KR20070015519A - 생체 조직 시트, 그것의 제조 방법, 및 그것을 이용한 이식방법 - Google Patents

생체 조직 시트, 그것의 제조 방법, 및 그것을 이용한 이식방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 높은 치료 효과를 기대할 수 있으며, 동시에 이식시 안전성이 높은 생체 조직 시트를 제공한다. 본 발명의 생체 조직 시트는, (a) 생체 유래 세포를 제조하는 단계, (b) 상기 생체 유래 세포를 양막 위에 접종하는 단계, (c) 이종 동물 세포의 비존재하에 상기 생체 유래 세포를 배양 및 증식시키는 단계에 따라 제조한다. 상기 생체 유래 세포로는, 예컨대 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막, 기도 점막 또는 장관 점막 유래의 세포를 사용한다.
생체 조직 시트, 양막

Description

생체 조직 시트, 그것의 제조 방법, 및 그것을 이용한 이식 방법{BIOLOGICAL TISSUE SHEET, METHOD OF FORMING THE SAME AND TRANSPLANTATION METHOD BY USING THE SHEET}
본 발명은 생체 조직 시트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 이종 동물 유래 세포를 영양세포(feeder cell)로서 사용하지 않고, 각결막 상피세포(keratoconjunctival epithelial cell), 피부 표피세포, 모낭 상피세포(hair follicle epithelial cell), 구강 점막 상피세포, 기도 점막 상피세포 또는 장관 점막 상피세포 등의 생체 유래 세포를, 양막 상에서 배양 및 증식시켜 제조한, 생체 조직 시트, 그의 제조 방법, 및 그의 사용 방법(이식 방법 등)에 관한 것이다.
피부는 생체의 최외층을 덮고 있는 기관으로서, 외부로부터 생체를 방어하는 일종의 장벽이다. 피부는 표피, 진피, 및 피하 조직으로 구성되고 있으며, 표피는 주로 각질형성세포(keratinocyte)로 구성되어 있으며, 색소 세포, 랑게르한스 세포 등이 일부 혼재되어 있다. 표피를 구성하는 세포는 주로 각질형성세포이고, (1) 최외층을 차지하는 핵이 소실된 각화 세포(cornified cell),(2) 핵을 가지는 그 하부에 위치한 세포(과립세포, 유극세포, 기저세포)로 이루어져 있으며, 또한 기저세포와 진피 사이에 최하층의 표피 기저막이 존재하고 있다. 기저층은 단일 세포 층 이고, 표피 각질형성세포의 모세포 층으로, 기저세포에만 분열 능력이 있는 것으로 여겨지고 있다.
어떠한 이유에 의해 표피가 결손된 상태가 궤양이다. 표피의 결손된 부위는 주변 각질형성세포의 증식이나, 일부 모낭 유래 각질형성세포의 증식에 의해 표피가 재생되어, 궤양 표면은 상피화된다. 그러나, 한번에 표피가 광범위하게 결손되는 화상이나, 모낭이 소실된 난치성 궤양의 경우, 주변의 표피 재생만으로 상피화되기까지에 많은 시간이 소요된다.
기저층의 세포 주기는 약 450시간이다. 분열에 의해 생긴 딸세포는 유극층으로 이동하여 형태적 및 기능적으로 변화되고, 또한 과립층을 거쳐서 각화되어 각질층이 된 다음, 최종적으로는 체외로 탈피된다. 탈피까지의 시간을 회전시간( turnover time)이라고 하는데, 47-48일인 것으로 여겨진다.
현재, 일반적으로 확인된 표피 재생 모델에서는, 표피의 각질형성세포를 분열 능력에 따라, 줄기세포(stem cell), 전이 증폭 세포(transit-amplifying cell), 분열후 세포(post-mitotic cell)의 3종류로 분류하고 있다. 줄기세포는 무한한 자기재생 능력을 가지는 세포로, 분열을 통해 전이 증폭 세포를 만든다. 전이 증폭 세포는 일정한 분열 능력을 가지고 있으며, 분열 후 전이 증폭 세포로 되지만, 최종적으로는 분열 능력을 상실하여 분열후 세포가 된다.
