JP2950519B2 - 皮膚の未変性状態組織培養法 - Google Patents
皮膚の未変性状態組織培養法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 説明 発明の技術分野 本発明は、皮膚の未変性状態組織培養法及びその方法
を用いるアッセイに関する。
を用いるアッセイに関する。
発明の背景 皮膚と接触する市販の製品（即ち、化粧品、家庭製品
及び医薬品）は全て、その製品がヒトに対して毒性がな
いことを確かめるために多くの試験を行わなければなら
ない。そのような製品の毒性を評価する現在用いうる手
段は、費用や時間の掛かるものであり、たいていは非常
に多くの生きた動物を毒性物質に曝すことを伴うもので
ある。そのような毒性試験に生きた動物を使用すること
について、社会、科学団体及び行政による批判や検査を
受けることが増えてきた。生きた動物を毒性物質に曝す
ことのない皮膚毒性アッセイを緊急に開発することが要
望されている。
及び医薬品）は全て、その製品がヒトに対して毒性がな
いことを確かめるために多くの試験を行わなければなら
ない。そのような製品の毒性を評価する現在用いうる手
段は、費用や時間の掛かるものであり、たいていは非常
に多くの生きた動物を毒性物質に曝すことを伴うもので
ある。そのような毒性試験に生きた動物を使用すること
について、社会、科学団体及び行政による批判や検査を
受けることが増えてきた。生きた動物を毒性物質に曝す
ことのない皮膚毒性アッセイを緊急に開発することが要
望されている。
皮膚毒性の生体外アッセイを開発する多くの試みが最
近報告されているが、かかる系は物質の毒性作用を自然
な皮膚について正確に且つ信頼できるように予測するに
は不十分であることがわかった。これらの生体外アッセ
イの多くは、被検動物の皮膚から単離された個々の細胞
を培養することを含んでいる。例えば、Van Brunt,J.,B
iotechnology,9:136−137（1991）及びNaughton等,Alte
rnative Methods In Toxicology,ed.A.M.Goldberg,7:18
3−189（1989）参照。細胞培養に基づくそのようなアッ
セイは、特に推定上の毒素が細胞間相互作用を変えて作
用する場合、余りに簡易化されており、不十分である。
近報告されているが、かかる系は物質の毒性作用を自然
な皮膚について正確に且つ信頼できるように予測するに
は不十分であることがわかった。これらの生体外アッセ
イの多くは、被検動物の皮膚から単離された個々の細胞
を培養することを含んでいる。例えば、Van Brunt,J.,B
iotechnology,9:136−137（1991）及びNaughton等,Alte
rnative Methods In Toxicology,ed.A.M.Goldberg,7:18
3−189（1989）参照。細胞培養に基づくそのようなアッ
セイは、特に推定上の毒素が細胞間相互作用を変えて作
用する場合、余りに簡易化されており、不十分である。
Naughton等のモデルは、皮膚組織から皮膚線維芽細胞
を単離し、その単離した線維芽細胞を適切な培地で増殖
し、その線維芽細胞をナイロンメッシュに塗布し、別の
皮膚試料からメラニン細胞を単離し、その単離したメラ
ニン細胞を培養し、その培養メラニン細胞を皮膚線維芽
細胞被覆ナイロンメッシュに塗布し、ケラチン細胞を単
離し、その単離したケラチン細胞をメラニン細胞−線維
芽細胞−ナイロンメッシュに塗布することを含んでい
る。そのような系は自然な皮膚に対する相等性に欠ける
ばかりでなく、その技法の使用は少なくとも３種類の異
なった細胞を単離し、各種類の細胞を培養し、次にナイ
ロンメッシュ上で個々の種類の細胞を一緒に共生培養す
るという手間が掛かる工程を含む。著者等によれば、こ
の系の確定に要する最短時間は約８〜約14日である。
を単離し、その単離した線維芽細胞を適切な培地で増殖
し、その線維芽細胞をナイロンメッシュに塗布し、別の
皮膚試料からメラニン細胞を単離し、その単離したメラ
ニン細胞を培養し、その培養メラニン細胞を皮膚線維芽
細胞被覆ナイロンメッシュに塗布し、ケラチン細胞を単
離し、その単離したケラチン細胞をメラニン細胞−線維
芽細胞−ナイロンメッシュに塗布することを含んでい
る。そのような系は自然な皮膚に対する相等性に欠ける
ばかりでなく、その技法の使用は少なくとも３種類の異
なった細胞を単離し、各種類の細胞を培養し、次にナイ
ロンメッシュ上で個々の種類の細胞を一緒に共生培養す
るという手間が掛かる工程を含む。著者等によれば、こ
の系の確定に要する最短時間は約８〜約14日である。
同様の方法において、現在用いうるあるいは開発中の
他の生体外系は、無傷な皮膚よりむしろ別個に培養した
細胞を使用している。ある場合には、異なった生物体か
らの細胞を単一の皮膚等価物に混合している。上記Van
Brunt。
他の生体外系は、無傷な皮膚よりむしろ別個に培養した
細胞を使用している。ある場合には、異なった生物体か
らの細胞を単一の皮膚等価物に混合している。上記Van
Brunt。
無傷な皮膚に対する培養系を確立するために１つの実
験が試みられたが、皮膚の生存力が24時間以上維持しな
かった。Kao等,Toxicology and Applied Pharmacology,
81:502−516（1985）。
験が試みられたが、皮膚の生存力が24時間以上維持しな
かった。Kao等,Toxicology and Applied Pharmacology,
81:502−516（1985）。
学会や産業科学業界が時間とエネルギーを費やしたに
もかかわらず、長時間未変性状態の三次元構築を維持し
ながら培養した皮膚の生存が保たれ増殖することができ
る皮膚組織培養系は現在有効なものがない。
もかかわらず、長時間未変性状態の三次元構築を維持し
ながら培養した皮膚の生存が保たれ増殖することができ
る皮膚組織培養系は現在有効なものがない。
本発明は、皮膚に対する長期間未変性状態組織培養系
を提供するものであり、そのような系の緊急で切実な要
望を解決するものである。
を提供するものであり、そのような系の緊急で切実な要
望を解決するものである。
発明の要約 本発明は、内側面及び外側面を有する皮膚試料の未変
性組織培養方法であって、内側面を細胞外支持マトリッ
クスに隣接させ、外側面を培地表面より上に露出させる
ことにより、培地に浸漬したマトリックス上に該皮膚試
料を置き、マトリックスとその上の皮膚を皮膚培養条件
下で維持することを含む方法を提供する。
性組織培養方法であって、内側面を細胞外支持マトリッ
クスに隣接させ、外側面を培地表面より上に露出させる
ことにより、培地に浸漬したマトリックス上に該皮膚試
料を置き、マトリックスとその上の皮膚を皮膚培養条件
下で維持することを含む方法を提供する。
細胞外支持マトリックスは、コラーゲン含有ゲル、ホ
モ多糖類スポンジ又は上層のコラーゲン含有ゲルと下層
のホモ多糖類スポンジを含む組み合わせマトリックスで
あることが好ましい。コラーゲン含有ゲルはゲル化ブタ
皮膚が好ましく、ホモ多糖類はセルロースが好ましい。
モ多糖類スポンジ又は上層のコラーゲン含有ゲルと下層
のホモ多糖類スポンジを含む組み合わせマトリックスで
あることが好ましい。コラーゲン含有ゲルはゲル化ブタ
皮膚が好ましく、ホモ多糖類はセルロースが好ましい。
本発明に従って用いられる皮膚試料は、哺乳動物由来
のものが好ましく、ヒト由来のものが更に好ましい。
のものが好ましく、ヒト由来のものが更に好ましい。
更に、本発明は、未変性状態組織培養皮膚のための細
胞外支持マトリックスであって、上層のコラーゲン含有
ゲルと下層のホモ多糖類スポンジを含むマトリックスを
提供する。
胞外支持マトリックスであって、上層のコラーゲン含有
ゲルと下層のホモ多糖類スポンジを含むマトリックスを
提供する。
また更に、本発明は、皮膚毒性アッセイであって、
（ａ）皮膚培養条件下で、内側面及び外側面を有する皮
膚試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接さ
せ、外側面を培地表面より上に露出させることにより、
培地に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し、
（ｂ）皮膚試料を推定上の毒素と接触させ、（ｃ）毒素
の存在下で皮膚試料とマトリックスを所定時間維持し、
（ｄ）皮膚試料の生存度により毒素の皮膚毒性を評価す
る工程を含むアッセイを提供する。
（ａ）皮膚培養条件下で、内側面及び外側面を有する皮
膚試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接さ
せ、外側面を培地表面より上に露出させることにより、
培地に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し、
（ｂ）皮膚試料を推定上の毒素と接触させ、（ｃ）毒素
の存在下で皮膚試料とマトリックスを所定時間維持し、
（ｄ）皮膚試料の生存度により毒素の皮膚毒性を評価す
る工程を含むアッセイを提供する。
生存度は、生存又は死細胞に特異な指示薬の皮膚試料
細胞への取込みを測定することにより評価する。指示薬
は光学的検出が可能な染料が好ましく、蛍光染料が更に
好ましい。また、生存度は生存細胞に特異な第１染料と
死細胞に特異な第２染料を培地に加え、染料含有培地を
所定時間維持し、場合によっては皮膚試料を光学的に走
査して皮膚試料中の第１及び第２染料の分布を定量する
ことにより評価し、これにより毒性を評価する。
細胞への取込みを測定することにより評価する。指示薬
は光学的検出が可能な染料が好ましく、蛍光染料が更に
好ましい。また、生存度は生存細胞に特異な第１染料と
死細胞に特異な第２染料を培地に加え、染料含有培地を
所定時間維持し、場合によっては皮膚試料を光学的に走
査して皮膚試料中の第１及び第２染料の分布を定量する
ことにより評価し、これにより毒性を評価する。
好ましい実施態様においては、皮膚毒性アッセイは、
更に皮膚試料を推定上の毒素と接触させる前に皮膚試料
の生存度を評価し、推定上の毒素との接触前後の評価生
存度により毒素の毒性を比較することを含む。
更に皮膚試料を推定上の毒素と接触させる前に皮膚試料
の生存度を評価し、推定上の毒素との接触前後の評価生
存度により毒素の毒性を比較することを含む。
また、本発明は、毛髪成長アッセイであって、（ａ）
毛髪の成長が可能であり内側面及び外側面を有する皮膚
試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接させ、
外側面を培地表面より上に露出させることにより、培地
に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し、（ｂ）
毛髪成長状態の第１測定を行い、（ｃ）培地中で皮膚試
料とマトリックスを所定時間維持し、（ｄ）毛髪成長状
態の第２測定を行い、（ｅ）毛髪成長状態の第１及び第
２測定を比較することにより、毛髪成長を求めることを
含むアッセイを提供する。
毛髪の成長が可能であり内側面及び外側面を有する皮膚
試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接させ、
外側面を培地表面より上に露出させることにより、培地
に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し、（ｂ）
毛髪成長状態の第１測定を行い、（ｃ）培地中で皮膚試
料とマトリックスを所定時間維持し、（ｄ）毛髪成長状
態の第２測定を行い、（ｅ）毛髪成長状態の第１及び第
２測定を比較することにより、毛髪成長を求めることを
含むアッセイを提供する。
毛髪成長状態は、毛の長さのような毛の物理的寸法で
あることが好ましい。
あることが好ましい。
本発明の１つの利点は、皮膚の組織培養系を提供する
ことにより、皮膚の未変性状態の三次元構築が培養中維
