WO2018193722A1 - 皮脂腺の観察方法 - Google Patents

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WO2018193722A1
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sebaceous gland
gland structure
sebaceous
sebum
substance
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PCT/JP2018/007559
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周太 石塚
倉田　隆一郎
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株式会社マンダム
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    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility

Definitions

  • the present invention relates to a method for observing sebaceous glands. More specifically, the present invention relates to a method for observing sebaceous glands and a method for evaluating a test substance, which are useful for developing external preparations such as cosmetics.
  • Sebum is secreted from the sebaceous glands to the surface of the skin and has the effect of protecting the skin from irritation from outside the body. However, if the sebum present in the skin is too small, the skin may not be sufficiently protected. On the other hand, if the sebum present in the skin is excessive, acne, seborrheic dermatitis, sebaceous gland hyperplasia and the like may be caused. Therefore, external preparations such as cosmetics that moderately regulate the production of sebum are desired.
  • the present invention has been made in view of the above prior art, and it is possible to accurately observe the sebaceous gland dynamics in a living body and whether or not the test substance is a substance that regulates the production of sebum. It is an object of the present invention to provide a method for evaluating a test substance that can be evaluated in a simple manner.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • (1) A method for observing sebaceous glands (I) a step of culturing a sebaceous gland structure from which all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue has been removed from the skin tissue in a suspended state in the medium, and (II) after the culture obtained in step (I)
  • a method for observing sebaceous glands comprising observing a sebaceous gland structure of (2)
  • the step (1) further includes the step of obtaining the sebaceous gland structure by removing all or part of the dermis and subcutaneous tissue from the isolated skin tissue before performing the step (I).
  • a step of culturing a sebaceous gland structure from which all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue has been removed from the skin tissue in a suspended state in a medium in the absence of the test substance (B) culturing a sebaceous gland structure from which all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue has been removed from the skin tissue in a suspended state in the medium in the presence of the test substance, and (C) the step (A).
  • the cultured sebaceous gland structure (A) obtained in step (B) and the cultured sebaceous gland structure (B) obtained in step (B) are observed, and the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland structure (A) are observed.
  • the present invention relates to a test substance evaluation method including a step of evaluating a sebum production regulating action of the test substance based on a difference from the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland structure (A) are observed.
  • the method for observing sebaceous glands of the present invention there is an excellent effect that the dynamics of sebaceous glands in a living body can be accurately observed.
  • the test substance evaluation method of the present invention there is an excellent effect that it is possible to accurately evaluate whether or not the test substance is a substance that regulates the production of sebum.
  • Experiment 1 (2) it is a drawing substitute photograph which shows the result of having observed the oil droplet of the sebum in the sebaceous gland structure A contained in the sample for observation obtained by the preparation example 7.
  • FIG. Drawing which shows the result of classifying and observing the state of intracellular oil droplets contained in the outermost layer of the sebaceous glands of the sebaceous gland structure A contained in each of the observation samples of Experiment Nos. 1 to 6 in Example 1 (5)
  • (A) is a drawing-substituting photograph showing the result of observing the inside of the sebaceous gland structure A included in the observation sample of Experiment No. 7 in Example 2 (3)
  • (B) is a framed portion in (A).
  • (A) is a drawing-substituting photograph showing the result of observing the inside of the sebaceous gland structure A included in the observation sample of Experiment No. 8 in Example 2 (3), and (B) is a framed portion in (A). It is a drawing substitute photograph which shows the result of having expanded and observed.
  • (A) is a drawing-substituting photograph showing the result of observing the inside of the sebaceous gland structure A included in the observation sample of Experiment No. 9 in Example 2 (3), and (B) is a framed portion in (A). It is a drawing substitute photograph which shows the result observed by expanding.
  • Example 2 (3) it is a graph which shows the result of having investigated the relationship between the kind of sample and sebum production progress.
  • Example 4 (4) it is a graph which shows the result of having investigated the relationship between the kind of sample, and sebum production degree.
  • the present invention in one aspect, is a method for observing sebaceous glands, (I) a step of culturing a sebaceous gland structure from which all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue has been removed from the skin tissue in a suspended state in the medium, and (II) after the culture obtained in step (I)
  • the present invention relates to a method for observing sebaceous glands, which includes the step of observing the sebaceous gland structure.
  • the operation of culturing the sebaceous gland structure in a suspended state in a culture medium is employed, so that the sebaceous gland structure is all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue. Even when the sebaceous glands are removed, the sebaceous gland structure is accurately reproduced in a state in which the dynamics of the sebaceous glands in the living body typified by production of sebum from the sebaceous glands in the living body can be easily observed. Therefore, according to the method for observing sebaceous glands of the present invention, the dynamics of the sebaceous glands can be observed in an environment closer to the living body.
  • the sebaceous gland structure is a structure obtained by removing all or part of the dermis and subcutaneous tissue from the skin tissue. Specifically, as shown in FIG. 1, the sebaceous gland structure includes a sebaceous gland 1, hair 2, a hair follicle 3 surrounding the hair 2, and an epidermis 4.
  • the sebaceous glands 1 are undifferentiated sebaceous gland basal cells 11 that are localized in the outermost layer of the sebaceous gland 1 and cells that are located on the inner side of the localization position of the undifferentiated sebaceous gland basal cells 11 and generate lipid droplets (hereinafter, referred to as sebaceous gland 1 12) (also referred to as "mature sebaceous gland cells") and a cell residue 13 that is localized in the central part of the sebaceous gland 1 and has been destroyed by the death of the mature sebaceous gland cells 12.
  • the sebum S generated in the sebaceous glands 1 is released out of the skin through the hair follicle 3.
  • the part composed of sebaceous glands 1, hairs 2, hair follicles 3 and epidermis 4 in the sebaceous gland structure is in vivo except that all or part of the dermis and subcutaneous tissue are removed from the skin tissue. It has the same structure as the part composed of sebaceous glands, hair, hair follicle and epidermis in the skin tissue.
  • a part of the dermis and subcutaneous tissue has been removed from the skin tissue means that the sebaceous gland is exposed to such an extent that the dermis and subcutaneous tissue are removed from the skin tissue and the sebaceous gland can be observed.
  • the sebaceous gland structure is cultured in a suspended state in the medium.
  • the sebaceous gland structure can be produced, for example, by removing all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue from the isolated skin tissue. Therefore, the method for observing sebaceous glands of the present invention includes the step of removing all or part of the dermis and subcutaneous tissue from the isolated skin tissue to obtain the sebaceous gland structure before performing step (I). Further can be included.
  • a method for producing the sebaceous gland structure for example, (A1) a step of excising all or part of the subcutaneous tissue from the isolated skin tissue, and (a2) removing fibers such as collagen fibers from the tissue obtained in the step (a1) to expose the sebaceous glands
  • a method comprising the step of obtaining the sebaceous gland structure (hereinafter also referred to as “Production Method A”); (B1) excising all or part of the subcutaneous tissue from the isolated skin tissue; (B2) contacting the tissue obtained in step (b1) with an enzyme for dissociating epidermal appendages such as dispase, collagenase, and pronase from the dermis; and (b3) obtained in step (b2).
  • a method including a step of separating the dermis from a tissue (hereinafter, also referred to as “Production Method B”) and the like are exemplified, but the present invention is not limited to such an example.
  • the sebaceous gland structure can be easily produced, and since the dynamics of the sebaceous gland in the living body can be accurately observed, the production method A and the production method B are preferable. More preferred.
  • Examples of the isolated skin tissue include, for example, skin tissue that is obtained from surplus skin generated during a surgical operation and is in a living state, but the present invention is limited only to such examples. It is not a thing.
  • living skin tissue refers to skin tissue in a state that exhibits biological activity and movement similar to the original biological activity and movement in vivo.
  • the skin tissue supply source examples include humans, but the present invention is not limited to such examples.
  • the source of the skin tissue is preferably human.
  • the method for observing sebaceous glands of the present invention is suitable for observing human sebaceous glands.
  • the sebaceous gland dynamics for example, the change in the shape of the cell when comparing the shape of the cells constituting the sebaceous gland at at least two time points during the production of sebum, the sebaceous gland at the two time points during the production of sebum Changes in the differentiation state of the cells when contrasting the differentiation states of the constituent cells, changes in the shape of the differentiated cells when contrasting the shapes of the differentiated cells at at least two time points during the production of sebum, production of sebum
  • the change of the position of the localized site of the differentiated cell when contrasting the position of the localized site of the differentiated cell at at least two time points is included, the present invention is limited only to such an example. It is not a thing.
  • the culture of the sebaceous gland structure is performed in a state where the sebaceous gland structure is suspended in the medium.
  • the “state in which the sebaceous gland structure is suspended in the medium” is not particularly limited as long as the sebaceous gland structure is not in contact with the wall surface of the culture vessel used for culturing the sebaceous gland structure. Absent. Therefore, “the state where the sebaceous gland structure is suspended in the medium” means that the sebaceous gland structure is not in contact with the wall of the culture vessel used for culturing the sebaceous gland structure.
  • the whole may be immersed in the medium, or a part of the sebaceous gland structure may be exposed outside the medium, and the remaining part may be immersed in the medium.
  • the medium is not particularly limited as long as it contains a differentiation promoting component suitable for differentiating undifferentiated sebaceous basal cells contained in the sebaceous gland structure into mature sebaceous cells and a proliferation component for growing the cells. is not.
  • the medium may be a conventional basic medium supplemented with the differentiation promoting component and the growth component, or a commercially available medium.
  • Examples of the differentiation promoting component include fetal bovine serum, fatty acids, peptides, hormones, and the like, but the present invention is not limited to such examples. These differentiation promoting components may be used alone or in combination of two or more.
  • the type of the culture medium varies depending on the type of the culture medium, the type of the differentiation promoting component, and the like, it is not unconditionally determined. Therefore, the type of the culture medium, the type of the differentiation promoting component, etc. It is preferable to set appropriately according to the above.
  • the growth component include amino acids, vitamins, inorganic salts, saccharides, cell growth promoting factors, and the like, but the present invention is not limited to such examples.
  • the content of the growth component in the medium is not determined unconditionally because it varies depending on the type of the culture medium, the type of the growth component, and the like. It is preferable to set appropriately.
  • These growth components may be used alone or in combination of two or more.
  • the basal medium include a mixed medium of Dulbecco's modified medium and F-12 medium, but the present invention is not limited to such examples.
  • the culture conditions for culturing the sebaceous gland structure vary depending on the type of skin tissue source used for the production of the sebaceous gland structure, the type of kinetics of the sebaceous gland to be observed, and so on. Since it cannot be performed, it is desirable to determine according to the type of skin tissue supply source used for manufacturing the sebaceous gland structure, the type of sebaceous gland dynamics to be observed, and the like.
  • the culture conditions include, for example, culture temperature, culture time, medium pH, and carbon dioxide concentration in the culture atmosphere.
