KR20030050168A - 모근 간엽세포로부터 제조된 진피대체물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모근 간엽세포를 이용하여 제조된 진피대체물에 관한 발명으로, 모근 특히 수염모근에서 분리한 간엽세포는 섬유아세포에 비해 세포의 재생을 촉진시키는 성장인자 및 기질단백질은 많이 만드는 반면 기질단백질을 분해하는 효소는 적게 만들기 때문에 본 발명의 간엽세포를 사용하여 제조된 진피대체물은 기존의 선행기술에 비해 세포재생효과 등이 더 우수하다.

Description

모근 간엽세포로부터 제조된 진피대체물{Bioartificial skin prepared from mesenchymal cells of hair follicle}

본 발명은 생 진피대체물에 관한 발명으로, 더욱 상세하게는 모근 간엽세포를 이용하여 제조된 진피대체물에 관한 발명이다.

일반적으로, 심부화상과 같은 전층피부 결손부위를 치료하는 데 가장 이상적인 방법은 자신의 전층피부를 채취하여 이식하는 방법이지만 공여부를 일차봉합하여야 하므로 이용할 수 있는 피부의 양이 매우 제한되어 있다. 따라서 부분층 피부이식술이 최선의 치료방법으로 되어 있으나, 광범위한 화상상처를 덮기 위한 생체 드레싱으로 냉동보관 또는 생 인간 시체 피부를 사용하기도 한다(Atnip and Burke,1983, Curr Prob. Surg.20: 623 -86). 이러한 상처에 대한 냉동보관된 이식피부는 냉동, 해동 그리고 냉동보관에 따른 각질형성세포 및 섬유아세포의 생존도의 감소 때문에 신선한 피부보다 그 성능이 낮다. 이외에도 냉동보존 과정에 의해, 기저막과 같은 피부의 물리적 조성물 중 일부가 파괴되어 세포의 생존도를 감소시킨다.

신선한 시체 피부 이식은 자가이식할 피부가 부족하거나, 공급이 제한될 때는 사용되는 경우가 있으나, 시체이식피부의 문제점은 이식 수 초내에 호스트 면역거부를 일으킨다. 몇 달은 완전히 상처를 아물게 하기 위해 자가이식을 위한 환자 자신의 피부를 다시 모으기 위해 회복된 제한된 공여 부분이 필요하기 때문에 큰 화상환자에게 있어서 중요한 문제가 될 수 있다. 이식피부의 빠른 거부반응은 그것의 반복된 적용을 필요로 하나 거부반응은 박테리아에 의한 감염(Monafo & Bradley, 1976, J. Am. Med. Assoc. 235:1248-9) 등을 수반하여 차후의 이식을 제한할 수 있을 수 있는 문제점이 있다.

따라서 이런 경우에 이용할 수 있는 인공피부에 대한 연구가 많이 진행되어 왔다. 인공피부는 초기에 표피와 진피층이 따로 개발되어 부분적으로 임상에 이용하였으나, 모두 문제점이 제기되어 있으며, 현재는 인공진피 이식 후 부분층 식피편으로 덮어 주거나, 배양한 표피세포로 덮는 방법을 이용하고 있다. 인공진피는 콜라겐을 스폰지나 젤형태를 만들어 이용하거나 흡수성 폴리머를 이용하여 만들고 있다.

참고로, 현재까지의 인공피부에 대한 연구들을 요약하면 다음과 같다.

1) 배양된 자가조직 각질층 이식(Cultured Autologous Keratinocyte Graft)

표피세포를 배양하여 전층 피부 결손 부위에 이용할 수 있다는 사실은 1950년대부터 인식되어 왔다. 1975년 Rheinwald와 Green에 의해 배양기 바닥을 간엽세포(mesenchymal cell)로 깔고 표피성장인자(EGF)나 콜레라 독소와 같은 성장촉진제를 첨가해 주면 표피세포가 신속히 증식된다는 사실이 보고되었다. 현재는 이들의 연구를 바탕으로 소량의 표피세포를 3∼4주만 배양하여도 5000배로 분열증식하여 성인의 체표면(1.7m2)을 모두 도포할 수 있게 발전하였다.

