KR20090049620A - Ｃｄ14＋ 단구로부터 랑게르한스 세포 및/또는 진피/간질성 수지상 세포를 생성시키는 방법 - Google Patents
Ｃｄ14＋ 단구로부터 랑게르한스 세포 및/또는 진피/간질성 수지상 세포를 생성시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함하는 세포 환경의 존재 하에 CD14+ 단구를 놓아둠으로써 CD14+ 단구를 랑게르한스 세포 (LC)로 분화시키거나, 진피/간질성 수지상 세포 (IDC)로 분화시키거나, 또는 LC 및 IDC로 분화시키는 것을 포함하는, 생물, 특히 인간의 말초 순환계 혈액으로부터 유래되는 CD14+ 단구로부터 LC, 또는 IDC, 또는 LC 및 IDC를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 따라서 수득될 수 있는, 적어도 LC 및/또는 IDC를 포함하고, 임의로 대식 세포 및 내피 세포를 포함하는 세포 또는 조직 모델; 및 그들의 용도에 관한 것이다.
CD14+ 단구, 랑게르한스 세포 (LC), 진피/간질성 수지상 세포 (IDC), 인간의 말초 순환계 혈액, 상피 세포, 각질 세포, 중간엽 세포, 진피 섬유아세포
Description
본 발명은 특히 활성 성분을 시험할 목적 및/또는 조직 모델에 관련된 생물학적/생화학적 현상을 연구할 목적으로 이들 조직 모델을 제조함으로써, 말초 순환계 혈액으로부터 단리한 CD14+ 단구로부터 수지상 세포, 및 특히 랑게르한스 (Langerhans) 세포 및/또는 간질성 수지상 세포/진피 수지상 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
수지상 세포 (DC)는 면역계의 파수병으로서 보고된 항원을 지닌 세포이다. 실제로, 수지상 세포는 즉 흉선, 전신 순환계, 이차 림프계 기관 및 또한 말초 조직, 예를 들어 피부 및 단층상 (mono-stratified) 또는 다층상 점막에 준-편재성 국재된다. 유기체에 극히 적은 수가 존재하긴 하지만, DC는 면역 반응의 특이성, 세기 및 성질에 대한 제어를 발휘함으로써 특이적 면역 반응을 촉발시키는 데에 있어서 중심에 있고, 선천 면역과 후천 면역 간의 경계에 놓여있다. DC는 면역 반응을 촉발시키기 위한 기능 이외에도, 말초 관용을 유도시키는 데에 있어서 일정 역할을 하기도 한다.
DC의 전구체는 많은 면역계와 혈액 세포 집단과 같이 CD34+ 조혈 전구 세포의 분화로부터 비롯된다. 이들 전구체는 피부 및 점막에서 혈액을 통하여 운반되어 미성숙 DC로서 분화 및 존재한다. 이러한 미성숙 상태는 특징적 표현형과 항원을 포획할 수 있는 강력한 기능적 능력으로써 표현된다. 그들의 생체내 국재에 따라서 두 가지 유형의 말초 DC가 보고되었다:
- 랑게르한스 세포 (LC)는 말피기 (malpighian) 유형 (피부 및 점막)의 상피에 국재되는데, 여기서 이들 세포는 유형 C의 렉틴인 랑게린 (langerine)을 특이적으로 발현한다. 랑게린은 특이적 초미세구조적이고 LC의 기준 표지인 세포질내 오가나이트 (organite), 즉 비르벡 과립 (Birbeck's granule)의 형성에 관여하고 있다. LC는 또한, CD1a 및 HLA-DR과 같은 특징적 표지를 발현한다.
- 간질성 DC (IDC)는 피부의 진피에서와 같은 점막 적층에서 발견되는데, 이는 진피 DC (DDC)로서 기재되기도 한다. 이들 세포는 단구/대식 세포의 세포주와 많은 유사성과 공통의 표지를 공유하고 있다. 피부 진피에서는, DCC가 DC-SIGN을 특이적으로 발현할 뿐만 아니라 HLA-DR, FXIIIa, MMR 및 CD1a와 같은 특징적 표지도 특이적으로 발현한다. 후술 내용은 일반적으로, 그들이 점막 적층에 위치하는지 아니면 피부 진피에 위치하는 지의 사실과는 독립적으로 간질성 수지상 세포를 지칭한다.
항원을 포획한 후, LC 및 IDC는 항원 정보를 림프구 T에 제시하기 위하여 림프절 쪽으로 이동한다. LC 및 IDC의 활성화와 상관이 있는 이러한 이동은 표현형별적 및 기능적 변화로써 표현된다. 예를 들어, "활성화된" LC 및 IDC는 공동-자 극 표지인 CD80 및 CD86의 발현을 획득하게 되고, 세포의 피부 이동에 절대적으로 필요한 CCR7 수용체의 발현을 획득하게 된다. 림프절에서는, 활성화된 LC 및 IDC가 그들과 T 림프구와의 상호 작용으로부터 "성숙한" 또는 "서로 맞물린" DC의 표현형을 획득하게 된다. 이러한 성숙한 상태는 특징적 표현형, 예를 들어 CD83 및 DC-LAMP의 발현 및 강력한 동종자극 능력, 즉 T 림프구의 증식을 유도시킬 수 있는 능력과 동의어이다. 외항원을 포획한 후 근접 림프절을 향하여 이동할 수 있는 능력 때문에, LC 및 IDC는 많은 피부 병리 상태, 예를 들어 접촉성 알레르기에 대해 책임이 있고, 보다 최근에는 인간 면역결핍증 바이러스 (HIV)의 제1 표적으로서 보고되었다.
피부 또는 인간 점막으로부터 유래되는 LC 및 IDC의 흥미로운 용도, 특히 상피 세포 또는 섬유아세포 유형의 중간엽 세포와 병용되는 경우의 LC 및 IDC의 흥미로운 용도는 이들을 3차원적 기관형 배양물 내로의 통합, 예를 들어
- LC 만을 통합하는, "재구축된 표피" 모델 및 "재구축된 점막" 모델, 예를 들어 질 및 구강 형태 모델 내로의 통합 [참고: Regnier et al., JID 1997; 109:510-2; Patent EP 0 789 074 of L'OREAL; Sivard et al., Exp. Dermatol. 2003; 12:346-55],
- DCC 또는 IDC를 통합하는, "재구축된 진피" 모델 및 "재구축된 융모막" 모델 내로의 통합 [참고: Guironnet et al., JID 2001; 116:933-9 and Dumont et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 2004; 20:383-97]
으로 이루어진다.
이들 용도는 현재 극도로 제한되는데, 이는 1. 시험관 내에서 LC 및 IDC를 산업 규모로 생성시키기 위한 신속하고, 단순하며 저렴한 방법이 없고, 2. 재구축된 조직의 상피 부분 또는 접속 부분만을 나타내고 결단코 둘 모두의 연합 조직 구획이 아닌 것으로 보고된 3D 모델의 결함 때문이다.
저자 [참고: Regnier et al., Sivard et al. and Dumont et al.]의 문헌은 다음과 같은 주요 단점을 지닌 제대혈로부터 유래되는 CD34+ 전구체의 용도를 다루고 있다: 1. 단리된 CD34+ 전구 세포는, 제한된 공급원인 제대혈로부터 추출되기 때문에 그의 수가 제한되므로, 산업적으로 사용하기가 곤란하고; 2. CD34+ 전구 세포를 LC 또는 IDC로 분화시키는 것을 유도하기 위하여 이들을 상기 3D 모델 내로 통합시키기 전에 CD34+ 전구 세포를 선행 배양해야 하며 (6 내지 12일 동안); 3. 보고된 방법에서는, LC 또는 몇몇 IDC를 통합하는 재구축된 표피, 재구축된 점막 및 재구축된 융모막을 성장시키기 위해서는 배지에 외인성 사이토킨을 부가해야만 한다.
문헌 [저자: Guironnet et al.]에서 저자는 재구축된 진피 모델 내로 통합시키기 위하여 혈액 단구로부터 DCC를 생성시켰다. 앞서 언급된 바와 같은 두 가지 단점이 강조되어야 한다: 1. 단구를 DCC로 분화시키는 것을 유도하기 위하여 이를 재구축된 진피 내로 통합시키기 전에 단구를 선행 배양해야 하며 (6일 동안); 2. DCC를 통합하는 재구축된 진피를 성장시키기 위해서는 배지에 외인성 사이토킨을 부가해야만 한다. 동일 문헌에서, 저자는 또한 단구가 등가의 진피 내로 직접 통합되었고, 사이토킨을 부가하지 않고서는 DC로의 분화가 일어나지 않았다는 것을 제시하였다.
문헌 [참고: L'Oreal's Patent US 6,130,482]에는 생성물의 합성 자극성 또는 알레르기 유발 효력을 평가하기 위하여, 특히 표피 모델 내로 통합시킬 목적을 지니고 LC 전구체를 LC로 분화시키는 것을 수행하기 위하여 LC 전구체와 각질 세포를 적당한 영양 배지에서 공동-배양하는 것이 기재되어 있다. 그러나, 상기 출원에는 문헌 [참고: Caux et al., Nature, 1992 Nov. 19, 360(6401):258-61]에 기재된 방법을 참고하여 제대혈로부터 유래하는 CD34+ 조혈 전구 세포의 용도가 기재되어 있다. 이러한 문헌에 기재된 방법은 CD34+ 조혈 전구 세포를 외인성 사이토킨의 존재 하에 성장시키는 것을 포함한다. 상기 특허는 일반적으로, LC 전구체를 CD1a+를 발현할 수 있는 것으로 정의하고 있지만, LC의 CD34+ 전구체로서의 CD34+ 조혈 세포의 용도 만이 상기 특허에 기재되었다. 그러나 CD34+ 조혈 세포는 말초혈에 별로 많지 않고, 산업적으로 만족할 만한 분화 방법을 개발해내지 못하게 한다. 제대혈로부터 유래되는 전구체의 사용은 이러한 제대혈이 다량으로 입수 가능하지 않는 한은 만족할 만한 수준이 아니다.
최근에, 문헌 [참고: BASF Beauty Care Solutions France SAS (Coletica, French Patent FR 2 833 271B1, filed on December 10th 2001)]에는 CD14+ 단구를 분화시켜 LC, IDC, 몇몇 LC 및 몇몇 IDC를 동시에 수득한 다음, 이를 피부 또는 인간 점막으로부터 유래되는 상피 세포 및/또는 중간엽 세포의 존재 하에 성장시킬 수 있다고 기재되어 있다. 이러한 특허에는 특히 다음이 기재되어 있다:
- LC 만을 통합하는 "재구축된 표피" 모델 및 "재구축된 점막" 모델,
- DCC 또는 IDC를 통합하는 "재구축된 진피" 모델 및 "재구축된 융모막" 모델,
- LC 및 IDC를 동시에 통합하는 "재구축된 피부" 모델 및 "재구축된 점막" 모델.