  • the culture temperature is usually preferably 35 ° C. to 38 ° C., more preferably 36.5 ° C. to 37.5 from the viewpoint of accurately reproducing the state of sebaceous glands in the living body. ° C.
  • the culture time is usually preferably 6 to 168 hours, more preferably from the viewpoint of maintaining the physiological function in the sebaceous gland structure in a good state in the medium. Is 24 to 48 hours.
  • the pH of the medium is usually preferably 6.8 to 7.6, more preferably 7.0, from the viewpoint of accurately reproducing the state of sebaceous glands in the living body. 7.4.
  • the concentration of carbon dioxide in the culture atmosphere is usually preferably 4 to 10% by volume, more preferably 5 to 7% by volume from the viewpoint of accurately reproducing the state of sebaceous glands in the living body.
  • the cultured sebaceous gland structure is observed.
  • Observation of the sebaceous gland structure after culture can be performed, for example, by using a sebaceous gland structure obtained by staining the cultured sebaceous gland structure with a staining reagent as an observation sample.
  • the sebaceous gland structure can be stained by, for example, bringing the sebaceous gland structure into contact with the staining reagent.
  • the cultured sebaceous gland structure used for the staining may be a fixed sample fixed by a fixing solution.
  • the fixed sample may be a sample in which the cell membrane of each cell contained in the sebaceous gland structure has a sufficient permeability to allow the staining reagent to pass therethrough.
  • the sebaceous gland structure is fixed, for example, by adding a fixing solution to the culture vessel containing the sebaceous gland structure and bringing the sebaceous gland structure into contact with the fixing solution.
  • the fixing solution examples include acetone, methanol, a mixed solution of acetone and methanol, an aqueous formaldehyde solution, a phosphate buffer solution of formaldehyde, an aqueous paraformaldehyde solution, and a phosphate buffer solution of paraformaldehyde.
  • the invention is not limited to such examples.
  • the fixed sample Prior to staining, the fixed sample may or may not be washed with an appropriate washing solution as necessary.
  • the washing solution include phosphate buffered physiological saline and Tris buffered physiological saline, but the present invention is not limited to such examples.
  • the staining reagent examples include a reagent containing a complex of a binding substance that binds to a marker and a detectable substance, and a reagent that contains the binding substance and does not contain the detectable substance.
  • the invention is not limited to such examples.
  • the “marker” refers to a substance that serves as an indicator of the presence of tissues, cells, etc. contained in the sebaceous gland structure and the degree of differentiation of the cells.
  • the binding substance varies depending on the use of the method for observing sebaceous glands of the present invention and cannot be determined unconditionally. Therefore, the binding substance is preferably determined as appropriate depending on the use of the method for observing sebaceous glands of the present invention.
  • the binding substance include an antibody that binds to the marker (hereinafter simply referred to as “antibody”) or a fragment thereof (hereinafter simply referred to as “antibody fragment”), a compound that binds to the marker, and the like.
  • the present invention is not limited to such examples.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Among the antibodies, a monoclonal antibody is preferable because of its high specificity for the marker.
  • the antibody fragment examples include a Fab fragment, an F (ab ′) 2 fragment, a single chain antibody, and the like, but the present invention is not limited to such examples.
  • the polyclonal antibody, the monoclonal antibody and the antibody fragment can be produced by a conventional technique using the marker as an antigen.
  • a commercially easily available polyclonal antibody, a commercially easily available monoclonal antibody and a commercially easily available antibody fragment should be used.
  • the binding substance may be a substance that generates a detectable signal or a substance that does not generate the signal.
  • Examples of the detectable substance include fluorescent substances and enzymes, but the present invention is not limited to such examples.
  • Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate and Alexa Fluor series fluorescent substances (for example, manufactured by Invitrogen, trade name: Alexa Fluor 647, etc.), but the present invention is limited to such examples only. is not.
  • Examples of the enzyme include peroxidase and alkaline phosphatase, but the present invention is not limited to such examples.
  • a fluorescent substance is preferable because the detection operation is easy and a detection target can be detected with high accuracy.
  • a fluorescent substance of Alexa Fluor series for example, product name manufactured by Invitrogen, trade name : Alexa Fluor 647 etc.] is more preferable.
  • the staining reagent may further contain a label binding substance that binds to the antibody or the antibody fragment thereof, if necessary.
  • the label binding substance include a complex of a second binding substance that binds to the binding substance and a labeling substance, but the present invention is not limited to such examples.
  • the second binding substance include an antibody against an immunoglobulin possessed by an animal immunized at the time of producing the antibody, an antibody against a fragment of the immunoglobulin, etc., but the present invention is limited only to such examples. Is not to be done.
  • the labeling substance include the detectable substance, but the present invention is not limited to such examples.
  • the staining reagent includes a staining reagent for the undifferentiated sebaceous gland basal cells (hereinafter also referred to as “undifferentiated cell staining reagent”), a staining reagent for sebum (hereinafter also referred to as “sebum staining reagent”), and a cell nucleus.
  • undifferentiated cell staining reagent a staining reagent for sebum
  • sebum staining reagent a staining reagent for sebum
  • cell nucleus examples include staining reagents (hereinafter also referred to as “nuclear staining reagents”) and differentiated cell staining reagents, but the present invention is not limited to such examples.
  • the undifferentiated cell staining reagent contains a substance (hereinafter also referred to as “undifferentiated cell binding substance”) that binds to a marker specific to undifferentiated sebaceous gland basal cells (hereinafter also referred to as “undifferentiated marker”).
  • the undifferentiated cell staining reagent may be a reagent containing a complex of an undifferentiated cell binding substance and a detectable substance, and the undifferentiated cell binding substance itself is a substance that generates a detectable signal. May be a reagent containing the undifferentiated cell-binding substance and not containing the detectable substance.
  • undifferentiated cell marker examples include keratin-5, keratin-7, keratin-14, B lymphocyte-induced mature protein 1 (Blip1), and leucine-rich repeat immunoglobulin-like domain protein 1 (Lrig1).
  • the present invention is not particularly limited.
  • the nuclear staining reagent includes a binding substance that binds to a substance constituting the nucleus (hereinafter also referred to as “nuclear binding substance”).
  • the nuclear staining reagent may be a reagent containing a complex of a nuclear binding substance and a detectable substance, and when the nuclear binding substance itself produces a detectable signal, the nuclear binding substance And a reagent that does not contain the detectable substance.
  • Examples of the substance constituting the nucleus include nucleic acids such as DNA, but the present invention is not limited to such examples.
  • the nuclear binding substance may be any substance that permeates the cell membrane. Examples of the nuclear binding substance include Hoechst 33342, but the present invention is not limited to such examples. Since Hoechst 33342 is a substance that produces detectable fluorescence, the nuclear staining reagent may be a reagent that does not contain the detectable substance.
  • the sebum staining reagent examples include fat-soluble dyes that dissolve in sebum, but the present invention is not limited to such examples.
  • the fat-soluble dye examples include Nile Red, Nile Blue, Oil Red O, Sudan III, Sudan IV, and Sudan Black B, but the present invention is not limited to such examples. Since the fat-soluble dye dissolves in sebum and stains sebum, the sebum staining reagent containing the fat-soluble dye may be a reagent that does not contain the detectable substance.
  • the differentiated cell staining reagent examples include a substance (hereinafter referred to as “differentiated cell binding substance”) that binds to a marker specific to sebaceous gland cells differentiated from undifferentiated sebaceous gland basal cells (hereinafter also referred to as “differentiation marker”).
  • the differentiated cell staining reagent may be a reagent containing a complex of a differentiated cell binding substance and a detectable substance, and when the differentiated cell binding substance itself produces a detectable signal, A reagent containing a differentiated cell binding substance and not containing the detectable substance may be used.
  • the differentiated cell marker include stearyl-CoA desaturase 1 (Scd-1) and peroxisome proliferator-activated receptor ⁇ (PPAR ⁇ ), but the present invention is not particularly limited. Absent.
  • the content of the binding substance in the staining reagent varies depending on the type of the binding substance, the use of the sebaceous gland observation method of the invention, and the like, it is not unconditionally determined. It is preferable to determine appropriately according to the use of the sebaceous gland observation method.
  • the detectable substance contained in the undifferentiated cell staining reagent, the detectable substance contained in the sebum staining reagent, and the detectable substance contained in the nuclear staining reagent are preferably substances that can be distinguished from each other.
  • the mixing ratio and contact time between the sebaceous gland structure and the staining reagent vary depending on the type of the staining reagent and the like, and are not determined unconditionally, they should be set appropriately according to the type of the staining reagent and the like. Is preferred.
  • washing liquid examples include phosphate buffered saline and phosphate buffer, but the present invention is not limited to such examples.
  • the said staining reagent contains an antibody or its antibody fragment
  • the blocking agent include phosphate buffered saline solution containing albumin, but the present invention is not limited to such examples.
  • the dynamics of the sebaceous glands are observed using the stained sebaceous gland structure.
  • the sebaceous gland can be observed using, for example, an optical microscope such as a fluorescence microscope or a confocal laser microscope.
  • the sebaceous gland can be observed by, for example, observing the stained sebaceous gland structure as it is, or detecting a signal derived from a staining reagent in the stained sebaceous gland structure.
  • the present invention relates to a method for evaluating a sebum production regulating action of a test substance, (A) A step of culturing a sebaceous gland structure from which all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue has been removed from the skin tissue in a suspended state in a medium in the absence of the test substance, (B) culturing a sebaceous gland structure from which all or part of each of the dermis and subcutaneous tissue has been removed from the skin tissue in a suspended state in the medium in the presence of the test substance, and (C) the step (A The cultured sebaceous gland structure (A) obtained in step (B) and the cultured sebaceous gland structure (B) obtained in step (B) are observed, and the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland structure (A) are observed.
  • the present invention relates to a test substance evaluation method including a step of evaluating a sebum production regulating action of the test substance based on a difference from the se
  • the test substance evaluation method of the present invention is obtained by performing the steps (A) and (B), and the sebaceous gland structure (A) after culturing obtained in the step (A) and the step (B). Since the operation of observing the cultured sebaceous gland structure (B) is performed, the sebum production regulating action of the test substance can be accurately evaluated. Therefore, according to the test substance evaluation method of the present invention, it is possible to accurately evaluate whether or not the test substance is a substance that regulates the production of sebum.
  • the sebum production regulating action includes a sebum production promoting action for increasing sebum production and a sebum production inhibiting action for reducing sebum production.
  • step (A) and step (B) may be the order in which step (B) is performed after step (A) is performed, and step (A) is performed after step (B) is performed. May be in the order of performing. Step (A) and step (B) may be performed simultaneously.
  • the sebaceous gland structure from which all or part of the dermis and subcutaneous tissue are removed from the skin tissue is cultured in a state of being suspended in the medium in the absence of the test substance.
