JPH05268949A

JPH05268949A - 皮脂腺細胞培養法

Info

Publication number: JPH05268949A
Application number: JP4103456A
Authority: JP
Inventors: Masami Koshiyama; 雅巳腰山; Yoshinari Tsuzaki; 芳成津崎; Hisashi Okuda; 尚志奥田; Rinshi Shiyou; 臨之庄; Jiyuuchiyuu Se; 従柱施; Eikou Ri; 英皓李
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1992-03-30
Publication date: 1993-10-19

Abstract

(57)【要約】【目的】未分化の皮脂腺細胞の長期継代培養が可能な
培養系を提供する。【構成】表皮細胞および／または真皮細胞が混在する
皮脂腺由来細胞を牛脳下垂体抽出液を添加した基本培地
を用いて培養することにより、単離された未分化の皮脂
腺細胞が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、未分化の皮脂腺細胞の
培養方法に関し、さらに詳しくは、牛脳下垂体抽出液を
含む基本培地を用いた皮脂腺細胞の培養方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】皮脂腺とは、皮膚腺の一種で、表皮性毛
嚢の細胞に由来する多細胞性の胞状腺体である。皮脂腺
の排出管は毛嚢部に開口し、皮脂腺細胞内に脂肪粒がた
まると細胞全体が壊れて脂肪様物質となり、排出管から
毛嚢部に分泌され、毛や皮膚を潤し、乾燥を防ぐ。従っ
て、皮脂腺細胞の培養技術は、脂漏、にきび等の疾患の
基礎研究、育毛剤や化粧品の開発研究のためにきわめて
重要である。

【０００３】従来、皮脂腺由来細胞の培養方法に関して
は、ヒト、ラット、アヒル等の皮脂腺に富む器官および
組織を酵素処理し、密度勾配遠心等で皮脂腺由来細胞を
分離し、牛胎児血清を含む培地を用い、マウス由来３Ｔ
３株を支持細胞として培養する方法が知られている
（Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９２、７５
１（１９８９）やＪ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏ
ｌ．、９３、３１５（１９８９）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．、１３７、２０５（１９８８））。

【０００４】しかし、これらの報告では、実質的に初代
培養の域を出なかった。また、これらの実験では支持細
胞を用いているため、支持細胞を未分化の皮脂腺細胞を
分離しにくく、従って、未分化の皮脂腺細胞のみを単離
することは困難であった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
技術のもとで未分化の皮脂腺細胞の長期継代培養を目指
し、鋭意研究の結果、牛脳下垂体抽出液を含む基本培地
を用いることによって混入し易い表皮細胞、真皮細胞を
除くことが可能であることを見いだし、ここに本発明を
完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、表皮細胞および／または真皮細胞が混在する皮脂腺
由来細胞を牛脳下垂体抽出液を添加した基本培地で培養
することを特徴とする未分化の皮脂腺細胞の培養方法が
提供される。

【０００７】本発明でいう皮脂腺細胞とは、皮脂を生合
成し、また蓄積できる皮脂腺由来の細胞をいい、通常、
増殖能を有さない。また、本発明でいう未分化の皮脂腺
細胞とは、増殖能を有するが、皮脂の生合成能を持たな
い細胞をいい、分化によってはじめて皮脂腺細胞になる
細胞である。

【０００８】一般に、細胞は器官や組織の特異性が高
く、それに比べ種の特異性が低いため、本発明に用いる
皮脂腺由来細胞の起源となる動物は、特に限定されず、
哺乳類や鳥類から適宜選択される。その具体例として
は、スンクス、マウス、ラット、モルモット、麝香鹿、
アヒル、ヒト等が挙げられる。用いる皮膚は、皮脂腺が
多く存在するものが好ましく、その例として、スンクス
の放臭腺付近の皮膚や麝香し鹿の麝香腺付近の皮膚等が
ある。

【０００９】これらの皮脂腺由来細胞は、どの様な方法
で得られたものであっても構わない。例えば、皮脂腺を
含む皮膚を常法にしたがってナイフ等で細切するか、ま
たは、適当なタンパク質分解酵素で酵素処理することに
よって得ることができる。酵素処理の場合には、混在す
る表皮細胞や真皮細胞と未分化の皮脂腺細胞との相互間
の結合が切断でき、未分化の皮脂腺細胞に付着するその
細胞の量が少なくなり、継代培養の効率が良くなる。