持されることである。
ことにより、皮膚の未変性状態の三次元構築が培養中維
持されることである。
本発明のもう１つの利点は、推定上の毒素の皮膚に対
する作用を求める簡易で費用の掛からない信頼性のある
皮膚毒性アッセイを提供することである。このようなア
ッセイは、また推定上の毒素の影響を生体外で評価する
経済上効率のよい手段となり、このアッセイは生きてい
る動物を毒素に曝す必要がない。このアッセイは、皮膚
科学的研究及び試験において細胞生存度及び生化学応答
を研究するモデルとなるものである。
する作用を求める簡易で費用の掛からない信頼性のある
皮膚毒性アッセイを提供することである。このようなア
ッセイは、また推定上の毒素の影響を生体外で評価する
経済上効率のよい手段となり、このアッセイは生きてい
る動物を毒素に曝す必要がない。このアッセイは、皮膚
科学的研究及び試験において細胞生存度及び生化学応答
を研究するモデルとなるものである。
また、本発明のもう１つの利点は、毛髪成長を生体外
で評価し、組成物の毛髪成長についての作用を測定する
簡易で費用の掛からない信頼性のある手段を提供するこ
とである。
で評価し、組成物の毛髪成長についての作用を測定する
簡易で費用の掛からない信頼性のある手段を提供するこ
とである。
図面の簡単な説明 本開示の一部をなす図面において： 図１は、実施例１に記載されるように２日間組織培養
したマウス皮膚をBCECF−AM（生細胞−緑）及びPI（死
細胞−赤）で二重染色したものを示す着色顕微鏡写真で
ある。同焦点走査レーザー顕微鏡。倍率1000Xの立体画
像。
したマウス皮膚をBCECF−AM（生細胞−緑）及びPI（死
細胞−赤）で二重染色したものを示す着色顕微鏡写真で
ある。同焦点走査レーザー顕微鏡。倍率1000Xの立体画
像。
図２は、イーグルMEMで６日間組織培養し、［3H−チ
ミジンで３〜６日間標識したマウス皮膚を示す着色顕微
鏡写真である。実施例１に記載されるように皮膚を固定
し、オートラジオグラフィー用に処理し、ヘマトキシリ
ン及びエオジンで染色した。オートラジオグラムを明視
野及び偏光で観察した。［3H−チミジン標識核は鮮やか
な緑色に見える。倍率1000X。
ミジンで３〜６日間標識したマウス皮膚を示す着色顕微
鏡写真である。実施例１に記載されるように皮膚を固定
し、オートラジオグラフィー用に処理し、ヘマトキシリ
ン及びエオジンで染色した。オートラジオグラムを明視
野及び偏光で観察した。［3H−チミジン標識核は鮮やか
な緑色に見える。倍率1000X。
図３は、実施例２に記載されるように２日間組織培養
し、BCECF−AM（生細胞−緑）とPI（死細胞−赤）で二
重染色し、次いで、エタノールで処理したマウス皮膚の
毛嚢の生存度を示す着色顕微鏡写真である。左側の画像
はエタノール処理前の皮膚を示し、右側の画像は処理後
の皮膚を示す。上の画像は、0.5％（v/v）エタノール処
理した皮膚を示す。下の画像は、5.0％（v/v）エタノー
ル処理した皮膚を示す。同焦点走査レーザー顕微鏡。倍
率1000X。立体画像。
し、BCECF−AM（生細胞−緑）とPI（死細胞−赤）で二
重染色し、次いで、エタノールで処理したマウス皮膚の
毛嚢の生存度を示す着色顕微鏡写真である。左側の画像
はエタノール処理前の皮膚を示し、右側の画像は処理後
の皮膚を示す。上の画像は、0.5％（v/v）エタノール処
理した皮膚を示す。下の画像は、5.0％（v/v）エタノー
ル処理した皮膚を示す。同焦点走査レーザー顕微鏡。倍
率1000X。立体画像。
図４は、２日間組織培養したマウス皮膚の生存度に関
するエタノールの用量依存性毒性作用の図表である。毒
性は、実施例２に記載されるようにエタノール処理の５
分後BCECF−AMとヨウ化プロピジウム（PI）の相対呼吸
として評価し、エタノール濃度の関数として致死細胞％
として示される。
するエタノールの用量依存性毒性作用の図表である。毒
性は、実施例２に記載されるようにエタノール処理の５
分後BCECF−AMとヨウ化プロピジウム（PI）の相対呼吸
として評価し、エタノール濃度の関数として致死細胞％
として示される。
図５は、４日間組織培養したマウス皮膚の生存度に関
するドキソルビシンの用量依存性毒性作用の図表であ
る。毒性は、実施例２に記載されるようにドキソルビシ
ン処理の24時間後BCECF−AMとPI染色の相対吸収として
評価し、ドキソルビシン濃度の関数として致死細胞％と
して示される。
するドキソルビシンの用量依存性毒性作用の図表であ
る。毒性は、実施例２に記載されるようにドキソルビシ
ン処理の24時間後BCECF−AMとPI染色の相対吸収として
評価し、ドキソルビシン濃度の関数として致死細胞％と
して示される。
図６は、２日間組織培養したマウス皮膚における異種
細胞の生存度に関するドキソルビシンの用量依存性毒性
作用の図表である。毒性は、ドキソルビシン処理の24時
間後［3H］−チミジン取込みとして評価した。細胞増殖
％は、ドキソルビシン処理皮膚における標識細胞％の対
照非処理皮膚における標識細胞％に相対する％として算
出した。
細胞の生存度に関するドキソルビシンの用量依存性毒性
作用の図表である。毒性は、ドキソルビシン処理の24時
間後［3H］−チミジン取込みとして評価した。細胞増殖
％は、ドキソルビシン処理皮膚における標識細胞％の対
照非処理皮膚における標識細胞％に相対する％として算
出した。
図７は、組織培養マウス皮膚の生存度及びマウス皮膚
の生体内刺激に関する次亜塩素酸ナトリウムの用量依存
性毒性作用を示す。毒性は、実施例２に記載されるよう
に次亜塩素酸ナトリウム濃度の関数として致死細胞
（％）及び一次刺激指数（PII）の両方で評価される。
の生体内刺激に関する次亜塩素酸ナトリウムの用量依存
性毒性作用を示す。毒性は、実施例２に記載されるよう
に次亜塩素酸ナトリウム濃度の関数として致死細胞
（％）及び一次刺激指数（PII）の両方で評価される。
図８は、実施例３に記載されるように数種のマトリッ
クスを用いた組織培養マウス皮膚系における毛髪成長を
生体内皮膚における毛髪成長と比較する図表である。
クスを用いた組織培養マウス皮膚系における毛髪成長を
生体内皮膚における毛髪成長と比較する図表である。
発明の詳細な説明 A.未変性状態組織培養法 本発明の１態様は、内側面及び外側面を有する皮膚試
料の未変性状態組織培養法であって、内側面を細胞外支
持マトリックスに隣接させ、外側面を培地表面より上に
露出させることにより、培地に浸漬したマトリックス上
に該皮膚試料を置き、皮膚培養条件下でマトリックスと
その上の皮膚を維持することを含む方法に関する。
料の未変性状態組織培養法であって、内側面を細胞外支
持マトリックスに隣接させ、外側面を培地表面より上に
露出させることにより、培地に浸漬したマトリックス上
に該皮膚試料を置き、皮膚培養条件下でマトリックスと
その上の皮膚を維持することを含む方法に関する。
本アッセイにおいて、任意の動物から採取した任意の
皮膚を用いることが可能である。動物は哺乳動物である
ことが好ましい。哺乳動物の例は、マウス、ラット、モ
ルモット、ハムスター、ウサギ、キヌザル、サル及びヒ
トである。特に好ましい動物は、ヒトである。
皮膚を用いることが可能である。動物は哺乳動物である
ことが好ましい。哺乳動物の例は、マウス、ラット、モ
ルモット、ハムスター、ウサギ、キヌザル、サル及びヒ
トである。特に好ましい動物は、ヒトである。
真皮層及び表皮層を有する皮膚試料は、典型的には動
物から切り取られる。余分な脂肪がある場合には取り除
かれる。皮膚試料は、皮膚が毛髪の成長を支持すること
ができる有毛動物又は皮膚に毛髪がない無毛動物、例え
ば無胸腺ヌードアニマルから切り取られる。皮膚試料を
有毛動物から得る場合、皮膚は切採前に毛が剃られるか
又は刈り込まれる。
物から切り取られる。余分な脂肪がある場合には取り除
かれる。皮膚試料は、皮膚が毛髪の成長を支持すること
ができる有毛動物又は皮膚に毛髪がない無毛動物、例え
ば無胸腺ヌードアニマルから切り取られる。皮膚試料を
有毛動物から得る場合、皮膚は切採前に毛が剃られるか
又は刈り込まれる。
皮膚試料は、本明細書において内側面及び外側面を有
するものと定義される。
するものと定義される。
“内側面”とは、真皮方向面、即ち、動物において未
変性状態にある皮膚の非露出面を意味する。“外側面”
とは、表皮方向面、即ち、動物において未変性状態にあ
る皮膚の露出面を意味する。
変性状態にある皮膚の非露出面を意味する。“外側面”
とは、表皮方向面、即ち、動物において未変性状態にあ
る皮膚の露出面を意味する。
本発明で用いられる皮膚片の表面積に関して制限は全
くない。典型的には、皮膚試料は外表面積約１〜約10,0
00平方ミリメートル（mm2）の範囲とすることができ
る。好ましい表面積は、約４〜約100mm2である。更に好
ましい表面積は約10mm2である。皮膚の厚さは、得られ
る動物によって変化する。皮膚試料がマウスから切り取
られる場合、好ましい厚さは約１〜2mmである。
くない。典型的には、皮膚試料は外表面積約１〜約10,0
00平方ミリメートル（mm2）の範囲とすることができ
る。好ましい表面積は、約４〜約100mm2である。更に好
ましい表面積は約10mm2である。皮膚の厚さは、得られ
る動物によって変化する。皮膚試料がマウスから切り取
られる場合、好ましい厚さは約１〜2mmである。
皮膚試料は支持マトリックス上で培養される。本発明
の支持マトリックスは、培地から未変性状態にある皮膚
の内面（底部）に栄養水溶液を送達する毛細管現象に適
した間隙を有する柱状構造を与える。即ち、この能力が
ある任意の支持体が予想され、ナイロン、ボロケイ酸塩
ガラス繊維もしくはポリプロピレンのような合成メッシ
ュ又はセルロースもしくはコラーゲンのような有機メッ
シュが挙げられる。支持マトリックスは細胞外支持マト
リックスであることが好ましい。本発明で用いられる
“細胞外支持マトリックス”とは、ゲル又はスポンジの
ような固形物を意味し、１種以上の有機分子又は分子集
合体を含み、その分子又は集合体は細胞によって細胞外
領域に産生及び分泌されるものであり、三次元組織構成
及び機能を維持する支持、接着及び骨格として生体内で
作用する。そのような分子の例は、コラーゲン、ラミニ
ン、フィブロネクチン等の高分子量タンク質及び糖タン
パク質、複合多糖類及び類似の分子である。
の支持マトリックスは、培地から未変性状態にある皮膚
の内面（底部）に栄養水溶液を送達する毛細管現象に適
した間隙を有する柱状構造を与える。即ち、この能力が
ある任意の支持体が予想され、ナイロン、ボロケイ酸塩
ガラス繊維もしくはポリプロピレンのような合成メッシ
ュ又はセルロースもしくはコラーゲンのような有機メッ
シュが挙げられる。支持マトリックスは細胞外支持マト
リックスであることが好ましい。本発明で用いられる
“細胞外支持マトリックス”とは、ゲル又はスポンジの
ような固形物を意味し、１種以上の有機分子又は分子集
合体を含み、その分子又は集合体は細胞によって細胞外
領域に産生及び分泌されるものであり、三次元組織構成
及び機能を維持する支持、接着及び骨格として生体内で
作用する。そのような分子の例は、コラーゲン、ラミニ
ン、フィブロネクチン等の高分子量タンク質及び糖タン
パク質、複合多糖類及び類似の分子である。
好ましい実施態様においては、細胞外支持マトリック
スはコラーゲン含有ゲルである。コラーゲン含有ゲルの
例は、ゲル化ブタ皮膚、例えばGELFOAMTM（Upjoh Coman
y,Kalamazoo,MI）及びラミニン、コラーゲン、プロテオ
グリカン及びエンタクチンを含む組成物、例えばMATRIG
ELTM（Collaborative Research,Inc.,Bedford,MA）であ
る。GELFOAMTMは、米国特許第2,465,357号に記載されて
いる特許された生産物であり、この開示を本明細書に参
考として引用する。
スはコラーゲン含有ゲルである。コラーゲン含有ゲルの
例は、ゲル化ブタ皮膚、例えばGELFOAMTM（Upjoh Coman
