DE102004061289B4

DE102004061289B4 - Testkit mit Testzellen und Immunzellen sowie Herstellverfahren hierfür

Info

Publication number: DE102004061289B4
Application number: DE200410061289
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. Richter; Sabine Krüger; Andreas Dr. Emmendörffer; Thomas Prof. Dr. Hunziker; Alain Dr. Limat
Original assignee: EURODERM GmbH
Current assignee: EURODERM GmbH
Priority date: 2004-12-20
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2009-04-02
Anticipated expiration: 2024-12-21
Also published as: DE102004061289A1

Abstract

Testkit mit Testzellen sowie mit Antigen-präsentierenden Zellen und immunologischen Effektorzellen desselben Spenders, zur in vitro-Untersuchung der Wirkung von Effektoren auf die Testzellen, wobei die Testzellen in vitro angezüchtet oder ex vivo gewonnen sind, wobei die Testzellen HLA-typisiert sind, aus der Haarwurzelscheide stammen, und epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Testzellen aus Stammzellen angezüchtet sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testkit mit Testzellen und Immunzellen für eine in vitro-Untersuchung der Wirkung von Effektoren auf die Testzellen gemäß dem Anspruch 1. Die Erfindung betrifft ferner ein Herstellverfahren für das erfindungsgemäße Testkit gemäß dem Anspruch 15 sowie Verwendungsverfahren gemäß den Ansprüchen 33 und 34.
Die Entwicklung von in vitro-Testsystemen zum Identifizieren von beispielsweise kutan sensibilisierenden Substanzen ist insbesondere für die chemische, kosmetische und pharmazeutische Industrie von sehr großem wirtschaftlichem Interesse. Bedingt wird dies nicht nur durch die gestiegenen gesetzlichen Vorgaben der europäischen Gemeinschaft. Insbesondere aufgrund der sich zunehmend ändernden Ansprüche der Verbraucher an Kosmetika aber auch Arzneimittel und der Forderung der Verbraucher nach Entwicklung der Produkte ohne Durchführung von Tierversuchen steigt der Bedarf an Testmodellen, welche den Kriterien des 3R-Prinzips (Refinement, Reduction, Replacement) Rechnung tragen, ständig.
Derzeit werden Studien potentiell immuntoxischer/allergotoxischer Wirkungen von Substanzen in erster Linie noch immer in Tierversuchen durchgeführt. In den letzten Jahren hat hierbei insbesondere der lokale Lymphknoten-Assay an Bedeutung erhalten, welcher, wenn an Mäusen und Ratten durchgeführt, Aussagen zum sensibilisierenden Potential einer Substanz gestattet. In aller Regel wird die Prüfsubstanz auf dem Rücken oder im Nacken des Versuchstieres aufgetragen. In einer zweiten Phase erfolgt dann eine erneute Exposition mit der Prüfsubstanz, und es werden die Schwellung der aurikulären Lymphknoten sowie nach Exzision die Zellzahl in den jeweiligen Lymphknoten bestimmt. Diese Untersuchungen können durch gezielte durchflußzytometrische Analysen (T-Zellsubpopulationen) oder molekulare Analysen erweitert werden. Auf diese Weise ist es möglich, Substanzen hinsichtlich irritierender und sensibilisierender Wirkung zu differenzieren.
Ergänzt werden diese in vivo-Studien durch neuere Testsysteme. So sind etwa für Untersuchungen an Hautzellen derzeit verschiedene Testsysteme auf dem Markt erhältlich. So wird beispielsweise von der Firma SkinEthic, Nizza, Frankreich, ein Epidermis-Äquivalent hergestellt und vertrieben, das aus mehreren Schichten besteht. Für den Aufbau des Systems werden Vorhautzellen aus Biopsien verwendet. Ein Nachteil dieses Modells ist, daß die Zellen verschiedener Spender gepoolt werden müssen, um ausreichend Gewebsmaterial für größere Chargen zu erhalten. Dies führt jedoch wiederum dazu, daß sich in einem Präparat Zellen mit unterschiedlichen Tranplantationsantigenen befinden. Dieses Modell ist somit für Fragen der Sensibilisierung und Immunkompetenz ungeeignet. Es reagiert zudem auf die Zugabe beispielsweise von T-Lymphozyten mit Fremdreaktionen (Alloreaktion).
Ein komplexeres Testsystem wird von der Firma CellSystems aus St. Katharinen, Deutschland, angeboten. Das Produkt AST 2000 dieser Firma weist eine epidermale Komponente auf, die auf einer Fibroblastenschicht (in Kollagenmatrix) gezüchtet wurde und als zwei „Komponenten-Haut" für Forschungs- und Prüfzwecke hergestellt wird. Auch bei diesem Modell werden aus Biopsien stammende Zellen eingesetzt. Die in diesem Modell enthaltenen Fibroblasten und Keratinozyten stammen wiederum von verschiedenen Spendern, woraus die oben genannte Unbrauchbarkeit für immunologische Untersuchungen resultiert. Darüber hinaus stehen das in diesem Modell verwendete fetale Kälberserum sowie Rattenkollagen dem Einsatz des Modells insbesondere für human-immunologische Fragestellungen entgegen.
Schließlich vertreibt die MatTek Inc., Massachussets, USA, ein aus Zellen aus Hautbiopsien aufgebautes Epidermisäquivalent unter dem Namen „EpiDerm". Da dieses Modell keine Zellen des Immunsystems aufweist, weist das Modell wie die zuvor genannten Modelle keinerlei Immunkompetenz auf. Ferner ist der HLA-Phänotyp der Spender nicht bekannt. Die dem Modell zugrunde liegenden Zellen stammen zudem von verschiedenen Spender, weshalb das Modell für Fragen der Sensibilisierung und Immunkompetenz wiederum ungeeignet ist.
Des weiteren finden in vitro-Analysen an einzelnen Zellpopulationen statt. So werden die Substanzeffekte an Zellen wie beispielsweise Fibroblasten, Lymphozyten oder Keratinozyten in der Flüssigkeitsphase untersucht. Im Gegensatz zu den 3-D Hautmodellen der Fa. SkinEthic handelt es sich um Monolayer oder Zellsuspensionen. Prüfungen von Schäumen oder Cremes sind hierbei nur bedingt möglich. Aussagen, welche allergieauslösende Eigenschaften von Substanzen betreffen, sind nicht möglich.
Aus der DE 103 20 633 A1 ist ein Verfahren zum Identifizieren einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von lebenden Zellen, die einem Reiz ausgesetzt wurden, und lebenden Zellen, die nicht diesem Reiz ausgesetzt wurden, bekannt. Hierbei wird mindestens eine dieser beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet. Das Verfahren erlaubt die mögliche Identifizierung von mindestens einem biologischen Parameter, der nach einem Reiz verändert ist.