표피세포를 이식용으로 이용하려면 정상적인 분화과정을 유도하여야 한다. 표피세포를 고식적으로 배지 내에서 배양하면 비정상적인 분화가 일어나서 이식용으로 이용할 수 없다. 즉 각질층이 만들어지지 않아서 이식 후 표피세포가 건조, 손실되며, 생화학적 분화가 불완전하게 일어나서 표피층의 골격유지와 방어 기능에 문제가 생기게 된다. Prunieras 등(1983)은 배양단계에서 표피층을 대기에 노출시키면 형태학적 분화가 정상적으로 일어난다고 하였고, 홍 등(1992)의 연구에 의하면 섬유아세포에서 심은 인공진피 위에서 배양하면 생화학적 분화가 정상적으로 일어나는 것을 알 수 있었다. 그러므로 표피세포 배양 시 인공진피 위에서 대기에 노출시켜 배양하면 이식 후 정상 표피의 기능과 구조를 되찾을 수 있다고 하였다.

O'conner(1981)가 화상 환자에 배양한 표피세포를 처음으로 이용하였고, 궤양, 모반, 표피수포증(epidermolysis bullosa) 부위에도 이식한 보고가 있으나, 생착율이 15%에서 50%까지 다양하게 보고되어 있고, 진피가 남아 있는 부위는 생착이 잘 되지만 지방, 만성 창상이나 감염창상에서는 생착이 되지 않는다.

배양한 표피세포는 생착이 되어도 창상 크기가 30% 정도로 수축이 되며, 비후성 반흔이 부분층 식피술보다 잘 생긴다. 또 이식부위가 쉽게 벗겨지거나 물집이 생기게 되는데 이런 현상은 표피층이 불안정하고 표피-진피 결합부가 늦게 만들어지기 때문이다.

2) 무세포성 인공 진피

이 인공진피는 Yanas와 Bruke(1980)에 의해 개발된 것으로, 콜라겐에 글리코스아미노글리칸을 혼합하여 급속히 동결건조시킨 뒤 고온에서 진공건조시켜 제작한다. 표피층이 없으므로, 실라스틱 시트(silastic sheet)로 덮었다가 이식후에 인공진피가 생착하면 벗겨 버리고 부분층 식피편으로 덮어 주는 두 단계 수술 방법을 이용하여야 한다.

이 인공진피는 세공이 있는 스폰지형태의 구조를 하고 있으며, 이식 후 이 세공내로 혈관, 섬유아세포, 섬유조직이 자라 들어와서 새로운 진피구조가 만들어 지고 인공진피는 흡수되게 된다. 그러므로 세공의 크기가 인공진피의 생착에 중요한 역할을 하며, 글리코스아미노글리칸의 종류나 함량, 고차결합방법, 냉동속도, 콜라겐의 농도에 따라 결정되며, 50∼150㎛이면 적당한 것으로 되어있다. 이 인공진피는 이식 후 생착율이 50∼70%로 낮게 보고되어 있으며, 이식부위에 혈종이 잘고이고, 감염율이 38%로 높으며, 체내 효소에 의해 조기 분해된다는 점을 낮은 생착율의 원인으로 들고 있다. 그러나 이 인공진피를 이용하지 못하는 가장 큰 원인은 이식 후 새로운 진피의 구조가 만들어지기 전에 체내의 콜라겐네이즈에 의해 인공진피 골격이 조기 분해되기 때문이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 글루타알데히드로 교차결합시킨 뒤 이용하였으나, 이 글루타알데히드가 세포독성이 강하다는 또 다른 문제점이 있다. 또 글루코스아미노글리칸 중 기존의 콘드로이틴-6-설페이트 대신 세포친화성이 좋은 헤파란 설페이트를 이용하면 이식 후 세포가 빨리 증식할 수 있어서 새로운 진피가 빨리 만들어 질 수 있고, 세포독성이 없는 아스코베이트-구리 이온 이용법 등이 있으나 원하는 교차결합을 유도하기에는 미약한 실정이다.