y,Kalamazoo,MI）及びラミニン、コラーゲン、プロテオ
グリカン及びエンタクチンを含む組成物、例えばMATRIG
ELTM（Collaborative Research,Inc.,Bedford,MA）であ
る。GELFOAMTMは、米国特許第2,465,357号に記載されて
いる特許された生産物であり、この開示を本明細書に参
考として引用する。
もう１つの好ましい実施態様においては、細胞外支持
マトリックスはホモ多糖類スポンジである。Leighton,
J.,J.Nat′l Cancer Instit.,12:545−561（1951）。好
ましいホモ多糖類はセルロースである。本発明で企図さ
れるホモ多糖類スポンジは、ウェーブやネットサイズに
関して制限されない。
マトリックスはホモ多糖類スポンジである。Leighton,
J.,J.Nat′l Cancer Instit.,12:545−561（1951）。好
ましいホモ多糖類はセルロースである。本発明で企図さ
れるホモ多糖類スポンジは、ウェーブやネットサイズに
関して制限されない。
またもう１つの好ましい実施態様においては、細胞外
支持マトリックスは、コラーゲン含有ゲルとホモ多糖類
スポンジの組み合わせを含む。そのような組み合わせ
は、上層のコラーゲン含有ゲルと下層のホモ多糖類スポ
ンジを含むことが好ましい。コラーゲン含有ゲルはゲル
化ブタ皮膚が好ましく、ホモ多糖類スポンジはセルロー
スが好ましい。特に好ましい実施態様においては、支持
マトリックスは上層のGELFOAMTMと下層のセルロースス
ポンジの組み合わせを含み、そのマトリックスは組織培
養された皮膚の正常な毛髪成長を維持するのに最も有効
であることを示した（実施例３参照）。
支持マトリックスは、コラーゲン含有ゲルとホモ多糖類
スポンジの組み合わせを含む。そのような組み合わせ
は、上層のコラーゲン含有ゲルと下層のホモ多糖類スポ
ンジを含むことが好ましい。コラーゲン含有ゲルはゲル
化ブタ皮膚が好ましく、ホモ多糖類スポンジはセルロー
スが好ましい。特に好ましい実施態様においては、支持
マトリックスは上層のGELFOAMTMと下層のセルロースス
ポンジの組み合わせを含み、そのマトリックスは組織培
養された皮膚の正常な毛髪成長を維持するのに最も有効
であることを示した（実施例３参照）。
皮膚試料サイズの細胞外支持マトリックスサイズに対
する比率は設定しない。マトリックスは、皮膚試料より
サイズが大きく実質的に皮膚試料と重なるように支持す
るのに十分な直径から任意とすることができる。皮膚試
料が実際に相接しない限り、複数の試料を同一マトリッ
クス上に置くことができる。皮膚試料間の好ましい距離
は約１〜2mmである。
する比率は設定しない。マトリックスは、皮膚試料より
サイズが大きく実質的に皮膚試料と重なるように支持す
るのに十分な直径から任意とすることができる。皮膚試
料が実際に相接しない限り、複数の試料を同一マトリッ
クス上に置くことができる。皮膚試料間の好ましい距離
は約１〜2mmである。
皮膚試料は、皮膚の内側面がマトリックスと隣接し、
皮膚の外側面がマトリックスから離れて面するようにマ
トリックス上に置かれる。好ましい実施態様において
は、皮膚の内側面がマトリックスと接触した状態にあ
る。この配置において、皮膚の外側面は、本方法により
皮膚についての作用を評価する毒素又は他の組成物と接
触させるのに有効である。
皮膚の外側面がマトリックスから離れて面するようにマ
トリックス上に置かれる。好ましい実施態様において
は、皮膚の内側面がマトリックスと接触した状態にあ
る。この配置において、皮膚の外側面は、本方法により
皮膚についての作用を評価する毒素又は他の組成物と接
触させるのに有効である。
マトリックスとその上の皮膚試料は、マトリックスと
接触するが皮膚を完全に覆わない培地量で浸漬される。
即ち、皮膚の外側面は浸水されず、培地の表面より上に
露出する。培地の表面はマトリックスの上面より0.5〜2
mm内側にあり、ウィッキング効果により皮膚試料と液が
接触する。例えば、皮膚試料が約１〜2mmの厚さを有す
る場合、培地の表面は皮膚の外側面より約0.5〜約2mm下
にあることが好ましい。
接触するが皮膚を完全に覆わない培地量で浸漬される。
即ち、皮膚の外側面は浸水されず、培地の表面より上に
露出する。培地の表面はマトリックスの上面より0.5〜2
mm内側にあり、ウィッキング効果により皮膚試料と液が
接触する。例えば、皮膚試料が約１〜2mmの厚さを有す
る場合、培地の表面は皮膚の外側面より約0.5〜約2mm下
にあることが好ましい。
細胞外支持マトリックスは典型的には軟質であり、そ
の上に皮膚試料を置く際にマトリックスの縁が皮膚試料
の垂直縁に接触することができるようにへこませてもよ
い。
の上に皮膚試料を置く際にマトリックスの縁が皮膚試料
の垂直縁に接触することができるようにへこませてもよ
い。
細胞外支持マトリックスを、その上に皮膚試料を置く
前にマトリックスを培地で平衡化するために前処理す
る。マトリックスの前処理は、マトリックスを所定のサ
イズに切断し、カットマトリックスを無菌容器内の培地
にマトリックスを培地で飽和し平衡化するのに十分な時
間浸漬することを含む。好ましい浸漬時間は37℃で４時
間である。
前にマトリックスを培地で平衡化するために前処理す
る。マトリックスの前処理は、マトリックスを所定のサ
イズに切断し、カットマトリックスを無菌容器内の培地
にマトリックスを培地で飽和し平衡化するのに十分な時
間浸漬することを含む。好ましい浸漬時間は37℃で４時
間である。
本発明で企図される培地は、皮膚試料の生存度を促進
及び維持するように計画された水性栄養培地である。好
ましい培地は、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）と抗生
物質で補足されたイーグル最小必須培地（MEM）であ
る。抗生物質の例は、ゲンタマイシン、ストレプトマイ
シン、ペニシリン、カノマイシン等である。好ましい抗
生物質はゲンタマイシンである。培地中の抗生物質の最
終濃度は、用いられる具体的な抗生物質に左右される。
抗生物質がゲンタマイシンの場合、好ましい濃度は培地
1mlにつき約0.2mgである。他の培地、好ましくはウシ胎
児血清の使用を含むか又は当該技術で周知の血清を含ま
ない特定培地を用いたものを使用することもできる。
及び維持するように計画された水性栄養培地である。好
ましい培地は、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）と抗生
物質で補足されたイーグル最小必須培地（MEM）であ
る。抗生物質の例は、ゲンタマイシン、ストレプトマイ
シン、ペニシリン、カノマイシン等である。好ましい抗
生物質はゲンタマイシンである。培地中の抗生物質の最
終濃度は、用いられる具体的な抗生物質に左右される。
抗生物質がゲンタマイシンの場合、好ましい濃度は培地
1mlにつき約0.2mgである。他の培地、好ましくはウシ胎
児血清の使用を含むか又は当該技術で周知の血清を含ま
ない特定培地を用いたものを使用することもできる。
マトリックスとその上の皮膚試料は、無期限に培地中
で維持される。培地は２〜３日毎に変えることが好まし
い。
で維持される。培地は２〜３日毎に変えることが好まし
い。
本発明の皮膚組織培養系の１つの利点は、簡易で費用
の掛からない生体外モデルを提供することであり、それ
により皮膚の未変性状態三次元構造が長時間維持され
る。従来の皮膚培養系では、皮膚の生存度をせいぜい１
又は２日間維持しただけであった。Kao等,Toxicology a
nd Applied Pharmacology,81:502−516（1985）。
の掛からない生体外モデルを提供することであり、それ
により皮膚の未変性状態三次元構造が長時間維持され
る。従来の皮膚培養系では、皮膚の生存度をせいぜい１
又は２日間維持しただけであった。Kao等,Toxicology a
nd Applied Pharmacology,81:502−516（1985）。
本発明のもう１つの態様は、かかる系に有効な細胞外
支持マトリックスである。１実施態様においては、細胞
外支持マトリックスがコラーゲン含有ゲル、例えばGELF
OAMTM又はMATRIGELTMを含む。もう１つの実施態様にお
いては、細胞外支持マトリックスがホモ多糖類スポン
ジ、例えばセルローススポンジを含む。好ましい実施態
様においては、細胞外支持マトリックスが上層のコラー
ゲン含有ゲル及び下層のホモ多糖類スポンジを含む組み
合わせマトリックスである。上層のGELFOAMTMと下層の
セルローススポンジを含む組み合わせマトリックスが最
も好ましい。かかるマトリックスは、組織培養マウス皮
膚において正常な毛髪成長を支持するのに優れた性状を
有する（実施例３参照）。
支持マトリックスである。１実施態様においては、細胞
外支持マトリックスがコラーゲン含有ゲル、例えばGELF
OAMTM又はMATRIGELTMを含む。もう１つの実施態様にお
いては、細胞外支持マトリックスがホモ多糖類スポン
ジ、例えばセルローススポンジを含む。好ましい実施態
様においては、細胞外支持マトリックスが上層のコラー
ゲン含有ゲル及び下層のホモ多糖類スポンジを含む組み
合わせマトリックスである。上層のGELFOAMTMと下層の
セルローススポンジを含む組み合わせマトリックスが最
も好ましい。かかるマトリックスは、組織培養マウス皮
膚において正常な毛髪成長を支持するのに優れた性状を
有する（実施例３参照）。
B.皮膚毒性アッセイ 本発明のもう１つの態様は、皮膚毒性アッセイであっ
て、（ａ）皮膚培養条件下、内側面及び外側面を有する
皮膚試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接さ
せ、外側面を培地表面より上に露出させることにより、
培地に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し、
（ｂ）皮膚試料を推定上の毒素と接触させ、（ｃ）毒素
の存在下で皮膚試料とマトリックスを所定時間維持し、
（ｄ）皮膚試料の生存度により毒素の皮膚毒性を評価す
る工程を含むアッセイに関する。
て、（ａ）皮膚培養条件下、内側面及び外側面を有する
皮膚試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接さ
せ、外側面を培地表面より上に露出させることにより、
培地に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し、
（ｂ）皮膚試料を推定上の毒素と接触させ、（ｃ）毒素
の存在下で皮膚試料とマトリックスを所定時間維持し、
（ｄ）皮膚試料の生存度により毒素の皮膚毒性を評価す
る工程を含むアッセイに関する。
毒性アッセイに用いられる皮膚試料は、毛髪のないこ
とが好ましい。無毛皮膚の好ましい試料は、無胸腺ヌー
ドアニマルのような無毛動物である。ヌードアニマルの
例は、Balb/Cヌードマウス由来の非近交系ヌードマウス
株である。
とが好ましい。無毛皮膚の好ましい試料は、無胸腺ヌー
ドアニマルのような無毛動物である。ヌードアニマルの
例は、Balb/Cヌードマウス由来の非近交系ヌードマウス
株である。
皮膚毒性アッセイの場合の細胞外支持マトリックス、
培地及び培養条件は、未変性組織培養法について上述し
たものと同一である。
培地及び培養条件は、未変性組織培養法について上述し
たものと同一である。
１実施態様においては、生存度が生存細胞に特異な指
示薬の皮膚試料の細胞への取り込みを測定することによ
り評価される。本明細書で用いられる“生存細胞に特異
な”とは、指示薬が生きていて死んでいない細胞に吸収
あるいは取り込まれることを意味する。
示薬の皮膚試料の細胞への取り込みを測定することによ
り評価される。本明細書で用いられる“生存細胞に特異
な”とは、指示薬が生きていて死んでいない細胞に吸収
