KR0156571B1 - 3차원 세포 및 조직 배양계 - Google Patents

3차원 세포 및 조직 배양계

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KR0156571B1
KR0156571B1 KR1019900700956A KR900700956A KR0156571B1 KR 0156571 B1 KR0156571 B1 KR 0156571B1 KR 1019900700956 A KR1019900700956 A KR 1019900700956A KR 900700956 A KR900700956 A KR 900700956A KR 0156571 B1 KR0156571 B1 KR 0156571B1
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론 코휀
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Abstract

내용없음

Description

[발명의 명칭]
3차원 세포 및 조직배양계
[도면의 간단한 설명]
제1도는 3차원 매트릭스에 대한 섬유아세포의 부착과 체의 개구를 가로지르는 세포의 확장을 보여주는 전자스케닝현미경사진이다.
제2도는 적혈구, 골수, 그외의 다른 군집의 발현을 위한 210μm 체면적을 보여주는 3차원 LTBMC의 전자스케닝현미경사진이다.
제3도는 배양물에서 여러주동안 나타난 3차원 LTBMC 흡착 및 비흡착층의 전체 세포수를 나타내는 그래프이다.
제4도는 배양물에서 여러주동안 3차원 LTBMC의 흡착지역에서 얻은 105세포당 CFU-C를 보여주는 그래프이다.
제5도는 3차원 피부모형의 다이어그램을 보여준다.
제6도는 흑혈구로 접종한지 3일 후의 3차원 기질의 전자스케닝현미경사진이다.
제7도는 헤마톡실린-에오신으로 염색된 3차원 피부매양물의 단면을 보여주는 현미경사진이다.
제8도는 톨루이딘으로 염색된 3차원 피부배양물에서 나온 표피영역을 보여주는 현미경사진이다.
제9도는 이식 7일후 쥐에게 이식된 3차원 피부모형의 현미경사진이다.
제10도는 이식 7일후 쥐에게 이식된 3차원 피부모형의 현미경사진이다.
제11도는 간기질세포에 3차원 다층조직을 형성하는 3차원 배양법에 따라 성장한 성숙 간 배양물의 현미경사진이다.
제12도는 면역후 10일 내지 20일동안 간세포가 간아세포 또는 재생간의 세포와 유사한 3차원 배양물로 활발히 분할하는 것을 보여주는 현미경사진이다.
제13도는 근육상피의 3차원 조직배양의 단면을 보여주는 현미경사진이다.
제14도는 췌장의 3차원 조직배양의 단면을 보여주는 현미경사진이다.
제15도는 뇌혈액 장벽의 3차원 조직배양 모형계의 단면을 보여주는 현미경사진이다.
제16도는 선암의 3차원 조직배양의 단면을 보여주는 현미경사진이다.
제17도는 기질이 있는 단일층에서 성장한 섬유아세포와 본 발명의 3차원 메쉬 시스템에서 성장한 완전두께의 골수의 반응을 비교한 그래프를 보여준다.
제18도는 기질 및 골수 3차원 배양에 의하여 시스-백금에 대한 투여량-관계반응을 보여주는 중성-레드 분석결과가 나타난 그래프를 보여준다.
제19도는 소형돼지에게 인체 신진피부이식 10일후 감긴 완전두께의 표면상태를 보여주는 사진이다.
제20도는 활성 섬유아세포와 자연-분비된 콜라겐과 함께 메쉬 섬유의 단면을 보여주는 신진피의 조직학적 평가치를 보여주는 현미경사진이다.
제21도는 신진피(왼쪽)와 미생물 분해 메쉬(오른쪽)로 각각 치료한 상처를 비교한 현미경사진이다.
제22도는 인체피부 섬유아세포 용해질에 흡수된 메쉬로 치료한 부위에서 떼어낸 생검의 조직학적 평가치를 보여주는 현미경사진이다.
제23도는 이식 21일후의 피부측정물의 조직학적 평가치를 보여주는 현미경사진이다.
제24도는 신진피로 치료한지 21일후의 완전밀생의 상체를 보여주는 현미경사진이다.
제25도는 도면의 N에 묘사된 상피/진피부위의 조직학적 평가치를 보여주는 현미경사진이다.
[발명의 상세한 설명]
[기술분야]
본 발명은 3차원 세포와 조직배양계에 관한 것이다. 이 배양계는 생체와 아주 유사한 환경의 시험관내에서 세포와 조직의 장기증식에 이용한다. 여기서 설명한 배양계는 증식 및 적절한 세포성장을 위해 제공되어 생체내상응하는 조직과 유사한 구조를 형성한다.
생성 배양물은 생체내에서의 이식 또는 내이식에서부터 시험관에서 세포독성 화합물과 약제학적 화합물 선별법 및 바이오리액터에서의 생물학적 활성분자 제조까지 다양하게 응용된다. 본 발명은 골수, 피부, 간장, 근육상피, 췌장, 또한 선암의 3차원 배양에 대하여 설명한 실시예와 또한 혈액-뇌관문 모형계와 피부이식조직, 또한 세포독성분석에서 3차원 배양계를 이용하는 것에 대한 또다른 실시예로 설명된다.
[배경기술]
대부분의 척추동물세포 배양물은 시험관내에서 영양소매질에 담긴 인공기질위에 단일층으로 성장한다. 단일층이 성장하는 기질은 플라스틱같은 고체 혹은 콜라겐이나 한천같은 반고체 겔이다. 1회용 플라스틱이 조직 혹은 세포배양에 이용할 기질로 바람직하다.
연구인들은 기저막성분에 관계하여 사용되는 자연기질에 대해 조사하였다. 기저막은 생체내에서 대부분의 세포를 둘러싸고 있는 당단백질과 프로테오글리칸을 포함한다. 예컨대 헵토사이트, 상피세포, 또한 내피조직을 배양하기 위해 콜라겐을 사용한다(Reid and Rojkund, 1979, In Methods in Enzymology, Vol. 57, Cell Culture, Jakoby Pasten, eds., New York, Acad. Press, pp. 263-278); (Vlodavsky et al., 1980, Cell 19:607-617); (Yang et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3401). 부유 콜로겐에서의 세포성장(Michalopoulos and Pitot, 1975, Fed. Proc. 34:826)과 질산섬유막(Savage and Bonney, 1978, Exp. Cell Res. 114:307-315)은 최종분화를 촉진하기 위한 시도로서 행한다. 그러나, 지속성 세포 재생과 이러한 계에 있는 조직의 배양은 달성되지 못하였다.
생쥐태아의 섬유아 세포배양은 특히 저밀도에서 세포성장을 증진시킨다. 이 효과는 부분적으로 배지의 보충과 세포생성물에 의한 기질조절에 따른 것이라고 추측된다. 이와 같은 계에서, 섬유아세포의 공급층은 다른 세포가 접착하기에 적당한 표면을 형성하는 합류단일층으로서 성장한다. 예컨대, 정상적인 태아내장의 합류공급층에서 신경교종이 성장하는 것을 발표한다(Lindsay, 1979, Nature 228:80).
2차원에서의 세포성장은 배양중의 세포를 생성하고, 관찰하고, 연구하는 편리한 방법으로써 신속한 세포증식이 가능한 반면에, 생체의 모든 조직의 세포-세포와 세포-매트릭스 상호작용성이 부족하다. 이러한 기능상의 또한 형태학적 상호착용성을 연구하기 위하여, 연구인들은 콜라겐 겔같은 3차원 기질의 이용을 연구하였으며(Douglas et al., 1980, In Vitro 16:306-312; Yang et al., 1979, Proc. Natl. acad. Sci. 76:3401; Yang et al., 1980, Proc. Natl. Acd. Sci. 77:2088-2092; Yang et al., 1981, Cancer Res. 41:1021-1027) 또한 어떤 사람은 셀룰로오스 스폰지를 단독으로(Leighton et al., 1951, J. Natl. Cancer Inst. 12:545-561) 혹은 콜라겐으로 피복하여 이용하는 것을 발표하고(Leighton et al., 1968, Cancer Res. 28:286-296) 또한 겔형의 젤라틴 스폰지의 이용도 발표한다(Sorour et al., 1975, J. Neurosurg. 43:742-749).
일반적으로, 이 3차원 기질을 배양된 세포로 접종한다. 많은 종류의 세포는 격벽에 침투하여 조직과 같은 조직학을 입증한다고 발표하였다. 예컨대, 3차원 콜레간 겔은 유방상피(Yang et al., 1981, Cancer Res. 41:1021-1027)와 교감신경(Ebendal, 1976, Exp. Cell Res. 98:159-169)의 배양에 이용한다. 덧붙여서, 분산된 단일층 배양물로부터 조직형 구성물을 재생하기 위한 다양한 시도가 있었다. 환류된 단일층이 10개의 세포두께보다 더 두껍게 성장하고 또한 유장기조직을 적절한 배지의 보급하에서 다층배양물로 발육할 수 있음을 발표하였다(Kruse and Miedema, 1965, J. Cell Biol. 27:273)(또한, Schneider et al., 1963, Exp. Cell Res. 30:449-459과 Bell et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:1274-1279참조). 또한 인체의 표면각질 세포가 이동없이 여러주동안 놓아두면 데마토글리프스(마찰릿지)를 형성한다고 발표하였다(Green 1978, Science 220:1385-1388). 또한 상피성장인자의 존재하에서 배양된 혈관상피세포와 또한 종양세포가 있는 배지의 배양물속에서 모세관이 형성되는 것을 발표한다(Folkman and Haudenschild, 1980, Nature 288:551-556). 또한 박층 콜라겐으로 피복된 나일론메쉬에서 10-13일동안 간세포를 1차 배양하는 것도 발표하였다(Sirica et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:283-287; 1980, Cancer Re. 40:3259-3267). 그러나, 이러한 계에서 세포의 장기배양과 증식은 이루어지지 않았다.
실제로, 골수와 같은 조직의 장기배양물을 만들고자 하는 시도가 있었다. 그 결과는 만족스럽지 못하였으며, 상이한 종류의 세포를 포함한 기질세포층은 신속히 형성되지만 실제 중요한 조혈작용을 유지할 수 없다(Dexter et al., In Long Term Bone Marrow Culture, 1984, Alan R. Liss, Inc., pp. 57-96).
[본 발명의 요약]
본 발명은 시험관내에서 장시간동안 다양한 세포와 조직을 배양하기 위해 사용할 수 있는 3차원 세포배양계에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 원하는 조직으로부터 유도된 세포를 사전-구성된 기질지지 매트릭스에 접종하여 성장시킨다. 기질지지 매트릭스는 3차원 매트릭스상에서 활성적으로 성장하는 섬유아세포같은 기질세포를 포함한다. 기질세포는 또한 상피세포, 대식세포/단핵세포, 지방세포, 혈관주위세포, 또한 골수기질에서 발견된 망상세포등과 같이 느슨한 연결조직에서 나온 다른 세포도 포함한다. 기질매트릭스는 배양물에서 세포의 장기 활성증식에 필수적인 서포트, 조절인자, 성장인자를 제공한다. 이 3차원계에서 성장할 때, 증식세포가 성숙하고 적당히 분리되어 생체내에서 발견된 상응물과 유사한 성숙조직의 성분을 형성한다.
본 발명은 부분적으로, 3차원에서의 기질세포성장으로 배양중인 세포의 활성증식을 단일층계보다 더 오랜시간동안 지속할 수 있음을 발견한 것에 기초한다. 이것은 3차원 매트릭스의 표면적이 증가하여 결과적으로 기질세포의 활성증식기간이 연장된다. 이 증식 기질세포는 기질매트릭스상에 접종된 기질과 조직-특이세포의 장기증식을 돕는 필수적인 단백질, 성장인자 또한 조절인자를 생산한다. 덧붙여서, 매트릭스의 3차원성 때문에 생체와 아주 유사한 조건의 공간분포로 되고 세포성숙과 이동에 도움이 되는 미시환경을 형성하게 된다. 서포트 존재하에 세포성장은 단백질, 당단백질, 글리코스아미노글리칸, 세포격벽, 또한 그외의 물질을 서포트에 첨가하거나 또는 서포트를 이러한 물질로 피복하면 더 증진된다.
3차원 서포트를 사용하면 세포가 다중층으로 성장하고 그 결과 본 발명의 3차원 세포배양계를 생성하게 된다. 많은 세포종류와 조직이 3차원 배양계에서 성장한다.
본 발명의 구체예에서, 골수, 피부, 간장, 췌장, 근육상피, 선암, 흑색종 조직등이 3차원 배양계에서 성장한다.
또한, 생성 배양물을 생리학적 혹은 병리학적인 조건의 연구대상인 모형계로서 이용한다. 예컨대, 본 발명의 한 구체예에서는 3차원 배양계를 혈액-뇌 관문 모형계로 사용한다. 또다른 구체예에서는 제한적인 방식은 아니지만 점막상피의 3차원 배양계를 허피스바이러스 또는 파필로마-바이러스 감염에 대해 연구하는 모형계로 이용할 수 있다. 생성 배양물은 배양물속에서 성장한 세포를 생체에 이식 혹은 내이식하는 것에서부터, 세포독성 검사와 시험관내의 화합물 선별, 또한 시험관내에서 생물학적 물질을 제조하기 위한 바이오리액터의 디자인등 다양하게 응용할 수 있다.
3.1. 정의와 약어
다음은 용어에 대한 설명이다:
흡착층:매트릭스에 직접부착된 세포 또는 매트릭스에 직접적으로 접착된 세포에 접착하여 간접적으로 연결된 세포.
기질세포:다른 세포 또한/또는 느슨한 연결조직에서 발견된 성분을 포함하거나 포함하지 않으며, 상피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 혈장세포, 비만세포, 지방세포 등을 포함한 섬유아세포.
조직-특이 혹은 실질세포:지지구조와 구별되는 기본적인 특이조직을 형성하는 세포.
3차원 매트릭스:(a) 세포가 부착할 수 있고(또는 세포를 부착하기 위해 변형시킬 수 있고); 또한 (b) 한 개의 층이상으로 세포가 성장하도록 하는 물질 또한/또는 형태로 구성된 3차원 매트릭스. 이 서포트를 기질세포와 접종시켜 3차원 기질매트릭스를 형성한다.
3차원 기질매트릭스:기질세포로 접종된 3차원 매트릭스. 합류 또는 준합류에 의해 본 발명에 따라 기질세포가 성장하기 시작하고 분할된다. 기질매트릭스는 후에 접종된 조직-특이 세포성장을 도와 3차원 세포배양물을 형성한다.
3차원 세포배양물:조직-특이세포로 접종하고 다시 배양된 3차원 기질매트릭스. 대체로, 3차원 기질매트릭스에 접종할 때 사용된 조직특이세포에는 이 조직에 대한 간(stem)세포(또는 예비세포) 즉, 조직의 실질부분을 이루는 구체화된 세포속에서 성숙할 새로운 세포를 생성하는 세포가 포함되어야 한다.
다음의 약어들의 뜻을 설명한다:
[도면의 상세한 설명]
제1도에서, 섬유아세포는 매트릭스 단백질을 활발하게 분비하며, 조직-특이세포로 접종하기 전에 얻은 적정 준합류 단계에 있다.
제2도에서, 서포트 세포는 3차원 매트릭스를 따라 선형으로 성장하고 이 매트릭스를 둘러싼다.
제3도에서, 배양물에 공급한 후 매 5일간마다 제거한 사용배지를 이용하여 흡착이 이루어지지 않은 부열에서의 총 세포수와 시토스핀 생성물을 만든다. 3차원 세포배양물을 콜라겐효소와 트립신으로 처리하여 유착세포를 제거하고 상이한 간격의 LTBMC에서 유착지역의 세포수를 측정한다. 배양한지 여러주일이 지나면 세포증식은 일정한 상태에 도달한다.
제5도에서, 색소가 들어있는 흑혈구와 또한 색소-함유 각질세포의 여러층이 있는 내피/표면연결점이 나타난다. 기질세포를 매트릭스에 부착하고 내피성분을 형성한다.
제6도에서, 수상돌기형성을 나타내고, 색소를 함유하고 또한 색소를 각질세포에 전달하는 능력을 보유한 흑혈구는 정상적으로 3차원계에서 성장한다.
제7도에서, 정상 표면(E)세포 형태학과 배향이 명백해진다. 표면 및 내피(D)성분이 체섬유(M)를 완전히 둘러싸고 뚜렷한 내피/표면연결점이 나타난다.
제8도에서, 각질세포(K)는 정상 형태학을 형성하고 또한 색소(P)입자를 함유한다. 각질층(SC)은 세포성숙이 나타난 증거이다.
제9도에서, 뚜렷한 내피 및 표면연결점이 제시된다. 세포는 거부반응없이 메쉬에 부착한 고정점을 보여준다.
제10도에서, 콜라겐속(c)과 모든 세포종류 특히 각질세포(k), 섬유아세포(f), 지방세포(a) 또한 연근육세포(s)를 포함한 세포는 나일론 메쉬 섬유(m)를 둘러싼 자연스런 구성으로 배열된 것으로 나타난다.
제14도에서, 화살표는 아키나르세포(acimar cell) 속의 효소원입자를 가리킨다. 별표는 기질세포이다.
제15도에서, 짙은 화살표는 작은 혈관 상피세포를 가리키며 흰 화살표는 신경세포를 지적한다. 별표는 성상교세포를 나타낸다.
제17도에서, 기질은 세포생존력에 대한 뉴트랄-레드(neutral-red)분석으로 다드리아마이신(dadriamycin)에 대한 투여량-관계반응을 보여준다.
제19도에서, 거부반응이나 탈수반응없이 최소수축현상을 관측하였다.
제21도에서, 신진피가 내이식된 상처의 수축감소와 색소형성 및 모(hair)성장증가를 살펴본다.
제22도에서, 각 메쉬 섬유주변의 상피세포성장증가를 살펴본다.
제23도에서, 상피세포를 진피면에 옮겨 고르게 접착하면 정상적인 분화와 성장을 볼 수 있다. 레이트(rete) 페그(peg)성장이 이식피부의 특징이다. 3개월 내지 4개월 안에 레이트 페그분해를 관찰할 수 있다.
제25도에서 진피측정물에 대한 각질세포접착과 고른 성장을 살펴본다. 메쉬섬유는 이식한지 21일후 까지도 나타나며 자연분비된 콜라겐 섬유에 둘러싸인 섬유아세포가 활성으로 남아있다.
[발명의 상세한 설명]
3차원 배양계
본 발명은 3차원 격벽과 또한 이것을 3차원 다층세포배양계를 위한 구조물로 사용하는 용도에 관계한다. 관례의 공지된 조직배양계에서 세포가 단일층으로 성장한다. 본 발명에 따른 3차원 기질서포트에서 성장한 세포는 세포매트릭스를 형성하는 다층으로 성장한다. 이 매트릭스계는 생체내에서 전술한 단일층 조직배양계보다 생리적 조건에 더 근접한다. 3차원 세포배양계는 다양한 세포종류의 증식과 골수, 피부, 간장, 췌장, 신장, 부신과 신경조직 등을 포함한 다수 조직의 형성에 응용할 수 있다.
배양계를 다양하게 응용한다. 예컨대 피부, 장기등과 같은 조직에서 3차원 배양물을 생체기관에 그대로 이식 혹은 내부이식한다. 별도로, 골수같은 확산조직에 대해서 증식세포를 이식을 위해 배양계로부터 분리할 수 있다. 3차원 배양물은 또한 시험관내에서 세포독성 검사와 화합물선별에 이용할 수 있다. 또다른 응용에서, 3차원 배양계는 바이오리액터로 사용하여 다량의 세포생성물을 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 원하는 조직에서 유도한 세포(조직-특이 세포 또는 실질세포)를 사전구성된 3차원 기질매트릭스에 접종하여 배양한다. 기질매트릭스는 3차원 매트릭스 혹은 조직에서 성장한 기질세포를 포함한다. 기질세포는 여기서 설명된 또다른 세포 또한/또는 성분이 있거나 없는 섬유아세포를 포함한다. 섬유아세포와 그외의 다른 세포 또한/또는 성분은 근원적으로 태아나 또는 성인에 기원하거나 피부, 간장, 췌장 등의 우수한 공급원에서 나온 기질을 포함한다. 이러한 조직과 또한/또는 기관은 적절한 생검이나 부검(autopsy)에 따라 수득할 수 있다. 실제로, 사체의 기관으로부터 기질세포와 성분을 풍부하게 제공한다.
태아 섬유아세포는 3차원 배양계에서 다양한 세포와 조직의 성장을 도와주고 따라서, 매트릭스에 접종하여 다양한 세포와 조직을 배양하기 위한 일반적인 기질서포트 매트릭스를 형성한다. 그러나 어떤 경우에서는 일반적인 기질서포트 매트릭스보다 특이성을 이용하는 것이 바람직하며 그 결과로 특별한 조직, 기관, 혹은 개체에서 기질세포와 성분을 수득할 수 있다. 에컨대, 3차원 배양으로 생체이식이나 생체내부이식할 경우는 이식편 혹은 내이식편을 수용할 개체로부터 기질세포와 성분을 얻는 것이 바람직하다. 이 접근방법은 특히 숙주질병에 대한 이식편 또한/또는 그라프트의 면역학적 거부반응이 있음직한 경우에 유리하다. 더욱이, 3차원 배양계에서 배양될 동종의 조직에서 섬유아세포와 그외의 기질세포 또한/또는 성분을 유도한다. 이것은 조직을 배양하는데 유익한데 이때 특수화된 기질세포는 특정 구조적/기능적 역할을 가지는데, 예를 들면 신경학적인 조직의 신경교 세포, 간장의 쿠퍼세포(Kupffer cell)등이다.
3차원 매트릭스상에 접종되면, 기질세포는 매트릭스에서 증식하고 본 발명의 3차원 배양계에 접종된 조직-특이세포성장을 돕는다. 실제로, 조직-특이세포로 접종했을 때, 3차원 기질서포트 매트릭스는 장시간동안 배양물을 활성적으로 증식시킨다. 성장 및 조절인자를 배양물에 첨가할 수도 있으나 기절서포트 매트릭스에 의해 동화되기 때문에 필수적인 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 생체내의 특정조직에서 발견된 세포 미시환경을 배양중에 재창조하는 것이 중요하기 때문에, 실질세포의 접종에 앞서서 기질이 성장하는 범위는 3차원 조직배양에서 성장한 조직의 종류에 따라 달라진다. 예컨대, 골수의 3차원 배양무에서는 조혈세포를 준합류된 기질매트릭스에 접종하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 따른 피부의 3차원 조직배양물에서는 각질세포 또한/또는 색소세포로 접종하기 전에 기질세포가 합류하도록 하여 피부의 내피성분구조를 재창조하는 것이 바람직하다. 중요한 것은, 메쉬의 구멍을 통해 배양중인 기질세포가 나가고, 합류기질세포가 접촉 억제 현상을 보이지 않으며 기질세포가 계속해서 성장, 분리 및 기능적인 활성상태를 유지한다는 것이다.