3) 세포성 인공피부

무세포성 인공진피의 경우에 두 번의 수술이 필요하다는 단점을 해결하기 위하여 배양한 표피세포로 무세포성 인공진피를 덮어서 만든 후 이 층구조로 된 인공피부이다. 이 인공진피가 스폰지 형태이어서 세공내로 세포가 빠질 수 있어서 인공진피의 표면을 콜라겐 젤이나 시트로 덮은 뒤, 이 위에 표피세포를 분주하여 제작한다. 이 인공피부는 무세포성 인공진피만 이식한 경우보다 창상 수축이 현저히 적게 일어나며, 배양 11일부터 정상 헤미데스모좀과 기저 층(lamina)과 유사한 구조가 만들어지는 것으로 보고되어 있다.

또 이 인공피부의 진피부위에 배양한 섬유아세포를 심어서 이식 후에 새로운 진피가 빨리 만들어 질 수 있도록 유도하고 있다. 이 방법을 환자에게 이식한 결과 70%의 생착율을 보인 것으로 보고되어 있고(Hansbrought, 1989), 이식 후 9일에 정착 원섬유(fibril)과 기저막이 만들어 지게 된다. 이 방법은 전층피부 결손부위에 이용할 수 있으나, 진피부위의 교차결합에 사용하는 글루타알데히드의 독성 등의 문제가 남아 있다.

4) 배양된 합성피부 이식

Bell에 의해 개발되어 생 피부 등가물(equivalent)또는 하이브리드 피부로 알려져 있는 인공피부이다. 콜라겐용액에 섬유아세포를 심고 수축시켜서 콜라겐 젤 상태로 만든 진피 부위 위에서 표피세포를 배양하여 표피부위를 만들게 된다. 진피부위의 섬유아세포는 콜라겐 젤을 성숙시켜 인공피부의 기계적 장력을 증가시켜 주고, 조작하기 쉽게 해주며, 콜라겐네이즈 분해작용에 저항성을 가지게 하며, 표피세포의 증식을 촉진시켜 준다. 또 섬유아세포는 새로운 기질을 생산하고 이식 후에 혈관이나 창상치유에 관여하는 세포가 빨리 자라 들어오게 하므로, 인공피부의 생착에 중요한 역할을 한다. Bell의 방법으로 만든 진피부위의 세포간 기질은 불규칙한 배열을 하고 시간이 지나면서 세포의 수가 감소하는 문제가 있고, 수술시에 조작이 힘들고 이식 후 진피 부위가 쉽게 분해되며, 표피세포의 생착율이 낮다는 문제점이 있다.

5) 동종피부로부터 제조된 인공진피

동종진피를 전층 피부결손부위에 이식하였을 때 거부반응 없이 생착이 되면 진피층의 두께를 보충해 주므로 전층 피부 이식을 하였을 때와 같이 우수한 결과를 얻을 수 있을 것이다. 동종피부 면역반응는 세포에 의하여 일어나고 진피의 세포간 기질은 거부 반응을 일으키지 않으므로 세포를 모두 제거하고 동결건조시켜 세포간 기질의 구조를 유지해 주면 이식용으로 이용이 가능할 수 있을 것이다. 이런 방법으로 처리한 동종진피가 AlloDerm으로 시판되고 있으나, 가격이 비싸고, 살아있는 세포조직을 사용하기 때문에 무균실에서 대량으로 배양하고 있는 살아있는 세포를 의사의 처방에 의해 환자에게 신속하게 공급하는 주문생산 체계에 의존하기 때문에 외국에서 개발된 제품을 수입하여 환자에게 공급하는 것은 오랜 기간이 소요되는 공급과정에서의 세포 괴사 현상이 문제가 있을 수 있다