앞서와 같이, 언급된 방법의 단점은 외인성 사이토킨의 존재 하에, 단구를 LC로 분화시키거나, IDC로 분화시키거나 또는 LC와 IDC로 동시에 분화시키는 것을 유도하기 위하여 이를 3D 모델 내로 통합시키기 전에 단구를 선행 배양해야 하는 것이다 (6일 동안).
오늘날, FR 특허 제2 833 271 B1호의 목적인 방법 (Engelhard Lyon에 의해 개발됨)에만 정상적인 인간 피부와 근접한 면역적격한 조직 모델을 개발하기 위하여 LC 및/또는 IDC를 제공할 목적으로 단구를 LC 및/또는 IDC로 분화시키는 것이 기재되어 있다. 그러나, 이러한 방법은 단순하고, 비용이 많이 들지 않으며 신속한 분화 방법을 사용함으로써 특히 개선시킬 수 있다.
발명의 목적
본 발명을 이용하여, 안전하고 신뢰 가능하며 재현 가능한 방식으로, 산업적 및 상업적 규모, 특히 농업-급수 및/또는 의학 및/또는 제약 및/또는 미용 산업 규모로 사용할 수 있는, 선행 기술에서 제시된 각각의 기술적 문제점을 처음으로 해결할 수 있다.
본 발명은 주로, 말초 순환계 혈액으로부터 유래되는 독특한 생체 전구체로부터 LC, 또는 IDC, 또는 LC 및 IDC를 동시에 생성시키거나, 또는 IDC 및 대식 세 포 및 내피 세포를 동시에 생성시키거나, 또는 LC 및 IDC 및 대식 세포 및 내피 세포를 동시에 생성시키는 것으로 이루어진다.
본 발명은 특히, 전술된 세포 (LC, IDC/DCC 등)를 함유하는 표피, 상피, 진피, 융모막, 피부 또는 점막 모델을 제공하는 것으로 이루어지는데, 이러한 모델은 생물, 특히 포유류 (특히, 인간)의 표피, 상피, 진피, 융모막, 피부 또는 점막을 재생시키기 위하여 가능한 가장 우수한 양질의 것이다. 본 발명의 목적은 추가로, 피부 또는 점막의 상피 및/또는 접속 시트 뿐만 아니라 피부 또는 점막의 면역적격한 등가물을 제공하는 것이다.
본 발명은 특히, 전술된 세포 (LC, IDC/DCC 등)를 수득하기 위하여 말초 순환계 혈액으로부터 유래되는 단구를 분화시키는 방법을 제공하는 것으로 이루어진다.
본 발명은 또한, 특히 화장품 성분의 자극성 및/또는 감작 효력을 시험하기 위하여, 동물 실험에 대한 대체 방법으로서 상기 언급된 모델을 제공하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 목적은 또한, 화장품, 피부-약학 및 약학에서 활성 성분을 시험하기 위하여, 특히 그의 활성 및/또는 그의 독성 또는 약리독성을 평가하기 위하여 상기 언급된 바와 같은 모델을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한, 분자 또는 화학물질을 시험하기 위하여, 특히 그의 독성을 평가하기 위하여 상기 언급된 바와 같은 모델을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한, 세포간 및 세포내 수준에서 생물학적/생화학적 현상을 연구 조사하기 위하여 상기 언급된 바와 같은 모델을 제공하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 주요 목적은, 예를 들어 외부 작용제의 알레르기 유발력/자극성/감작력을 예측하기 위하여 시험관내 시험을 수행할 목적으로 약리독성학적 연구 조사하기 위한 모델/도구를 제공하는 것이다. 본 발명의 목적은 면역조정 특성을 지닌 물질을 연구 조사하기 위한 모델/도구를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한, 특히 생물 조직의 한 가지 이상 부분을 복구하기 위한 조직 또는 세포 공학에 있어서의 상기 언급된 바와 같은 모델의 용도에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명의 범위 내에서 "세포"를 논의하는 경우, 이는 달리 언급되지 않는 한 항상 "생체 세포"이다.
"말초 순환계 혈액"이란 본 발명에 따라서, 혈액이 특히 동물, 포유류, 바람직하게는 인간의 말초에서 순환을 달성하는 혈액 시스템을 갖는 모든 생물의 혈액을 의미한다.
"활성 성분"이란 산업, 특히 농업-급수, 음식물, 피부-제약, 제약, 미용 산업 등에서 잠재적으로 흥미로운 활성을 지닐 수 있는 모든 물질, 생성물 또는 조성물을 의미한다.
"외인성 사이토킨의 부가"란 관련 세포 배지에 존재하는 세포에 의해 합성된 사이토킨 이외에 한 가지 이상의 사이토킨을 부가하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 CD14+ 단구를 상피 세포 및/또는 예를 들어, 섬유아세포 유형의 중간엽 세포의 존재 하에,
- LC로 분화시키거나,
- IDC로 분화시키거나,
- LC 및 IDC로 동시에 분화시키거나,
- IDC 및 대식 세포 및/또는 내피 세포로 동시에 분화시키거나
- LC 및 IDC 및 대식 세포 및/또는 내피 세포로 동시에 분화시키는 것에 관한 것이다.
본 발명은 특히, LC 및/또는 IDC를 포함하는 세포 모델을 수득하기 위하여, CD14+ 단구를 상피 세포 및/또는 예를 들어, 섬유아세포 유형의 중간엽 세포의 존재 하에 LC 및/또는 IDC로 분화시키는 것에 관한 것인데 (그들의 분화를 증진시키는 조건 하에 선행 성장시키지 않으면서, 그리고 특히 외인성 사이토킨을 수반하여 선행 성장시키지 않으면서 수행한다), 그들의 배양은 본질적으로 외인성 사이토킨의 실재적 부가 없이, 즉 배지에 존재하는 세포에 의해 합성된 내인성 사이토킨 이외에 어떠한 사이토킨도 부가하지 않으면서 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명은 특히,
- CD14+ 단구를 특히 인간의 순환계 혈액으로부터 수집하는 단계;
- CD14+ 단구를 DC로 분화시키는 것을 증진시키지 않는 조건 하에 CD14+ 단구를 유지시키는 단계;
- CD14+ 단구를 LC, 또는 IDC, 또는 LC 및 IDC로 분화시키는 것을 증진시키지 않는 조건 하에, 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 섬유아세포를 포함하는 세포 환경 하에 CD14+ 단구를 접촉시켜 두는 단계
를 포함하는, CD14+ 단구를 LC 및/또는 IDC로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
CD14+ 단구를 DC로 분화시키는 것을 증진시키지 않는 조건 하에 CD14+ 단구를 유지시키는 단계는, 특히 CD14+ 단구를 순환계 혈액으로부터 수집한 후 즉시 또는 심지어 직접적으로 CD14+ 단구를 유포시키기 위하여 시간상 제한을 두는 것이 바람직하다.
유리하게, CD14+ 단구를 DC로 분화시키는 것을 증진시키지 않는 조건은 어떠한 외인성 사이토킨도 포함하지 않는 배양 조건 하에 수득된다. 여기서의 목적은 특히, CD14+ 단구가 DC 분화 경로에 관여하지 않는 것이다.
본 발명을 이용하여, 전구체/세포 수의 증가를 획득하는 것이 특히 가능한데, 이는 특정 수준의 세포 사망률을 수반하는 CD14+ 단구의 선행 성장을 피하게 해주기 때문이다.
시험관 내에서 생성된 DC는 극히 민감하고 부서지기 쉬운 세포이다. 검사해야할 제1 파라미터는 수득된 세포의 수득량이다. DC의 손실량 및/또는 세포 사망률은 후자가 모든 세포 배양 모델에 나타난 경우에는 유의적이란 사실은 명백하지만, 정량 가능하지는 않다. DC의 전구체로서의 본 발명에 따르는 CD14+ 단구의 용도는 이러한 문제점을 제거시키므로, 세포에서 보다 우수한 수득량을 허용해준다.
본 발명을 이용하여, 시간상 이득을 획득하는 것이 특히 가능해지는데, 이는 단구를 LC 또는 IDC로 분화시키기 위해서는 6일 동안 배양해야하기 때문이다.
본 발명을 이용하여, 시약상 이득을 획득하는 것이 특히 가능해지는데, 이는 바람직하게 외인성 사이토킨이 전혀 사용되지 않기 때문이다.
본 발명을 이용하여, 생성된 세포의 질적인 이득을 획득하는 것이 특히 가능해진다. DC를 단구로부터 시험관내 생성시키는 것은 사이토킨인 면역 가용성 매개인자의 효과 하에 세포 분화기와 관계가 있다. 최근 문헌 [참고: Nicolas BECHETOILLE et al., Journal of Leukocytes Biology: Mixed Langerhans cell and interstitial/dermal dendritic cell subsets emanating from monocytes in Th2 -mediated inflammatory conditions respond differently to pro-inflammatory stimuli]에는 단구로부터 유래된 LC 및 DDC 유형의 DC가 그들의 세포 분화 과정에 있어서 "동시성"이 아닌 것으로 기재되었다. 달리 말하면, 분화를 개시한 CD14+ 단구는 모두가 동일한 분화 단계를 갖지는 않는 LC 및 DCC를 생성시킨다. 이러한 결함은 상기 분화 단계를 피함으로써 없앨 수 있다. 본 발명에서 성장된 단구는 DC의 분화를 위한 보다 생리학적 환경을 형성하는 세포 재구축의 매트릭스 환경, 세포 및 사이토킨에 의해 영향을 받는다.
시험관 내에서 생성된 DC는 자발적으로 "성숙"할 수 있는 능력을 지니고 있는 것으로 널리 공지되어 있는데, 이러한 능력은 성숙한 DC가 더 이상 활성화되고 자극될 수 없기 때문에 주요 문제점이 된다. 본 발명자들이 시험관 내에서 이들 세포의 미성숙 조건을 제어하긴 하지만, 시험관 내에서 자발적 성숙 위험은 단구를 LC 및 DCC의 전구체로서 직접 사용함으로써 없앨 수 있다. 또한, CD14+ 단구를 DC로 분화시키기 위한 시스템으로서의 본 발명에 따르는 세포 또는 조직 배양 모델의 유리한 용도는 보다 생리학적인데, 이는 DC를 피부 및 점막에서 분화시키기 위한 천연 조건을 보다 우수하게 재생시키고, 이로써 생체 내에서 그들의 동족체에 필적하는 미성숙 DC가 수득될 수 있기 때문이다.