Aus der DE 103 20 602 A1 ist ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren einer möglichen Modifikation von mindestens einem biologischen Parameter unter Verwendung von jungen und alten lebenden Zellen bekannt. Hierbei wird wiederum eine der beiden Zellklassen in einem dreidimensionalen Gewebemodell verwendet.
Aus der DE 196 51 992 A1 ist ein Serum als Zusatz von Kulturmedium bei der Züchtung von stratifizierten Hautäquivalenten aus Stammzellen bekannt. Dem Kulturmedium zur Züchtung von Zellen ist hierbei homologes oder autologes Serum bzw. wirksame Bestandteile davon zugesetzt.
Alle die oben genannten Modelle arbeiten mit Keratinozyten und werden zur Untersuchung von Reaktionen oder Eigenschaften der menschlichen Haut eingesetzt. In der Praxis besteht jedoch oftmals auch die Frage nach der Wirkung von Effektoren auf andere Zellen, wie beispielsweise Muskelzellen, Nervenzellen, Knochenzellen und andere Zellen, sowie solche Zellen enthaltende Zellsysteme bzw. Organe oder Organsysteme. Jedoch gibt es bislang kein Modell oder Testkit, mittels welchem Immunantworten solcher Zellsysteme bzw. Organe oder Organsysteme untersucht werden könnten.
Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testkit zum Untersuchen der Wirkung von Effektoren auf Testzellen vorzuschlagen. Ferner soll ein Verfahren zum Herstellen eines solchen Testkits angegeben werden. Zudem sollen Anwendungsverfahren angegeben werden.
Die vorliegende Aufgabe wird mittels des Testkits gemäß Anspruch 1 gelöst.
Dabei wird ein Testkit vorgeschlagen, welches neben Testzellen auch Antigenpräsentierende Zellen und immunologische Effektorzellen aufweist. Je nach Ziel der mit dem Testkit durchgeführten bzw. durchzuführenden Untersuchung werden im Testkit jene Testzellen verwendet, deren Verhalten gegenüber bestimmten Effektoren untersucht werden soll. Dies können Muskelzellen, Nervenzellen, Keratinozyten, Melanozyten oder andere Zellen sein. Als Testzellen können ferner auch Zellmischungen, also Zellen verschiedener Zellreihen bzw. -arten verwendet werden. Die für das erfindungsgemäße Testkit verwendeten Testzellen können in vitro angezüchtet bzw. vermehrt werden. Sie können jedoch auch ex vivo gewonnen werden. Die Testzellen stammen von demselben Spender, sind HLA-typisiert und stammen aus der Haarwurzelscheide und sind epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs. Beispielsweise können die Testzellen auch durch das Auszupfen eines Haares zum Gewinnen von Haarzellen erhalten werden. Die im erfindungsgemäßen Kit verwendeten Testzellen sind aus Stammzellen angezüchtet.
Die Effektoren können beispielsweise physikalischer Art sein, wie UV- oder Infrarot-Licht, radioaktive Strahlung, Temperatur oder dergleichen. Die Effektoren können aber auch chemischer Art sein. So kann mittels des Testkits beispielsweise die Wirkung von toxischen oder auch regenerierenden bzw. pflegenden Substanzen untersucht werden. Aber auch die Wirkung biologischer Effektoren, beispielsweise auf die Testzellen oder einen Verbund von Testzellen oder auf das Testkit insgesamt einwirkende Kleinstlebewesen können mittels des erfindungsgemäßen Testkits untersucht werden.
Das Testkit weist ferner Immunzellen auf, die zum Ablesen einer Immunfunktion dienen und somit zur Qualifizierung und Quantifizierung der Wirkung der Effektoren auf das Testkit und insbesondere auf die untersuchten Testzellen sowie Immunzellen dienen. Die Immunzellen tragen insofern zu einem Qualifizieren und Quantifizieren der Wirkung der Effektoren bei, als sie durch Ausbildung von Entzündungszeichen, Abgabe von Enzymen, Proteinexpression, Proliferation und/oder Änderung der Differenzierung in bestimmte Subpopulationen oder Reifungsstadien, Antigenpräsentation und dergleichen die Wirkung des jeweils einwirkenden Effektors bzw. der Effektoren widerspiegeln. Unter Immunzellen werden in der vorliegenden Beschreibung jene Zellen verstanden, welche nach dem Verständnis des Fachmannes dem Immunsystem zugerechnet werden, wobei unter Immunsystem im Rahmen dieser Beschreibung das körpereigene System eines Menschen oder Tieres zur Abwehr körperfremder Substanzen und zur kontinuierlichen Elimination anomaler (beispielsweise maligne entarteter) Körperzellen gemeint ist, an der die Organe des lymphatischen Systems, im Organismus verteilte Zellen und Moleküle beteiligt sind. Zu den Immunzellen werden in der vorliegenden Beschreibung beispielsweise Leukozyten, Zellen des Monozyten-Makrophagensystems, Phagozyten, Lymphozyten, dendritische Zellen gezählt, wobei diese Aufzählung nicht in der Absicht erfolgt ist, eine abschließende Aufzählung zu machen.
Die Verwendung von Stammzellen erstreckt sich wahlweise auf embryonale Stammzellen oder auf adulte Stammzellen. Die Erfindung kann jedoch auch mit einer Mischung adulter sowie embryonaler Stammzellen ausgeführt werden.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Testkits besteht darin, daß es erstmals erlaubt, komplexe immunologische Interaktionen zwischen Testzellen und Immunzellen in der Zellkultur zu analysieren. Dies ist insbesondere angesichts der Forderung der Politik von Vorteil, die Anzahl der Tierversuche, welche derzeit noch in der chemischen und kosmetischen Industrie zum Testen von Wirkung und Verträglichkeit von Substanzen üblich sind, auf ein absolut erforderliches Maß zu reduzieren, und statt dessen auf andere Testverfahren zurückzugreifen. Dies ist auch die Forderung bereits erlassener EU-Richtlinien. Für die pharmazeutische Industrie ergeben sich bei Verwendung des erfinderischen Testkits auf vorteilhafte Weise neue Ansätze bei der Wirkstoffsuche, da mittels des erfindungsgemäßen Testkits Fragen der modernen Allergologie und der Transplantationsforschung auf molekularer Ebene genau darstellbar sind.
Das erfindungsgemäße Testkit weist Antigen-präsentierende Zellen und immunologische Effektorzellen auf. Bevorzugt sind dies Vorläuferzellen des peripheren Blutes (beispielsweise CD34+ hämatopoietische Vorläuferzellen, verschiedene Subpopulationen von Monozyten bzw. deren Vorläufer), welche mittels verschiedener Wachstumsfaktor-/Zytokin-, Mitogen- bzw. Peptid-/Lipopolysaccharid-(beispielsweise bakteriell) Beigaben oder Entzündungsmediatoren (beispielsweise Prostaglandine, Leukotriene) angezüchtet wurden und in Interaktion mit oben genannten Testzellen, sei es in einer direkten Ko-Kultur, durch Einwandern in eine Testzell-Kultur oder mittels räumlich getrennter Ko-Kultur, ausreifen und somit eine Antigen-Prozessierung und -Präsentation im Testkit übernehmen können.
