骤(三)、再内皮化肝素化修饰的阴茎脱细胞支架(HEP-HUVECs-DPSs)的构建；
人脐静脉内皮细胞(HUVECs，中国科学院，上海)被认为具有血管生成的生理作用，并已被用于组织工程的许多方面；因此，探索人脐静脉内皮细胞促进血管生成的作用以及阴茎支架中生长因子的变化。将1×106人脐静脉内皮细胞与肝素化修饰的阴茎脱细胞支架(HEP-DPSs)用内皮培养基在48孔培养板中进行了共培养，每2天一次，用20G注射器做多点穿刺脱细胞支架进行细胞移植。每2天更换一次内皮培养基(Gibco公司)以确保细胞有足够的营养。根据制造商的说明，通过EdU染色(Beyotime Biotechnology)评估人脐静脉内皮细胞的稳定性。此外，两周后通过H&E染色检查每个支架中的存活细胞。
上述构建步骤，与目前负载富血小板血浆PRP后再进行人脐静脉内皮细胞的种植相比，肝素化后HUVECs数目和活力相当，有利于简化步骤并且肝素有利于避免血栓形成。
实施例2–脱细胞效果验证
本实施例对实施例1中制备的阴茎脱细胞支架(DPSs)进行脱细胞效果验证，具体包括：
(1)用1％Triton X-100/0.1％氢氧化铵溶液浸泡后，DPSs逐渐变得透明，其结果如图1所示，初步可见细胞成分消失。
(2)进行H&E染色、DAPI染色和扫描电子显微镜(SEM)进一步验证DPSs的脱细胞效果；
1)H&E染色的具体操作如下：
a)取材：将阴茎脱细胞支架装在ep管中用多聚甲醛浸泡24h以上；最后将组织做好对应的标签，放于脱水盒中。
b)脱水：把脱水盒放入吊篮里，于梯度酒精内依次进行脱水。主要步骤为：75％乙醇4小时；85％乙醇2小时；90％乙醇2小时；95％乙醇2小时；无水乙醇30分钟；无水乙醇30分钟；二甲苯I10分钟；二甲苯II 10分钟。
c)包埋：把组织块放置于包埋机内。蜡块加热融化后倒入包埋框，待蜡完全凝固之前将组织从中取出。在-80℃超低温工作台中冷却，蜡块凝固后，取出蜡块并修整蜡块。
d)切片：取出蜡块固定在石蜡切片机的卡槽内，片厚设置5-10μm。做连续切片，然后用镊子将切片铺于摊片机40℃的温水上，将切片组织小心展平，用载玻片将组织捞起，并放进50℃的烘架上烤片。2-4小时后取下载玻片放置在暗盒内保存备用。
e)脱蜡：二甲苯(I)10分钟；二甲苯(II)10分钟；100％无水乙醇(I)10分钟；100％无水乙醇(II)10分钟；80％乙醇10分钟；蒸馏水5分钟。
f)脱蜡后按以下流程进行HE染色：苏木素染色1分钟，用纯水轻轻冲洗1分钟。0.5％伊红液染色3分钟，用纯水轻轻冲洗1分钟。切片放置在室温下1-2小时，加中性树胶5μL左右，封片。
g)切片染色后按照下述步骤进行脱水：80％乙醇10秒；95％乙醇(I)10秒；95％乙醇(II)10秒；无水乙醇(I)10分钟；无水乙醇(II)10分钟；二甲苯(I)10分钟；二甲苯(II)10分钟；二甲苯(Ⅲ)10分钟。
f)切片放置在室温下1-2小时，加中性树胶5μL左右，封片，置于显微镜下观察，图像采集分析。
2)DAPI染色步骤：将上述切片脱蜡后按以下流程进行DAPI染色；切片滴加10-20μL即用型DAPI染液(Gibco公司)染色5-10分钟，然后用PBS冲洗3次，每次5分钟，切片放置在室温下1-2小时，加中性树胶5μL左右，封片，置于显微镜下观察，图像采集分析。
3)SEM步骤：将阴茎脱细胞支架浸泡在0.5％的戊二醛固定液(Gibco公司)中1小时，然后1％四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，包埋，半薄切片光学定位，超薄切片，电镜下观察拍照。
上述实验结果如图2所示。H&E(图2的A和D部分)和DAPI(图2的B和E部分)染色清楚地显示，脱细胞支架上没有细胞残留(图2的D和E部分)，胶原基质是连续的，没有任何破损；SEM(图2的C和F部分)显示细胞外基质(ECM)是完整的，没有观察到残留的细胞核(图2的F部分)，这表明采用实施例1的脱细胞操作成功地将阴茎组织中的细胞脱去，并对细胞外基质影响较小。
(3)免疫荧光染色观察胶原保留情况，具体步骤如下：
a)将上述切片脱蜡后滴加4％多聚甲醛并于室温固定1h后，随后加入含0.1％Triton X-100的PBS 1ml，破膜10min。吸去液体后，加入PBS，在摇床上摇10min，反复2次。
b)甩干水分后加入5％BSA，封闭1h。注意避光，动作要轻柔。
c)加入对应稀释过的一抗，1：100，4℃冰箱孵育过夜。
d)取出暗盒，在室温下复温30min，用PBS洗涤，反复3次，每次10min。
e)加入相应荧光二抗，1：200，室温下孵育1h后，用PBS洗涤，反复3次，每次10min。
f)封片剂封片，拍照观察。