본 발명은 부분적으로 3차원의 기질세포성장이 배양중의 기질과 또한 조직-특이세포를 단일층계보다 더 긴시간동안 활성적으로 계속 증식할 수 있다는 발견에 기초한다. 더욱이, 3차원계는 시험관 배양세포의 성숙, 분화, 분리작용을 보조하여 결과적으로 생체에서 발견된 대응부와 유사한 성숙조직의 성분을 구성한다.
출원인이 발명실행의 메카니즘을 설명할 의무나 책임은 없다고 하더라도, 3차원 배양계에 접착된 다수의 인자가 성공적인 결과에 공헌한다:
(a) 3차원 매트릭스는 단백질이 접착하고 결과적으로 기질세포가 접착할 표면적을 증가시킨다.
(b) 매트릭스의 3차원성 때문에, 기질세포는 계속적으로 활발히 성장하며 이것은 점차 합류되고, 접촉억제현상을 나타내어 성장 및 분할이 정지되는 단일층 배양물의 세포와 대조적이다. 기질세포복제에 따른 성장과 조절인자로 인하여 배양물에서 세포의 증식을 자극하고, 조절하고 분화시키게 된다.
(c) 3차원 매트릭스에서는 생체의 대응부 조직에서 발견된 것과 더욱 유사한 세포성분의 공간분포가 가능하다.
(d) 3차원계에서 세포성장을 위한 잠재적인 부피의 증가는 세포성숙에 기여하는 지역화된 미시환경을 구성하는데에 공헌한다.
(e) 3차원 격벽은 대식세포, 단핵세포, 또한 접착층속에 있는 임파구와 같은 이동성 세포의 운동을 확대할 수 있는 가능성을 제공하여 세포-세포간의 상호작용을 최대화한다.
(f) 분화된 세포표현형을 지속하기 위해서는 성장/분화인자뿐만 아니라 적절한 세포상호작용도 필요하다는 점이 인지되었다. 본 발명은 조직 미시환경을 효과적으로 재창조한다.
3차원 기질서포트, 배양계와 그 유지, 또한 3차원 배양물의 다양한 용도 등을 다음의 소단락에서 상세히 설명한다.
5.1. 3차원 기질매트릭스의 구성
3차원 서포트는 (a) 여기에 세포가 접목할 수 있고(또는 세포접목을 위해 변형가능하고) 또한, (b) 세포가 하나의 층이상으로 성장할 수 있도록 하는 물질 또한/또는 형태로 되어 있다. 나일론(폴리아미드), 테이크론(폴리에스테르), 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐화합물(즉, 폴리염화비닐), 폴리카보네이트(PVC), 폴리테트라플루오르에틸렌(PFE; 테프론), 테르마녹스(TPX), 니트로셀룰로오스, 목면, 폴리글리콜산(PGA), 고양이 내장 봉합사, 셀룰로오스, 젤라틴, 텍스트란 등의 다양한 물질로 매트릭스를 만든다. 이러한 재료를 엮어서 메쉬로 직조하여 3차원 매트릭스를 형성한다. 나일론이나 폴리스티렌과 같은 물질은 세포접목용으로는 적합하지 못한 기질이다. 이것을 3차원 서포트 매트릭스로 사용할 경우, 기질세포접종에 앞서서 매트릭스를 사전-처리하여 매트릭스에 대한 기질세포 접목을 향상시킨다. 예컨대, 기질세포로 접종하기 전에 나일론 격벽을 0.1M 아세트산으로 처리한 후 폴리리신, FBS, 또한/또는 콜라겐에서 배양하여 나일론에 피복한다. 폴리스티렌도 황산을 이용하여 유사하게 처리한다.
3차원 배양물을 그대로 생체에 내이식할 경우, 예컨대 폴리글리콜산, 고양이 내장 봉합사 또는 젤라틴처럼 생분해 가능한 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다. 배양물이 장기간동안 보존되거나 또는 냉온 저장될 경우, 나일론, 테이크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 테플론, 목면 등의 비-분해성 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용하는 편리한 나일론 그물눈으로서 평균 세공 크기가 210μm이고 또한 나일론 섬유 직경이 90μm으로된 나일론 여과메쉬인 Nitex를 들 수 있다(#3-210/36 Tetko, Inc, N.Y.).
다음에서 설명한 세포를 포함한 또는 포함하지 않은 섬유아세포로 된 기질세포를 매트릭스에 접종한다. 이 섬유아세포는 생검으로(적절한) 혹은 검시에서 얻을수 있는 피부, 간장, 췌장 등의 기관으로부터 유도된다. 실제로, 섬유아세포는 적절한 사체의 기관에서 다량으로 얻을 수 있다. 상술한 것과 같이, 태아 섬유아세포를 사용하여 다양한 세포 또한/또는 조직성장을 도와주는 일반적인 3차원 기질매트릭스를 형성할 수 있다. 그러나, 특이성 기질매트릭스는 배양된 동종의 조직으로부터 또는 차후에 본 발명의 3차원계에 따라 배양중 성장한 세포나 조직을 수령하게될 개인으로부터 유도된 섬유아세포와 함께 3차원 매트릭스를 접종시켜서 제조할 수 있다.
섬유아세포는 공급원으로서 보급한 적절한 기관 또는 조직을 분해하면 쉽게 분리된다. 이것은 숙련자에게 공지된 방법을 이용하여 쉽게 성취된다. 예컨대, 조직이나 기관은 이웃한 세포사이의 결합력을 약화시켜 세포파괴없이 세포 부유물속으로 조직을 분산시킬 수 있는 킬레이트제 또는 분해효소로 처리하거나 기계적으로 분해시킨다. 조직을 잘게 부수고, 분해효소 단독으로 또는 다른것과 복합하여 부숴진 조직을 처리하여 효소적 분해를 할 수 있다. 이러한 효소로는 트립신, 키모트립신, 콜라겐효소, 엘라스타제, 또한/또는 히알루로니다제, DN 효소, 프로나제, 디스파제 등을 포함하나 이에 한정시키지 않는다. 또한 그라인더, 블렌더, 체, 파쇄기, 압력셀 또는 인소네이터 등을 포함한 다수의 방법으로 기계적인 교란도 가능하다.(조직분해법에 대해서, Freshney, Culture dof Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, pp. 107-126).
조직이 각 세포 부유물로 분해되면 이 부유물은 섬유아세포 또한/또는 다른 기질세포 또한/또는 성분을 수득하는 부차집단으로 분류할 수 있다. 이것은 또한 클로닝과 또한 특이세포종류의 선별, 원치않는 세포의 선택적 파괴(네가티브 선별), 혼합집단의 분할세포 점착성을 기초로한 분리, 냉동-해빙법, 혼합집단세포의 분별점착성, 여과, 종래의 지역적원심분리, 원심분리성 수비(elutriation)(역류원심분리), 단위중력분리, 역류분포, 전기영동 또한 형광-활성 세포 분리작용 등을 포함한 세포분리를 위한 표준방법으로 달성할 수 있다.(클론성 선별과 세포분리법에 대하여 Freshney, Culture of Animal Cell을 참조한다)(A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11과 12, pp. 137-168).
예컨대, 섬유아세포 분리는 다음과 같이 실행된다:신선한 조직표본을 깨끗이 세척하고 Hanks평형 염용액(HBSS)에서 분쇄하여 혈청을 제거한다. 분쇄조직을 트립신같은 분해 효소 용액에서 1시간-12시간동안 배양한다. 그후, 분리된 세포는 부유시키고, 원심분리로 펠릿화하고, 배양접시에 담는다. 섬유아세포는 다른 세포보다 먼저 흡착하여 적정량의 기질세포를 선택적으로 분리하고 다시 성장시킨다. 분리된 섬유아세포가 생장하여 합류하고, 합류 배양물에서 덜어내어, 3차원 매트릭스위에 접종시킨다(Naughton et al., 1987, J. Med. 18(34):219-250). 3차원 매트릭스에 고농도 기질세포 즉, 약 106내지 5×107세포/ml의 세포를 접종하면 짧은 시간동안에 3차원 기질서포트가 구성된다.
섬유아세포에 더하여, 다른 세포를 첨가하여 배양중에서 장기 성장을 돕기위해 필요한 3차원 기질매트릭스를 형성한다. 예컨대, 느슨한 연결조직에서 발견된 타세포를 섬유아세포와 함께 3차원 기질서포트 위에 접종한다. 이러한 세포로는 상피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단핵세포, 혈장세포, 비만세포, 지방세포 등을 포함한다. 이 기질세포는 상기에서 검토된 공지방법에 따라 피부, 간장 등의 적절한 기관에서 쉽게 유도할 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 배양될 특정조직으로 특이화된 기질세포를 섬유아세포 기질에 더한다. 예컨대, 조혈조직의 기질세포로서 섬유아세포, 상피세포, 거대파지/단핵세포, 지방세포, 망상세포등이 포함되며 이것을 사용하여 시험관내에서 골수의 장기배양을 위한 3차원 준합류기질을 형성한다. 조혈성 기지세포는 3,000×g의 저속 원심 분리에 의해 골수 부유물속에 형성된 '버피코(buffy coating)으로부터 용이하게 수득한다. 간의 기질세포는 섬유아세포, 쿠퍼세포, 또한 혈관과 담즙생성 상피세포등이 포함된다. 유사하게, 신경교세포 기질로 사용하여 신경학적 세포 및 조직의 증식을 보조한다; 이러한 목적을 위한 신경교세포는 미성숙 또는 성숙뇌의 트립신화 혹은 콜라겐효소 소화에 따라 수득할 수 있다(Ponten and Westermark, 1980, in Federof, S. Hertz, L., eds. Advances in Cellular Neurobiology, Vol. 1, New York, Academic Press pp. 209-227).
다시, 생체이식이나 내이식을 위해 배양 세포를 사용할 경우, 환자의 조직에서 기질세포를 수득하는 것이 바람직하다. 3차원 기질서포트 매트릭스 존재하에서 매트릭스에 단백질(예컨대, 콜라겐, 탄성섬유, 망상섬유), 당단백질, 글리코스아미노글리칸(즉, 황산헤파란, 콘드로이틴-4-황산염, 콘드로이틴-6-황산염, 황산데르마탄, 황산케라탄등) 세포매트릭스, 또는 그외의 물질을 매트릭스에 첨가하거나 이것으로 매트릭스 서포트에 피복하면 세포성장이 향상된다.
기질세포 접종후, 3차원 매트릭스를 적절한 영양배지에서 배양한다. 시판하는 PRMI 1640, Fisher's Iscove's, McCoy's, 등의 배지를 사용하는 것이 적합하다. 배양기간에 배양기속에 부유하거나 현탁된 3차원 기질매트릭스의 증식 활성도를 최대로 하는 것이 중요하다. 덧붙여서, 배양물을 주기적으로 주입하여 소모된 배지를 제거하고 방출된 세포를 감소시키고, 다시 새로운 배지를 첨가한다.
배양할 때, 기질세포는 3차원 매트릭스를 따라 선형으로 성장하고 이것을 덮어 매트릭스의 구멍쪽으로 생장한다. 조직-특이세포로 기질매트릭스에 접종하기에 앞서서 생체조직에 존재하는 기질세포의 양을 반영하는 일정한 정도까지 세포를 성장시키는 것이 중요하다.
격벽의 구멍은 적정한 크기로서 기질세포가 이것을 가로질러 성장할 수 있도록 한다. 격벽을 가로질러 확장하는 기질세포가 활발하게 성장하도록 유지하면 기질세포에 의해 동화된 성장인자 생성이 강화되고 그 결과 장기배양물을 보조한다. 예컨대, 구멍이 너무 작으면, 기질세포가 빨리 합류되어 메쉬에서 쉽게 빠져나가지 못하게 된다; 포집된 세포는 접촉억제현상을 보여주고 또한 증식작용을 보조하면서 장기배양을 유지하기 위해 필요한 적절한 인자의 생성을 중단한다. 구멍이 너무 클 경우, 기질세포는 구멍을 교차하여 신장할 수 없다; 이것은 또한 증식작용을 보조하면서 장기배양을 유지하는데 필요한 적절한 인자의 기질 세포 생성을 감소시킨다. 메쉬형 매트릭스를 사용할 때, 여기서 실시한 바와 같이 약 150μm 내지 220μm 범위의 구멍크기가 실행하기에 만족스러운 것으로 나타났다. 그러나, 3차원 구조와 매트릭스의 복잡성에 따라서, 다른 크기의 것도 사용할 수 있다. 실제로, 기질세포가 확장하고 계속적으로 복제하고, 장기간동안 성장할 수 있는 형태이면 어느 것이나 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
매트릭스상에 붙은 다양한 종류의 상이한 비율의 콜라겐을 차후에 접종된 조직-특이 세포 성장에 영향을 줄 수 있다. 예컨대, 조혈세포의 이상적인 성장을 위하여 매트릭스는 초기 매트릭스에서 대략 6:3:1 비율의 콜라겐 제(Ⅲ)형, (Ⅳ)형 및 (Ⅰ)형을 포함하는 것이 바람직하다. 3차원 피부배양계에서 콜라겐 제(Ⅰ)형과 (Ⅲ)형은 초기 매트릭스에 침착되는 것이 바람직하다. 침착된 콜라겐 종류의 비율은 적절한 종류의 콜라겐을 만드는 섬유아세포를 선별함으로써 조절하거나 향상시킬 수 있다. 보체를 활성화할 수 있고 또한 특정한 콜라겐형을 정하는 적당한 이형 혹은 아강의 단일클론항체를 이용하여 달성할 수 있다. 이 항체와 보충물을 사용하여 원하는 콜라겐형을 표현하는 섬유아세포를 반대로 선별한다. 별도로, 매트릭스에 접종하기 위해 이용한 기질은 적절한 콜라겐형을 합성하는 세포혼합물이 될 수도 있다. 5가지 콜라겐형의 분포와 기원이 표 1에 보여진다.
따라서, 배양될 조직과 원하는 콜라겐 형에 따라 적절한 기질세포를 선택하여 3차원 격벽을 접종할 수 있다.
3차원 기질서포트의 배양중에서, 증식세포는 매트릭스로부터 방출된다. 이 방출세포는 배양물의 혈관벽에 흡착하여 계속적으로 증식하여 합류단일층을 형성한다. 예컨대, 공급과정에서 방출세포를 제거하거나 3차원 기질매트릭스를 새로운 혈관으로 이동시켜서 이러한 현상을 최소화하거나 또는 방지해야 한다. 관속에 합류단일층이 존재하면 3차원 매트릭스 또는 배양물에서의 세포성장이 중단된다. 합류단일층을 제거하거나 또는 매트릭스를 새로운 관속에 있는 신선한 배지에 옮겨서 3차원 배양계의 증식활성도를 보존한다. 이러한 작업은 기질 단일층의 합류도가 25%를 초과하는 경우에 배양관에서나 실시해야 한다. 별도로, 배양계를 교반하여 방출세포가 접착하지 않도록 방해하거나 또는 배양물을 주기적으로 공급하는 대신에 배양계를 고정시키고 새로운 배지를 이 계를 통해 계속해서 주입하는 방법도 가능하다. 유입속도는 3차원 배양내의 증식작용을 최대로 하고 또한 매트릭스에서 방출된 세포를 세척하여 제거할 수 있는 값으로 조절하여 결과적으로 세포가 관의 벽에 접착하고 점차로 합류하는 것을 방해한다. 차후의 이용에 대비하여, 기질세포를 수거해서 냉온보존할 수도 있다.
5.2. 3차원 기질매트릭스에서의 조직-특이 세포 접종과 배양물 보존
3차원 기질매트릭스가 적절한 성장을 한 경우, 배양하기 위한 조직-특이 세포(망상세포)를 기질매트릭스상에 접종한다. 접종원의 세포는 저농도보다 고농도의 것이 바람직하며 배양중의 증식이 훨씬 신속하게 증가한다. 접종용으로 선택할 세포는 배양될 조직 즉, 골수, 피부, 간, 췌장, 신장, 신경계조직, 또한 부신 등을 포함하는 조직에 따라 달라진다.
예컨대, 제한적인 것은 아니지만, 각종 상피세포를 3차원 생체 기질서포트에서 배양할 수도 있다. 이러한 상피세포에는 구강점막과 위장(G.I.)관 세포등이 포함된다. 이러한 상피세포는 공지방법에 따른 조직의 효소처리로 분리할 수 있고 그후 배양중에서 이 세포를 팽창시키고 또한 상피세포를 3차원 기질 서포트 세포 매트릭스(신-점막하조직)에 응용한다. 점막하조직이 존재하면 구강 점막 세포와 G.I. 관내면의 세포의 정상적인 분할과 분해를 촉진할 성장인자와 그 외의 단백질을 공급하게 된다. 이 방법을 이용하면 비(nasal)상피, 호흡관 상피, 질(vaginal)상피, 또한 각막 상피 등을 포함한 그 외의 상피세포도 성공적으로 성장시킬수 있다.
다양한 종류의 종양을 3차원 살아있는 기질 서포트에서 성장시킨다. 이러한 종양의 예로서 선암과 악성흑색종을 들 수 있으며 이것은 원위치 또는 전이위치에서 유발된다. 이러한 배양물은 다른 3차원 상피배양물과 유사한 방식으로 구성된다. 요약하면, 환자의 종양이나 정상조직 또는 타성(allogeneic)공급원에서 나온 기질세포를 메쉬 위에 구성한다. 합류상태에 거의 도달한 후 기질세포를 종양세포와 함께 접종시킨다. 종양세포는 계속하여 신속히 분할하고 3차원 고체종양을 형성한다. 3차원 서포트에서 성장한 종양세포는 생체환경과 유사한 형태를 보여주며 발현하고 또한 고체 종양에서와 유사한 방식으로 항원표면을 벗어난다; 단일층에서 성장한 악성세포는 생체내 종양조직과 동일한 유사성을 나타내지 않는다. 종양세포의 생리학적 성장은 새로운 화학치료제, 개별적인 화학치료 양생법 및 전이메카니즘 등의 연구와 개발에 응용할 수 있다. 덧붙여서, 이러한 종양배양물은 개별적인 면역치료법에 사용할 수 있다. CR 방출연구의 실행에 있어서, 랙(Lak)세포는 단일층에서 배양된 세포와 비교할 때 3차원에서 성장한 종양세포에 대해 훨씬 큰 반응 효과를 일으킨다. 전통적인 기술을 이용하여 환자에게서 면역세포를 취하고 3차원 배양에서 성장한 환자자신의 종양세포에 대한 감응성을 부여한다.
대체로, 이 접종물에는 이 조직에 대한 간(stem)세포(또한 예비세포라고 하는)를 포함한다; 이들 세포는 다양한 조직성분을 형성하는 특수화된 세포로 성숙한다.
접종물에서 사용되는 실질 혹은 조직-특이세포는 섹션 5.1에서의 기질세포를 수득하기 위해 설명된 표준방법을 이용하여 원하는 조직을 분리하여 제조된 세포부유물에서 얻는다. 전체의 세포부유물을 사용하여 3차원 기질서포트 매트릭스에 접종한다. 결과적으로, 균질화된 물질속에 들어있는 재생세포가 매트릭스상에서 증식, 성숙 및 격벽상에 적절히 분화하는 반면에, 비-재생세포는 그렇게 되지 않는다. 특수한 세포종류는 기지 세포 분별에 대해 섹션 5.1에서 설명한 표준방법에 따라 세포부유물의 적절한 단편에서 분리가능하다. 간(setm)세포 또는 예비세포가 쉽게 분리될 경우, 이 세포를 이용하여 3차원 기질서포트에 우선적으로 접종할 수 있다. 예컨대, 골수배양에서, 3차원 기질에 신선한 또는 냉각보존표본에서 나온 골수세포를 접종할 수 있다. 피부배양에서, 3차원 기질에 색소세포와 각질세포를 접종한다. 간 배양에서, 3차원 기질에 췌장의 내분비선 세포를 접종한다. 각종 조직에서 망상세포를 얻기 위한 방법을 연구하였다(Freshney, Culture of Animal Cells)(A Manual of Basic Technique, 2d Ed., A.R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 20, pp 257-288).
배양과정에서, 3차원 세포배양계를 영양배지에 현탁하거나 부유시킨다. 배양물에는 신선한 배양을 함께 주기적으로 공급한다. 배양물로부터 방출된 세포가 이들이 증식하여 합류단층을 형성하는 관벽에 접착하지 않도록 주의해야 한다. 3차원 배양에서의 세포방출은 구성된 조직에 대비하여 확산조직을 배양할 때 더 용이하게 발생한다. 예컨대, 본 발명의 3차원 피부배양은 조직학적으로 또한 형태학적으로 전형적인 것이다; 서로 다른 내층과 외피층은 세포를 주변배지로 세포를 방출하지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 3차원 골수배양물은 성숙한 비-접착성 세포를 생체의 골수에 방출하는 것과 유사한 방법으로 배지내에 방출한다. 전술한 바와 같이, 방출세포는 배양관에 접착하여 합류단일층을 형성하고, 3차원 배양의 증식작용이 정지하게 된다. 공급하는 동안에 방출된 세포를 제거하고, 새로운 관으로 3차원 배양물을 이동시키고, 관벽에 방출된 세포가 흡착하는 것을 막기 위해 배양물을 교반시키고 배양물에서 영양분을 재공급하고 방출된 세포를 제거하기에 충분한 속도로 새로운 배지를 연속적으로 공급하여 이 문제를 피할 수 있다. 차후의 이용에 대비할 경우에는, 방출세포를 수집하여 냉각보존할 수 있다.
성장인자와 조절인자는 3차원 기질세포에 의해 만들어지기 때문에 첨가할 필요가 없다. 그러나, 이러한 인자를 첨가하거나 그 외의 특이화된 세포를 접종하면 배양물에서의 증식과 세포성숙이 향상, 변화하거나 조절된다. 배양중인 세포의 성장과 활성은 인슐린, 성장호르몬, 소마토메딘, 콜로니자극인자, 에리드로포이에틴, 외피성장인자, 간적혈구조혈인자(헤파토포이에틴), 또한 간-세포 성장 인자등과 같은 성장인자에 의해 영향을 받는다. 증식 또는 분화조절을 위한 그 외의 인자로서 프로스타글란딘, 인터레우킨, 또한 자연발생 칼론등이 포함된다.