【００１０】酵素処理に用いる酵素は、細胞間の結合を
切断できるものであり、かつ未分化の皮脂腺細胞を破壊
したり、培養できない状態にしないものであれば、特に
限定されない。一般に、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、
トリプシン等が用いられる。酵素処理の方法は、通常の
方法で行えばよい。

【００１１】酵素処理温度は通常、０〜３７℃（但し、
培地が凍結する場合は、この範囲であっても酵素処理は
できない）、酵素処理時間は約１００個以下のクラスタ
ーとなって浮遊しているのが確認できたら処理を終えれ
ばよく、特に限定されない。

【００１２】通常、得られた細胞には、皮脂腺細胞のほ
かに表皮細胞や真皮細胞も含まれている。皮脂腺細胞以
外の細胞を除去するために密度勾配遠心分離等の遠心分
離操作を行うと、表皮細胞や真皮細胞がわずかに混在し
た状態にある皮脂腺細胞（以下、細胞群という）を得る
ことができる。

【００１３】得られた細胞群が少ない場合、該細胞群を
培養し、未分化の皮脂腺細胞を増殖させるとよい。その
培養方法は、未分化の皮脂腺細胞が増殖する限り如何な
る培地を用い、如何なる培養条件下で培養しても構わな
い。例えば、通常の培地に牛脳下垂体抽出液や牛胎児血
清を添加したものを使用した場合、５％ＣＯ₂−９５％
空気存在下、３７℃で培養すると未分化の皮脂腺細胞が
増殖する。また、皮脂腺細胞を増殖させるための培地に
は、常法にしたがって、抗生物質、上皮成長因子、イン
スリン等を添加することができる。

【００１４】本発明においては、細胞群を牛脳下垂体抽
出液を添加した培地で培養することにより、混在する表
皮細胞や真皮細胞を除去することができ、未分化の皮脂
腺細胞のみを得ることができる。

【００１５】この細胞群を牛脳下垂体抽出液を添加した
基本培地で継代培養することにより、初めて表皮細胞や
真皮細胞が混在しない皮脂腺細胞が得られる。本発明で
いう基本培地とは、アミノ酸、糖、核酸、塩類、ビタミ
ン、微量金属等既知成分よりなる培地であり、未知成分
を含まないものである。

【００１６】未知成分を含むものの例として、血しょ
う、血清、リンパ液、腹水や組織抽出液、血清代替物質
等が挙げられる。また、このような基本培地の具体例と
して、例えば、イーグル培地、ダルベッコ改変イーグル
培地、イーグル最小必須培地、ハム氏Ｆ−１２培地など
が挙げられ、これらの培地を混合したり、組成比を変え
て用いることもできる。細胞の増殖を早めるためにイン
スリンを１〜２０μｇ／ｍｌ、および上皮成長因子を５
〜２０μｇ／ｍｌを加えることができる。

【００１７】培地に添加する牛脳下垂体抽出液の濃度
は、通常、０．１〜８％、好ましくは、０．５〜５％で
ある。また、培地中のＣａ²⁺は、０．３〜３ｍＭ、好ま
しくは０．５〜１．５ｍＭである。一般の基本培地に
は、Ｃａ²⁺が含まれているが、Ｃａ²⁺が少ない、または
全く含まれていない培地を用いる場合、Ｃａ²⁺を添加し
てもよい。

【００１８】培地に０．３〜３ｍＭのＣａ²⁺が存在する
と、表皮細胞は角化を起こし易く（「細胞成長因子」日
本組織培養学会編、朝倉書店、１９８４年、１７２
頁）、角化すると表皮細胞は増殖しなくなり、生着しに
くくなる。同様に真皮由来の繊維芽細胞もＣａ²⁺が存在
する培地中では、生着しにくい。一方、未分化の皮脂腺
細胞は、培地中のＣａ²⁺の影響をほとんど受けず、培地
中に生着する。従って、Ｃａ²⁺が存在する培地では、未
分化の皮脂腺細胞の選択が容易である。

【００１９】このようなＣａ²⁺を含有する培地で培養し
た場合、通常４日以上、好ましくは１週間以上の培養で
表皮細胞や真皮細胞が生着しなくなる。上記培地で継代
培養すると、表皮細胞や真皮細胞は生着できず、除去さ
れていくので、未分化の皮脂腺細胞が分離できる。例え
ば、１回の継代操作を４日毎に行った場合、１回以上、
好ましくは５回以上の継代操作で完全に表皮細胞や真皮
細胞を除去できる。