  • the sebaceous gland structure and medium used in step (A) are the same as the sebaceous gland structure and medium used in the above-described method for observing sebaceous glands.
  • the culture of the sebaceous gland structure in the step (A) can be performed by the same technique as the culture method of the sebaceous gland structure in the above-described sebaceous gland observation method.
  • the culture conditions of the sebaceous gland structure vary depending on the content of the evaluation, the type of test substance to be evaluated, the type of test substance and the source of the skin tissue used to manufacture the sebaceous gland structure, etc. Since it cannot be performed, it is desirable to determine according to the content of evaluation, the type of test substance to be evaluated, the type of skin tissue supply source used for manufacturing the sebaceous gland structure, and the like.
  • step (B) the sebaceous gland structure from which the dermis and subcutaneous tissue have been removed from the skin tissue is cultured in a state of being suspended in the medium in the presence of the test substance.
  • the sebaceous gland structure used in the step (B) is the same type of sebaceous gland structure obtained from the same source skin tissue as the sebaceous gland structure used in the step (A). It is a sebaceous gland structure different from the sebaceous gland structure used.
  • the medium used in the step (B) is the same type of medium as that used in the step (A).
  • the sebaceous gland structure is cultured in the presence of the test substance.
  • the test substance obtained by adding the test substance to the same type of medium as that used in the step (A) Except for the use of the containing medium it can be carried out by the same method as the method for culturing the sebaceous gland structure in the above-described method for observing sebaceous glands. Since the concentration of the test substance in the test substance-containing medium varies depending on the content of the evaluation, the type of the test substance to be evaluated, the type of skin tissue source used for manufacturing the sebaceous gland structure, etc., it cannot be determined unconditionally. Therefore, it is desirable to determine according to the evaluation contents, the type of test substance to be evaluated, the type of skin tissue supply source used for manufacturing the sebaceous gland structure, and the like.
  • the culture condition of the sebaceous gland structure in the step (B) is the same as the culture condition of the sebaceous gland structure in the step (A) except that the test substance is not used.
  • the cultured sebaceous gland structure (A) obtained in the step (A) and the cultured sebaceous gland structure (B) obtained in the step (B) are observed, Based on the difference between the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland structure (A) and the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland structure (B), the sebum production regulating action of the test substance is evaluated.
  • the method for observing the sebaceous gland structure in the step (C) is the same as the method for observing the sebaceous gland structure in the above-described sebaceous gland observation method.
  • the difference between the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland structure (A) and the sebaceous gland dynamics in the sebaceous gland structure (B) includes the difference in the number of cells containing sebum in the outermost layer of the sebaceous gland depending on the presence or absence of the test substance, Difference in the rate of differentiation of undifferentiated sebaceous gland basal cells to mature sebaceous gland cells in the sebaceous gland with or without the substance, difference in the number of mature sebaceous cells in the vicinity of the sebaceous gland with or without the test substance, The difference in the amount of sebum present in the vicinity of the center of the sebaceous gland depending on the presence or absence, the difference in the expression position of the differentiation marker depending on the presence or absence of the test substance, the difference in the expression level of the differentiation marker depending on the presence or absence of the test substance, etc. It is not limited only to such illustration.
  • Examples of the indicator that the test substance has a sebum production promoting action include the following indicators (1a) to (3a). These indicators may be used alone or in combination of two or more.
  • (1a) The number of cells encapsulating sebum in the outermost layer of the sebaceous gland structure (B) is greater than the number of cells encapsulating sebum in the outermost layer of the sebaceous gland of the sebaceous gland structure (A), (2a) Compared to the rate of differentiation from undifferentiated sebaceous gland basal cells to mature sebaceous gland cells in the sebaceous gland of the sebaceous gland structure (A), the sebaceous gland basal cells to mature sebaceous gland in the sebaceous gland of the sebaceous gland structure (B) The rate of differentiation into cells is large, and (3a) the sebaceous glands of the sebaceous gland structure (B) compared to the number of disrupted mature sebaceous cells present near the center of the sebaceous gland of the
  • examples of an indicator that the test substance has a sebum production inhibitory action include the following indicators (1b) to (3b). These indicators may be used alone or in combination of two or more.
  • (1b) The number of cells encapsulating sebum in the outermost layer of the sebaceous gland structure (B) is smaller than the number of cells encapsulating sebum in the outermost layer of the sebaceous gland of the sebaceous gland structure (A),
  • (2b) Compared to the rate of differentiation of the sebaceous gland structure (A) from undifferentiated sebaceous gland basal cells to mature sebaceous gland cells in the sebaceous gland, the sebaceous gland structure (B) sebaceous gland basal cells to mature sebaceous gland The rate of differentiation into cells is small, and (3b) the sebaceous glands of the sebaceous gland structure (B) compared to the number of disrupted mature sebaceous cells present near the center of the sebaceous gland of the sebaceous gland structure
  • the sebum production regulating action of the test substance can be accurately evaluated, screening of the sebum production regulating substance, the effectiveness of the sebum production regulating substance is effective. It is expected to be used for sex evaluation.
  • the sebum production regulator is expected to be used, for example, as a sebum production inhibitor, a sebum production promoter, or the like blended in skin cosmetics such as the face, wrinkles, and scalp.
  • Preparation Example 2 A primary antibody-containing solution was obtained by adding anti-K5 antibody [manufactured by Abcam Co., Ltd., trade name: ⁇ K5 antibody] to a PBSTT solution containing 2% by mass BSA so that the concentration was 0.33 ⁇ g / mL. .
  • K5 is a marker of undifferentiated sebaceous gland basal cells present in the outermost layer of the sebaceous gland.
  • Preparation Example 3 Labeled anti-IgG antibody [Invitrogen Co., Ltd., trade name: ⁇ IgG antibody Alexa fluor 647] and nuclear stain [Invitrogen Co., Ltd., trade name: hoechst 33342] was added to a PBSTT solution containing 2% by mass BSA so that the concentration of the nuclear stain was 10 ⁇ g / mL.
  • the labeled anti-IgG antibody is a secondary antibody against the anti-K5 antibody used in Preparation Example 2.
  • Preparation Example 4 A staining reagent B was obtained by adding a fat staining reagent [trade name: Nile Red, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.] to a PBSTT solution containing 2% by mass BSA so that the concentration thereof was 10 ⁇ g / mL. .
  • Preparation Example 5 A spacer (diameter 9 mm and thickness 0.12 mm) was pasted on a cover glass (24 mm ⁇ 55 mm) to obtain a cover glass with a spacer.
  • sebaceous gland structure A a sebaceous gland structure in which the sebaceous glands were exposed.
  • the sebaceous gland structure A contained sebaceous glands, hair, hair follicles and epidermis in the skin tissue, but did not substantially contain dermis and subcutaneous tissue, and the sebaceous glands were exposed.
  • Preparation Example 7 The sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6 was immersed in a 4% by mass PFA-containing PBS solution at 4 ° C. for 30 minutes to fix the sebaceous gland structure A and obtain a fixed sample. The obtained fixed sample was washed by incubation in PBSTT solution containing 2% by mass BSA at 4 ° C. for 1 hour. Washing was performed 3 times.
  • the washed fixed sample was incubated in the staining reagent A obtained in Preparation Example 3 at 4 ° C. for 12 hours to stain sebaceous gland basal cells and nuclei existing in the outermost layer of the sebaceous gland. Washing was performed by incubating the fixed sample after staining in a PBSTT solution containing 2% by mass of BSA at 4 ° C. for 1 hour. Washing was performed 3 times.
  • the fixed sample after washing was incubated in the staining reagent B obtained in Preparation Example 4 at room temperature (25 ° C.) for 30 minutes to stain sebum contained in the sebaceous gland structure A. Washing was performed by incubating the fixed sample after staining in a PBSTT solution containing 2% by mass of BSA at 4 ° C. for 1 hour. Washing was performed 3 times.
  • the fixed sample was incubated for 1 hour at 4 ° C. in a PBS solution containing 20% by weight glycerol, incubated for 1 hour at 4 ° C. in a PBS solution containing 50% by weight glycerol, and room temperature in a PBS solution containing 80% by weight glycerol. Incubation was performed at 4 ° C. for 1 hour to replace moisture contained in the fixed sample with glycerol.
  • a suitable amount (for example, 50 ⁇ L) of an 80% by mass glycerol aqueous solution was added to the portion surrounded by the spacer of the cover glass with spacer obtained in Preparation Example 5.
  • the sebaceous gland structure A after glycerol substitution was placed on the part surrounded by the spacer of the cover glass with a spacer so that the sebaceous gland side would face downward.
  • the observation sample was obtained by covering the part surrounded by the spacer of the cover glass with a spacer with a circular cover glass (diameter 12 mm).
  • Test example 1 Observation of appearance of sebaceous gland structure The appearance of sebaceous gland structure A contained in the observation sample obtained in Preparation Example 7 was observed under a confocal microscope.
  • Test Example 1 (1) the results of observing the appearance of the sebaceous gland structure A contained in the observation sample obtained in Preparation Example 7 are shown in FIGS.
  • the length of the scale bar in FIG. 2 is 50 ⁇ m. Further, the length of the scale bar in FIG. 3 is 50 ⁇ m.
  • 1 is a sebaceous gland
  • 3 is a hair follicle.
  • the sebaceous gland structure A has a sebaceous gland having a smooth surface covered with undifferentiated sebaceous gland basal cells.
  • the results shown in FIG. 3 show that in the sebaceous gland structure A, the hair follicle 3 and the hair wrapped in the hair follicle 3 remain without being removed. Therefore, it can be seen that the sebaceous gland structure A retains the original structure of the sebaceous gland in the living body.
  • the sebaceous gland structure A retains the structure of the sebaceous gland in the living body, it can be seen that the sebaceous gland dynamics in the living body can be accurately observed by using the sebaceous gland structure A.
  • A represents sebum oil droplets present in the outermost layer of the sebaceous gland
  • B represents sebum oil droplets present in the intermediate layer of the sebaceous gland
  • C represents sebum oil droplets present near the center of the sebaceous gland.
  • the sebaceous gland structure A retains the original structure of the sebaceous gland in the living body. I understand. Also, from the results shown in FIG. 5, the size of the oil droplets in the cell increases from the outermost layer of the sebaceous gland (A in FIG. 5) to the vicinity of the center (C in FIG. 5). I understand. From these results, when the sebaceous gland structure A is cultured in a state of being suspended in the medium, as the culture time elapses, as shown in FIG.
  • sebaceous gland structure A can retain the structure of the sebaceous gland in the living body and reproduce the sebum production process in the living body. Therefore, according to the sebaceous gland structure A, it can be seen that the dynamics of the sebaceous gland in the living body can be accurately observed.
  • test sample A test sample was prepared by adding linoleic acid to the mixed medium obtained in Preparation Example 1 (hereinafter also referred to as “test sample A”) to a concentration of 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M. B was obtained. Moreover, it added to the mixed culture medium obtained by the preparation example 1 so that the density
  • test sample A (1 mL) was added to each well of a 24-well plate.