5.3. 3차원 배양계의 이용
본 발명의 3차원 배양계는 다양하게 응용할 수 있다. 매트릭스에서 나온 배양세포 혹은 배양매트릭스 자체를 생체에 이식이나 내이식; 세포독성 화합물, 알레르겐, 성장/조절인자, 약제적 화합물 등의 시험관 내에서의 선별; 질병 메카니즘의 해석; 약물 또는 성장인자가 작용하는 메카니즘의 연구; 환자의 암을 진단하고 관찰하는 것; 유전자 치료법; 또한 생물학적 활성물질의 제조등이 포함된다.
생체이식 혹은 내이식에 있어서, 배양으로 얻은 세포나 3차원 배양물은 관련 조직형태에 따라 내부이식할 수 있다. 예컨대, 3차원 골수배양물은 장기간동안 시험관내에 보존할 수 있다; 이 배양물에서 분리된 세포를 이식작업에 이용하거나 혹은 배양물 전체를 내부이식한다. 대조적으로, 피부배양물의 경우에는 화상이나 피부궤양, 상처 등을 치료하기 위해 3차원 배양물 자체를 생체에 이식할 수 있다.
본 발명에 있어서, 3차원 조직배양 내이식편을 사용하여 배출조직을 대체하거나 증대하고, 또는 새로운 혹은 변형조직을 삽입하거나, 인공기관으로 변경하거나 또는 생물학적 조직 혹은 구성물과 결합시킨다. 예컨대, 제한적인 것은 아니지만, 본 발명의 특이한 구체예에서 (ⅰ) 화학요법처리과정에서 파괴된 골수를 대체하기 위해 이용하는 3차원 골수배양 이식편과; (ⅱ) 간경병 환자의 간기능을 증대하기 위해 사용하는 3차원 간조직 이식편; 또한 (ⅲ) 3차원 배양에서(예컨대 인슐린을 인코드하는 재조합 유전자를 표현하는 섬유아세포의 3차원 배양물과 같은) 성장한 유전적 변형세포와; (ⅳ) 3차원 배양물이나 연골로 피복된 엉덩이 인공기관과; 또한 (ⅴ) 구강점막의 3차원 배양물과 접합된 인공치아 기관등이 포함된다.
3차원 배양물은 시험관내에서 세포독성 화합물, 성장/조절 인자, 약제학적 작용제등과 같은 광범위한 종류의 화합물을 선별한다. 이것이 끝나면, 배양물을 시험관내에 보유하고 시험용 화합물에 노출시킨다. 세포독성 화합물의 활성도는 배양중인 세포를 손상하거나 사멸시키는 능력에 따라 측정된다. 이것은 생체 염색법으로 쉽게 평가할 수 있다. 성장/조절인자의 효능은 매트릭스의 세포함량 즉, 총세포수와 판별세포수를 분석하면 평가할 수 있다. 이것은 형태-특이성 세포항원을 결정하는 항체가 이용되는 면역세포화학법을 포함한 표준 세포학적 또는 조직학적 방법으로 달성할 수 있다. 3차원계에서 배양된 정상세포에서의 각종 약물의 효능을 평가한다. 예컨대, 적혈세포형성을 증대시키는 약물을 3차원 골수배양물에서 시험할 수 있다. 콜레스테롤 대사에 효과적인 즉, 콜레스테롤 형성을 저하하는 약물은 3차원간 배양계에서 시험할 수 있다. 종양-세포의 3차원 배양물을 예컨대 항암제 효능검사를 위한 모형계로 이용한다.
본 발명의 3차원 배양물은 생리학적 혹은 병리학적 조건의 연구를 위한 모형계로 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 특정한 구체예에서 3차원 배양계를 혈액-뇌 관문의 모형으로 사용한다; 이 모형계는 혈액-뇌 관문을 통한 물질의 침투현상을 연구하기 위해 사용한다. 또다른 구체예에서, 제한적인 것은 아니지만 점막상피의 3차원 배양계를 허피스바이러스 또는 유두종바이러스 감염연구를 위한 모형계로 사용한다; 이 모형계는 항바리어스 약물검사를 위해 사용할 수 있다.
또한 3차원 세포배양물의 도움으로 악성종양과 질병을 진단하고 치료할 수 있다. 예컨대, 조직(즉, 골수, 피부, 간등)의 생검을 악성종양환자에게서 취한다. 생검세포가 본 발명의 3차원계에서 배양될 경우, 악성세포를 배양의 증식과정에서 클론 확장시킨다. 그 결과 악성물질의 감지 기회가 증대되고 따라서 진단의 정확도가 커진다. 이것은 특히 세포의 감염집단의 생체내에서 방혈하는 AIDS와 같은 질병에 유용하다. 더욱이, 환자의 배양물은 시험관내에서 세포독성 또는 약제학적 화합물을 선별하여 가장 효과적인 즉, 악성이나 질병에 걸린 세포를 사멸시키고 반면에 정상세포는 잘 보존하는 능력이 있는 화합물을 확인하기 위해 사용한다. 이 작용제를 다시 환자에게 사용하여 치료요법적으로 처리한다.
본 발명에 있어서, 질병에 걸린 환자로부터 비교적 소량의 골수를 수득하여 화학요법이나 방사선으로 파괴한다. 다시 적절한 화학치료 작용제를 이용하여 병든 세포를 골수표본에서 제거하고 이 표본을 시험관내에서 확장시킨 후, 다시 환자에게 투여한다. 질병에 걸린 작은 부피의 골수를 처리하여 더 효과적으로 제거하고 그후 시험관내에서 확장시키는 것과 함께, 3차원 배양계를 더 큰 부피의 정화된 골수에 활용할 수 있다. 대부분의 정화제의 부작용은 정상의 조혈피부세포를 파괴하고 분열시키는 것으로써 이식하는데에 더 오랜시간이 걸리고 2차 감염으로 인하여 사망률이 높아진다. 심각한 비임파구성 백혈병에 사용하는 한가지 효과적인 정화제는 필연적으로 악성세포의 사멸을 가져오는 4-히드록시페록시오이올로 포스파미드(4HC)이다. 통상적인 치료에서, 병에걸린 50ml 내지 1,000ml의 골수는 생체밖에서 60 내지 100ng의 4HC/ml로 골수를 배양하여 치료한다. 그후 골수를 냉각보존하고 임상의 화학요법처리 2-3주후에 환자에게 재투여한다. 본 발명에 있어서, 비교량의 골수를 취하여 4HC로 정화하고 다시 시험관내의 3차원 배양에서 확장시키면, 더 신속히 이식할 수 있고 환자의 사망률도 감소한다.
시험관 내에서의 방법은 동물(쥐의 골수이식)과 인간(이질상피이식)의 모두에 대한 이식에 필요한 세포의 거부반응을 감소시키는데에 유용하다. 3차원 골수배양은 또한 외부항원에 대한 세포의 내성을 촉진시킬 수 있다. 이 점에서, 제공자의 조혈세포는 수용인의 3차원 기질세포에서 성장한다. 이러한 배양물은 골수계에 있는 임파의 성장을 유도할 부가의 성장인자와 분화인자를 공급하는 3차원 흉선배양물의 존재하에서 성장한다. 조혈세포가 복제 및 성숙하면 자기것인의 수용세포항원을 줄 수 있도록 양성하고 그 결과로, 이 외부의 것인세포에 대한 내성이 생긴다.
증식된 세포와 조직의 사용에 따라서, 다양한 특이화된 세포를 3차원 배양에 첨가할 수 있다. 예컨대, 3차원 배양물속에 있는 배양물에 대해 단핵세포군을 첨가하거나, 배양배지에 대해 성장인자를 더하거나 조절된 기질세포의 이용으로 원하는 성장인자(들)을 생산하므로써 골수세포의 장기 증식을 강화될 수 있다. 이러한 배양물에서 수집된 세포는 혈관주사 이식과 뱅킹(banking)한다. 환자에게서 취한 임파구를 3차원 피부배양물에 더하면 자가 면역 질병같은 면역학적 질환을 평가하고 진단하는데에 도움을 준다. 유사하게, 환자에게서 취한 임파구와 비만세포를 3차원 피부배양물에 더하면 환자를 알레르겐에 노출시키지 않고도 각종 알레르겐에 대한 알레르기반응을 평가할 수 있다. 그후, 환자의 임파구와 비만세포가 다양한 알레르겐에 노출된다. 환자가 과민하게 감지하는 알레르겐에 가교된(bridged) 경우 임파구-생성 IgE를 주위의 비만세포에 결합시키면 히스타민 같은 혈관활성 조정물질이 방출하게 된다. 배양중에서 이러한 조정물질이 3차원 배양물에 노출된 알레르겐에 반응하면 환자의 알레르기반응을 나타내는 것으로 측정할 수 있다. 이것은 위험하고도 잠재적으로 유해한 알레르겐에 대해 개체를 노출시킴 없이 알레르기 검사를 가능하도록 한다. 이 계는 시험관 내에서의 화장품 검사용으로 유사하게 이용한다.
본 발명의 3차원 배양계에서 유전자요법에 사용하기 위하여 생체내에 유전자와 유전자 생성물을 주입할 부형제도 제공한다. 예컨대, 제조한 DNA법을 이용하여 환자에게 결핍된 유전자를 바이러스 조직-특히 촉진자의 조절하에서 포함시킬 수 있다. 유전자를 함유하는 재조합 DNA 구성을 사용하여 먼저 클론화되고 다시 클론적으로 3차원 배양계에 확장된 숙주세포를 형질전환하거나 혹은 형질감염시킬 수 있다. 활성유전자 생성물을 발현하는 3차원 배양물 이 유전자 생성물이 결핍된 개체에게 내부이식할 수 있다.
유전자 요법에 3차원 배양계를 이용하는데에는 여러 장점이 있다. 먼저, 배양물은 진핵 생물 세포를 포함하고 있기 때문에, 유전자 생성물이 배양물에서 적절히 발현되고 처리되어 활성물질을 형성한다. 둘째로, 유전자 요법은 다수의 전달감염된 세포가 임상적인 값, 검색값 및 효용성에 있어서 증가한 경우에만 유용하다; 본 발명의 3차원 배양에 따라 다수의 전달감염된 세포가 확장하고 증폭(세포 분할을 통해)할 수 있다.
발현조절성분 이용하면 유전자의 조절된 표현이 가능하고 그 결과 생성물은 생체내에서 요구될 때에만 합성된다. 프로모터의 선택은 배양된 조직과 세포의 종류에 따라 달라진다. 단백질(즉, 풍부한 내부원형질 망상체와 골지복합체를 특징으로 하는)을 분비할 수 있는 조직과 세포가 바람직하다. 이 목적을 위해 간과 다른 입상조직이 선택될 수 있다. 간세포를 이용하는 경우 헤파티티스 B 바이러스 성분처럼 간 특이성 바이러스 프로모터를 사용하여 외부유전자를 간 세포속에 주입하고 또한 이 유전자의 표현을 조절할 수 있다. 이 세포는 그후 본 발명의 3차원계 속에서 배양한다. 별도로, 알부민 프로모터와 같은 간-특이성 프로모터를 사용할 수 있다.
상술한 것과 같은 조직특이성을 가지는 전사조절부분에는 다음과 같은 것이 있으나 이에 국한시키는 것은 아니다; 췌장의 아키나르세포에서 활성인 엘라스타 제Ⅰ유전자 조절영역(Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:42s-51s); 췌장의 베타세포에서 활성이 있는 인슐린 유전자 조절영역(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); 임파세포에서 활성이 있는 면역글로부린 유전자 조절영역(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adams et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); 간에서 활성적인 알부민 유전자 조절영역(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); 간에서 활성이 있는 알파-페토단백질 유전자 조절영역(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성이 있는 알파-1-항트립신 유전자 조절영역과(Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); 골수세포에서 활성이 있는 베타-글로빈 유전자 조절영역(Magram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); 뇌 속의 올리고덴드로사이트 세포에서 활성인 미엘린성 단백질 유전자 조절영역(Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골근육에서 활성인 미오신 경 사슬-2 유전자 조절영역(Shani, 1985, Nature 314:283-286); 시상하부에서 활성인 고나도트로핀 방출호르몬 유전자 조절영역(Mason et al., 1986, Science 334:1372-1378)등이 포함된다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 3차원 배양물을 사용하여 유전자 형질도입을 용이하게 한다. 예컨대, 재조합 바이러스 발현벡터를 포함한 섬유아세포의 3차원 배양물로 재조합 바이러스를 기질매트릭스와 접촉한 세포속에 전달할 수 있으며 그 결과, 생체 내에서의 바이러스유전을 모사한다. 3차원 배양계는 현행 DNA 전달감염법보다 더 효과적인 유전자 형질도입을 달성할 수 있는 방식이다.
본 발명의 또다른 구체예에서, 3차원 배양계를 시험관내에 이용하여 고수득율의 생물학적 생성물을 제조한다. 예컨대, 다량의 특별한 생물학적 생성물을 자연적으로 생성하는 세포(즉, 성장인자, 조절인자, 펩티드 호르몬, 항체)나 또는 유전공학적으로 처리된 외부유전자 생성물을 형성하는 숙주세포는 시험관 내에서의 3차원 배양계를 이용하여 클론적으로 확장할 수 있다. 형질전환된 세포가 유전자 생성물을 영양 배지에 분비하면, 이 생성물은 표준분리방법(즉, HPLC, 컬럼, 크로마토그래피, 전기영동법등)을 이용하여, 배지로부터 분리할 수 있다. 바이오리액터는 시험관내에서 3차원 배양물을 공급하는 연속 주입법에 유리한 형태로 고안할 수 있다. 기본적으로, 새로운 배지를 3차원 배양물에 통과시키면 유전자 생성물은 배양중에 방출된 세포와 함께 배양물에서 세척된다. 유전자 생성물은 사용된 배지유출물에서 분리할 수 있다(즉, HPLC 컬럼 크로마토그래피, 전기영동법등으로).
다음의 소단락에서 본 발명의 다양한 구체예를 설명한다. 이것은 단지 설명을 위한 것이며 이에 제한하는 것은 아니다. 본 발명의 3차원 배양계는 다양한 계에서 이용하는 종류의 세포와 조직을 기초로 하여 설명한다. 이 설명은 특히 골수, 피부, 간, 또한 췌장 등을 포함하나 이에 국한되는 것은 아니다. 한편 3차원 배양계를 이외의 다른 종류의 세포와 조직에 대하여 응용할 수 있다고 이해된다. 본 발명은 또한 설명된 각 계에서 얻은 특성 데이타를 실시예로서 보여준다.
6. 3차원 골수배양계
생리학적 조건에 필적하는 시험관계에서 골수 세포 복제를 위해 본 발명의 3차원 배양계를 제공한다. 중요하게도, 이 계에서 복제된 골수세포는 정상적인 골수에 존재하는 모든 세포를 포함하며, 이 모든 종류의 세포가 본래의 골수접종원에 들어있어 배양을 개시한다고 추정한다.
단독배양할때의 골수세포는 그 성장이 제한되지만, 기질세포나 그 분비생성물이 들어있을 경우에는 배양물의 장기성장이 가능하다(Long-Term Bone Marrow Culture, D.G. Wright J.S. Greenberger, eds., A.R. Liss, New York, (1984), pp. 441-156).
본 발명에 있어서, 골수세포는 섬유아세포(태아 혹은 골수원의)를 포함하는 기질세포나 또는 섬유아세포, 대식세포, 망상세포, 지방세포 등을 포함한 정상적인 골수의 기질성분이 함유된 세포의 혼합물과 함께인 공동-배양물 속의 3차원 보조물에서 성장한다. 비장 또는 간장의 대식세포 배양물의 배지나 기질세포 부분집단에서 나온 인자를 배양물에 첨가할 수도 있다. 본 발명의 3차원 배양계는 골수가 본질적인 또는 환경에 의한 질병에 의해 혹은 이러한 질병을 화학요법 또한/또는 방사선으로 치료하여 파괴될 때 다시 이 골수를 재집합시키는 능력이 있는 다효능 조혈계통세포의 증식을 최대화할 수 있음을 보여준다.
종래의 단일층 세포배양법을 사용하면, 골수재집합 활성도(MRA)가 있는 간(stem)세포는 쥐의 장기골수배양물을 지속적으로 복제하는 것으로 나타난다. 그러나, 이 계에서는 성숙 조혈 세포 발현은 골수계통과 단핵세포계통으로 주로 제한된다. 간과 인간이 아닌 영장동물의 골수세포의 단일층 배양물은 분석가능한 원종(CFU-GM, CFU-GEMM, GFU-E, 등)에 있어서 시간에 대한 일정한 감소를 보여준다. 생쥐의 이 단일층 배양물에서 표현된 쥐 성숙세포는 과립구이다. 대조적으로, 모든 혈액세포계통의 조혈원종과 조혈선구물질은 본 발명의 3차원 기질배양계에서 복제 및 증식하는 것으로 나타난다. 더욱이, 분화현상은 생리학적인 방식으로 일어난다. 예컨대, 적혈구, 골수구, 임파구, 대식세포, 거핵구 콜로니는 설명한 바와 같은 본 발명의 계를 이용하는 동일 배양물에서 발생한다. 언명된 원종의 지속적인 증식으로 이 계의 계통세포복제를 예측할 수 있다.
6.1. 골수세포의 수득
접종원으로 이용하는 골수세포는 제공자에게서 직접 얻거나 냉각보존 저장물로부터 구한다. 이 세포는 물리적인 방법으로 망상질에서 1차 분리한다. 따라서, 제공자의 장골융기부를 통해 소량(말초 혈액 부유물 당 10-15cc의 골수)을 흡출한다. 이식 목적으로, (a) 배양 또는 냉각보존용으로 골수를 취할 때 각 개인의 나이가 40세 이하이고 또한, (b) 대상자가 질병이 없을 때 가장 이상적인 결과를 얻을 수 있다:하지만 본 발명은 반드시 이러한 기준에 제한시키지는 않는다. 제공자의 골수를 흡출하는 방법도 공지되었다. 골수흡출장치와 방법의 예가 미국특허 제4,481,946호와 제4,486,188호에 나와 있다.
골수를 배양하여 전이성 질병이나 혈액연관 불치병에 걸린 환자를 치료할 경우, 환자의 골수를 배양하기에 앞서서 물리적 혹은 화학요법적인 방법으로 악성세포를 제거해야 한다. 현재, 물리적인 또한 화학요법적인 제거법을 사용하면 악성세포와 정상세포를 무차별적으로 죽이기 때문에 상당크기의 표본이 필요하다. 그러나, 악성세포제거를 위한 선택적인 방법도 최근에 개발중이다. 예컨대, 독성작용제를 표적으로 하거나 특히 악성세포를 죽이기 위하여 악성세포에 대한 특이성이 있는 항체를 실험한다. 이 선택적 제거법은 표본크기가 작을 때 효과적이다. 본 발명의 3차원 배양계는 소형표본을 효과적으로 제거할 수 있고 남아있는 건강한 세포를 확장할 때 적합하도록 만든다. 제공자로부터 분리된 골수를 복제하거나 또는 차후에 복제할 수 있도록 보존한다. 골수를 저장할 경우, 컴퓨터 냉동공학장치를 이용하여 점차로 냉동시킨다. 예를 들어, 신선한 골수/혈액부유물에서 동일부피로 표본을 취하여 멸균 Nunc관에 넣고 냉각보존실에서 4℃의 온도로 될 때까지 잘게 부수어진 얼음이 담긴 비이커에 담아둔다. 표본을 소실에 넣기 직전 멸균법을 이용하여 각 Nunc관에 용액을 첨가하여 냉각보존물인 디메틸술폭시드와 글리세로를 각각 7%와 5%의 최종농도로 되게 한다. 냉동프로그램은 표본을 넣은 직후에 개시된다. 냉동프로그램 제1호(CryoMed Model Number 1010 조절기가 달린)를 이용한다.
이 방법을 사용하면, 80℃수조에서 냉각 및 급속 해동후의 세포생존력은 트립판 블루 배출법으로 분석했을 때 90%를 초과한다. 덧붙여서, 냉동후 최초의 콜로니 형성 단위 배양물(CFU-C)의 80% 이상을 회수할 수 있다. 사전측정된 온도와 시간곡선에 따르는 골수와 생물학적 물질을 냉동하기 위한 시스템의 실시예를 미국특허 제4,107,937호와 제4,117,881호에서 발표한다. 모든 세포대사활성이 중지되는 온도인 -196℃의 액체질소의 액상에 저장하는 것이 바람직하다.
6.2. 3차원 기질격벽의 형성
골수부유물에서 나온 기질세포를 다른 골수성분들로부터 분리한다. 적절한 공지방법을 이용하여 이것을 달성한다. 예를 들어, 골수부유물을 저속 즉, 3,000×g으로 20분동안 원심분리하여 대식세포, 섬유아세포, 지방세포, 단핵혈액세포, 망상세포, 내피세포 등을 포함한 세포의 백색기저부(즉 버피 코오트(guffy coat))를 수득한다. FBS, HS, 히드로코티손 헤미숙시네이트 및 적절한 항생제로 보충되는 RPMI 1640배지와 같은 적절한 배지에서 버피 코오트의 세포를 현탁할 수 있다.
그후, 이 세포를 3차원 매트릭스위에 놓는다. 접종원으로서 고농도 기질세포를 사용할 경우, 기질서포트 매트릭스는 단시간동안 적절한 준합류수준에 도달한다. 예컨대, 1ml당 약 10 내지 10 기질세포는 배양 접시나 그외의 적절한 소실에 담긴(즉, Titer-Tek containers) 멸균나일론 메쉬처럼 3차원 매트릭스위에 있다(Tetko Corp. of New York, New York, USA).
접종된 메쉬는 적절한 부피의 영양배지가 포함된 배양플라스크에 담는다. 3차원 배양물을 부유하며 부분적으로 배지표면 아래에 침전한다. 배양물을 약 90% 이상의 상대습도로된 주위공기에서 또한 약 5% CO에서 온도로 배양시킨다. 주로 섬유아세포인 기질세포는 나일론 섬유를 따라 성장하고 싼후 메쉬 구멍쪽으로 생장한다. 접종원으로 사용하는 세포의 농도에 따라서, 이 처리방법은 약 5 내지 18일이 소요된다. 기질세포의 준합류도는 조혈 세포 접종이전의 제1도에서 보는 바와 같다.