6) 생분해성 폴리머로 만든 인공진피

Langer와 Vacanti에 의해 흡수성 폴리머를 이용하여 원하는 조직을 생성하는 조직공학기법이 소개된 이후 이를 인공피부에 적용한 방법이다. 콜라겐으로 제작한 인공진피는 이식 후 염증이 잘 생기고, 새로운 진피의 골격을 만들어지기 전에 분해되며, 콜라겐 대신 폴리머로 골격을 만들고 여기에 섬유아세포를 심어서 만든 인공진피이다. 미국의 Advanced Tissue Science에서 폴리그락틴을 이용하여 제작한 인공진피가 Dermagraft라는 이름으로 시판되고 있고 미국특허 제5,460,939호로 등록되어 있다. 실라스틱 시트로 덮어져 있어, 생체에 이식하고 2주 후에 혈관화가 완료되므로 실라스틱 시트를 제거하고 부분층 식피편으로 덮어주며, 생착율은 51%로 보고되어 있다. 폴리그락틴은 생체에서 60일 이내에 가수분해에 의해 분해되지만 인공진피 제작시 배지 내에서 배양하는 기간 동안에 분해되기 시작하므로 이식 후 빠른 시간 내에 분해되어 없어지게 되므로 인공진피의 역할을 제대로 수행하지 못하는 문제가 있다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 진피대체물에서 요구하는 기질단백질이나 성장인자 등이 선행기술에 비하여 훨씬 많고, 콜라겐 등을 분해하는 콜라겐네이즈 활성은 훨씬 적은 피부세포 재생능력이 뛰어난 진피대체물을 제공하는 것이다.

도 1은 모근의 구조를 나타내는 그림.

도 2는 배양상태에서 수염간엽세포(A)와 섬유아세포(B)의 모양을 나타낸 것.

도 3은 수염간엽세포와 섬유아세포를 10일간 배양하였을 때 성장속도를 나타낸 그림.

도 4는 배양상태에서 수염간엽세포(A)와 섬유아세포(B)를 α-평활근 액틴에 대한 항체로 면역염색한 결과를 나타낸 그림.

도 5는 3차원 지지틀에 수염 간엽세포를 배양한 그림.

도 6은 3차원 지지틀에서 배양된 수염 간엽세포를 염색한 결과를 나타낸 그림.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 in vitro에서 제조된 틀을 감싸는 생 기질조직 및 트랜지셔널 커버링을 포함하는 진피대체물을 제공한다.

본 발명의 기질조직은 모근 간엽세포와 모근 간엽세포에서 분비되는 결합조직단백질과 성장인자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 모근 간엽세포는 모유두세포(dermal papilla cell)와 결합조직초세포(connective tissue sheath cell)를 의미한다.

도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 모발은 상피조직과 진피조직으로 구성되어 있다. 모발의 진피조직은 간엽세포인 모유두와 결합조직초로 이루어져 있다. 모유두는 모발의 성장과 유지에 중요한 역할을 한다고 알려져 있지만 결합조직초의 역할은 알려진바 없다. 결합조직초는 모낭의 하반부를 둘러싸고 있으며 미세혈관을 많이 포함하고 있다.

본 발명에 사용되는 모근간엽세포는 모든 모근간엽세포가 가능하지만, 두피모근 또는 수염모근의 간엽세포가 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 수염모근간엽세포를 사용하였다.

또, 참고예 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 근섬유아세포(myofibroblast)에 특징적으로 존재하는 α-평활근 단백질 SM22와 α-평활근 액틴이 섬유아세포에는 거의 검출되지 않으나, 모근 간엽세포에서는 많이 검출되는 것으로 보아 본 발명의 모근 간엽세포는 섬유아세포보다는 근섬유아세포에 가까운 성질을 갖는다.

또한, 진피대체물에 있어서 가장 중요한 것이 콜라겐, 피브로넥틴, 데코린, 오스테오넥틴과 같은 기질단백질과 CTGF, PEDF, PDGF-α, IGF, TGF 등의 성장인자와 글리코사미노글라이칸 등이므로, 본 발명은 참고예 2에서 알 수 있는 바와 같이, 선행기술의 기질세포로 사용한 섬유아세포에 비해 이들 활성은 크고, 기질단백질을 분해하는 콜라겐네이즈 활성은 섬유아세포보다 적은 모근 간엽세포를 이용하여 피부세포 재생능력이 뛰어난 진피대체물을 제공할 수 있다.

