KR100760989B1 - 생체적합성 스캐폴드에서 섬유아세포와 피부각질세포를공동 배양하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 섬유아세포 및 피부각질세포를 생체적합성 스캐폴드에 접종하는 단계; 및 (b) 상기 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포를 배양하는 단계를 포함하는 섬유아세포 및 피부각질세포를 공동배양하는 방법, 이러한 공동배양에 의해 제작된 인공피부 대체물 및 콜라겐-코팅 생체적합성 스캐폴드에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 피부 진피층의 주세포인 섬유아세포와 피부 표피층의 주세포인 피부각질세포를 우수한 효율로 공동 배양할 수 있어 인공피부 대체물을 제작하는 데 매우 효율적이며, 이렇게 하여 제작된 인공피부 대체물에서 피부각질세포는 스캐폴드의 상부쪽으로 이동되어 위치하는 데, 이러한 3차원 구조는 본 발명의 피부각질세포-섬유아세포-스캐폴드 복합체가 피부 대체물로서 매우 유용하게 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.

섬유아세포, 각질세포, 스캐폴드, 공동배양, 콜라겐

Description

생체적합성 스캐폴드에서 섬유아세포와 피부각질세포를 공동 배양하는 방법{Method for Coculturing Fibroblasts and Keratinocytes in Biocompatible Scaffolds}

도 1은 타입 I 콜라겐으로 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드에 피부유래 섬유아세포를 배양한 상태를 나타낸다. 접종 농도는 1 x 10⁶-10 x 10⁶ 이다. 섬유아세포가 7일 배양된 후에 H/E 염색결과 (패널 A), 섬유아세포 표지 단백질인 바이멘틴에 대한 면역조직화학을 행한 결과 (패널 B)를 나타낸다.

도 2는 타입 I 콜라겐으로 코팅된 키토산 스캐폴드에 피부유래 섬유아세포를 배양한 상태를 나타낸다. 접종 농도는 1 x 10³-50 x 10³ 이다. 섬유아세포가 7일 배양된 후에 H/E 염색결과 (패널 A), 섬유아세포 표지 단백질인 바이멘틴에 대한 면역조직화학을 행한 결과 (패널 B)를 나타낸다.

도 3은 피부유래 섬유아세포와 피부각질세포를 타입 I 콜라겐이 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드에 공동 배양한 것을 나타낸다. 접종 농도는 섬유아세포의 경우 1 x 10⁷, 피부각질세포의 경우 3 x 10⁵ 이다. 7일 동안 액내 배양된 후에 H/E 염색결과 (패널 A), 섬유아세포 표지 단백질인 바이멘틴에 대한 면역조직화학을 행한 결과 (패널 B), 증식 표지인 PCNA에 대한 면역조직화학 결과 (패널 C) 및 피부 각질세포의 표지 단백질인 판-사이토케라틴에 대한 면역조직화학 결과 (패널 D)를 나타낸다.

도 4는 타입 Ⅰ 콜라겐이 코팅된 키토산 스캐폴드에 피부유래 섬유아세포와 피부각질세포를 접종한 후, 공기-건조 배양을 통해 피부각질세포의 분화를 유도한 것을 나타낸다. 접종 농도는 섬유아세포의 경우 5 x 10⁴, 피부각질세포의 경우 3 x 10⁵ 이다. 7일 동안 액내 배양된 후에 H/E 염색결과 (패널 A), 섬유아세포 표지 단백질인 바이멘틴에 대한 면역조직화학을 행한 결과 (패널 B), 증식 표지인 PCNA에 대한 면역조직화학 결과 (패널 C)　및 피부각질세포의 표지 단백질인 판-사이토케라틴에 대한 면역조직화학 결과 (패널 D)를 나타낸다.

도 5는 타입 I 콜라겐이 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드에 피부유래 섬유아세포와 피부각질세포를 공동배양한 것을 나타낸다. 접종 농도는 섬유아세포의 경우 1 x 10⁷, 피부각질세포의 경우 3 x 10⁵ 이다. 7일 동안 액내 배양 후 다시 7일 동안 공기-건조 상태에서 배양된 후 H/E 염색결과 (패널 A), 섬유아세포 표지 단백질인 바이멘틴에 대한 면역조직화학을 행한 결과 (패널 B), 증식 표지인 PCNA에 대한 면역조직화학 결과 (패널 C) 및 피부각질세포의 표지 단백질인 판-사이토케라틴에 대한 면역조직화학 결과 (패널 D)를 나타낸다.

도 6은 타입 Ⅰ 콜라겐이 코팅된 키토산 스캐폴드에 피부유래 섬유아세포와 피부각질세포를 접종한 후, 공기-건조 배양을 통해 피부각질세포의 분화를 유도한 것을 나타낸다. 접종 농도는 섬유아세포의 경우 5 x 10⁴, 피부각질세포의 경우 3 x 10⁵ 이다. 7일 동안 액내 배양 후 다시 7일 동안 공기-건조 상태에서 배양된 후 H/E 염색결과 (패널 A), 섬유아세포 표지 단백질인 바이멘틴에 대한 면역조직화학을 행한 결과 (패널 B), 증식 표지인 PCNA에 대한 면역조직화학 결과 (패널 C) 및 피부각질세포의 표지 단백질인 판-사이토케라틴에 대한 면역조직화학 결과 (패널 D)를 나타낸다.