표피의 줄기세포는 다음과 같은 특징들을 가지고 있는 것으로 여겨지고 있다: (1) 줄기세포는 자체 세포 주기가 길다(주기가 느림). (2) 줄기세포는 부위에 따라 상이한 위치에 존재한다. (3) 줄기세포는 집합적으로 존재한다. (4) 줄기세 포는 α2β1 및α3β1 인테그린을 강하게 발현한다. 그러나, 기저세포의 약 40%는 인테그린을 강하게 발현하며, 실제 기저세포의 약 10%는 줄기세포인 것으로 추정된다. 즉, 기저층에는 줄기세포 뿐만 아니라 전이 증폭 세포와 분열후 세포가 포함되어 있음을 시사한다.
표피가 손상되면, 증식성 자극이 발생되어 세포가 왕성하게 증식되기 시작하여, 재생이 개시된다. 이때, 일련의 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF)들이 가장 중요한 역할을 한다. EGF 패밀리로는 EGF, 형질전환 증식 인자(transforming growth factor, TGF)-α, 헤파린 결합성 EGF형 증식 인자(heparin binding EGF like growth factor, HB-EGF), 베타셀루린(betacellulin), 앰피레귤린(amphiregulin), 뉴레귤린(neuregulins)이 포함되지만, 실제로 표피 각질형성세포의 증식에 관계하는 인자는 TGF-α, HB-EGF 및 앰피레귤린인 것으로 여겨지고 있으며, 이들 인자는 표피 각질형성세포의 자기-증식에 유리하게 작용하는 것으로 보인다. 반대로, 표피 각질형성세포의 증식에 대하여 억제적으로 작용하는 인자로는 TGF-β, 비타민D3, 레티노산(retinoic acid) 등이 알려져 있다.
재생 의학의 분야에서는, 인간 피부의 진피 및 상피 전층이 결손된 손상 부위에 이식하기 위한 이식편 개발이 진행되고 있다. 예를 들면, 일본 특허 공개공보 평 10-277143호(특허문헌 1)에는 인간 피부 등의 전층이 결손된 상처를 치료하기 위한 이식편 및 그 제조 방법이 기재되어 있다. 상기 문헌에 개시된 이식편은 인간의 피브린 시트에 진피 조직에서 유래된 섬유아세포를 포매시킨 후, 표피 조직 을 상기 시트의 표면에 부착하여 제조된다.
종래 피부 결손을 회복시키는 방법으로 피부 전층을 이식하는 전층 피부 이식과, 표피와 진피 상층을 이식하는 피부 분층 이식이 행해지고 있지만, 채취 부위의 크기에 한계가 있다. 이런 점에서, 배양한 표피는 작은 피부편을 채취하는 것만으로도 몇 천배의 피부 면적을 수득할 수 있는 이점이 있으며, 또한, 동결 보존이 가능하기 때문에 반복 사용할 수 있다는 점이, 종래의 피부 이식 기술과 대비되는 최대 이점인 것으로 생각된다.
표피 시트는 사용하는 세포의 유래에 따라 자가배양한 표피 시트와 타가(xeno 또는 allogeneic) 배양한 표피 시트로 분류된다. 자가배양한 표피 시트의 이식은 표피의 결손 부위를 피복하여 생존시키는 것을 주된 목적으로 하는 경우가 많고, 한편, 타가배양한 표피 시트의 이식은 생물학적 피복 재료(biological dressing)로서의 효과를 기대하는 경우가 많다. 표피 세포에 대한 기초적인 연구를 통해 표피 각질형성세포가 여러가지 세포 성장 인자 및 사이토카인을 생산한다는 것이 명확해졌으며, 타가배양한 표피 시트의 유효성이 확인되고 있다.
배양 표피를 안전하면서도 동시에 안정적으로 공급할 수 있는 기술이 완성되면, 이식 기술의 발전과 더불어 재생 의료가 실용화되어, 환자에게 다수의 유의적인 이점을 줄 수 있다. 표피의 재생을 고려한 경우, 이식에 사용하기 위해 분열 및 증식 능력을 가지는 기저세포를 분리 및 배양하여 대량으로 증식시킨 다음 표피를 재생시키는 것은 매우 합당한 일이다. 그러나, 기저세포에는 줄기세포 뿐만 아니라, 전이 증폭 세포와 분열후 세포도 포함되고 있으므로, 보다 효과적인 배양 피 부를 제조하기 위해선 표피 줄기세포만을 선택적으로 배양하는 기술의 확립이 요구되고 있다.