Das Testkit kann dabei jede Art von Antigen-präsentierenden Zellen aufweisen, so können dies alle Arten von Monozyten, dendritische Zellen, Langerhans'sche Zellen und dergleichen sein. Die Testzellen können alternativ auch aus Zelllinien gezüchtet oder aus Geweben (ex vivo) isoliert sein.
Die immunologischen Effektorzellen sind vorzugsweise aus dem peripheren Blut isolierte Lymphozyten (insbesondere verschiedene Subsets der T-Lymphozyten), welche das immunologische Milieu des Testkits komplettieren können und durch zelluläre Interaktionen (direkter Kontakt oder indirekt beispielsweise mittels interaktivem Zytokinprofil) die Immunkompetenz des Testkits steigern.
Anders als bei den Modellen des Standes der Technik stammen die Testzellen und die Immunzellen von demselben Spender und daher ist es erfindungsgemäß möglich, dem Testkit zur bestimmungsgemäßen Verwendung des Testkits ohne weitergehende, aufwendige Kompatibilitätsuntersuchungen Immunzellen hinzuzugeben. Auf diese Weise wird vorteilhaft verhindert, daß die im Testkit ebenfalls vorliegen Testzellen von den im Testkit ebenfalls vorhandenen Immunzellen als fremd erkannt werden. Letzteres hätte beispielsweise eine Veränderung der Reaktivität der Immunzellen zur Folge und würde bereits ohne Einwirkung des Effektors zu Immunreaktionen führen können. Eine solche, unerwünschte und die Untersuchungsergebnisse verfälschende Immunreaktion wird bei dieser Ausführungsform somit vorteilhaft vermieden.
Die Verwendung von ausschließlich HLA-typisierten Zellen für das Testkit ermöglicht es, ein für bestimmte Fragestellungen zur Sensibilisierung vorbereitetes Testkit zu erstellen.
Die Gewinnung von Zellen aus der Haarwurzelscheide ist vergleichsweise wenig aufwendig und zudem nicht-invasiv. Ein weiterer Vorteil dieser vergleichsweise einfachen Gewinnung der Testzellen aus der Haarwurzelscheide besteht darin, daß es ungleich einfacher ist, Spender oder Probanden zur Spende von Zellen als Testzellen bzw. deren Grundlage zu bewegen, als wenn derselbe Zelltyp beispielsweise durch eine am Spender durchgeführte Biopsie gewonnen wird. Eine Zellspende von Zellen aus der Haarwurzelscheide kann durch Auszupfen eines Haares erfolgen und ist somit praktisch nicht belastend.
Ferner enthält die Haarwurzelscheide adulte, pluripotente Stammzellen, mittels welcher sich selbst regenerierende, ausdifferenzierende Testzellen anzüchtbar sind, was einen weiteren Vorteil darstellt.
Die Verwendung von Stammzellen bietet den Vorteil, daß sich bei entsprechender Behandlung ein gewünschter Zelltyp als Testzelle erhalten bzw. heranzüchten läßt. Eine weiterer Vorteil bei der Verwendung von Stammzellen besteht darin, daß bei einer Stammzelle eine Vielzahl von Zellteilungen erfolgen kann. Somit sind regenerierende Zellkulturen aus Stammzellen vorteilhaft anzüchtbar. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Stammzellen im erfindungsgemäßen Testkit dieser Ausführungsform besteht in der großen proliferativen Kapazität der Stammzellen. Diese Kapazität ermöglicht eine besondere Langlebigkeit des Testkits bzw. seiner Testzellen. Diese Langlebigkeit ist insbesondere bei der Untersuchung von Langzeitsubtoxizität einer als Effektor wirkenden Substanz oder anderen längerdauernden Untersuchungen von großem Vorteil.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Stammzellen liegt beispielsweise bei Verwendung von aus Stammzellen gewonnenen Keratinozyten als Testzellen darin, daß diese unter den angeführten Kulturbedingungen eine Basalzellschicht aufbauen können.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Unteransprüche.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist das Testkit eine Basalzellschicht auf. Die Basalzellschicht weist wiederum ein besonders hohes Wachstumspotential auf, was vorteilhaft dazu beiträgt, daß sich bei Verwendung der Basalzellschicht in vergleichsweise kurzer Zeit eine große Zahl von Testzellen heranzüchten läßt. Dies verkürzt vorteilhaft die Anzuchtdauer und verringert den Aufwand bei der Anzüchtung. Ferner wirkt sich das hohe Wachstumspotential in der Basalzellschicht vorteilhaft auch auf die Haltbarkeit des sich differenzierenden, stratifizierten, d. h. geschichteten Hautpräparats aus und verlängert somit die zur Verfügung stehende Zeit zwischen dem Ansetzen einer Kultur oder der Auslieferung des Testkits mit den Testzellen an den Kunden und dem Zeitpunkt, in welchem der Kunde spätestens mit der Verwendung des Testkits zu Versuchszwecken begonnen haben sollte. Die im Testkit angestrebte Homöostase des geschichteten Hautpräparats hängt von einem kontinuierlichen, möglichst langanhaltenden „Zellnachschub" aus dem proliferativen Kompartiment in der Basalzellschicht ab. Die Basalzellschicht ermöglicht vorteilhaft einen solchen „Zellnachschub". Daher weist die Erfindung in einer weiter bevorzugten Ausführungsform eine Basalzellschicht auf.