あるいは取り込まれることを意味する。
生存細胞に特異な指示薬は、生細胞に接近する代謝前
駆体又は非代謝物質とすることができる。代謝前駆体の
例は、リボ又はデオキシリボ核酸前駆体、例えばプリ
ン、ピリミジン、ヌクレオシド及びヌクレオチドであ
る。検出を容易にするために、代謝前駆体を指示手段に
操作的に結合することが好ましい。代謝前駆体指示薬と
して好ましい指示手段は、放射能標識、例えば35S、
32P、125I、3H等である。特に好ましい放射能標識代謝
前駆体指示薬は3H−チミジンである。
駆体又は非代謝物質とすることができる。代謝前駆体の
例は、リボ又はデオキシリボ核酸前駆体、例えばプリ
ン、ピリミジン、ヌクレオシド及びヌクレオチドであ
る。検出を容易にするために、代謝前駆体を指示手段に
操作的に結合することが好ましい。代謝前駆体指示薬と
して好ましい指示手段は、放射能標識、例えば35S、
32P、125I、3H等である。特に好ましい放射能標識代謝
前駆体指示薬は3H−チミジンである。
生存細胞に特異な好ましい非代謝指示薬は、光学的検
出が可能な染料である。生存細胞に特異的である当該技
術において確認されている任意の染料は、本発明の皮膚
毒性アッセイに従って用いることができる。例えば、Ha
ndbook of Fluorescent Probes and Research Chemical
s,ed.R.P.Haugland,Molecular Probes,publisher,Eugen
e,Oregon（1989−1991）参照。
出が可能な染料である。生存細胞に特異的である当該技
術において確認されている任意の染料は、本発明の皮膚
毒性アッセイに従って用いることができる。例えば、Ha
ndbook of Fluorescent Probes and Research Chemical
s,ed.R.P.Haugland,Molecular Probes,publisher,Eugen
e,Oregon（1989−1991）参照。
好ましい実施態様においては、染料が蛍光染料であ
る。生存細胞特異的蛍光染料はBCECF−AM（Ｂ−115
0）、カルセイン−AM（Ｃ−1430）、CFDA（カルボキシ
フルオレセインジアセテート;C−195）アクリジンオレ
ンジ（Ａ−1301）、カルセインブルー（Ｈ−1426）、フ
ラ−2AM（Ｆ−1201）、フルオレセインジアセテート
（Ｆ−1303）又はカルボキシ類縁体（Ｃ−1431）等であ
る。このような染料は当該技術において周知であり、市
販されている（Molecular Probes,Eugene（OR）。染料B
CECF−AM又はカルセイン−AMが特に好ましい。括弧内の
数字はMolecular Probesから入手できる蛍光染料リスト
の製品番号を示す。
る。生存細胞特異的蛍光染料はBCECF−AM（Ｂ−115
0）、カルセイン−AM（Ｃ−1430）、CFDA（カルボキシ
フルオレセインジアセテート;C−195）アクリジンオレ
ンジ（Ａ−1301）、カルセインブルー（Ｈ−1426）、フ
ラ−2AM（Ｆ−1201）、フルオレセインジアセテート
（Ｆ−1303）又はカルボキシ類縁体（Ｃ−1431）等であ
る。このような染料は当該技術において周知であり、市
販されている（Molecular Probes,Eugene（OR）。染料B
CECF−AM又はカルセイン−AMが特に好ましい。括弧内の
数字はMolecular Probesから入手できる蛍光染料リスト
の製品番号を示す。
１実施態様においては、生存細胞に特異な蛍光染料の
取込みあるいは吸収が生存細胞の代謝活性に左右され
る。本実施態様によれば、非蛍光染料は生存細胞によっ
て吸収され、エステラーゼのような細胞内酵素によって
蛍光産物に転換される。細胞内蛍光の存在は生存度を示
す。
取込みあるいは吸収が生存細胞の代謝活性に左右され
る。本実施態様によれば、非蛍光染料は生存細胞によっ
て吸収され、エステラーゼのような細胞内酵素によって
蛍光産物に転換される。細胞内蛍光の存在は生存度を示
す。
もう１つの実施態様においては、死細胞に特異な指示
薬の皮膚試料の細胞への吸収あるいは取込みを測定する
ことにより、生存度が評価される。本明細書に用いられ
る“死細胞に特異な”とは、指示薬が非生存死細胞にの
み吸収あるいは取込まれることを意味する。
薬の皮膚試料の細胞への吸収あるいは取込みを測定する
ことにより、生存度が評価される。本明細書に用いられ
る“死細胞に特異な”とは、指示薬が非生存死細胞にの
み吸収あるいは取込まれることを意味する。
典型的には、死細胞に特異な染料は、染料が無傷な細
胞膜を浸透することができないような高イオン電荷及び
低透過性を有する化合物である。細胞が死ぬと、死細胞
に特異な染料が核膜のような細胞内成分に結合する細胞
内領域に接近するように、膜が構造上又は機能上破壊さ
れる。
胞膜を浸透することができないような高イオン電荷及び
低透過性を有する化合物である。細胞が死ぬと、死細胞
に特異な染料が核膜のような細胞内成分に結合する細胞
内領域に接近するように、膜が構造上又は機能上破壊さ
れる。
好ましい死細胞特異的指示薬は、光学的検出が可能な
染料である。好ましい死細胞特異的染料は、ヨウ化プロ
ピジウム、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体
［（5,5′−ジアザデカメチレン）ビス（3,8−ジアミノ
−６−フェニル−フェナントリジウム）ジクロリド、２
塩酸塩］等の蛍光染料である。ヨウ化プロピジウムが最
も好ましい。ヨウ化プロピジウム（PI）及び死細胞に特
異な他の染料は、当該技術において周知であり市販され
ている（Molecular Probes,Eugene,OR）。
染料である。好ましい死細胞特異的染料は、ヨウ化プロ
ピジウム、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体
［（5,5′−ジアザデカメチレン）ビス（3,8−ジアミノ
−６−フェニル−フェナントリジウム）ジクロリド、２
塩酸塩］等の蛍光染料である。ヨウ化プロピジウムが最
も好ましい。ヨウ化プロピジウム（PI）及び死細胞に特
異な他の染料は、当該技術において周知であり市販され
ている（Molecular Probes,Eugene,OR）。
またもう１つの好ましい実施態様においては、生存細
胞に特異な指示薬と死細胞に特異な指示薬の双方の吸収
あるいは取込みを同時に測定することにより生存度の評
価が行われる。生存度は生存細胞の死細胞に対する比率
として評価される。生存細胞に特異な指示薬と死細胞に
特異な指示薬の双方が蛍光染料である場合、かかる染料
は生存細胞と死細胞の間の区別を容易にするように異な
った発光スペクトルを有するべきである。生存細胞と死
細胞に特異な指示薬の識別吸収による細胞生存度を定量
する組成物及び方法及び組織培養試料は当該技術におい
て周知である。上記Haughland。
胞に特異な指示薬と死細胞に特異な指示薬の双方の吸収
あるいは取込みを同時に測定することにより生存度の評
価が行われる。生存度は生存細胞の死細胞に対する比率
として評価される。生存細胞に特異な指示薬と死細胞に
特異な指示薬の双方が蛍光染料である場合、かかる染料
は生存細胞と死細胞の間の区別を容易にするように異な
った発光スペクトルを有するべきである。生存細胞と死
細胞に特異な指示薬の識別吸収による細胞生存度を定量
する組成物及び方法及び組織培養試料は当該技術におい
て周知である。上記Haughland。
好ましい実施態様においては、皮膚毒性アッセイが、
更に皮膚試料を推定上の毒素と接触する前に皮膚試料の
生存度を評価し、推定上の毒素と接触する前後の評価生
存度を比較することにより毒素の毒性を求めることを含
むものである。
更に皮膚試料を推定上の毒素と接触する前に皮膚試料の
生存度を評価し、推定上の毒素と接触する前後の評価生
存度を比較することにより毒素の毒性を求めることを含
むものである。
生存細胞に特異な指示薬の吸収あるいは取込みを検出
する手段は、用いられる具体的な指示薬に左右され、当
業者に周知である。放射能標識代謝前駆体の検出に好ま
しい手段は、前駆体を吸収した皮膚試料の組織学的切片
のオートラジオグラフィーである。
する手段は、用いられる具体的な指示薬に左右され、当
業者に周知である。放射能標識代謝前駆体の検出に好ま
しい手段は、前駆体を吸収した皮膚試料の組織学的切片
のオートラジオグラフィーである。
染料の検出に好ましい手段は顕微鏡試験である。顕微
鏡試験は、三次元未変性皮膚組織培養中の種々の場所に
おいて皮膚試料の特異細胞への指示薬取込みを選択的且
つ再現性ある評価をすることができる任意の顕微鏡の使
用を含むことができる。
鏡試験は、三次元未変性皮膚組織培養中の種々の場所に
おいて皮膚試料の特異細胞への指示薬取込みを選択的且
つ再現性ある評価をすることができる任意の顕微鏡の使
用を含むことができる。
典型的には、顕微鏡試験は光学的切片法の能力を必要
とする。光学的切片法は、皮膚内のミクロソーム、気
泡、脂肪球及び光の反射及び光学的妨害を与える他の組
織成分の存在による光学的妨害なしに皮膚の三次元構造
内の所定の厚みを見ることができる方法である。
とする。光学的切片法は、皮膚内のミクロソーム、気
泡、脂肪球及び光の反射及び光学的妨害を与える他の組
織成分の存在による光学的妨害なしに皮膚の三次元構造
内の所定の厚みを見ることができる方法である。
更に、光学的切片法は三次元皮膚組織培養内の種々の
面を見ることができる。皮膚の連続層を連続的に切り取
ることにより、皮膚の全様相あるいは問題の具体的な種
類の細胞が位置する皮膚領域の様相を作製することがで
きる。即ち、皮膚の多数の厚み又は領域の比較研究をす
ることができる。このようにして、表面細胞、真皮層底
部の細胞、表皮層内部の細胞又は他の特定の種類の細
胞、例えば神経細胞、油分泌細胞、毛嚢細胞の生存度を
評価することができる。
面を見ることができる。皮膚の連続層を連続的に切り取
ることにより、皮膚の全様相あるいは問題の具体的な種
類の細胞が位置する皮膚領域の様相を作製することがで
きる。即ち、皮膚の多数の厚み又は領域の比較研究をす
ることができる。このようにして、表面細胞、真皮層底
部の細胞、表皮層内部の細胞又は他の特定の種類の細
胞、例えば神経細胞、油分泌細胞、毛嚢細胞の生存度を
評価することができる。
光学的切片の厚さは、観察されるべき細胞サイズ又は
組織を調節するために変動させることができ、約0.1〜1
000ミクロンの範囲とすることができる。好ましい切片
は0.5〜10ミクロンの範囲にあり、約２〜６ミクロンが
好ましい。
組織を調節するために変動させることができ、約0.1〜1
000ミクロンの範囲とすることができる。好ましい切片
は0.5〜10ミクロンの範囲にあり、約２〜６ミクロンが
好ましい。
光学的切片法を行うことができる好ましい顕微鏡は、
10×PlanApo式対物鏡を用いたNikon Optiphotに取り付
けたMRC−600 CONFOCAL IMAGING SYSTEM（Bio−Rad,Ric
hmond,Ca.）のような同焦点走査レーザー顕微鏡であ
る。かかる同焦点走査顕微鏡を用いて皮膚毒性を研究す
ることに成功した（実施例１及び２参照）。組織試料面
の他の有効な光学的走査又は切片法も本発明により企図
される。
10×PlanApo式対物鏡を用いたNikon Optiphotに取り付
けたMRC−600 CONFOCAL IMAGING SYSTEM（Bio−Rad,Ric
hmond,Ca.）のような同焦点走査レーザー顕微鏡であ
る。かかる同焦点走査顕微鏡を用いて皮膚毒性を研究す
ることに成功した（実施例１及び２参照）。組織試料面
の他の有効な光学的走査又は切片法も本発明により企図
される。
皮膚内の任意の特定場所の生存度は、生存細胞及び死
細胞に各々特異な指示薬の吸収に基づいて生存細胞又は
死細胞の全細胞に対する比率又は生細胞の死細胞に対す
る比率として評価される。生存度を推定上の毒素との接