  • the sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6 is cultured in a test sample A in each well of the 24-well plate for 24 hours at 37 ° C. in 5% carbon dioxide.
  • the sebaceous gland structure A and the test sample A were brought into contact with each other (Experiment No. 1).
  • Experiment No. 1 the same operation as in Experiment No. 1 was performed except that 48 hours of culture was performed instead of 24 hours of culture, and the sebaceous gland structure A and test sample A were brought into contact (experiment). Number 2).
  • the sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6 is floated in the test sample B in each well of the 24-well plate and cultured at 37 ° C. for 24 hours under 5% by volume of carbon dioxide, thereby obtaining the sebaceous gland.
  • the structure A and the test sample B were brought into contact (experiment number 3).
  • Experiment No. 3 the same operation as in Experiment No. 3 was performed except that 48 hours of culture was performed instead of 24 hours of culture, and the sebaceous gland structure A and test sample B were brought into contact (experiment). Number 4).
  • the sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6 is floated in the test sample B in each well of the 24-well plate and cultured at 37 ° C. for 24 hours under 5% by volume of carbon dioxide, thereby obtaining the sebaceous gland.
  • the structure A and the test sample C were brought into contact (experiment number 5).
  • Experiment No. 5 the same operation as in Experiment No. 5 was performed except that 48 hours of culture was performed instead of 24 hours of culture, and the sebaceous gland structure A and test sample C were brought into contact (experiment). Number 6).
  • Test Example 1 (1) instead of using the observation sample obtained in Preparation Example 6, the observation samples of Experiment Nos. 1 to 6 obtained in Example 1 (3) were used. Except that it was used, the same operation as in Test Example 1 (1) was performed, and the intracellular oil droplets contained in the outermost layer of the sebaceous gland of the sebaceous gland structure A contained in each of the observation samples of Experiment Nos. 1 to 6 The condition was observed. Next, the observed state of oil droplets in the cells of the sebaceous gland was classified and observed based on (A) to (G) in Table 1. The classification was performed by selecting the one closest to (A) to (G) in Table 1 based on the observed state of oil droplets in the cells.
  • Example 1 (5) the results of categorizing and observing the state of intracellular oil droplets contained in the outermost layer of the sebaceous gland structure A of the sebaceous gland structure A contained in the observation samples of Experiment Nos. 1 to 6 are shown in FIG. Shown in In the figure, the length of each scale bar (A) to (G) is 10 ⁇ m. Moreover, the part containing the cell which differentiation advanced in the order from (A) to (G) in the figure is shown. The upper and lower stages of (A) to (G) indicate the same part in the sebaceous glands of the sebaceous gland structure A, respectively.
  • the solid line shows the outline of the cell
  • the broken line shows the outline of the oil droplet.
  • the states of the oil droplets in the cells contained in the outermost layer of the sebaceous gland shown in FIGS. 6A to 6G correspond to the states (A) to (G) in Table 1, respectively.
  • the sebaceous gland structure A can reproduce the sebum production process in the living body. Therefore, according to the sebaceous gland structure A, it can be seen that the dynamics of the sebaceous gland in the living body can be accurately observed.
  • Preparation Example 8 In the mixed medium obtained in Preparation Example 1, linoleic acid and a linoleic acid receptor antagonist (trade name: GSK-3787, manufactured by Abcam Co., Ltd.) as a test substance were added at a concentration of linoleic acid of 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M and Test sample D was obtained by adding the test substance to a concentration of 1 ⁇ M.
  • linoleic acid and a linoleic acid receptor antagonist trade name: GSK-3787, manufactured by Abcam Co., Ltd.
  • Example 2 (1) Culture of sebaceous gland structure and contact between sebaceous gland structure and test sample Test sample A (1 mL) was added to each well of a 24-well plate. Next, the sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6 is cultured in a test sample A in each well of the 24-well plate for 24 hours at 37 ° C. in 5% carbon dioxide. Thus, the sebaceous gland structure A and the test sample A were brought into contact (experiment number 7).
  • Test Sample B (Experiment No. 8) obtained in Example 1 (1) or Test Sample D (Experiment No. 9) obtained in Preparation Example 8 was used.
  • the sebaceous gland structure A was brought into contact with test sample B (experiment number 8) or test sample D (experiment number 9).
  • Example 2 (3) the result of observing the inside of the sebaceous gland structure A included in the observation sample of Experiment No. 7 was observed by enlarging the framed portion in FIGS. 7 (A) and 7 (A). The results are shown in FIG. The length of the scale bar in FIG. 7 (A) is 20 ⁇ m, and the length of the scale bar in FIG. 7 (B) is 10 ⁇ m. Moreover, the part enclosed with the broken line in FIG. 7 shows the outermost layer of sebaceous glands. In Example 2 (3), the result of observing the inside of the sebaceous gland structure A contained in the observation sample of Experiment No. 8 is shown by enlarging the framed portion in FIGS. 8 (A) and 8 (A).
  • the observation result is shown in FIG.
  • the length of the scale bar in FIG. 8A is 40 ⁇ m
  • the length of the scale bar in FIG. 8B is 10 ⁇ m.
  • the part enclosed with the broken line shows the outermost layer of sebaceous glands
  • the arrowhead shows the oil droplet of sebum.
  • Example 2 (3) the result of observing the inside of the sebaceous gland structure A included in the observation sample of Experiment No. 9 is shown by enlarging the framed portion in FIG. 9 (A) and FIG. 9 (A).
  • the observation result is shown in FIG.
  • the length of the scale bar in FIG. 9A is 40 ⁇ m
  • the length of the scale bar in FIG. 9B is 10 ⁇ m.
  • the portion surrounded by a broken line indicates the outermost layer of the sebaceous gland.
  • Example 2 (3) the result of examining the relationship between the type of sample and the degree of sebum production is shown in FIG.
  • lane 1 is the degree of sebum production in sebaceous gland structure A (Experiment No. 7) contacted with test sample A containing no linoleic acid
  • lane 2 is a sebaceous gland structure contacted with test sample B containing linoleic acid.
  • lane 3 shows the sebum production progress in the sebaceous gland structure A (experiment number 9) brought into contact with the test sample D containing linoleic acid and a linoleic acid receptor antagonist.
  • the outermost layer of the sebaceous gland structure A (experiment number 9) contacted with the test sample D containing linoleic acid and a linoleic acid receptor antagonist shows sebum oil. It can be seen that no drops are seen.
  • sebaceous gland structure B A sebaceous gland structure containing a sebaceous gland and a hair follicle by pulling the hair follicle attached with the sebaceous gland after damaging the periphery of the hair follicle attached with the sebaceous gland from the structure with the tip of the tweezers ( Hereinafter, “sebaceous gland structure B”) was obtained.
  • the sebaceous gland structure B contains sebaceous glands, hair, hair follicles, and epidermis in the skin tissue, but did not substantially contain dermis and subcutaneous tissue.
  • Example 3 Culture of sebaceous gland structure In Example 2 (1), except that the sebaceous gland structure B obtained in Preparation Example 9 was used instead of the sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6. The same operation as in Example 2 (1) is performed to contact the sebaceous gland structure with the test sample.
  • Test Example 1 (1) instead of using the observation sample obtained in Preparation Example 7, the observation sample obtained in Example 3 (2) was used, The same operation as in Test Example 1 (1) is performed to observe the sebaceous gland structure B.
  • the sebaceous gland which the sebaceous gland structure B has is small, it turns out that the dynamics of the sebaceous gland can be accurately observed.
  • the sebaceous gland structure B has a large sebaceous gland it is sometimes difficult to accurately observe the dynamics of the sebaceous gland as compared with the case where the sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6 is used.
  • Example 4 (1) Preparation of test sample In the mixed medium (test sample A) obtained in Preparation Example 1, the concentration of linoleic acid and phytic acid as a test substance is 1 ⁇ 10 ⁇ 4 M and the test substance concentration is Test sample E was obtained by adding 100 ⁇ M.
  • test sample A (1 mL) was added to each well of a 24-well plate.
  • the sebaceous gland structure A obtained in Preparation Example 6 is cultured in a test sample A in each well of the 24-well plate for 24 hours at 37 ° C. in 5% carbon dioxide.
  • the sebaceous gland structure A and the test sample A were brought into contact (experiment number 10).
  • test sample B (experiment number 11) obtained in Example 1 (1) or test sample E (experiment number 12) obtained in Example 4 (1).
  • test sample B (experiment number 11) obtained in Example 1 (1) or test sample E (experiment number 12) obtained in Example 4 (1). ) was used in the same manner as in Experiment No. 10, and the sebaceous gland structure A was brought into contact with Test Sample B (Experiment No. 11) or Test Sample E (Experiment No. 12).
  • FIG. 11 shows the results of examining the relationship between the type of sample and the degree of sebum production.
  • lane 1 is the sebum production degree in the sebaceous gland structure A brought into contact with the test sample A not containing linoleic acid
  • lane 2 is the sebum production degree in the sebaceous gland structure A brought into contact with the test sample B containing linoleic acid
  • Lane 3 shows the degree of progress of sebum production in the sebaceous gland structure A brought into contact with the test sample E containing linoleic acid and phytic acid.
  • the sebum production degree in the sebaceous gland structure A contacted with the test sample B containing linoleic acid is the sebum production degree in the sebaceous gland structure A contacted with the test sample A not containing linoleic acid. It is clear that it is higher than Therefore, it can be seen that linoleic acid has a sebum production promoting action.
  • the degree of sebum production in the sebaceous gland structure A brought into contact with the test sample C containing linoleic acid and phytic acid is lower than the degree of sebum production in the sebaceous gland structure A brought into contact with the test sample B containing linoleic acid. I understand that. Therefore, it turns out that phytic acid has a sebum production inhibitory effect. From these results, it can be seen that according to the sebaceous gland structure A, the sebum production regulating action of the test substance can be accurately evaluated.
  • the dynamics of the sebaceous gland can be accurately observed, and the test substance regulates sebum production. It can be seen that it is possible to accurately evaluate whether or not the substance has an action. Therefore, it is expected to be used for the development of external preparations such as cosmetics suitable for humans who need to control sebum production, the method for observing sebaceous glands of the present invention, the method for evaluating test substances, and the regulation of sebum production.