본 발명은 실라스틱 쉬트 등의 트랜지셔널 커버링에 연결되어 있는 3차원의 생기질 조직을 포함한다. 이 바깥쪽의 트랜지셔널 커버는 3차원으로 짠 나이론 메시(mesh)상에서 배양한 인간 모근 간엽세포를 포함하는 밑에 있는 살아있는 피부조직과 기계적으로 연결되어 있다. 따라서 본 발명의 진피대체물을 상처부위 등에 놓으면, 상기 대체물이 콜라겐, 피브로넥틴, 성장인자 및 사이토카인 등을 분비하고, 상당기간동안 조밀한 밑에 있는 혈관을 성장시키면서, 상처부위와 강하게 결합한다.

본 발명은 살아있는 모근 간엽세포를 접종하여 증식하게 하여 3차 기질세포를 형성하는 틀에 결합된 바깥 표피층으로 트랜지셔널 커버를 갖는 생합성 드레싱물질을 갖는 진피대체물에 관한 발명이다.

모근간엽세포는 성장하고, 틀을 싸는 과정에서 많은 양의 기질 단백질과 사이토카인을 분비한다.

진피대체물 제조를 위한 모근 간엽세포는 조직을 얻기 전과 그 사이에 HIV 등과 같은 감염원에 대한 스크린을 하였고, 배양된 세포는 중간중간에 프로브와 PCR을 포함하는 매우 정교한 바이러스 분석을 사용하여 스크리닝하였다. 또 분리된 모근세포는 모든 스크리닝의 결과가 음성이 나올 때 까지 더 이상 in vitro 증식이 없이 냉동보관하였다. 따라서, 배양된 세포로부터의 전염병등의 전달에 대한 위험을 최소화하였다.

본 발명의 진피대체물은 살아있는 기질조직/트랜지셔날 커버링을 형성하는 합성표피로 트랜지셔널 커버링에 결합된 3차원틀위에서 배양된 모근간엽세포와 같은 기질세포를 포함한다.

일반적으로 트랜지셔날 커버링은 세포가 배양되고 성장하는 3차원 지지틀에 연결된 반투막으로 구성되어 있다.

3차원 지지틀은 세포가 거기에 붙게 하여야 하고, 세포가 한 층 이상 성장할 수 있게 하여야 한다. 지지틀에는 나이론(폴리아미드), 다크론(폴리에스테르), 포리스틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐화합물, 폴리카보네이트 (PVC), 나이트로셀루로스, 면, 셀루로스, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 덱스트란 등이 사용된다.

In vivo에서 사용하기 위해서는 폴리그락틱산, 폴리글리코릭산, 콜라겐, 피브린 또는 젤라틴 등의 생분해성 물질을 사용한다. 특히 키틴과 키토산은 in vivo에서 사용하기 위해 생분해성 틀을 만드는 물질로 바람직하다. 키틴은 갑각류나 진균류의 구조중합체를 이루는 다당류이고, 키토산은 키틴에서 초산기를 제거한 것으로, 키틴/키토산은 상처드레싱에 사용된다. 키틴과 키토산은 지혈, 세포성장기질, 항 미생물활성 및 상처를 아물게 하는 활성이 있다.

키토산은 알카리처리하여 다양한 분자량으로 얻을 수 있다.

다른 세포 또는 요소를 갖거나 갖지 않는 모근간엽세포를 포함하는 기질세포는 트랜지셔널 커버링에 연결된 3차원의 틀 위에 접종한다.

모근 간엽세포를 접종 후에 3차원 틀을 적당한 영양배지에서 배양한다. 그런 배지로는 DMEM, RPMI1640, Fisher's 등이 있다. 증식활성을 최대화하기 위해서 배양기간 동안 3차원 기질조직을 배지 내에 부유 시켜야 한다. 이 외에도 주기적으로 새로운 배지로 배지를 교환하여 주어야 한다. 외부단백질의 위험을 피하기 위해서 혈청이 없는 배지를 사용할 수도 있다.

