JPS59501298A - 骨同等物およびその製造法 - Google Patents
骨同等物およびその製造法Info
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- JPS59501298A JPS59501298A JP50220583A JP50220583A JPS59501298A JP S59501298 A JPS59501298 A JP S59501298A JP 50220583 A JP50220583 A JP 50220583A JP 50220583 A JP50220583 A JP 50220583A JP S59501298 A JPS59501298 A JP S59501298A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
骨同等物およびその製造方法
技術分野
本発明・ま、生物学の分野に1関し、とくに皮膚の代わりに使用することができ
、あるいは人工器官の実作に使用できる生きている組織のV科に自する。
背景技術
人間の皮膚のかなりの区域の損1易を8ひ多くの−う、とく頷ひどい火傷の場合
において、皮膚の俊能のあるものを提F#する材料でm ’x :ra sうこ
とが直ちに必要でめろ。
これらの、操能は、体液損失の減少、感染の1坊止、:F6よび酒任刊傷跡の区
域の減少を包百する。
この問題を解決するとき用いら1%できたアフーローチは、同撞移萌、変性皮蒲
異橿移植、合成溝造物、または再構成し之コラーゲンフィルムのづ吏用をυ、ざ
する。こ3tらのアフーローチの各々は部分的成功を提供する711S、各々は
また解決さイtな力・つたNx1間、魂を多くもつ。これらのアプローチの多く
に2いてとくに重大な問題は、とくに免疫抑制剤の不存在における、皮膚代@物
の拒絶、あるG)は宿主S素による移植物の破壊であった。
発明の開示
本発明は、生きている組織を形成できるという発見に力する。この生きている頃
懺は、水和コラーゲン格子を生不外で形成するこ七により生成される。収縮剤の
例は、線維芽a胞ぢよび皿小・仮である。
皮膚同等物は、この生きている結合組織の基体(5ubstration )か
ら、その上にケラチノサイト(keratinocyte)fiII胞を置き、
そしてそれを生育させろことにより生産されろうる。この皮膚同等物は前述の人
工皮膚と独行に異なる。なぜなら、その基本的組織化は皮層のそれに頌似し、そ
して生きている構成成分の細胞はa狂的移植受容体から供与されうろからである
。
小さい脈管同等物は、ガラス偉または他のマンドレルのまわりに平滑筋子ざ有す
るコラゲーン烙子を注形し、引き絖いて下蒔維芽細胞の外層を注形し、次いで内
皮細胞の内層?配置することにより、形成することができろ。
小さい脈管同等物の製作における本発明により生産きイtた生きているIf’J
1餓同等物全同等物特定の手順1ま、1981年5月8日出I領の同時係属米国
特許出す預第261,923号に記載されている。
ここに記載する収縮水オロコラーゲン格子から、腺/器同等物全形成することも
できろ。たとえば、小腺細胞たとえばパンクレアチンβ細胞をコラーゲン格子上
で成長でぜて、受容体の血流へのイン/ニリン供給を促進できるすいa同等物を
生成させることができる。同様に、肝ff1l胞全収縮水和コラーゲン浴子上で
成長させて肝同等物全生成させろことができるであろう。
骨同等物を収縮水和コラーゲン格子から形成できる。
骨同等物は、線維芽」胞で収縮させた水和コラーゲン格子中へ、脱イオン(de
mineralized )骨粉を組込むことによって製造される。こうして、
分化する骨の究極の形状は型の形状によって前もって決定することができ、この
型内で水和コラーゲン格子を形成する材料を注形する。
こうして、不発明により調造され8生さている組織同等物は、多くの種類3よび
機能の生きている組織、腺および器官の同等物ヲ喪造するという可能性を提供す
る。
このような同等物は、製作し、そして使用する必要性が生ずるまで在庫品として
貯蔵することさえできる。
このような組織同等物の王な利点の1つは、期待されうろ拒絶の重大な問題に悩
まされないで、組織同等物の製造に使用した細胞の供与体以外の宿主にEいてそ
の担織同等物全1更用できるということである。この理由は、生きている組織の
製作に1吏用する細胞が不発明に従い増殖するとき、受容体の免役系による拒絶
の原因とlろ細胞に対して選択が行われろD)らである。さらに、ある棟の細胞
は、最近の研究の報告に従うある条件下で組織培地中に保存されろとき、拒絶を
刺激する能力を失なう。
本発明の他の面において、免疫の受容または拒絶の測定は前述の組織同等物に基
づくことができろ。
図面の簡単な説明
第1図は、水和コラーゲン格子の線維芽細胞による収縮を示すデータのプロット
である。
第2図は、コラーゲン含量が異なる水和コラーゲン格子の腺維芽細胞による収縮
を示すデータのプロットであ第3図は、異なる数の線維芽細胞を富有する水和コ
ラーゲン格子のa維芽細胞による収縮を示すデータのプロットである。
第41図;よ、異なる集団倍加レベルの細胞音用′J)ろ水和コラーゲン格子へ
の線維芽細胞の収縮能カケ示すデータのプロットである。
第5図は、水和コラーゲン格子を収縮さぜる線維芽刊胞の能力への1O00μ(
1/1rrlの阻害剤サイトカラノンBの作用を示すデータのプロットである。
第6f図は、水和コラーゲン格子を収縮ぜぜる線維芽細胞の能力への0.36μ
g/lnεの阻害剤コルセミド’ (colcernid )の作用を示すデー
タのプロットである。
第7図は、水利コラーゲン格子を収縮さぜる虜維芽細胞の能力へのント/ンアラ
ビノシドの作用を示すデータ”、、)7’。ッ、−,cfF、お。
亡
第8図は、40単位/ mtのトロンビン一度に旧けろコラーゲン格子の血小板
による収縮へのトロンヒ゛ンの作用を示すプロットである。
第9図は、血小板a度および4.0単位/ mllの濃度におけるトロンビンの
存在の関数としてのコラーゲン格子の収縮を示すプロットである。
第10.4〜10Dは、使用したコラーゲンの種類2よび濃度の関数としてコラ
ーゲン格子の格子収縮を示すフ。
ロットである。
第11図は、血小板による水和コラーゲン格子の収縮への1阻害剤サイトカラ/
ンB2よひコルセミドの作用”v水和コラーゲン格子は、ラットの尾の雌Sよひ
子牛の皮膚のコラーゲンから誘導されたコラーゲンを用いて製造できろ。ヒトの
胎児の皮膚を包含するコラーゲンの池の源全使用し、そしてなお池の源も適当で
あろう、、コラーゲンの浴液を調凄し、わずかに璽性の条件下に維持する。晒子
(ま、燻維芽刊胞を加え、栄養培地ぢよび1各液n・らコラーゲンのフィブリル
全沈殿させろたのに十分なpHを上昇さぜ′7SI堪基を用いて、形成する。水
和さイtたコラーゲン名子の装造は次の文献に詳述σれてSす、そ:I%らの教
示?引用によって加えろ: Elsdale、T、εよびBard、J、、”
ColCo11a 5ubstrata Far 5tudies 0nCel
l Blh、avior”、J、Ce1l Biol、 54 、626−63
7(1972) ; Ehrman、n、R,L、およびGe’/、G、O,、
FheGrowt ノt of Ce1ls oa A Transparen
t Gel ofEmerrnann、J、T、 bよひPitelka、D、
R,、”HorrnonalEffects on Intraceltula
r and 5ecreted Ca5einirr Cu1tures of