도 7은 공동배양 조건의 개략도이다.

도 8은 키토산 스캐폴드에 콜라겐 코팅 여부를 확인한 면역조직화학염색 결과 사진이다.

도 9는 콜라겐 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드에 섬유아세포와 피부각질세포를 시간차 접종하여 공동배양한 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명은 섬유아세포 및 피부각질세포의 공동 배양방법, 인공피부 대체물 및 생체적합성 스캐폴드에 관한 것이다.

표피와 진피로 구성되어있는 피부의 성공적인 인 비트로 재생은, 본래의 피 부에 존재하는 특정한 요소들로 공동배양 되는 몇 종의 세포들 및 상기 세포들을 수용하고 지지할 수 있는 적절한 스캐폴드 구조를 필요로 한다.

두 가지의 주요 구성 성분인 표피와 진피 외에도, 피부의 주요한 기관 중의 하나는 영양분과 산소의 적절한 관류를 보증하는 모세혈관 네트워크이다. 내피화된 피부는 인체의 전층 (full-thickness) 피부 샘플로 얻을 수 있는 피부각질세포 (keratinocytes), 섬유아세포 (fibroblasts) 그리고 혈관내피세포 (endothelial cells)의 세 가지 인체 세포 타입을 스캐폴드에서 공동배양하여 얻을 수 있다.

적절한 진피 스캐폴드는 피부 결함을 영구히 보완할 수 있는 인공 피부 대체물의 필수 구성요소이다. 진피 스캐폴드 물질에 대한 이러한 필요를 충족시키기 위하여 많은 생체적합성 중합 물질이 개발되었다. 이러한 많은 생체적합성 물질 중에서 콜라겐은, 염증성과 세포독성이 적고 세포의 생장을 촉진시키는 점에서, 가장 주목받는 피부 대체물이라 여겨진다. 콜라겐 스폰지를 전층 피부 결손 상처에 사용하면, 상처 부위에서 섬유 모세포와 모세혈관이 스폰지 내에 침투해서 증식하고, 자가 콜라겐의 합성에 의하여 콜라겐 섬유가 형성되어, 진피 모양의 조직이 구축된다. 그 후 콜라겐 스폰지는 극히 순수하게 분해 흡수된다. 따라서 이 진피 모양의 조직은 완전한 자기 진피 조직이 된다. 재료 자체가 생체 진피 조직으로 바뀌어 지기 때문에 이 스폰지는 진피대체물이라고도 불리고, 일부에서 이미 상품화되었으며 여러 가지 연구와 임상 보고가 들어와 있다.

한편, 히알루론산 (HA： Hyaluronic acid)은 인공 피부의 기저물질로서의 약물로 광범위하게 이용되어왔고, 주입(injection) 가능한 조직 팽창 용액으로 이용 되어왔다. 그러나 이러한 생체적합성 물질들은 기계적 강도가 약하고, 세균에 의한 오염이 쉽기 때문에 진피 스캐폴드로 이용되기엔 제약이 따른다.

이러한 진피 대체물에 관련된 종래 기술로는 다음과 같은 것들이 있다. 대한민국 출원공개번호 제2000-0013701호에는 콜라겐, 라미닌 및 히아루론산으로 구성된 경질층과 다공성층의 이중구조로 된 진피재생 유도용 다공성 교원질 이중구조 창상 보호막이 개시되어 있고, 대한민국 출원공개번호 제2000-0007983호는 콜라겐을 스폰지 및 망사의 복합구조로 제조한 강화된 콜라겐 층을 포함하는 생체조직 및 이의 용도를 제시하고 있으며, 대한민국 출원공고번호 제94-1379호의 생 조직 등가물은 겔상태의 콜라겐 층 내에 섬유아세포로 수축시킨 콜라겐 격자형태로 구성된 진피층으로 이루어진 진피대체물을 개시하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 피부 결함 (skin defects)을 치료할 수 있는 인공피부 대체물을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 생체적합성 스캐폴드에 피부 진피층의 주세포인 섬유아세포와 피부 표피층의 주세포인 피부각질세포를 접종하여 우수한 효율로 공 동 배양하는 데 성공하였고, 이는 인공피부 대체물을 제작하는 데 매우 효율적임을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 피부유래 섬유아세포와 피부각질세포를 공동으로 배양하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 생체적합성 스캐폴드, 섬유아세포 및 피부각질세포로 이루어져 있는 인공피부 대체물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 콜라겐-코팅 생체적합성 스캐폴드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 섬유아세포 및 피부각질세포를 생체적합성 스캐폴드에 접종하는 단계; 및 (b) 상기 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포를 배양하는 단계를 포함하는 섬유아세포 및 피부각질세포를 공동 배양하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 피부 결함 (skin defects)을 치료할 수 있는 인공피부 대체물을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 생체적합성 스캐폴드에 피부 진피층의 주세포인 섬유아세포와 피부 표피층의 주세포인 피부각질세포를 우수한 효율로 공동 배양할 수 있어, 인공피부 대체물을 제작하는 데 매우 효율적임을 발견하였다.

본 발명에 있어서 놀라운 발견은 생체적합성 스캐폴드를 이용하여 섬유아세포와 피부각질세포를 공동배양할 수 있다는 것이다. 본 명세서에서, 용어 “공동배양”은, 생체적합성 스캐폴드에 최소 2종의 세포를 접종하여 여러 종의 세포를 동시에 증식 및 유지하는 것을 의미한다. 또한, 상기 접종은 여러 종의 세포를 동시에 접종하는 것뿐만 아니라, 시간적 차이를 두어 접종하는 것도 포함한다.