이와 동일한 맥락에서, 앞서 생성된 DC의 용도와는 반대로, DC의 전구체로서 CD14+ 단구를 사용함으로써 본 발명의 모델에서 표현형별적으로 성장시키기 위하여 보다 미성숙하고 기능적으로 보다 민감한 LC 및 DCC를 생성시키는 것이 가능하다. 실제로 및 이러한 맥락에서, 본 발명자들은 최근에, CD34+ 전구 세포로부터 유래된 다음 외인성 사이토킨의 존재 하에 재구축된 융모막에서 성장시킨 DC가, 외인성 사이토킨의 존재 하에서 성장시킨 그의 동족체 보다, HIV 바이러스 복제 측면에서 더 만족할 만한 미성숙 상태를 지니고 있다는 사실을 입증하였다 [참고; Sandy DUMONT et al., When integrated in a subepithelial mucosal layer equivalent, dendritic cells keep their immature stage and their ability to replicate type R5 HIV-1 strains in absence of T cell subsets. AIDS Res. and Hum. Retroviruses 20: 383-397, 2004]. 이로써 수득된 DC는 기존에 언급된, 특히 프랑스 특허 (FR) 제2 833 271B1호 (2001년 12월 10일자로 Coletica에 의해 출원됨)에 언급된 것과는 극히 상이하다.
추가로, CD14+ 단구를 피부 DC의 전구체로서 직접 사용하는 것은 기존에 보고된 공정과 비교해서 보다 생리학적인 공정이다. 실제로, 유기체의 생체 내에서 혈액 단구는 피부에 집락 형성하는데, 여기서는 세포, 사이토킨 및 매트릭스 환경이 그들의 분화를 제어한다. 본 발명의 배양 모델에서 사전에 분화된 DC의 통합은 오늘날 CD14+ 단구인 그들의 전구체를 직접 사용하는 것 보다는 덜 만족스러운 흥 미로운 대체 방안이었다. 이러한 시스템 개선은 본 발명의 3차원적 배양 모델에서 LC 및 DCC의 보다 균질한 세포 분포도로써 면역조직학적으로 표현된다.
본 발명을 이용하여, 본 발명의 모델에 사용하기 전에 신선하게 단리된 단구를 동결시키는 것이 특히 가능해진다.
본 발명을 이용하여, 그의 생체내 동족체와 실질적으로 동일한 표현형을 갖고 있고 동일한 기능을 나타내는 세포를 생성시키는 것이 가능해진다.
본 발명은 특히, 공동-배양한 경우에
- 상피 환경 하에서, DC로 표현형별 및/또는 기능적으로 분화되는 독특한 세포 전구체,
- 접속(conjunctive) 환경 하에서, IDC, 대식 세포 및 내피 세포로 표현형별 및/또는 기능적으로 분화되는 독특한 세포 전구체
에 관한 것이다.
따라서, 제1 국면에 따르는 본 발명은 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함하는 세포 환경의 존재 하에 CD14+ 단구를 놓아둠으로써 CD14+ 단구를 LC로 분화시키거나, IDC로 분화시키거나 또는 LC 및 IDC로 분화시키는 것을 포함하는, 생물, 특히 인간의 말초 순환계 혈액으로부터 유래되는 CD14+ 단구로부터 LC, 또는 IDC, 또는 LC 및 IDC를 제조하는 방법에 관한 것이다.
유리하게는, CD14+ 단구를 분화시킴으로써 IDC 및 대식 세포 및 내피 세포, 또는 LC, IDC, 대식 세포 및 내피 세포를 수득할 수 있다. 유리하게는, LC 및 IDC 세포 집단의 분포도는 단구와 연합해서 성장하는 세포 유형의 함수이다. 각질 세포를 사용하는 것은 LC로의 분화를 증진시켜 주고, 섬유아세포를 사용하는 것은 IDC로의 분화를 증진시켜 준다.
유리하게는, 어떠한 외인성 사이토킨도 실재적으로 부가하지 않고서도 단구의 분화를 수행한다. 한 양태에 따르면, 외인성 사이토킨을 전혀 부가하지 않는다.
유리하게는, 단구를 상피 세포 환경, 예를 들어 각질 세포와 함께 성장시키는 것은 단구를 미성숙 및 기능적 LC로 분화시키는 것을 증진시켜 준다. 본 발명에서 "미성숙"이란 특히, 활성화 표지 (CD80, CD86, CCR7) 및 성숙 표지 (CD83, DC-LAMP)를 전혀 발현하지 않거나 극히 약간만 발현한다는 것을 의미한다. 한편, 미성숙 LC는 CCR6을 발현한다.
본 발명에서 "기능적"이란 특히, 항원 내재화 능력 (미성숙 상태), 세포 이동 능력 (미성숙 및 활성화 상태) 및 항원 제시 능력 (성숙한 상태)을 갖춘 것을 의미한다.
한 양태에 따르면, 단구를 진피 섬유아세포와 같은 중간엽 세포 환경 하에 배양하는 것은 단구를 미성숙 및 기능적 IDC로 분화시키는 것을 증진시켜 준다. 상기 정의를 참고할 수 있지만, 미성숙 IDC는 CCR6을 발현하지 않는다.
유리하게, 단구를 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함하는 세포 환경 하에 배양하는 것은 단구를 전형적인 LC 및 IDC로 분화시키는 것을 증진시켜 준다. 본 발명에서 "전형적"이란 미성숙 표현형과 기능성, 즉 자극, 스트레스 후 반응할 수 있는 능력 측면에서 생체내에서 그의 동족체와 유사한 것을 의미한다.
CD14+ 단구와 비교해서, (분화를 위한) 배양에 사용된 상피 세포 및/또는 중간엽 세포의 비율은 수득하고자 하는 LC 및/또는 IDC와 상피 세포 및/또는 중간엽 세포 간의 세포 분포도에 좌우된다.
제2 국면에 따르는 본 발명은 CD14+ 단구를 상피 세포, 예를 들어 각질 세포 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포의 존재 하에 성장시킴으로써, 생물, 특히 인간의 말초 순환계 혈액으로부터 유래되는 CD14+ 단구의 세포 또는 조직 모델 (이러한 세포 또는 조직 모델은 상피 세포, 예를 들어 각질 세포 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함한다) 내로 통합시켜 이러한 모델 내에서의 CD14+ 단구를 LC로 분화시키거나, IDC로 분화시키거나 또는 LC 및 IDC로 분화시키는 것을 포함하는, CD14+ 단구를 성장시키는 방법에 관한 것이다.
유리하게는, 단구의 성장을 어떠한 외인성 사이토킨의 부가 없이도 수행한다.
유리하게는, 세포 또는 조직 모델이 표피 모델, 상피 모델, 진피 모델, 융모막 모델, 피부 모델 또는 점막 모델, 특히 잇몸 또는 질 점막 모델로 이루어진 군 중에서 선택된다.
유리하게는, 3차원적 배양 모델이
- 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 또는 피브린에 의거한 젤 또는 필름,
- 하나 이상의 글리코사미노글리칸 및/또는 임의로 키토산을 함유할 수 있는 콜라겐으로부터 만든 다공성 매트릭스 (이러한 다공성 매트릭스는 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 통합하거나 통합하지 않은 것이다),
- 반-투과성 합성 막, 특히 반-투과성 니트로셀룰로스 막, 반-투과성 나일론 막, 폴리테트라플루오로에틸렌 (Teflon®, PTFE) 막 또는 스폰지, 반-투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막, 산화알루미늄의 모세관 다공성 구조를 지닌 무기 막 [반-투과성 아노포어 (Anopore) 막], 반-투과성 폴리에스테르 막으로 이루어진 군 중에서 선택된 불활성 지지체 (이러한 불활성 지지체는 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 함유하거나 함유하지 않는다),
- 폴리카보네이트 또는 폴리스티렌에 의거한 배양을 위해 처리된 불활성 지지체 (이러한 불활성 지지체는 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 함유하거나 함유하지 않는다)
로 이루어진 군 중에서 선택된 진피 또는 융모막 매트릭스 지지체를 포함한다.
유리하게는, 사용된 조직 모델이 상피 세포, 특히 각질 세포를 표면에 침착시킨 상기 진피 또는 융모막 지지체를 포함한다.
유리하게는, 세포 또는 조직 모델이 한 가지 이상의 부가의 세포 유형, 예를 들어 신경 세포 및/또는 내피 세포 및/또는 멜라닌 세포 및/또는 림프구 및/또는 지방 세포 및/또는 피부 부속물, 예를 들어 털, 모발, 피지선을 포함한다.
유리하게는, 특히 CD14+ 단구를 적어도 중간엽 세포를 포함하는 세포 또는 조직 모델에 주입하는 경우에, 이러한 CD14+ 단구의 일부가 내피 세포 및 대식 세포로 분화된다.
유리하게는, 상기 방법이 주로, LC, 또는 IDC, 또는 LC와 IDC의 혼합물, 또는 LC, IDC, 내피 세포 및 대식 세포의 혼합물, 또는 IDC, 내피 세포 및 대식 세포의 혼합물을 포함한다.
유리하게는, 세포 또는 조직 모델이 상피 부분과 접속 매트릭스를 포함하고, LC가 본질적으로 상피 부분에 국재된다는 것을 특징으로 하고, IDC, 대식 세포 및 내피 세포가 본질적으로 접속 매트릭스에 국재된다는 것을 특징으로 한다.
제3 국면에 따르는 본 발명은 상기 LC 및/또는 IDC 집단 중의 하나 이상을 포함하고, 추가로 앞서 정의된 바와 같은 방법에 따라서 수득될 수 있는 대식 세포 및/또는 내피 세포 집단을 임의로 포함하는 세포 모델에 관한 것이다.
이러한 모델은 수득된 DC가 앞서 기재된 방법에 따라서 수득된 것과는 상이하다는 것을 특징으로 하는데, 주요 차이는 LC 및 IDC에 대한 세포 분화 단계의 동시성에 관한 것이다.
제4 국면에 따르는 본 발명은 상기 LC 및/또는 IDC 집단 중의 하나 이상을 포함하고, 추가로 앞서 정의된 바와 같은 방법에 따라서 수득될 수 있는 대식 세포 및/또는 내피 세포 집단을 임의로 포함하는 조직 모델에 관한 것인데, 이러한 조직 모델은 표피 모델, 상피 모델, 진피 모델, 융모막 모델, 피부 모델 또는 점막 모델, 특히 잇몸 또는 질 점막 모델로 이루어진 군 중에서 선택된다.
유리하게는, 상기 언급된 세포 또는 조직 모델이 면역적격하다.