3차원 매트릭스에서 성장하는 부유 기질 세포를 골수세포에 대하여 전술한 바와 같은 동일기술에 따라 냉각보존할 수 있다. 메쉬 위의 준-합류세포를 냉각보존하기 위해, 최종농도가 각각 5%와 15%인 디메틸술폭시드와 글리세롤같은 냉각보존물질로 보충된 RPMI 1640과 같이 적절한 배지를 포함한 Nunc 관속에 나일론 메쉬를 둥글게 감아서 넣는다. 메쉬상의 기질세포를 +10℃ 내지 -40℃에서 -1℃/분의 초기냉각속도로 냉동시킬 수 있다. 최종단계의 온도가 -84℃로 될 때까지 -2 내지 13℃/분의 냉각속도로 실행하는 것이 최적이다. 이 과정에서 약 20 내지 25%의 기질세포가 나일론 메쉬로부터 떨어진다.
6.2.1. 골수기질세포성장의 강화
골수기질세포의 성장에 있어서 초기 속도 제한 인자는 골수기질세포중에 포함된 섬유아세포의 비교적 낮은 유사분열지표이다. 이 세포의 성장과 세포외 매트릭스성분의 침착은 고속 세포 분할을 하는 배양된 인체 태아 섬유아세포의 배지로부터 나온 자가-조절성장인자 또는 히드로코티손 헤미숙시네이트를 첨가하면 강화된다.
또한 메쉬에 대한 섬유아세포의 접착과 성장은 가용화된 콜라겐 제Ⅰ형 내지 Ⅳ형을 메쉬에 사전-피복하거나 태아 인체의 섬유아세포 혹은 어떤 콜라겐형을 합성하는 능력을 기초로 하여 부분집합된 어른 섬유아세포(이후부터 성장 강화 섬유아세포로 칭함)에 의해 분비된 콜라겐으로 피복하거나 둘러싸인 메쉬를 사용하므로써 강화할 수 있다. 이점에 있어서, 성장강화 섬유아세포는 합류에 도달했을때(태아 인체 섬유아세포의 경우는 5 내지 7일간, 어른 섬유아세포의 경우는 14 내지 18일간)의 메쉬로부터 약한 트립신처리에 의해 향상되고 상술한 것처럼 기질골수세포와 함께 접종하거나 앞으로 사용할 것에 대비하여 냉각보존한다.
본 발명의 한 구체예에서, 콜라겐과 그외의 세포의 매트릭스성분을 합성하는 성장 강화 섬유아세포는 준합류에 도달할 때까지 메쉬에서 성장한다. 조혈성과 기질 골수 세포의 혼합물을 준합류성장 강화 섬유아세포 메쉬망에 접종한다.
성장강화 섬유아세포의 생장, 서브세팅 및 냉동보존방법은 다음과 같다.
(a) 성장강화 섬유아세포 배양
적절한 방법을 사용하여 성장강화 섬유아세포를 배양한다. 예를 들어, 1μg/ml 히드로코티손 헤미숙시네이트와 2μg/ml 겐타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 또한 퓨기존(fungizone)같은 항생제를 보충한 2-10% FBS나 2-10% HS로 보충된 RPMI 1640처럼 적당한 배지에서 섬유아세포를 성장시킨다. 약 90% 이상의 상대습도로된 35℃ 내지 37℃의 주위온도에서, 배양물을 약 5% CO에서 성장시킨다.
(b) 성장강화 섬유아세포의 서브세팅
섬유강화 섬유아세포를 서브세팅하기 위해 다수의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 골수부유물의 버피 코오트에서 나온 약 5.0×10 섬유아세포, 내피-섬유아세포, 또는 시체의 간에서 취한 섬유아세포를 마이크로타이터 웰(mm )에 놓고 생장시켜 합류시킨다. Ca 나 Mg 가 없는 Hank's 평형염용액으로 4회 내지 5회정도 반복 세척하여 세포가 배양용 웰(well)에서 분리되도록 한다. 마이크로타이터 판위에 남은 매트릭스는 직접 혹은 간접라벨에 의해 가시화된 각종 격벽성분에 대하여 단일클론항체를 이용한 간접면역형광으로 검사할 수 있다. 예컨대, 효소-라벨 혹은 형광성 이소티오시아네이트-라벨화된 토끼 항-생쥐 면역글로부린 G를 이용하여 특별한 매트릭스성분에 대한 특이성이 있는 미분류된 생쥐 IgG 단일클론항체의 결합을 가시화할 수 있으며 그 결과 존재하는 콜라겐형을 확인할 수 있다. 다수의 방법으로 반대선별이 가능하게 된다. 예컨대, 현탁된 세포는 보체(IgG, IgM)를 활성화시킬 수 있고 특정 매트릭스성분(즉, 콜라겐 제Ⅰ형 내지 Ⅳ형, 엘라스틴, 트로포엘라스틴, 또는 피브로넥틴)이 되는 이소타입 단일클론 항체로 처리하여 각 생성물을 합성할 수 있는 세포 부-집단을 분리한다. 그후 다시 기니아픽 보체로 이 세포를 처리하면 단일항체가 결합한 세포는 손상되거나 파괴된다. 표본에 남은 생존세포를 전술한 바와 같이 마이크로타이터 웰에 다시 올려놓고 합류하도록 생장시켜 향상시킨다. 분리법의 효과는 직접 혹은 간접라벨링 기술에 따라 가시화된 적절한 단일클론항체를 포함하고 있는 생존세포에 의해 분비된 매트릭스를 검사함으로써 확인가능하다.
조혈세포의 최적 생장을 위해, 초기 매트릭스에는 콜라겐 Ⅲ, Ⅳ, Ⅰ이 6:1:1의 비율로 포함되어야 한다.
(c) 성장강화 섬유아세포의 냉각보존
기질세포에 대해 상술한 것과 같은 방법을 사용하여 성장강화 섬유아세포를 냉각본존할 수 있다. 기질세포와 유사하게, 성장강화 섬유아세포를 냉동과정에서 메쉬로부터 분리한다. 그러나, 이 매트릭스는 아직까지 골수기질세포에 접착하고 있으며 따라서, 조혈세포성장에 도움을 주는 매트릭스의 형성에 필요한 시간을 감소시킨다.
6.3. 조혈세포로 접종
골수세포가 적절한 배지(예를 들면, FBS, HS, 아히드로코티조운이 보충된 RPMI/1640 그리고 적절한 항생물질이 사용될 수 있었다)내에 현탁되며 3차원 기질서포트에 접종한다. 이들 세포는 신선한 것이거나 예를 들어 한냉보존된 샘플에서 80℃의 고온물에서 신속하게 데워서 사용할 수 있다. 준합류된 기질 세포 메쉬망에 적절한 농도 세포를 접종한다. 예를 들어 10 내지 10 세포가 25mm 플라스틱 배양 플래스크에 있는 3차원 기질 매트릭스로 주입되며 약 33℃ 내지 34℃ 및 5% CO순환공기에서 성장된다. 이들 배양과 관련된 습도는 약 90%를 초과하여야 한다. 3일이 지난뒤에, 배양온도는 약 35℃ 내지 37℃로 상승되어야 한다.
대개 조혈세포는 준합류 기질 세포에 의해 형성된 천연 주머니내에서 성장할 것이며 자손 세포는 세포접착층내에 남아있게 될 것이다. 이같은 접착층은 메쉬에 직접 부착된 세포이거나 메쉬에 직접 부착된 세포에 부착시키므로써 간접 연결된 것들이다. 비록 조혈 콜로니형성이 신속하게 발생된다 해도 기질 접종은 접종물이 기질 서포트 매트릭스가 있는 지역에 주로 접종되기 때문에 조혈단계에서 속도 제한 단계인 것으로 보인다. 콜로니형성은 부분적으로 발생된 기질층에 의해 형성된 자연 격자내에서 발생되며 매트릭스의 가장 바깥측 표면에서 또한 나타나 보인다. 표면 콜로니는 매트릭스내 콜로니보다 다소 작으며, 때때로 비-흡착 영역 일부인 것으로 보인다. 실제 이들은 느슨하게 부착되며 공급 이후에도 남아 있다. 단일층 형태의 LTBMC에서 지속적으로 볼 수 있는 세포들은 가상-흡착층(pseudo-adherent layer)(Coulombel 등 1983, 혈액 62; 291-297)으로 칭한다.
4,5일이 지난뒤에 성숙된 과립성 백혈구, 단핵 세포, 그리고 적혈구가 사이토스핀 제조시에 관찰되는 바와 같이 비-흡착 층내에 나타난다. 7 내지 10일이 경과된 후에 다수의 조혈 콜로니는 메쉬 격자내에서 관찰될 수 있으며 CFU-C 혼합된 콜로니 및 림프성 콜로니와 형태학적으로 양립한다. 거대 핵 세포 성장이 제한되나 이같은 매트릭스에서도 마찬가지로 관찰될 수 있다. 평균 3.6cm 배양은 1주일에 450 내지 950 CFU-C를 발생시킨다.
기질 세포 그리고 같은 개체(오토로고스)로부터 유도된 조혈세포로 구성된 균주는 매주 2회 공급되어야 한다. 또다른 개체(이형)으로부터 유도된 기질 세포 메쉬 워크로 주입되어진 환자의 골수로 이루어진 균주는 매주마다 3회 공급되어 비-흡착 층으로부터의 성숙된 면역감응 세포의 적절한 감소를 보장케 하여야 한다.
6.4. 입체적 골수 균주의 장기간 성장
선택에 따라, 3차원 골수배양물은 장기간 성장을 향상시키기 위해 단핵 세포와 접합될 수 있다. 주변 혈액 단핵 세포가 Ficoll-hypaque 또는 Percoll을 사용하여 헤파린처리한 현탁액으로부터 준비될 수 있다. 주변혈액 세포 및 골수 조혈세포는 같은 개체(antologous)로부터 유도되는 것이 좋다. 이들은 정맥천자를 통해 획득되며 골수표본을 취하여 냉량보관된다. 또다른 주변혈액 세포가 배양과정중 필요하다면 환자로부터 조달될 수 있다. 그러나 만약 전이성 질병이 의심이 간다면 샘플을 앞서 언급된 바와 같이 정화(purging)해야 한다. 단핵 세포는 골수세포에 접종후 바로 3차원 배양물에 접종할 수 있다. 예를 들어 5×10 내지 10 단핵 세포(단세포 아집단이 이같은 단계용으로 단핵 세포층내에서 바람직한 세포형태이다)가 골수 조혈 세포와의 초기 접종 4,5일후 메쉬워크에 접종될 수 있으며 그 뒤 매 3주마다 접종될 수 있다. 이같은 과정은 매주마다 관찰되는 바에 의하면 10 내지 13%씩 조혈성을 향상시킬 수 있다.
우리의 경험에서, 합류 기질 세포 균주는 기껏해야 조혈성을 지탱시킬 뿐이다. 만약 이들에게 필요한 기질-유도된 성장/조절 인자가 제공된다면 인체 조혈성 선조물질은 무한성장할 수 있다. 본 발명의 3차 배양계는 기질 세포가 준합류 상태를 유지하고 따라서 오랜기간동안 조혈을 위해 필요한 인자를 생산할 수 있게 한다. 그러나 3차 배양계의 추가 조작에 의해 이 기간을 연장시킬 수 있다.
예를 들어 초기 골수샘플은 다수의 분취량으로 나뉘어질 수 있으며, 각각이 약 10 개의 조혈세포를 담고 있다. 이들 각각은 준합류 기질 세포 메쉬워크에 접종시킨다. 균주는 역상 현미경을 사용하여 직접 관찰하고 공급후에 사용된 배지의 사이토스핀 물질에서 볼 수 있는 것과 같이 비-흡착 세포의 차등적 계수에 의해 모니터될 수 있다. 합류되기전에 균주는 콜라게나아제로 처리하고 약 6-10분 동안 약하게 초음파 파쇄시킨다. 배양물로부터 분리된 조혈세포 및 기질 세포는 밀도차 방법에 의해 분류시킨다. 조혈세포는 혈구계산반을 사용하여 계수될 수 있으며 앞서 설명된 방법을 사용하여 약 50% 한냉보존된다. 조혈세포의 나머지 50%는 약 10 세포를 포함하도록 분취하고 준합류 기질세포에 접종한다. 이들이 합류되면 동일과정을 반복한다. 이같은 기술로 인하여 (a) 필요한 성장 요소를 생산시키는 미소환경을 제공하므로써 조혈세포의 성장을 영속시키며, (b) 이식에 적합한 숫자가 달성될때까지 조혈 조상세포를 기탁하는 지속적인 은행을 만들 수 있다.
6.5. 3차원 장기 골수 배양물내에 조혈성 조절
사람 골수의 다양한 세포성분을 별도 배양물로써 3차 배양계에 계대배양할 수 있다. 대식세포, 망상세포, 지방세포 및 섬유아세포가 별도 생장시키고 여러 물질로 처리하여 이들의 분비활성을 변형시킨다. 섬유아세포 활동의 조절은 앞서 설명하였다.
3차원 메쉬워크상의 장기 인체 골수배양물내에 조혈성은 배양물에서 생장할 때 다음과 같은 방법으로 골수의 대식세포(Kupffer 세포)분비에 의해 변조될 수 있다. Kupffer 세포가 예를 들어 프로나아제 처리에 의해 이들 기관기질로부터 분리될 수 있다. 요약하면 조직표본이 프로나아제 용액[0.2% 프로나아제(Calbiochem)와 Geys' 밸런스 염용액(BSS)]내에서 1시간동안 배양된다. 이같은 용액의 pH는 예를 들어 1N NaOH를 사용하여 7.3 내지 7.5로 유지되어야 한다. 데옥시리보 핵산 분해효소(0.5mg; Calbiochem)가 상기 과정중 30분 간격으로 첨가되며 생성된 세포 현탁액을 여과시키고 10분동안 350×g에서 원심분리한다. 펠렛은 Geys' BSS로 재현탁시키고, 간엽세포(대식세포 및 상피세포)가 Percoll(Pharmacia) 농도차를 사용하여 세포찌꺼기 및 성숙된 혈액 세포로부터 분리시킨다. 생성된 세포분취물은 10% 태아 송아지 혈청이 보충된 변형 Dulbecco's 배지를 사용하여 3분간 3회에 걸쳐 세척되어야 하며 약 3 내지 4×10 개 세포를 포함하는 양으로 플라스틱 배양접시 위에 넣는다.
하루동안 배양한 뒤에 비-흡착 세포는 배양배지로 씻어내어 제거하고 흡착세포는 약 80% 상대습도의 실내환경에서 약 6% CO로된 가스 혼합물속에서 33℃로 유지시킨다. 이들 세포의 성장 및 분비활동은 (a) CO:O비를 변환시키고, (b) 라텍스 비드로 배양물들을 처리하며, (c) 실리카로 배양물을 처리하고, (d) 배지에 프로스타글라딘 E, E또는 F를 추가하며, 그리고 (f) 배지에 인터루킨1 또는 인터루킨2를 보충시키므로써 촉진될 수 있다. 대식세포 분비생성물은 이들 과정/약물에 의해 조정될 수 있다.
이들 대식세포의 분비생성물로 조건화된 배지는 장기 골수배양물 조혈성/과립 형성 비를 조정하는데 사용될 수 있다.
6.6. 3차 골수 배양물 시스템의 용도
6.6.1. 이식
본 발명의 3차 골수배양물은 건강한 골수세포를 파괴하거나 이들의 능력을 억압시키는 질병의 치료에 사용된다. 이같은 치료는 악성 혈액 및 골수로 전이되는 다른 종양을 치료하는데 특히 효과적이다. 본 발명의 이같은 특징은 환자의 골수가 환경요소(예를 들어, 방사선, 독소등), 골수에 직접 영향을 주지 않는 질병에 요구되는 화학요법 및 방사선에 의해 역으로 영향을 받게 되는 환자를 치료하는데 효과적이다. 이들의 경우 건강한 환자로부터의 골수세포가 꺼내어 보존하여, 골수를 직접 파괴하거나 골수에 역으로 영향을 미치게 하는 병을 가지는 환자에 재생 및 투여하여야 한다.
본 발명의 3차원 균주시스템은 골수이식을 필요로 하는 환자에게 여러 가지 장점을 제공한다. 만약 환자가 자신의 세포를 이식받는다면, 이는 자가(autologous) 이식이라 하며, 이같은 이식은 골수이식 거부, 즉 이식편에 대한 숙주 거부 반응원인을 없애준다. 만약 골수가 악성 또는 병든 세포를 포함하면, 본 발명의 3차 배양 시스템을 사용하여 때보다 효과적으로 일소할 수 있다. 앞서 설명된 바와 같이, 악성 또는 병든 세포를 일소하기 위한 선택적 방법은 소량의 골수세포에서도 적절하다. 여기서 설명된 3차원 배양시스템은 이를 가능하게 한다. 따라서 환자로부터 획득된 소량 샘플이 건강한 세포에 영향을 끼치지 않고 악성세포를 죽이는 선택적 방법을 사용하여 보다 효율적으로 일소될 수 있다. 남아있는 건강한 세포는 다음 본 발명의 3차원 배양시스템을 사용하여 크게 확장될 수 있다. 또한 본 발명의 공정은 화학요법제 및 방사선을 사용하여 신조직형성질환을 보다 적극적으로 치료하게 한다. 현재 이같은 치료는 골수의 독성으로 인해 그 범위가 제한된다.
6.6.2. 환자의 질병 감시
암이나 다른 질병을 가진 환자의 경우 환자의 골수부분을 빨아내고 샘플을 시험하므로써 환자의 상태를 감시하는 것이 효과적이다. 이같은 방법은 임상적으로 명확해지기 전에 전이 또는 재발생을 감지할 수 있다. 골수세포를 시험하므로써 탐지될 수 있는 다른 질병을 갖는 환자는 이같은 방법으로 역시 감지될 수 있다.
본 발명의 3차 시스템을 사용하여 흡취된 그러나 일소되지 않은(깨끗해지지 않은) 골수 표본으로부터 유도된 세포의 장기성장은 염색체 이상이 있는 전이세포와 조혈세포의 탐지를 강화시킨다. 이같은 세포들은 본 발명의 3차 배양시스템에서 무성생식에 의해 팽창될 것이며, 따라서 보다 용이하게 탐지될 것이다. 이들 세포들은 새롭게 흡취된(배양되지 않은) 골수의 통상적인 표본에서는 탐지되지 않을 수 있다.
6.6.3. 화합물 선별
의약, 항-종양제, 발암물질, 식품첨가제 및 기타 다른 물질이 골수에 대한 세포독성은 본 발명의 시험관내 골수복제 시스템을 사용하여 검사할 수 있다.
먼저 골수세포의 안전된 성장 균주(기질세포와 조혈세포 모두를 포함함)를 만든다. 다음 배양물들을 다양한 농도의 시험물질에 노출시킨다. 이들 시험물질로 배양시킨 이후에 배양물들의 최대 내성 약량(HTD)-최초로 형체학적인 이상이 나타날 때 시험물질의 농도-를 결정하기 위해 상현미경으로 시험한다. 세포독성 시험은 본 기술분야에 숙련된 자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 이같은 입체적인 시스템내에 있는 세포 생존력에 평가하기 위해 다양한 슈펴바이탈 염료를 사용하여 수행될 수 있다. HTD 결정은 또다른 시험을 위한 농도범위를 제공한다.
일단 시험범위가 결정되면, 시험물질의 농도를 변화시켜 본 기술분야에 숙지의 지식을 가진 자들에게 공지된 수단에 의해 골수배양물을 만드는 여러 다른 세포종류의 생존력, 성장 및 형체에 대해 이들의 영향을 테스트할 수 있다.
마찬가지로, 약제의 유용한 영향도 시험관에서 3차 배양시스템을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들어 혈액세포 형성을 향상시킬 수 있는 성장요소, 호르몬, 약제를 시험할 수 있다. 이같은 경우에, 안정된 성장배양물에 시험물질을 노출시킨다. 배양후, 시험물질의 효과를 나타내는 생존력, 성장, 형체, 세포종류 등에 대해 배양물을 테스트한다.
본 발명에서 상술하는 다른 3차 세포 배양물 시스템은 세포독성 시험 및 의약 선별에 채택될 수 있다. 세포독성 분석에서 사용되는 3차 골수배양물의 사용예는 섹션 18에서 제공된다.
7. 입체 피부 배양계
본 발명의 3차 배양계는 생리학적 조건들에 필적하는 시스템에서 생체내 상표피 및 표피요소 복제를 제공한다. 이같은 시스템에서 복제되는 세포는 형체학적으로 그리고 조직학적으로 정상적인 상표피 및 표피성분을 형성시키도록 적절히 분리된다.
상표피 및 표피세포의 성장을 위한 3차 공동-배양계 사용은 현재 사용된 단일층 시스템에 비해 여러 장점을 갖는다. 이같은 모델은 정상적인 세포-세포간 작용 및 자연 성장요소의 분비를 허용케 하며, 생체내에서 발견되는 것과 동일한 연결조직 네트워크를 만들어내도록 하고, 특히 기질 세포는 특정타입 및 특정종 콜라겐을 만들어낸다. 생성된 완전한 이동가능한 메쉬워크는 이식될 수 있으며 한랭보존되거나 세포독성 및 의약 메카니즘 연구에서 대상조직으로 사용되기도 한다. 또한 이같은 모델은 표피 동등물을 형성시키기 위해 섬유아세포 단독 성장 또는 완전한-두께 표피 동등물을 위한 케라틴세포 및 흑혈구와 함께 섬유아세포의 성장을 허용케한다. 이같은 3차시스템 내 모든 세포는 대사적으로 활성을 유지하고 세포분열을 하는데 이는 다른 모델에 없는 장점이 된다.
본 발명의 3차 표피 배양은 화합물 스크리닝, 이식 및 피부이식 그리고 피부질병 및 치료의 연구 등을 위한 기질로서 사용되는등 다양한 용도를 갖는다. 예를 들어 잠정적 독성의 화학물질을 철저하게 검사함이 일반적으로 필요한 것으로 인식되고 있으며, 의약, 화장품, 식품첨가물용으로 생체외에서 민감하며 재생가능한 단기간의 분석을 발전시킬 필요가 분명한 것이다. 여기서 설명된 3차 피부 모델은 한 분석기질로서 조직-동등물의 사용을 허용하며 생체 내 상태를 거의 닮고 있는 시스템내에서 정상적인 세포간 상호작용의 장점을 제공한다.