Bei einer wiederum bevorzugten Ausführungsform stammen die verwendeten Testzellen oder die verwendeten Immunzellen jeweils aus einem Pool von unterschiedlichen Spender. Die verwendeten Testzellen oder die verwendeten Immunzellen stammen somit von mehr als nur einer Person. Ein Vorteil dieses als Pooling bezeichneten Vorgehens besteht darin, daß man bei einem Rückgriff auf mehrere Spender über größere Chargen verfügen kann, wobei dieser Rückgriff auf Spender beschränkt sein kann, welche entsprechende Transplantationsmerkmale oder andere Merkmale der immunologischen Disposition beispielsweise im Sinne einer erhöhten genetischen Wahrscheinlichkeit, bestimmte Krankheiten bzw. Reaktionen zu entwickeln, derart aufweisen, daß es nicht zu den oben genannten, verfälschenden interaktiven Immunreaktionen unter den im Testkit eingesetzten Zellen kommt. Ein weiterer Vorteil besteht beim sogenannten Pooling darin, daß das von einer Mehrzahl von Spender gewonnene Gewebsmaterial gegenüber dem nur einem Spender entnommenen Gewebsmaterial eine größere Stabilität bzw. Sicherheit im Sinne hinsichtlich bestimmter Eigenschaften aufweist. Die dem Pool entnommen Zellen weisen geforderte Zell- bzw. Gewebseigenschaften mit einer größeren statistischen Sicherheit auf. Mit dem Testkit dieser Ausführungsform erzielte Untersuchungsergebnisse zeichnen sich daher vorteilhaft durch besondere Zuverlässigkeit aus.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform stammen die Testzellen und/oder die Immunzellen von Spender, die in einem für eine Untersuchung, welche mit dem erfindungsgemäßen Testkit stattfinden soll, relevanten Enzymsystem oder Metabolisierungsverhalten definiert sind. So gibt es für verschiedene Enzymsysteme angeborene, genetisch bedingte sogenannte Isoenzymsysteme, die sich in ihrer enzymatischen Aktivität von Isoenzymsystemen anderer Personen/Probanden unterscheiden (beispielsweise langsame versus schnelle Acetylierer). Diese unterschiedliche Enzymausstattung hat Einfluß auf Art und Intensität der Reaktion auf den Kontakt mit beispielsweise Effektoren wie chemischen Substanzen, Inhaltsstoffen von Kosmetika oder dergleichen. Durch die entsprechende Auswahl von Spender ist es somit auf einfache Weise möglich, das erfindungsgemäße Testkit an spezielle Fragen anzupassen, bei welchen die Metabolisierungskapazität und/oder das Metabolisierungsverhalten insbesondere der Testzellen eine besondere Rolle spielt. Dies ist insbesondere beispielsweise dann von Vorteil, wenn die Wirkung einer Substanz getestet werden soll, welche zur Behandlung einer bestimmten Krankheit verwendet werden soll, und wenn bekannt ist, daß die an dieser Krankheit Erkrankten sich durch ein spezielles oder besonderes Enzymsystem oder ein besonderes Metabolisierungsverhalten auszeichnen.
Eine weitere Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, daß alle Spender HLA-typisiert sind. Dies bedeutet, daß die Transplantationsmerkmale des Spenders (der sogenannte HLA-Phänotyp) bekannt sind. Dieser HLA-Phänotyp bestimmt die im Testkit erfolgende und das Ergebnis der Untersuchung der Wirkung der Effektoren beeinflußende Immunreaktion der Zellen des Testkits wesentlich mit.
Durch ein Zurückgreifen auf die HLA-typisierten Spender eines Pools lassen sich somit auf spezielle Fragestellungen „maßgeschneiderte", im HLA-Phänotyp charakteristische Testkits erstellen, die eine Überprüfung der Wirkung von Effektoren besonders auf Träger des entsprechenden HLA-Antigens vorteilhaft erlaubt. Die Leukozytenantigene sowie weitere, beispielsweise auch klinische Merkmale der Spender können ferner in einer Spenderkartei erfaßt werden, so daß jederzeit Testkits mit Gewebe von z. B. HLA-definierten Patienten mit Nickelallergie oder Neurodermitis erstellt werden können.
Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testkits ist dadurch gekennzeichnet, daß die Testzellen sowie die Immunzellen jeweils humanen oder tierischen Ursprungs sind. Somit ist es möglich, mittels des erfindungsgemäßen Testkits die Wirkung von Effektoren auf menschliche Zellen aber auch auf tierische Zellen zu untersuchen. Letzteres ist beispielsweise für das Testen der Wirkung veterinärmedizinischer Produkte oder das Testen von Stoffen, denen Haustiere ausgesetzt sind wie Parfüms, Bodenreiniger und dergleichen von Vorteil.
Das erfindungsgemäße Testkit ist nicht darauf beschränkt, nur Immunzellen eines Zelltyps aufzuweisen. Ebensowenig soll die Erfindung darauf beschränkt sein, etwa nur Antigen-präsentierende Zellen oder nur Effektorzellen als Immunzellen aufzuweisen. Vielmehr soll je nach der mittels des Testkits zu untersuchenden Fragestellung auch eine Kombination von beispielsweise Antigen-präsentierenden und Effektorzellen im Testkit zum Einsatz kommen. Auf diese Weise können auch synergistische Effekte durch Zusammenwirken verschiedener Zellen, beispielsweise wie dies auch im lebenden Organismus der Fall ist, vorteilhaft genutzt werden. Dies gilt um so mehr, als im erfindungsgemäßen Testkit auch noch weitere, bislang nicht genannte Zellen, beispielsweise Immunzellen oder Melanozyten oder Merkelzellen, vorliegen können.
Die für das erfindungsgemäße Testkit jeweils benötigten Immunzellen können auf einfache Weise gewonnen werden. So können bei einer venösen Blutentnahme von weniger als 500 ml Vollblut oder vorzugsweise einer Apherese ausreichend weiße Blutzellen gewonnen werden, aus denen mittels üblicher Trennverfahren (Dichtegradientenzentrifugation, Magnetseparation und Einsatz neuer monoklonaler Antikörper) beispielsweise dendritische Zellen, Monozyten und Lymphozyten getrennt werden. Diese Zellen können im Anschluß an ihre Gewinnung entweder unmittelbar im Testkit zum Einsatz kommen, sie können aber auch in eine Zellkultur genommen werden, um weitere Populationen von Immunzellen zu generieren. Auf diese Weise gewonnene Zellen können bis zu ihrem Einsatz aber auch bei beispielsweise –150°C eingefroren werden.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann das Testkit als Antigenpräsentierende Zellen solche Zellen umfassen, welche aus Vorläuferzellen des peripheren Blut angezüchtet wurde, aus Zelllinien gezüchtet oder aus Geweben (ex vivo) isoliert wurden.
Das erfindungsgemäße Testkit weist in einer weiter bevorzugten Ausführungsform ferner wenigstens einen Indikator bzw. ein Indikatorsystem auf. Dieses Indikatorsystem kann ein oder mehrere pH-Indikatoren aufweisen, wie sie dem Fachmann durchaus bekannt sind. Ferner können chemische Substanzen, etwa zum Nachweis von Mitochondrienaktivität der Testzellen und/oder der Immunzellen, als Indikatoren verwendet werden. Es können auch moderne Technologien wie entsprechend ausgestaltete Biochips als Indikatoren zum Einsatz kommen. Des weiteren können menschliche, tierische, pflanzliche oder bakterielle Zelllinien als Indikatoren oder Indikatorsysteme (Indikatorzellen) zum Einsatz kommen, welche geeignet sind, eine Wirkung des oder der untersuchten Effektoren auf das Testkit mit für den jeweiligen Zweck ausreichender Empfindlichkeit anzugeben. Solche Indikatorzellen können hierbei epithelialen und/oder mesenchymalen bzw. hämatopoietischen Ursprungs sein. Ferner können auch unterschiedliche Indikatorzellen miteinander kombiniert werden und Kombinationen von Indikatorzellen und nicht auf Zellen basierende Indikatoren miteinander kombiniert werden. Darüber hinaus können Indikatoren, welche nicht auf Zellen basieren, miteinander kombiniert im Testkit vorliegen. Dabei können lösliche Indikator-Moleküle dem Testkit oder (wenn vorhanden) seinem Kulturmedium zu definierten Zeitpunkten zugegeben werden. Indikatorzellen können hingegen auch für bestimmte Zeiträume kokultiviert werden. Dies kann beispielsweise im unteren Kompartiment eines 2-Kammer-Kulturgefäßes erfolgen, welches im Einsatz die Kultur der Testzellen trägt.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testkits werden Keratinozyten als Testzellen verwendet. Mittels eines auf Keratinozyten als Testzellen basierenden Testkits lassen sich die Wirkungen von Effektoren auf die (je nach Spenderwahl menschliche oder tierische) Haut untersuchen. Die Spenderzellen können hierbei aus der Haarwurzelscheide stammen, wodurch die an entsprechender Stelle oben diskutierten Vorteile erzielt werden.