유리하게는, 조직 모델이 상피 세포 (예: 각질 세포)를 포함하는 상피 부분과 중간엽 세포 (예: 진피 또는 융모막 섬유아세포)를 포함하는 접속 매트릭스를 포함하는데, 이러한 모델은 LC가 본질적으로 상피 부분에 국재된다는 것을 특징으로 하고, 존재하는 IDC 및 대식 세포 및/또는 내피 세포가 본질적으로 접속 매트릭스에 국재된다는 것을 특징으로 한다.
이러한 모델은 수득된 DC가 앞서 기재된 방법에 따라서 수득된 것과는 상이하다는 것을 특징으로 하는데, 주요 차이는 본 발명의 3차원적 배양 모델에서 LC 및 DCC의 보다 균질한 세포 분포도에 관한 것이다.
제5 국면에 따르는 본 발명은 생물, 특히 인간의 말초 순환계 혈액으로부터 단리된, 동결시킨 CD14+ 단구에 관한 것이다.
특히 본 발명을 이용하여, 상이한 DC 집단을 생성시킬 수 있는데, 그의 상이한 기능성으로 인해, 유기체의 방어/감염 과정에 관여한 현상, 예를 들어 자극, 알레르기 유발성 및 감작 현상 전부를 예기할 수 있다.
따라서, 제6 국면에 따르는 본 발명은 화장품, 피부-약학 또는 약학 분야에서 연구 조사용 모델로서 및/또는 활성 성분 선별을 위한, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 조직 모델의 용도에 관한 것이다.
LC 및/또는 IDC의 또 다른 흥미로운 용도는 신규 분자의 자극성 대 감작 효력을 평가하기 위해 이들을 사용하는 것으로 이루어진다. 2005년 이래로 미용상 완제품의 독성을 평가하기 위해 동물을 사용하는 것을 금기시하고 있는 유럽 지침 2003/15/EC은 신규 분자의 감작 효력을 예측하기 위한 시험관내 또는 컴퓨터 내에서의 예측 방법을 개발할 수 있는 공공의 산업 실험실 설립을 강력히 역설하고 있다. 이러한 맥락에서, 접촉성 알레르기를 촉발시키는 데에 있어서의 피부 DC의 중요한 역할 때문에, 이러한 피부 DC를 동물 실험에 대한 대체 방법으로서 사용하는 것이 오늘날 개발의 주축을 이룬다.
제7 국면에 따르는 본 발명은 유기체의 방어/감염 과정에서 발생하는 현상 및 활성 성분의 활성, 특히 면역자극 또는 면역억제 활성을 연구 조사하기 위한, 또는 상기 활성 성분에 의한 면역조정 (면역관용 또는 면역활성화)을 평가하거나 이러한 면역조정을 유도시키기 위한, 또는 외부 작용제의 알레르기 유발/자극/감작 효력을 예측하기 위한 시험관내 시험을 수행하기 위한, 또는 분자 또는 화학물질의 독성을 연구 조사하기 위한, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 조직 모델의 용도에 관한 것이다.
제8 국면에 따르는 본 발명은 상피 장벽의 생리병리 현상; 피부 및 점막의 자극; 생물학적 종류, 예를 들어 바이러스, 레트로바이러스 (예: HIV), 세균, 진균, 미생물, 입자 항원의 침습성; 광독성; 광보호; 활성 성분, 특히 화장품 또는 제약 성분의 효과; 완제품, 특히 화장품 또는 의약품의 효과; 분자 또는 화학물질의 효과; 병원체에 의한 감염 기전을 연구 조사하기 위한, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 조직 모델의 용도에 관한 것이다.
유리하게, 본 발명은 활성 성분 또는 기타 물질의 독성을 연구 조사하는 것에 관한 것이다. 특히, 이러한 연구 조사는 특히 DC를 포함한 세포 표지를 연구함으로써 수행한다.
제9 국면에 따르는 본 발명은 HIV와 같은 레트로바이러스를 포함한 바이러스의 바이러스성 감염, 복제 및 전파 현상에 관여한 기전을 연구 조사하기 위한, 또는 백신 또는 약물 투여를 포함한 대체 치료 방법을 연구 조사하고 개발하기 위한, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 조직 모델의 용도에 관한 것이다.
제10 국면에 따르는 본 발명은 병원체, 예를 들어 바이러스, 레트로바이러스 (예: HIV), 세균, 진균, 미생물, 입자 항원의 존재를 탐지하기 위한, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 조직 모델의 용도에 관한 것이다.
제11 국면에 따르는 본 발명은 특히 예방적 또는 치료적 목적으로, 특히 물리적 유형, 예를 들어 자외선, 화학적 유형, 예를 들어 자극/알레르기 유발/감작제, 생물학적 유형의 환경학적 공격에 따른 결과로서, 의학적, 생물의학적 또는 화장품에 적용하기 위한, 특히 시험관내 또는 생체 내에서 면역 또는 관용 반응을 조정하기 위한, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 조직 모델의 용도에 관한 것이다.
제12 국면에 따르는 본 발명은 세포 또는 조직 공학 적용하기 위한; 또는 예를 들어, 면역 반응을 자극할 수 있는 DC 주사에 의한 항암 세포 요법에서, 예를 들어 면역관용 자극을 창출시킴으로써, 예를 들면 아네르기성 (anergic) T 세포를 생성시킴으로써 자가면역 질환 경우의 세포 요법에서, 예를 들어 면역계에 영향을 미치는 질병의 유전자 요법에서 의학적 또는 생물의학적 적용하기 위한; 또는 백신을 개발 및 제조하기 위한, 앞서 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 또는 조직 모델의 용도에 관한 것이다.
제13 국면에 따르는 본 발명은
- 생물의 말초 순환계 혈액으로부터 CD14+ 단구를 단리시키는 단계;
- 피부 또는 점막 세포를 지지체 상에 유포시키고, 이들을 영양 배지에서 배양하여 재구축된 조직을 수득하는 단계;
- 이와 같이 재구축된 조직에 CD14+ 단구를 피부 또는 점막 세포와 동시에 유포시키거나 동시에 유포시키지 않는 단계;
- CD14+ 단구 및 피부 또는 점막 세포를 포함하는 재구축된 조직을, CD14+ 단구를 LC로 분화시키거나, IDC, 내피 세포 및 대식 세포의 혼합물로 분화시키거나, 또는 LC, IDC, 내피 세포 및 대식 세포의 혼합물로 분화시킬 수 있게 해주는 조건 하에 성장시키는 단계
를 포함하는 (상기 피부 세포는 재구축된 조직이 표피 모델인 경우에는 표피 각질 세포이고, 피부 세포는 재구축된 조직이 진피 모델인 경우에는 진피 섬유아세포이며, 점막 세포는 재구축된 조직이 상피 모델인 경우에는 상피 점막 세포이고, 점막 세포는 재구축된 조직이 융모막 모델인 경우에는 점막 섬유아세포이다), 조직 모델을 제조하는 방법에 관한 것이다.
상피 세포는, 예를 들어 하나 이상의 피부 조직으로부터 단리된다.
피부 또는 점막 세포를 유포하는 것은 CD14+ 단구를 유포하기 전에 또는 유포한 후에 수행할 수 있다.
바람직하게는, CD14+ 단구의 유포를 피부 또는 점막 세포의 유포와 동시에 수행한다.
제14 국면에 따르는 본 발명은
- IDC 및 임의로 내피 세포 및 대식 세포를 포함하는 진피 또는 융모막 모델의 표면에서, 가능하게는 메르켈 (Merkel) 세포 및/또는 멜라닌 세포의 존재 하에 각질 세포 또는 상피 점막 세포를 영양 배지에 유포하여 성장시키는 단계 (상기 진피 또는 융모막 모델은 상기 정의된 바와 같은 진피 또는 융모막 모델을 제조하는 방법에 의해 수득될 수 있다); 및
- CD14+ 단구를 LC로 분화시킬 수 있게 해주는 조건 하에 각질 세포 또는 상피 점막 세포의 존재 하에 생물의 말초 순환계 혈액으로부터 단리된 CD14+ 단구를, 각질 세포 또는 상피 점막 세포와 동시에 또는 그렇치 않게 유포하여 성장시키는 단계
를 포함하는, 임의로 메르켈 세포 및/또는 멜라닌 세포의 존재 하에 각질 세포 또는 상피 점막 세포를 포함하는 상피 부분과, 진피 또는 점막 섬유아세포를 포함하는 접속 매트릭스를 포함하는 재구축된 점막 또는 재구축된 피부를 제조하는 방법에 관한 것이다.
유리하게는, 세포가 인간의 세포이다. 바람직하게는, 조직 모델을 제조하는 상기 방법이 외인성 사이토킨의 어떠한 부가도 포함하지 않는다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 이점은 단지 예시적이고 그로써 본 발명의 범위를 제한하지 않는 실시예를 참고로 하는 설명서를 당업자가 판독한 후에 명백해질 것이다.
실시예는 본 발명의 통합 부분이고, 실시예를 포함한 전체로서 취한 설명으로부터 선생 기술 부분과 비교해서 비교적 신규한 것으로 여겨지는 모든 특징이 그의 기능 및 일반성 측면에서 본 발명의 통합 부분이다.
따라서, 각 실시예는 일반적 범위를 갖는다.
한편, 실시예에서 모든 비율은 달리 언급되지 않는 한 중량을 기준한 것이고, 온도는 달리 언급되지 않는 한 ℃이며, 압력은 달리 언급되지 않는 한 대기압이다.
실시예 1: 말초 순환계 혈액으로부터 단구를 분리시키는 방법
1명 이상의 인간 공여자 상의 정맥혈을, 바람직하게 통상적인 항응고제, 예를 들어 리튬 헤파린이 보충된 진공 채혈관 또는 봉지에 샘플링함으로써, 말초 순환계 혈액을 수거하였다.
단구를 순환계 혈액으로부터 분리시키는 것은 다음 프로토콜에 따라서 수행하는 것이 유리할 수 있다:
1. 혈액을 림프구 분리 배지 상에서 원심분리시킨 후에, 단핵화 세포를 회수한 다음,
- 항체 칵테일, 예를 들어 항-CD3, 항-CD7, 항-CD16, 항-CD19, 항-CD56, 항-CD123 항체, 자기 비드와 커플링된 항-글리코포린 A로 표지시켰다. 자기화 칼럼 상으로 통과시킨 후, 표지되지 않은 단구 만을 용출시키고 회수하거나, 또는
- 자기 비드와 커플링된 단구의 특이적 항체, 예를 들어 항-CD14 항체로 표지시키고; 자기 칼럼 상으로 통과시킨 후, 표지된 단구 만을 칼럼에 보존시켰다. 칼럼으로부터 용출시킨 후, 표지된 단구를 회수하거나, 또는
- 플루오로크롬, 예를 들어 피코에리트린 (phycoerythrin)과 커플링된 단구의 특이적 항체, 예를 들어 항-CD16 항체로 표지시켰다. 유동 세포계수법으로 세포 분류한 후, 표지된 단구 만을 회수하였다.