Abstract

（Ｉ）皮膚組織から真皮及び皮下組織の全部又は一部が除去された皮脂腺構造体を培地中に浮遊状態で培養するステップ及び（ＩＩ）前記（Ｉ）で得た培養後の皮脂腺構造体を観察するステップを含む化粧料などの外用剤の開発などに有用な皮脂腺の観察法。

Description

皮脂腺の観察方法
　本発明は、皮脂腺の観察方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、化粧料などの外用剤の開発などに有用な皮脂腺の観察方法および被験物質の評価方法に関する。
　皮脂は、皮脂腺から皮膚の表面に分泌され、体外からの刺激から皮膚を保護する作用を有する。しかし、皮膚に存在する皮脂が過少である場合、皮膚を十分に保護することができないことがある。一方、皮膚に存在する皮脂が過剰である場合、ざ瘡、脂漏性皮膚炎、皮脂腺増殖症などが引き起こされることがある。したがって、皮脂の産生を適度に調節する化粧料などの外用剤が望まれている。
　一方、皮脂の産生に与える物質の影響は、皮脂腺細胞を用いる培養試験によって解析されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、皮脂腺細胞を用いる培養試験には、生体における皮脂腺からの皮脂の産生を十分に再現することができないことから、生体における皮脂腺の動態を的確に観察し難いという欠点がある。
特開２０１３－３２３３１号公報
　本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができる皮脂腺の観察方法および被験物質が皮脂の産生を調節する物質であるかどうかを的確に評価することができる被験物質の評価方法を提供することを目的とする。
　本発明の要旨は、
（１）皮脂腺を観察する方法であって、
（Ｉ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた培養後の皮脂腺構造体を観察するステップ
を含む皮脂腺の観察方法、
（２）前記ステップ（Ｉ）を行なう前に、単離された皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去して前記皮脂腺構造体を得るステップをさらに含む前記（１）に記載の皮脂腺の観察方法、ならびに
（３）被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
（Ａ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、
（Ｂ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価するステップ
を含む被験物質の評価方法
に関する。
　本発明の皮脂腺の観察方法によれば、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができるという優れた効果が奏される。また、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が皮脂の産生を調節する物質であるかどうかを的確に評価することができるという優れた効果が奏される。
皮脂腺構造体の皮脂腺を含む要部の構造を示す概略説明図である。 試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を観察した結果を示す図面代用写真である。 試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を観察した結果を示す図面代用写真である。 試験例１（２）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真である。 試験例１（２）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部における皮脂の油滴を観察した結果を示す図面代用写真である。 実施例１（５）において、実験番号１～６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態を分類して観察した結果を示す図面代用写真である。 （Ａ）は実施例２（３）において、実験番号７の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を示す図面代用写真である。 （Ａ）は実施例２（３）において、実験番号８の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を示す図面代用写真である。 （Ａ）は実施例２（３）において、実験番号９の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を示す図面代用者写真である。 実施例２（３）において、試料の種類と皮脂産生進行度との関係を調べた結果を示すグラフである。 実施例４（４）において、試料の種類と皮脂生成度との関係を調べた結果を示すグラフである。
　本発明は、１つの側面では、皮脂腺を観察する方法であって、
（Ｉ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（ＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた培養後の皮脂腺構造体を観察するステップ
を含む皮脂腺の観察方法に関する。
　本発明の皮脂腺の観察方法によれば、前記皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するという操作が採られているので、前記皮脂腺構造体が真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去されていても、当該皮脂腺構造体において、生体における皮脂腺からの皮脂の産生などに代表される生体における皮脂腺の動態が観察しやすい状態で、的確に再現される。したがって、本発明の皮脂腺の観察方法によれば、生体内により近い環境下で皮脂腺の動態を観察することができる。
　前記皮脂腺構造体は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された構造体である。具体的には、前記皮脂腺構造体は、図１に示されるように、皮脂腺１と、毛２と、毛２を取り囲む毛包３と、表皮４とを含有する。皮脂腺１は、皮脂腺１の最外層に局在する未分化の皮脂腺基底細胞１１と、未分化の皮脂腺基底細胞１１の局在位置よりも内側に局在し、脂肪滴を生成する細胞（以下、「成熟皮脂腺細胞」ともいう）１２と、皮脂腺１の中心部に局在し、成熟皮脂腺細胞１２が死滅して崩壊した細胞残さ１３とを含有している。皮脂腺１で生成された皮脂Ｓは、毛包３を介して皮膚の外に放出される。前記皮脂腺構造体における皮脂腺１と毛２と毛包３と表皮４とから構成される部分は、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去されている点を除き、生体中の皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とから構成される部分と同じ構造を有する。
　なお、本明細書において、「皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの一部が除去された」とは、皮膚組織から真皮および皮下組織が除去され、皮脂腺を観察することができる程度に皮脂腺が露出していることを意味する。
　前記ステップ（Ｉ）では、前記皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養する。前記皮脂腺構造体は、例えば、単離した皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去することなどによって製造することができる。したがって、本発明の皮脂腺の観察方法は、前記ステップ（Ｉ）を行なう前に、単離された皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去して前記皮脂腺構造体を得るステップをさらに含むことができる。
　前記皮脂腺構造体の製造方法としては、例えば、
（ａ１）単離された皮膚組織から皮下組織の全部または一部を切除するステップ、および
（ａ２）前記ステップ（ａ１）で得られた組織から膠原繊維などの繊維を除去して皮脂腺を露出させて前記皮脂腺構造体を得るステップ
を含む方法（以下、「製法Ａ」ともいう）；
（ｂ１）単離された皮膚組織から皮下組織の全部または一部を切除するステップ、
（ｂ２）前記ステップ（ｂ１）で得られた組織をディスパーゼ、コラゲナーゼ、プロナーゼなどの表皮付属器官を真皮から解離させるための酵素と接触させるステップ、および
（ｂ３）前記ステップ（ｂ２）で得られた組織から真皮を分離するステップ
を含む方法（以下、「製法Ｂ」ともいう）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの皮脂腺構造体の製法のなかでは、皮脂腺構造体を容易に製造することができ、しかも生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることから、製法Ａおよび製法Ｂが好ましく、製法Ａがより好ましい。
　前記単離された皮膚組織としては、例えば、外科手術の際に生じた余剰皮膚などから取得され、生きている状態の皮膚組織などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本明細書において、「生きている状態の皮膚組織」とは、生体内における本来の生物学的活性および本来の動きと同様の生物学的活性および動きを示す状態の皮膚組織をいう。
　前記皮膚組織の供給源としては、例えば、ヒトなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。本発明の皮脂腺の観察方法をヒトにおける皮脂の産生時の皮脂腺の観察などに用いる場合、前記皮膚組織の供給源は、ヒトであることが好ましい。従来、ヒトの皮脂腺の動態を的確に観察することが困難であったことから、本発明の皮脂腺の観察方法は、ヒトの皮脂腺の観察に好適である。
　皮脂腺の動態としては、例えば、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における皮脂腺を構成する細胞の形状を対比したときの細胞の形状の変化、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における皮脂腺を構成する細胞の分化状態を対比したときの細胞の分化状態の変化、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における分化した細胞の形状を対比したときの分化した細胞の形状の変化、皮脂の産生の際の少なくとも２つの時点における分化した細胞の局在部位の位置を対比したときの分化した細胞の局在部位の位置の変化などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　皮脂腺構造体の培養は、皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で行なわれる。「皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態」は、前記皮脂腺構造体の培養に用いられる培養容器の壁面に当該皮脂腺構造体が接触していない状態であればよく、特に限定されるものではない。したがって、「皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態」は、前記皮脂腺構造体の培養に用いられる培養容器の壁面に当該皮脂腺構造体が接触していない状態であれば、前記皮脂腺構造体の全体が培地中に浸漬している状態であってもよく、前記皮脂腺構造体の一部が培地外に露出し、その残部が培地中に浸漬している状態であってもよい。
　前記培地は、皮脂腺構造体に含まれる未分化の皮脂腺基底細胞を成熟皮脂腺細胞に分化させるのに適した分化促進成分および細胞を増殖させる増殖成分を含む培地であればよく、特に限定されるものではない。前記培地は、慣用の基本培地に、前記分化促進成分および増殖成分を補った培地であってもよく、市販されている培地であってもよい。前記分化促進成分としては、例えば、ウシ胎児血清、脂肪酸、ペプチド、ホルモンなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの分化促進成分は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。前記培地における前記分化促進成分の含有率は、前記培地の種類、前記分化促進成分の種類などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記培地の種類、前記分化促進成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記増殖成分としては、例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、糖類、細胞増殖促進因子などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記培地における前記増殖成分の含有率は、前記培地の種類、前記増殖成分の種類などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記培地の種類、前記増殖成分の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。これらの増殖成分は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。前記基本培地としては、例えば、ダルベッコ改変培地とＦ－１２培地との混合培地などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記皮脂腺構造体の培養を行なう際の培養条件は、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類、観察対象の皮脂腺の動態の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類、観察対象の皮脂腺の動態の種類などに応じて決定することが望ましい。前記培養条件は、例えば、培養温度、培養時間、培地のｐＨ、培養雰囲気における二酸化炭素濃度などを含む。
　前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養温度は、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは３５℃～３８℃、より好ましくは３６．５℃～３７．５℃である。また、前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培養時間は、培地中において、前記皮脂腺構造体における生理機能を良好な状態で維持する観点から、通常、好ましくは６～１６８時間、より好ましくは２４～４８時間である。さらに、前記皮膚組織の供給源がヒトである場合、培地のｐＨは、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは６．８～７．６、より好ましくは７．０～７．４である。培養雰囲気における二酸化炭素濃度は、生体における皮脂腺の状態を的確に再現する観点から、通常、好ましくは４～１０体積％、より好ましくは５～７体積％である。
　つぎに、前記ステップ（ＩＩ）では、培養後の皮脂腺構造体を観察する。培養後の皮脂腺構造体の観察は、例えば、培養後の皮脂腺構造体を染色試薬によって染色された皮脂腺構造体を観察試料として用いることなどによって行なうことができる。
　前記皮脂腺構造体の染色は、例えば、前記皮脂腺構造体と前記染色試薬とを接触させることなどによって行なうことができる。前記染色に用いられる前記培養後の皮脂腺構造体は、固定液によって固定された固定試料であってもよい。前記固定試料は、前記皮脂腺構造体に含まれる各細胞の細胞膜が前記染色試薬を透過させるのに十分な透過性を有する状態にされた試料であればよい。皮脂腺構造体の固定は、例えば、皮脂腺構造体が入っている培養容器中に、固定液を添加して、皮脂腺構造体と固定液とを接触させることなどによって行なわれる。