上述实验结果如图3所示。结果显示，胶原蛋白IV(图3的D部分)、胶原蛋白I(图3的E部分)和纤连蛋白(图3的F部分)在脱细胞后都保存得很好(图3的A、B、C部分为正常组织)，这表明采用实施例1的脱细胞操作成功地将阴茎组织中的细胞脱去的同时，细胞外基质保存良好，对其影响较小。
实施例3–肝素化修饰的验证
本实施例对对脱细胞支架进行肝素化修饰效果验证，其采用与脐静脉内皮细胞培养2周后收获的再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架(HEP-HUVECs-DPSs)进行了分析，具体包括：
将支架切成5μm厚的片子。脱蜡后，将切片放在甲苯胺蓝(TB)液体中染色30分钟，然后用去离子水冲洗3-5分钟。密封后，通过显微镜观察图像。将支架进行H&E染色(具体步骤参见实施例2)，切片密封后，置于显微镜下观察，图像采集分析。上述实验结果如图4所示。
TB染色表明，肝素化支架的交联是成功的(图4的C部分)；肝素化后，肝素化支架在整个细胞基质中表现出TB阳性染色，而在未修饰的DPSs(图4的A部分)中没有观察到TB染色，这表明采用实施例1的方法成功地将肝素交联到阴茎脱细胞支架上。
H&E染色显示，肝素化DPSs中脐静脉内皮细胞的数量(图4的D部分)明显高于未修饰的DPSs(图4的B部分)，可见肝素交联后的阴茎脱细胞支架为细胞生存提供了更好的微环境，有利于内皮细胞的黏附与增殖。由图4的E部分可知，相较于未修饰的DPSs，HEP-HUVECs-DPSs的血管内皮(细胞)生长因子和碱性成纤细胞生长因子均显著提高。
实施例4-脐静脉内皮细胞活力的验证
本实施例将脐静脉内皮细胞与原生DPSs或肝素化DPSs(HEP-DPSs)共同培养，并通过EdU染色(碧云天生物有限公司)来评估体外的细胞相容性。上述实验结果如图5所示。
EdU染色的具体操作如下：
a)在6孔板中培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，与原生DPSs或肝素化DPSs(HEP-DPSs)共同培养处理24小时。
b)配制2X的EdU工作液：由于EdU工作液是与培养液等体积加入到孔板中，所以需要配制成2X的工作液。推荐的EdU终浓度为10μM(1X)，用细胞培养液1：500稀释EdU(10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
c)将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM)，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议替换所有的培养液。
d)继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细胞周期10％左右的时间。
e)EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml固定液
f)去除固定液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。
g)去除洗涤液，每孔用1mL通透液(使用碧云天含0.3％Triton X-100的PBS)，室温孵育10-15分钟。
h)去除通透液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。
i)配制Click Additive Solution：对于C0075S，用1.3mL去离子水溶解一管ClickAdditive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；配制后可以适当分装，并-20℃保存。参考说明配制Click反应液。严格按照说明中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；同时，Click反应液须在配制后15分钟内使用。
j)去除上一步骤中的洗涤液。每孔加入0.5mL Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。室温避光孵育30分钟。吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
k)为了检测细胞增殖的比例，使用Hoechst 33342进行细胞核染色。1X Hoechst33342溶液的配制：按1：1000比例用PBS稀释Hoechst 33342(1000X)。吸除洗涤液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1mL，室温避光孵育10分钟。吸除1X Hoechst 33342溶液。用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。随后即可进行荧光检测。