3차원 기질 지지체의 배양동안, 증식하는 세포는 틀로부터 떨어져 나올 수 있다. 이들 떨어져 나온 세포들은 배양기의 벽에 붙어서 증식을 계속하고, 융합성 단층을 형성한다. 이것은 예를 들어, 배지공급 동안 방출된 세포를 제거하거나, 붙어 있는 3차원 기질조직을 갖는 드레싱물질을 새로운 배양기로 옮겨서 최소화할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 콜라겐-키토산-글리코자미노글리칸으로 된 3차원 기질 지지체에 수염에서 분리된 간엽세포를 배양하여 제조하였다.

이하, 본 발명을 비한정적인 참고예 및 실시예를 통하여 더욱 상세하게 설명한다.

참고예 1: 모근 간엽세포의 분류학상의 섬유아세포와의 차이 실험

1) 모근 간엽세포 및 섬유아세포 배양

남성형탈모증 환자로부터 수염이 있는 조직을 생검하여 수염 모근을 분리하였다. 분리한 수염모근의 상부 2/3를 제거한 후 남은 하부1/3을 5% 이산화탄소 하에서 배양하였다. 섬유아세포는 포경수술시 얻은 피부에서 분리하였다. 배양액은 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100ug/ml), 그루타민(0.584 mg/ml), 20% 우태혈청이 들어있는 Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하였으며 배양액은 매3일마다 교체하였다. 배양 4주 후 각 세포들을 0.25% 트립신과 0.02% EDTA 용액으로 채취한 후 계대배양하였다. 3번째 계대배양된 세포를 이용하여 10일간 세포의 성장속도를 측정하였다.

2) 면역조직염색

배양된 세포를 메탄올에 5분간 고정한 후 α-평활근 액틴에 대한 단항체와 실온에서 1시간 반응시켰다. PBS(Phosphate-buffered saline) 으로 세척 후 바이오틴처리된 항-마우스 항체(Dako, Glostrup, Denmark)로 1시간, 그리고 호스래디쉬 과산화효소 연결된 스텝타비딘(horseradish peroxidase-linked steptavidin)과 1시간 반응시켰다. 1% 과산화수소와 5% 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)으로 발색시킨 후, 헤마토시린 (hematoxylin)으로 배경 염색하였다.

그 결과는 다음과 같다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이 섬유아세포는 세포모양이 방추형이지만 수염의 간엽세포는 세포질 돌기가 많으며 평편하게 퍼진 모양으로 세포끼리 뭉쳐지는 특징을 보였다.

또, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 세포의 성장속도는 섬유아세포가 수염의 간엽세포에 비해 빨랐다.

또한, 도 4에서 알 수 있는 바와 같이 섬유아세포와 수염의 간엽세포를 α-평활근 액틴에 대한 항체로 면역염색을 시행한 결과, 섬유아세포는 염색이 거의 되지 않지만 수염의 간엽세포는 염색이 진하게 되었다. 이는 수염의 간엽세포가 섬유아세포보다는 근섬유아세포에 가깝다는 것을 의미한다.

참고예 2: 모근 간엽세포 및 섬유아세포로부터 cDNA 라이브러리 제작 및 cDNA 분석을 통한 유전자 발현 빈도 차 실험

참고예 1의 모근간엽세포와 섬유아세포의 배양방법과 같은 배양방법으로 이들 세포가 70% 정도 밀생상태로 자랐을 때 poly(A+) RNA를 추출하였다. 각 세포에서 추출한 poly(A+) RNA 5μg을 가지고 Uni-Zap XR cDNA synthesis kit(Stratagene, 미국)을 이용하여 λZAP II vector(Stratagene)에 클로닝하여 cDNA library를 얻었다. Phage library는 ExAssist/SOLR system(Stratagene)을 이용한 massin vivoexcision에 의해 pBlueScript phagemid cDNA library로 변환시켜 plasmid clone으로 얻었다. pBlueScript cDNA library는 X-gal, IPTG, 및 ampicillin을 포함한 LB plates에 접종하여 흰색의 colony가 생기는 것으로 확인할수 있었다. 각각의 colony를 무작위로 선택하였으며 선택한 클론의 plasmid DNA는 QIA plasmid extraction kits(QIAGEN)를 이용하여 분리하였고, 이 DNA의 염기서열은 Sequenase version 2.0 DNA 염기서열 분석 kit(United States Biochemical, 미국)을 이용하여 sequencing 하였다. 그 결과를 BLAST를 이용하여 GenBank의 데이타베이스와 비교검색하여 선택된 클론이 기존의 어느 유전자와 상동성을 가지는지 확인하였다. 각각의 cDNA 라이브러리에서 클론 1,400개씩을 분석하여 기질단백질, 성장인자, 기질단백질 분해효소에 대한 유전자를 비교하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1] 모근에서 분리한 간엽세포와 피부에서 분리한 섬유아세포의 성장