2. 당업자에게 널리 공지된 모든 물리적 분리 방법을 이용하여 처리함으로써, 특히 침강 또는 원심분리함으로써 단구를 회수하고, 이를 그 자체로서 후속 배양을 위해 용출시켰다.
3. 100 ml의 샘플 혈액에 대해, 약 1억 5천만개 (±2천만개) 이하의 단핵화 세포를 추출하고, 4천만개 이하의 단구를 정제하였다.
실시예 2: 말초 순환계 혈액으로부터 단리된 단구를 동결시키는 방법
실시예 1에서 수득된 바와 같은 단구를 혈청 및 한랭보호제, 예를 들어 DMSO (디메틸 설폭시드)로 보충시킨 영양 배지, 예를 들어 RPMI 배지에 현탁시킨 다음,동결시켰다.
단구를 해동시키는 경우, 세포 사망률은 30% 미만이었다.
100 ml의 샘플 말초 순환계 혈액에 대해, 80.106개 이하의 단구를 동결시키고, 이를 해동시킨 후에 76.106개 이하의 단구를 회수하였다.
실시예 3: 공동 배양 중인 각질 세포 및 LC의 다세포성 단층 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
1 내지 2.106개 인간 각질 세포와 1 내지 2.106개 인간 단구 (실시예 1 또는 2에 따라서 수득됨)를, 예를 들어 K-SFM 유형의 영양 배지에서, 예를 들어 6-웰 판 유형의 배양 디쉬에서 함께 성장시켰다. 합한 배양물을, 예를 들어 K-SFM 유형의 영양 배지에서, 어떠한 외인성 사이토킨도 부가하지 않으면서 6일 동안 유지시켰다.
그 다음, 세포를 당업자에게 널리 공지된 효소적 방법에 의해, 특히 트립신 처리함으로써 회수하였다. 각질 세포와 단구로 이루어진 2.105개 세포의 혼합 세포 현탁물을 모노클로날 항-랑게린 항체와 함께 항온 배양한 다음, 유동 세포계수법으로 분석하였다. 본 발명자들은 40% 이하의 랑게린+ LC를 관찰하였다.
실시예 4: 공동 배양 중인 섬유아세포 및 DDC의 다세포성 단층 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
1 내지 2.106개 인간 섬유아세포와 1 내지 2.106개 인간 단구 (실시예 1 또는 2에 따라서 수득됨)를, 예를 들어 FBM 유형의 영양 배지에서, 예를 들어 6-웰 판 유형의 배양 디쉬에서 함께 성장시켰다. 합한 배양물을, 예를 들어 FBM 유형의 영양 배지에서, 어떠한 외인성 사이토킨도 부가하지 않으면서 6일 동안 유지시켰다.
그 다음, 세포를 당업자에게 널리 공지된 효소적 방법에 의해, 특히 트립신 처리함으로써 회수하였다. 섬유아세포와 단구로 이루어진 2.105개 세포의 혼합 세포 현탁물을 모노클로날 항-DC-SIGN 항체와 함께 항온 배양한 다음, 유동 세포계수법으로 분석하였다. 본 발명자들은 60% 이하의 DC-SIGN+ DCC를 관찰하였다.
실시예 5: 활성 성분의 영향 하에 분비된 사이토킨의 프로파일을 연구 조사하기 위한, 실시예 3 및 4에 기재된 단층 다세포성 모델의 용도
인간 피부에 사용하고자 하는 활성 성분의 자극, 감작, 알레르기 유발 효력을 평가하고, 그의 가능한 프로-염증성 또는 소염 활성을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 다음 프로토콜에 따라서, 배양 상등액 중에서 사이토킨, 예를 들어 IL-1, IL-6, IL-8, IL-1O, TNF-알파, INF-감마의 분비를 정량화하였다:
- 실시예 3 또는 4에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
- 그 다음, 레티놀을 3일 동안 0.05%의 최종 농도로 배양 배지에 가하였다.
- 이어서, 배양 상등액을 회수하고 분석하였다.
레티놀이 프로-염증성 사이토킨의 분비를 자극시키는 것으로 관찰되었다.
실시예 6: 활성 성분의 면역활성화 또는 면역억제 활성을 연구 조사하기 위한, 실시예 3 및 4에 기재된 다세포성 단층 모델의 용도
LC 및 DCC가 활성 성분에 대한 면역 및/또는 관용 반응을 유도시킬 수 있는 능력이 있는지 없는지를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 다음 프로토콜에 따라서, 유동 세포계수법에 의해 그들의 표현형 프로파일을 연구하였다:
- 실시예 3 또는 4에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
- 그 다음, 활성 성분을 3일 동안 각종 농도로 배양 배지에 가하였다.
- 이어서, 세포를 트립신 처리함으로써 회수하였다. 각질 세포와 LC 또는 섬유아세포와 DCC로 이루어진 2.105개 세포의 혼합 세포 현탁물을 다음 한 벌의 항체 기구에서 항온 배양하였다: 항-CCR7, 항-HLA-DR, 항-CD80, 항-CD83, 항-CD86, 항-DC-LAMP.
세포 표현형별 검사를 이용하여, 시험된 활성 성분의 면역활성화 프로파일 (표지된 분자의 발현 유도 및/또는 증가) 또는 면역억제 프로파일 (표지된 분자의 발현 억제 및/또는 저해)를 확립시킬 수 있다.
실시예 7: 활성 성분의 면역조정 활성을 연구 조사하기 위한, 실시예 3 및 4에 기재된 다세포성 단층 모델의 용도
자극, 감작 또는 알레르기 유발 스트레스 후 활성 성분의 면역조정 효과를 다음 프로토콜에 따라서 연구 조사하였다:
- 실시예 3 또는 4에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
- 그 다음, 300 ㎕의 TNP (2,4,6-트리니트로벤젠-설폰산)을 37℃ 하에 30분 동안 5 mM의 농도로 가하였다.
- 이러한 자극 후, 각종 농도로 시험된 활성 성분을 2일 동안 배양 배지에 가하였다.
- 면역 사이토킨, 예를 들어 IL-12의 분비를 연구 조사하기 위하여, 세포를 포함하는 배양 배지를 회수하였고; 상기 세포를 회수한 다음, 항-랑게린 항체와 함 께 또는 항-DC-SIGN 항체와 함께 항온 배양하여 유동 세포계수법으로 LC 또는 DCC를 각각 분류하였다.
- 그 다음, 이와 같이 분류된 LC 또는 DCC를 보이덴 (Boyden) 유형의 이동 챔버 (MATRIGEL™으로 덮거나 덮지 않은 5 내지 8 ㎛의 막 다공성)에 유포시킨 다음, 37℃ 하에 72시간 이하 동안 항온 배양하였다.
- 이동된 LC 또는 DCC의 수를, 예를 들어 광학 현미경에서 계수함으로써 정량화하였다.
이동 및/또는 IL-12 합성 및 분비 시험 결과로 인해, 시험된 활성 성분의 면역조정 프로파일을 확립시킬 수 있었다.
실시예 8: LC를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 표피 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 정상 인간 피부의 0.5 내지 1.106개 각질 세포를 보이덴 챔버 유형 (다공성 0.4 ㎛을 지닌 막)의 삽입물에 유포시킨 다음, 송아지 혈청, 아스코르브산 및 바람직하게, 최종 농도 1 mM의 EGF (표피 성장 인자) 및 바람직하게 최종 농도 10 ng/ml, 히드로코르티손 및 바람직하게 최종 농도 0.4 ㎍/ml, 우물린 (umulin) 및 바람직하게 최종 농도 0.12 IU/ml, 이수프렐 (isuprel) 및 바람직하게 최종 농도 0.4 ㎍/ml, 트리요오도티로닌 (triiodothyronine) 및 바람직하게 최종 농도 2.10-9 M, 아데닌 및 바람직하게 최종 농도 24.3 ㎍/ml, 노르모신 (normocin) 및 바람직하 게 최종 농도 100 ㎍/ml으로 보충시킨, 예를 들어 DMEM-글루타맥스 유형의 영양 배지에서 2일 동안 성장시켰다.
- 그 다음, 1 내지 5.104개 단구를 상피 등가물의 표면에 유포시키고, 2일의 추가 기간 동안 성장시켰다.
- 이어서, 상기 배양물을 송아지 혈청, 히드로코르티손, 우물린, 이수프렐 및 트리요오도티로닌을 제외한, 침지 배양을 위해 사용된 바와 동일한 배지에서 10일의 추가 기간 동안 공기-액체 계면에 놓아두었다.
- 이어서, 배양물을 무정형 수지 (예를 들어, Tissue-Teck®)에 포매시키고, 액체 질소에서 직접 동결시켰다.
- 그 다음, 면역조직화학적 연구 조사를 조직학적 박편 상에서 수행하여 특이적 항체를 통하여 세포 유형을 성상 확인하였다.
- 수행된 표지화는 LC (랑게린+ 세포)의 존재를 나타내었다.
결론
재구축된 표피 모델 내로 통합된 단구는 렉틴, 랑게린의 관찰로써 입증된 바와 같이 LC 유형의 DC로 분화되었다.
실시예 9: LC를 함유하는 3차원적 다세포성 색소침착 및/또는 신경 재구축된 표피 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
정상적인 인간 피부로부터 유래되는 0.5 내지 1.105개 멜라닌 세포 및/또는 메르켈 세포를 각질 세포와 함께 동시에 유포시킴으로써, 실시예 8에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
실시예 8에 기재된 표지화 이외에도, 멜라닌을 탐지하기 위하여 멜라닌 세포 (HMB45) 및 DOPA 반응 표지화를 수행하였을 뿐만 아니라 메르켈 세포를 확인하기 위하여 항-케라틴 20 항체를 이용한 표지화를 수행하였다.
결론
색소침착 및/또는 신경 재구축된 표피 모델 내로 통합된 단구는 렉틴, 랑게린의 관찰로써 입증된 바와 같이 LC 유형의 DC로 분화되었다.
실시예 10: LC를 함유하는 잇몸 및 질 재구축된 점막의 3차원적 다세포성 상피 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음과 같은 변화를 수반하는, 실시예 8에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 정상 인간 각질 세포를 정상 인간 잇몸 및 질 점막의 상피 세포로 대체시켰다.
- 배양 배지 중의 혈청 비율은 1%였다.
- 성장은 배지 중에 침지시키면서 전적으로 수행하였다.
- 달성된 표지화는 LC (랑게린+ 세포)의 존재를 나타내었다.
결론
잇몸 및 질 재구축된 점막의 상피 모델 내로 통합된 단구는 렉틴, 랑게린의 관찰로써 입증된 바와 같이 LC 유형의 DC로 분화되었다.