触前後の両方で評価する場合、推定上の毒素との接触前
後に評価される生細胞の死細胞に対する比率を比較する
と推定上の毒素の毒性が示される。
細胞に各々特異な指示薬の吸収に基づいて生存細胞又は
死細胞の全細胞に対する比率又は生細胞の死細胞に対す
る比率として評価される。生存度を推定上の毒素との接
触前後の両方で評価する場合、推定上の毒素との接触前
後に評価される生細胞の死細胞に対する比率を比較する
と推定上の毒素の毒性が示される。
指示薬を皮膚培養に適用する方法は、用いられる具体
的な指示薬により異なる。典型的には、皮膚試料を培地
に置いた約６時間後に、好ましくは24時間後に、指示薬
が培地に加えられる。指示薬を培地に加えた後、培養条
件下で皮膚試料の細胞に指示薬が入り標識するのに十分
な時間培養を維持する。指示薬の存在下で約５分から約
２時間培養を維持することが好ましく、約10〜20分が更
に好ましい。
的な指示薬により異なる。典型的には、皮膚試料を培地
に置いた約６時間後に、好ましくは24時間後に、指示薬
が培地に加えられる。指示薬を培地に加えた後、培養条
件下で皮膚試料の細胞に指示薬が入り標識するのに十分
な時間培養を維持する。指示薬の存在下で約５分から約
２時間培養を維持することが好ましく、約10〜20分が更
に好ましい。
培地に添加する指示薬の濃度は、用いられる具体的な
指示薬により異なる。蛍光染料PI及びBCECF−AMを使用
する場合、染料濃度は各々約１〜約100ミクロモルであ
り、約２〜50ミクロモルが好ましく、約５ミクロモルが
更に好ましい。
指示薬により異なる。蛍光染料PI及びBCECF−AMを使用
する場合、染料濃度は各々約１〜約100ミクロモルであ
り、約２〜50ミクロモルが好ましく、約５ミクロモルが
更に好ましい。
典型的には、毒素を培地に直接加えることにより皮膚
試料を推定上の毒素と接触させる。また、毒素を皮膚試
料の表面に直接加えるる。毒素を添加した後、皮膚試料
は毒素含有培地中で所定時間維持され、その時間は実験
する具体的な毒素により異なる。
試料を推定上の毒素と接触させる。また、毒素を皮膚試
料の表面に直接加えるる。毒素を添加した後、皮膚試料
は毒素含有培地中で所定時間維持され、その時間は実験
する具体的な毒素により異なる。
本発明の皮膚毒性アッセイは、現在用いうる毒性試験
法より有効で有益である。１つの主な利点は、生きてい
る動物を毒性物質に曝すことがない信頼性のある生体外
アッセイの提供に関する。即ち、本アッセイは、Draize
試験のような皮膚毒性試験の伝統的な形態を置き換える
ために用いることができる。
法より有効で有益である。１つの主な利点は、生きてい
る動物を毒性物質に曝すことがない信頼性のある生体外
アッセイの提供に関する。即ち、本アッセイは、Draize
試験のような皮膚毒性試験の伝統的な形態を置き換える
ために用いることができる。
C.毛髪成長アッセイ またもう１つの態様においては、本発明は毛髪成長ア
ッセイであって、内側面と外側面を有する皮膚試料を、
内側面を細胞外支持マトリックスに隣接させ、外側面を
培地表面より上に露出させることにより、培地に浸漬し
たマトリックス上に該皮膚試料を置き、皮膚培養条件下
で、マトリックスとその上の皮膚を培地中で維持し、皮
膚における毛髪の成長を評価することを含むアッセイに
関する。
ッセイであって、内側面と外側面を有する皮膚試料を、
内側面を細胞外支持マトリックスに隣接させ、外側面を
培地表面より上に露出させることにより、培地に浸漬し
たマトリックス上に該皮膚試料を置き、皮膚培養条件下
で、マトリックスとその上の皮膚を培地中で維持し、皮
膚における毛髪の成長を評価することを含むアッセイに
関する。
毛髪成長アッセイの場合、皮膚試料を有毛動物から入
手するので、皮膚試料は毛細胞を含み、毛幹を囲む皮膚
に典型的に見られる毛嚢、毛幹等を含む毛髪成長を支持
する組織成分の正常な補足を含んでいる。皮膚試料は複
数の毛幹を含むことが好ましい。特に好ましい動物は乳
児動物である。好ましい実施態様においては、背、頚又
は頭皮から切り取られるが毛髪成長を支持する任意の皮
膚が用いられる。動物から切り取られる前に、皮膚試料
は毛を剃られるか又は刈り込まれる。皮膚から毛嚢を取
り除かず、毛嚢から毛幹の基底部を取り除かない限り、
他の毛髪の除去方法を用いることができる。
手するので、皮膚試料は毛細胞を含み、毛幹を囲む皮膚
に典型的に見られる毛嚢、毛幹等を含む毛髪成長を支持
する組織成分の正常な補足を含んでいる。皮膚試料は複
数の毛幹を含むことが好ましい。特に好ましい動物は乳
児動物である。好ましい実施態様においては、背、頚又
は頭皮から切り取られるが毛髪成長を支持する任意の皮
膚が用いられる。動物から切り取られる前に、皮膚試料
は毛を剃られるか又は刈り込まれる。皮膚から毛嚢を取
り除かず、毛嚢から毛幹の基底部を取り除かない限り、
他の毛髪の除去方法を用いることができる。
細胞外支持マトリックスの種類、培地の組成及び培養
条件は、組織培養系及び皮膚毒性アッセイに関して上記
で定義したものと実質的に同一である。
条件は、組織培養系及び皮膚毒性アッセイに関して上記
で定義したものと実質的に同一である。
毛髪成長アッセイは、（ａ）有毛動物から得られ内側
面と外側面を有する皮膚試料を、内側面を細胞外支持マ
トリックスに隣接させ、外側面を培地表面より上に露出
させることにより、培地に浸漬した細胞外支持マトリッ
クス上で培養し、（ｂ）毛髪成長状態の第１測定を行
い、（ｃ）培地中の皮膚試料とマトリックスを所定時間
維持し、（ｄ）毛髪成長状態の第２測定を行い、（ｅ）
毛髪成長状態の第１及び第２測定を比較することによ
り、毛髪の成長を求める工程を含む。
面と外側面を有する皮膚試料を、内側面を細胞外支持マ
トリックスに隣接させ、外側面を培地表面より上に露出
させることにより、培地に浸漬した細胞外支持マトリッ
クス上で培養し、（ｂ）毛髪成長状態の第１測定を行
い、（ｃ）培地中の皮膚試料とマトリックスを所定時間
維持し、（ｄ）毛髪成長状態の第２測定を行い、（ｅ）
毛髪成長状態の第１及び第２測定を比較することによ
り、毛髪の成長を求める工程を含む。
本明細書で用いられる“毛髪成長状態”とは、毛髪成
長を表す任意のパラメーターを意味する。かかるパラメ
ーターは毛の物理的寸法であることが好ましく、毛の長
さ又は直径であることが更に好ましい。毛髪成長状態を
測定する手段は、実験される具体的なパラメーターに左
右される。パラメーターが毛の長さである場合、長さは
組織培養皮膚試料のその場で求められる。パラメーター
が毛の直径である場合、毛幹の顕微鏡拡大を用いるその
場で又は組織学的に切り取った毛幹の顕微鏡写真を用い
る生体外で直径が求められる。毛髪成長を評価するアッ
セイは、当該技術で周知である。Fraiter等,J.Invest.D
ermatol.,61:72−81（1973）。
長を表す任意のパラメーターを意味する。かかるパラメ
ーターは毛の物理的寸法であることが好ましく、毛の長
さ又は直径であることが更に好ましい。毛髪成長状態を
測定する手段は、実験される具体的なパラメーターに左
右される。パラメーターが毛の長さである場合、長さは
組織培養皮膚試料のその場で求められる。パラメーター
が毛の直径である場合、毛幹の顕微鏡拡大を用いるその
場で又は組織学的に切り取った毛幹の顕微鏡写真を用い
る生体外で直径が求められる。毛髪成長を評価するアッ
セイは、当該技術で周知である。Fraiter等,J.Invest.D
ermatol.,61:72−81（1973）。
成長を測定する生体外手段を提供する他に、本アッセ
イは推定上の毛髪成長刺激剤の作用を評価するのに有用
である。本実施態様においては、毛髪成長状態の第１測
定が組織培養皮膚試料で行われ、推定上の毛髪成長刺激
剤を皮膚試料と接触させ、皮膚試料を刺激剤の存在下で
所定時間維持し、毛髪成長状態の第２測定を行い、かか
る薬剤のあり又はなしでの毛髪成長の変化を比較する。
この実施態様は、例えばミノキシジル、ジアゾアキシド
等の薬剤の多毛作用を試験するのに極めて有用である。
イは推定上の毛髪成長刺激剤の作用を評価するのに有用
である。本実施態様においては、毛髪成長状態の第１測
定が組織培養皮膚試料で行われ、推定上の毛髪成長刺激
剤を皮膚試料と接触させ、皮膚試料を刺激剤の存在下で
所定時間維持し、毛髪成長状態の第２測定を行い、かか
る薬剤のあり又はなしでの毛髪成長の変化を比較する。
この実施態様は、例えばミノキシジル、ジアゾアキシド
等の薬剤の多毛作用を試験するのに極めて有用である。
また、毛髪成長アッセイは、成長以外の毛髪の特徴を
研究するために変更することができる。例えば、毛の色
を変えるように計画された染料のような組成物の効能及
び安全性を試験するためにこのアッセイを用いることが
できる。本アッセイ及びその変法は、毛髪成長又は性状
に影響するように計画された化合物の製造業者にヒトの
ような生きている動物で試験する前に生体外でその化合
物を試験する機会を与える。
研究するために変更することができる。例えば、毛の色
を変えるように計画された染料のような組成物の効能及
び安全性を試験するためにこのアッセイを用いることが
できる。本アッセイ及びその変法は、毛髪成長又は性状
に影響するように計画された化合物の製造業者にヒトの
ような生きている動物で試験する前に生体外でその化合
物を試験する機会を与える。
D.抗老化／抗しわアッセイ 本発明の未変性状態皮膚組織培養系は、推定上の抗老
化又は抗しわ剤の抗老化又は抗しわ作用を評価するアッ
セイに適用することもできる。このアッセイの場合、細
胞外支持マトリックス、培地及び皮膚培養条件は、皮膚
毒性アッセイについて上述したものと実質的に同一であ
る。しかしながら、抗老化又は抗しわアッセイに用いら
れる皮膚試料は、有毛又は無毛動物から得られる。
化又は抗しわ剤の抗老化又は抗しわ作用を評価するアッ
セイに適用することもできる。このアッセイの場合、細
胞外支持マトリックス、培地及び皮膚培養条件は、皮膚
毒性アッセイについて上述したものと実質的に同一であ
る。しかしながら、抗老化又は抗しわアッセイに用いら
れる皮膚試料は、有毛又は無毛動物から得られる。
抗老化アッセイにおいては、皮膚老化を表すパラメー
ターを評価する。老化を表すパラメーターの例として
は、表皮の厚さ（表皮は老化で薄くなる）、表皮のメラ
ニン含量（メラニン含量は老化で減少する）及び皮腺数
（数は老化で減少する）が挙げられる。Cecil Textbook
of Medicine,15th Edition ed.Beeson等,W.B.Saunder
s,Philadelphia,pp.27及び2272（1979）。
ターを評価する。老化を表すパラメーターの例として
は、表皮の厚さ（表皮は老化で薄くなる）、表皮のメラ
ニン含量（メラニン含量は老化で減少する）及び皮腺数
（数は老化で減少する）が挙げられる。Cecil Textbook
of Medicine,15th Edition ed.Beeson等,W.B.Saunder
s,Philadelphia,pp.27及び2272（1979）。
抗しわアッセイにおいては、しわを表すパラメーター
を評価する。しわを表すパラメーターの例としては、コ
ラーゲン及びエラスチン含量（双方がしわの増加と共に
減少する）、皮膚の弾力性及び表皮のひだの頻度及び分
布のような物理的パラメーターが挙げられる。上記Text
book of Medicine。
を評価する。しわを表すパラメーターの例としては、コ
ラーゲン及びエラスチン含量（双方がしわの増加と共に
減少する）、皮膚の弾力性及び表皮のひだの頻度及び分
布のような物理的パラメーターが挙げられる。上記Text
book of Medicine。
抗老化又は抗しわアッセイの１実施態様においては、
しわ又は老化の徴候を示す老化動物ドナーから皮膚試料
を得、老化又はしわ過程を逆転又は弱める能力について
推定上の抗老化又は抗しわ剤を試験する。
しわ又は老化の徴候を示す老化動物ドナーから皮膚試料