화상을 입은 환자의 피부대체가 필요하다. 미국과 유럽에 여러 센터는 화상 및 만성궤양의 상처를 영구히 덮기 위해 배양된 인체의 케라틴세포 동종이식편과 자가이식물로 사용하였다(Eisinger et al., 1980, Surgery 88:287-293; Green et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:5665-5668; Cuono et al., 1987. Plast. Reconstr, Surg. 80:626-635). 이들 방법은 성공적이지 못하며 최근 연구에서는 치료된 이식물내에 수포 및 피부파멸등이 나타나는데 그 이유는 이식된 상표피층 아래에서 형성된 하나 또는 둘이상의 연결조직 성분이 비정상이기 때문이다(Woodley et al., 1988, JAMA 6:2566-2571). 본 발명의 3차 피부 배양계는 상표피 및 표피모두의 피부 동등물을 제공하며 현재 사용된 배양된 케라틴 세포 이식에서 특징적인 문제를 극복한다. 세포독성 및 피부대체에 추가하여; 3차 피부매양물은 피부질병을 연구하고 새로운 의약과 치료 양상을 개발하기 위한 모델로서 사용하며 자연적으로 분비되는 약제 원료로서 사용함을 포함하는 여러 산업분야에 응용될 수 있다.
7.1. 3차 기질 서포트의 확립 및 표피 동등물의 형성
섬유아세포를 3차 매트릭스에서 접종시키고 생장시켜 준합류시켜 표피 동등물을 만든다. 본 바명의 한 바람직한 실시예에서 섬유아세포는 전체 성장 기질이 덮혀질때까지 증식되며, 섬유아세포가 합류에 도달한때까지도 섬유아세포는 지속적으로 분열하는데 그 이유는 3차 배양물이 세포의 탈출을 허용하여 접촉 저해를 막기 때문이다. 비록 접종물에 어떠한 섬유아세포가 사용될 수도 있겠으나 이들이 적절한 타입의 콜라겐을 침착시키고 다른 표피 성분을 공들여 만든 것이기 때문에 피부 섬유아세포를 사용하는 것이 유리하다. 섬유아세포는 동종이계 혹은 자기유래의 것일 수 있다. 피부 섬유아세포는 표피조직의 기계적 및 효소적 분리에 의해 준비된 세포 현탁액으로부터 쉽게 획득된다. 이같이 획득된 세포 현탁액이 플레이트위에 놓이는때 섬유아세포는 다른 세포들보다 신속하게 부착될 것이며 따라서 성장하여 합류될 수 있으며 약한 효소적 처리에 의해 들어올려지고 앞서 설명된 것처럼 3차 매트릭스로 배양된다.
일단 3차 매트릭스에 접종하면, 섬유아세포의 흡착이 쉽게 보여지며(예를 들어 수시간내에) 섬유아세포는 수일내에 매트릭스 개구를 가로질러 펼쳐지기 시작된다. 이들 섬유아세포는 대사적으로 활성을 가지며 세포의 매트릭스를 분비하고 활성 섬유아세포와 콜라겐으로된 표피 동등물을 신속하게 형성시킨다. 3차 매트릭스상의 섬유아세포의 약 60% 합류가 나중에 접종된 상피 세포의 성장을 지지하는데 요구된다.
섬유아세포만으로도 표피 동등물로 작용하는 3차 기질매트릭스를 형성기키기에 충분한 반면, 다른 기질 세포가 3차 매트릭스를 배양시키기 위해 사용될 수 있다. 이들로는 내피세포, 혈액주변세포, 골수세포, 단세포 임파세포, 혈장세포, 지방세포등이 있다.
7.2. 상피 세포를 표피등가물에 접종
상피 및 표피층 모두를 포함하는 완전한 두께의 피부를 배양하기 위해 상피세포를 표피 대응물에 배양된다. 이같은 목적을 위해 흑혈구 및 케라틴세포를 동시에 혹은 차례로 접종시킨다. 예를 들어 케라틴세포는 기질매트릭스에 미리 접종된 준합류 흑혈구 위에 접종시킬 수 있다.
흑혈구 및 케라틴세포는 섬유아세포 기질 세포와 관계에서 동종이계 또는 자가유래의 것일 수 있으며, 표피 및 상피층을 분리시키기 위해 트립신과 같은 소화 효소에서 피부를 배양하는 것과 같은 공지의 과정을 사용하여 피부로부터 분리될 수 있다. 예를 들어 각질세포와 흑혈구는 다음과 같이 분리될 수 있다. 예를 들어 포피와 같은 조직샘플이 잘라내지므로써 전 표면이 항생물질에 쉽게 노출될 수 있다. 조직은 먼저 약 20분동안 농축된 항생물질 용액으로 씻겨내며, 각각 10분간 2회 세척한다. 다음, 조직의 바깥측 부분은 작게 조각내고 0.15% 트립신 용액내에 넣었다가(칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS속에) 곧바로 빼낸 다음 동일 트립신 용액이 담긴 새로운 용기내에 넣고(용액으로 모든 조직이 덮여지도록) 약 2℃-8℃에서 밤새 냉장된다. 다음날, 조직 조각들을 트립신 용액으로부터 꺼내 구부러진 쪽집게를 사용하여 표피로부터 상피를 분리한다. 상피는 원뿔 튜브내에 넣고, PBS(칼슘 혹은 마그네슘 없이) 내 약 0.15% 트립신을 사용하여 조직을 단일세포 현탁액으로 절단하고, 이같은 과정을 실행하기 위해 샘플이 파스퇴르피펫 안팎으로 반복하여 흡출시킨다. 샘플이 단세포 현탁액으로 될 때 1400g으로 약 7분동안 원심분리시키고 성장 배지나 0.01mg/ml PMA를 포함하는 성장 배지에서 다시 현탁시켜 흑혈구를 선택한다. 따라서, 각질세포 또는 흑혈구 배양물을 만들 수 있다. 상피 세포는 현탁시키고 표피 상응물을 접종하는데 사용될 수 있다. 또는 상피 세포 현탁액이 도말되면 흑혈구와 각질세포는 차별적 접착력에 따라 분리된다. 분리된 흑혈구는 먼저 표피 동등물에 접종하여 각질세포의 접종전 수일동안 성장하도록 한다. 이같은 조직은 신속히 성장되며 외부에서 공급하는 성장요소 없이 영양배지내에서 유지될 수 있다.
모든 피부 대체의 단점으로는 이식된 부분에서의 모발 여포 세포 및 땀 그리고 지방 분비선이 부족하다는 것이다. 이같은 결핍은 결국 환자의 체온을 정상적으로 조절하는 능력을 잃게 하며, 환자의 피부가 심하게 건조되고 제어할 수 없게 된다. 이같은 문제를 감소시키기 위해, 영향을 받지 않은 피부 부분으로부터 생검으로 제거하여 표피 동등물에 이식한다. 전략적으로 이들을 위치시키므로써 생검 여포세포와 관련된 그랜드가 이식위치내로 삽입된다. 생검크기는 약 4cm 내지 8cm이며 표준 베이커 펀치(Baker's punch)를 사용하여 떼낸다. 동등한 크기의 생검을 표피 이식으로부터 떼내어 여포세포를 포함하는 이식물로 대체하고, 따라서 조직학적으로 정상적이며 기능적으로는 정상 피부와 이식된 부위를 만들 수 있다.
일례로서, 3차원 피부 세포 배양 시스템은 다음과 같이 만들 수 있다:
(a) 섬유아세포를 메쉬에 부착하고 약 7-9시간동안 생장시켜 준합류시키고 시험관내 골수 복제시스템에서 사용된 섬유아세포의 생장을 강화시키기 위해 앞서 설명된 것처럼 콜라겐 타입 Ⅰ과 Ⅲ를 침착시킨다.
(b) 흑혈구를 기질 메쉬위에 놓이며 약 5일동안 성장시켜 준합류시킨다.
(c) 각질세포는 준합류 흑혈구에 접종한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 3차원 피부 세포 배양 시스템은 다음과 같이 만들 수 있다:
(a) 섬유아세포가 메쉬에 부착되도록 되며 약 14일간 성장시켜 합류되도록 하고 콜라겐 Ⅰ과 Ⅲ을 침착시키도록 한다.
(b) 섬유아세포가 기지 메쉬위에 놓이며 약 5일간 생장시켜 준합류되도록 한다.
(c) 각질세포는 준합류 흑혈구에 접종한다.
특히 본 발명의 실시예는 예를 들어 화상 환자의 경우, 상해를 받은 바로 직후 상처를 입은 곳에 덮을 수 있는 장점이 있고, 이같은 경우 표피에 상응하고(이하 신표피라 칭함), 주로 섬유아세포로 구성된 본 발명에 따른 3차 세포배양물을 상처위에 놓일 수 있으며, 각질세포 및 흑혈구를 뒤이어 적용시킬 수 있다. 신표피는 환자의 자기인지인 것과 동종이계인 세포로 구성된다. 상피 세포는 동종이계인 것이거나 바람직하게는 환자 자기유래인 것일 수 있다. 본 발명은 생체 또는 시험관에서 상피 세포가 첨가될 수 있는 살아있고 생장가능한 신표피의 이식을 포함하고, 환자자신의 세포는 이식된 신표피를 확산시키도록 될 수 있다.
7.3. 입체 피부배양의 형태학 특징
3차원 기질의 형태학 특징은 매트릭스에 접종된 섬유아세포는 오프닝을 가로질러 뻗어있으며, 매트릭스 침착을 나타내고 메쉬의 격자로 이동한다. 제1도는 자연히 분비된 콜라겐 묶음사이의 평행한 층으로 이들을 배열시키는 섬유아세포의 능력을 설명한다. 이들 섬유아세포는 빠른 속도로 세포를 분할시키고 단백질을 분비시킨다. 흑혈구는 3차 배양 시스템에서 정상적으로 생장하여 수지상 형상을 나타내며, 색소를 유지하고, 색소를 전달시키는 능력을 보유한다(제6도 내지 제8도).
완전한 두께를 가지는 피부는 여러 방법으로 성장될 수 있으며 공기 경계면을 허용시킨다. 케라틴세포를 공기에 노출시키면 케라틴세포가 보다 신속한 분화되고 각질층의 보다 분비를 증진시키고 이는 피부투과 연구에 매우 중요하다.
피부 연구 및 이식연구에서 현재 사용되는 다른 것들에 비해 이같은 세포배양계의 주요한 장점은 3차 매트릭스내의 섬유아세포는 위에서 설명된 바와 같이 합류 또는 준합류된 상태에서 대사 활성을 유지하며 자연 성장 요소와 자연발생 콜라겐 타입 Ⅰ과 Ⅲ을 분비한다는 것이다. 이들 세포의 정상적인 대사 활성은 이같은 시스템이 콜라겐 분비에 직접 영향을 끼치는 질병의 연구에서 혹은 표피 및 상피세포 사이의 상호작용이 질병과 일치하는 병리학적 변경을 일으키게 하는 연구에서 뿐아니라 세포독성 검사 등에 유용하도록 한다.
7.4. 생체 내 이식
이식을 위해서는 장선봉합, 젤라틴등과 같은 생물적 분해가능한 재료로 구성된 3차원 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다. 이들은 3차원 배양계의 모든 장점들을 허용하나 이식된 조직이 본래인대로 남아 있도록 하며 메쉬는 자연적으로 분해되어 신체에 의해 흡수되고 그 부위로 이동하는 정상 세포에 의해 대체된다.
3차 기질 매트릭스를 형성시키기 위해 이식을 받게될 환자로부터 획득된 피부 섬유아세포를 사용하는 것이 바람직하다. 또는 태아 섬유아세포 또는 태아 섬유아세포와 환자의 섬유아세포 혼합물이 사용될 수 있다. 그러나 본 발명에 따르면 자기유래, 동종이계성 또는 이종유래된 섬유아세포가 사용될 수 있으며, 실시예 19에서는 인체 섬유아세포가 본 발명에 따라 배양되고 돼지에 성공적으로 이식되는 것을 설명한다. 그러나 중요한 것은 나중에 접종된 상피 세포가 이식 거부의 위험을 최소로 하기 위해 환자로부터의 유도해냄이 바람직하다.
본 발명의 이같은 점에 대한 또다른 실시예에서, 신표피를 형성시키는 3차원 기질 서포트 매트릭스는 그 자체가 환자의 상처에 이식될 수 있다. 이 경우에, 상처난 부위에 환자 자신의 상피 세포는 기질 매트릭스에 침투하며 생체에서 기질매트릭스상에서 증식하여 완전한 두께의 피부, 즉 상피 및 표피층 모두를 형성시키게 된다. 또는 상피 세포는 신표피에 접종될 수 있으며, 상피 세포의 쉬트에 적용될 수 있다. 상처부위가 큰 경우, 완전한 3차 피부배양물을 이식시키거나 신피부 및 완전한 두께의 피부 균주 배양물을 복합하여 사용하는 것이 적합하다. 예를 들어 신피부는 상처의 가장자리에 그리고 상처 중앙부에는 완전두께의 배양물을 각 이식하여 성장 및 치료를 증진시키고, 흉터 형성을 최소화하도록 한다.
7.5. 입체 피부배양물의 시험관내 용도
3차 피부 배양물은 시험관내에서 유지될 수 있으며 독성, 의약작용의 메카니즘 연구, 피부 파괴 및 질병의 연구를 위해 화합물을 분류하는 것과 같은 여러 용도에 사용할 수 있다.
3차 피부배양물은 화합물 및 다른 물질의 세포독성을 시험하기 위한 기질로서 사용될 수 있다. 예를 들어 세포독성 분석에서 사용하기 위해, 인체세포를 6mm 두께로 절단하고 96-웰 평편한 조직배양 미소테스트 플레이트에 넣고 적절한 배지를 공급한다. 다음 시험물질을 각 샘플에 첨가한다. 희석에 의해 시험물질을 유익하게 이용할 수 있는데 이 경우에 독성물질의 농도범위를 테스트할 수 있다. 각 조직형태는 자료를 삼중으로 제공하기 위해 메쉬에서 3줄로 제공된다. 적절히 조절된 분석은 다음과 같이 진행될 수 있다:메쉬단독; 섬유아세포를 접종한 메쉬; 섬유아세포와 각질세포를 접종한 메쉬; 그리고 섬유아세포와 흑혈구 및 각질세포로 배양된 메쉬; 화학물질은 기질 각각에 추가되어 24시간동안 배양된다. 이같은 물질의 세포독성 영향은 여러 가지 방법으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 편리한 방법이면서 잘 알려진 뉴트랄-레드 분석이 사용될 수 있다. 이를 위해 배지를 제거한 뒤, 각 웰을 씻어내고 뉴트랄-레드 염료 0.4% 수용성 보존액을 첨가한다. 다양한 시간 간격을 두고 염료를 제거하며 세포들을 4.0% 포름알데히드, 1.0% CaCl로 빨리 씻어낸다. 약 20분이 경과한 뒤에 각 샘플조직내에 존재하는 염료의 양은 540nm 필터가 장치된 Dynatech 마이크로 플레이트 판독기로 흡수성을 판독하므로써 측정될 수 있다. 흡수된 생체 염료의 양은 각 웰에 있는 생존가능 세포의 수와 직접 비례한다. 판독을 평균내고 결과는 기준 배양물내 기저선 위로 나타나는 흡수도가 된다.
최근의 연구에 따르면 피부는 면역계의 일체이며 활성 요소이다는 것이다.(Cooper et al., 1987, The mechanobullous diseases. In:Dermatology in General Medicine, 3d, Ed., McGraw Hill, NY, pp 610-626) 다양한 면역 활동에 대해 책임을 지는 피부 내 주요한 한 세포는 랑게르한스(Langerhans) 세포이다. 이들 세포들을 새로운 피부 샘플들로부터 준비하고 3차원 피부배양물에 추가하여 면역적으로 완전한 조직계를 만든다. 종래의 조직배양 기술을 이용하여 장기간 배양물내에서 세포를 생장시키는 것은 어렵다. 3차원 배양계내에서 세포들을 성장시키는 능력은 이식, 세포독성 및 질병 메카니즘을 포함하는 연구에서 매우 중요할 것이다. 이같은 종류의 피부배양계는 직,간접적으로 피부를 포함하는 자기-면역파괴 연구에 중대한 영향을 끼치게 된다(홍반성 낭창, 뷸러스(bullous) 유전포창등).
앞서 설명된 바와 같이 3차 피부 배양물은 알레르겐에 대한 민감도의 시험에 사용되었다. 알레르기 시험을 위해 피부배양물에 림프구(또는 플라즈마 세포)와 환자에서 구한 비만세포를 접종한다. 비만세포에 결합되어 있는 IgE 항체(림프구에 의해 발생된)에 브리지(bridge)하는 알레르겐에 배양물을 노출시키면 비만세포에 의해 히스타민과 같은 혈관 활성 중개물질이 방출하게 된다. 배양물에 히스타민의 방출은 측정할 수 있으며 이는 시험 알레르겐에 대한 신체의 알레르기 반응과 연관이 있다.
8. 3차원 간 조직 배양계
간 세포는 인간의 간 생검 또는 사체해부재를 위해 적합한 종래의 방법(Berry 및 Friend, 1969, J. Cell. Biol. 43:506-520)에 의해 분리된다. 간단히 말해 캔뉼러를 문맥 또는 문맥 브렌치내로 삽입하며 조직이 힘이 없어지는 때까지 칼슘이 없거나 마그네슘이 없는 완충액으로 관류시킨다. 다음, 적절한 흐름 속도로 콜라겐 효소용액과 같은 단백질 분해 효소로 기관에 관류된다. 이는 연결 조직 프레임워크를 절단시킨다. 다음 버퍼내에서 세척되며 세포가 흩어지게 된다. 세포 현탁액은 70μm 나일론 메쉬를 통해 여과시켜 세포찌꺼기를 제거한다. 현탁액으로부터 2 내지 3회 분별 원심분리에 의해 간 세포를 선별할 수 있다.
잘라낸 인체 간의 개별엽(lobe)을 관류시키기 위해, HEPES 완충액을 사용할 수 있다. HEPES 완충액내 콜라겐 효소의 관류속도는 약 30ml/분이다. 단세포 현탁액은 37℃에서 15-20분동안 콜라겐 효소로 추가 배양시키므로써 수득된다(Guguen-Guillouzo and Guillouzo, eds, 1986, Isolated and Culture Hepatocytes Paris, INSERM, and London, John Libbey Eurotext, pp. 1-12; 1982, Cell Biol. Int. Rep. 6:625-628).
다음 분리된 간 세포는 3차원 기질을 배양시키기 위해 사용된다. 배양된 기질은 골수와 피부에 대해 설명된 것과 같이 생리적 조건에 필적하는 계내에서 시험관내 간 세포를 배양하여 복제시킨다. 이로써 간 세포에 의한 기능적 발현이 증가된다.
이와 같이 하여 유지되는 간배양물은 세포독성 검사, 약품 선별 등을 포함하는 여러 목적으로 사용될 수 있다. 한 실시예에서, 3차원 간배양물은 시험관에서 발암물질과 돌연변이 물질을 선별하는데 사용하였다. 특히 다수의 화합물이 박테리아나 균류와 같은 테스트 유기체에서는 돌연변이 물질로 작용하지 못하나 생쥐와 같은 실험동물내에서 종양을 야기시키는 것으로 잘 알려져 있다. 이는 대사 활성때문인데, 즉 일부 화학물질은 간(산화효소계 및 하이드록시화계 P450) 또는 다른 조직내 효소에 의해 대사적으로 변경되어, 돌연변이유발성 및 발암물질유발성을 모두 가지는 신규한 화합물을 만들게 된다. 이같은 발암물질을 확인하기 위해, 테스트 유기체에 대사 생성물을 노출시키기 전에 간 추출물로 화학적 화합물을 배양시켜 스크리닝하는 검사를 고안하였다(Ames et al., 1975, Mut. Res. 31:347-364). 다소 복잡한 방법이기는 하지만, Ames의 분석은 감도가 부족하다. 대조적으로, 3차원 간 배양물은 대사 전환물질 및 테스트 유기체 모두로서 사용되어 시험되는 물질의 돌연변이 유발성과 발암성을 결정하도록 할 수 있다.
9. 혈액-뇌 관문용 3차원 모델 시스템
본 발명에 따라 혈액-뇌 관문용 3차원 조직배양 모델 시스템을 만들 수 있다. 간단히 요약해서 이같은 입체배양물은 뇌의 작은 혈관으로부터 유도된 내피세포를 배양하여 3차원 메쉬에서 합류시켜 혈류로부터 중추신경계를 분리시키는 내피세포 관문을 재생시킨다. 먼저 성상세포와 뉴런은 내피세포에 의해 형성된 합류기질 매트릭스에 공급하고 위에 있는 배양물 표면과 아래에 있는 뉴런사이에서 내피세포가 장벽을 형성하도록 한다. 내피세포 표면으로 가해진 물질은 아래의 뉴런에 도달하기 위해 내피세포층을 통과하여야 한다.
예를 들어 내피세포가 Larson et al의 방법에 따라 작은 뇌의 혈관으로부터 분리될 수 있으며(1987 Microvasc. Res. 34:184) 이들의 수는 표준방법을 사용해서 시험관에서 배양하여 확장될 수 있다. 이들 작은 혈관 내피세포는 다음 적절한 메쉬에 접종시키고(예를 들어, Tetko, Inc., #3-210/36)에 의해 제조된 나일론 여과 스크린) 생장시켜 합류에 도달하도록 하고, 실버 스테인을 이용하여 작은 혈관 내피에 특정한 그리고 내피의 관문기능과 결합된 밀폐 접합 콤플렉스의 존재를 확인하도록 한다.
뉴런과 성상세포를 다음 배아 또는 분만전후의 쥐로부터 획득하여 표준기술(Hattan et al., 1988. J. Cell. Biol. 106)을 사용하여 서로 분리한다. 예를 들어 뉴런은 기질에 차등흡착에 의해 성상세포로부터 분리되며, 성상세포는 100μg/ml 폴리-D-리신으로 사전코팅된 배양접시에 부착되고 뉴런은 500μg/ml 폴리-D-리신으로 사전코팅된 배양접시에 부착하게 된다.