　前記固定液としては、例えば、アセトン、メタノール、アセトンとメタノールとの混合溶液、ホルムアルデヒド水溶液、ホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液、パラホルムアルデヒド水溶液、パラホルムアルデヒドのリン酸緩衝液溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記固定試料は、染色に先立ち、必要に応じて、適切な洗浄液で洗浄してもよく、洗浄しなくてもよい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水、トリス緩衝化生理的食塩水などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記染色試薬としては、例えば、マーカーに結合する結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬、前記結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、本明細書において、「マーカー」とは、皮脂腺構造体に含まれる組織、細胞などの存在の指標、細胞の分化度などの指標となる物質をいう。
　前記結合物質は、本発明の皮脂腺の観察方法の用途などによって異なるので一概には決定することができないことから、発明の皮脂腺の観察方法の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。前記結合物質としては、例えば、前記マーカーに結合する抗体（以下、単に、「抗体」という）またはその断片（以下、単に、「抗体断片」という）、前記マーカーに結合する化合物などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。前記抗体のなかでは、前記マーカーに対する特異性が高いことから、モノクローナル抗体が好ましい。前記抗体断片としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、単鎖抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記ポリクローナル抗体、前記モノクローナル抗体および前記抗体断片は、前記マーカーを抗原として用い、慣用の手法によって製造することができる。また、前記ポリクローナル抗体、前記モノクローナル抗体および前記抗体断片として、商業的に容易に入手可能なポリクローナル抗体、商業的に容易に入手可能なモノクローナル抗体および商業的に容易に入手可能な抗体断片を用いることができる。前記結合物質は、検出可能なシグナルを生じる物質であってもよく、当該シグナルを生じない物質であってもよい。
　前記検出可能な物質としては、例えば、蛍光物質、酵素などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒシリーズの蛍光物質〔例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７など〕などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、前記酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスフォターゼなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらの検出可能な物質のなかでは、検出操作が容易であり、高い精度で検出対象物を検出することができることから、蛍光物質が好ましく、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒシリーズの蛍光物質〔例えば、インビトロジェン製、商品名：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７など〕がより好ましい。
　なお、前記結合物質が抗体またはその抗体断片である場合、前記染色試薬は、必要に応じ、前記抗体またはその抗体断片に結合する標識結合物質をさらに含んでいてもよい。前記標識結合物質としては、例えば、前記結合物質に結合する第２の結合物質と標識物質との複合体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記第２の結合物質としては、例えば、前記抗体を製造する際に免疫した動物が有する免疫グロブリンに対する抗体、当該免疫グロブリンの断片に対する抗体などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記標識物質としては、例えば、前記検出可能な物質などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記染色試薬の種類は、発明の皮脂腺の観察方法の用途などによって異なるので一概には決定することができないことから、発明の皮脂腺の観察方法の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。前記染色試薬としては、例えば、前記未分化の皮脂腺基底細胞に対する染色試薬（以下、「未分化細胞染色試薬」ともいう）、皮脂に対する染色試薬（以下、「皮脂染色試薬」ともいう）、細胞核に対する染色試薬（以下、「核染色試薬」ともいう）、分化細胞染色試薬などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記未分化細胞染色試薬は、未分化の皮脂腺基底細胞に特異的なマーカー（以下、「未分化マーカー」ともいう）に結合する物質（以下、「未分化細胞結合物質」ともいう）を含む。前記未分化細胞染色試薬は、未分化細胞結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記未分化細胞結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記未分化細胞結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記未分化細胞マーカーとしては、例えば、ケラチン－５、ケラチン―７、ケラチン―１４、Ｂリンパ球誘導成熟タンパク質１（Ｂｌｉｍｐ１）、ロイシン－リッチリピート・イムノグロブリン様ドメインタンパク質１（Ｌｒｉｇ１）などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。
　前記核染色試薬は、核を構成する物質に結合する結合物質（以下、「核結合物質」ともいう）を含む。前記核染色試薬は、核結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記核結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記核結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記核を構成する物質としては、例えば、ＤＮＡなどの核酸などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記核結合物質は、細胞膜を透過する物質であればよい。前記核結合物質としては、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２は、検出可能な蛍光を生じる物質であることから、前記核染色試薬は、前記検出可能な物質を含有しない試薬であってもよい。
　前記皮脂染色試薬としては、例えば、皮脂に溶解する脂溶性色素などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。前記脂溶性色素としては、例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、オイルレッドＯ、ズダンＩＩＩ、ズダンＩＶ、ズダンブラックＢなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。なお、前記脂溶性色素は、皮脂に溶解して皮脂を染色することから、前記脂溶性色素を含む皮脂染色試薬は、前記検出可能な物質を含有しない試薬であってもよい。
　前記分化細胞染色試薬としては、例えば、未分化の皮脂腺基底細胞から分化した皮脂腺細胞に特異的なマーカー（以下、「分化マーカー」ともいう）に結合する物質（以下、「分化細胞結合物質」ともいう）を含む。前記分化細胞染色試薬は、分化細胞結合物質と検出可能な物質との複合体を含む試薬であってもよく、前記分化細胞結合物質自体が検出可能なシグナルを生じる物質である場合には、前記分化細胞結合物質を含有し、前記検出可能な物質を含まない試薬であってもよい。前記分化細胞マーカーとしては、例えば、ステアリル－ＣｏＡ不飽和化酵素１（Ｓｃｄ－１）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）などが挙げられるが、本発明は、特に限定されるものではない。
　前記染色試薬中における前記結合物質の含有率は、前記結合物質の種類、発明の皮脂腺の観察方法の用途などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記結合物質の種類、発明の皮脂腺の観察方法の用途などに応じて適宜決定することが好ましい。
　前記未分化細胞染色試薬に含まれる検出可能な物質、前記皮脂染色試薬に含まれる検出可能な物質および前記核染色試薬に含まれる検出可能な物質は、互いに識別可能な物質であることが好ましい。
　前記皮脂腺構造体と前記染色試薬との混合比および接触時間は、前記染色試薬の種類などによって異なるので一概に決定されるものではないことから、前記染色試薬の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。
　前記皮脂腺構造体と前記染色試薬との接触後、皮脂腺の動態をより的確に観察する観点から、染色された皮脂腺構造体を適切な洗浄液で洗浄することが好ましい。前記洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝生理的食塩水、リン酸緩衝液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　なお、前記染色試薬が抗体またはその抗体断片を含む場合、皮脂腺の動態をより的確に観察する観点から、前記染色された皮脂腺構造体に対し、ブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施すことが好ましい。前記ブロッキング剤としては、例えば、アルブミンを含有するリン酸緩衝生理的食塩水溶液などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記染色された皮脂腺構造体を用いて皮脂腺の動態を観察する。皮脂腺の観察は、例えば、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡などの光学顕微鏡などを用いて行なうことができる。具体的には、皮脂腺の観察は、例えば、染色された皮脂腺構造体をそのまま観察すること、染色された皮脂腺構造体における染色試薬に由来するシグナルを検出することによって行なうことができる。
　以上説明したように、本発明の皮脂腺の観察方法によれば、皮脂腺からの皮脂の産生を的確に観察することができることから、皮脂産生調節物質のスクリーニング、皮脂産生調節物質の有効性の評価などに用いられることが期待される。
２．被験物質の評価方法
　本発明は、他の側面では、被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
（Ａ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、
（Ｂ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
（Ｃ）前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価するステップ
を含む被験物質の評価方法に関する。
　本発明の被験物質の評価方法は、前記ステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）を行ない、前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察するという操作が行なわれるので、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を的確に評価することができる。したがって、本発明の被験物質の評価方法によれば、被験物質が皮脂の産生を調節する物質であるかどうかを的確に評価することができる。前記皮脂産生調節作用には、皮脂産生を増加させる皮脂産生促進作用および皮脂産生を減少させる皮脂産生抑制作用が含まれる。なお、前記ステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）を行なう順は、ステップ（Ａ）を行なった後にステップ（Ｂ）を行なう順であってもよく、ステップ（Ｂ）を行なった後にステップ（Ａ）を行なう順であってもよい。また、ステップ（Ａ）およびステップ（Ｂ）を同時に行なってもよい。
　まず、前記ステップ（Ａ）では、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養する。前記ステップ（Ａ）に用いられる皮脂腺構造体および培地は、前述の皮脂腺の観察方法に用いられる皮脂腺構造体および培地と同様である。前記ステップ（Ａ）における前記皮脂腺構造体の培養は、前述の皮脂腺の観察方法における前記皮脂腺構造体の培養の手法と同様の手法で行なうことができる。前記皮脂腺構造体の培養条件は、評価内容、評価対象の被験物質の種類、被験物質と前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などに応じて決定することが望ましい。
　前記ステップ（Ｂ）では、皮膚組織から真皮および皮下組織が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養する。前記ステップ（Ｂ）に用いられる皮脂腺構造体は、前記ステップ（Ａ）で用いられる皮脂腺構造体と同じ供給源の皮膚組織から得られる同じ種類の皮脂腺構造体であるが、前記ステップ（Ａ）で用いられた皮脂腺構造体とは別の皮脂腺構造体である。前記ステップ（Ｂ）で用いられる培地は、前記ステップ（Ａ）で用いられる培地と同じ種類の培地である。前記ステップ（Ｂ）において、被験物質の存在下での前記皮脂腺構造体の培養は、例えば、前記ステップ（Ａ）で用いられる培地と同じ種類の培地に被験物質を添加して得られた被験物質含有培地を用いることを除き、前述の皮脂腺の観察方法における前記皮脂腺構造体の培養の手法と同様の手法で行なうことができる。被験物質含有培地における被験物質の濃度は、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などによって異なるので一概には決定することができないことから、評価内容、評価対象の被験物質の種類、前記皮脂腺構造体の製造に用いられる皮膚組織の供給源の種類などに応じて決定することが望ましい。前記ステップ（Ｂ）における皮脂腺構造体の培養条件は、被験物質を用いないことを除き、前記ステップ（Ａ）における皮脂腺構造体の培養条件と同じである。
　前記ステップ（Ｃ）では、前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する。前記ステップ（Ｃ）における皮脂腺構造体の観察の手法は、前述の皮脂腺の観察方法における皮脂腺構造体の観察の手法と同様である。
　前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いとしては、被験物質の有無による皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数の違い、被験物質の有無による皮脂腺の中心部付近に存在する皮脂量の違い、被験物質の有無による分化マーカーの発現位置の違い、被験物質の有無による分化マーカーの発現量の違いなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記被験物質が皮脂産生促進作用を有することの指標としては、例えば、以下の（１ａ）～（３ａ）の指標などが挙げられる。これらの指標は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