본 발명의 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 섬유아세포 및 피부각질세포를 생체적합성 스캐폴드에 접종하는 단계

생체적합성 스캐폴드에 섬유아세포 및 피부각질세포를 접종한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “생체적합성 스캐폴드”는 생체 내에서 분해될 수 있으며 세포가 잘 부착하여 3차원적인 조직의 구조를 형성하는 뼈대의 역할을 할 수 있는 물질을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 생체적합성 스캐폴드는 이식 후 염증반응이나 이물반응 (foreign body reaction)을 일으키지 않도록 면역학적으로 불활성이며, 한편으로는 적극적으로 주위조직과 반응하여 주위에 존재하는 세포가 증식하여 들어오도록 유도할 수 있고, 또한 이식물에 대한 이물반응으로 인해 이식된 후, 이식된 세포와 조직의 역할이 다 끝나기도 전에 그 지지층인 재료가 분해되지 않도록 그 분해속도가 적절한 것이며, 일정기간 지난 후에는 스스로 분해 되어 이물질로 남지 않는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 스캐폴드는 콜라겐으로 코팅된 것이다. 생체적합성 스캐폴드에 코팅되는 콜라겐은, 척추동물의 주된 구조 물질이며 기계적 기능을 하는 조직에 존재하고, 적어도 19개 타입이 있으며 그들 모두 동일한 3차 구조를 갖는다. 본 발명에서는 어떠한 타입의 콜라겐도 이용가능하며, 바람직하게는 콜라겐 타입 Ⅰ을 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 스캐폴드는 키토산, 글리코스아미노글리칸, 젤라틴, 하이드록시애퍼타이트, 폴리-d,l-락트산, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜산, 혼합 d,l-락트산과 글리콜산의 공중합체, L-락트산과 글리콜산의 공중합체, 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리(락트산-카프로락톤), 폴리(글리콜산-카프로락톤),히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane) 및 카제인으로 구성된 군으로부터 선택된다.

보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 스캐폴드로 키토산을 이용한다. 키토산과 그의 유도체들은 인 비트로 상의 수성 배지에 라이소자임이 존재하더라도 느린 속도로 분해되기 때문에 키토산 스폰지는 세포가 배양되는 동안에 그 형태와 크기가 안정한 상태로 유지될 수 있기 때문에 본 발명에 적합하다. 더욱이, 키토산은 면역성이 없고 미생물오염에 대한 내성이 있으며 키틴의 탈아세틸화(deacetylation)반응으로 쉽게 얻을 수 있고 키토산과 키토산의 미생물 분해 산물인 글루코사민은 독성이 없기 때문에 본 발명에 더욱 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 콜라겐-코팅된 생체적합성 스캐폴드를 이용하며, 이는 섬유아세포와 각질세포의 동시배양의 효율을 크게 증가시킨다. 본 명세서에서 생체적합성 스캐폴드와 연결되어 사용되는 용어 “콜라겐-코팅”은 콜라겐이 생체적합성 스캐폴드의 표면 및/또는 스캐폴드 두께의 전(全) 부분에 도포된 것을 의미한다. 즉, 스캐폴드의 기본적인 골격을 제조하는 과정에서 콜라겐이 사용되는 것이 아니라, 이미 기본적인 골격이 제작된 스캐폴드에 도포되는 것을 의미한다.

생체적합성 스캐폴드에 접종되는 섬유아세포 및 피부각질세포의 양은 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 1 x 10²-1 x 10⁸개의 세포를 접종한다.

본 발명의 변형예에 따르면, 생체적합성 스캐폴드에 접종되는 세포는 섬유아세포 및 피부각질세포 이외에도 피부를 구성하는 다른 세포를 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 멜라닌세포, 미분화 지방세포, 지방조직-유래 간엽줄기세포, 혈관내피세포 및/또는 모낭-유래 미분화 세포를 포함할 수 있다.

(b) 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포의 배양단계

상기 단계에서 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포를 공동으로 배양한다. 공동배양에 있어서, 적용되는 온도 및 대기 조건은 당업계에서 통상적으로 이용되는 조건을 그대로 적용할 수 있다. 예컨대, 공동배양 온도는 약 37℃, 대기 조건은 약 5% CO₂로 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 섬유아세포 및 피부각질세포의 공동배양은 다음의 서브-단계를 포함한다: (b-1) 상기 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포를 액내배양 (submerge) 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (b-2) 상기 배양된 섬유아세포 및 피부각질세포를 공기-건조 (air-dry) 조건에서 배양하는 단계.

접종된 섬유아세포 및 피부각질세포의 배양 조건은 공기 노출도에 따라 크게 3가지 조건을 선택할 수 있다: 공기-건조 (air-dry) 조건, 반-건조 (semi-dry) 조건 및 액내배양 (submerged) 조건.

본 명세서에서 공기-건조 조건은 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포는 액내에 존재하고 피부각질세포가 공기 중에 완전히 노출된 상태를 의미한다 (참조: 도 7의 A).