성상세포는 합류 내피세포 3차 기질 매트릭스에 접종되며 약 5일간 배양시키고 뉴런세포로 함께 다시 접종한다.
다중층 3차원 조직 배양계는 한층의 작은 혈관 내피세포와 또다른 한층의 성상세포 및 뉴런을 포함하며, 생체내에서 발견되는 혈액-뇌관문 구조를 재발생시키고, 이때 혈액내 물질은 작은 혈관의 내피를 통과하여 뇌의 뉴런조직에 도달하도록 한다. 이같은 계를 이용하여 혈액-뇌관문을 통과하는 물질의 능력을 테스트한다. 많은 물질들이 이같은 관문을 통과할 수 없기 때문에 시험관에서 테스트물질의 투과능력을 신속하게 스크리닝시키기 위해 긴 펠트의 필요가 있다. 예를 들어, 많은 항생물질들이 혈액-뇌관문을 가로지를 수 없다. 투과능력에 대해 새롭게 개발된 항생물질들을 신속하게 스크리닝하는데 유용할 것이며; 중추신경계 감염을 치료하기 위해 사용되는 항생제는 상대적으로 적고, 이들중 대부분은 페니실린과 관계있으며 알레르기 반응과 연관되어 새로운 CNS-활성제의 개발이 긴급하다.
10. 3차원 췌장 조직 배양계
췌장 세엽 세포 현탁액은 다음 문헌에 의해 설명된 기술을 사용하여 준비한다(Ruoff and Hay, 1979, Cell Tissue Res. 204:243-252; and Hay, 1979, in Methodological Surveys in Biochemistry. Vol. 8, Cell Populations. London, Ellis Hornwood, Ltd., pp. 143-160). 간단히 요약해서, 조직은 칼슘이 없고, 마그네슘이 없는 완충액내에서 잘게 썰고 세척된다. 잘게 썬 조직 파편들은 트립신 및 콜라겐 효소의 용액내에 배양한다. 분리된 세포는 20μm 나일론 메쉬를 사용하여 여과시키고, Hank 밸런스 염용액과 같은 적절한 완충액내에 다시 현탁시켜 원심분리에 의해 펠렛을 만든다. 생성된 세포 펠렛은 최소양의 적절한 배지내에 다시 현탁시키고 앞서 설명된 바와 같이 준비된 3차원 기질에 접종한다. 이같은 세엽세포들은 효소원소적 합입물을 기초로하여 확인할 수 있다. 3차 기질 계내 췌장 세엽 세포의 배양은 배양물내에 세포의 생존을 연장시킨다.
11. 실시예:3차원 골수배양계
하기의 한 단원들은 3차원 배양계를 이용하여 인체, 비-인체 영장류(macaque) 및 쥐에 사용할 수 있는 장기 골수배양물을 만들 수 있다. 3차 배양물은 전자현미경을 주사시켜 평가하고, 세포내용물은 다수의 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 선조 세포 내용물은 CFU-C 및 BFU-E에 의해 평가하고 세포내용물은 감별혈구계산에 의해 그리고 각기 다른 조혈세포 라인에 특이한 라벨이 붙인 단일클론 항체를 사용하여 세포흐름분석에 의해 평가된다.
그 결과에 따르면 3차원 배양계는 인체, 영장동물 및 생쥐세포의 비-흡착 및 흡착영역 감별혈구계산에 의해 증명되는 바와 같이 여러개의 혈액조직 혈통을 서포트한다. 3차 기질 즉 흡착영역에 부착된 세포의 사이토플루오르그라프 분석에서는 초기 및 후기 골수 전구물질, 성숙 과립구, B 및 T 림프구, 거핵세포/혈소판 및 단세포/대식세포의 존재가 나타난다. 비록 매트릭스내에 위치한 선조 세포가 가변적이기는 하나 이는 지지 매트릭스를 형성시키기 위해 사용된 기질 세포의 무작위 집단으로부터 유래되었다.
조혈은 성장과 관계한 활성과 지지 세포에 의해 생성된 인자에 따라 달라지기 때문에, 3차 배양물은 합류단층으로 된 기질 세포를 담고 있는 플라스크에서 생장시킨다. 3차 배양계내 조혈 및 기질 세포성장이 합류 기질 세포가 존재하는 경우에 제한된다는 것을 볼 수 있다. 즉 플라스크내 기질 세포의 합류 단일층은 3차 배양계를 차단(shut off)하는 것으로 나타난다. 3차 배양물을 새로운 플라스크로 옮길 때 조혈성이 회복되는 것이 관찰된다. 이같은 결과는 기질 세포가 조혈세포 뿐아니라 다른 기질 요소에도 영향을 끼친다는 것을 의미한다.
방법, 결과 및 자료 등을 다음 단원들에서 더욱 상세히 설명한다.
11.1. 골수샘플의 준비
11.1.1. 인체의 골수
골수는 미리 동의를 구한후에 조혈학적으로 정상적인 성인 지원자의 후 장골능상의 여러 장소에서 흡출한다. 표본은 헤파린처리된 튜브에 수집하며, 10% FBS 및 5-10% HS로 조절된 그리고 하이드로코르틴손, 훈지존 및 스트렙토미신이 추가된 RPMI 1640 배지 8ml에 현탁시킨다. 세포군집을 흩어져 5×10 개의 핵을 가진 세포 분취량으로 나눈다.
11.1.2. 비-인체 영장동물 골수
원시 시노말거스 원숭이족 원숭이 대퇴골을 Charles River Primate Center(Porter Washington, NY)으로부터 구입하였다. 대퇴골의 골단을 살균상태로 뼈에서 분리하였다. 적색골수를 제거하고 배지에 현탁시켜 5×10 개 핵을 구성하는 세포로 분취한다.
11.1.3. 생쥐골수
다 자란 숫 Long-Evnas 생쥐(225-400gm)를 에테르로 마취하여 이들 대퇴골을 제거시킨 후 헤파린처리된 주사기를 사용하여 복부 대동맥으로부터 피를 뽑아낸다. 대퇴골을 쪼개어 골수내용물을 10% FNS 및 10% HS로 조건화된 그리고 히드로코티손, fungizone, 헤파린 및 항생물질(Naughton et al., 1987, J. Med. 18:219-250)이 추가된 Fischer 배지(Gibco, NY) 3ml을 포함하는 배양접지에 긁어 넣는다. 5-7×10 세포 분취량을 준비한다.
11.2. 3차원 기질 매트릭스의 생성
나일론 여과 스크린(#3-210/36, Tetko Inc., NY)을 주형으로 하여 하기 실시예에서 설명된 모든 LTBMC를 지원한다. 스크린은 직경이 90μm이며 210μm의 구멍을 갖는 정사각 편직패턴으로 조립되었다. 기질 세포는 다음 단원들에서 설명되는 프로토콜에 따라 접종되었다. 기질 요소의 흡착과 뒤이은 성장은 역상대비 현미경을 사용하고 전자현미경(SEM)을 주사시키어 모니터되었다.
11.2.1. 인체 LTBMC용 기질 세포의 스크린 및 접종의 준비
8mm×45mm 스크린을 30분동안 0.1M의 아세트산에 담구고 10mM 폴리리신 현탁액으로 1시간 처리하여 서포트세포의 흡착을 강화시켰다. 이들이 살균 배양 접시내에 놓고 5×10 인체 골수세포 혹은 동량의 인체 태아 섬유아세포(1M 1380, Coriell Institute, NY)로 접종시킨다. 사람의 태아 섬유아세포는 10% FBS, 5-10% HS로 조건화되고 히드로코르티손, fungizone 및 스트렙토비스를 35℃, 5% CO및 90% 이상의 비교적 습기찬 상태로 추가시킨 RPMI 1540 배지를 사용하여 단일 합류층으로 성장시킨다. 이들 세포들이 콜라게나제(15분간 10μg/ml)를 사용하여 선별되었으며 스크린으로 옮겨졌다. 5% CO에서 1-2시간 배양시킨 이후에 스크린은 Corning 25cm 배양 플라스크내에 놓고 추가의 5ml 배지에서 부유시킨다. 골수 기질 세포가 접종된 스크린은 유사한 방법으로 옮겨졌다.
11.2.2. 비-인체 영장동물 LTBMC용 기질 세포의 스크린 및 접종준비
두 개의 매트릭스가 원숭이 세포의 LTBMC를 위해 사용되었다. 나일론 메쉬에서 사람태아의 섬유아세포가 접종되었으며(상기에서 설명된 바와 같은) 시노말거스 원숭이속으로부터의 5×10 개의 대퇴골 골수가 나일론 메쉬에 접종되었다. 배양 조건들과 스크린 사전처리 프로토콜은 상기 설명된 인체 배양을 위한 것들과 동일하다.
11.2.3. 생쥐 LTBMC를 위한 기질 세포의 스크린 및 접종준비
8mm×45mm 나일론 스크린은 0.1M 아세트산내에 30분동안 잠겨있도록 하였으며 용융된 타입의 Ⅳ쥐 콜라게(GIBCO Labs, NY)으로 1-2시간동안 코팅되었다. 스크린에 5-7×10 Long-Evans 쥐 대퇴의 골수세포를 접종하였으며 33℃ 5% CO내에서 1-2시간 배양시킨 뒤에, 메쉬를 25cm 배양 플라스크로 옮긴다. 배지 5ml가 첨가하여 스크린을 부유시킨다.
11.3. 조혈세포를 3차원 기질 매트릭스 접종 및 배양물생성
메쉬구멍의 약 70%가 지원세포로 브리지된 때(생쥐 스트로말은 10-14일간, 인체 또는 원숭이 기질은 7-13일간, 그리고 사람태아 섬유아세포는 4-7일간), 스크린을 멸균시킨 배양접시에 옮기고 5×10 개의 인체 또는 몽키의 핵을 가진 골수세포 또는 2-5×10 개의 생쥐 태아 대퇴세포 각각으로 접종하였다. 5% CO내에서 2시간 배양시킨 뒤에 각 스크린을 5ml 배지를 추가하는 25cm 의 Corning 플라스크내에 서서히 부유시켰다. 배양물에는 사용된 배지를 새로운 배지로 교체시키어 5일마다 공급시킨다. 배양용기 또한 용기벽에서 세포단일층이 출현하는가에 대해 조사되었다. 만약 이같은 단일층이 225% 이상 합류하면 3차 배양물은 새로운 플라스크로 옮겨졌다.
11.4. 3차원 골수 배양의 평가
골수세포의 성장 및 입체 배양물의 세포함량은 하기에서 설명되는 차등계수 CFU-C 및 BFU-E 분석 및 사이토플루오르 그라프 분석에 의해 조직학적으로 분석되었다.
11.4.1. 조직학적 분석
전자현미경 연구를 위해, 최초 기질 세포의 접종 및 두 번째 조혈세포 접종에 뒤이어 다양한 간격을 두고 배양물을 떼어낸다. 간단히 요약해서, 나일론 스크린이 대략 4개의 동등한 부분들로 잘라내 3% 글루터 알데히드 포스페이트 완충 용액내에 고정되고, 세척되며, 아세톤내에서 탈수되고, 그리고 Denton Critical Point Dryer내에 놓이게 된다. 어떤 경우에는 기질층은 물리적으로 파괴되어 아래에 놓인 세포성장을 볼 수 있다(Naughton et al., 1987, J. Med. 18:219-250). 표본이 60% 금과 40% 팔라듐으로 피복되고 Amray SEM으로 연구되었다.
3차 LTBMC에 사람과 원숭이속 세포의 성장패턴은 생쥐 골수의 성장패턴과 유사하였다. 간단히 요약하면, 기질 세포(골수로부터 유도되거나 태아 섬유아세포로부터 유래된)가 선형으로 성장하여 각 나일론 가닥을 에워싸고 메쉬 구멍으로 연장된다(제1도). 기질세포에 의해 형성된 천연 격자에 접종된 제2접종물의 조혈(및 기질) 세포는 3.6cm 메쉬에 있는 구멍의 70% 정도로 진행한다(제2도). 조혈세포는 나일론에 직접 결합되지는 않으나 지지세포가 부착되는 부위에는 결합되는 것으로 나타난다. 조혈세포의 두 번째 접종이후 3-6일경에 모든 배양물내에 콜로니 형성이 분명하여진다. 조혈, 골수성 및 다른 콜로니를 발현하기 위해서는 210μm체가 충분한 부위를 제공한다(제2도). 조혈세포는 나일론 스크린 LTBMC 바깥측 표면에서 관찰되나 발생되는 지지세포 격자에서 가장 광범위하게 퍼져있다.
11.4.2. 3차 LTBMC의 사용된 배지에서 총세포 계수와 사이토스핀 분석
배양물이 공급된 후(매 5일마다) 제거된 배지를 사용하여 총세포 계수와 사이토스핀 분석을 하였다. 세포계수는 혈구계산 방법을 사용하여 수행된다. 사이토스핀은 Wright's-Giemsa로 채색되며 무작위로 차등계수를 실시한다. 사이토스핀 슬라이드의 분석은 각 공급이 사람과 몽키 배양물(표 2)내 에리트로이드, 골수성 및 유입파구 직계의 나중단계 프리커서 존재를 들어낸 후에 준비된다. 비록 세포 종류가 다양하나 시험된 각종(생쥐는 39주, 영장류는 12.5주)의 배양기간은 일치하였다. 인체 배양의 비-흡착부위내로 방출된 대식세포/단세포/섬유아세포는 주로 골수세포(표 2)를 희생하여 시간이 지남에 따라 증가된다.
11.4.3. 입체 LTBMC의 착성 부위 총세포 계산과 사이토스핀 분석
흡착부위 세포수는 콜라겐 효소와 트립신 1:1 혼합물(10μg/ml)과 약한 초음파로 스크린을 각 상이한 시간 간격으로 처리하므로써 행해졌다. 사람과 시노멀거스 원숭이속 LTBMC의 이같은 흡착부위 분석에서 조혈세포에 대한 기질 세포의 상대적 비율은 배양물내에서 시간이 경과함에 따라 증가되는 것으로 나타났다(표 3). 특히 조혈 콜론화가 진행됨에 따라 기질 요소의 상대적 비율이 감소되었다. 그러나 LTBMC의 나중 기간에 기질 세포가 조혈세포의 희생으로 성장되었다.
세포증식은 배양에서 수주일 후에 정상상태를 취하였다; LTBMC를 주간 기준으로 시험했을 때 접착 및 비접착 영역에서 비슷한 수의 세포가 발견되었다(제3도). 배양물의 첫 1∼2주에서 비-흡착 영역에서 세포수는 다소 잘못되었다. 이들은 용이하게 떨어지기 때문에 비 흡착지역에서 상당히 높은 세포수가 나오게 되었다. 유사하게 상대적으로 낮은 접종효율 때문에 접종용적이 5×10 세포일때에도 단지 5×10 내지 10 세포만이 메쉬에 초기에 접착된다. 이것은 배양의 첫주중에 메쉬에 발생되는 2-3배의 세포증식은 은폐시킨다.
11.4.4. 3차원의 LTBMC의 접착영역의 CFU-C와 BFU-E 함량
쥐의 LTBMC의 접착영역의 CFU-C 함량은 Bradley and Metclaf의 방법을 변형하여 측정하였다(1966, Austr, J. Exptl. Biol. Med. Sci. 44:287-300). 간략히 설명하면 4×10 세포를 평판하고 7-7.5% CO에서 37℃로 배양하였다. Pokeweed 유사분열물질 쥐의 비장세포 조절한 배지를 사용하여 배양물에서 14일후에 계수한 쥐의 CFU-C에 대한 콜로니자극 활성도(CSA)를 측정하였다. 사람 CFU-C는 20% FBS로 보충한 Iscove's Modified Dulbecco's 배지에서 ml당 10 핵을 가진 세포로 분취하고 0.5% 한천에서 10 PBLs의 층에 도말하여 사람 CFU-C를 측정하였다(Griffin et al., 1981, J. Clin. Invest. 68:932). 평판후 7일과 14일에 콜로니를 평가하였다(7% CO에서 37℃로). 사람 BFU-E를 30% FBS, 1% 소 혈청알부민, 10 M 메르캅토에탄올, 2.5-5I.U/ml의 부분적으로 정제한 사람뇨의 에리트로포이에틴(Naughton et al., 1985, J. Surg. Oncol. 30:184-197)과 4.5% 피토헤마글루틴-자극된 사람 백혈구 조절된 배지(Cashman et al., 1983, Blood 61:876-884)를 포함하는 Iscove 배지에서 0.8% 메틸셀룰로오스로 LTBMC를 여러 간격으로 검사하였다.
상당한 수의 CFU-C를 최초의 접종에 존재하는 것과 관련된 쥐와 사람 LTBMC의 접착영역에서 회수하였다(제4도). 예비발견으로 BFU-E가 사람 LTBMCD에서 지속됨을 나타낸다(표 4).
11.4.5. 3차원의 LTBMC 접착영역의 세포함량의 세포형광 사진법
사람과 원숭이 LTBMC의 흡착영역의 세포함량의 세포형광 사진법 분석은 EPICS 시스템(Coulter Electronics, Hialeah, Fla)을 사용하여 실시하였다. 세포는 콜라게나제 효소와 트립신을 사용하고 잘 씻어서 조혈세포를 접종시킨 후 여러 간격으로 나일론 메쉬로부터 분리하였다. 다음에 세포를 Ca 나 Mg 가 들어있는 Hank's 염용액에서 45-60분간 배양하였다. 이들은 Mo01, T-3, B-1, Plt-1 및 MY-9(Coulter Immunology, Fla)의 형광 이소티오시안산염(FITC)에 콘쥬게이트된 단일클론의 항체와 반응하였다. 새앙쥐의 IgM-FITC-처리된 세포를 기준으로 사용하였다. 분류창은 형광과 광주사 히스토그램의 기준에서 선택하였다. 0.255창은 대략으로 달고 세포프로파일을 측정하였다.
2,7 및 10.5주에서 사람 배양물의 접착영역의 세포형광 사진 분석으로 초기(MY9) 및 후기(Mo-1) 골수세포, B(B-1) 및 T(T-3) 임파구, 거대핵세포/혈소판(Plt-1) 및 단세포/대식세포(Mo-1)의 존재를 확인하였다(표 5).
사람과 원숭이 LTBMC은 사람 태아의 섬유아세포의 층에서 형성시킬 수 있었지만 이 매트릭스는 쥐의 LTBMC의 생장을 지지하지는 않는다. 태아 섬유아세포는 골수기질보다 매우 빨리 골수세포의 연속적 접종을 허용하는 준합류(subconfluence) 단계에 도달한다. 적색원숭이의 골수가 태아 섬유아세포의 지지구조에서 생장할 때 흡착영역의 표현형 프로파일은 본인들이 연구한 다른 배양물보다 Plt-1 항체와 더 많이 반응하지만 다른 혈액학적 직계 또한 나타내었다(표 5). 어느 정도로 이러한 발견이 태아세포로 매개된 흡착영역의 세포모집단에서의 변위나 항체의 가교-반응성을 반영하는지 알려져 있지 않다.
11.4.6. 3차원 배양물에서의 세포성장에 대한 합류 기질세포 단일층의 효과
Long-Evans 쥐나 시노몰로구 적색원숭이에서 얻은 대퇴골수 세포를 Boswell and co-workers(Boswell et al., 1987, Exptl. Hematol. 15:46-53)에서 기술한 것 같이 충전된 Fenwal 컬럼을 통해서 쏟았다. 간략히 설명하면, 10 -10 대퇴 골수 세포를 4ml의 배지에 넣고, 배지에서 37℃로 45분간 사전-배양시킨 나일론 모 칼럼에 쏟았다. 45분간, 추가 배양시킨 다음에 비-흡착성 세포를 배출시키고, 흡착 세포를 강력히 씻어내고 EDTA-Versene 용액(식염수에서 1:5000, GIBCO, Grand Island, NY)로 용출시켜 제거하였다. 대략 10 세포를 25cm 플라스크에 나란히 접종시키고, 50% 내지 100% 합류하도록 생장시켰다. 2차접종 후에 시간에 대해 표준화시킨 사전-형성된 나일론 스크린 LTBMC를 각 플라스크 속으로 삽입하였다. 나일론 스크린 LTBMC와 단일층에서의 생장이 현미경으로 관찰되었다. 비-흡착영역에서의 세포계수와 사이토스핀을 매 5일마다 실시하였다. 효소해리된 흡착세포의 사이토스핀 제품의 차등계수는 나일론 스크린 LTBMC의 삽입 5일 후에 실시하였다.
합류 기질세포 단일층을 나일론 스크린 LTBMC로 동시 배양시켰을 때, 현탁된 배양물에서 생장시킨 조혈작용과 기질세포는 모두 접착성 기질이 없거나(p가 0.05보다 적은) 또는 대략 50% 합류에서 기질세포가 있는(p가 0.05보다 적은) 플라스크에서 현탁된 LTBMC에 비교하여 억제되었다(표 6). 또한 합류 기질 단일층과의 동시-배양으로 비-접착성 영역속으로 메쉬-연합된 기질세포의 탈착과 방출을 일으켰다. 조혈성 콜로니는 융합하고 생장이 중지되었다. 만일 LTBMC를 새로운 플라스크에 옮기면, 조혈작용의 회복이 3-5일에 나타난다.
12. 실시예:3차원의 피부 배양 시스템
다음의 소항들은 시험관에서 피부를 배양하는 본 발명의 3차원 배양시스템을 기술한다. 간략히 설명하면, 섬유아세포의 배양물은 미리 살균한 나일론 메쉬에 형성시켰다. 배양한 6-9일 내 흡착 섬유아세포는 메쉬구멍속으로 생장하기 시작하여, 콜라겐 묶음을 석출하였다. 단일클론 항체를 사용하는 간접 면역형광은 또한 몇가지 형태 Ⅲ을 가진 주로 형태 Ⅰ의 교질을 나타내었다. 7일 후에 사람 흑혈구와 케라틴 세포의 동시-배양물을 섬유아세포 메쉬에 평판화하였다. TPA나 콜레라 독소는 첨가되지 않았는데 그 이유는 영양인자가 흡착층의 준합류 섬유아세포에서 생성되기 때문이다. 전자현미경 연구에서 정상형태의 특성과 세포-세포 부착을 가지는 피부세포가 나타났다.