In einer wiederum weiter bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testkits werden Keratinozyten verwendet, welche aus der Haarwurzelscheide stammen (Guter Root Sheath-Keratinozyten oder (ORS-)Keratinozyten genannt). Ein Vorteil der Verwendung dieser Zellen als Testzellen besteht wie oben ausgeführt darin, daß sie sich nicht-invasiv bei jedem Spender repetitiv gewinnen lassen, d. h. es besteht wiederholt die Möglichkeit, Zellen desselben Spenders zu erhalten, ohne eine Biopsie durchführen zu müssen. Diese Gewinnung bedeutet keine besondere Belastung oder Aufwand für den Spender, was dazu beiträgt, daß eine kontinuierliche Bereitstellung von Testzellen von immunologisch und/oder enzymatisch definierten Spender ermöglicht wird. Dies ist bei Hautmodellen des Standes der Technik nicht der Fall, da diese Modelle ausschließlich interfollikuläre Keratinozyten aus Hautbiopsien verwenden. Bei Einsatz der Guter Root Sheath-Keratinozyten (ORS-Keratinozyten) kann aus diesen aus der Haaranlage stammenden Keratinozyten unter geeigneten Kulturbedingungen in vitro ebenfalls eine funktionelle Epidermis vom Typ der interfollikulären Epidermis nachgestaltet bzw. gezüchtet werden.
Guter Root Sheath Keratinozyten (ORS-Keratinozyten oder kurz: ORS) enthalten ferner pluripotente Stammzellen, welche die epithelialen Hautstrukturen lebenslang regenerieren. Dadurch weisen sie auch bei betagten Spendern ein hohes Proliferationspotential auf.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch das Verfahren gemäß Anspruch 15 und die Verwendung gemäß den Ansprüchen 33 und 34.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines Testkits, welches in vitro gezüchtete oder ex vivo gewonnen Testzellen sowie Immunzellen und zwar Antigenpräsentierende Zellen und immunologische Effektorzellen desselben Spenders aufweist, wobei das Testkit zur in vitro-Untersuchung der Wirkung von Effektoren auf die Testzellen dient, die Testzellen HLA-typisiert sind, aus der Haarwurzelscheide stammen, epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs sind und aus Stammzellen angezüchtet sind, umfaßt die Schritte Verwenden von Testzellen und Beigabe von Immunzellen und zwar Antigen-präsentierenden Zellen und immunologischen Effektorzellen zu den Testzellen. Hierbei können die Testzellen in einer Zellkultur angezüchtet oder ex vivo gewonnen sein.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Herstellen eines Testkits sind jeweils Gegenstand der Unteransprüche.
So werden in einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Testzellen und die Immunzellen in einer direkten oder räumlich getrennten Ko-Kultur in Verbindung miteinander gebracht.
Zum Anzüchten der Testzellen in einer Zellkultur wird der Zellkultur Humanserum zugegeben. Nach Erreichen der Konfluenz wird die Zellkultur mit den Testzellen luftexponiert weitergeführt, so dass sich ein hochdifferenzierter, stratifizierter, d. h. geschichteter Testzellverband, ein sogenanntes Epidermisaequivalent, ausbildet.
Die Testzellen können in einem Einsatz oder parallel in mehreren Einsätzen angezüchtet werden und werden in einer weiter bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung eines Enzyms, beispielsweise Dispase, jeweils vom Einsatz gelöst.
Der Vorteil dieses Vorgehens besteht darin, daß der Testzellverband, nachdem er abgelöst wurde, auf einfache Weise angehoben werden und bewegt werden kann. Die Testzellen können daher ohne Schwierigkeiten beispielsweise zu ihrer weiteren Verwendung auf andere Kulturen oder Ko-Kulturen transferiert werden. Die Testzellen können hierzu unterstützend mit einer Trägermembran, beispielsweise mit eine Silikonmembran armiert sein.
In einer bevorzugten Ausgestaltung werden Outer Root Sheath-Keratinozyten (ORS-Keratinozyten) als Testzellen verwendet. Diese Keratinozyten werden hierbei zu hochdifferenzierten, stratifizierten Epidermisäquivalenten mit einem langfristig aktiven, proliferativen Kompartiment in der Basalzellschicht angezüchtet.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden dieselben Vorteile, wie sie oben stehend bereits diskutiert wurden, ungeschmälert erzielt. Zur Vermeidung von Wiederholungen wird daher an dieser Stelle auf die entsprechende Diskussion verwiesen.

Das erfindungsgemäße Testkit kann, wie bereits angesprochen, je nach Fragestellung des mit dem Testkit durchzuführenden Tests auf geeignete Weise zusammengestellt werden. Das Testkit kann dabei aus im wesentlichen vier verschiedenen Modulen I, II, III und IV beliebig zusammengestellt werden. Diese können durch Ko-Kultursysteme (direkte Ko-Kultur, Mehrkammer-Kulturgefässe (beispielsweise das CULTEX-System der Firma Vitrocell Systems) variablel integriert oder sequentiell kombiniert werden. Im folgenden gilt:

Modul I	weist die Testzellen des Testkits auf;
Modul II	weist Antigen-präsentierende Zellen auf;
Modul III	weist Immunologische Effektorzellen auf; und
Modul IV	weist wenigstens ein Indikatorsystem auf.

Im folgenden werden Beispiele für bestimmte Untersuchungen mit aus den oben genannten Modulen zusammengestellten Testkits angeführt, wobei rein exemplarisch ORS-Zellen als Testzellen des Moduls verwendet werden.