본 명세서에서 반-건조 조건은 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포가 가능한 최소 높이의 배양액으로 덮여 있는 상태를 의미한다 (참조: 도 7의 B). 이 조건에서는 세포층 바로 위에 배앵액이 가능한 얇게 덮여 있게 되며, 세포층에 영향을 주는 요소들은 배양액과 공기를 통하여 작용을 하게 된다.

본 명세서에서 액내배양 조건은 생체적합성 스캐폴드에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포가 가능한 최대 높이의 배양액으로 덮여 있는 상태를 의미한다 (참조: 도 7의 C). 이 조건에서는 세포층에 영향을 주는 요소들이 배양액을 통하여 작용을 하게 된다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 초기 공동배양은 액내배양 조건 하에서 이루어지고, 후기 공동배양은 공기-건조 조건에서 이루어진다.초기 공동배양의 기간은 1-20일, 바람직하게는 2-10일, 보다 바람직하게는 3-9일, 가장 바람직하게는 6-7일이다. 후기 공동배양의 기간은 1-20일, 바람직하게는 2- 10일, 보다 바람직하게는 3-9일, 가장 바람직하게는 6-7일이다.

공동배양시 이용되는 배지는, 당업계에서 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 것도 가능하다. 예를 들어, KGM, FGM, DMEM, MEM, F-12, RPMI 및 DMEM:F12의 3:1 혼합배지에 FBS가 첨가된 배지를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 공동배양의 초기 배양 (액내배양 조건 하에서의 배양)은 KGM을 이용하여 실시하고, 후기 배양 (공기-건조 조건 하에서의 배양)은 DMEM:F12의 3:1 혼합배지에 10% FBS가 첨가된 배지를 이용하여 실시한다.

한편, 본 발명은 콜라겐이 코팅된 생체적합성 스캐폴드뿐만 아니라, 콜라겐이 코팅되지 않은 생체적합성 스캐폴드에도 적용된다. 본 발명이 콜라겐 비코팅-스캐폴드에 적용되는 경우에는, 바람직하게는 우선적으로 섬유아세포를 접종하고 어느 정도 배양한 후에 피부각질세포를 접종하여 공동배양한다. 이러한 변형예에따르면, 본 발명은 (ⅰ) 섬유아세포를 생체적합성 스캐폴드에 접종하고 배양하는 는 단계; (ⅱ) 피부각질세포를 상기 스캐폴드에 접종하는 단계; (ⅲ) 상기 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포를 공동배양하는 단계를 포함한다. 상기 단계 (ⅰ)의 배양은 액내 배양이 바람직하다. 액내배양 기간은 1-20일, 바람직하게는 2-10일, 보다 바람직하게는 3-9일, 가장 바람직하게는 6-7일이다. 상기 단계 (ⅱ)의 배양은 초기에는 액내배양이 바람직하고, 후기에는 공기-건조 조건에서 실시하는 것이 바람직하다. 초기 공동배양의 기간은 1-20일, 바람직하게는 2-10일, 보다 바람직하게는 3-9일, 가장 바람직하게는 6-7일이다. 후기 공동배양의 기간은 1-20일, 바람직하게는 2-10일, 보다 바람직하게는 3-9일, 가장 바람직하게는 6-7일이다.

상기한 과정을 통해 생체적합성 스캐폴드에서 배양한 결과, 섬유아세포 및 피부각질세포의 배양 효율이 매우 우수할 뿐만 아니라, 피부각질세포는 스캐폴드의 상부쪽으로 이동되어 위치하는 데, 이러한 배양 결과는 본 발명의 방법에 의해 형성된 피부각질세포-섬유아세포-스캐폴드 복합체가 피부 대체물로서 매우 유용하게 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생체적합성 스캐폴드, 섬유아세포 및 피부각질세포로 이루어져 있으며, 상기의 공동 배양방법에 의해 제조된 인공피부 대체물을 제공한다.

본 발명의 인공피부 대체물은 상술한 공동 배양방법에 의해 제조되기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 인공피부 대체물은 액내배양 (submerge) 조건 하에서의 배양과 공기-건조 (air-dry) 조건 하에서의 배양으로 실시되는 상술한 본 발명의 방법에 따라 제조된 것이고, 피부각질세포는 상기 스캐폴드의 상부에 위치해 있는 것이다.

본 발명의 인공피부 대체물은 피부결함을 치료할 수 있는 충분한 양의 섬유아세포 및 피부각질세포를 포함하며, 피부각질세포가 상부에 위치해 있는 3-차원 구조를 가지기 때문에 인공피부 대체물로서 매우 유용하다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생체적합성 스캐폴드의 표면에 콜라겐이 코팅된 콜라겐-코팅 생체적합성 스캐폴드를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 스캐폴드는 키토산, 글리코스아미노글리칸, 젤라틴, 하이드록시애퍼타이트, 폴리-d,l-락트산, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜산, 혼합 d,l-락트산과 글리콜산의 공중합체, L-락트산과 글리콜산의 공중합체, 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리(락트산-카프로락톤), 폴리(글리콜산-카프로락톤),히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 키토산, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane) 및 카제인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체적합성 스캐폴드는 키토산이며, 가장 바람직하게는 중화 키토산 스폰지이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 콜라겐-코팅 생체적합성 스캐폴드는 섬유아세포 및 피부각질세포의 공동배양에 이용되는 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