12.1. 3차원 기질의 형성
피부 섬유아세포를 피부조직을 가지고, 2시간 트립신처리하고 그리고 물리적 수단을 이용하여 세포를 현탁액속으로 분리시켜 단리하였다. 섬유아세포를 25cm Falcon 조직 배양 접시에 생장시켜 합류시키고 10% 태아 소 혈청(FBS), fungizone, 젠타마이신 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충시킨 RPMI 1640(Sigma, MO)을 공급하였다. 섬유아세포를 약하게 트립신처리하여 세포를 나일론 여과 메쉬에 도말하고 여과된 섬유는 직경이 대략 90μm가 되고 210μm의 메쉬 구멍을 가진 사각직물에 모은다(Tetko, Inc., NY). 이 메쉬는 약산으로 세척하여 사전처리하고 폴리리신과 FBS에서 배양시킨다. 섬유아세포의 흡착이 3시간 이내에 나타나고 섬유아세포는 초기 접종후 5-7일내에 메쉬 구멍을 가로질러 이어진다. 이러한 섬유아세포는 대사적으로 활성이 있으며, 세포외 매트릭스를 분비하며 활성 섬유아세포와 콜라겐으로 구성된 피부 등가물을 형성하였다. 제1도는 섬유아세포 부착과 메쉬개구부에 걸쳐 세포처리의 연장을 나타내는 주사전자 현미경 사진이다.
12.2. 흑혈구와 케라틴세포의 접종
흑혈구를 Eisinger와 Marko(1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:2018-2022) 방법을 사용하여 분리하였다. 간략히 설명하면, 피부샘플을 트립신에서 4-6시간 배양하여 상피와 피부층을 분리시킨다. 상피세포를 배지에 현탁시키고 25cm Falcon 조직배양 플라스크에 도말하였다. 흑혈구를 케라티노사이트로부터 분리하였다. 단리된 흑혈구를 섬유아세포-피복된 나일론 메쉬에 도말하고 3일간 생장시킨 후 케라틴 세포를 첨가한다. 흑혈구는 이런 시스템에서 정상적으로 생장하고 이속에서 수지상 돌기를 만들고, 색소를 여전히 보유하고 있으며 색소를 케라틴세포로 옮기는 능력도 보유한다. 제6도는 3차원 배양시스템에서 3일후 흑혈구의 출현을 나타낸다. 단리된 케라틴세포는 3-4일후에 흑혈구에 도말하였다. 이 조직은 급히 생장하여 RPMI 1640, 10% FBS와 적절한 항체에서 유지시킨다. 천연 생장인자가 피부요소에 의해서 분비되기 때문에 외부에서 공급하는 인자(예컨대, TPA, 콜레라 독소 등(as described by Sengel, 1983, in Biochemistry and Physiology of Skin, Vol. 1, pp. 102-131, oxford Univ, Press, NY; and Eisinger et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1937-1941)의 첨가는 필요없다.
12.3. 피부배양물의 조직학적 분석
피부배양물은 다음의 방법을 사용하여 광 현미경을 사용하여 조직학적으로 평가하였다; 모든 조직은 2.5% 완충된 글루테르알데히드에 고정시키고, 에탄올에서 탈수시키고, 크실렌으로 세척하고 파라핀에 넣는다. 부분을 6 내지 8μm의 두께로 절단하고, 헤마토크실린-에오신으로 착색하고, 정상 및 변경된 형태학적 특성을 검사하였다.
피부 모델의 단면은 제7도와 제8도의 현미경 사진에서 나타낸다. 정상세포 배열과 형태는 분명하다. 상피와 피부성분은 메쉬섬유를 완전히 둘러싸고, 독특한 피부-외피 결합이 분명하다(제7도). 케라틴 세포는 정상형태를 가지고 색소입자를 포함하고 세포의 성숙이 나타나는데 이는 각질의 형성이 되었다는 증거이다(제8도).
12.4. 생체 내에서의 3차원 피부 이식
쥐에 대한 이식연구에 따르면 이러한 3차원 시스템은 거부반응없이 피부와 외피성분이 신속하게 접합할 수 있게 한다.
24마리 쥐를 피부이식 연구에 사용하였다. 메쉬를 6mm의 원형조각으로 절단하고, 증기 살균하고, 약산으로 처리하고, 콜라겐 Ⅳ으로 배양시키고, 태아 소의 혈청으로 배양하고 제2케라틴 세포 유무에 관계없이 기질세포를 접종시킨다. 피부 및 상피세포 성분으로 덮은 메쉬를 상처부위에 봉합하고 다음과 같이 매 12-24시간마다 정밀하게 조사하였다; 쥐에 가볍게 에테르 마취를 시키고, 이들의 등 표면을 면도하고 베타딘 용액으로 세척하였다. 1회용 Baker 펀치 생검바늘을 이용하여 6mm 펀치 4개를 만들고, 소-표피 봉합을 사용하여 이식되 메쉬를 제자리에 유지시켰다. 쥐를 수술후 12시간이 될 때까지 면밀히 시험하고 다음에 매 24시간마다 모니터하였다.
메쉬이식의 면적은 홍반, 팽윤, 삼출물 또는 취약성의 흔적이 없었다. 메쉬를 이식후 7일, 14일 및 21일에 제거하였다. 이러한 이식의 결과는 제9도와 제10도에서 설명한다. 모든 피부세포는 이식후 7일에 나타내었다(제9도). 제10도는 케라틴세포(k) 섬유아세포(f), 콜라겐(c), 지방세포(a) 및 연근세포(s)를 설명하며, 모두는 나일론 메쉬섬유(m) 주위의 고유배열로 되어있다. 메쉬에 세포의 강력한 자연적 흡착과 함께 임파구와 다른 면역성분이 없음으로 생체내에서 거부반응이 없음을 나타낸다.
피부와 상피성분을 가진 메쉬를 10mm×10mm 피부 생검속으로 이식시키고 다음에 14일간 배양물속에 유지하고 조직학적으로 검사하는 병행연구도 실시하였다. 유사한 세포 이주, 부착, 분화 형태도 이러한 시험관 이식물에서 관찰되었다. 현재까지의 접목연구에서 모든 세포성분이 활성화되고 천연 생장인자가 생성되는 본인들의 3차원 기질 시스템이 사실적 생리학적 시스템이라는 가설을 실체화하는데 도움을 준다.
비록 본 발명을 이들의 특이한 구체예에 대해서 상세히 기술하였지만, 위에서 기술하고 다음의 청구범위에 기술한 것같이 본 발명의 요지에서 이탈치 않고서도 여러 변경을 가할 수 있음을 알 수 있다.
13. 실시예:3차원의 간 배양시스템
13.1. 물질과 방법
13.1.1. 마취
무게가 대략 300gm 나가는 성장한 Long-Evan 쥐의 복강내로 0.3ml의 주사용 펜트바르비탈나트륨을 주사하였다.
13.1.2. 해부
동물을 날카로운 핀셋으로 집어서 적절히 마취되도록 보장한다. 중심선 절개를 검사과정과 서혜부 면적 사이에 만들고, 다음에 추가로 절개하여 플랩이 복부의 공동속으로 들어가게 한다. 내장과 기타 기관을 동물의 우측으로 밀어서, 간장의 문맥 정문을 노출시켰다. 간장의 문맥정맥을 해부하여 다시 노출시키고 4.0 봉합을 간장의 문맥의 정맥 말단주위로 조이고 여기에 카테테르를 설치한다. 제2봉합을 간장의 문맥의 정맥 기부 주위에 놓고 여기에 카테테르를 설치한다. 21게이지 바늘을 사용하여 간장의 문맥정맥에 작은 새김눈을 만들었다. 연동펌프를 가동시키고 500ml HEPES 완충액(4.1gm NaCl, 0.25gm KCl, 3ml의 1M NaOH 및 10ml의 0.24%w/v HEPES주를 포함하는)을 주입하고; 직후에 하부대정맥을 절단하여 완충액을 빼낸다. 주입을 완료한 후에 펌프를 정지시키고, 간을 제거하여 Buckner 펜넬속으로 넣고 다음에 콜라게나제 용액(0.4gm NaCl, 0.05g KCP, 10ml HEPES종(위의), 0.07gm CaCl2HO, 6.6ml 1M NaOH, 100cc에든 50mg 교원효소를 37℃에서 pH 7.6으로한)으로 관류시켰다. 관류는 15-20분간 계속시켰다. Buckner 펜넬의 함유물을 여과하고, 간을 제거하여 1.5%(w/v) BSA를 포함하는 콜라게나제 용액에 넣었다.
13.1.3. 세포용액제조
관류한 간의 엽을 분리하고, 외측 실질을 처내었다. 다음에 내측 실질을 생리학적 Ca 와 Mg 를 포함하는 Hanks 균형시킨 염용액(HBSS)에서 다졌다. 큰 간 조직단편을 침강시키고, 세포 현탁액을 Percoll 경사(5ml의 DMEM와 0.5Iu/ml 인슐린 주입, 0.007mg/ml 글루카곤 및 20% 태아소의 혈청)를 통하여 원심분리하고, 50ml의 원추형 원심분리 튜브에 넣고, HBSS와 생리학적 Ca 및 Mg 를 50ml 표식에 첨가하고, 5ml의 Percoll 작용 용액[70% 보존 Percoll+30% PBS; 보존 Percoll을 9부 Percoll과 1부 10X 농축된 Dulbecco의 배지]을 800g에서 10분간 원심분리하여 HBSS의 상부에 깐다. 간 실질 세포를 경사의 바닥으로부터 수거하고 준합류 기질을 가진 3차원 메쉬 배양물에 첨가하였다.
13.1.4. 3차원 기질 매트릭스의 제조
나일론 여과스크린(#3-210/36, Tetko, Inc., NY) 8mm×45mm 조각을 0.1M 아세트산에 30분간 담구고 10mM 폴리리신 현탁액으로 1시간동안 처리하였다. 이 메쉬를 살균한 배양접시에 넣고, 쥐에서 수거한 1×10 섬유아세포를 DMEM 완전배지에서 접종시켰다. 5% CO에서 접종한 1-2시간후에 채를 Corning 25cm 조직배양 플라스크에 넣고, 3일 간격으로 추가 5ml 배지를 추가 주입하여 부유시키고 준합류에 도달하게 한다.
13.1.5. 3차원 간조직 배양물의 유지
3차원 기질 매트릭스에 간 실질세포를 접종한 후에, 세포를 DMEM 완전배지에서 37℃ 가습 대기상에서 5% CO에 유지시키고 매 3일마다 새 배지를 공급하였다.
13.2. 결과와 토의
이런 형태로 배양된 성장한 간세포는 유사핵분열에 활성을 나타내었고, 3주 이상 단배질 분비를 계속하였다. 간세포는 그 자체가 세포의 코드속으로 배열되었고(제11도) 그리고 3차원 배양의 첫번째 10-12일중에 조직학적으로 간아세포를 닮았거나 재생 간세포를 닮았다(제12도). 배양물이 고도로 합류되기 때문에 실질세포는 담즙도관세포, Kupfter 세포는 성숙한 간세포를 닮기 시작하고 기타 다른 수는 간 기질세포가 존재한다. 세포를 배양 첫 10-12일간 대략 매 24시간마다 분할하고 최고 3주간 매 72시간마다 계속 분할하였다. 알부민은 3주배양기간에 걸쳐 게속분비되고 간세포는 시험관에서 이들의 생성물을 대사될 수 있도록 활성화된 효소를 보유한다. 배양물이 완전한 합류에 도달한 후에 이들은 최고 12주동안 살아있는 기질로서 유지될 수 있다.
14. 실시예:3차원 점막상피 조직 배양시스템
14.1. 재료와 방법
14.1.1. 점막 상피세포의 준비
구강 점막 조직 샘플을 치열교정 수술 피검물에서 수득하였다. 조직을 항생제를 포함하는 새로운 MEM(GIBCO, Cat. #600-5240 AG에서 취한 2ml의 항체 항진균성 용액; 100cc MEM당 GIBCO, Cat. #600-5710 AD에서 취한 0.01ml의 겐타마이신)으로 세척하고, 작은 조각으로 절단하고, 다음에 0.02% EDTA(W/V)로 세척하고, 0.25% 트립신(Ca 또는 Mg 없이 PBS에든)을 첨가하고; 수초후에 이 조직 조각을 제거하고 새로운 0.25% 트립신(Ca 나 Mg 없이 PBS에든)에 넣고 4℃로 밤새껏 냉장시켰다. 다음에 조직을 제거하고 새로운 트립신 용액에 넣고, 세포가 단일-세포 현탁액을 형성하는 것으로 나타낼때까지 약하게 교반하였다. 다음에 단일 세포현탁액을 10% 열처리하여 비활성화한 태아 소의 혈청을 포함하는 MEM으로 희석하고, 1400g에서 7분간 원심분리시켰다. 상청액을 버리고 점액 상피세포를 포함하는 펠릿을 접종 배지에 넣었다. 배지는 2% 울트로센 G, 1×L-글루타민, 1×비필수아미노산, 페닐시린 및 스트렙토마이신으로 구성되었다. 다음에 이 세포를 3차원 기질매트릭스에 접종하였다(다음 참조).
14.1.2. 3차원 기질매트릭스의 준비
점막 상피 배양에 사용한 3차원 기질매트릭스는 구강 섬유아세포와 나일론 여과스크린(#3-210/36, Tetko Inc., NY) 8mm×45mm 조각을 이용하여 13.1.4항에서 3차원 간 배양물에 대해서 기술한 것같이 발생시켰다.
14.1.3. 3차원 점막 상피조직 배양물의 유지
3차원 기질매트릭스에 점막 상피세포를 접종한 다음에 배양물을 DMEM 완전배지에서 37℃, 5% CO에서 유지시키고, 매 3일마다 새로운 배지를 주입하였다.
14.2. 결과와 토의
제13도는 위에 기술된 방법으로 제조한 3차원 점막 상피 조직배양물의 단면 현미경 사진이다. 이 조직배양물은 생체 내에서의 구강점막의 중층 인설상의 외피를 개괄하는 것으로 발견되었고; 세포가 배양물의 표면에 접근할때에 핵은 편평해지고 생체내에서 발생되는 것같이 표면에 평행으로 평면에 배열되었다.
15. 실시예:3차원의 췌장 조직 배양시스템
15.1.1. 췌장 선방세포의 준비
췌장 선방세포는(Ruoff and Hay(1979, Cell Tissue Res. 204:243-252) and Hay(1979 in Methodological Surveys in Biochemistry, Vol. 8, Cell Populations, London, Ellis Hornwood, Ltd. pp. 143-160)에 기술된 기술을 사용하여 제조하였다. 이 조직을 성숙한 수놈 Long-Evan 쥐에서 수거하고, 다지고 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS 완충액으로 세척하였다. 다진 조직을 0.25% 트립신과 콜라게나제를 포함하는 용액에서 배양시켰다. 해리된 세포를 20μm 나일론 메쉬를 사용하여 여과하고, HBSS에서 재현탁하고 300g에서 15분간 원심분리하여 펠릿으로 만들었다. 새성된 펠릿을 소량 DMEM 완전배지에 재현탁시키고, 3차원 기질에 접종하였다(다음을 참조).
15.1.2. 3차원 기질 매트릭스의 준비
췌장 조직배양에 사용된 3차원의 기질주형을 13.1.4항에서 3차원 간 배양물에 대해서 위에서 기술한 것같이 성장한 쥐 췌장 섬유아세포와 나일론 여과스크린(#3-210/36, Tetko, Inc., NY) 8mm×45mm 조각을 사용하여 만든다.
15.1.3. 3차원 췌장 조직 배양물의 유지
3차원 기질매트릭스에 췌장 선방세포를 접종한 후, 배양물을 DMEM 완전 배지에서 37℃, 5% CO에 유지하고 매 3일마다 새로운 배지를 주입하였다.
15.2. 결과와 토의
제14도는 위에서 기술한 방법으로 제조한 3차원 췌장 조직 배양물의 단면 현미경사진이다. 조직배양 선방세포는 기질세포(별표)의 보다 균질한 외양과 비교하면 효소원 방울 함입물(화살표)에 기초하여 확인할 수도 있다. 작은섬 같은(Islet) 세포는 각 메쉬구멍의 중앙에 농축되어 남았고, 1-2×10 인슐린-분비 세포를 포함하는 구조를 형성하였다.
16. 실시예:혈액-뇌 장벽을 위한 3차원 모델시스템
16.1. 물질과 방법
16.1.1. 작은 혈관 내피세포의 준비
Larson et al.(1987, Microvasc. Res. 34:184)의 방법에 따라서 뇌에 단리한 소관 내피세포를 T-75 조직 배양 플라스크를 사용하여 시험관에서 배양하였다. 세포를 Dulbecco의 변형 Eagle 배지/Hams-F-12배지 조합물(이 용액은 1:1 혼합물로서 시판된다)에 유지시켰다. 이 배지에 20% 열처리하여 비활성화된 태아소의 혈청(FCS), 글루타민 및 항생물질을 보충하였다. 세포를 플라스크당 1×10세포의 농도로 접종하고 일주일내에 합류상태에 도달하였다. 이 세포를 일주에 한 번씩 통과시키고 위에서 기술한 것같이 FCS, 글루타민 및 항생물질을 포함하는 DMEM/Hams-F-12를 일주일에 한 번씩 주입하였다. 세포를 계대시키기 위하여, 플라스크를 5ml PBS(Ca 또는 Mg 없이)로 두 번 헹구고, 3ml 0.05% 트립신과 0.53mM EDTA로 트립신처리하였다. 이 세포를 펠렛화하고, 재현탁하고, 트립판 블루 압출에 의한 생존력을 시험하고, 접종하고 DMEM/Hams-F-12 보충 배지 25ml을 주입하였다. 항원 검사관련된 인자 Ⅷ를 이용하여(Grulnick et al., 1977, Ann. Int. Med. 86:598-616) 내피세포를 양성으로 확인하고, 은착색을 사용하여 작은 혈관 내피에만 특이성이 있는 단단한 접점 복합체를 확인하였다.
16.1.2. 메쉬의 제조 및 접종
나일론 여과스크린 메쉬(#3-210/36, Tetko, Inc., NY)는 간, 췌장, 골수등과 같은 조직 배양시스템용으로 위에서 기술한 것과 같이 제조하였다. 이 메쉬를 아세트산 용액(1ml 빙초산과 99ml의 증류수)에 30분간 담구고 같은 양의 증류수로 헹구고 다음에 증기 살균한다. 메쉬는 8×8cm 메쉬당 6ml의 태아소 혈청으로 피복하고 밤새껏 배양하였다. 이 메쉬를 세 개 높이로 쌓고, 3×10 작은 혈관 내피세포(위에서 기술한 것같이 배양한)를 쌓아둔 메쉬에 접종하고, 가습대기에서 5% CO에서 37℃에서 3시간동안 배양하였다. 접종한 메쉬가 완전한 합류에 도달할때까지(대략 2주후에) 10ml DMEM/Hams-F-12를 매 3-4일마다 주입하였다.
16.1.3. 뉴론(Neuron)과 성상세포 집단의 준비
뉴론과 성상세포를 쥐의 소뇌에서 단리하였다. 5마리 쥐에서 취한 소뇌를 절개하고 PBS 완충액에 넣었다. PBS를 제거하고, 1ml의 트립신용액(10mg 트립신, 0.01g MgSO-7HO를 가진 1ml PBS 및 6μl 1N NaOH)을 각각에 첨가하였다. 3분 후에 조직을 약 1ml PBS 완충액과 7.5mg DNAse 및 15ml Earles BME를 포함하는 보존용액 2ml으로 헹구었다. 용액이 흐려질때까지, 18 내지 25게이지 범위의 점차로 작은 주사바늘을 통해 조직을 흡입시켜 개별세포를 현탁액속으로 옮겼다. 수득되는 단일세포 현탁액을 800g로 5분간 원심분리하고 이 세포펠릿을 배지에 재현탁시키고 33μm 여과기를 통과시켰다. 다음에 세포를 60%/35% Percoll 단계 경사면에 깔고 800g 10분간 원심분리하였다. 0%/35% 계면에 있는 세포는 대부분 글리아(glia)와 성상세포이고; 35%/60% 계면에 있는 세포는 대부분 뉴론이었다. 두 집단 모두 수거하고, 5ml PBS로 별도 희석하고, 세척하고, 그리고 2500g로 5분간 원심분리하여 수거하였다. 세포를 배지(10% 열처리에 의해 비활성화된 말-혈청을 포함하는 BME)에 재-현탁시켰다. 두 세포형태 모두를 별도로 폴리-D-리신이 피복된 배양접시에 도말하였다. 첫째 이들은 100μg 폴리-D-리신으로 사전 피복된 접시에 도말하여, 20-45분간 배양하고, PBS로 헹구고; 글리아와 성상세포는 배양접시에 선택적으로 부착되었고, 뉴론은 헹구어 내었다. 헹굼 완충액은 500μg 폴리-D-리신으로 피복한 배양접시에 도말하였고, 이 경우 뉴론은 배양접시에 부착하였다.
16.1.4. 3차원 내피 세포배양물에 성상세포의 접종
메쉬로부터 배지를 제거하고, 성상세포를 메쉬에 접종하고, 가습 대기하에서 5% CO, 37℃에서 1시간동안 배양하여 합류 내피세포(위에서 기술된)로 피복된 메쉬에 5×10 성상세포를 접종하였다. 이 메쉬에 인터페론, 트란스페린, 셀리늄을 포함하는 DMEM-K12를 주입하고 연속하여 2-3일 간격으로 주입한다.
16.1.5. 3차원-내피세포-성상세포 조직배양물에 뉴런의 파종
대략 5일 후에 뉴런을 내피세포-우주세포 조직배양물에 파종하였다. 축색 부산물(배양물에서 약 1주후에 관찰된)을 나타내는 뉴런 세포배양물을 수거하고 대략 5×10 세포를 내피세포/우주세포 3차원 배양물 메쉬에 파종하였다. 뉴런세포를 최소용적의 배양배지에 파종하고 다음에 습윤된 분위기에서 5% CO로 37℃로 3시간 배양하고 그후에 표준용적의 DMEM/F12를 주입하고, 재배양하고, 연이어서 2-3일 간격으로 주입하였다.
16.2. 결과와 투입
나일론 메쉬에 태아소의 혈청에 사전피복하고 이위에 표준 단일층 배양에 합류되도록 생장시킨 작은 혈관 내피세포에 파종하고 완전 합류가 되도록 생장시켰다.