−Ifouse 、Ifarnmary EpilhelialG、およびp
itot、Iイ、C,、”Pr1rnary Cwlture of Pare
nch)/mal Liver Ce1ls on ColCo11a Mem
、franes。
” Exrr、Ce1l Res、 9工、7O−78(1975):Ggy、
G。
0、Svo t e l i s 、、1/、 、Fo ord 、M、および
Bang、F、B、、”Long−Term Growth of Chick
en Fibroflasts on、ACollagen、5ubstrat
e、”Exp、Ce1l Res、、84.63−71(1974):zよひH
i l l is 、W、D、 i6よびBand 。
F、B、、”The Cwltiva、tion、of Human Embr
o’10nic収縮剤としてここに記載する実・倹に2いて実際に使用した繊維
芽7謡胞は、ヒトの包皮線維芽□2■胞およびモルモットの皮ti線維芽浦飽で
あった。池の源からの、l!!維芽刊胞も使用し、そして、事実、を椎助物0・
らの線維、謡Kajま水和コラーゲン格子を収縮するために適当であろう。同時
に格子全形成しかつその中に細胞會配置する便利な技術は、繊維芽411胞を含
有する栄養培地を有する培養皿内に維持さ11.7′ic鹸性コラーゲン浴液を
中オロすることを包含する。中和すると、コラーゲンのフィブリルは溶液から沈
殿して、繊維芽細胞が均質に全体に分散した格子を形成する。次いで、細胞をコ
ラーゲン格子へ取付けかつそイ2+もとの大きさの数分の1に収縮させろ条件の
もとに、細胞石よびコラーゲン格子を維持し、これにより生きている組織を得ろ
。
水和コラーゲン搭子千に1課維芽刊胞を組込むと、格子7 特表昭59−501
2!78 (3)は収縮し、このとき捕捉さgでいた水は収り出さイz 7)。
格子をその上に形成した表面が水にぬれないとき、たとえば、疎水性の板である
とき、得られろ岨裁は規則正しい形状寸法をもつ。組織培養板上で、細胞のある
ものは格子から移動し、そして格子の収縮は常に規則正しいというわけではない
。非湿潤1生表面、たとえば、細菌学的セトリ皿を使用するとき、格子は、細胞
によりその半径が減少するとき、はとんど完全な円板にとどまろ。
線維芽細胞はコラーゲン格子全体に均質に分散し、単に格子表面上に存在しない
ことがわかった。それゆえ、これは人間忘よび他の哨乳動物の皮膚層ヲノミュレ
ートする。
細胞の不存在では、格子は半径を変化させない。たとえば、栄養培地中でlXl
0’個のヒト包皮線維芽則胞全5日間成長させることにより調浚した、コンディ
ノヨニングされた培地は、細胞が存在しなかったとき、収縮しなかった。
細胞を肩する収縮したコラーゲン格子は皮膚に類似する。部分的に収縮したとき
でさえ、格子は合理的な密度を有し、容易に取り扱うことができる。細胞を用い
て構成されると、格子はほとんど透明であるが、水が排除されかつ直径が減少す
るにつれて不透明となる。格子面積が20〜30倍減少した後、格子はかたいゴ
ムのコンンステンンー、白味がかったピンク色の着色をもち、多少延伸すること
ができ、その時裂けたり、変形することはない。
格子の初期直径は、材料の使用量εよびそれを形成するとき用いろ板によって決
定されろ。こうして、最大の収縮(I任意の程度であるが、細胞の数およびタン
/ぐり質のa度に関係する。
大部分の収棉水和コラーゲノ格子;ヨ/−トとして形成したが、池の造形物を形
成することができる。たとえば、管は環状型内で収縮された格子全形成すること
ができ、あるいは皮膚の手袋全適当な型内で製造できろであろう。
生検において得られた、人間の皮膚のケラチノサイトを、収縮した水利コラーゲ
ン俗子上へ付量さ4:た。こJ″l。
は生体外で培養したケラチノサイト=用゛5)て実施した。
ケラチノサイトの配! (plating) !:、マトリックスのゲルが形成
する時、格子の収縮の期間中、あるい・:マ収縮が完結したいずれの時に5いて
も、実測できろ、3解話したケラチノサイトの)°謬濁〆夜の配置後3日以内に
、副、剋は浴子辰扁上に合流層を形成し、そして角化の過程は角質化層全形成し
始め、これ・乙より組、城の流1不の損失は防止されろであろう。
繊維芽J胞に力0えて、池の細胞の収縮剤が存在する。
これらのうちには、平滑筋の細胞、横収筋の細胞および心筋の細胞が存在する。
他の収縮剤は血小板であり、これは多くの、場合においで、潜在的移植受容体か
ら得ろことができる。血小板は全血から遠、し分離、あるいは全血から血液成分
を分離する他の技術により、分離される。
血小板による収縮は非常に角速であり、ン’sとんどの場合において血小板を含
有するコラーゲン格子の注形後3時間目の終りまでに、流体の約80〜90%の
田川は完結する。約6時間までに、反応は通常完結するように見え、平衝に到達
し、そして100チの湿度の条件下にそれ以上の流体の解放は起こらない。この
時点において、典型的(では、出発流体の体積の20〜80%がコラーゲン格子
から圧出されてしまい、端確な量は血小板およびコラーゲンの濃度およびある種
の他の注形媒質、の変数に依存する。
血小板lてよろ格子の収縮速度は、1吏用するコラーゲンの神頌に対して独立で
あるように巴われる。血小板濃度を工冑大すると、収縮速度は710速され、そ
して格子の流体(才比例して少なくなる。これに関して、血小板の収縮は主きて
いる勝維芽1nifl胞を使用して達成される収縮に類似する。
コントロールされた実演において、阻害剤のサイトカラノンBは格子の収縮が起
こらないように血小板を不活性化することが決定された。サイトカラノンBは血
小板の円板形を安定化し、偽足の形成を防止することが翔られている。サイトカ
ラノンBの存在下に、血小板を用いないであるいは用いて格子を注形したとき、
格子は収縮しなかった。
曲刃において、阻害剤のコルセミドは格子の収縮に対して作用を及ぼさなかった
。これは、コルセミドがヒト血小板のフィブリンイ疑固物を収縮さぞる能力に作
用を及ぼさないので、期待された。
十分な数の皿小根ヲ有する注形混合物中にトロンビン金含有させろと、組織同等
物は形成され、それから流体が急速に排除される。このようにして急速に形成し
た組織同等物は、血小板単独を用いて、よりゆっくり形成したものと多少異なる
性質をもつ。たとえば、トロンビンを用いないで形成した対応する組織よりも、
その引張り強さは多少大きくかつその流体@量は多少低い。急速に形成した組織
は、その形成が、血小板濃度および、コラーゲンに加えて、トロンビンまたはい
くつかの他の血小板解放因子に依存するように思われる。他の血小板解放因子は
、脂肪酸、ADP、およびガンマグロブリンを包含する。
繊維芽細胞または血小板のような収縮剤による格子の収縮は、収縮剤を用いない
コラーゲン格子注形物と比べて、両者を100%の相対湿度の条件下に維持し友
とさ、コラーゲン格子全比較的高い引張り強さの組織同等物に転化する。収縮剤
を用い々いて注形すると、コラーゲン格子は新鮮なゼラチンのコンシステンンー
を有し、取す扱うとき分離して落下する。血小板または細胞により収縮された格
子は、損傷せずに、取り扱い、延伸しかつ縫合することができろ。
引張り強さは、所定時間収縮された格子につるすことQ≦できる最大の重りを測
定することにより、試験した。
1つの実施例において、5mlの体積の格子を直径5.3確の皿中で形成し、そ
して繊維芽細胞で約2cmの直径に収潴させだ1子は3.5g全7分間支持した
。直径5.3c1nの皿中で5m1.の体積の他の格子を、血小板により、直径
全変化させないで、高さ0.23 cmyv・ら高さ0.09cmに収縮させた