1. 인체 진피 섬유아세포 (Human Dermal Fibroblast)의 배양

수술 직후 얻은 피부 조직을 5% PS 가 포함된 PBS (phosphate buffered saline)로 10 회 이상 세척하고 대부분의 지방조직을 가위로 제거하였다. 조직을 2 mm 단위로 절편을 만들고 4℃에서 10 유닛의 디스파아제 (dispase, Roche, Mannheim, 독일))를 16시간 처리하여 상피 세포층을 분리한 후, 37℃에서 2시간 동안 0.35%의 콜라게나아제 (collagenase, Roche, Mannheim, 독일)를 처리하여 진피 세포층에 분포하는 섬유아세포를 단일세포로 분리해냈다. 섬유아세포를 FGM-2 [섬유아세포 배지(Cambrex, walkersville, MD, USA)에 2% FBS, 1 ng/㎖ hFGF-B (human basic fibroblast growth factor), 5 ㎍/㎖ 인슐린, 0.1% 젠타마이신, 암포테리신 B]에서 배양하였다.

2. 인체 피부각질세포(keratinocyte)의 배양

절제된 조직을 5% PS 가 포함된 PBS로 8 회 이상 세척하여 응고된 혈액과 오염물들이 제거되도록 하였다. 이 과정에서 진피 쪽의 혈관과 지방층을 가능한 깨끗이 제거하고, 조직을 5 mm 정도로 잘게 절단하였다. 절단된 조직을 50 ㎖ 원심튜브에 옮긴 후, 트립신 용액 (0.125% trypsin : versene = 1 : 1) 10 ㎖를 첨가한 후, 마그네틱 바를 이용하여 실온에서 1시간동안 물리적인 자극(100 rpm)을 주어 피부각질세포가 떨어져 나오도록 하였다. 트립신 용액에 40 ㎖의 PBS를 첨가하여 1,200 rpm, 4℃에서 5분간 원심분리 한 후, 상등액을 제거하였다. 피부각질세포 침전물에 20% FBS 가 포함된 KGM [keratinocyte growth media: 피부각질세포 배양액 (Cambrex, walkersville, MD, USA) 0.4% BPE (bovine pituitary extract), 0.1 ng/㎖ hEGF (human epithelial growth facotr), 5 ㎍/㎖ 인슐린, 0.5 ㎍/㎖ 하이드로코티손, 0.1% 젠타마이신, 암포테리신 B] 10 ㎖ 를 첨가하여 원심분리(1,200 rpm, 4℃, 5분간)하였다. 원심분리가 끝난 후, 상층액을 제거한 원심튜브에 1-4 ㎖ 의 새로운 KGM 배지를 넣어 세포를 단일화하였다. 세포수를 계산하여 0.1 mg/㎖ 콜라겐 IV (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA)가 코팅된 10 cm의 배양접시 한 개당 3-5 x 10⁵ 개의 세포수가 되도록 분주하였다.

3. 키토산 스캐폴드 I의 제작

부피 1 L을 기준으로 1.5％ 키토산 (15 g), 1％ 아세트산 (10 ㎖) 그리고 멸균 증류수를 넣어 제작 원료를 만들어 상온에서 12시간 정도 쉐이킹 하였다. 만들어진 용액을 유리 필터로 여과한 후 용액의 기포를 제거하기 위해서 4℃ 냉장고에서 하룻밤 동안 보관하였다. 몰드 (9× 11 ㎝)에, 상기 지지체 원료를 35 g 붓고 평평하게 골고루 몰드에 퍼지도록 한 다음, -80℃ 냉동고에서 하룻밤 동안 급속 동결시킨 후, 냉동고에서 꺼내 -70℃ 진공 5 torr인 동결건조기에 넣어 24시간 동안 건조시켰다. 지지체에 잔류하는 아세트산이 없도록 하기 위해, 알코올 세척을 하였다. 100% 알코올로 1시간씩 세척 2회, 70% 알코올로 1시간씩 세척 2회, 50% 알코올로 1시간씩 세척 2회 후 알코올 제거를 위해 3차 증류수로 1시간 세척하고, 증류수를 교체한 후 하룻밤 동안 놓아두었다. 이어, 3차 증류수로 교체하고, 30분 세척 후 -80℃ 냉동고에 하룻밤 동안 보관하여 급속 동결시켰다. 그런 다음, 냉동고에서 꺼내 -70℃, 진공 5 torr인 동결건조기에 넣어 24시간 동안 건조시켜 최종적으로 키토산 스캐폴드를 제조하였다.

4. 키토산 스캐폴드 II의 제작

본 발명자들의 대한민국 특허 제298846호에 개시된 방법에 따라 중화 키토산 스폰지를 제작하였다.

5. 키토산 스캐폴드의 타입 I 콜라겐에 의한 코팅

60％ 알코올에 실험에 필요한 크기의 지지체(상기에서 제조된 키토산 스캐폴드)를 넣고 귀지용 솜으로 키토산 지지체를 살살 눌러 기포를 제거해 지지체에 알코올이 완전히 스며들게 하였다. 이어, 1-2시간 동안 상온에서 방치 후 흡착지 (kimwipes)를 이용 알코올을 제거하였다. 그런 다음, 클린 벤치 안에서 0.3% 타입 I 콜라겐 (Vitrogen)을 PBS로 현탁하여 0.1%로 만든 후, 키토산 지지체와 혼합하고 4℃에서 2시간 동안 쉐이킹 하였다. 코팅된 키토산 지지체를 페트리 디쉬에 잘 펴서 -80℃ 냉동고에 하룻밤 동안 보관하여 급속 동결시킨 다음, 냉동고에서 꺼내 -70℃, 진공 5 torr인 동결건조기에 넣고 24시간 동안 건조시켰다. 동결건조 된 콜라겐-코팅 키토산 지지체를 4℃에서 보관 하거나 또는 UV 처리 후 PBS에 적신 뒤 배지에 3-4일 동안 함침시킨 다음 실험에 사용하였다.