지금까지 많은 연구자들이 표피 세포를 배양하는 기술들을 연구 및 개발하고자 시도하였으며, 그 결과 피부 생물학의 분야에서 많은 혜택을 볼 수 있었다. 구체적으로는, 배양한 각질형성세포를 이용함으로써, 표피 세포의 특성, 표피의 재생, 분화 및 증식 메커니즘들이 빠르게 밝혀지고 있다. 한편, 환자에게서 작은 피부편을 채취하고, 각질형성세포를 이차배양(subculture)하여 대량으로 증식시키는 것이 가능하게 되었으며, 또한 배양한 세포를 동결 보존할 수 있게 되어, 광범위한 화상과 난치성 궤양 등의 치료에 배양 피부를 사용하게 되었다.
피부와 함께 재생 의료에 기여할 것으로 기대되고 있는 조직중 하나가 각막이다. 각막은 안구를 구성하는 광학 시스템의 가장 외층에 위치하는, 혈관이 없는 투명한 조직으로서, 눈물과 함께 평활한 표면을 형성하여 양호한 시력 확보에 기여하고 있다. 또한, 각결막 상피세포는 항상 외계와 접하고 있어, 외부 미생물 등의 이물질, 자외선 등의 광선 등으로부터 안구를 지키는 방어 작용을 가지고 있다. 즉, 각결막 상피세포는, 항상성을 유지하기 위하여 각막의 투명성과 안구 전체를 보호하는데 매우 중요한 역할을 수행한다.
각막은, 예를 들면, 각막염, 각막궤양, 천공 등의 병증으로 탁해지거나, 투명성이 소실될 수 있다. 이러한 각막의 혼탁으로 인한 영구적인 시력 저하는, 안구 기증자의 각막을 이용하는 각막 이식으로 치료하고 있다. 각막 이식은 투명성이 소실된 환자의 각막을 제거한 후, 투명한 각막을 이식하는 방법으로, 이러한 이 식에 의해 투명성이 회복되고, 다시 시력을 되찾을 수 있다.
이러한 각막 이식으로 효과적인 치료 효과를 기대할 수 있는 경우가 있지만, 각막 이식만으로는 대처할 수 없는 질병도 있다. 예를 들면, 스티븐스-존슨 증후군, 안류 천포창(ocular pemphigoid), 화학 외상, 화상 등이다. 통상적으로, 각결막 상피세포는 매일 분열을 반복하여 오래된 세포는 탈피되고, 줄기세포 조직으로부터 새로운 세포가 재생된다. 그러나, 상기한 병증은 각막을 재생시키는 줄기세포 조직에 결함이 있는 것이 알려져 있다.
이러한 각막 이식으로 효과적인 치료 효과를 기대할 수 있지만, 각막 이식만으로는 치료하기 어려운 질병도 있다. 예를 들면, 스티븐스-존슨 증후군, 안류 천포창(ocular pemphigoid), 화학적 외상, 화상 등이다. 통상적으로, 각결막 상피세포는 매일 분열하여, 오래된 세포는 탈피되고, 새로운 세포가 줄기세포 조직에서 재생된다. 그러나, 상기한 병증에서는 각막을 재생시키는 줄기세포 조직에 결함이 있는 것으로 알려져 있다.