（１ａ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数が多いこと、
（２ａ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度が大きいこと、および
（３ａ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数が多いこと。
　また、前記被験物質が皮脂産生抑制作用を有することの指標としては、例えば、以下の（１ｂ）～（３ｂ）の指標などが挙げられる。これらの指標は、単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
（１ｂ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の最外層における皮脂を内包する細胞の数が少ないこと、
（２ｂ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺における未分化の皮脂腺基底細胞から成熟皮脂腺細胞への分化の速度が小さいこと、および
（３ｂ）前記皮脂腺構造体（Ａ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数に比べて前記皮脂腺構造体（Ｂ）の皮脂腺の中心部付近に存在する崩壊した成熟皮脂腺細胞の数が少ないこと。
　以上説明したように、本発明の被験物質の評価方法によれば、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を的確に評価することができることから、皮脂産生調節物質のスクリーニング、皮脂産生調節物質の有効性の評価などに用いられることが期待される。前記皮脂産生調節物質は、例えば、顔、腋、頭皮などの皮膚用の化粧料に配合される皮脂産生抑制剤、皮脂産生促進剤などに用いられることが期待されるものである。
　以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。以下において、各略語の意味は、以下のとおりである。
＜略語の説明＞
　ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
　ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変培地
　ＦＢＳ：ウシ胎児血清
　ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
　ＰＢＳＴＴ：ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０）とポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００）とを含有するＰＢＳ溶液〔組成：０．１体積％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５体積％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００および残部ＰＢＳ〕
　ＰＦＡ：パラホルムアルデヒド
調製例１
　ＤＭＥＭとＦ－１２培地との混合培地〔ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（体積比）が１／１〕に、ＦＢＳおよび細胞外基質〔コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社製、商品名：マトリゲル〕をＦＢＳの濃度が１０体積％および細胞外基質の濃度が２体積％となるように添加して混合培地を得た。
調製例２
　抗Ｋ５抗体〔アブカム（ａｂｃａｍ）（株）製、商品名：αＫ５　ａｎｔｉｂｏｄｙ〕をその濃度が０．３３μｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液に添加して一次抗体含有溶液を得た。なお、Ｋ５は、皮脂腺の最外層に存在する未分化の皮脂腺基底細胞のマーカーである。
調製例３
　標識抗ＩｇＧ抗体〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（株）製、商品名：α　ＩｇＧ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｌｅｘａ　ｆｌｕｏｒ　６４７〕および核染色剤〔インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（株）製、商品名：ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２〕を標識抗ＩｇＧ抗体の濃度が２μｇ／ｍＬおよび核染色剤の濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液に添加して染色試薬Ａを得た。なお、前記標識抗ＩｇＧ抗体は、調製例２で用いられた抗Ｋ５抗体に対する二次抗体である。
調製例４
　脂肪染色試薬〔和光純薬（株）製、商品名：ナイルレッド（Ｎｉｌｅ　Ｒｅｄ）〕をその濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液に添加して染色試薬Ｂを得た。
調製例５
　カバーグラス（２４ｍｍ×５５ｍｍ）上にスペーサー（直径９ｍｍおよび厚さ０．１２ｍｍ）を貼り、スペーサー付カバーグラスを得た。
調製例６
　実体顕微鏡下に、ハサミを用い、皮膚組織から皮下組織を除去した。つぎに、ハサミおよびピンセットを用い皮下組織除去後の皮膚組織中の真皮から膠原繊維を除去することにより、皮脂腺が露出した皮脂腺構造体（以下、「皮脂腺構造体Ａ」という）を得た。なお、皮脂腺構造体Ａは、皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とを含有しているが、真皮および皮下組織を実質的に含有しておらず、皮脂腺が露出していた。
調製例７
　調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを４質量％ＰＦＡ含有ＰＢＳ溶液中に４℃で３０分間浸漬させることにより、皮脂腺構造体Ａを固定して固定試料を得た。得られた固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。
　洗浄後の固定試料を、調製例２で得られた一次抗体含有溶液中において、４℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後の固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。
　洗浄後の固定試料を、調製例３で得られた染色試薬Ａ中において、４℃で１２時間インキュベーションすることにより、皮脂腺の最外層に存在する皮脂腺基底細胞および核を染色した。染色後の固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。
　洗浄後の固定試料を、調製例４で得られた染色試薬Ｂ中において、室温（２５℃）で３０分間インキュベーションすることにより、皮脂腺構造体Ａに含まれる皮脂を染色した。染色後の固定試料を２質量％ＢＳＡ含有ＰＢＳＴＴ溶液中において、４℃で１時間インキュベーションすることにより、洗浄を行なった。洗浄は、３回行なった。
　洗浄後の固定試料を２０質量％グリセロール含有ＰＢＳ溶液中における４℃で１時間のインキュベーション、５０質量％グリセロール含有ＰＢＳ溶液中における４℃で１時間のインキュベーションおよび８０質量％グリセロール含有ＰＢＳ溶液中における室温４℃で１時間のインキュベーションに供して固定試料に含まれる水分をグリセロールに置換した。
　調製例５で得られたスペーサー付カバーグラスのスペーサーに囲まれた部分に８０質量％グリセロール水溶液適量（例えば５０μＬ）を添加した。つぎに、グリセロール置換後の皮脂腺構造体Ａを前記スペーサー付カバーグラスのスペーサーに囲まれた部分に皮脂腺側が下向きになるように載置した。その後、前記スペーサー付カバーグラスのスペーサーに囲まれた部分に円形のカバーガラス（直径１２ｍｍ）をかぶせることにより、観察用試料を得た。
試験例１
（１）皮脂腺構造体の外観の観察
　調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を共焦点顕微鏡下で観察した。試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を観察した結果を図２および図３に示す。図２中のスケールバーの長さは、５０μｍである。また、図３中のスケールバーの長さは、５０μｍである。図３中、１は皮脂腺、３は毛包を示す。
　図２に示された結果から、皮脂腺構造体Ａは、未分化の皮脂腺基底細胞で覆われた滑らかな表面を有する皮脂腺を有していることがわかる。また、図３に示された結果から、皮脂腺構造体Ａには、毛包３および毛包３に包まれた毛が除去されずに残存していることがわかる。したがって、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺本来の構造を保持していることがわかる。このように、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺の構造を保持していることから、皮脂腺構造体Ａを用いることにより、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。
（２）皮脂腺構造体の内部の観察
　調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を共焦点顕微鏡下で観察した。試験例１（２）において、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体の内部を観察した結果を図４、調製例７で得られた観察用試料に含まれる皮脂腺構造体の内部における皮脂の油滴を観察した結果を図５に示す。図４中のスケールバーの長さは７０μｍ、図５中のスケールバーの長さは、５０μｍである。図４中、１１は未分化の皮脂腺基底細胞、Ｎは核、Ｓは皮脂を示す。また、図５中、Ａは皮脂腺の最外層に存在する皮脂の油滴、Ｂは皮脂腺の中間層に存在する皮脂の油滴、Ｃは皮脂腺の中心付近に存在する皮脂の油滴を示す。
　図４に示された結果から、皮脂腺の表面は、未分化の皮脂腺基底細胞で覆われた滑らかな表面であることから、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺本来の構造を保持していることがわかる。また、図５に示された結果から、皮脂腺の最外層（図５中、Ａ）から中心付近（図５中、Ｃ）に向かうにしたがって細胞内の油滴の大きさが大きくなっていることがわかる。これらの結果から、皮脂腺構造体Ａは、培地中に浮遊させた状態で培養した場合、培養時間の経過に伴い、図１に示されるように、未分化の皮脂腺基底細胞１１が、皮脂腺１の最外層から皮脂腺１の中心部に向けて移動しながら成熟皮脂腺細胞１２に分化すること、および成熟皮脂腺細胞１２によって生成された油滴が成熟皮脂腺細胞１２が死滅して崩壊した細胞残さ１３から毛２を取り囲む毛包３を介して皮脂Ｓとして皮膚の外に放出されることが推定される。このように、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂腺の構造を保持するとともに、生体における皮脂産生過程を再現することができることがわかる。したがって、皮脂腺構造体Ａによれば、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。
実施例１
（１）被験試料の調製
　調製例１で得られた混合培地（以下、「被験試料Ａ」ともいう）に、リノール酸をその濃度が１×１０-4Ｍとなるように添加して被験試料Ｂを得た。また、調製例１で得られた混合培地に、リノール酸の濃度が１×１０-3Ｍとなるように添加して被験試料Ｃを得た。
（２）皮脂腺構造体の培養および皮脂腺構造体と被験試料との接触
　被験試料Ａ１ｍＬを２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。つぎに、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ａ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号１）。また、実験番号１において、２４時間の培養を行なう代わりに４８時間の培養を行なうことを除き、実験番号１と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号２）。
　調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ｂ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｂとを接触させた（実験番号３）。また、実験番号３において、２４時間の培養を行なう代わりに４８時間の培養を行なうことを除き、実験番号３と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｂとを接触させた（実験番号４）。
　調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ｂ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｃとを接触させた（実験番号５）。また、実験番号５において、２４時間の培養を行なう代わりに４８時間の培養を行なうことを除き、実験番号５と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ｃとを接触させた（実験番号６）。
（３）観察用試料の調製
　調製例７において、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例１（２）で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａ（実験番号１～６）を用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、実験番号１～６の観察用試料を得た。
（４）皮脂腺構造体の内部の観察
　試験例１（１）において、調製例６で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例１（３）で得られた実験番号１～６の観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、実験番号１～６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を共焦点顕微鏡下で観察した。
（５）皮脂産生過程の観察