콜라겐 코팅 여부를 확인하기 위하여, 타입 I 콜라겐에 대한 면역조직화학 염색을 실시하였다. 도 8에서 확인할 수 있듯이, 콜라겐은 키토산 스캐폴드의 표면 및 끝면뿐만 아니라, 스캐폴드 두께의 중간 부분에도 코팅되어 있음을 알 수 있다.

키토산 스캐폴드(chitosan scaffold)에 세포 접종과 배양

상기 실험방법 4에서 제조된 키토산 스캐폴드 또는 콜라겐-코팅된 실험방법 4의 키토산 스캐폴드를 8 mm 생검 펀치로 자른 후, FGM-2 배지에 한 시간 동안 담가두어 충분히 세척하였다. 8 mm 키토산 스캐폴드에 흡수된 배지를 거의 제거한 후, 섬유아세포와 피부각질세포 현탁액을 접종하여 흡수되게 하였다. 세포를 혼합 접종하여 7일간 37℃, 5% CO₂에서 섬유아세포만 접종한 경우는 FGM-2 배지에서 피부각질세포를 혼합 접종한 경우에는 KGM 배지에서 배양하였다. 콜라겐 코팅이 된 경우에는 1, 5, 10, 50 x 10³ 개의 섬유아세포만을 접종하거나, 5 x 10⁴ 개의 섬유아세포와 3 x 10⁵ 개의 피부각질세포를 혼합 접종하여 7일간 배양하였다. 피부 각질세포를 혼합한 경우에는 7일간 배양액에 잠기도록 액내배양 (Submerged culture)하고, 키토산 스캐폴드의 실리콘 막을 벗겨 제거하고 밀리셀 (millicell)에 옮긴 후 E-배지 [10% FBS, DMEM(dulbecco's modified eagle medium):F-12(nutrient mixture)를 3:1로 혼합한 배지]에서 다시 7일간 공기-건조 (air-dry) 조건 하에서 배양하였다. 액내배양 하는 동안 섬유아세포만 접종한 군은 FGM-2 배지에서 배양하였으며, 피부각질세포를 혼합한 군은 KGM 배지에서 배양하였다.

ABC 법을 이용한 PCNA , 바이메틴 , 판- 사이토케라틴 조직염색

파라핀 블록을 4 μm 두께로 박절한 후 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다. 탈파라핀 과정을 위해서 자일렌 (xylene)에서 5분간 3번, 100% 에탄올에서 2분간 3번, 90% 에탄올에서 1분간 1번, 80% 에탄올에서 1분간 1번, 70% 에탄올에서 1분간 1번 반응시킨 후, PBS에서 10분간 세척하였다. 전 처리 과정을 위해서 0.5% 과산화수소를 포함한 메탄올에서 10분간, 0.3% PBST (Tween 20이 0.05% 함유된 PBS)에서 5분간, 100℃로 끓인 0.01 M 소듐 시트레이트 용액에서 10분간 반응시켰다. 비 특이적인 단백질의 반응을 억제하기 위해서 PBS에 1% 노말 블로킹 혈청 (normal blocking serum)을 혼합한 용액에서 30분간 반응시켰다. 바이멘틴 (vimentin : Dako, Carpinteria, CA, 미국), 판사이토케라틴 (pancytokeratin: Dako, Carpinteria, CA, 미국), PCNA (proliferating cell nuclear antigen: (Dako, Carpinteria, CA, 미국)에 대한 일차항체(Primary Antibody)를 각각 1% 노말 블로킹 혈청에 혼합하여 40분간 반응시킨 후 바이오틴이 붙어있는 유니버설 이차항체 (Universal Secondary Antibody, Vector, Burlingame, CA, 미국)를 35분간 반응시켰다. 스트렙타비딘이 부착된 스트렙타비딘 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (streptavidin-conjugated horseradish peroxidase, Vector, Burlingame, CA, 미 국)를 30분간 반응 시켰다. 발색제로는 DAB (Diaminobenzidine : Dako, Carpinteria, CA, 미국)용액에 3.5% 과산화수소와 니켈을 혼합하여 사용하였다. 카운터염색 (Counterstain)으로는 패스트 레드 (fast red, Sigma, Saint Louis, MO, USA)를 사용하였다. 70% 에탄올에 1초간 10번, 80% 에탄올에 1초간 10번, 90% 에탄올에 1초간 10번, 100% 에탄올에 1분간 2번, 자일렌에 3분간 3번 반응 시킨 후, 마운틴 (mounting)용액으로 마운팅 하였다.