인자, 기질단백질, 그리고 기질단백질 분해효소의 유전자 발현 빈도

		모근간엽세포	섬유아세포
성장인자 유전자	connective tissue growth factor	29	0
	pigment epithelial-differentiation factor	4	0
	Cyr61	5	0
	IGF-2	2	0
	Mac-25	6	0
세포외 기질 유전자	fibronectin	39	20
	type I collagen	34	4
	osteonectin	31	6
	decorin	9	0
세포외 기질 분해효소	stromelysin	0	22
	collagenase	0	13

실시예: 모근간엽세포를 이용한 진피대체물의 제조

1) 수염에서 간엽세포 배양

남성형탈모증 환자로부터 수염이 있는 조직을 생검하여 수염 모근을 분리하였다. 분리한 수염모근의 상부 2/3를 제거한 후 남은 하부1/3을 5% 이산화탄소, 37℃의 조건에서 배양하였다. 배양액은 페니실린(100U/ml), 스트렙토마이신(100ug/ml), 그루타민(0.584 mg/ml), 20% 우태혈청이 들어있는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)을 사용하였으며 배양액은 매3일마다 교체하였다. 배양 4주 후 각 세포들을 0.25% 트립신과 0.02% EDTA 용액으로 채취한 후 계대배양하였다.

2) 진피대체물 제작

도 5에서와 같이, 콜라겐-키토산-글리코자미노글리칸 쉬트를 5x8 cm로 자른 후 그 위에 상기에서 배양한 수염 간엽세포를 5x105개 얹어 4∼5주간 배양하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, 수염간엽세포가 3차원 지지틀에 붙어서 잘 배양된 것을 관찰할 수 있었다.

본 발명에서 알 수 있는 바와 같이, 모근 특히 수염모근에서 분리한 간엽세포는 섬유아세포에 비해 세포의 재생을 촉진시키는 성장인자 및 기질단백질은 많이 만드는 반면 기질단백질을 분해하는 효소는 적게 만들기 때문에 본 발명의 간엽세포를 사용하여 제조된 진피대체물은 기존의 선행기술에 비해 세포재생효과 등이 더 우수하다.

Claims (6)

1. a) in vitro에서 제조된 틀을 감싸는 모근 간엽세포와 모근 간엽세포에서 분비되는 결합조직단백질을 포함하는 생기질조직 ; 및

   b) 상기 기질조직에 연결된 트랜지셔널 커버링을 포함하는 진피대체물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기의 모근 간엽세포는 모유두세포와 결합조직초세포인 것을 특징으로 하는 진피대체물.
3. 제 1 또는 제 2 항에 있어서,

   상기의 모근은 두피 또는 수염모근인 것을 특징으로 하는 진피대체물.
4. 제 1 항의 a)에 있어서,

   상기의 틀은 폴리그락틱산, 키틴, 키토산, 면, 폴리글루코릭산, 셀루로스, 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 생분해성 물질인 것을 특징으로 하는 진피대체물.
5. 제 1 항의 a)에 있어서,

   상기의 틀은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴, 폴리비닐, 폴리카보네이트, 폴리테트라플루로에틸렌 및 나이트로셀루로스로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 비생분해성 물질인 것을 특징으로 하는 진피대체물.
6. 제 1 항의 b)에 있어서,

   상기의 트랜지셔널 커버링은 실리콘 또는 폴리우레탄으로 만들어진 것을 특징으로 하는 진피대체물.