Anwendungsbeispiel 1

a) Modul I allenfalls kombiniert mit Modul IV zur Testung von Irritation bzw. Korrosion. Read-out für akut gestörte Zellvitalität sind neben der Histologie der Neutralrot- oder MTT-Test oder die Ausschüttung von beispielsweise LDH, IL-1/6/8 durch geschädigte ORS-Keratinozyten ins Kulturmedium.
b) Insbesondere zur Testung subtoxischer Epidermisschädigungen bei Langzeiteinwirkung als Ersatz für Tierversuche (beispielsweise Sicherheit dermatologischer Topika) kann als Read-out die Kapazität zur Proliferation und Differenzierung der nach der Exposition erneut isolierten ORS-Keratinozyten eingesetzt werden. Für solche Ansätze empfiehlt sich in Anbetracht der großen biologischen Variabilität ein großer Pool definierter Spender. Diesen Pool anzulegen stellt aufgrund der nicht-invasive ORS-Keratinozyten-Gewinnung erfahrungsgemäß keine Schwierigkeit dar.

Anwendungsbeispiel 2
Modul I zur Testung der Metabolisierungskapazität (beispielsweise Cytochrom P 450-vermittelt) von Xenobiotika durch Keratinozyten in einer in-vivo ähnlichen Stratifizierung mit allen Differenzierungsstufen. Auch hier empfiehlt sich in Anbetracht der großen biologischen Variabilität die Verwendung eines Pools bezüglich des keratinozytären Enzymbesatzes definierter Spender, um aussagekräftige, reproduzierbare Analysen zu erhalten. Hierbei sind Pools zwischen zwei bis mehr als hundert Spendern möglich, in der Regel genügen jedoch fünf bis zehn Spender. Je nach Substanz ist als Read-out ein geeignetes Modul IV beizufügen. Dabei können lösliche Indikator-Moleküle zu definierten Zeitpunkten dem Kulturmedium beigefügt werden, Indikatorzellen hingegen für definierte Zeiträume kokultiviert werden, beispielsweise im unteren Kompartiment eines 2-Kammer-Kulturgefässes (beispielsweise das CULTEX-System der Firma Vitrocell Systems), welches im Einsatz die ORS-Kultur trägt.
Anwendungsbeispiel 3
Modul I zur Testung des Einflusses von Xenobiotika auf die epidermale Regeneration. Read-out sind Homöostase-Parameter in der Langzeitkultur (beispielsweise BrdU- oder Ki67-Markierung des proliferativen Kompartimentes), die Kapazität zur Proliferation bzw. Differenzierung nach erneuter Isolation der Keratinozyten (vergleiche Anwendungsbeispiel 1b], Testung subtoxischer Epidermisschädigungen) sowie ein Wundheilungsmodell durch Setzen eines standardisierten Defektes (beispielsweise mittels einer Stanzbiopsie) in die organotypische ORS-Kultur, gefolgt von der Dokumentation (beispielsweise phasenoptische Photographie) der Wiederbesiedelung des Defektes über die Zeit mit Keratinozyten vom Biopsierand her.
Anwendungsbeispiel 4
Modul I und II zur Testung der epidermalen Antigenprozessierung mit konsekutiver Aktivierung der Antigen-präsentierenden Zellen. Read-out sind auf der Protein- oder Genaktivierungsebene Änderungen in der Expression von Reifungs- und Aktivierungsmarkern wie beispielsweise Oberflächen- oder sekretorischen Proteinen im zeitlichen Ablauf nach der Exposition (beispielsweise CD1a/c, Langerin, CCR7, HLA-DR, CD 86, IL-1beta, Aquaporin) sowohl der Antigen-präsentierenden Zellen wie auch der ORS-Keratinozyten sowie das Migrationsverhalten der Antigen-präsentierenden Zellen.
Anwendungsbeispiel 5
Modul I, II und III als immunkompetentes Hautmodell. Hier liegt ein wesentlicher Vorteil im Einsatz von ORS-Keratinozyten, da die im Gegensatz zu interfollikulären Keratinozyten nicht-chirurgische Materialentnahme eine den Spender zumutbare, minimal-invasive und allenfalls repetitive Isolation aller drei Zelltypen zum Aufbau des zur Vermeidung von Alloreaktionen benötigten autologen Testsystems erlaubt. Als Read-out kommen zu den Analysen entsprechend Anwendungsbeispiel 4 Aktivierungsmarker und/oder Proliferationsassays der eingesetzten Lymphozyten(-Subsets) hinzu.
Im folgenden werden Beispiele zur Herstellung erfindungsgemäßer Testkits mit ORS-Keratinozyten als Testzellen gegeben. Die Herstellung von Testkits mit anderen Testzellen als ORS-Keratinozyten ergibt sich dem Fachmann bei Studium der gegebenen Beispiele ohne weiteres. Die Anzucht der ORS-Keratinozyten als Testzellen wird im Folgenden beschrieben. Alternativ können die ORS-Keratinozyten als Testzellen jedoch auch nach der in der veröffentlichten Patentschrift WO 01/05942 offenbarten Verfahrensweise hergestellt werden. Dieses Verfahren wird hiermit ausdrücklich als alternatives Herstellverfahren in die vorliegende Beschreibung aufgenommen.
Die im folgenden verwendeten Begriffe werden hierbei wie folgt verwendet:
Der Begriff „autolog" bedeutet: (i) daß biologisches Transplantationsmaterial von dem Spender erhalten wurde, welcher das Transplantationsmaterial auch wieder erhalten soll, oder (ii): daß biologisches Material eines Spenders einer Zell- oder Gewebekultur hinzugefügt wird, deren Zellen bzw. Gewebe von demselben Spender stammen.
Der Begriff „allogen" bedeutet: (i) daß biologisches Transplantationsmaterial von einem Spender der Art erhalten wurde, zu welcher auch der fremde (genetisch nicht identische) Empfänger gehört, welcher das Transplantationsmaterial erhalten soll, oder (ii): daß biologisches Material eines Spenders einer Art einer Zell- oder Gewebekultur hinzugegeben wird, deren Zellen bzw. Gewebe von einem anderen (genetisch nicht identischen) Spender derselben Art stammt.
Der Begriff „organotypische Kultur" und dergleichen bezieht sich auf die Kultur bzw. Kultivierung von Zellen, insbesondere Keratinozyten, unter Bedingungen, welche die Zelldifferenzierung fördern. Unter den Bedingungen einer „organotypischen Kultur" ist die Proliferation dieser Zellen verglichen mit der Kultur bzw. Kultivierung unter „proliferativen Bedingungen" verlangsamt und es stellt sich über die Zeit eine Homöostase zwischen Proliferation und Differenzierung der Zellen ein.
Herstellungsbeispiel 1
Organotypische Kultur und Handling von Epidermisäquivalenten aus ORS-Keratinozyten
2 – 3.5 × 10⁵ ORS-Keratinozyten je nach Fragestellung eines Spenders (autologes System) oder allenfalls mehrerer definierter Spender (Screeningsysteme) werden in K-Medium (bestehend hauptsächlich aus DMEM/Ham'sF12 in einem 3:1-Verhältnis, mit verschiedenen Wachstumsfaktoren [EGF, Insulin, Transferrin, Tri-Iodo-Thyronin, CholeraToxin, Antibiotika] und Humanserum angereichert) in 12-Well-Einsätze (beispielsweise Costar 3460), welche an ihrer Unterseite durch Mitomycinbehandlung (für 4–6 Stunden mit 8 μg Mitomycin pro ml Medium) oder Röntgen-Bestrahlung (7000 cGy) Wachstums-arretierte Fibroblasten tragen, eingesät. Bei Erreichen der Konfluenz nach 36–72 Stunden werden die submersen Kulturen für 2 Wochen luftexponiert weitergeführt bis phasenoptisch eine deutliche Stratifizierung erkennbar ist.