格子は11gを1o分間支持した。
引張り強および他の性質は、使用するコラーゲンおよび収縮剤および他の添加剤
の種頃および量を包含する多くのパラメーターの関数で夙ろこさが、認められた
。ここに記載する研究において、たとえば、I型コラーゲン孕用いた。しかしな
がら、1■型コラーゲンは追加の引張り強さを皮膚2よび血管に付与することが
知ら孔てぃろので、にに記載するコラーゲン格子に■型コラーゲンを使用すると
、引張り強さは増大することが予測さイtろであろう。同様に、グリコサミノグ
リカン類、たとえば、ヒアウロン酸、コンドロイチン4−サルフェート3よびデ
ルマタン硫酸塩を添加すると、引張り箇さ2よび水程持性が改良されることがわ
かった。
抗生物質、たとえば、4二/リン、ストレプトマイノンSよびファンジゾン(f
ungizone)k、必要に応じて。
加えて微生物の感染を防止できる。
きわめてすぐれた凝着性の大きいならびに小さい組織同等物は、血小板単独を用
いて、あるいは血小板および外部D)ら供給される血小板解放因子を用いろより
急速な2
方法により、形成することができる。なぜなら、コラーゲンそれ自体は解放因子
として作用できるからである。
血小板による格子の収縮は厚さの次元においてのみ起こるように見えるので、最
終の大きさSよび形状は注形容器の形状寸法により決定される。流体含量の平衡
時の厚さは、注形媒質の初期体積によりならびに前述の、他の変数により決定さ
れろ。
ここで説明する動物への実験的移植は、万一トロガス血小板を用いた。血小板は
かなりの抗原性を示すので、異型移植は免疫反応全喚起するであろう。
ここに記載する研究の大部分は収縮されたコラーゲン格子上のケラチンサイ)
(keratinocyte)の成長による皮膚同等物の形成に1Aするが、他
の種類の細胞を格子の上でまたは中で成長さぐることができるであろう。例は平
滑筋εよび横絞筋の細胞、軟骨、骨の細胞、すい臓の細胞、肝細胞などである。
骨同等物は、前述のように線維芽細、泡で収縮させて調製された水利コラーゲン
格子中へ、脱イオン骨粉を組込むことによって製造できろ。皮下に移植さIzだ
脱イオン骨粉間の相互作用は、従来記載されている。Reddi、A。
つてここに加え・ろ、参照。骨同等物は、繊維芽細胞で収縮させた組織同等物中
に脱イオン骨粉を組込むことによって製造できる。これによりこのような組織同
等物は任3
意の形状に注形するこξができ、そして組織同等物は脱イオン骨粉を軟骨および
骨に転換させる因子となろ線維芽刊胞を全体に含有する。こうして、分化する骨
Sよび軟骨の究極の形状は、このような材料を注形するとき用いる型の形状によ
り前もって決定することかできる。
詳述するさ、従来用いられている酸油・用法により誠実された脱イオン骨粉を、
ホルモン「カクテル」に加えて、皮膚同等物格子の構成に用いられる標準成分と
組み合わセル。添加前K、骨粉を70%のエタノール中f滅菌L、IXマノコイ
(McCoy) 5 A媒質で洗浄しかつ・−夜ノーキングして、それをこの媒
質で飽和させろ。
人間の皮屑の線維芽訓胞と、コラーゲン、血清、およびインシュリン10−8モ
ル、T3(チロキノン)10−7モル、テストステロン1〜2μf//m1−7
よびツマトメジン(somntornedin ) 1.0〜10.011Al
から成るホルモンカクテルを含有する媒質と組み合わせると、注形用混合物が構
成され、これに骨粉を加える。
注形用混合物は、固化および収縮後、形状寸法が所望のものになる型に注入する
ことができる。コラーゲン8よび細胞の収縮剤に依存して、5〜20倍の体積減
少が起こる。
ホルモン混合物、経過時間、細胞密度および骨粉濃度についての要件を試験する
ために実験を実施した。変数の各組み合わせから得られる組織同等物を、組織学
的検査のために固定し、準備した。
14
、線維芽細胞、すなわち、出発細胞の種類は、軟骨芽、細胞、軟骨細胞および鉱
化組織の細胞と形態学的に容易に区別することができ、かつ軟骨細胞の分l、生
産物は適当な着色法により証明することができるので、組織学単独により実検結
果を分析しかつ評価することが可能であった。
主安な1現祭は、線維芽細胞が化生し、かつ軟骨のマトリックス特性の分泌にお
いて活性である、軟骨芽釧胞および軟骨細胞、すなわち、軟骨表現型の細胞に分
化することであった。化生の事象の前に、広範な細胞増殖の波が先行て、脱イオ
ン骨粉と初め隣接するゾーンにおけろ細胞密度は非常に高くなった。
成分の最適な組み合わせおよび「硬化」時間は、次ぎの通りであろ゛マノコイ5
A組織培地中に3いて骨粉4−84 / 5 ml、106細胞75 ml、3
.54/mlのI型コラーゲン、10%の血清。最適な培養期間は、試験生成吻
を1.2および3週間培養した後、1月である。
観測された分化の段階は、骨の形成に導ひく前駆物質である。この発見の王な実
用性は、要求する形状に注形された予備骨組織が損協部分または疾患部分の代替
物の役目をすることができろであろうということである。これらの組織同等物は
、供与体から宿主へ移植される細胞が異型的であってさえ、免疫学的に中性であ
る。また、それらは、生物学的不凍剤たとえばDusot浸潤させた後、凍結し
、貯蔵することができる。
収縮させたコラーゲン格子をコントロール可能な寸法2よび/または種々の形状
の/−トに注形することを促進するために、ある種の方法および装置を開発した
。収縮剤として線維芽細胞を用いるとき、拘束しないコラーゲン格子は典型的に
はすべての次元に収縮する。しかしながら、へりを固定して保持する/−トは厚
さの次元に2いてのみ収縮する。
へ11 を拘束するために適当な装置は、ある形状のステンレス鋼の網から作る
ことができろ。注形すべき所望の形状物をステンレス鋼の網の中央から切り、次
いで過剰の7−)i)’Jミングして除去し、形状物のまわりの網のほぼ0.5
インチ(1,27cT++)tへりを残す。これはステンレス鋼の鋼のフレーム
を形成し、これを非粘着性材料、テフロン(Te f ton”’ ) ポリテ
トラフルオロエチレンでコーティングさイtだパン中へ横たえることができ、次
いで酷子を形成するために使用する成分を導入する。
成分を注入しかつ格子が形成するとき、格子はステンレス鋼の間隙を充填し、そ
れへ定着さイするようになる。格子の承田胞要素がコラーゲンのフィブリルを一
緒に引くことによりそれを圧縮ずろとき格子の体積は減少するが、周辺は固定さ
れて保持されるので、減少する次元は厚さである。この方法に2いて、格子は流
体を失なう。
鋼のフレームの特別の利点は、組織同等物の最終大きさがフレームの同寸法の大
きさに精確に相当しそしてとくに、拘束フレームにより付与された細胞の配向の
ため、6
格子が追加の強さを獲得するということである。さらに、格子を長方形のフレー
ム中で注形する場合、格子をフレームから切り取った後でさえ、格子の次元は福
および長さにおいて変化しないので、注形後1日程度に早い時期ンて皮層同等物
の表皮成分を皮層同等物へ適用し、こうして書者)てより提供きれた生)芙から
皮膚同等物の移項物を1調製するだめに要する時間を少なくとも4日短縮するこ
とが可能である。
格子の成分をコーティングされたパン中に注いで拘束用(社)を忘石うことがで
きろ。格子が固化するにつれて、そイ1は→4甲に定着されるので、収縮時に、
長さと幅は未変化にとどまる。長さのみが減少する。厚さの究極寸法(J、(1
)Fii子の初期体積、(2)、141B胞濃度Sよひ(3)コラーゲン宮壮の
関数である。プロテオグリカン類、たとえは、ヒアルロア酸お、よびコ/ドロイ