　試験例１（１）において、調製例６で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例１（３）で得られた実験番号１～６の観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、実験番号１～６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態を観察した。つぎに、観察された皮脂腺の細胞内の油滴の状態を表１の（Ａ）～（Ｇ）に基づいて分類して観察した。なお、分類は、観察された細胞内の油滴の状態に基づき、一見して表１の（Ａ）～（Ｇ）に最も近いものを選択することによって行なった。実施例１（５）において、実験番号１～６それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態を分類して観察した結果を図６に示す。図中、（Ａ）～（Ｇ）それぞれのスケールバーの長さは、１０μｍである。また、図中、（Ａ）から（Ｇ）の順に分化が進んだ細胞を含む部分を示す。（Ａ）～（Ｇ）それぞれの上段と下段とは、皮脂腺構造体Ａの皮脂腺中の同一の部分を示す。さらに、図中、（Ａ）～（Ｇ）の下段において、実線は細胞の輪郭、破線は油滴の輪郭を示す。なお、図６（Ａ）～（Ｇ）に示される皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態は、それぞれ、表１中の（Ａ）～（Ｇ）の状態に対応する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、実験番号１～６それぞれの観察用試料の皮脂腺の最外層で見られる細胞内の油滴の状態と、図６に示される皮脂腺の最外層に含まれる細胞内の油滴の状態との対応関係を表２に示す。表２中、「〇（白丸）」は図６に示される所定の状態が観察されること、「－」は図６に示される所定の状態が観察されないことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図６に示された結果から、（Ａ）から（Ｆ）の順に分化が進むにつれて、細胞内に占める油滴の割合が増えていることがわかる。また、（Ｇ）では、皮脂が放出され、細胞が消失していることがわかる。また、表２に示された結果から、皮脂腺構造体Ａにおける皮脂産生には、生体における皮脂産生と同様に、被験試料におけるリノール酸濃度が低く、培養時間が短いほど、皮脂産生が進んでいない細胞が多く、被験試料におけるリノール酸濃度が高く、培養時間が長いほど、皮脂産生が進んでいる細胞が多くなる傾向が見られることがわかる。これらの結果から、皮脂腺構造体Ａは、生体における皮脂産生過程を再現することができることがわかる。したがって、皮脂腺構造体Ａによれば、生体における皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。
調製例８
　調製例１で得られた混合培地に、リノール酸および被験物質としてのリノール酸受容体アンタゴニスト〔アブカム（株）製、商品名：ＧＳＫ－３７８７〕をリノール酸の濃度が１×１０-4Ｍおよび被験物質の濃度が１μＭとなるように添加して被験試料Ｄを得た。
実施例２
（１）皮脂腺構造体の培養および皮脂腺構造体と被験試料との接触
　被験試料Ａ１ｍＬを２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。つぎに、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ａ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号７）。
　また、実験番号７において、被験試料Ａを用いる代わりに実施例１（１）で得られた被験試料Ｂ（実験番号８）または調製例８で得られた被験試料Ｄ（実験番号９）を用いたことを除き、実験番号７と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと、被験試料Ｂ（実験番号８）または被験試料Ｄ（実験番号９）とを接触させた。
（２）観察用試料の調製
　調製例７において、調製例６で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例２（１）で得られた実験番号７～９の皮脂腺構造体Ａを用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、実験番号７～９の観察用試料を得た。
（３）皮脂腺構造体の内部の観察
　試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例２（２）で得られた実験番号７～９の観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、実験番号７～９それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を共焦点顕微鏡下で観察した。
　実施例２（３）において、実験番号７の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を図７（Ａ）、図７（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を図７（Ｂ）に示す。図７（Ａ）におけるスケールバーの長さは２０μｍ、図７（Ｂ）におけるスケールバーの長さは１０μｍである。また、図７中、破線で囲まれた部分は皮脂腺の最外層を示す。また、実施例２（３）において、実験番号８の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を図８（Ａ）、図８（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を図８（Ｂ）に示す。図８（Ａ）におけるスケールバーの長さは４０μｍ、図８（Ｂ）におけるスケールバーの長さは１０μｍである。また、図８中、破線で囲まれた部分は皮脂腺の最外層、矢頭は皮脂の油滴を示す。さらに、実施例２（３）において、実験番号９の観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの内部を観察した結果を図９（Ａ）、図９（Ａ）における枠囲み部分を拡大して観察した結果を図９（Ｂ）に示す。図９（Ａ）におけるスケールバーの長さは４０μｍ、図９（Ｂ）におけるスケールバーの長さは１０μｍである。また、図９中、破線で囲まれた部分は皮脂腺の最外層を示す。
　さらに、図７～９に示された結果を用い、以下の評価基準に基づいて各図に示された最外層の細胞４０個の各細胞の状態を評価した。
＜評価基準＞
　０点：細胞内に油滴がまったく見られない〔図６（Ａ）参照〕。
　１点：細胞内にわずかに油滴が見られる〔図６（Ｂ）参照〕。
　２点：細胞内に油滴のスペースができている〔図６（Ｃ）参照〕。
　３点：細胞内の油滴が細胞の核を侵食しはじめている〔図６（Ｄ）参照〕。
　４点：細胞内の油滴同士がつながりはじめている〔図６（Ｅ）参照〕。
　５点：細胞内のすべてが油滴によって占められている〔図６（Ｆ）参照〕。
　６点：細胞が消失している〔図６（Ｇ）参照〕。
　つぎに、図７～９のそれぞれにおいて、最外層の細胞４０個における点数の平均値を求めることにより、皮脂腺構造体Ａに含まれる皮脂腺の細胞における皮脂産生進行度を評価した。実施例２（３）において、試料の種類と皮脂産生進行度との関係を調べた結果を図１０に示す。図中、レーン１はリノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号７）における皮脂産生進行度、レーン２はリノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号８）における皮脂産生進行度、レーン３はリノール酸とリノール酸受容体アンタゴニストとを含む被験試料Ｄと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号９）における皮脂産生進行度を示す。
　図７および図１０に示された結果から、リノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号７）の最外層には、皮脂の油滴が見られないことがわかる。ところが、図８および図１０に示された結果から、リノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号８）の最外層には、皮脂の油滴が見られることがわかる。一方、図９および図１０に示された結果から、リノール酸とリノール酸受容体アンタゴニストとを含む被験試料Ｄと接触させた皮脂腺構造体Ａ（実験番号９）の最外層には、皮脂の油滴が見られないことがわかる。
調製例９
　実体顕微鏡下に、ハサミを用い、皮膚組織から皮下組織を除去した。つぎに、皮下組織除去後の皮膚組織を、前記６０ｍｍ径ディッシュ内のディスパーゼ含有ＰＢＳ溶液に浮かべた状態で、４℃で１６時間インキュベーションした。インキュベーション後の皮膚組織から真皮を除去して表皮と毛と毛包と皮脂腺とを含む構造体を得た。
　前記構造体から皮脂腺が付属している毛包の根元の周囲をピンセットの先で傷つけた後、皮脂腺が付属している毛包を引っ張ることにより、皮脂腺と毛包とを含有する皮脂腺構造体（以下、「皮脂腺構造体Ｂ」という）を得た。なお、皮脂腺構造体Ｂは、皮膚組織における皮脂腺と毛と毛包と表皮とを含有しているが、真皮および皮下組織を実質的に含有していなかった。
実施例３
（１）皮脂腺構造体の培養
　実施例２（１）において、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに調製例９で得られた皮脂腺構造体Ｂを用いたことを除き、実施例２（１）と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体と被験試料との接触を行なう。
（２）観察用試料の調製
　調製例７において、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例３（１）で得られた培養後の皮脂腺構造体Ｂを用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、観察用試料を得る。
（３）皮脂腺構造体の観察
　試験例１（１）において、調製例７で得られた観察用試料を用いる代わりに実施例３（２）で得られた観察用試料を用いたことを除き、試験例１（１）と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ｂの観察を行なう。その結果、皮脂腺構造体Ｂが有する皮脂腺が小さい場合には、当該皮脂腺の動態を的確に観察することができることがわかる。一方、皮脂腺構造体Ｂが有する皮脂腺が大きい場合には、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを用いたときと比べ、当該皮脂腺の動態を的確に観察しにくいことがあることがわかる。
実施例４
（１）被験試料の調製
　調製例１で得られた混合培地（被験試料Ａ）に、リノール酸および被験物質としてのフィチン酸をリノール酸の濃度が１×１０-4Ｍおよび被験物質の濃度が１００μＭとなるように添加して被験試料Ｅを得た。
（２）皮脂腺構造体の培養および皮脂腺構造体と被験試料との接触
　被験試料Ａ１ｍＬを２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。つぎに、調製例６で得られた皮脂腺構造体Ａを、前記２４ウェルプレートの各ウェル内の被験試料Ａ中に浮かべた状態で、５体積％二酸化炭素下に３７℃で２４時間培養することにより、皮脂腺構造体Ａと被験試料Ａとを接触させた（実験番号１０）。
　また、実験番号１０において、被験試料Ａを用いる代わりに実施例１（１）で得られた被験試料Ｂ（実験番号１１）または実施例４（１）で得られた被験試料Ｅ（実験番号１２）を用いたことを除き、実験番号１０と同様の操作を行ない、皮脂腺構造体Ａと、被験試料Ｂ（実験番号１１）または被験試料Ｅ（実験番号１２）とを接触させた。
（３）観察用試料の調製
　調製例７において、調製例６で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａを用いる代わりに実施例４（２）で得られた培養後の皮脂腺構造体Ａ（実験番号１０～１２）を用いたことを除き、調製例７と同様の操作を行ない、実験番号１０～１２の観察用試料を得た。
（４）皮脂腺構造体の観察
　画像解析ソフトウェア〔ビットプレーン（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）社製、商品名：Ｉｍａｒｉｓ〕を用い、実施例４（３）で得られた実験番号１０～１２それぞれの観察用試料に含まれる皮脂腺構造体Ａの外観を共焦点顕微鏡下で観察することにより、皮脂腺構造体Ａの３次元画像のデータを得た。つぎに、画像解析ソフトウェア〔ビットプレーン（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）社製、商品名：Ｉｍａｒｉｓ〕を用い、得られた３次元画像のデータから皮脂腺構造体Ａの最外層の情報を抽出した。その後、抽出された情報から最外層に存在する細胞の全体積を算出するとともに、最外層に含まれる皮脂滴を計数した。最外層に存在する細胞の全体積および皮脂の油滴数を用い、式（Ｉ）：
　［皮脂生成度］
＝［皮脂の油滴数］／［最外層に存在する細胞の全体積］　　　（Ｉ）
にしたがい、皮脂生成度を求めた。
　試料の種類と皮脂生成度との関係を調べた結果を図１１に示す。図中、レーン１はリノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度、レーン２はリノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度、レーン３はリノール酸とフィチン酸とを含む被験試料Ｅと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂産生進行度を示す。
　図１１に示された結果から、リノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度は、リノール酸を含まない被験試料Ａと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度と比べて高いことがわかる。したがって、リノール酸は、皮脂産生促進作用を有することがわかる。一方、リノール酸とフィチン酸とを含む被験試料Ｃと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度は、リノール酸を含む被験試料Ｂと接触させた皮脂腺構造体Ａにおける皮脂生成度と比べて低いことがわかる。したがって、フィチン酸は、皮脂産生抑制作用を有することがわかる。これらの結果から、皮脂腺構造体Ａによれば、被験物質が有する皮脂産生調節作用を的確に評価することができることがわかる。
　以上説明したように、皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を用いることにより、皮脂腺の動態を的確に観察することができるとともに、被験物質が皮脂産生調節作用を有する物質であるかどうかを的確に評価することができることがわかる。したがって、本発明の皮脂腺の観察方法および被験物質の評価方法、皮脂産生の調節が必要なヒトに適した化粧料などの外用剤の開発に用いられることが期待されるものである。
　１　皮脂腺
　２　毛
　３　毛包
　４　表皮
　１１　未分化の皮脂腺基底細胞
　１２　成熟皮脂腺細胞
　１３　細胞残さ
　Ｓ　皮脂
　Ｎ　核

Claims (3)

  1. 　皮脂腺を観察する方法であって、
    （Ｉ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
    （ＩＩ）ステップ（Ｉ）で得られた培養後の皮脂腺構造体を観察するステップ
    を含む皮脂腺の観察方法。
  2. 　前記ステップ（Ｉ）を行なう前に、単離された皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部を除去して前記皮脂腺構造体を得るステップをさらに含む請求項１に記載の皮脂腺の観察方法。
  3. 　被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価する方法であって、
    （Ａ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、
    （Ｂ）皮膚組織から真皮および皮下組織それぞれの全部または一部が除去された皮脂腺構造体を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養するステップ、および
    （Ｃ）前記ステップ（Ａ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ａ）と前記ステップ（Ｂ）で得られた培養後の皮脂腺構造体（Ｂ）とを観察し、前記皮脂腺構造体（Ａ）における皮脂腺の動態と前記皮脂腺構造体（Ｂ）における皮脂腺の動態との違いに基づき、前記被験物質が有する皮脂産生調節作用を評価するステップ
    を含む被験物質の評価方法。
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