Für den Einsatz im modularen Testkit werden die Epidermisäquivalente mit Dispase (Dispase II [Roche Diagnostics Nr. 295825], 1:10 verdünnt mit Kulturmedium, entsprechend einer Endkonzentration von 100 mg/ml) für 5–15 Minuten bei 37°C in einem Brutschrank inkubiert und hiermit vom Einsatz abgelöst und mittels eines auf die Hornschicht aufgebrachten Trägers (beispielsweise Silikonmembran) ins jeweilige Testkit transferiert. Das Kulturmedium wird entsprechend den vorab ausgetesteten Bedürfnissen/Verträglichkeiten der im jeweiligen Testkit eingesetzten Zelltypen modifiziert, als basales Medium eignet sich beispielsweise (gegebenenfalls angereichertes) DMEM/Ham'sF12 in einem 3:1-Verhältnis.
Zur Testung der epidermalen Regeneration im Wundheilungsmodell wird beispielsweise in 6 mm durchmessende Epidermisäquivalente mittels einer Biopsiestanze ein zentraler runder Defekt von 2 mm Durchmesser gesetzt, dessen Repopulation mit Keratinozyten im zeitlichen Ablauf der unter definierten Versuchsbedingungen fortgesetzten Kultur planimetrisch (beispielsweise phasenoptische Photodokumentation) analysiert wird.
Herstellungsbeispiel 2
Langzeit-Subtoxizität
Organotypische Kulturen von ORS-Keratinozyten (vergleiche. Herstellungsbeispiel 1) werden für 7–28 Tage mit der zu testenden Substanz bzw. dem zu testenden Substanzgemisch exponiert, wobei die Exposition „topisch", d. h. die Substanz bzw. das Substanzgemisch wird direkt auf die Hornschicht der organotypischen Kultur appliziert, oder „systemisch", d. h. die Substanz bzw. das Substanzgemisch wird im Zellkulturmedium gelöst, erfolgen kann. Nicht akut-toxische Konzentrationen werden vorangehend an Epidermisäquivalenten gemäß Anwendungsbeispiel 1)a) ausgetestet. Im Falle der topischen Applikation kann die Substanz bzw. das Substanzgemisch in freier Form oder mittels eines Trägers (beispielsweise Löschblattpapier oder Kunststoffnetzwerk – sustained release) aufgetragen werden. Die zu testende Substanz bzw. das zu testende Substanzgemisch kann in beliebigen Zeitabschnitten erneuert werden. Nach Beendigung der Exposition mit der Substanz bzw. dem Substanzgemisch wird neben der Bestimmung von konventionellen Zytotoxizitäts-relevanten Parametern (Neutralrot, MTT, LDH, und dergleichen) im Medium bzw. im histologischen Präparat die Einwirkung auf die Proliferation und die Differenzierung der ORS-Keratinozyten in der organotypischen Kultur ermittelt. Zur Erfassung eines Einflusses auf das proliferative Kompartiment werden die vorzugsweise basalen Keratinozyten der organotypischen Kultur zunächst durch eine sequentielle Dispase- und Trypsinbehandlung (beispielsweise Dispase II [Roche Diagnostics Nr. 295825], 1:10 verdünnt mit Kulturmedium, entsprechend einer Endkonzentration von 100 mg/ml) für 5–15 Minuten bei 37°C inkubiert; Trypsin in einer Konzentration von 0.1% in Ca/Mg freier, gepufferter Phosphat-Lösung für 1–3 Minuten bei 37°C) in Form einer Einzelzellsuspension gewonnen, und in einem zweiten Schritt ihre proliferative Kapazität durch Ansetzen einer Klonkultur bestimmt (beispielsweise Ansetzen von 50 ORS-Keratinozyten pro cm² Kulturfläche in Anwesenheit von Wachstums-arretierten Dermisfibroblasten als Helferzellen in 20 cm² Kulturschalen und Bestimmung der Anzahl der Klone, welche nach 12 Tagen ausgewachsen sind).
Herstellungsbeispiel 3
APC-Aktivierung
Organotypische Kulturen von ORS-Keratinozyten (vergleiche Herstellungsbeispiel 1) werden mit Hilfe einer Dispase-Behandlung (Dispase 11 [Roche Diagnostics Nr. 295825], 1:10 verdünnt mit Kulturmedium, entsprechend einer Endkonzentration von 100 mg/ml, für 5–15 Minuten bei 37°C inkubiert) vom Substrat (Membran des Zellkultureinsatzes [Costar 3460]) abgelöst. Das abgelöste Epidermisäquivalent wird auf die Membran eines neuen Zellkultureinsatzes (beispielsweise Costar Multiwell 3460) mit 2 × 10⁵ oder ohne wachstumsarretierte (vergleiche Herstellungsbeispiel 1) Dermisfibroblasten auf der Unterseite aufgelegt, welche auf ihrer Oberseite 10²–10⁶ Antigenpräsentierende Zellen pro cm² Kulturfläche trägt. Als Antigen-präsentierende Zellen können autologe oder allogene, beispielsweise aus dem peripheren Blut isolierte CD-34-positive, Zytokin-kultivierte dendritische Zellen, aus Epidermis isolierte Langerhans-Zellen oder Zytokin-kultivierte Blut-Monozyten dienen (Modul II). Diese Ko-Kultur wird entsprechend den Eigenschaften der zu testenden Substanzen für definierte Zeitintervalle allenfalls repetitiv (beispielsweise für 1 bis 72 Stunden) der zu testenden Substanz bzw. dem zu testenden Substanzgemisch exponiert, wobei die Exposition „topisch", d. h. die Substanz bzw. das Substanzgemisch wird direkt auf die Hornschicht der organotypischen Kultur appliziert, oder „systemisch", d. h. die zu testende Substanz bzw. das zu testende Substanzgemisch wird im Zellkulturmedium gelöst, erfolgen kann. Die zu testende Substanz bzw. das zu testende Substanzgemisch kann in beliebigen Zeitabschnitten erneuert werden. Im Falle der topischen Applikation kann die Substanz bzw. das Substanzgemisch in freier Form oder mittels eines Trägers (beispielsweise Löschblattpapier oder Kunststoffnetzwerk – sustained release) aufgetragen werden, diese Applikationsform stellt die Interaktion der verschiedenen Differenzierungsstufen der ORS-Keratinozyten mit in-vivo auf die Haut applizierten Topika nach (Metabolismus, Modifikation von Haptenen zu Vollantigenen). Adjuvantien zur Induktion einer immunologischen Reaktion (beispielsweise Zytokine wie GM-CSF oder Pharmaka wie Imiquimod) können beigegeben werden. Zwischen 0–72 Stunden nach Beendigung der Exposition mit der Substanz bzw. dem Substanzgemisch erfolgt die Messung der Aktivierung der Antigenpräsentierenden Zellen, beispielsweise durch Bestimmung auf der Genaktivierungs- oder Proteinebene der Erhöhung der Expression von CD 86 an der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zellen oder einer Zunahme der IL-1beta- bzw. Verringerung der Aquaporin-Produktion durch die Antigenpräsentierenden Zellen, durch histologische Dokumentation des Migrationsverhaltens (beispielsweise Einwandern in das bzw. Auswandern aus dem Epidermisaequivalent) der Antigen-präsentierenden Zellen, oder durch Nachweis einer Aufnahme und Prozessierung der zu testenden, allenfalls beispielsweise radioaktiv markierten Substanz bzw. des Substanzgemisches durch die Antigen-präsentierenden Zellen.