由图5可知，用HEP-DPSs培养，观察到的脐静脉内皮细胞的增殖比原生DPSs的增殖要高，上述结果表明，HEP-DPSs对脐静脉内皮细胞的增殖显示出更好的生物相容性。
实施例5-大鼠模型中的血管生成的验证
本实施例将HEP-HUVECs-DPSs、HEP-DPSs和未经处理的支架植入大鼠的背部，以进行大鼠模型中的血管生成的验证，具体步骤包括：
(1)H&E染色
取SD雄鼠，予以5％水合氯醛腹腔内注射麻醉，生效后，鼠背脱毛膏脱毛备皮，大鼠取俯卧位，碘伏消毒，铺无菌洞巾，沿背部后正中线近颈部向尾部方向隔1.5cm取1cm切口共四个，依次埋入四个支架组织于皮下深筋膜内，组织块切面面向深筋膜层，1号丝线缝合皮肤，碘伏再次消毒皮肤切口。植入后1、2、3、4周收获样品，并通过H&E染色(具体步骤参见实施例2)评估血管生成的程度，其实验结果如图6所示。
H&E染色显示支架上有小的新生血管。在第一周，HEP-HUVECs-DPSs和HEP-DPSs内开始出现血管，而这在未处理的支架中没有观察到。小血管直到第三周才出现在对照组支架上。同时，HEP-HUVECs-DPSs中的血管数量明显增加，结构更加完整，更加成熟，且HEP-HUVECs-DPSs的内皮化程度优于HEP-DPSs和未经处理的支架。
(2)免疫荧光染色
种植到SD大鼠体内后，直接观察表明，支架结构保持完整，表面可见血管化，所有的支架都具有良好的生物相容性(图7的A和B部分)。CD31的表达被用来准确地量化再内皮化支架的血管生成情况，采用免疫荧光观察不同组内血管生成的数目(具体步骤参见实施例2)，其结果如图7的C部分所示。
免疫荧光染色显示在第一周，HEP-HUVECs-DPSs和HEP-DPSs内开始出现血管，而这在未处理的支架中没有观察到。小血管直到第三周才出现在对照组支架上。同时，HEP-HUVECs-DPSs中的血管数量明显增加，结构更加完整，更加成熟；且在相同的时间点，HEP-HUVECs-DPSs中的血管明显多于HEP-DPSs和对照支架。
由上述实施例可知，本发明的构建方法可成功地将阴茎组织中的细胞脱去，且细胞外基质保存良好；成功地将肝素交联到阴茎脱细胞支架上，为细胞生存提供了更好的微环境，有利于内皮细胞的黏附与增殖；并将人脐静脉内皮细胞重新植入肝素化脱细胞支架以促进血管化，构建的HEP-HUVECs-DPSs具有良好的组织相容性和血管再生能力，有效的去除细胞成分，降低免疫原性，血管再生能力也为移植组织提供营养成分和氧气，避免了移植物的坏死，可用于在阴茎组织工程中进一步研究。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架，其特征在于，所述再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架为在脱细胞的阴茎组织中进行肝素化修饰，在肝素化修饰后的阴茎脱细胞支架中种植人脐静脉内皮细胞；
所述再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)构建阴茎脱细胞支架：取出大鼠的阴茎海绵体，进行脱细胞处理以去除细胞成分，形成多孔支架，获得细胞外基质完整的阴茎脱细胞支架；
步骤2)对所述阴茎脱细胞支架进行肝素化修饰：对肝素进行预定时间的活化羧基处理后，将阴茎脱细胞支架与活化羧基后的溶液混合以进行肝素的修饰，去除未能结合的肝素，灭菌，获得肝素化修饰的阴茎脱细胞支架；
步骤3)人脐静脉内皮细胞的种植：将人脐静脉内皮细胞与肝素化修饰的阴茎脱细胞支架共培养，采用多点穿刺脱细胞支架进行细胞移植，获得再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架；
其中，所述步骤1)中，所述脱细胞处理的具体步骤包括：将所述阴茎海绵体在磷酸盐缓冲盐水中浸泡预定时间后，换用预定浓度的Triton X-100/氢氧化铵的蒸馏水溶液浸泡预定时间，直到阴茎组织变得半透明，形成多孔支架；用蒸馏水冲洗阴茎组织，用磷酸盐缓冲盐水再浸泡，以清除剩余的细胞碎片并保持等渗性，获得细胞外基质完整的阴茎脱细胞支架。
2.根据权利要求1所述的再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架，其特征在于，所述步骤1)中，所述阴茎海绵体的取出步骤包括：SD大鼠安乐死后，将抗凝血剂注入下腔静脉，以避免血栓形成；在下腹正中做切口，向下延长暴露阴茎组织，在阴茎脚处剪断，去除多余的脂肪和肌肉组织，取出阴茎海绵体，整个过程保持无菌；