チン硫酸塩が存在すると、収縮は増大しかつ格子の厚さは減少する。皮膚細胞金
」二に接種する格子または皮膚同等物を保持する長方形の網は、皮・14ケ必要
とする傷−」1で適用することができる。
所定位置にあるとき、網の存在は移植物の一体性を維持することを促進するこ七
ができるので、網は直ちにあるいはある時間の経過後に絹の内周辺から切ること
ができろ。
皮膚同等物の調製物の皮膚同等物上の表皮の定着を促進する池の技術石よび方、
去は、次のとおりである。皮膚同等物をまず注形し、そして針の先端を通過させ
かつ長7
方形のパターンを維持することができろプラスチックシート、たとえば、テフロ
ン(Teflon■)ポリテトラフルオロエチレンの7−トヲ新らしい注形物の
上へ横たえる。このプラスチックノート2よび針の先端全1〜4日後に除去し、
次いで注形物に皮膚細胞を接種する。これにより表皮細胞が流入する穴か形成し
、これにより宍皮と皮層同等物との間のより大きい表面接触が提供される。
酵素の解離技術により単離することができろ濾胞細胞3よび小線細胞は、表皮細
、抱の漕濁を接種して、このような穴を満たすことができるであろう。
ここに記載する生きている組織の主要な利点は、受容体が組織同等物の製造に使
用する細胞の供与体き異なるとき直面する拒絶が存在しないということである。
たとえば、皮膚同等物の移植物を移植物の受容体の郁胞以外の細胞から製作し、
動物の宿主に移植した。前述のように製作したが、スブレイダーダウリーC8p
γague −f)aurley)系統のラットの雌動物からの細、抱で組み立
てた皮層同等物の移植物を、雄のフイノ/ヤ−CFi sch e r )ラッ
トの宿主へ移項し、所定位置へ種々の期間とど1らせた。移植物を取り出すと、
表皮細胞は角化しており〔染色体は表現されかつカタロクグ化(Catalog
u、e)されている〕そして性は決定されている。雌細胞は2つのX染色体の存
在により同定されるので、移植された細胞の存在または不存在は積極的に確証す
ることができる。
この手順を用いて、初めに移植された細胞は異質性にか1日
D・わらず皮膚同等物の移植物を居住させ続け、正常の皮膚の異型移植を行うと
き、線維芽細抱が免疫反応を誘発する細胞ではないことを示すことが、決定され
た。同種異種の拒絶反応を開始させろ種類の細胞は何であっても、それらは皮膚
同等物の移植物中には存在しない。このため、移植受容体以外の源からの細胞を
用いて皮膚同等物を製作すること、2よび臨床的使用または危急の使用のだめに
移植全いつでも行うことが可能となる。
自然の組織中に遍在する特殊化された免疫細胞を用いないで製作される種類の同
等移植物は、移植拒絶の原因である抗原決定因子が同等移植物中に組み込まイt
た。洲胞の表面上に表現されないので、拒絶されないであろうと、−膜化するこ
とができる。その不存在のため、宿主の免疫細胞は異種細胞を感仰するこさがで
きない。こ、I″Lにより、受容体がy・要とする種類の細胞、組織または器官
は、受容体自体がそれらに欠乏するがあるい(まそれらが存在しないため、交換
しあるいは加える機会が提供される。
ここに記載する組織同等物は、ある供与本からの所定の細胞の種類が受容体にお
いて免疫反応を誘発するかどうかを決定するだめの検定に、使用することもでき
ろ。
前述のように、種間または種内の移植においてしげしげ直面する型の免疫応答音
引き出す抗原決定因子を、繊維芽細胞が含有しないという証拠が存在する。前述
のように製造された組織同等物は、免疫応答を誘発する能力が未知である供与体
からの試験細胞を組込むことにより用19 1!表昭59−5(11298(6
)′J)られろであろう。次いで、このような組織同等物を供与体に適用して、
試験細胞の種類について免疫応答が起こるかどうかを決定することができる。こ
うして、数百種類の唾乳動物の器官を、このような検定に組織同等物を用いて、
試験することができろであろう。
次の実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。
実施例1
組織同等物の製造す繊維芽細胞を接種したコラーゲン格子の収縮
粗製コラーゲン溶液金欠のようにして調製した。体重450gのラットからの凍
結したラットの尾を、70%のEtOH中で20分間解凍した。朧の束を70%
のEtOH中で層状流のフード内で切除した。個の廊ヲそのざやから引き出し、
細かく切り、希酢酸(1:1,000)甲に250mε/尾を用いて入れた。こ
の溶tLを4℃において48時間静置し、その時点で細かく切った鍵は膨潤して
全体積を満たした。この粘稠な浴液を23 krpmでベックマン(Beckm
an) L型超遠心分離器により5W250−ター内で1時間遠心した。上澄み
を抜き出し、4℃において粗製コラーゲン浴液(タンパク質“C”)として貯蔵
した。
この粗製コラーゲン溶液を0.1モルのNaOHと6 : 1の比で混合して酢
酸を中和し、これによりコラーゲンを沈殿させろことによって、精製されたコラ
ーゲン溶液を調製した。この溶液k 1500 rpmで5分間臨床用遠心分離
器で遠心分離した。上澄みを廃棄し、等体積の新らしい酢酸(1°1,000
) ’iz導入してコラーゲンを可溶化した。この浴液を4℃で精製されたコラ
ーゲン溶液(タンパク質゛R”)として貯蔵した。
タンパク質a度は、Lowr’/ et alの方法により測定した。Lowr
y、O,Il、 、Rosebrong、N、J、 、Fatr、N、J、およ
びRandaLl、R,J、、J、Biol、Chem、、) 93 、 26
5−314(1956)@照。
タンパク質格子を、繊維芽細胞が接着性に劣る60mmファルコン(Falco
n )?g!iA菌学的皿中で調製した。各皿は次きの成分を含有した°1.O
mlの5Xマノコイ(IVcCo’/)の5α培地、1.QLnA’の牛の胎児
の血清、0.25me (D 0.1 モ/l/のNaOH,1,5mlのコラ
ーゲン溶液、旧よひ1.Om、lのIXマノコイの培地中に普濁させた繊維芽細
胞。皿にまず上の体積のマノコインの培地、血清およびN a OHを充填し、
次いで繊維芽細胞の懸濁液を調製するまで、横に置いた。ゲルが直ちに固化し始
めるので、コラーゲン溶液および繊維芽細胞の同時添加の速度は重要である。益
金インキュベーターに37℃にお(,1て5%のCO2雰囲気のもとに100%
の相対湿度で入れた。繊維芽細胞を組込んだゲルはIO分後完全に固化した。
使用した繊維芽細胞は、ヒトの包皮の繊維芽細胞(系統1519 、 the
Humnn Genetic Ce1l Repositor’J。
the Jnstitute for Medical Re5earch、C
amtlen。
New Jerseyから入手した)であった。これらの細胞Lt、1
20%の血清、ベニ/リン3よびストシブ上マイシンで変性したマノコイの5α
泪池中で成長さぞかつ維持した。
培養物はマイコプラズマ金言頁しなかった。、M I T細胞カルチャー−1ン
ター(Tulture Center)は、第10の集団倍化レベ/l/ (p
opulation、 doubling 1evel )(PDL)ごとの−
1−!I]胞を調製しかつ凍結した。
格子の直径を測定するために1皿を暗色のバックグラウンドに3いて透明なメー
トル定規の上に置いた。ゲルのヘリの最適な可視性は、皿のへりに対して水平シ
て白色光を当てることにより得た。収縮したゲルは良好に形成した円板であった
。それらは種々の点にεいて直径の非常にわずかの差を示した。艮、4”lH2
3よひ味到の平均ヶ直径として採用した。
実施例2