Die vorliegende Erfindung schlägt somit erstmals ein Testkit vor, welches Testzellen als auch Immunzellen aufweist, zur in vitro-Untersuchung der Wirkung von Effektoren auf die Testzellen. Die Effektoren können hierbei insbesondere physikalischer oder biologischer oder chemischer Natur sein. Die Testzellen können in vitro angezüchtet oder ex vivo gewonnen sein.
Die Erfindung gibt ferner ein Verfahren zum Herstellen des erfindungsgemäßen Testkits, sowie Verfahren zu seiner Anwendung an.

Claims

Testkit mit Testzellen sowie mit Antigen-präsentierenden Zellen und immunologischen Effektorzellen desselben Spenders, zur in vitro-Untersuchung der Wirkung von Effektoren auf die Testzellen, wobei die Testzellen in vitro angezüchtet oder ex vivo gewonnen sind, wobei die Testzellen HLA-typisiert sind, aus der Haarwurzelscheide stammen, und epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Testzellen aus Stammzellen angezüchtet sind.
Testkit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Testkit eine Basalzellschicht aufweist.
Testkit nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Testzellen oder die Immunzellen jeweils aus einem Pool von unterschiedlichen Spender stammen.
Testkit nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß jeder der zum Spenderpool zusammengefaßten Spender zumindest in einem bestimmten Enzymsystem mit den übrigen Spender des Pools übereinstimmt.
Testkit nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß alle Spender des Pools HLA-typisiert sind.
Testkit nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der wenigstens eine Spender ein Mensch oder ein Tier ist.
Testkit nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Testkit Monozyten aufweist.
Testkit nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Testkit dendritische Zellen aufweist.
Testkit nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigen-präsentierenden Zellen solche Zellen umfassen, welche aus Vorläuferzellen des peripheren Bluts angezüchtet wurden, aus Zelllinien gezüchtet oder aus Geweben (ex vivo) isoliert wurden.
Testkit nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Testkit zumindest auch Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten, aufweist.
Testkit nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Testkit ferner wenigstens ein Indikatorsystem aufweist.
Testkit nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das wenigstens eine Indikatorsystem wenigstens einen pH-Indikator, und/oder Zellen oder Zelllinien menschlichen, tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs aufweist.
Testkit nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Testzellen Keratinozyten sind.
Testkit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten Outer-Root-Sheath-Keratinozyten sind.
Verfahren zum Herstellen eines Testkits, welches in vitro angezüchtete oder ex vivo gewonnene Testzellen sowie Antigen-präsentierende Zellen und immunologische Effektorzellen desselben Spenders aufweist, zur in vitro-Untersuchung der Wirkung von Effektoren auf die Testzellen, wobei die Testzellen HLA-typisiert sind, aus der Haarwurzelscheide stammen, epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs sind und aus Stammzellen angezüchtet sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: Verwenden von in einer Zellkultur angezüchteten oder ex vivo gewonnenen Testzellen; und Beigabe von Antigen-präsentierenden Zellen und immunologischen Effektorzellen zu den Testzellen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Testzellen und die Immunzellen in einer direkten oder räumlich getrennten Ko-Kultur miteinander in Verbindung gebracht werden.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anzüchten der Testzellen in einer Zellkultur die Zellkulturdichte der zum Anzüchten verwendeten Testzellen zu Beginn der Anzüchtung zwischen 1 bis 3,5 × 10⁵ Zellen/cm² beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anzüchten der Testzellen in einer Zellkultur die Anzüchtung in einem mit Wachstumsfaktoren angereicherten Zellkulturmedium erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anzüchten der Testzellen in einer Zellkultur die Anzüchtung unter Beigabe von wachstumsarretierten Fibroblasten erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anzüchten der Testzellen in einer Zellkultur der verwendeten Zellkultur DMEM/Ham'sF12 in einem Verhältnis 3:1 zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anzüchten der Testzellen in einer Zellkultur der verwendeten Zellkultur Humanserum zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß bei Anzüchten der Testzellen in einer Zellkultur die Zellkultur mit den Testzellen bei Erreichen der Konfluenz luftexponiert weitergeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Testzellen in wenigstens einem Einsatz angezüchtet werden und zu ihrer Verwendung mittels eines Enzyms, insbesondere Dispase, vom Einsatz gelöst werden, wobei sie mittels eines Trägers transferiert werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest die Testzellen und/oder die Immunzellen aus einem Pool von Spender stammen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß dem Testkit Antigen-präsentierende Zellen beigefügt werden, welche aus Vorläuferzellen des peripheren Bluts angezüchtet wurden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Testkit Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten, umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Testkit wenigstens ein Indikatorsystem umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß dem Testkit als das wenigstens eine Indikatorsystem wenigstens ein pH-Indikator und/oder Zellen oder Zelllinien beigefügt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens ein Spender ein Mensch, ein Tier, eine Pflanze oder ein Bakterium ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß als Testzellen Keratinozyten verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Keratinozyten Outer-Root-Sheath-Keratinozyten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunzellen dem Blut des Spenders entnommen sind.
Verwendung eines Testkits nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zum Testen der epidermalen Regeneration bei Verwendung von Keratinozyten als Testzellen und/oder zum Testen von Toxizität und/oder Allergenität von Substanzen bezogen auf die Testzellen sowie die Immunzellen.
Verwendung eines nach einem der Ansprüche 15 bis 32 hergestellten Testkits zum Testen der epidermalen Regeneration bei Verwendung von Keratinozyten als Testzellen und/oder zum Testen von Toxizität von Effektoren bezogen auf die Testzellen und/oder zum Testen von Allergenität von Effektoren bezogen auf die Testzellen sowie die Immunzellen.