실시예 11: 3차원적 다세포성 재구축된 피부 모델
본 모델은 재구축된 진피 배양물과 연관이 있는데, 이때 이 배양물 상에서 재구축된 표피의 부가 배양을 수행하였다.
재구축된 진피 모델은 다음 프로토콜에 따라서 만들었다:
- 정상 인간 피부의 0.5 내지 1.106개 섬유아세포를 디페닐-포스포릴 아지드와 가교 결합된 콜라겐을 기초로 한 매트릭스 기질 상에 유포시킨 다음, 10% 송아지 혈청, 아스코르브산 및 바람직하게 최종 농도 1 mM의 EGF (표피 성장 인자) 및 바람직하게 최종 농도 10 ng/ml, 노르모신 및 바람직하게 최종 농도 100 ㎍/ml으로 보충시킨, 예를 들어 DMEM-글루타맥스 유형의 영양 배지에서 14일 동안 성장시켰다.
재구축된 피부 모델은 다음 프로토콜에 따라서 만들었다:
- 0.5 내지 1.106개 정상 인간 각질 세포를 진피 등가물 상에 유포시킨 다음, 송아지 혈청, 아스코르브산 및 바람직하게 최종 농도 1 mM의 EGF (표피 성장 인자) 및 바람직하게 최종 농도 10 ng/ml, 히드로코르티손 및 바람직하게 최종 농도 0.4 ㎍/ml, 우물린 및 바람직하게 최종 농도 0.12 IU/ml, 이수프렐 및 바람직하게 최종 농도 0.4 ㎍/ml, 트리요오도티로닌 및 바람직하게 최종 농도 2.10-9 M, 아데닌 및 바람직하게 최종 농도 24.3 ㎍/ml, 노르모신 및 바람직하게 최종 농도 100 ㎍/ml으로 보충시킨, 예를 들어 DMEM-글루타맥스/햄 (Ham) F-12 (비 3/1 v/v)의 영 양 배지에서 성장시켰다. 성장은 침지 조건 하에 7일 동안 지속하였다.
이어서, 상기 배양물을 송아지 혈청, 히드로코르티손, 이수프렐, 트리요오도티로닌 및 우물린을 제외한, 침지 배양을 위해 사용된 바와 동일한 배지에서 14일 더 공기-액체 계면에 놓아두었다.
결론
본 발명자들은 시험관 내에서 표피와 진피인 피부의 양 세포 구획을 재구축할 수 있었다.
실시예 12: DCC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 진피 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
재구축된 진피를 성장시키는 것은 실시예 11에 따라서 수행하였다.
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 1 내지 5.104개 단구를 진피 등가물의 표면에 유포시키고, 7일의 추가 기간 동안 성장시켰다.
- 이어서, 배양물을 무정형 수지 (예를 들어, Tissue-Teck®)에 포매시키고, 액체 질소에서 직접 동결시켰다.
- 면역조직화학적 연구 조사를 조직학적 박편 상에서 수행하여 특이적 항체를 통하여 존재하는 세포 유형을 성상 확인하였다.
- 수행된 표지화는 DDC (DC-SIGN+ 세포), 대식 세포 (CD68+ 세포) 및 내피 세포 (CD31+ 및 CD36+ 세포)의 동시 존재를 나타내었다.
결론
본 발명자들의 재구축된 진피 모델에서 통합시킨 다음 성장시킨 단구는 DDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화될 수 있다.
실시예 13: IDC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 융모막 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음과 같은 변화를 수반한, 실시예 12에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 섬유아세포는 정상 인간 잇몸 및 질 점막으로부터 유래되는 섬유아세포이다.
- 수행된 표지화는 IDC (DC-SIGN+ 세포), 대식 세포 (CD68+ 세포) 및 내피 세포 (CD31+ 및 CD36+ 세포)의 동시 존재를 나타내었다.
결론
본 발명자들의 재구축된 잇몸 및 질 유형의 융모막 모델에서 통합시킨 다음 성장시킨 단구는 IDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화될 수 있다.
실시예 14: LC를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 피부 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
재구축된 피부 모델의 배양을 실시예 11에 따라서 수행하였다.
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 1 내지 5.104개 단구를 진피 등가물 상에 각질 세포와 함께 유포시켰다.
- 수행된 표지화는 배양물의 표피 구획 내에 LC (랑게린+ 세포 및 비르벡+ 과립)이 존재한다는 것을 나타내었다.
결론
본 발명자들의 재구축된 피부 모델에서 각질 세포와 함께 성장시킨 단구는 LC 유형의 DC로 분화되었다.
실시예 15: LC를 함유하는 3차원적 다세포성 색소침착 및/또는 신경 재구축된 피부 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
LC를 함유하는 재구축된 피부 모델을 성장시키는 것은 실시예 14에 따라서 수행하였다.
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 정상 인간 피부로부터 유래되는 1 내지 5.104개 멜라닌 세포 및/또는 메르켈 세포를 재구축된 진피 상에 각질 세포 및 단구와 함께 유포시켰다.
- 실시예 14에 기재된 표지화 이외에도, 멜라닌을 탐지하기 위하여 멜라닌 세포 (HMB45) 및 DOPA 반응 표지화를 수행하였을 뿐만 아니라 메르켈 세포를 확인하기 위하여 항-케라틴 20 항체를 이용한 표지화를 수행하였다.
결론
본 발명자들의 재구축된 피부 모델에서 각질 세포, 멜라닌 세포 및/또는 메르켈 세포와 함께 성장시킨 단구는 LC 유형의 DC로 분화되었다.
실시예 16: LC를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 점막 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음과 같은 변화를 수반한, 실시예 14에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 각질 세포를 정상 인간 잇몸 및 질 점막의 상피 세포로 대체시켰고, 섬유아세포는 정상 인간 잇몸 및 질 점막으로부터 유래되는 섬유아세포이다.
- 상피화 단계를 위한 배양 배지 중의 송아지 혈청 비율은 1%였다.
- 성장은 배지 중에 침지시키면서 전적으로 수행하였다.
- 수행된 표지화는 배양물의 상피 구획 내에 LC (랑게린+ 세포 및 비르벡+ 과립)이 존재한다는 것을 나타내었다.
결론
본 발명자들의 재구축된 점막 모델에서 잇몸 또는 질 유형의 상피 세포와 함께 성장시킨 단구는 LC 유형의 DC로 분화되었다.
실시예 17: DCC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 피부 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
재구축된 피부 모델을 성장시키는 것은 실시예 11에 따라서 수행하였다.
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 1 내지 5.104개 단구를 진피 등가물의 표면에 유포시키고, 7일의 추가 기간 동안 성장시켰다.
- 수행된 표지화는 DCC (DC-SIGN+ 세포), 대식 세포 (CD68+ 세포) 및 내피 세포 (CD31+ 및 CD36+ 세포)의 동시 존재를 나타내었다.
결론
재구축된 피부 모델의 진피 구획 내로 통합시킨 다음 성장시킨 단구는 DDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화되었다.
실시예 18: DCC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 3차원적 다세포성 색소침착 및/또는 신경 재구축된 피부 모델
정상적인 인간 피부로부터 유래되는 1 내지 5.105개 멜라닌 세포 및/또는 메르켈 세포를 각질 세포와 함께 동시에 유포시킴으로써, 실시예 17에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
실시예 17에 기재된 표지화 이외에도, 멜라닌을 탐지하기 위하여 멜라닌 세포 (HMB45) 및 DOPA 반응 표지화를 수행하였을 뿐만 아니라 메르켈 세포를 관찰하기 위하여 항-케라틴 20 항체를 이용한 표지화를 수행하였다.
결론
색소침착 및/또는 신경 재구축된 피부 모델의 진피 구획 내로 통합시킨 다음 성장시킨 단구는 DDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화되었다.
실시예 19: IDC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 재구축된 점막의 3차원 적 다세포성 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음과 같은 변화를 수반하는, 실시예 17에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- 각질 세포를 정상 인간 잇몸 및 질 점막의 상피 세포로 대체시켰고, 섬유아세포는 정상 인간 잇몸 및 질 점막으로부터 유래되는 섬유아세포이다.
- 상피화 단계를 위한 배양 배지 중의 송아지 혈청 비율은 1%였다.
- 성장은 배지 중에 침지시키면서 전적으로 수행하였다.
- 수행된 표지화는 IDC (DC-SIGN+ 세포), 대식 세포 (CD68+ 세포) 및 내피 세포 (CD31+ 및 CD36+ 세포)의 동시 존재를 나타내었다.
결론
잇몸 및 질 유형의 재구축된 점막 모델의 접속 구획 내로 통합시킨 다음 성장시킨 단구는 IDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화되었다.
실시예 20: LC, DCC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 피부 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- DCC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 재구축된 진피 모델은 실시예 12에 따라서 만들었다.
- LC를 함유하는 재구축된 피부 모델을 실시예 14에 따라서 만들었다.
- 수행된 표지화는 배양물의 표피 구획 내에 LC (랑게린+ 세포 및 비르벡+ 과립)이 존재하고, 배양물의 진피 구획 내에 DCC (DC-SIGN+ 세포), 대식 세포 (CD68+ 세포) 및 내피 세포 (CD31+ 및 CD36+ 세포)가 동시에 존재한다는 것을 나타내었다.
결론
진피 구획 내에서 연속적으로 성장시킨 다음, 재구축된 피부 모델에서 각질 세포와 함께 성장시킨 단구는 표피 구획에서는 LC 유형의 DC로 분화되었고, 진피 구획에서는 DDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화되었다.
실시예 21: LC, DCC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 3차원적 다세포성 색소침착 및/또는 신경 재구축된 피부 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- DCC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 재구축된 진피 모델은 실시예 12에 따라서 만들었다.
- LC를 함유하는 색소침착 및/또는 신경 재구축된 피부 모델은 실시예 15에 따라서 만들었다.
- 수행된 표지화는 배양물의 표피 구획 내에 LC (랑게린+ 세포 및 비르벡+ 과립)이 존재하고, 배양물의 진피 구획 내에 DCC (DC-SIGN+ 세포), 대식 세포 (CD68+ 세포) 및 내피 세포 (CD31+ 및 CD36+ 세포)가 동시에 존재한다는 것을 탐지하였다.
결론
진피 구획 내에서 연속적으로 성장시킨 다음, 색소침착 및/또는 신경 재구축된 피부 모델에서 각질 세포, 멜라닌 세포 및/또는 메르겔 세포와 함께 동시에 성장시킨 단구는 표피 구획에서는 LC 유형의 DC로 분화되었고, 진피 구획에서는 DDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화되었다.
실시예 22: LC, IDC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 3차원적 다세포성 재구축된 점막 모델
단구를 수득하였다 (실시예 1 또는 2 참고).