を得、老化又はしわ過程を逆転又は弱める能力について
推定上の抗老化又は抗しわ剤を試験する。
もう１つの実施態様においては、動物の子供から皮膚
試料を得、老化又はしわを防止する能力について推定上
の抗老化又は抗しわ剤を試験する。
試料を得、老化又はしわを防止する能力について推定上
の抗老化又は抗しわ剤を試験する。
本発明の抗老化又は抗しわアッセイは、多くの用途や
応用がある。このアッセイは、保湿剤、担体、軟化剤、
乳化剤等の化粧品の作用を試験するために用いられる。
応用がある。このアッセイは、保湿剤、担体、軟化剤、
乳化剤等の化粧品の作用を試験するために用いられる。
１実施態様においては、皮膚試料の多くのパラメータ
ーを試験物質による処理前後に評価することができる。
このようにして、老化、しわ、毒性及び毛髪成長につい
て種々の物質の作用に関するデータを同一の組織培養系
で同時に評価することができる。
ーを試験物質による処理前後に評価することができる。
このようにして、老化、しわ、毒性及び毛髪成長につい
て種々の物質の作用に関するデータを同一の組織培養系
で同時に評価することができる。
下記実施例は本発明の特定の実施態様を具体的に説明
するものであり、特にことわらない限り明細書及び請求
の範囲を限定するものではない。
するものであり、特にことわらない限り明細書及び請求
の範囲を限定するものではない。
実施例 1.未変性状態皮膚組織培養 外表面積約10mm2及び厚さ約１〜2mmを有する皮膚試料
を無胸腺ヌードマウスから切り取り、約0.2mg/mlのゲン
タマイシン及び10％（v/v）胎児ウシ血清を含むイーグ
ルMEMに浸漬したGELFOAMTMマトリックス上に置いた。使
用する前に、マトリックスを培地に37℃で時間浸漬して
マトリックスを培地中で平衡化した。
を無胸腺ヌードマウスから切り取り、約0.2mg/mlのゲン
タマイシン及び10％（v/v）胎児ウシ血清を含むイーグ
ルMEMに浸漬したGELFOAMTMマトリックス上に置いた。使
用する前に、マトリックスを培地に37℃で時間浸漬して
マトリックスを培地中で平衡化した。
95％空気及び５％CO2の混合物でガス処理したインキ
ュベーター内約37℃の温度で培地中のマトリックス上で
皮膚試料を維持した。図１及び２に示されるように培養
開始後種々の時間で培養した皮膚試料の生存度を評価し
た。生存細胞に特異な指示薬（BCECF−AM）と死細胞に
特異な指示薬（ヨウ化プロピジウム、PI）の吸収又は［
3H］−チミジンの吸収として生存度を評価した。
ュベーター内約37℃の温度で培地中のマトリックス上で
皮膚試料を維持した。図１及び２に示されるように培養
開始後種々の時間で培養した皮膚試料の生存度を評価し
た。生存細胞に特異な指示薬（BCECF−AM）と死細胞に
特異な指示薬（ヨウ化プロピジウム、PI）の吸収又は［
3H］−チミジンの吸収として生存度を評価した。
蛍光染料指示薬BCECF−AM及びPI（Molecular Probes,
Eugene,OR）を最終濃度５ミクロモルで培地に直接添加
した。培地に染料を添加した30分後に10×PlanApo対物
鏡を備えたNikon Optiphotに取り付けたMRC−600 CONFO
CAL IMAGING SYSTEM（Bio−Rad,Richmond,Ca）を用いた
光学走査により、染料の取込みを顕微鏡的に評価した。
試料を約４ミクロンの光学的切片を用いて観察した。
Eugene,OR）を最終濃度５ミクロモルで培地に直接添加
した。培地に染料を添加した30分後に10×PlanApo対物
鏡を備えたNikon Optiphotに取り付けたMRC−600 CONFO
CAL IMAGING SYSTEM（Bio−Rad,Richmond,Ca）を用いた
光学走査により、染料の取込みを顕微鏡的に評価した。
試料を約４ミクロンの光学的切片を用いて観察した。
［3H］−チミジンを最終濃度４μCi/mlで培地に直接
添加した。皮膚試料をチミジン含有培地で３日間維持し
た。３日後、皮膚培養液をリン酸塩緩衝食塩水、pH7.0
で洗浄し、組織学カプセルに入れ、10％（v/v）ホルマ
リンで固定した。次いで、組織学業者に周知の標準方法
により、固定皮膚培養液を脱水し、パラフィンに包埋
し、切片にし、スライドに置いた。スライドを脱パラフ
ィン化し、コダックNTB−２エマルジョンで被覆し、５
日間露光し、現像した。例えば、Freeman等,Proc.soc.N
atl.Acad.Sci.USA,83:2694−2698（1986）及びHoffman
等,Proc.Soc.Acad.Sci.USA,86:2013−2017（1989）。
添加した。皮膚試料をチミジン含有培地で３日間維持し
た。３日後、皮膚培養液をリン酸塩緩衝食塩水、pH7.0
で洗浄し、組織学カプセルに入れ、10％（v/v）ホルマ
リンで固定した。次いで、組織学業者に周知の標準方法
により、固定皮膚培養液を脱水し、パラフィンに包埋
し、切片にし、スライドに置いた。スライドを脱パラフ
ィン化し、コダックNTB−２エマルジョンで被覆し、５
日間露光し、現像した。例えば、Freeman等,Proc.soc.N
atl.Acad.Sci.USA,83:2694−2698（1986）及びHoffman
等,Proc.Soc.Acad.Sci.USA,86:2013−2017（1989）。
現像したスライドを洗浄し、ヘマトキシリン及びエオ
ジンで染色し、エピイルミネーション偏光を備えたニコ
ン又はオリンパス写真用顕微鏡を用いて試験した。
ジンで染色し、エピイルミネーション偏光を備えたニコ
ン又はオリンパス写真用顕微鏡を用いて試験した。
これらの実験の結果を図１及び２に示す。
図１に示されるように、イーグル最小必須培地中の浮
遊GELFOAMTMマトリックス上で２日間組織培養したマウ
ス皮膚は、主要な種類全ての細胞の未変性三次元組織構
築の保存を示した。毛嚢、表皮細胞及び真皮線維芽細胞
が、BCECF−AM（緑−生細胞）を取込んでいるがPI（赤
−死細胞）を取込んでいない同焦点顕微鏡により容易に
可視化され、正常な形態を有すると思われる。皮膚組織
培養は、少なくとも10日間生存可能であった。
遊GELFOAMTMマトリックス上で２日間組織培養したマウ
ス皮膚は、主要な種類全ての細胞の未変性三次元組織構
築の保存を示した。毛嚢、表皮細胞及び真皮線維芽細胞
が、BCECF−AM（緑−生細胞）を取込んでいるがPI（赤
−死細胞）を取込んでいない同焦点顕微鏡により容易に
可視化され、正常な形態を有すると思われる。皮膚組織
培養は、少なくとも10日間生存可能であった。
図２に示されるように、皮膚組織培養液中の細胞は、
６日間まで増殖活性を保持した。写真用偏光顕微鏡を用
いた組織学的オートラジオグラフィーにより示されたDN
A合成及び複製（［3H］−チミジン標識核は鮮やかな緑
色である）は、毛嚢、表皮細胞及び真皮細胞で明らかで
あった。毛嚢、表皮細胞及び真皮細胞の［3H］標識細胞
％は、各々38.6％、75.2％及び10.2％であった。
６日間まで増殖活性を保持した。写真用偏光顕微鏡を用
いた組織学的オートラジオグラフィーにより示されたDN
A合成及び複製（［3H］−チミジン標識核は鮮やかな緑
色である）は、毛嚢、表皮細胞及び真皮細胞で明らかで
あった。毛嚢、表皮細胞及び真皮細胞の［3H］標識細胞
％は、各々38.6％、75.2％及び10.2％であった。
これらのデータは、イーグルMEM中のGELFOAMTMマトリ
ックス上で組織培養した場合、皮膚試料が少なくとも数
日間生存を維持することを示している。
ックス上で組織培養した場合、皮膚試料が少なくとも数
日間生存を維持することを示している。
2.皮膚毒性アッセイ 無胸腺ヌードマウスから得らた皮膚試料を実施例１の
方法に従って培養した。生存細胞に特異な指示薬として
BCECF−AM及び［3H］−チミジン及び死細胞に特異な指
示薬としてPIを用いて推定上の毒素の添加前後に生存度
を評価した。これらの指示薬の吸収は、実施例１の方法
に従って求めた。
方法に従って培養した。生存細胞に特異な指示薬として
BCECF−AM及び［3H］−チミジン及び死細胞に特異な指
示薬としてPIを用いて推定上の毒素の添加前後に生存度
を評価した。これらの指示薬の吸収は、実施例１の方法
に従って求めた。
BCECF−AM及びPIを用いた組織培養開始２日後に最初
の生存度を評価した。この最初の評価直後に、種々の濃
度の毒素、エタノール、ドキソルビシン又は次亜塩素酸
ナトリウムを皮膚試料と接触させた。毒素の最終濃度
は、エタノールの場合約0.5〜約70％（v/v）、ドキソル
ビシンの場合約29〜725mgs/ml及び次亜塩素酸ナトリウ
ムの場合約0.6〜約60.0（v/v）に変動させた。
の生存度を評価した。この最初の評価直後に、種々の濃
度の毒素、エタノール、ドキソルビシン又は次亜塩素酸
ナトリウムを皮膚試料と接触させた。毒素の最終濃度
は、エタノールの場合約0.5〜約70％（v/v）、ドキソル
ビシンの場合約29〜725mgs/ml及び次亜塩素酸ナトリウ
ムの場合約0.6〜約60.0（v/v）に変動させた。
皮膚試料をエタノール、ドキソルビシン又は次亜塩素
酸ナトリウムと各々約５分、約24時間及び約２時間接触
させた。これらの接触時間の後、毒素含有培地を新しい
非毒素含有培地と交換し、皮膚試料をBCECF−AM及びPI
を用いた生存度について再評価した。毒素との接触前後
に皮膚試料の同一領域の生存度を評価した。
酸ナトリウムと各々約５分、約24時間及び約２時間接触
させた。これらの接触時間の後、毒素含有培地を新しい
非毒素含有培地と交換し、皮膚試料をBCECF−AM及びPI
を用いた生存度について再評価した。毒素との接触前後
に皮膚試料の同一領域の生存度を評価した。
更に、ドキソルビシンと接触させた皮膚試料を毒素接
触の24時間後に測定される［3H］−チミジンの吸収を用
いて生存度について評価した。
触の24時間後に測定される［3H］−チミジンの吸収を用
いて生存度について評価した。
これらの実験の結果を図３−７に纏める。
図３は、エタノール処理前後の組織培養マウス皮膚の
着色顕微鏡写真である。エタノールの毒性は、エタノー
ル処理前後の生存度を評価し、２つの生存度評価を比較
することにより求めた。上記実施例１の生存度の評価に
従い、生存細胞は緑に染色され、死細胞は赤に染色され
る。顕微鏡写真は、エタノール処理前（左側の画像）に
はマウス皮膚の大多数の細胞が生存していたことを示し
ている。0.5％（v/v）（上右側の画像）あるいは5.0％
エタノール（下右側の画像）で処理した後、多数の細胞
が死んでいる。更に、データは、5.0％エタノールが0.5
％エタノールより毒性（生存度の減りが大きい）であっ
たことを示している。30％、50％及び70％エタノールを
用いた結果は、５％を用いて見られた減りの程度より生
存度の減りが増加することを示した（データは示されて
いない）。
着色顕微鏡写真である。エタノールの毒性は、エタノー
ル処理前後の生存度を評価し、２つの生存度評価を比較
することにより求めた。上記実施例１の生存度の評価に
従い、生存細胞は緑に染色され、死細胞は赤に染色され
る。顕微鏡写真は、エタノール処理前（左側の画像）に
はマウス皮膚の大多数の細胞が生存していたことを示し
ている。0.5％（v/v）（上右側の画像）あるいは5.0％
エタノール（下右側の画像）で処理した後、多数の細胞
が死んでいる。更に、データは、5.0％エタノールが0.5
％エタノールより毒性（生存度の減りが大きい）であっ
たことを示している。30％、50％及び70％エタノールを
用いた結果は、５％を用いて見られた減りの程度より生
存度の減りが増加することを示した（データは示されて
いない）。
図４のデータは、組織培養マウス皮膚についてエタノ
ールの用量依存性毒性作用を示す。本実験においては、
毒性を致死細胞の％として示した。処理培養液の全細胞
［PI−陽性（赤）及びBCECF−AM−陰性（緑）細胞］に