水相コラーゲン格子の線維芽1.I(1減による収縮の測定実施例1の手順に従
って調襞力・つ570μg/lnbのタンパク質゛C″全苫有する水オロコラー
ゲン格子の7.5×106個のヒト包皮線維芽釧廁、株1519、第19のPD
Lによる収縮を、測定した。培地は皿に3いて第1日、第4日3よび第8日に変
えた。得らイtたデータ全第1図にフーロソトする。第1図は7日をわずかに超
る日数における格子面積の112倍の或少を示す。1日以内で、7倍の収縮が起
こった。
実施例3
異なるタンパク質濃度の水利コラーゲン格子の収縮水和コラーゲン格子中のタン
パクAa度の格子の収縮への効果を、次のようにして」1]定した。3棟類のコ
ラーゲン格子全実施クリ1の手順に従い調製し、ただし谷格子は異なるla度の
タンパク質”R″を含有した。ヒト包皮線作芽鋪胞、系統1519、第19のP
DLを使用し、そして培地を第4日に変えた。
得らイtたデータを第2図に示す。第2スVrcSいて、格子収縮速度(iゲル
タンパク′釘譲度に逆に変化することかわかる。格子の面積は時間経過とともに
減少した。
水和コラーゲン格子の収縮へのia胞の数の効果を、次のようにして1Ii11
足した。720μjj/labのタンパク質“R″全言再する水和コラーゲン格
子のゐろ数を、実施例1の手順に従って調製した。ヒト包反、勿維芽細胞、系統
1519を使用し、そして各培養に2ける培地を第3日、第7日石まひ第1OH
に変えた。
紬@全7)0え7よい対照金円いた。さらに、4系列の実験を、異なる故の細胞
を加えて、実施した。得られたデータ全第3図に示す。各点は3または4つの格
子の収縮の平均全表わす。偏りはすべて非常に小ざい(〈±1.0+++m)の
で示さない。
明らかなように、細胞の数は格子の収縮速度へある効果全事実示したが、収縮に
おけろこの差は時間経過とともに呵意差か不溶〈なった。格子の直径はある最小
値より上の濃度について共通の小さい数に近づいた。最小匝より下に2いて、格
子の収縮速度と細胞の数との間の関係は明確に非@線であった。8.I X 1
0’個の細胞全もつ格子は、24時間の間収縮し始めなかった。これらの希薄に
集団を形成する格子は、実、験期間全通じてより密に集団を形成した格子よりか
々り後に遅延した。
集団倍化レベル(PDL)が異なる細胞、す′なわち、異なろ数の細胞分割を行
う、la胞、の水和コラーゲン格子を収縮させろ能力を、次のように測定した。
実施例1の手順に従って調製しかつ720μg/m14のタンパク質゛R″をざ
有する水和コラーゲン格子から培養物を形成した。
培地を第3日、第7日Sよび爾10日に変えた。
対照の培養物は細胞全含有しなかった。さらに、異なるPDLの細胞を用いて一
系列の実験を実施した。
収集したデータ全第4図にプロットする。各点は3または4の格子収縮の平均で
ある。偏りはく士LOmmであった。明らかなように、第35のPDLの細胞は
第19のPDLの細胞と同じようにすぐれた能力を有したが、第50のPDLの
細胞は釣り合いが取れた速度で格子を収縮させろことができなかった。
4
水和コラーゲン格子を収縮させろ細胞の能力への阻害剤サイトカラノンBの効果
凱次のように刊1定した。
570μg /ml:のタンパク質“C”ff:含有する水和コラ−ゲル格子凱
実施例1の手順に従って調書した。培養物中の線維芽細胞(ヒト包皮、系統15
19、第19のP I) L )濃度は、5.0X10′であった。10. O
pg/meのサイトカラ/ンBk各培養物に加え、そして培地を第4日2よび第
8日に変えた。
得られたデータ全第5図にプロットする。明らかなように、この濃度のサイトカ
ラノンBは、比較的高いavの、l鉗胞を用いたときでさえ、格子の収縮を完全
に遮断した5、
尖 施 し14 7
コラ−ケン子の 縮へのコルセミドの効果タンパク質格子の収縮への阻害剤コ/
l/セミドの効果を、次のように測定した。570μ1fialのタンノぐり質
”C”を含む水和コラーゲン格子含■培養物を、実施例1の手順に従って調製し
た。0,36μjj/mlVのコルセミドヲこイtらの各々に加えだが、ただし
対照;まコルセミドを含有しなかった。同一数の細胞を試験培養物および対照培
養物の両者に加え、そして得られたデータ全第6図にプロットする。この図から
明らかなように、第45のPDL細胞は第19のPDL細吃よりも性能にすぐれ
たが、第45のPDL未処理細胞は第19のPDL未処理細胞よりも遅イtた。
コルセミドは格子の収縮の速度忘よび程度t%整するために使用できるこさが、
明らかである。
実施例8
異なるPDLの細胞によるコラーゲン格子の収縮への/ト/ンアラビノンドの効
果”
異なるPDLレベルの細胞によるタンパク質格子の収縮への1.0μg/mlの
/ト/ンアラビノ/ドの効果を、次のように測定した。タンパク質”C″を57
0μL乍のl層間で官有する水和コラーゲン格子を言む培養物を、調製した。第
19のPDLまたは第47のPDLのヒト包皮a維芽」胞、系統1519を、/
ト/ンアラビノンド全含有しないスj照とント/ンアラビノンド金富有する試験
培養物の両者に加えた。得られたデータを第7図にプロットする。ここでg47
のPDL細胞は低いPDLの細胞よ・・)も、故υ)少なくてさえ1曲籠にすぐ
れろことが理解できろ。これらの実験に2いて、/ト/ンアラビノ/ドを使用し
てDNA合成をブロックし、こイtにより格子中の細胞の数を一定に保った。
実施例9
ヒト包皮繊維芽細胞Zよびケラチノサイトi用いる皮屑同等物の形成
500μg/rrrlのタンパク質″C″を含有する水和コラーゲン格子を、実
施例10手順に従って調製した。生検に2いて得られたヒト包皮繊維芽細胞を、
EDTAおよびトリプ/ンを用いた培養板から取り出しだ。単一細胞26
の懸濁液を遠心・して細胞を沈降させ、その後細胞を培地中に再懸濁させ、次い
で線維閉離1泡を導入した後7日目に水和コラーゲンマトリックスの上部へ堆積
させた。3日以内K、ケラチノサイト(keratinocyte)細胞は格子
基体へ付着し、そして角化のプロセスが開始して、不透過性角質層の形成に導ひ
いた。電子顕微鏡観察により、形態学的観察を行った。
実@e2す10
モルモットの皮膚線維芽細胞2よびケラチノサイトヲ用いろ皮膚同等物を用いる
生体内研完
成+1のバイオプアー全モルモットについて行い、そして真皮を表皮から外科的
に分離した。真皮全4累的に構成細胞に解離し、この細胞を組織培養皿上へ配置
し、増殖させた。@実験動物からの細胞を別々の皿中に成長させ、こうして同一
性が保存されるようにした。モルモットからの線維芽細胞を用いる以外、実施例
10手頓に従い、収縮させた木本ロコラーゲン格子を形成することにより、組織
を生体外で構成した。格子のいくつかを、収縮後、第2バイオブ/−から得た表
皮細胞まだはケラチノサイトを用いて配置した。ここで各移植中のケラチノサイ
トならびに線維芽細胞は、移植物の受容体となるべき動物からのものであった。
これらの皮膚同等物の移植は実験動物(モルモット)の背に行い、そしてこのよ
うな移植物はすべてのレベルに3いて1週間以内に一体化したごとがわかった。
下か27 特表昭59−501298(8)ら、そイtらは脈管化した。真皮の
レベルにおいて、移植物のコラーゲンフィブリルは取り巻く宿主組成のそイtと
相互にからみ合った。形態学的切片iCSいて、移植物は、偏光顕微鏡で見たと
き、取り巻く皮膚のものに比べて、高い緋維芽細胞密度および復化析度の減少に
より区別することができた。表皮をもたない移植物は表皮細胞層(ケラチノサイ
ト)で完全にはお2われでいなかったが、なお多くの細胞は深かった。層は隣接