【００２０】培地以外の継代培養条件は、未分化の皮脂
腺細胞が死なない限りにおいて特に限定されないが、一
般には、５％ＣＯ₂−９５％空気下、３７℃の条件が用
いられる。継代培養により選択された未分化の皮脂腺
細胞は、上皮細胞の形態を示す。このようにして得ら
れた未分化の皮脂腺細胞に細胞塊を形成させ、細胞塊を
培養することにより、皮脂腺細胞に分化させることがで
き、細胞内に皮脂を蓄積させることができる。

【００２１】

【発明の効果】かくして本発明によれば、皮膚より得ら
れた未分化の皮脂腺細胞を牛脳下垂体抽出液を含む基本
培地で培養することにより、未分化の皮脂腺細胞が長期
継代でき、また、純化された未分化の皮脂腺細胞を得る
ことができる。さらに、純化された未分化の皮脂腺細胞
は、脂漏、にきび等の疾患の基礎研究、育毛剤、化粧品
の研究開発に重要な皮脂腺細胞を効率よく得るために有
用な細胞である。

【００２２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。なお、実施例、比較例、および参考例中の
部、および％はとくに断りのないかぎり重量基準であ
る。

【００２３】（実施例１）未分化の皮脂腺細胞の単離
培養スンクス（オス、５週齢）を脱頸し、放臭腺を含む皮膚
を切り出し、７０％エタノールで消毒した。皮膚から放
臭腺を採取し、ハンクス液（日水製薬製）で洗浄後、放
臭腺から表皮、皮下組織をメスで取り除いた。得られた
放臭腺組織をメスで、充分に細切し、０．０５％コラゲ
ナーゼ（タイプＩＩＩ、ワシントン・バイオケミカル社
製）含むハンクス液中で、３７℃、３０分間振盪した。
この状態で細胞を顕微鏡観察したところ、放臭腺由来皮
脂腺由来細胞は１０個〜数１００個程度のクラスターと
なってコラゲナーゼに含むハンクス液中に浮遊してい
た。

【００２４】皮脂腺細胞のクラスターが浮遊しているハ
ンクス液をステンレスメッシュ（メッシュサイズは１５
０μｍ程度）に通し、７００ｒ．ｐ．ｍ．（回転半径１
５．５ｃｍ）で３分間遠心して、皮脂腺由来細胞のペレ
ットを得た。５％牛血清アルブミン（フラクションＶ、
シグマ社製）を含むハンクス液でペレットをほぐし、７
００ｒ．ｐ．ｍ．（回転半径１５．５ｃｍ）で１分間遠
心分離し、上清を除去し、ペレットを得た。このペレッ
トを同様の操作で２度洗浄することで、混入する表皮細
胞や真皮細胞をできるだけ取り除き、細胞群を得た。

【００２５】つぎに、この細胞群のペレットを１％牛脳
下垂体抽出液を含むダルベッコ改変イーグル培地（日水
製薬製）とハム氏Ｆ−１２培地（日水製薬製）との等比
混合培地にペニシリン・ストレプトマイシン液（５００
０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ＆５０００μｇ／ｍｌ、フローボラト
リー社製）１０ｍｌ／ｌ、カナマイシン（５０００μｇ
／ｍｌ、フローラボラトリー社製）２０ｍｌ／ｌ、牛膵
臓由来インスリン（シグマ社製）５μｇ／ｍｌ、および
マウス由来上皮成長因子（東洋紡社製）１０μｇ／ｍｌ
を加えた培地（以下、Ａ培地という）を用いて、組織培
養用培養皿に植え込み、３７℃下、５％ＣＯ₂−９５％
空気のインキュベーター内で培養したところ、多くの未
分化の皮脂腺細胞が遊走し、増殖した。

【００２６】得られた未分化の皮脂腺細胞を、０．０２
％のＥＤＴＡと０．２５％のトリプシン（ディフコ社
製）をＭｇ²⁺とＣａ²⁺を含まないリン酸緩衝液（フロー
ラボラトリー社製、以下、ＰＢＳ（−）という）に溶解
したもので１回洗浄後、ＰＢＳ（−）で３７℃下、５分
間処理して、細胞の浮遊液を得る。細胞浮遊液を８００
ｒ．ｐ．ｍ．（回転半径１５．５ｃｍ）で３分間遠心分
離して、細胞を集める。培地で細胞を洗浄し、再度遠心
分離して細胞を集め、前述のＡ培地に約１／３の密度で
移しかえることにより継代した。この未分化の皮脂腺細
胞の倍加時間は約４０時間であった。