関して致死細胞（PI−陽性細胞）のフラクションを同焦
点蛍光走査顕微鏡で測定し、未処理の対照と比較して細
胞毒性を求めた。致死細胞の％は、処理後の赤色細胞数
−処理前の赤色細胞数を全細胞数（処理後の緑色細胞数
＋処理後の赤色細胞数）で割ったものとして示される。
データは、致死細胞％（毒性）がエタノールの濃度が増
加するにつれて増加することを示している。
ールの用量依存性毒性作用を示す。本実験においては、
毒性を致死細胞の％として示した。処理培養液の全細胞
［PI−陽性（赤）及びBCECF−AM−陰性（緑）細胞］に
関して致死細胞（PI−陽性細胞）のフラクションを同焦
点蛍光走査顕微鏡で測定し、未処理の対照と比較して細
胞毒性を求めた。致死細胞の％は、処理後の赤色細胞数
−処理前の赤色細胞数を全細胞数（処理後の緑色細胞数
＋処理後の赤色細胞数）で割ったものとして示される。
データは、致死細胞％（毒性）がエタノールの濃度が増
加するにつれて増加することを示している。
皮膚毒性に関するドキソルビシン又は次亜塩素酸ナト
リウムの作用を、上記エタノールの場合と同様の方法で
求めた。
リウムの作用を、上記エタノールの場合と同様の方法で
求めた。
図５のデータは、組織培養マウス皮膚に関するドキソ
ルビシンの用量依存性毒性作用を示す。データは、ドキ
ソルビシンの毒性が組織培養系に添加したドキソルビシ
ン濃度に相対的に比例したことを示した。
ルビシンの用量依存性毒性作用を示す。データは、ドキ
ソルビシンの毒性が組織培養系に添加したドキソルビシ
ン濃度に相対的に比例したことを示した。
図６のデータは、未変性組織培養マウス皮膚内の種々
の細胞、即ち、真皮細胞、表皮細胞及び毛嚢細胞につい
てドキソルビシンの用量依存性毒性作用を示している。
組織培養マウス皮膚をドキソルビシンで24時間処理する
と用量依存方式で皮膚細胞のDNA合成を阻害した。本実
験においては、毒性を細胞増殖％として表した。細胞増
殖％は、（１）ドキソルビシン処理試料中全細胞に対す
る［3H］−チミジンで標識した細胞の％を（２）対照の
未処理皮膚試料中全細胞に対する［3H］−チミジン標識
細胞の％と比較した比率として算出した。対照と相対的
にドキソルビシン処理は、用量依存性の細胞増殖低下を
生じた。データは、ドキソルビシンの作用が具体的な細
胞の種類で異なることも示している。ドキソルビシンの
毒性は毛嚢細胞で最も顕著であった。
の細胞、即ち、真皮細胞、表皮細胞及び毛嚢細胞につい
てドキソルビシンの用量依存性毒性作用を示している。
組織培養マウス皮膚をドキソルビシンで24時間処理する
と用量依存方式で皮膚細胞のDNA合成を阻害した。本実
験においては、毒性を細胞増殖％として表した。細胞増
殖％は、（１）ドキソルビシン処理試料中全細胞に対す
る［3H］−チミジンで標識した細胞の％を（２）対照の
未処理皮膚試料中全細胞に対する［3H］−チミジン標識
細胞の％と比較した比率として算出した。対照と相対的
にドキソルビシン処理は、用量依存性の細胞増殖低下を
生じた。データは、ドキソルビシンの作用が具体的な細
胞の種類で異なることも示している。ドキソルビシンの
毒性は毛嚢細胞で最も顕著であった。
図７は、生体内で行われる皮膚毒性評価と比較した場
合、本発明の生体外組織培養皮膚試料を用いた皮膚毒性
評価の信頼度を評価するために行われた比較実験を示
す。毒性の生体内評価は、以下で示される皮膚刺激標準
試験を用いて求めた。
合、本発明の生体外組織培養皮膚試料を用いた皮膚毒性
評価の信頼度を評価するために行われた比較実験を示
す。毒性の生体内評価は、以下で示される皮膚刺激標準
試験を用いて求めた。
異なった濃度の次亜塩素酸ナトリウムに浸漬した小さ
なガーゼペーパー片（サイズ約1.5cm2）をマウスの背面
の３ヵ所にしっかりとかぶせた。次亜塩素酸ナトリウム
を除去して1/2時間及び１時間後に紅斑及び浮腫の皮膚
部位を１〜４段階で評点した。各濃度の次亜塩素酸ナト
リウムに対する一次刺激指数（PII）を次式から誘導し
た。
なガーゼペーパー片（サイズ約1.5cm2）をマウスの背面
の３ヵ所にしっかりとかぶせた。次亜塩素酸ナトリウム
を除去して1/2時間及び１時間後に紅斑及び浮腫の皮膚
部位を１〜４段階で評点した。各濃度の次亜塩素酸ナト
リウムに対する一次刺激指数（PII）を次式から誘導し
た。
本実験の結果を図７に纏める。
図７のデータは、生体内で評価した毒性と組織培養マ
ウス皮膚で評価した毒性との間に高い正相関を示してい
る。特に、データは毒性の閾値（次亜塩素酸ナトリウム
約0.6％）が２系で一致したことを示している。
ウス皮膚で評価した毒性との間に高い正相関を示してい
る。特に、データは毒性の閾値（次亜塩素酸ナトリウム
約0.6％）が２系で一致したことを示している。
これらのデータは、本発明の皮膚毒性アッセイが推定
上の毒素の作用を信頼でき且つ正確に評価するために用
いることができることを示している。
上の毒素の作用を信頼でき且つ正確に評価するために用
いることができることを示している。
3.毛髪成長アッセイ 有毛マウスから得た皮膚試料を細胞外支持マトリック
スの３種類の処方を用いて実施例１の方法に従って組織
培養した。細胞外支持マトリックスの３処方は、GELFOA
MTMマトリックス、上層のMATRIGELTMと下層のセルロー
ススポンジを含む組み合わせマトリックス及び上層のGE
LFOMATMと下層のセルローススポンジを含み組み合わせ
マトリックスとした。
スの３種類の処方を用いて実施例１の方法に従って組織
培養した。細胞外支持マトリックスの３処方は、GELFOA
MTMマトリックス、上層のMATRIGELTMと下層のセルロー
ススポンジを含む組み合わせマトリックス及び上層のGE
LFOMATMと下層のセルローススポンジを含み組み合わせ
マトリックスとした。
毛髪成長は、組織培養の６日間の毛の長さの変化とし
て評価した。比較のために、毛髪成長を同一期間生体外
で測定した。本実験の結果を図８に纏める。
て評価した。比較のために、毛髪成長を同一期間生体外
で測定した。本実験の結果を図８に纏める。
図８のデータは、組織培養したマウス皮膚が毛髪成長
の正常な速度を支持したことを示している。皮膚試料を
上層のGELFOAMTM下層のセルローススポンジを含む組み
合わせマトリックスで組織培養した場合、組織培養皮膚
試料の毛髪成長は生体内成長速度に極めて近似した。
の正常な速度を支持したことを示している。皮膚試料を
上層のGELFOAMTM下層のセルローススポンジを含む組み
合わせマトリックスで組織培養した場合、組織培養皮膚
試料の毛髪成長は生体内成長速度に極めて近似した。
これらのデータは、実施例１及び２で得たデータと共
に、本発明の方法に従って組織培養した皮膚試料が
（１）正常な未変性状態の三次元構築を維持し、（２）
数日間生存を維持し、（３）細胞増殖を示し、（４）正
常な毛髪成長を支持することを示している。更に、これ
らのデータは、かかる組織培養法が皮膚毒性及び毛髪成
長のための信頼できる生体外アッセイを提供することを
示している。
に、本発明の方法に従って組織培養した皮膚試料が
（１）正常な未変性状態の三次元構築を維持し、（２）
数日間生存を維持し、（３）細胞増殖を示し、（４）正
常な毛髪成長を支持することを示している。更に、これ
らのデータは、かかる組織培養法が皮膚毒性及び毛髪成
長のための信頼できる生体外アッセイを提供することを
示している。
ここでは本発明を特定の好ましい実施態様によって述
べ、それに関して例示してきたが、その思想を逸脱する
ことなく種々の修正、変更、省略及び置換がなされても
よいことを当業者は容易に理解するであろう。
べ、それに関して例示してきたが、その思想を逸脱する
ことなく種々の修正、変更、省略及び置換がなされても
よいことを当業者は容易に理解するであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/02 G01N 33/15 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ ＷＰＩ
Claims (28)
- 【請求項１】内側面及び外側面を有する皮膚試料の未変
性状態組織培養法であって、 ａ）培地に浸漬し浮遊している、軟質である細胞外支持
マトリックス上に該皮膚試料を置き、 ここで該マトリックスは、培地からの栄養素を未変性状
態における皮膚の内側面に送るための毛管作用に適した
間隙を柱状構造に提供し、また ここで該内側面はマトリックスに隣接しており、外側面
は培地表面より上に露出しており；そして ｂ）マトリックスとその上の皮膚を培養条件下で維持す
る、 工程を含む方法。 - 【請求項２】皮膚試料がヒト由来である請求項１記載の
方法。 - 【請求項３】毛管成長アッセイであって、 ａ）内側面及び外側面を有する毛髪細胞を含む皮膚試料
を、培地に浸漬し浮遊している細胞外支持マトリックス
上で培養し、 ここで該マトリックスは、培地からの栄養素を未変性状
態における皮膚の内側面に送るための毛管作用に適した
間隙を柱状構造に提供し、また ここで該内側面はマトリックスに隣接しており、外側面
は培地表面より上に露出しており； ｂ）毛髪成長状態の第１測定を行い； ｃ）培地中で皮膚試料とマトリックスを所定時間維持
し； ｄ）毛髪成長状態の第２測定を行い；そして ｅ）毛髪成長状態の第１及び第２測定を比較することに
より毛髪成長を判定する； 工程を含むアッセイ。 - 【請求項４】毛髪成長状態が毛の物理的寸法である請求
項３記載のアッセイ。 - 【請求項５】皮膚試料がヒト由来である請求項３又は４
記載のアッセイ。 - 【請求項６】細胞外支持マトリックスがコラーゲン含有
ゲル及び／又はホモ多糖類スポンジを含む請求項１又は
３記載の方法。 - 【請求項７】コラーゲン含有ゲルがゲル化ブタ皮膚であ
り、ホモ多糖類がセルロースである請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】細胞外支持マトリックスが上層のコラーゲ
ン含有ゲルと下層のホモ多糖類スポンジを含む請求項６
記載の方法。 - 【請求項９】ホモ多糖類がセルロースであり、コラーゲ
ン含有ゲルがゲル化ブタ皮膚である請求項８記載の方
法。 - 【請求項１０】皮膚毒性アッセイであって、 ａ）皮膚組織培養条件下、内側面及び外側面を有する皮
膚試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接さ
せ、外側面を培地表面より上に露出させることにより、
培地に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し； ｂ）皮膚試料を推定上の毒素と接触させ； ｃ）毒素の存在下で皮膚試料とマトリックスを所定時間
維持し；そして ｄ）皮膚試料の生存度により毒素の皮膚毒性を評価す
る； 工程を含むアッセイ。 - 【請求項１１】浸漬した細胞外支持マトリックスが培地
中に浮遊しており、該マトリックスが培地からの栄養素
を未変性状態における皮膚の内側面に送るための毛管作
用に適した間隙を柱状構造に提供する請求項10記載のア
ッセイ。 - 【請求項１２】皮膚試料が無胸線ヌード哺乳動物由来で
ある請求項10又は11記載のアッセイ。 - 【請求項１３】皮膚試料を推定上の毒素と接触させる前
に皮膚試料の生存度を評価し、推定上の毒素と接触前後
の評価生存度により毒素の毒性を比較する工程を含む請
求項10〜12のいずれかに記載のアッセイ。 - 【請求項１４】生存度評価が生存細胞に特異な指示薬の
皮膚試料への取込みを測定することにより行われる請求
項10〜13のいずれかに記載のアッセイ。 - 【請求項１５】指示薬が放射能標識チミジン又は光学的
検出が可能な染料、又は蛍光染料である請求項14記載の
アッセイ。 - 【請求項１６】蛍光染料がBCECF−AM,、カルセイン−A
M、CFDA、アクリジンオレンジ、カルセインブルー、フ
ラー2AM、フルオレセインジアセテート又はカルボキシ
類似体である請求項15記載のアッセイ。 - 【請求項１７】生存度評価が生存細胞に特異な第１染料