다음 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다:
- IDC, 대식 세포 및 내피 세포를 함유하는 재구축된 융모막 모델은 실시예 13에 따라서 만들었다.
- LC를 함유하는 재구축된 점막 모델은 실시예 16에 따라서 만들었다.
- 수행된 표지화는 배양물의 상피 구획 내에 LC (랑게린+ 세포 및 비르벡+ 과립)가 존재하고, 배양물의 접속 구획 내에 IDC (DC-SIGN+ 세포), 대식 세포 (CD68+ 세포) 및 내피 세포 (CD31+ 및 CD36+ 세포)가 동시에 존재한다는 것을 나타내었다.
결론
접속 구획 내에서 연속적으로 배양한 다음, 잇몸 및 질 유형의 재구축된 점막 모델에서 상피 세포와 함께 배양한 단구는 상피 구획에서는 LC 유형의 DC로 분화되었고, 접속 구획에서는 IDC 유형의 DC, 대식 세포 및 내피 세포로 동시에 분화 되었다.
실시예 23: 태양 자외선의 영향력을 연구 조사하기 위한, 실시예 20에 기재된 3차원적 다세포성 재구축된 피부 모델의 용도
각종 환경적 요인, 특히 태양 자외선의 영향력을 연구 조사하기 위하여, 본 발명자들은 다음 프로토콜에 따라서 면역조직화학적 연구 조사함으로써 재구축된 피부 모델에서 LC 및 DCC의 이동 및 표현형 프로파일을 평가하였다.
- 실시예 20에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
- 배양한지 42일 째에, 재구축된 피부에, 예를 들어 2 J/㎠의 UVA 및 0.5 J/㎠의 UVB (solar irradiator Suntest CPS+, ATLAS)에 상응하는 태양 에너지 526 kJ/㎠의 단일 용량을 조사하였다. 성장을 2일의 추가 기간 동안 지속시켰다.
- 이어서, 한 벌의 항체 기구 (항-CD1a, 항-CD80, 항-CD83, 항-CD86, 항-CCR7, 항-DC-LAMP, 항-DC-SIGN, 항-랑게린, 항-HLA-DR)를 이용하여 면역조직화학적 연구 조사를 수행하여 LC 및 DCC의 이동을 관찰하고 그들의 표현형 상태를 성상 확인하였다.
태양 자외선을 조사한 후, LC의 이동이 배양물의 진피 구획에서 관찰되었을 뿐만 아니라 Cl 및 DCC 상에서의 CCR7 수용체의 발현 획득이 관찰되었다. 추가로, 진피 구획 내로 이동한 LC 만이 성숙 표지 DC-LAMP를 발현하였다.
결론
따라서, 본 발명자들의 다세포성 모델은 이동, 활성화 및 성숙 능력을 지닌 LC 및 DCC를 표적화함으로써 자외선 스트레스의 전조가 된다.
실시예 24: 활성 성분의 효율을 연구 조사하기 위한, 실시예 20에 기재된 3차원적 다세포성 재구축된 피부 모델의 용도
인간 피부용으로 의도된 활성 성분의 소염 효력을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 다음 프로토콜에 따라서, 배양 상등액 중에서 프로-염증성 사이토킨, 예를 들어 IL-1, IL-6, IL-8, TNF-알파, INF-감마의 분비를 정량화하였다:
- 실시예 20에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
- 배양한지 42일 째에, 재구축된 피부에, 예를 들어 2 J/㎠의 UVA 및 0.5 J/㎠의 UVB (solar irradiator Suntest CPS+, ATLAS)에 상응하는 태양 에너지 526 kJ/㎠의 독특한 용량을 조사하였다.
- 연속해서, 3% 항산화제 활성 성분, 예를 들어 플라바그럼 (Flavagrum®) (Hesperitine Laurate, ENGELHARD) 및 플라벤저 (Flavenger®) (Quercitine Caprylate, ENGELHARD)를 함유하거나 함유하지 않는 8 ㎕의 미용 제형을 재구축된 피부 상에 10일 동안 적용하였다.
- 이러한 처리가 끝날 무렵, 재구축된 피부를 침지 배지 내에서 48시간의 추가 기간 동안 성장시킨 다음, 1. 세포 생육도를 분석하고 (메틸티아졸테트라졸륨 - MTT 시험), 2. 배양 상등액 중에서의 사이토킨 분비량을 유동 세포계수법 투여 (CBA - 세포계수 비드 어레이)함으로써, 항-산화제 처리 효율을 평가하였다.
본 발명의 방법을 이용하여, 태양 자외선 스트레스가 세포 생육도 저하를 유도시킬 뿐만 아니라 프로-염증성 인터루킨의 합성 증가를 유도시키는 지를 알아보는 것이 가능하였다. 따라서, 적당하게 선택된 활성 성분을 사용함으로써 세포 사망률 뿐만 아니라 프로-염증성 분자의 합성을 제한하는 것은 흥미로운 일이다. 스크리닝된 활성 성분 중에서 2가지, 즉 플라바그럼 및 플라벤저는 이들 파라미터 둘 다에 대한 기준 수준을 복구시킬 수 있는 경향을 지닌 효율을 나타내는 것으로 입증되었다.
실시예 25: 활성 성분의 면역자극 또는 면역억제 활성을 연구 조사하기 위한, 실시예 14, 17 및 20에 기재된 3차원적 다세포성 재구축된 피부 모델의 용도
LC 및/또는 DCC가 활성 성분에 대한 면역 및/또는 관용원성 반을을 유도시킬 수 있는지를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 다음 프로토콜에 따라서, 동종의 타고난 본래의 T 림프구의 증식을 자극할 수 있는 세포의 기능성을 연구 조사하였다.
- 실시예 14, 17 및 20에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
- 배양한지 42일 째에, 활성 성분을 면봉을 통하여 재구축된 피부 상에 직접 적용하거나 (국소 적용) 또는 활성 성분을 10일 동안 배양 배지 내로 도입하였다 (전신 적용).
- 이러한 처리가 끝날 무렵, 배양물은 트립신 (1 mg/ml) 및 콜라게나제 (1 mg/ml)를 이용하여 37℃ 하에 2시간 동안 효소적 처리함으로써 연속적으로 분해시켜 LC 및/또는 DCC를 회수하였다.
- LC 및/또는 DCC를 10% 인간 AB 혈청으로 보충시킨 RPMI 배양 배지에서 동종의 타고난 본래의 T 림프구와 함께 3일 동안 성장시켰다. 125개 내지 8,000개 세포의 LC 및/또는 DC의 범위가 달성되었고, 이를 105개 타고난 본래의 T 림프구와 함께 성장시켰다. 혼합 림프구 배양 3일 째에, 20 ㎕의 5 mCi 삼중수소화 티미딘을 18시간 동안 가하였다.
- 그 결과는 가로 좌표에 LC 및/또는 DCC의 수를 기록하고 세포 좌표에 동종의 타고난 본래의 T 림프구 내로의 삼중수소화 티미딘의 혼입량 [cpm (분당 계수치)로 표현됨]을 기록한 그래프 상에 나타내었다.
본 발명자들의 활성 X로 처리한 후, LC 및/또는 DCC는 타고난 본래의 T 림프구의 약한 증식 만을 유도시키는 처리시키지 않은 LC 및/또는 DCC (1.103 내지 4.103 cpm)와 비교해서 T 림프구의 증식을 강력하게 자극하였다 (5.104 내지 7.104 cpm).
실시예 26: 알레르기성 반응을 조정할 수 있는 활성 성분의 스크리닝을 수행하기 위한, 3차원적 다세포성 모델의 용도
자극, 감작 및 알레르기 유발 스트레를 유도시킨 후 활성 성분의 면역조정 효과를 다음 프로토콜에 따라서 연구 조사하였다:
- 실시예 12에 기재된 프로토콜에 따라서 본 모델을 만들었다.
- 배양 21일 후, 바람직하게 최종 농도 2%의 자극제 (나트륨 도데실 설페이트) 및 바람직하게 최종 농도 0.25%의 감작제 DNCB (1,4-클로로-디니트로벤젠)를 24시간 동안 배양 배지 내로 도입하였다.
- 그 다음, 최종 농도 3%의 진정 활성제를 함유하거나 함유하지 않는 100 ㎕의 미용 제형을 등가 진피의 배양 배지 내로 3일 동안 도입하였다.
- 이러한 처리가 끝날 무렵, 예를 들어 IL-10 및 IL-12를 투여하기 위하여 배양 상등액을 회수하고, 한 벌의 항체 기구: 항-CD80, 항-CD83, 항-CD86, 항-CCR7, 항-DC-LAMP, 항-HLA-DR를 이용하여 면역조직화학적 연구를 개발하였다.
면역조직화학에 의한 DCC의 표현형 연구 결과와 IL-10 및 IL-12 분비 결과를 이용하여, 시험된 활성 성분의 면역조정 프로파일을 확립할 수 있다.
결론
따라서, 본 발명자들의 다세포성 모델은 사이토킨 분비, 활성화 및 성숙 능력을 지닌 DCC를 스크리닝함으로써 활성 성분의 잠재적 면역조정 효과를 평가하는 것이 가능한 예측 도구이다.
Claims (29)
- CD14+ 단구를 랑게르한스 세포 (LC)로 분화시키거나, 간질성/진피 수지상 세포 (IDC)로 분화시키거나, 또는 LC 및 IDC로 분화시키기 위하여, CD14+ 단구를 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함하는 세포 환경의 존재 하에 놓아두는 단계를 포함하는, 생물, 특히 인간의 말초 순환계 혈액으로부터 유래되는 CD14+ 단구로부터 LC, 또는 IDC, 또는 LC 및 IDC를 제조하는 방법.
- 제1항에 있어서, CD14+ 단구를 IDC, 및 대식 세포 및/또는 내피 세포로 분화시키거나, 또는 LC, IDC, 대식 세포 및/또는 내피 세포로 분화시키기 위하여, CD14+ 단구를 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함하는 세포 환경의 존재 하에 놓아두는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, CD14+ 단구의 분화가 외인성 사이토킨의 어떠한 실재적 부가도 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 단구를 미성숙 및 기능성 LC로 분화시키는 것을 증진시키기 위하여, 단구를 상피 세포, 예를 들어 각질 세포를 포 함하는 세포 환경의 존재 하에 놓아두는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 단구를 미성숙 및 기능성 IDC로 분화시키는 것을 증진시키기 위하여, 단구를 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함하는 세포 환경의 존재 하에 놓아두는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 단구를 전형적인 LC 및 IDC로 분화시키는 것을 증진시키기 위하여, 단구를 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함하는 세포 환경의 존재 하에 놓아두는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- CD14+ 단구를 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포의 존재 하에 성장시킴으로써, 생물, 특히 인간의 말초 순환계 혈액으로부터 유래되는 CD14+ 단구를 세포 또는 조직 모델 (이러한 세포 또는 조직 모델은 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 진피 섬유아세포를 포함한다)에서 통합시켜, 이러한 모델 내에서 CD14+ 단구를 LC, 또는 IDC, 또는 LC 및 IDC로 분화시키는 단계를 포함하는, CD14+ 단구를 성장시키는 방법.