する宿主細胞の層と連続であった。まだ、真皮の傷の収縮は、ちょうど自己移植
を行ったときのように、皮膚同等物の移植物の存在により、阻止された。
実施例11
ラットの皮膚5θ維芽細胞、真皮細胞2よび宍皮訓胞を用潜在的移植受容体から
の小さいバイオプン−fLOmm2の断片に切った。線維芽細胞全断片から成長
させ、ラックス(Lux )組織培養皿で集団形成させ、そして4〜7日後、断
片全敗り出し、廃棄するか、あろい1は新らしい板へ移しだ。1まだは2以上の
板上の細胞を、はとんど合流するようになるまで、増殖させ、次いで細胞をトリ
プシンの処理により取り出し、洗浄し、その後組織培養フラスコ内で増殖させた
。約5X10’個の細胞を各1cm2の真皮同等物に必要とし、そして過当な数
の細胞を次のようにして注形した。細胞を基質からトリプ/ンで取り8
出し、その後コラーゲン浴液、ラットの血清、および組織培養基中にぜ濁しかつ
一緒にした。コラーゲンは、ラットの尾の)踵を0.02モルの酢酸中に抽出し
かつ遠心により精製すること(Cより、得た。ある酸apHおよび1.5mq/
miのタンパク質、農ζを保持すると、コラーゲンは粘llAlなわずかに不透
明の浴液であった。そ才tはコラーゲンl型のみから成り、汚染するタンパク質
類はSDS千〇アクリルアミドゲルの電気亦@により咲出できなかった。コラー
ゲンl型胞および他の成分と一緒にする時、pHをNaOHで7.2に調整し、
これによりコラーゲンをイ容液からフィブリルの形で析出させた。これが起こる
とき、流体を捕捉したゲルすなわち格子が形成した。格子中の間胞は格子全体に
多少不均一に分布された。細胞によるコラーゲンフィブリルの活性的圧縮法によ
り、格子はかたいコンメステン/−の組織に転換された。その鑓果、捕捉された
流体は失なわれ、モしてもとの格子の体積は多数倍減少した。真皮同等物CDE
)を構成する組織が得られた。
表皮の付加
トリプ/ンによりバイオプアー断片から解離された表皮細胞を、懸濁液として真
皮同等物上へ分布させた。2〜4日以内て、表皮細胞は真皮下層を2おう連続ソ
ートを形成した。この時間内知、細胞の合流シートは分化しはじめた。橋小体の
結合、張厚線維およびケラトヒアアリン顆粒が現われ、そして角質化の過程が進
行し、不透過性角質層の形成に導ひく。全過程1才、許されろならばDE上に生
体外で起こるであろう。しかしながら、この研究において、生きている2層の組
織は、皮刊同等物C5E)として作用する合流/−トを表皮細胞が形成するさ丁
ぐに、移植に1吏用できると考えられた。
皮膚同等物全多数のラットへ移植して、次の結果が得ら孔た。第1に、移植後3
〜5日までに、移植物の脈管化が始まり、かつ、@、速に連続し、壊死や虚血は
起こらなかった。第2に、わずかの例外を除いて、阻外された移植物は収縮して
であろう。移植を行うとき、移植物に隣接する正常な皮膚に刺青して移植物の限
界にしろしをした。この方法により、移植物の経時的寸法を監視することができ
る。傷の収縮の阻止に対するし1外は、表皮によろ真皮の不適切な初期の22い
、動物による移植物の分離、17もはコラーゲン調製物の使用量の関数である不
適切な格子の形成を原因としたものであろう。
包帯を除去した時(9〜14日)検査した31のこのような移植物の1つの研究
において、7つは傷の収縮を完全に阻止し、15は湯の収縮を75%以上ブロッ
クし、そして23はそれを50%以上ブロックした。
52の移植物の他の研究において、傷の収縮は移植物の少なくとも75〜85%
においてブロックされた。
ある数の移植物は時間とともに大きさの減少を示したが、大部分は60日までに
安定化され、そして拒絶されたものはなかった。すぐれた表皮のお2いを有する
太きい大きさくほぼ8X12C−m)の移植物は、収縮を効果的にブロックしく
75%以上)そして火傷した皮膚のすぐれた代替物として作用した。
移植物は長期間存続しつづけ、最長のものは2年間にわたって所定位置に存在し
た。
良好に脈管化することに加えて、真皮同等物のマトリックスは移植後最初の故か
月間がなりの改造を行った。
その構造の変化を形態学的切片の複屈折の研究により研究した。この研究から、
マトリックスは移植後1屋間まで複屈折を示すことが明らかにされ、この現象は
匹敵する年令の額粒組織においては観測されなかった。複屈折は時間とともに強
さが増加したが、パターンは、一般に、正常の真皮に特徴的なバスケットウィー
ブの形状の1つではなかった。しかしながら、移植物が正常組織と出合う遷移区
域に2いて10週までに、バスケットウィーブのパターンは発現し始めた。
生体同に2いて、表皮は肥大であり、モして移題咲10週後でさえ、隣接する正
常組織よりかなり厚かった。
舌またCオ被グ(peq)または表皮が真皮同等物を浸透していることが見られ
た。外部的に、数か月の間、表面の出現は多少ぼれてあり、そして移植物は赤味
がかった着色を有した。約3か月までに、移植物はなめらかでありかつピンク色
がかり、白ラットの正常の皮膚に類似したが、毛をもっていなかった。ある程度
の落屑は7か月まで持続したが、Cれは皮脂腺の不存在によるものであったであ
ろう。
古くなった血小板濃縮物を赤十字血液センターCRedCross Blood
Centeγ、Boston、:l1assachusetts )から入手
した。ラット8よびブタの尾の鍵のコラーゲンを実施例1に記載するようにして
抽出した。ブタの皮のコラーゲンは、パウル・エールリッヒ博士(Dr、 Pa
u、IEhrlich、the 5hriners’ Burns In5ti
tute ofJ3oston)から供給を受けた。つ/のコラーゲンはコラゲ
ン・コーポレーション(ColCo11a Corporation。
Pa1o Alto、Ca1ifornia)から入手した。コラーゲンの濃度
は、Watitiel法の修正法により測定した。Wadde l 。
W、J、、J、Lab and C11n、Med、 ’48 、311−14
(1956)参照。次式を使用した
μI/■=O,D、 215−0.D、 225 / 64−6゜赤十字から入
手したとき60Xに一縮した血小板濃縮物を、4℃において2530−タを用い
ろIECPR−2遠心機により500 rpmで50分間遠心して赤血球を除去
することにより、さらに濃縮した。次いで、上澄みを同じローターを用いて15
00 rpm’lCおいてさら(50分間遠心して、血小板を濃縮した。上澄み
を抜き出し、得られた血小板の再懸濁に使用した。絶対血小板濃度1は、供与体
の血液中の血小板濃度に依存して、実験ご2
とに変化したが1、各尖恢内のすべての濃度の頃は、濃縮し、次いで希釈した1
つ試料またはプールし′PL試料の使用に基づく。1X血小板濃度は、1. 、
Om(:の血色中の血小板濃度に等しい。
■小板格子は、次の成分全順番に結合することによって生形した2,3rneの
D IvI 、E ’A/、、T1.、.76 X培地(、’ll owLa、
boratories)、1.5mAのラットの尾の鍵コラーゲン、OJ5me
の0.INのNa O,PI t(コラーゲン全中和するために要するa度は、
使用したコラーゲン調委物の酸度に依存してわずかに変化した)、Sよひo、4
5m1のFBS(Flow Laboratories) 。この混合物f 6
0 mmのファル:17 (Falcon) 1007 d )り皿中に注さ、
0.5 rniの5 、Y血小板痛縮物全小さい謂で面表面へ適用した。あるい
うま、丁べての成分を別の容器内で一緒にし、空の被ト)1皿中へ庄いた。得ら
れる格子全37℃3よび100乃の温1fYC16いて90チの空気/10弼C