H & E 염색

파라핀 블록을 4 μm 두께로 박절한 후 건조시켜 파라핀 절편을 제작하였다. 탈파라핀과정을 위해 자일렌에서 5분간 3번, 100% 에탄올에서 2분간 3번, 90%에탄올에서 1분간 1번, 80% 에탄올에서 1분간 1번, 70% 에탄올에서 1분간 1번 반응시킨 후, 흐르는 물에 10분간 세척하였다. 헤마토자일린 (Hematoxylin) 염색액에 10분간 반응 시킨 후 흐르는 물에 3분간 세척하고 에오신 (Eosin) 염색액에 10분간 반응시킨 후, 흐르는 물에 에오신 염색액이 나오지 않을 때가지 세척하였다. 70% 에탄올에 1초간 10 번, 80% 에탄올에 1초간 10번, 90% 에탄올에 1초간 10번, 100% 에탄올에 1분간 2번, 자일렌에 3분간 3번 반응 시킨 후, 마운팅 용액으로 마운팅 하였다.

키토산 스캐폴드 ( chitosan scaffold)에 섬유아세포와 피부각질세포의 시간차 접종과 배양

키토산 스캐폴드를 10 mm 생검 펀치로 자른 후, FGM-2 배지에 한 시간 동안 담가두어 충분히 세척하였다. 본 실험에서 이용된 키토산 스캐폴드는 상기 실험방법 3에서 제조된 키토산 스캐폴드로서 콜라겐 코팅이 되지 않은 것이다. 10 mm 키토산 스캐폴드에 흡수된 배지를 거의 제거한 후, 섬유아세포를 cm² 당 7 x 10⁵개 접종하여 흡수되게 하였다. 37℃, 5% CO₂, 인큐베이터에서 7일간 FGM-2 배양액에서 잠기도록 액내배양 (Submerged culture)하고, 키토산 스캐폴드의 실리콘 막을 벗겨 제거하고 밀리셀 (millicell)에 옮긴 후 1 x 10⁶개의 피부각질세포를 스캐풀드 위쪽에 접종하였다. 37℃, 5% CO₂, 인큐베이터에서 7일간 E-배지 [10% FBS, DMEM(Dulbecco's modified eagle medium): F-12(nutrient mixture)를 3:1로 혼합한 배지]에서 다시 잠기도록 액내배양(Submerged culture)하고, 7일간 같은 배지에서 공기-건조 (air-dry) 조건 하에서 배양하였다.

실험결과

키토산 스캐폴드에서 인체 진피 섬유아세포의 증식 및 생존

키토산 스캐폴드의 사용에 의한 3차원 배양 (three dimensional culture)에서 인체 진피 섬유아세포가 생존하고 증식할 수 있는지 확인하였다. 인체 진피 섬유 아세포는 타입 I 콜라겐을 코팅한 키토산 스캐폴드의 경우 8 mm 직경의 환형 스캐폴드 각각에 1 x 10³, 5 x 10³, 10 x 10³, 50 x 10³ 의 농도로 접종되었고, 타입 I 콜라겐을 코팅하지 않은 키토산 스캐폴드의 경우 8 mm 직경의 환형 스캐폴드 각각에 1 x 10⁶, 3 x 10⁶, 6 x 10⁶, 10 x 10⁶ 농도로 접종되었다. 접종 후 인체 진피 섬유아세포는 FGM-2 배지를 이용하여 7일 동안 일반적인 세포배양조건에서 배양되었다. 키토산 스캐폴드에서 인체 진피 섬유아세포의 생존과 증식을 확인하기 위하여 헤마토자일린/에오신 염색 (H/E 염색) 및 섬유아세포 표지 단백질인 바이멘틴에 대한 면역조직화학반응 (immunohistochemistry)을 수행하였다.

인체 진피 섬유아세포는 타입 I 콜라겐을 코팅한 키토산 스캐폴드와 코팅하지 않은 키토산 스캐폴드에서의 세포 접종 농도에 비례하여 증식되었다 (도 1 및 도 2 ). 이러한 결과는 키토산 스펀지는 인체 진피 섬유아세포의 3-D 배양에 있어서 적당한 스캐폴드임을 보여준다.

키토산 스캐폴드에서의 인체 진피 섬유아세포 및 인체 피부각질세포의 증식과 생존

인체 각질세포와 혼합하지 않은 인체 진피 섬유아세포뿐만 아니라, 인체 진피 섬유아세포와 피부각질세포의 혼합물 또한 키토산 스캐폴드를 이용한 3-D 배양에서 생존하고 증식할 수 있는지 살펴보았다. 섬유아세포와 피부각질세포를 타입 I 콜라겐이 코팅된 8 mm 직경의 원형 키토산 스캐폴드에 각각 5 x 10⁴와 3 x 10⁵ 의 농도로 접종하였다 (도 4). 타입 I 콜라겐이 코팅되지 않은 경우에는 8 mm 직경의 원형 키토산 스캐폴드에 섬유아세포와 피부각질세포를 각각 1 x 10⁷ 및 3 x 10⁵ 의 농도로 접종하였다 (도 3). 접종 후, 세포들은 7일 동안 FGM-2 배지를 이용하여 액내배양 되었다. 피부각질세포를 분화시키기 위하여, 세포들은 다시 7일 동안 공기-건조 상태에서 배양되었다.

첫째로, 키토산 스캐폴드에서 세포의 생존과 증식을 확인하기 위하여 H/E 염색과 PCNA에 대한 면역조직화학반응을 실시하였다. 두 번째로, 섬유아세포의 표지단백질인 바이멘틴 또는 피부각질세포의 표지단백질인 판-사이토케라틴에 대한 면역조직화학반응을 실시하여 배양된 세포가 섬유아세포인지 피부각질세포인지를 입증하였다. H/E 염색과 PCNA에 대한 면역조직화학반응에서 살펴보면 세포들은 타입 I 콜라겐이 코팅되거나 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드 모두에서 잘 증식되었다 (도 3 및 도 4).