- 제7항에 있어서, CD14+ 단구를 성장시키는 것이 외인성 사이토킨의 어떠한 실재적 부가도 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 세포 또는 조직 모델이 표피 모델, 상피 모델, 진피 모델, 융모막 모델, 피부 모델 및 점막 모델로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 조직 배양 모델이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 진피 또는 융모막 매트릭스 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:- 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 또는 피브린에 의거한 젤 또는 필름,- 하나 이상의 글리코사미노글리칸 및/또는 임의로 키토산을 함유할 수 있는, 콜라겐으로부터 만든 다공성 매트릭스 (이러한 다공성 매트릭스는 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 통합하거나 통합하지 않은 것이다),- 반-투과성 합성 막, 특히 반-투과성 니트로셀룰로스 막, 반-투과성 나일론 막, 폴리테트라플루오로에틸렌 (Teflon®, PTFE) 막 또는 스폰지, 반-투과성 폴리카보네이트 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET) 막, 산화알루미늄의 모세관 다공 성 구조를 지닌 무기 막 [반-투과성 아노포어 (Anopore) 막], 셀룰로스 아세테이트 또는 에스테르 (HATF)의 모세관 다공성 구조를 지닌 무기 막, 반-투과성 바이오포어 (Biopore)-CM 막, 반-투과성 폴리에스테르 막으로 이루어진 군 중에서 선택된 불활성 지지체 (이러한 불활성 지지체는 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 함유하거나 함유하지 않는다),- 폴리카보네이트 또는 폴리스티렌에 의거한 배양을 위해 처리된 불활성 지지체 (이러한 불활성 지지체는 중간엽 세포, 특히 섬유아세포를 함유하거나 함유하지 않는다).
- 제10항에 있어서, 사용된 세포 또는 조직 모델이 상피 세포, 특히 각질 세포을 표면에 놓아둔 상기 진피 또는 융모막 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 세포 또는 조직 모델이 한 가지 이상의 부가의 세포 유형, 예를 들어 신경 세포 및/또는 메르켈 (Merkel) 세포, 및/또는 내피 세포 및/또는 대식 세포, 및/또는 멜라닌 세포 및/또는 림프구 및/또는 지방 세포 및/또는 피부 부속물, 예를 들어 털, 모발, 피지선을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 단구의 일부가 내피 세포 및/ 또는 대식 세포로 분화되도록 하기 위해 적어도 중간엽 세포를 포함하는 세포 또는 조직 모델에서 CD14+ 단구를 성장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제7항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 조직 모델이 상피 부분과 접속 매트릭스를 포함하고, LC는 본질적으로 상피 부분에 국재되며, IDC, 대식 세포 및/또는 내피 세포는 본질적으로 접속 매트릭스에 국재된다는 것을 특징으로 하는 방법.
- - CD14+ 단구를 순환계 혈액으로부터 수집하는 단계;- CD14+ 단구를 DC로 분화시키는 것을 증진시키지 않는 조건 하에 CD14+ 단구를 유지시키는 단계;- CD14+ 단구를 LC, 또는 IDC, 또는 LC 및 IDC로 분화시키는 것을 증진시키는 조건 하에, 상피 세포, 예를 들어 각질 세포, 및/또는 중간엽 세포, 예를 들어 섬유아세포를 포함하는 세포 환경의 존재 하에 CD14+ 단구를 놓아 두는 단계를 포함하는, CD14+ 단구를 LC 및/또는 IDC로 분화시키는 방법.
- 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 따라서 수득될 수 있는, LC 및/또는 IDC 집단 중의 하나 이상을 포함하고, 추가로 대식 세포 및/또는 내피 세포 집단을 임의로 포함하는 세포 모델.
- 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 방법에 따라서 수득될 수 있는, LC 및/또는 IDC 집단 중의 하나 이상을 포함하고, 추가로 대식 세포 및/또는 내피 세포 집단을 임의로 포함하며, 표피 모델, 상피 모델, 진피 모델, 융모막 모델, 피부 모델 및 점막 모델로 이루어진 군 중에서 선택되는 조직 모델.
- 제17항에 있어서, 상피 세포, 예를 들어 각질 세포를 포함하는 상피 부분과 중간엽 세포, 예를 들어 진피 또는 융모막 섬유아세포를 포함하는 접속 매트릭스를 포함하는 것을 특징으로 하고, LC는 본질적으로 상피 부분에 국재되며, 존재하는 IDC 및 대식 세포 및/또는 내피 세포는 본질적으로 접속 매트릭스에 국재된다는 것을 특징으로 하는 조직 모델.
- 생물, 특히 인간의 말초 순환계 혈액으로부터 단리된, 동결된 CD14+ 단구.
- 화장품, 피부-약학 또는 약학 분야에서 연구 조사용 모델로서, 및/또는 활성 성분 선별을 위한, 제16항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 모델, 또는 제17항 또는 제18항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조직 모델의 용도.
- 유기체의 방어/감염 과정에서 발생하는 현상 및 활성 성분의 활성, 특히 면역자극 또는 면역억제 활성을 연구 조사하기 위한, 또는 상기 활성 성분에 의한 면 역조정을 평가하거나 이러한 면역조정을 유도시키기 위한, 또는 외부 작용제의 알레르기 유발, 자극, 감작 효력을 예측하기 위한 시험관내 시험을 수행하기 위한, 또는 분자 또는 화학물질의 연구 조사, 특히 독성 연구 조사를 수행하기 위한, 제16항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 모델, 또는 제17항 또는 제18항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조직 모델의 용도.
- 상피 장벽의 생리병리 현상; 피부 및 점막의 자극; 생물학적 종류, 예를 들어 바이러스, 레트로바이러스 (예: HIV), 세균, 진균, 미생물, 입자 항원의 침습성; 광독성; 광보호 뿐만 아니라 활성 성분, 특히 화장품 또는 제약 성분의 효과; 완제품, 특히 화장품 또는 의약품의 효과; 병원체에 의한 감염 기전을 연구 조사하기 위한, 제16항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 모델, 및 제17항 또는 제18항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조직 모델의 용도.
- HIV와 같은 레트로바이러스를 포함한 바이러스의 감염, 복제 및 전파 현상에 관여하는 기전을 연구 조사하기 위한, 또는 백신 또는 약물 투여를 포함한 대체 치료 방법을 조사 또는 개발하기 위한, 제16항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 모델, 및/또는 제17항 또는 제18항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조직 모델의 용도.
- 병원체, 예를 들어 바이러스, 레트로바이러스 (예: HIV), 세균, 진균, 미생 물, 입자 항원의 존재를 탐지하기 위한, 제16항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 모델, 또는 제17항 또는 제18항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조직 모델의 용도.
- 특히 예방적 또는 치료적 목적으로, 특히 물리적 유형, 예를 들어 자외선, 화학적 유형, 예를 들어 자극/알레르기 유발/감작제, 생물학적 유형의 환경학적 공격에 따른 결과로서, 의학적, 생물의학적 또는 화장품에 적용하기 위한, 특히 시험관내 또는 생체 내에서 면역 또는 관용 반응을 조정하기 위한, 제16항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 모델, 또는 제17항 또는 제18항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조직 모델의 용도.
- 조직 및 세포 공학 적용하기 위한; 또는 예를 들어 면역 반응을 자극할 수 있는 DC 주사에 의한 항암 세포 요법에서, 예를 들어 면역관용 자극을 창출시킴으로써, 예를 들면 아네르기성 (anergic) T 세포를 생성시킴으로써 자가면역 질환 경우의 세포 요법에서, 예를 들어 면역계에 영향을 미치는 질병의 유전자 요법에서 의학적 또는 생물의학적 적용하기 위한; 또는 백신을 개발 및 제조하기 위한, 제16항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 세포 모델, 또는 제17항 또는 제18항에 정의된 바와 같은 하나 이상의 조직 모델의 용도.
- - 생물의 말초 순환계 혈액으로부터 CD14+ 단구를 단리시키는 단계;- 피부 또는 점막 세포를 지지체 상에 유포시키고, 이들을 영양 배지에서 성장시켜 재구축된 조직을 수득하는 단계;- 이와 같이 재구축된 조직에 CD14+ 단구를 피부 또는 점막 세포와 동시에 유포시키거나 동시에 유포시키지 않는 단계;- CD14+ 단구 및 피부 또는 점막 세포를 포함하는 재구축된 조직을, CD14+ 단구를 LC로 분화시키거나, IDC, 내피 세포 및 대식 세포의 혼합물로 분화시키거나, 또는 LC, IDC, 내피 세포 및 대식 세포의 혼합물로 분화시킬 수 있게 해주는 조건 하에 성장시키는 단계를 포함하는 (상기 피부 세포는 재구축된 조직이 표피 모델인 경우에는 표피 각질 세포이고, 피부 세포는 재구축된 조직이 진피 모델인 경우에는 진피 섬유아세포이며, 점막 세포는 재구축된 조직이 상피 모델인 경우에는 상피 점막 세포이고, 점막 세포는 재구축된 조직이 융모막 모델인 경우에는 점막 섬유아세포이다), 조직 모델을 제조하는 방법.
- - IDC 및 임의로 내피 세포 및/또는 대식 세포를 포함하는 진피 또는 융모막 모델의 표면에서, 임의로 메르켈 세포 및/또는 멜라닌 세포의 존재 하에 각질 세포 또는 상피 점막 세포를 영양 배지에 유포하여 성장시키는 단계 (상기 진피 또는 융모막 모델은 제27항에 정의된 바와 같은 진피 또는 융모막 모델을 제조하는 방법에 의해 수득될 수 있다); 및- CD14+ 단구를 LC로 분화시킬 수 있게 해주는 조건 하에 각질 세포 또는 상 피 점막 세포의 존재 하에 생물의 말초 순환계 혈액으로부터 단리된 CD14+ 단구를, 각질 세포 또는 상피 점막 세포와 동시에 또는 그렇치 않게 유포하여 성장시키는 단계를 포함하는, 각질 세포 또는 상피 점막 세포, 임의로 메르켈 세포 및/또는 멜라닌 세포를 포함하는 상피 부분과, 진피 또는 융모막 섬유아세포를 포함하는 접속 매트릭스를 포함하는 재구축된 피부 또는 재구축된 점막을 제조하는 방법.
- 제27항 또는 제28항에 있어서, 세포가 인간 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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