O2の雰囲気中て培yした。格子の厚さは、注形する合計の格子体積を増減する
ことに、より、コントロールした。格子の収縮速度(ま、注形手順の関数として
差がMIl]1]されなかった。
収縮速度は次のようにしてijl!I定した。格子により解放さイする流体ケま
ずl miのピRノド中に抜き出し、その後大きいものに抜き出し、次いで抜き
出された流体を記録し、その後抜き出された流体を皿へもどした。これらの、1
す定は格子が最大1限に収縮するまで続けた。IX以下の血小板:a 7Je
’x有する格子(二2いて、格子のへ’J f小さい3
メスで皿からまず分離し、格子の下に捕捉された流体をfi11定のために遊離
させた。格子は裂けるとき追加の流体を解放するので、格子を損傷しないように
注意して、血小板の収縮だけにより解放された流体を測定した。また、結合し之
り、MEMコラーゲン、NaoIIおよびFBSの添加前に1、トロンビンおよ
び血小板濃縮物ニー9)1皿上へ離散した滴として供給することにより、トロン
ビン(SigmaCんemicals )の添加の効果を決定するために。
実験全行った。
第8図は、トロンビン濃度が4.0単位/aで′あるときの、コラーゲン格子の
血小板による収縮に対するトロンビンの効果を示す、得られたデータのプロット
である。
第9図は、血小板濃度Sよび4.0単位/ばの濃度のトロンビンの存在の関数と
して得られた格子収縮を示すプロットである。
明らかなように、この反応は非常に、@、速である。lXの血小板濃度において
、合計の流体の80〜90%は格子の注形後筒3時間までに圧出されてしまうで
あろう。
6時間までに1反応は本質的に完結し、かつ平衡が達成される。すなわち、10
0%の湿度の条件下で、それ以上の流体の解放は捩察されない。この時点におい
て、初期流体体積の20〜80%が格子から圧出され、精確な量は血小板および
コラーゲンの濃度と他の注形媒質の変数に依存する。血小板の格子収縮のこのプ
ロセスは、血小板を用いないコラーゲン格子注形物に比べて、比較的34
向い引張り価妊の組織同等物を形成する。
十分な数の皿小板を有する注形混合物にトロンビンを言めろと1組織間等吻は第
1図に示すよりも急速に形成するであろう。トロンビンを含有する組戦同等物は
、それをままない注形物と多少異なる性質をもち、その引張り強さは多少低くか
つその流体言置は多少低い。引張り強さは、注形後組織同等物にダラム重りを結
ひつげ、破壊時間を測定することにより測定した。
血小板の格子の収縮速度は、血小板のイ農度に関係する。
血小板濃度を増加すると、格子の収縮速度は加速され、そして比例して少ない流
体全有する格子が1@られ、この事実は第9図から理解することができろ。
皿小板による格子の収縮へのタンパク質の濃度2よび源の効果は、異なる源から
のコラーゲンを異なる濃度で使用するが、それ以外実施”iil 12の手順に
従って測定した。得られたデータf:第10.4〜10D図にプロットする。
明らかなように、注形媒質のコラーゲン含量全増加すると、収縮速度および圧出
される流体の量は減少する。
これらの結果は、繊維芽細胞を収縮剤として使用したとき得られた結果に一般に
相当する。
使用した4種の異なる源からのコラーゲンは同様に機能し念が、ただしテロゲン
(telogen )は他の3種の#っ・らのコラーゲンよりも収縮に対してが
なり少ない抵抗を提供した。
実施例14
皿小板によるコラーゲン格子の収縮に・ る阻害剤サイトカラノンBSよびコル
セミドの効果
水和コラーゲン格子を収縮させる血小板の能力に対する阻害剤サイトカラノンB
3よびコルセミドの効果を、以下の例外を除いて、実施ヒ]]12の一般手順に
従って測定した。
サイトカラ/7 B (51gm、a Chemicals ) j6よびコル
セミド(CI BA Pharmace′u、tical Compan’/)
k濃縮さイtたD 、IIE M媒質に直接加えで、5 、wl!の格子体積
中の最終4をそイtぞ3t10μソ/mlおよび0.5μ97m1Eさした。
得ら几念データテ第11図にプロットする。
明らD・なように、ザイトカランンBの存在下に皿小板を有する硲子注形物は収
縮しなかった。こイ′Lに対して。
コルセミドは格子収縮に対して見掛けの効果を示でなかった。コルセミドはヒト
皿小板のフィブリン凝固物を収縮させろ能力に対して作用しないことが知られて
いるので、上の事実は予測された。他方において、サイトカラノンBは、血小板
の円板形を安定化し、かつ偽足の形成6
血小板により収縮させた水利コラーゲン格子から形成しかつウサギの耳への移植
に適する組織同等物を、次のようにして製造した。、a夜曲移植受容体から心臓
穿刺により採取したウサギの血液の10罰から血小板全集め、そして実施例12
に記載するように分画遠心分離により濃縮した。ウサギの血小板を、また実施例
12の手順に従い、注形した。収論後、格子に、実施例11の手順に従い同一ウ
サギからのバイオブ/−により誘導された表・i細胞を接紳した。。
麻酔したウサギを、グラフト部位の毛を切り取ることによって、移植のために準
1ift Lだ。移植床の輪郭を画き、そして輪郭の周辺のちょうど外側に刺青
でしろしをした。
その部位を70%の工S7ノールで洗浄し、そして軟骨の上に錨だわろ筋ノ嘆へ
下方に到るすべての組織を除去した。
ボ旧浅同等物を皿から取り出し、移植床上へ配置し、ここで(多植物のヘリケ移
植床のへりとわずかに重なるようにした。、テルファCTc1fa)バッドをワ
セリンで含浸させろこ乏により調製したパラフィン(tlLlle gras
)で、移植物を:、;2つだ。アール(Earle)の塩浴液中でノーキングし
たテルファパノド全パラフィンの上に配置した。
フオームのバンドを耳に2いて使用して、耳をその形状に保持し、そして耳を3
インチ(7,62C:m)のエラストプラス) (Elastplast )で
包帯をした。ウサギが包帯全除去することを防ぐために、両方の耳を3インチ(
7,62cm)のエラストブラストで一緒にテープ止めし7
た。包帯を移植後7日に除去した。ウサギにエリザベス(Elizabetha
n )カラー全敗り付けて、さらに2日間引つn=さを防止した。
正常な皮、・冑のへりさ一緒にり嘔区域を単一片としてウサギの耳から切除し、
0,03モルのリン酸塩暖@液中の10%のホルマリン中に浸漬した。皮膚に一
夜固定し、蒸留水ですすぎエタノール中で脱水し、酢酸アミル中で、次いでトル
エン中で清浄し、パラプラス) (Paraplast)L中に埋め込んだ。7
ミクロンの切片を回転ミクロトー移植物は、すべての実、・恢にSいて許容さイ
tうろものであり、陥の収縮を阻止した。全体的に、移植物は取り巻く皮J呵よ
りも白く見え、表面は多少はぼろ層ち、毛をもたなり・つた。6週後ではえ、小
さい中央に泣iするかさぶたが残った。
所定位置に6遇間存在した移植物音一部分形帖学的に倹をし、移植物に取り巻く
組織L・ら緋維則胞が浸透する程度を決定した。移植物中の繊維芽細胞の密度は
、隣接する組織よりもかなり太きかった。移植物は、取り巻く組織から、光学顕
微鏡で見て、複屈折の減少により区別された。移植物中の脈管化は、隣接組織よ
りも太きいように見えた。移植物は二次誘導体、すなわち、毛包2よび皮脂腺の
不存在により、囲りの組織からさらに区別された。移植物を8おう表皮は、著し
く肥大していた。
38
皮屑の小片を雌のフィノ/ヤ−(Fischer) −344ラツト(Char
les River Breeding Labs )の背から取った。、これ
らのバイオプ/−ヲ異質組織からトリミングし、2〜3mm3片に切り、そして