각막상피를 재생시키는 줄기 세포조직은 "각막 윤부 조직(corneal limbus tissue)"이라고 하며, 정확히 눈의 검은 자위와 백안의 경계부분에 국한되어 있으며, 외부에 노출된 특수한 환경에 있다. 전술한 병증에서는, 줄기세포 조직 자체가 일부 결함되어 결손되는 것으로 여겨지고 있다. 그리고, 줄기세포 조직의 결손으로 인해, 결합 부분이 그 주변에 존재하는 결막 상피로 덮혀, 투명성을 잃게 되고, 시력이 극단적으로 저하된다. 이와 같이, 전술한 병증에서는 각막 윤부가 고갈되었기 때문에, 단순히 각막을 이식하는 것만으로는 이식된 각막을 장기간 유지 시킬 수 없다. 따라서, 안구 표면을 항구적으로 재건하기 위해서는 각막 윤부의 이식도 필수적이다. 각막 윤부를 이식하는 방법들 중 한가지 방법으로 양막 이식법이 개발되어 있다(Medical Asahi, September, 1999: p62-65, N Engl J Med 340: 1697 - 1703, 1999: 비특허문헌 1). 상기 이식법에 이용되는 양막은, 제왕 절개한 임산부 등의 태반으로부터 얻어진다. 양막은 두꺼운 기저막을 가지므로, 이식되었을 경우, 각결막 상피세포의 증식 및 분화용 기질로서 작용한다. 또한, 양막은 면역원성이 거의 없으며, 게다가, 항염증 및 반흔 형성 억제 등의 작용을 겸비하고 있어, 양막 위에 이식되는 각결막 상피나 또는 그의 줄기세포 조직은 이식 수용자(recipient)의 거부 반응 등으로부터 보호된다.
특허문헌 1: 일본 특허 공개공보 평 10-277143호
비특허문헌 1: Medical Asahi, September, 1999: p62-65, N Engl J Med 340: 1697~1703, 1999
발명이 해결하려고하는 과제
종래에는 표피의 각질형성세포를 배양하기 어려운 것으로 생각되었으나, 1975년 Rheinwald와 Green에 의해 마우스 3T3 세포층(feeder layer) 방법이 발표되어, 처음으로 표피의 각질형성세포의 배양이 가능해졌다. 이 방법은 마우스 3T3 세포를 세포층으로 사용하며, 소태아 혈청 사용으로 로트 간에 차이가 야기되기 때문에, 결단코 용이한 방법이 아니었다. 1980년대에는, Hennings와 Yuspa가 배양액의 Ca2 + 농도를 낮추면 표피의 각질형성세포가 미분화 상태로 되어 증식이 항진된다는 것을 발견하였다. 또한, Boyce와 Ham은 Ca2 + 저농도 배지인 MCDB153 배지를 개발하여, 소의 뇌하수체 추출액의 첨가시 인간 표피 각질형성세포의 무혈청 배양이 가능하다는 것을 확인하였다. 1986년, Pittelkow 등은 무혈청 배양법으로 표피 각질형성세포를 배양하고 소태아 혈청이 첨가된 고칼슘 배지로 교체함으로써, 배양한 표피 시트를 제조한 다음, 이를 화상 환자에게 이식하여 양호한 성과를 보았다. 현재에는 무혈청 배양법이 주류이며, 이종 동물 세포 유래의 3T3 세포를 세포층으로 사용하고 있다. 이종 동물 세포에서 유래된 세포의 공존하에, 배양하여 수득한 이식편에는, 이종 동물 세포 유래의 산물이 존재할 위험성이 있다. 따라서, 이러한 이식편을 이용한 이식 기술은 이종이식 또는 거기에 준하는 것으로서 간주되며, 윤리적으로 및 안전적인 측면에서 큰 문제가 있는 것으로 여겨지고 있다. 실제, 의료현장에서 이종이식이 실용화된 예는 전무한 실정이다.
배양한 표피 시트의 이식은, 우표 크기의 피부로부터 각질형성세포를 이차배양함으로써 광범위한 상처 표면을 덮을 수 있다. 또한, 동결 보존이 가능하므로, 반복 이식이 필요한 난치성 및 재발성 피부 궤양 치료에 응용할 수 있다. 그러나, 종래 배양법으로 제조된 배양 시트, 예컨대, 이식된 배양한 표피 시트를 양호하게 생존시키는 것이 반드시 용이한 일은 아니다. 이는 배양한 표피 시트에는 기저막의 구성 성분이 결핍되어 있으며, 중층화된 표피가 견고한 각질층을 형성하지 않았기 때문이다. 이러한 점에서, Bell이 개발한 삼차원의 배양 피부에서는 각질층, 과립층도 확인되어 현시점에서는 피부에 가장 가까운 배양 피부이지만, 손 조작 기술이 복잡하고, 특수 기술이 필요하여, 아직 일본에서는 보급되지 않고 있다. 삼차원의 구조의 배양 피부는 해외에서는 이미 타가-이식으로 유효성이 확인되어, 상품화되어 있다. 그러나, 타가-이식시 상피화 촉진 작용은 확인되지만, 영구적인 생존은 기대할 수 없는 실정이다. 일본에서는, 윤리적인 측면 및 안전성 측면에서 타가-이식이 보급될 가능성이 낮으며, 자가이식 방법 개선에 집중되고 있다.