그 후, 키토산 스캐폴드에서 증식하는 세포를 동정하기 위하여 면역조직화학반응을 행하였다. 타입 I 콜라겐으로 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드의 경우에는, 대부분이 바이멘틴 포지티브(+)세포이고 판-사이토케라틴 네거티브(-)세포였다 (도 3 및 도 5). 그러나 타입 I 콜라겐이 코팅된 키토산 스캐폴드에서는 바이멘틴 포지티브(+)세포와 판-사이토케라틴 포지티브(+)세포를 모두 관찰할 수 있었다 (도 4 및 도 6). 이러한 결과는 타입 I 콜라겐이 코팅된 키토산 스캐폴드가 섬유아세포와 피부각질세포의 공동 배양에 특히 바람직하다는 것을 보여준다.

또한, 놀랍게도, 피부각질세포, 판-사이토케라틴 포지티브(+)세포는 공기-건조 조건을 준 경우 스캐폴드의 상부쪽으로 이동되었다(도 6의 패널 D). 이러한 각질세포의 이동은 피부 대체물로서의 사용 가능성을 더욱 명확하게 보여준다.

키토산 스캐폴드에서 섬유아세포와 피부각질세포의 시간차 접종과 공동배양

섬유아세포와 피부각질세포를 동시에 접종하여 공동배양하는 경우뿐만 아니라, 시간적 차이를 두고 접종하고 공동배양하는 경우에도, 키토산 스캐폴드를 이용한 3-D 배양에서 두 세포가 잘 증식할 수 있는지를 조사하였다.

타입 I 콜라겐으로 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드에 섬유아세포와 피부각질세포를 동시에 접종하였을 경우, 섬유아세포의 표지 단백질인 바이멘틴 포지티브(+)세포이고 피부각질세포의 표지 단백질인 판-사이토케라틴 네거티브(-)세포였다 (도 3 및 도 5). 그러나 타입 I 콜라겐이 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드에 섬유아세포를 먼저 접종하여 7일간 액내배양하고, 피부각질세포를 상부 층에 접종하였을 경우에는 도 9에서 확인할 수 있듯이 섬유아세포의 표지 단백질인 바이멘틴 포지티브(+)세포이고 피부각질세포의 표지 단백질인 판-사이토케라틴 포지티브(+)세포를 모두 관찰할 수 있었다. 이는 타입 I 콜라겐이 코팅되지 않은 키토산 스캐폴드에 섬유아세포를 먼저 접종하여 7일간 액내배양 하는 동안 섬유아세포에 의해서 생산된 타입 I 콜라겐이 피부각질세포의 생착률을 도왔기 때문이라고 판단된다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 피부유래 섬유아세포와 피부각질세포를 공동으로 배양하는 방법, 인공피부 대체물 및 콜라겐-코팅 생체적합성 스캐폴드를 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 피부 진피층의 주세포인 섬유아세포와 피부 표피층의 주세포인 피부각질세포를 우수한 효율로 공동 배양할 수 있 어 인공피부 대체물을 제작하는 데 매우 효율적이며, 이렇게 하여 제작된 인공피부 대체물에서 피부각질세포는 스캐폴드의 상부쪽으로 이동되어 위치하는 데, 이러한 3차원 구조는 본 발명의 피부각질세포-섬유아세포-스캐폴드 복합체가 피부 대체물로서 매우 유용하게 이용될 수 있음을 보여주는 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (12)

1. 다음의 단계를 포함하는 섬유아세포 및 피부각질세포를 공동배양하는 방법.

   (a) 섬유아세포 및 피부각질세포를 생체적합성 스캐폴드에 동시에 접종하는 단계;

   (b-1) 상기 생체적합성 스캐폴드에 동시에 접종된 섬유아세포 및 피부각질세포를 액내배양 (submerge) 조건 하에서 동시에 배양하는 단계; 및

   (b-2) 상기 배양된 섬유아세포 및 피부각질세포를 공기-건조 (air-dry) 조건에서 동시에 배양하는 단계.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 스캐폴드는 콜라겐으로 코팅된 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 생체적합성 스캐폴드는 키토산, 글리코스아미노글리칸, 젤라틴, 하이드록시애퍼타이트, 폴리-d,l-락트산, 폴리-L-락트산, 폴리글리콜산, 혼합 d,l-락트산과 글리콜산의 공중합체, L-락트산과 글리콜산의 공중합체, 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리(락트산-카프로락톤), 폴리(글리콜산-카프로락톤),히아루론산(hyaluronic acid) 및 그의 유도체, 키틴, 키토산, 알지네이트(alginate), 피브로넥틴, 폴리안히드라이드 (polyanhydride), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리우레탄(polyurethane) 및 카제인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 생체적합성 스캐폴드는 키토산인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 2 항에 있어서, 상기 콜라겐은 타입 Ⅰ 콜라겐인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 삭제
7. 생체적합성 스캐폴드, 섬유아세포 및 피부각질세포로 이루어져 있으며, 상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 인공피부 대체물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 인공피부 대체물은 상기 제 1 항의 방법에 의해 제조되고 상기 피부각질세포는 상기 스캐폴드의 상부에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 인공피부 대체물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제

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