乾燥してラックス(Lux )組織培養皿上へ置いた。バイオプ/−から成長し
た朦維芽細胞を、10%の牛の胎児の血清、4二/リン、ストレプトマイノンS
よびファンジゾン(fungizone)(Flow Laboratorie
s ) f補充したイータ/l/ CEagl e )の最小必須培地(DME
M)のタルベコ<Dulbecco )の変性培地中で10%のCO7の雰囲気
のもとに37℃で培養した。
コラーゲン格子を実施例11の手順に従い調委した。
1?11単に述べると、2〜8X105個の線維芽・細胞を、100朋のプラス
チック皿中で、1:1000の水中面Itt希釈(4W中のaDMEMプラス1
0%の牛胎児血清、抗生物質Sよび6mgのラットの尾の廓コラーゲンと一緒に
し′fc。
1週以内で、繊維芽細胞はコラーゲン格子を収縮させ、そして新らしいバイオプ
シーから解離した表皮細胞の懸濁液を格子上へ層状に配置した。1o−10モル
のコレラ毒素、20μg〜の表皮成長因子および0.4μg/gのヒドロコルテ
ノンを培地へ加えて、表皮細胞の成長全促進させ、そして皿を5チのCotの雰
囲気中へ勅かした。1週以内で、表皮細胞はコラーゲン格子の表面上に合流する
ノート全形成し、そして皮膚同等物はすぐに移植できろ状態であった。
アロブラフトラ試験するために、格子を雌のスフレイグーダウリイ(Sprag
rte −Dawl e ’/ )ラットからの細胞を用いて調製し、そして雄
のフイノ/ヤ−(Fisher )う体重はぼ350〜400Iの雄のフィソ/
ヤーーラットヲナトリウムフエノバルビタールで麻酔した。格子とほぼ同じ大き
さの移植床を、各動物の背から全厚さの皮膚全切除することにより準備した。格
子をこの偏中に配くし、ワセリン含浸テルファCTe1fa)パッドでEEす、
そしてテルファ・パッド全アールCEarla)の塩溶液でノーキングした。こ
れらの包帯を、体を数層のエラストブラストで包装することにより、25つだ。
移植を初めに適用した後9日から13か月の期間に8いて、動物を再び麻酔し、
移植物全体を切除した。移植物の半分tlJン醒塩緩衝ホルマリン中で固定し、
エタノール中で脱水し、パラフィン中に埋め込んだ。移植物の他の半分の中央部
分を下層の脂肪組織からトリミングし、2〜8mm3片に切り、そして組織培養
基中に入れ、存在する繊維芽細胞を成長させた。
核型の調製
移植物から成長した繊維芽細胞の集団を継代培養して、負速に分割する細胞の3
〜6のT−150フラスコを得た。線維芽綱胞全2μL官のコルヒチンで4時間
処理し、フラスコを振とうし、低張性媒質(1部のD ME M対3部の蒸留H
20)中で#潤させ、ガラススライド上へ空気乾燥させ、そしてアセトーオルセ
イン(αceto−vrcein)で着色した。各時点にj6ける20〜3oの
完全な染色体数がりを写真撮影し、核型(ka’/rot’/pe)を調製して
線維芽1鉗胞の合計の集団中の雌訓胞の比率を決定した。
スブレイグーダウリーの雌−1iB胞を有するドラフト(draft)は、移植
1〜2月後に雌細胞の存在により決定して、雄のフイノンヤー宿主により受容さ
れかつ保持ここに記載する皮膚同等物は、人間または他の動物の皮IMの1易の
処置に適する。そltはとくに広範囲の大腸に適する。
jM #it−芽細胞によろ水和コラーゲン格子の収縮は、収縮カケ仮言する、
線維芽訓胞の機能を測定する検定として用いろこともてきろ。
皮1+j同等物、傷の包帯などに加えて、組織同等物は他の用途のために修正す
ることができる。たとえば、収縮されたコラーゲン格子は、他の種類の細胞、た
とえば、すい臓の小島細胞の担体として、すい・臓機能を有する組織、とくに潜
在的受容体から得られた細胞から製造したもの、の製造において開用することが
できるであろう。
1
さらに、管や他の造形品り繊維芽細胞、心筋細胞などの細胞を含Mする収縮さ、
Tした格子から製造して、生きている人工器官を形成できろであろう。このよう
な人工器官は、たとえば、照射線によりまだは化学薬品でさらに処理して、生き
ていないが、生物分解性人工器官とすることさえできるであろう。
同等物
この明細書に記載された特定の反応成分、触媒、工程、技術などの他の同等物を
、日常実暎により、認識し、あるいは確認すること1ま、当業者にとって可能で
・あろう。
このような同等物は、以下の請求の範囲内に包含される。
浄書(内容に変更なし)
第4図
日今拮1(日)
第9図
第10図A 第10図B
第10図C第10図り
第11図
手続補正書(方式)
%式%)
#固”l’rr太目・こつy1升、
3、補正をする者
事件との関係 出 願 人
住所
5゜補正命令の日付 昭和d年 2月話日(発送日)国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、a、水和コラーゲン格子を形成し、b、説イオン骨粉を前記浴子甲に組込み 、c、Aj+記水和コラーゲン烙子金線維芽細胞と接咄させ、そして d 前記線維茅細7抱が前記コラーゲン格子を収縮させて骨同等物を形成するた めに十分な条件下に、前記格子:5 jひ前記線維芽細胞を維持する、ことから なる骨同等物を形成する方法。 2、脱イオン骨粉全含有しかつ線維芽細胞で収縮でイtた水和コラーゲン格子か らなる骨同等物。 浄書(内容に変更なし)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US381978 | 1982-05-26 | ||
PCT/US1983/000810 WO1983004177A1 (en) | 1982-05-26 | 1983-05-25 | Bone-equivalent and method for preparation thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59501298A true JPS59501298A (ja) | 1984-07-26 |
JPS6134832B2 JPS6134832B2 (ja) | 1986-08-09 |
Family
ID=22175188
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50220583A Granted JPS59501298A (ja) | 1982-05-26 | 1983-05-25 | 骨同等物およびその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59501298A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010500335A (ja) * | 2006-08-10 | 2010-01-07 | ユニベルシテ ルネ デカルト−パリ サンク | 皮膚創傷を治療する方法 |
-
1983
- 1983-05-25 JP JP50220583A patent/JPS59501298A/ja active Granted
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010500335A (ja) * | 2006-08-10 | 2010-01-07 | ユニベルシテ ルネ デカルト−パリ サンク | 皮膚創傷を治療する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6134832B2 (ja) | 1986-08-09 |
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