한편, 각막이 결막 상피로 덮혀 혼탁이 생기는 안구 표면 질환에 대한 외과적 치료로, 현재 각막 상피 이식 기술이 행해지고 있지만, 심한 염증을 수반하는 난치성 각결막 질환(스티븐스-존스 증후군, 안류 천포창, 각막부식 등)에서는, 예후가 매우 나쁜 상태이다. 이의 가장 큰 이유는 강한 항원성을 가지는 이질성(타가; allo) 각막 상피를 숙주의 면역계가 인식하여 거부하기 때문이다. 또한, 거부 반응을 예방하기 위해, 수술 후에 다량의 면역억제제를 전신 및 국소투여함으로써 초래되는 합병증도 그 예후를 불량하게 하는 큰 요인이 되고 있다. 한편, 이질성 각막 상피를 이용할 경우에는, 기증자가 부족한 문제가 있다. 따라서, 한쪽 눈으로부터 얻어지는 각막을 이용하여 수십개의 각막 상피 시트를 제조할 수 있는 기술이 현실화된다면, 기증자 부족으로 인한 문제점을 해결할 수 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명은 전술한 배경 및 과제를 감안하여 이루어진 것으로, 높은 치료 효과를 기대할 수 있으며 동시에 이식 안전성이 높은 생체 조직 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다. 이와 같은 목적으로, 본 발명자들은 우선 배양한 표피 시트를 제조하고자 시도하였다. 구체적으로는, 안전성을 고려하여 상피세포의 배양시 이종 동물 세포에서 유래된 세포(영양세포)를 사용하지 않는 조건으로, 종래의 배양한 표피 시트 자가이식의 발전형 시스템으로서 삼차원 구조의 배양 피부를 제조하고, 기저막 구성 성분, 세포 접착성 분자, 분화 항원에 대하여 면역 조직학적 및 전자 현미경으로 조사하였다. 그 결과, 종래의 배양한 표피 시트와 비교하여, 견고한 각질층이 형성되는 것이 확인되었으며, 세포 접착성 분자, 분화 마커가 생체 내 표피에서와 동일하게 충분히 발현되고 있었다. 기저막 구성 성분으로서, 헤미데스모좀이 양호하게 형성되었으며, 유천포창 항원(pemphigoid antigen)과 β4 인테그린이 충분히 발현되고 있었다.
배양한 표피 시트의 생존성은 기저막의 구성 성분의 생성에 좌우된다. 즉, 배양한 표피 시트는 플라스틱 페트리 디쉬(schale)의 바닥면에 밀착되어 배양되므로, 시트를 제조할 때에 페트리 디쉬 바닥면으로부터 박리할 필요가 있다. 이 박리에는 디스파제나 콜라게나제를 사용하지만, 이들의 효소에 의해 기저막의 구성 성분이 분해된다. 지금까지의 보고에서는, 디스파제에 의해 유천포창 항원은 웨스턴 블로팅에서 검출할 수 없게 되며, 형광 항체 방법에서는 GB3 단일 클론 항체로 인식되는 라미닌5이 분해된다. 또한, 콜라게나제는 부착 섬유(anchoring fiber)나 IV형, VII형 콜라겐의 발현을 감소시키지만, α6β4 인테그린에는 영향을 주지 않는 것이 보고되어 있다. 이와는 대조적으로, 삼차원 구조의 배양 피부는 생체 내 표피에 가까운 구조를 유지하고 있으며, 기저막의 구성 성분의 형성이 확인되었다. 본 발명자들의 연구를 통해 β1 인테그린, β4 인테그린 및 유천포창 항원이 비교적 양호하게 형성되어 있음을 확인하였으며, 전자 현미경으로도 헤미데스모좀의 양호한 형성을 확인하였다.