뉴런과 성상세포를 태아 쥐의 소뇌에서 준비하고, 차등흡착에 의해 분리하였다. 성상세포를 합류된 내피세포 3차원 기질매트릭스에 생장시키고, 연이어서 뉴런 세포를 3차원 조직배양물에 첨가하였다.
내피세포의 층을 덮는 준합류된의 제2단계에 도달할때까지 생성된 내피세포/성상세포/뉴런 3차원 조직세포를 유지하였다. 제15도에서 나타낸 것같이, 한층은 합류 작은 혈관 내피세포로 구성되고, 다른층은 성상세포와 뉴런으로 구성된 다중-층 3차원 조직배양 시스템은 생체내에서 발견되는 혈관-뇌 장벽의 구조를 재발생시키고, 이때 혈액 속의 물질이 작은 혈관의 내피를 투과하여 뇌의 뉴런조직에 도달한다. 이러한 혈관-뇌 장벽 모델 시스템은 뇌속으로의 화합물이나 비루스의 통과 또는 이들의 결핍을 연구하는데 사용할 수 있고; 이것은 어떠한 항생제 예컨대 항비루스가 혈관-뇌 장벽을 통과하여 중추신경계 감염을 치료할 수 있는지를 결정하는데 유익하다. 더욱이, 이러한 모델 시스템은 다양한 신경독성의 활성과 잠재력을 연구하기 위한 물질로 사용할 수가 있다.
17. 실시예:3차원 선암 조직 배양 시스템
17.1. 재료와 방법
17.1.1. 선암 기질 및 실질세포의 준비
HBSS에서 종양세포를 다지고, 세포를 0.27% 트립신에서 37℃ 24시간동안 배양하고, 추가로 플라스틱 배양접시에든 DMEM 완전배지에서 현탁된 세포를 37℃로 12시간동안 배양하여, 기질세포로부터 선암세포는 분리하였다. 기질세포를 플라스틱 접시에 선택적으로 부착된다.
17.1.2. 3차원 기질 매트릭스의 준비
선암 조직배양에 사용한 3차원 기질매트릭스는 13.1.4항에서 3차원 간 배양에 대해서 기술한 것같이 종양에서 얻은 기질세포(위의 17.1.1.항 참조)와 나일론 여과스크린(#3-210/36, Tetko, Inc., NY) 8mm×45mm 조각을 사용하여 만든다.
17.1.3. 3차원 선암 조직 배양물의 유지
선암세포를 3차원 종양 기질 매트릭스에 접종한 후에, 배양물을 고농도 포도당, 15% FBS 및 0.03% 글루타민을 가진 DMEM 완전배지에서 37℃ 가습대기에서 5% CO에 유지하고 매 3일마다 새로운 배지를 주입하였다.
17.2. 결과와 토의
제16도는 3차원 선암조직 배양물의 현미경사진이다. 선암세포는 3차원 종양같은 구조가 겹치고 배열된 특성을 나타내었다. 세포는 이들 상피-같은 형상을 유지하였다.
18. 실시예:3차원 조직배양 세포독성 시험 시스템
18.1. 재료와 방법
18.1.1. 3차원 골수조직 배양물의 준비
3차원 골수조직 배양물은 위의 11항에 기술된 방법에 따라 준비하였다.
18.1.2. 3차원 골수배양물의 세포독성제에의 노출
개개의 3차원 골수배양물을 세포 독성 시험 목적으로 96웰 조직-배양 웰에 유지하였다.
배양물을 0.1 내지 10μm 범위의 아드리아마이신의 10배 희석물에 24시간 노출시켰다. 기준은 소 혈청 알부민(BSA)의 10배 희석물에 노출하였다.
유사하게, 96웰 다중-웰 조직 배양유닛에든 다른 3차원 골수배양물을 1-75μm범위의 시스-백금의 10배 희석물에 24시간동안 노출시켰다. 기준은 BSA 연속희석물에 노출시켰다.
모든 경우에서 통상적 기술로 배양한 사람 섬유아세포의 단일층을 기질세포만 또는 조혈세포가 있는 3차원 배양물과 비교하였다.
18.1.3. 세포독성 검사법
세포로부터 배지를 제거하고 0.2ml 뉴트랄-레드 염료-매개된 용액(다음의 18.1.4.항 참조)을 각 웰에 첨가하였다. 다음에 배양물을 37℃ 3시간동안 배양하였다. 3차원 배양물을 포함하는 배양 트레이에서 웰1A을 기준으로 삼고 이는 세포없이 메쉬만을 포함하였다.
배양후에 염료/배지를 제거하고, 그리고 각 웰을 포르말-칼슘(다음의 18.1.4.항 참조)으로 신속하게 세척하여, 결합안된 뉴트랄-레드를 제거하고, 하부기질에의 세포의 부착을 증대시켰다.
0.2ml 아세트산/에탄올 용액(다음의 18.1.4.항 참조)을 각 웰에 첨가하고, 배양물을 실온에서 15분간 유지시키고(염료를 추출하고) 진탕평판에서 수초동안 교반시켰다.
배양트레이를 자동화한 분광사진 판독 및 기록 목적으로 540nm 여과기가 장치된 Dynatech 미량평판 판독기로 옮겼다. 기준 웰에든 아세트산/에탄올 용액을 기준으로 한다.
18.1.4. 세포 독성 검사용 용액
뉴트랄 레드/배지를 다음과 같이 제조하였다. 뉴트랄-레드는 0.4% 보존 수용액으로 준비하고 포일을 사용하여 빛을 차단하였다. 새로운 1:80 염료희석물을 만들었다. 사용 직전에, 염료 배지 용액을 1500g로 5분간 원심분리하고 상청액을 뉴트랄 레드검사법에 사용하였다.
포르말-칼슘은 다음과 같이 제조하였다. 5g의 CaCl(무수물)을 497.5ml 살균 증유한 HO에 첨가하고, 2.5ml 40% 포름알데히드를 첨가하여 1% CaCl와 0.5% 포르말린으로된 포르말-칼슘용액을 제조하였다.
아세트산 에탄올 용액을 다음과 같이 제조하였다. 1.09ml 빙초산을 99ml 50% 에탄올에 첨가하였다.
아드리아마이신과 시스-백금은 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO에서 구입하였다.
18.2. 결과와 토의
제17도와 제18도는 각각 아드리아마이신과 시스-백금을 시험약제로 사용하는 3차원 골수배양물 세포독성 검사의 결과를 나타낸다. 각 경우에서 3차원 배양시스템이 시험 약제에 대해서 투여량-관련된 반응을 나타내었다. 중요한 것은 아드리아마이신이나 시스-백금 어느것이든, 골수 3차원 배양물에 대한 TD이 통상적인 섬유아세포 단일층 배양물을 사용하여 측정한 TD과는 상이하였다. 중요한 것은 이러한 결과는 단일층 배양물의 세포독성에 대해서 정밀한 측정이 아닐 수도 있으며 이는 아마도 세포가 극히 비자연적 환경에서 생장하고, 단일층 세포 배양물은 독성 약제에 대해서 더욱 민감할 수도 있다. 시험물질의 실제 독성을 측정하는 것은 어렵다; 예를 들면 화학요법에서 악성세포를 제거하기 위해 감내할 수 있는 최고 투여량을 투여하는 것이 중요할 수도 있다. 최대 투여량이 과소 평가되어 항암제가 덜 효과있는 양을 투여될 수도 있다. 골수와 기타 정상조직 뿐만 아니라 또한 종양조직의 3차원 조직 배양물을 제공하여, 본 발명이 시험관에서 화학요법제의 최적 투여량의 측정을 가능케 한다.
19. 실시예:소돼지에서 신피부를 사용하는 이식용의 3차원 피부배양시스템
피부이식은 네 마리의 Charles River micropig에 대해서 실시하였다. 실험은 신피부, 세포 용출액으로 투과한 메쉬 기질 및 수축에 메쉬단독의 분할-두께 및 전체-두께 상체의 치료와 상피화 효과의 비교를 목적으로 하였다. 각부위에서 치료의 정밀한 평가하기 위해 하도록 각 동물의 배측표면을 따라서 다수의 나란히 있는 상처를 비교하였다. 이러한 연구에서 생체 분해성 메쉬를 돼지피부 섬유아세포로 접종하고 피부 대체물로서 이식하였다. 다른 메쉬에는 사람 피부 섬유아세포를 포함하고 돼지 피부 섬유아세포는 돼지 케라틴세포로 접종하였다. 조직학적 단면을 통한 이식된 면적과 형상의 총체적 변화(삼출물, 홍반등)를 감시하여 이식 모형으로서의 3차원 피부시스템의 효능을 연구할 수가 있었다.
19.1. 재료와 방법
19.1.1. 상처난 베드의 준비
상피이식을 적절히 평가하기 위하여는 상처이식 베드를 만들어서 진피, 모발 소포, 땀이나 피지의 한선이 남아있지 않도록 하는 것이 필수적이다. 이를 달성하기 위하여, 0.075-0.090인치의 세팅에서 Browne 피부절을 사용하여 돼지의 상부측면으로부터 가장 두꺼운 피부를 제거하였다. 5cm×5cm 상처면을 만들었다. 하부 측면 영역을 제조했을 때 세팅을 0.60-0.75인치로 조정하였다. 메쉬 단독으로나 또는 배양한 세포를 가진 메쉬를 베드의 위에 근막 바로 위에 놓았다. 살균 피부 절-제조된 베드는 오염의 가능성을 감소시켜서 이식베드에서 절대 지혈이 가능케하였다.
만일 피부제거후 약간의 출혈이 있으면, 건조 가제 드레싱을 상처위에 놓고 10-15분간 압력을 가하였다. 모든 경우에 살균 베드는 이식물이 근막에 놓여질때까지 PBS로 미리 적신 살균 가제로 덮었다. 견직 봉합물(3-0)을 제조한 이식베드의 양쪽에 대략 1 내지 1/2인치 떨어지게 놓아서 제자리에 압축스텐트를 눌러준다. 배양한 이식물(세포가 있는 메쉬)을 살균겸자로 조직배양 플라스크에서 꺼내어서 통상적인 피하의 바늘뜸을 써서 제자리에 봉합하였다. 이식물을 와셀린 가제로 덮고 견직사로 조여서 압축스텐트를 제공한다. 이 돼지는 탄성플라스트로 붕대감는다. 상처 드레싱은 4일 후에 바꾸었다.
19.1.2. 마취
돼지를 케타민 염화수소(Ketalar)를 써서 마취하고 할로탄, 이산화질소 및 산소로서 마취상태로 유지하였다. 피부면을 포비돈-요오드(베타딘)과 7% 알코올로 세척하고 위에서 기술한 것같이 돼지의 측면에 네 개의 완전-두께의 이식베드를 제조하였다.
19.1.3. 동물유지
4 내지 5일후에 상처 드레싱을 떼어내고, 이식된 면을 감염 및/또는 저부의 흔적을 조사하였고 와셀린 가제로 한 번 더 덮고 탄력 플라스트를 감았다. 상처를 처리한 면을 생검으로 취하면서 4일 간격으로 관찰하였다. 동물은 Ketalar로 마취하여 일회용 Baker 펀치와 살균기술을 사용하는 4mm 생검의 살균제가 가능케 하였다. 시료를 이식부착과 상처치료를 평가하기 위하여 조직학적 평가를 하도록 보냈다.
19.1.4. 상피 이식물
선택된 동물은 피부 등가물로 이식한 후 10일에 자기인식의 케라틴 세포의 반-이식을 받았다. 과-합류로 생장시킨 단리된 세포에서 만든 케라틴세포 시이트를 피부등가물에 내이식하기전에 10-14일간 배양하였다. 시이트는 네 개의 국소봉합에 의해 부착시키고, 와셀린 가제와 붕대로 덮어서 세포를 부착시킨다.
19.2. 결과
동물치료에서 피부등가물은 잘 부착되었고, 수축과 탈수가 방지되었고 상피세포가 이주하거나 또는 자가(autologous) 이식에 놓을 수 있는 생조직 베드를 제공하였다. 제19도는 전체 두께의 상처속으로 사람 피부 등가물(신피부)을 내이식한 후 10일에 치료의 대표가 된다. 본인들은 최소의 수축면은 있으나 거부반응이 없는 것으로 보아서 이식에 동종이계의 섬유아세포의 사용을 나타낸다. 이러한 면을 조직학적 평가로서 섬유아세포의 활성 생장과 최소 백색 세포침윤의 콜라겐의 침착을 나타내었다(제20도). 분지두께의 상처는 피부등가물(좌측)과 생체분해성 메쉬단독(우측)으로 처리한 상처와 비교했을 때 생장된 수축, 상피화, 색소화 및 모발생장에 현저한 차이를 나타내었다(제21도). 섬유아세포 용해질로 함치시킨 메쉬는 메쉬 섬유역 위에 생장된 상피의 증가를 나타내었지만(제22도) 살아있는 신피부로 처리한 면에서 보다 총체적으로 더 느린 치료과정을 나타내었다.
신피부는 치료면으로의 상피 이주를 증대시켰다. 제23도에서 보는 것같이, 생진피 등가물로 이주하여 이에 부착될 때 케라틴세포에 의해서 깊은 리트 페그(rete peg)가 형성되었다. 이런 형태는 치유부위에서 상피화의 특징이 된다.
자가 케라틴세포가 잘 부착되고 심지어 새로운 피부에서도 치료되었다. 제24도는 상처치료의 비교를 나타내는데 이중 반은 자가 상피이식을 받았고, 나머지 반은 새로운 피부만을 받았다. 상피이식은 균일하게 치료되었고 추가 수축이 방지되었고 밑의 피부등가물에 단단히 부착되었다. 제25도는 균일한 생장과 새로운 피부에 피부세포의 부착을 나타낸다. 새로운 피부는 활성적으로 생장하는 섬유아세포와 천연-분비된 섬유아세포로 구성된 것으로 보였다. 메쉬섬유는 교차-부분에서 보인 것같이 여전히 존재하였다.
19.3. 토의
현재까지의 이식실험은 새로운 피부(섬유아세포와 생체분해성 메쉬에서 천연으로 분비된 콜라겐)가 전체-두께 상처에 대해서 우수한 치료를 제공했음을 나타내었다. 이종의 이식물을 사용하여 욕창궤양이 있는 화상희생자와 환자에서 동종이계 신피부를 사용하는 능력이 설명되었다. 이식으로 자가상피 시이트의 지지와 생장은 물론 내이식된 표면에의 상피세포의 이주를 허용한다. 이식물을 4개월 후 중첩이나 또는 깊은 반흔 흔적이 없이 영구적이었다.

Claims (46)

  1. 시험관에서 만들 수 있는 살아있는 기질 조직에 있어서, 기질 조직은 3차원 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  2. 제1항에 있어서, 기질 세포는 섬유아세포를 포함하는 것을 특징으로하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  3. 제2항에 있어서, 기질 세포는 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단일세포, 백혈구, 혈장세포, 비만세포 또는 지방세포와 섬유아세포가 복합된 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  4. 제1항에 있어서, 3차원 구조물은 생분해 가능한 물질을 구성된 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  5. 제4항에 있어서, 생분해 가능한 물질은 면, 폴리글리콜산, 고양이 장 봉합사, 셀룰로오스, 겔라틴 또는 덱스트란에서 선택되는 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  6. 제1항에 있어서, 3차원 구조물은 생분해 되지 않는 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  7. 제6항에 있어서, 생분해 되지 않는 물질은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스트렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카아보네이트, 폴리테트라풀루오로에틸렌 또는 니트로셀룰로오스 화합물에서 선택된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  8. 제4, 5, 6 또는 7항중 어느 한 항에 있어서, 구조물에 콜라겐을 미리 피복시키는 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  9. 시험관에서 만들 수 있는 살아있는 기질 조직에서 배양된 실질세포(parenchymal cell)로 구성된 3차원 세포 배양물에 있어서, 3차원 세포 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  10. 제9항에 있어서, 기질 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  11. 제9항에 있어서, 기질 세포는 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단일세포, 백혈구, 혈장세포, 비만세포 또는 지방세포와 섬유아세포가 복합된 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  12. 제9항에 있어서, 구조물은 생분해 가능한 물질을 구성된 것을 특징으로하는 3차원 세포 배양물.
  13. 제12항에 있어서, 생분해 가능한 물질은 면, 폴리글리콜산, 고양이 장 봉합사, 셀룰로오스, 겔라틴 또는 덱스트란에서 선택되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  14. 제9항에 있어서, 3차원 구조물은 생분해 되지 않는 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  15. 제14항에 있어서, 생분해 되지 않는 물질은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스트렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카아보네이트, 폴리테트라풀루오로에틸렌 또는 니트로셀룰로오스 화합물에서 선택된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  16. 제12, 13, 14 또는 15항중 어느 한 항에 있어서, 구조물에 콜라겐을 미리 피복시키는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  17. 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직에서 배양된 조혈성 세포로 구성된 3차원 골수 배양물에 있어서, 3차원 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 골수 배양물.
  18. 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직에서 배양된 흑혈구와 각질세포로 구성된 3차원 피부 배양물에 있어서, 3차원 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 피부 배양물.
  19. 제18항에 있어서, 기질 세포는 합류(confluent)된 것을 특징으로 하는 3차원 피부 배양물.
  20. 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직에서 배양된 신경세포와 성상세포(atrocytes)로 구성된 3차원 배양물에 있어서, 3차원 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 배양물.
  21. 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직에서 배양된 점막 상피 세포로 구성된 3차원 배양물에 있어서, 3차원 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 배양물.
  22. 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직에서 배양된 종양세포로 구성된 3차원 배양물에 있어서, 3차원 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 종양 배양물.
  23. 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직에서 배양된 간세포로 구성된 3차원 간 배양물에 있어서, 3차원 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 간 배양물.
  24. 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직에서 배양된 췌장 선방세포로 구성된 3차원 췌장 배양물에 있어서, 3차원 배양물은 구조물에 부착되고 이를 에워싸는 기질 세포에 의해 자연적으로 분비되는 기질 세포와 연결 조직 단백질로 구성되고, 이때 3차원 구조물은 기질 세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 것을 특징으로 하는 3차원 췌장 배양물.
  25. 제1항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  26. 제8항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 살아 있는 기질(stromal)조직.
  27. 제9항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  28. 제16항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양물.
  29. 시험관에서 신경세포를 배양하는 방법에 있어서, (a) 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직위에 성상세포를 접종시키고, 이때, 살아있는 기질 조직은 기질세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 구조물에 부착하여 이를 에워싸는 합류된 내피세포로 구성되고; (b) 성상세포에 신경세포를 추가 접종하고; 그리고 (c) 접종된 살아 있는 기질 조직을 배양하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 시험관에서 신경세포를 배양하는 방법.
  30. 시험관에서 점막 상피세포를 배양하는 방법에 있어서, (a) 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직위에 점막 상피세포를 접종시키고, 이때 살아있는 기질 조직은 기질세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 구조물에 부착하여 이를 에워싸는 기질세포와 기질세포에 의해 자연적으로 분비되는 연결 조직 단백질로 구성되고; 그리고 (b) 접종된 살아 있는 기질 조직을 영양 배지에서 배양하여 접종된 세포가 배양물에서 증식되는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 시험관에서 점막 상피세포를 배양하는 방법.
  31. 시험관에서 종양 조직 세포를 배양하는 방법에 있어서, (a) 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직위에 종양 조직세포를 접종시키고, 이때 살아있는 기질 조직은 기질세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 구조물에 부착하여 이를 에워싸는 기질세포와 기질세포에 의해 자연적으로 분비되는 연결 조직 단백질로 구성되고; 그리고 (b) 접종된 살아 있는 기질 조직을 영양 배지에서 배양하여 접종된 세포가 배양물에서 증식되는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 시험관에서 종양 조직 세포를 배양하는 방법.
  32. 시험관에서 췌장 세포를 배양하는 방법에 있어서, (a) 시험관에서 만든 살아 있는 기질 조직위에 췌장 선방 세포를 접종시키고, 이때 살아있는 기질 조직은 기질세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 구조물에 부착하여 이를 에워싸는 기질세포와 기질세포에 의해 자연적으로 분비되는 연결 조직 단백질로 구성되고; 그리고 (b) 접종된 살아 있는 기질 조직을 영양 배지에서 배양하여 접종된 세포가 배양물에서 증식되는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 시험관에서 췌장 선방 세포를 배양하는 방법.
  33. 유전공학으로 조작된 세포를 배양하는 방법에 있어서, (a) 살아 있는 기질조직에 형질감염(transfected)된 실질(parenchymal)세포를 접종하고 이때, (ⅰ) 형질 감염된 실질세포에는 발현요소의 조절을 받는 상태에서 외래유전자를 포함하고; 그리고 (ⅱ) 시험관내에서 만들어진 살아 있는 기질세포는 기질세포에 의해 연결된 간질성(interstitial) 공간을 가지는 생체 적응성이 있는 무생물(non-living) 물질로 구성되는 구조물에 부착하여 이를 에워싸는 기질세포와 기질세포에 의해 자연적으로 분비되는 연결 조직 단백질로 구성되고; 그리고 (b) 접종된 3차원 기질조직을 영양배지에서 배양시켜 형질 감염된 세포를 배양물에서 증식시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  34. 제33항에 있어서, 기질 세포는 섬유아세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  35. 제33항에 있어서, 기질 세포는 내피세포, 혈관주위세포, 대식세포, 단일세포, 백혈구, 혈장세포, 비만세포 또는 지방세포와 섬유아세포가 복합된 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  36. 제33항에 있어서, 구조물은 생분해 가능한 물질을 구성된 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  37. 제36항에 있어서, 생분해 가능한 물질은 면, 폴리글리콜산, 고양이 장 봉합사, 셀룰로오스, 겔라틴 또는 덱스트란에서 선택되는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  38. 제33항에 있어서, 구조물은 생분해되지 않는 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  39. 제38항에 있어서, 생분해되지 않는 물질은 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스트렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카아보네이트, 폴리테트라풀루오로에틸렌 또는 니트로셀룰로오스 화합물에서 선택된 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  40. 제36, 37, 38 또는 39항중 어느 한 항에 있어서, 구조물에 콜라겐을 미리 피복시키는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  41. 제33항에 있어서, 실지세포는 조혈세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  42. 제33항에 있어서, 실질세포는 흑혈구와 각질세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  43. 제33항에 있어서, 실질세포는 간 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  44. 제33항에 있어서, 실질세포는 췌장 선방세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  45. 제33항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
  46. 제40항에 있어서, 구조물은 메쉬인 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 세포의 배양방법.
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