和/或，所述步骤2)中，所述肝素化修饰的具体步骤包括：在吗啉乙磺酸缓冲液中加入预定配比的肝素、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应预定时间以激活肝素的羧基；将所述脱细胞阴茎支架放在活化羧基后的缓冲液中，充分混合以进行肝素的结合，预定时间后用磷酸盐缓冲盐水冲洗肝素化的脱细胞阴茎支架，去除未能结合的肝素，用紫外线灭菌，获得肝素化修饰的阴茎脱细胞支架。
3.根据权利要求1所述的再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架，其特征在于，所述步骤3)中，所述人脐静脉内皮细胞的种植的具体步骤包括：将1×105～1×107人脐静脉内皮细胞与肝素化修饰的阴茎脱细胞支架用内皮培养基进行共培养，定期更换内皮培养基，定期用注射器做多点穿刺脱细胞支架进行细胞移植，预定时间后获得再内皮化肝素化修饰的阴茎脱细胞支架。
4.根据权利要求1所述的再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架，其特征在于，具体包括步骤：
步骤A)阴茎脱细胞支架的构建；
SD大鼠安乐死后，将抗凝血剂肝素100IU/kg注入下腔静脉，以避免血栓形成；在下腹正中做切口，向下延长暴露阴茎组织，在阴茎脚处剪断，去除多余的脂肪和肌肉组织，取出阴茎海绵体，整个过程保持无菌；将阴茎海绵体在磷酸盐缓冲盐水中浸泡1小时，然后换用加入1％w/v Triton X-100/0.1％氢氧化铵的蒸馏水浸泡24小时，直到阴茎组织变得半透明，从而形成多孔支架；用蒸馏水冲洗阴茎组织2小时，用磷酸盐缓冲盐水再浸泡4小时，以清除剩余的细胞碎片并保持等渗性，将获得的细胞外基质完整的阴茎脱细胞支架保存在4℃的PBS中；
步骤B)阴茎脱细胞支架的肝素化构建；
在500毫升0.05M吗啉乙磺酸缓冲液中加入1毫克1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺、0.6毫克N-羟基琥珀酰亚胺和1毫克肝素，激活肝素的羧基30分钟；将阴茎脱细胞支架放在所述缓冲液中，放在摇床上充分摇晃6-8小时，以进行肝素的结合；用磷酸盐缓冲盐水冲洗肝素化阴茎脱细胞支架，每次5分钟共3次，去除未能结合的肝素，用紫外线照射2小时以达到灭菌的目的，获得肝素化修饰的阴茎脱细胞支架；
步骤C)人脐静脉内皮细胞的种植；
将1×106人脐静脉内皮细胞与肝素化修饰的阴茎脱细胞支架用内皮培养基进行共培养，每2天一次，用20G注射器做多点穿刺脱细胞支架进行细胞移植，每2天更换一次内皮培养基以确保细胞有足够的营养，两周后获得再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架。
5.一种如权利要求1～4中任一项所述的再内皮化的肝素化修饰的阴茎脱细胞支架在制备器官异体移植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述阴茎脱细胞支架在制备降低免疫原性和提高血管再生能力的器官异体移植物中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述器官异体移植物为阴茎组织移植物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1210005C (zh) * 2003-09-02 2005-07-13 中国人民解放军第四军医大学口腔医学院 含有血管结构的组织工程皮肤及其构建方法
US7622298B2 (en) * 2006-03-24 2009-11-24 Norits, Inc. Method for creating perfusable microvessel systems
JP2012522511A (ja) * 2009-03-31 2012-09-27 リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ 臓器および組織を脱細胞化および再細胞化する方法
US20150079069A1 (en) * 2012-04-30 2015-03-19 Elastomics Ab Methods for modification of tissues
CN107432954B (zh) * 2017-08-17 2020-08-28 陈强 一种新型生物类脱细胞植入材料的制备方法
CN113855859A (zh) * 2021-05-28 2021-12-31 首都医科大学宣武医院 一种由脱细胞血管基质构建的可促进快速内皮化的小口径组织工程血管

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