이후, 본 발명자들은 배양한 표피 시트와 동일한 방법으로 다른 조직에 적용 가능한 이식 재료를 제조할 수 있는지 여부를 검토하였다. 구체적으로는, 각막 상피 시트의 제조를 시도하였다. 그 결과, 섬유아세포를 함유한 콜라겐 위에 탑재한 양막 상에서 각막 상피 세포를 배양함으로써, 영양세포를 사용하지 않고도 양호한 중층화 및 상피화가 달성되었다.
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 이종 동물 세포에서 유래된 세포를 전혀 사용하지 않아 안전하고 실용적인 생체 조직 시트를 제조하는데 성공하였다. 또한, 무혈청 배양 조건 하에 있어서도 생체 조직 시트를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 표피 세포의 배양 기질로서 양막이 특히 뛰어나다는 가정하에, 여러가지 실험을 수행하였다. 먼저, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔에 양막을 밀착시키고, 그 위에 인간 표피 각질형성세포를 접종하여 주변 인간 표피 각질형성세포의 이동을 관찰한 바, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 세포를 직접 접종한 경우(대조군)와 비교하여 이동이 분명히 항진되어 있었다. 한편, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 탑재한 양막 상에서 배양한 인간 표피 각질형성세포를 양막과 함께 회수하고, 그 후 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔에 밀착시킨 다른 양막 위에 탑재하여, 주변의 인간 표피 각질형성세포의 이동을 관찰한 바, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 탑재한 경우(대조군)와 비교하여, 이동이 분명하게 항진되었다. 이러한 실험 결과로, 양막 상에 표피 각질형성세포의 증식이 양호하며, 동시에 세포의 이동 능력도 양호한 것으로 확인되었다. 즉, 표피 각질형성세포의 배양 기질로서 양막이 매우 우수하다는 것이 명확해졌다. 또한, 이러한 사실을 근거로, 2가지의 이식 기술, 즉, (1) 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 탑재한, 양막 상에서 배양한 표피 각질형성세포를 양막과 함께 회수한 후, 다른 양막 위에 탑재하여 배양하여 얻어지는 시트형 구축물(양막(제1 양막)의 한쪽 면에 다른 양막(제2 양막)이 접착하고 있고, 또한 일부는 제1 양막으로 피복되어 있고, 다른 일부로는 제2 양막으로 피복된 세포층이 구비된 구축물)을 표피 결손부에 이식하는 방법, 및 (2) 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 탑재한 양막 상에서 배양한 표피 각질형성세포를 양막과 함께 회수하고, 이를 미리 피부 결손부에 이식한 다른 양막 위에 이식하는 방법이, 우수한 표피 재건 기술인 것으로 생각된다. 여기서, 진피 전층 및 피하 조직까지 결손된 경우, 보존적 치료로는 상피화할 수 없어, 우선 이식 기반을 갖출 필요가 있다. 진피 결손에는 종래부터 인공 진피를 사용하여, 어느 정도의 치료 효과가 있다. 인공 진피에서는 혈관의 재생이 확인되지만, 그 위에 배양 표피를 이식할 경우 기저막의 구성이 불충분하여 생존이 불량해지는 것으로 지적되고 있다. 한편, 인공 진피 이식과 조합하여, 상기의 (1) 또는 (2)의 이식 기술을 사용하면, 기저막 구성 성분을 가지는 양막을 통하여 배양 표피가 이식되기 때문에 높은 생존율을 기대할 수 있다. 또한, 양막 위에 배양 표피가 형성된 상태가 되므로, 이식 후 배양 표피를 구성하는 세포의 양호한 증식 및 주변 이동이 촉진되어, 그 결과 배양 표피가 신속하게 확장되고 높은 치료 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 피하 조직까지 이르는 광범위한 피부 결손에, 인공 진피 이식과 상기 이식 기술을 조합함으로써, 정용적인 측면(cosmetic viewpoint)으로도 뛰어난 치료법을 확립할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명은 전술한 결과와 사실을 토대로 완성하였으며, 아래 구성을 제공한다.
즉, 본 발명은 이종 동물 세포의 비존재하에, 양막 상에서 증식시킨 생체 유래 세포를 함유하는 생체 조직 시트를 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 인간 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 겔 위에 양막을 탑재한 상태로 생체 유래 세포를 증식시킨다. 이로 인해, 생체 유래 세포의 증식율이 향상된다.