及び死細胞に特異な第２染料を培地に加え、染料含有培
地を所定時間維持し、場合によっては、皮膚試料を走査
して皮膚試料中の第１及び第２染料の分布を定量するこ
とにより行われる請求項14記載のアッセイ。 - 【請求項１８】第１及び第２染料が異なった放射スペク
トルを有する蛍光染料である請求項17記載のアッセイ。 - 【請求項１９】第１蛍光染料がBCECF−AM、カルセイン
−AM、CFDA、アクリジンオレンジ、カルセインブルー、
フラー2AM、フルオレセインジアセテート又はカルボキ
シ類似体であり、そして／又は第２蛍光染料がヨウ化プ
ロピジウム、臭化エチジウム又はエチジウムホモ二量体
である請求項18記載のアッセイ。 - 【請求項２０】推定上の抗老化剤又は抗しわ剤の抗老化
又は抗しわ効果を評価するアッセイであって、 ａ）皮膚組織培養条件下、内側面及び外側面を有する皮
膚試料を、内側面を細胞外支持マトリックスに隣接さ
せ、外側面を培地表面より上に露出させることにより、
培地に浸漬した細胞外支持マトリックス上で培養し； ｂ）皮膚試料を推定上の抗老化剤又は抗しわ剤と接触さ
せ； ｃ）推定上の薬剤の存在下で皮膚試料とマトリックスを
所定時間維持し；そして ｄ）皮膚の老化又はしわを示すパラメーターを評価する
ことにより推定上の薬剤の効果を評価する； 工程を含むアッセイ。 - 【請求項２１】浸漬した細胞外支持マトリックスが培地
中に浮遊しており、該マトリックスが培地からの栄養素
を未変性状態における皮膚の内側面に送るための毛管作
用に適した間隙を柱状構造に提供する請求項20記載のア
ッセイ。 - 【請求項２２】皮膚の老化を示すパラメーターが表皮の
厚さ、表皮のメラニン含量及び皮腺数からなる群より選
択され、そして／又はしわを示すパラメーターがコラー
ゲン及びエラスチン含量、皮膚の弾力性、及び表皮ひだ
の頻度及び分布からなる群より選択される、請求項20又
は21記載のアッセイ。 - 【請求項２３】細胞外支持マトリックスがコラーゲン含
有ゲル及び／又はホモ多糖類スポンジである請求項10〜
11及び20〜21のいずれかに記載のアッセイ。 - 【請求項２４】コラーゲン含有ゲルがゲル化ブタ皮膚で
あり、ホモ多糖類がセルロースである請求項23記載のア
ッセイ。 - 【請求項２５】細胞外支持マトリックスが上層のコラー
ゲン含有ゲルと下層のホモ多糖類スポンジを含む請求項
23記載のアッセイ。 - 【請求項２６】ホモ多糖類がセルロースであり、コラー
ゲン含有ゲルがゲル化ブタ皮膚である請求項25記載のア
ッセイ。 - 【請求項２７】上層のコラーゲン含有ゲルと下層のホモ
多糖類スポンジを含む未変性状態組織培養皮膚のための
細胞外支持マトリックスであって、該マトリックスが培
地からの栄養素を未変性状態における皮膚の内側面に送
るための毛管作用に適した間隙を柱状構造に提供する上
記マトリックス。 - 【請求項２８】コラーゲン含有ゲルがゲル化ブタ皮膚で
あり、ホモ多糖類がセルロースである請求項27記載のマ
トリックス。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66223991A | 1991-02-28 | 1991-02-28 | |
| US662,239 | 1991-02-28 | ||
| PCT/US1992/001571 WO1992015700A1 (en) | 1991-02-28 | 1992-02-28 | A native-state histoculturing method for skin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06505636A JPH06505636A (ja) | 1994-06-30 |
| JP2950519B2 true JP2950519B2 (ja) | 1999-09-20 |
Family
ID=24656946
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4508222A Expired - Lifetime JP2950519B2 (ja) | 1991-02-28 | 1992-02-28 | 皮膚の未変性状態組織培養法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5849579A (ja) |
| EP (1) | EP0573606B1 (ja) |
| JP (1) | JP2950519B2 (ja) |
| AT (1) | ATE175242T1 (ja) |
| DE (1) | DE69228055T2 (ja) |
| WO (1) | WO1992015700A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6399380B1 (en) * | 1991-02-28 | 2002-06-04 | Anti-Cancer, Inc. | Native-state histoculturing skin extracellular support |
| US5763255A (en) * | 1994-04-25 | 1998-06-09 | Becton Dickinson And Company | Inducing epithelial cell differentiation with dried native fibrillar collagen |
| US5563067A (en) | 1994-06-13 | 1996-10-08 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Cell potential measurement apparatus having a plurality of microelectrodes |
| USRE40209E1 (en) | 1994-06-13 | 2008-04-01 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Cell potential measurement apparatus having a plurality of microelectrodes |
| US6890762B1 (en) | 1996-01-24 | 2005-05-10 | Matsushita Technical Information Services Co., Ltd. | Method for measuring physiocochemical properties of tissues of cells, method for examining chemicals, and apparatus therefor |
| CN1183121A (zh) * | 1996-01-24 | 1998-05-27 | 松下电器产业株式会社 | 测定组织或细胞物理化学特性的方法、检测药品的方法及其装置 |
| US6551772B1 (en) | 1996-11-27 | 2003-04-22 | Anticancer, Inc. | Model for viral infection and immune response |
| DE10100122A1 (de) * | 2001-01-03 | 2002-07-11 | Henkel Kgaa | Verfahren zur Bestimmung der Hautalterung in vitro |
| US20020182112A1 (en) * | 2001-04-30 | 2002-12-05 | Unilever Home & Personal Care Usa, Division Of Conopco, Inc. | In vivo method for measuring binding of chemical actives to skin or specific constituents of skin |
| RU2005106264A (ru) | 2002-08-09 | 2005-08-27 | Норт Каролина Стейт Юниверсити (Us) | Способы и композиции для улучшения роста мясной птицы |
| US7252941B2 (en) * | 2002-11-12 | 2007-08-07 | Anticancer, Inc. | Expression profiling based on histocultures |
| FR2847345B1 (fr) * | 2002-11-18 | 2005-02-18 | Oreal | Procede de criblage et/ou d'evaluation de l'activite anti-ride de produits |
| GB0512214D0 (en) | 2005-06-15 | 2005-07-27 | Capsant Neurotechnologies Ltd | Method |
| DE102007026639A1 (de) | 2007-06-06 | 2008-12-11 | Stefan-Andreas Ulrich | Industrielle Fertigung tierischer Lederhautsubstitute für die Lederproduktion aus etablierten Epithelzelllinien und/oder primären Epithelzellkulturen, wie vorzugsweise Fibroplasten, Melanozyten, Keratiozyten sowie deren Verfahren und Vorrichtungen |
| CA2658074C (fr) * | 2008-03-17 | 2017-11-07 | L'oreal | Equivalent de peau pigmentee fonctionnelle |
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| SG11201908240YA (en) * | 2017-03-31 | 2019-10-30 | Dana Farber Cancer Inst Inc | Methods for evaluating tumor cell spheroids using 3d microfluidic cell culture device |
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| FR2597499A1 (fr) * | 1986-04-18 | 1987-10-23 | Merieux Inst | Procede de culture microbiologique sur supports de collagene, supports pour ce procede et produits obtenus |
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-
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- 1992-02-28 WO PCT/US1992/001571 patent/WO1992015700A1/en active IP Right Grant
-
1996
- 1996-05-03 US US08/642,322 patent/US5849579A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，６１［２］（１９７３）ｐ．７２−８１ |
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