【００２７】（実施例２）麝香鹿の麝香線由来未分化
の皮脂腺細胞の単離培養麝香鹿（オス、５才）の麝香嚢の近傍にある皮脂腺組織
を用いる以外は、実施例１と同様の方法により、麝香鹿
由来の未分化の皮脂腺細胞を得た。この未分化の皮脂腺
細胞の倍加時間は約４０時間であった。

【００２８】（比較例１）皮脂腺由来細胞の血清培地
での培養Ａ培地の成分である１％牛脳下垂体抽出液の代わりに１
０％牛胎児血清を添加した培地を用いるほかは、実施例
１と同様の方法により細胞を培養した。その結果、未分
化の皮脂腺細胞は、３代継代したところから増殖が非常
に遅くなり、また、継代時の着生率が低下していった。
そして、未分化の皮脂腺細胞に代わって、混入していた
真皮細胞の増殖が目立ってきた。

【００２９】（実施例３）旋回培養法による分化の誘
導培養細胞の培養皿への付着を防ぐために１％濃度の組織
培養用寒天のＰＢＳ（−）溶液３ｍｌを入れて固化させ
ることで、底面を被覆した直径６ｃｍの培養皿に、Ａ培
地にＤＮａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製、グレー
ド２）５０μｇ／ｍｌを加えた培地（以下、Ｂ培地とい
う）２ｍｌを入れた。この培地に実施例１で得た未分化
の皮脂腺細胞２×１０⁶個を懸濁させ、スンクス放臭腺
由来の未分化の皮脂腺細胞を、植物用旋回振盪培養液を
用いて３７℃下、５％ＣＯ₂−９５％空気のインキュベ
ーター内で振幅半径２５ｍｍ、６５ｒ．ｐ．ｍ．の回転
数で水平方向に２４時間旋回培養した（Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｃｈ、２２、４５５
−４７５（１９６１））。旋回培養後、４００ｒ．ｐ．
ｍ．（回転半径１５．５ｃｍ）、１分間遠心分離して細
胞塊を集めた。得られた細胞塊は、顕微鏡で観察、測定
したところ、約１００μｍの大きさであった。

【００３０】（実施例４）皮脂の製造、確認、抽出実施例３で得た細胞塊を実施例３で使用したＢ培地５ｍ
ｌに懸濁して、３７℃、５％ＣＯ₂−９５％空気のイン
キュベーター内で３日間静置培養した。培養後、皮脂腺
細胞の一部をＯ．Ｔ．Ｃ．コンパウンド（マイルス社
製）中に包埋し、クリオスタットで８μｍ厚の凍結切片
とした。

【００３１】一方、ネオプレン（日新ＥＭ株式会社製）
を０．１％含むトルエン溶液を調製し、スライドグラス
を、この溶液に数秒間浸した後、風乾して、ネオプレン
をコートしたスライドグラスを用意した。このスライド
グラス上に前述の凍結切片をのせ、ドライヤーで乾燥さ
せ、オイルレッドＯ染色（「染色法のすべて」第２版、
昭和５９年、月刊ＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ編、医歯薬出版、３８〜３９頁）を行った。

【００３２】細胞内に蓄積された皮脂は、赤く染色され
た脂肪滴として観察された。細胞内には非常に多くの脂
肪滴が存在し、この細胞を顕微鏡で観察・測定したとこ
ろ、脂肪滴の直径が約１．５μｍの大きなものもあっ
た。残りの皮脂腺細胞塊を超音波破砕装置で処理した
後、２０００ｒ．ｐ．ｍ．（回転半径１５．５ｃｍ）で
遠心分離して細胞および細胞片を集め、凍結融解を３回
繰り返し、細胞を破砕した。

【００３３】これに適量のクロロホルム−メタノール
（２：１）混合溶媒を加えて激しく攪拌し、細胞片を濾
過して除き、溶媒を窒素気流下、減圧留去して、抽出物
を得た。この抽出物をシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ーに供し、ヘキサンで展開した。展開後、４０％硫酸を
噴霧し、加熱して発色させたところ、標準品のスクワレ
ン（東京化成社製）と同じ位置に同様のスポット（Ｒｆ
値０．４９）が確認された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者李英皓中華人民共和国北京市中関村路19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】表皮細胞および／または真皮細胞が皮脂
腺由来細胞を牛脳下垂体抽出液を添加した基本培地で培
養することを特徴とする未分化の皮脂腺細胞の培養方
法。