JP3686068B2 - 皮膚の分離無細胞化方法、無細胞化真皮マトリックス及びその製造方法並びに無細胞化真皮マトリックスを用いた複合培養皮膚 - Google Patents
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Rheinwald JG & Green H : Serial cultivation of human epidermal keratinocytes : the Cell formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975;6:331-344 0’Connor NE, Mulliken JB, Banks-Schlegel S, et al : Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells. Lancet. 1981;1:75-78 Nanchahal J & Ward CM : New grafts for old? A review of alternatives to autologous skin. Brit J Plast Surg. 1992;45:354-363 Hansbrough JF., Morgan JL., Greenleaf GE., et al : Composite grafts of human keratinocytes grown on a polyglactin mesh cultured fibroblasts dermal substitute function as a bilayer skin replacement in full-thickness wounds on athymic mice. Burn Care Rehabil. 1993;14:485-494 Bell E., Ehrlich HP., Buttle DJ., et al : Living tissue formed in vitro and accepted as skin-equivalent tissue of full-thickness. Science. 1981;211:1052-1054 Boyce ST., Christianson D., Hansbrough JF. : Structure of a collagen-GAG skin substitute optimized for cultured human epidermal keratinocytes. J Biomed Mater Res. 1988;22:939-957 Livesey SA, Herndon DN, Hollyoak MA, et al : Transplanted acellular allograft dermal matrix. Potential as a template for the reconstruction of viable dermis. Transplantation. 1995;60:1-9 Wainwright DJ. Use of an acellular dermal matrix(AlloDerm) in the management of full-Thickness burns. Burns. 1995;21:243-248
本発明の無細胞化真皮マトリックスの製造方法の特徴と利点を検討するために、従来報告されている分離無細胞化の方法との比較検討を行った。
手術時あるいは同種皮膚採取後に不要となった余剰皮膚(分層皮膚:平均約0.38mm厚:0.015インチ厚)を、液体窒素を用いて凍結(温度−80℃、24時間、次いで温度−196℃、48時間)、融解(温度37℃、5分)した後、1M NaClに浸し、37℃、12時間インキュベートした。この処理により、表皮と真皮は、真皮に基底膜が残った状態で容易に分離にされた。
余剰皮膚を、液体窒素を用いて凍結、融解後、1M NaClとデタージェントであるTriton X−100(商品名)を、順次、用いる方法。すなわち、分層皮膚を表皮と真皮に分離する際においては、凍結融解に続いて1M NaCl処理を行い、分離した真皮の無細胞化処理においてはTriton X−100によって処理を行う方法。
余剰皮膚を、液体窒素を用いて凍結、融解後、1M NaClとデタージェントであるSDS(Sodium Dodecyl Sulfate:ドデシル硫酸ナトリウム)を、順次、用いる方法。すなわち、分層皮膚を表皮と真皮に分離する際においては、凍結融解に続いて1M NaCl処理を行い、分離した真皮の無細胞化処理においてはSDSによって処理を行う方法。
余剰皮膚を、液体窒素を用いて凍結、融解後、分層皮膚を表皮と真皮に分離する際に、タンパク質分解酵素であるディスパーゼのみを用いる方法。
余剰皮膚を、液体窒素を用いて凍結、融解後、タンパク質分解酵素であるトリプシンとデタージェントであるTriton X−100(商品名)を、順次、用いる方法。すなわち、分層皮膚を表皮と真皮に分離する際においては、凍結融解に続いてトリプシン処理を行い、分離した真皮の無細胞化処理においてはTriton X−100によって処理を行う方法。
<細胞の除去(Cell Removal)>
good:ADMから細胞が完全に除去された。
<IV型コラーゲン(Type IV Collagen)>
+++:IV型コラーゲンが基底膜部および真皮内において最も強く染色された。
++:IV型コラーゲンが基底膜部のみにおいて染色された。
−:IV型コラーゲンが基底膜部および真皮内において染色されなかった。
<ラミニン(Laminin)>
++:ラミニンが基底膜部および真皮内において強く染色された。
+:ラミニンが基底膜部の一部において染色された。
−:ラミニンが基底膜部および真皮内において染色されなかった。
図4に従い、実施例1で得られた各ADMに線維芽細胞、次いで、表皮細胞を播種し、1週間気相培養することにより表皮細胞を重層化させ、複合型培養皮膚を得た。
図4に従い、本発明の複合型培養皮膚と、従来から開発されている担体を用いた複合型培養皮膚とに線維芽細胞、次いで、表皮細胞を播種し、1週間気相培養することにより表皮細胞を重層化させ、複合型培養皮膚を得た。なお、表2中、従来のADMとは、具体的に従来の方法とは凍結融解による物理的方法やトリプシン、ディスパーゼなどのタンパク質分解酵素、あるいはSDSやTritonX100などのデタージェントを用いた化学的方法により得られたADMをいう。
<基底膜>
+:基底膜がADM自体に残存していた。
−:基底膜が残存していなかった。
<表皮細胞の接着性>
++:担体に表皮細胞が接着し易かった。
+:担体に表皮細胞が接着し難かった。
−:担体に表皮細胞が接着しなかった。
<重層化表皮層の接着性>
+++:担体に重層化表皮層が強く接着していた。
++:担体に重層化表皮層が接着していた。
+:担体に重層化表皮層が接着していたが、接着力が弱かった。
−:担体に重層化表皮層が接着しなかった。
<重層化>
+:気相培養により担体への表皮細胞の重層化が観察された。
重症熱傷例の創部の一部に本発明の複合型培養皮膚をHBSS(Hanks’ Balanced Salt Solution:ハンクスの平衡塩類溶液)で3回洗浄した後、1時間以内に患部に移植した。移植枚数は4枚でそれぞれ5×5cmであった。移植方法はピンセットでシャーレから無菌的に培養皮膚を取り出し、表皮面を上にして患部に移植した。移植後22日の所見では培養皮膚は完全に生着し、表皮が形成された(図7)。移植後13日の培養皮膚のHE染色像では移植床と培養皮膚の接着は良好で、培養皮膚真皮内に新生血管が形成され、表皮細胞は正常皮膚組織とほぼ同等の形態を有していた。
本発明の無細胞化真皮マトリックスを担体として、線維芽細胞は使用せずに培養口腔粘膜上皮細胞又は培養小腸上皮細胞を組み込んだ培養組織を1週間気相培養することにより得た。得られた培養組織をHE染色することにより観察した。図8は、培養口腔粘膜組織の断面写真であり、口腔粘膜上皮細胞はADMに接着し、重層化した。また、図9は、培養小腸組織の断面写真であり、小腸粘膜上皮細胞はADMに接着し、重層化した。培養口腔粘膜組織、培養小腸組織ともに、接着性は良好であり、ADMは種々の細胞の担体として使用可能である。
Claims (5)
- 採取した皮膚を凍結融解した後、高張食塩水で処理することにより表皮と真皮とに分離する工程、及び、分離した真皮に等張緩衝液を持続的に流しかけることにより真皮内細胞を除去する工程を含むことを特徴とする皮膚の分離無細胞化方法。
- 採取した皮膚を凍結融解した後、高張食塩水で処理することにより表皮と真皮とに分離する工程、及び、分離した真皮に等張緩衝液を持続的に流しかけることにより真皮内細胞を除去する工程により、分離無細胞化したことを特徴とする、実質的に真皮内の全ての細胞成分が除去され、基底膜が温存された無細胞化真皮マトリックス。
- 採取した皮膚を凍結融解した後、高張食塩水で処理することにより表皮と真皮とに分離する工程、及び、分離した真皮に等張緩衝液を持続的に流しかけることにより真皮内細胞を除去する工程を含むことを特徴とする無細胞化真皮マトリックスの製造方法。
- 請求項2に記載の無細胞化真皮マトリックスを担体とする複合培養皮膚。
- 請求項2に記載の無細胞化真皮マトリックスを担体とする複合培養上皮。
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