생체 유래 세포 증식용 배지로, (1) 무혈청 배지, 또는 (2) 혈청 성분으로서, 수용자 유래 혈청만을 포함하는 배지를 사용할 수 있다.
생체 유래 세포는 바람직하게는, 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막, 기도 점막 또는 장관 점막에서 유래된 세포이다.
배양 기질로서의 양막은, 상피가 제거된 양막을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 예로, 생체 조직 시트는 배양 기질로서 양막을 포함하며 증식한 세포가 첨가된 것이다.
본 발명의 생체 조직 시트는 예를 들면, 직접 또는 배양 기질로서 사용한 양막과는 다른 양막을 통하여 조직 결손부에 이식된다. 후자의 경우, 전형적으로는 조직 결손부에 대하여 양막(제2 양막, 즉 생체 조직 시트의 제조에 사용하는 양막과는 다른 양막)을 이식한 후, 상기 양막 상에 생체 조직 시트를 이식하게 된다.
또한, 일 예의 생체 조직 시트는 이종 동물 세포의 비존재하에, 인간 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 겔 위에 탑재한 양막 상에서, 증식시킨 생체 유래 세포를 상기 양막과 함께 제2 양막 위에 탑재하고, 또한 증식시켜서 얻어지는 세포를 함유하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 생체 조직 시트의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법의 일 예로 아래 단계를 포함한다. 즉, (a) 생체 유래 세포를 제조하는 단계, (b) 상기 생체 유래 세포를 양막 위에 접종하는 단계, 및 (c) 이종 동물 세포의 비존재하에 상기 생체 유래 세포를 배양 및 증식시키는 단계이다.
본 발명의 일 예에서, 상기 단계 (b)로 이하의 단계가 실시된다. 즉, (b-1)콜라겐 겔 중에 인간 섬유아세포를 배양하는 단계, 및 (b-2) 상기 콜라겐 겔 위에 양막을 탑재한 후, 상기 생체 유래 세포를 상기 양막 위에 접종하는 단계이다.
본 발명의 다른 일 예로, (d) 상기 생체 유래 세포를 증식시킨 후, 최표층을 공기와 접촉시키는 단계가 추가로 실시된다. 상기 단계로 세포층의 각화(상피화)가 촉진된다.
본 발명의 또다른 일 예로, (e) 상기 생체 유래 세포를 상기 양막과 함께 회수하는 단계, 및 (f) 회수한 상기 생체 유래 세포 및 상기 양막을, 양막이 아래쪽에 놓이도록 하여 제2 양막 위에 탑재한 후, 상기 생체 유래 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 추가로 실시한다. 즉, 두 단계의 배양을 실시할 수 있다.
단계 (c)에 사용되는 배지로, (1) 무혈청 배지나 또는 (2) 혈청 성분으로 수용자 유래 혈청만을 포함하는 배지를 사용할 수 있다.
생체 유래 세포는 바람직하게는, 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막, 기도 점막 또는 장관 점막 유래 세포이다.
배양 기질로서의 양막에는, 상피가 제거된 양막을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 이하의 단계, 즉, (A) 피부 표피세포를 양막 위에 접종하는 단계, (B) 상기 피부 표피세포를 배양 및 증식시키는 단계, 및 (C) 증식시킨 피부 표피세포를 회수하는 단계를 포함하는, 피부 표피 세포의 제조 방법을 제공한다.
본 발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은 아래 구성으로 이루어진 생체 조직 시트를 제공한다. 즉, 이종 동물 세포의 비존재하에 양막 상에서 증식시킨 생체 유래 세포를 함유하는 생체 조직 시트이다. 생체 유래 세포는 세포층을 형성하고 있다. 이하에 본 발명의 생체 조직 시트 및 그 제조법의 특징을 상술한다.
본 발명의 생체 조직 시트는, (a) 생체 유래 세포를 제조하는 단계, (b) 상기 생체 유래 세포를 양막 위에 접종하는 단계, (c) 이종 동물세포의 비존재하에 상기 생체 유래 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
단계 (a)에서 생체 유래 세포를 제조한다. 생체 유래 세포는, 최종적으로 얻어지는 생체 조직 시트의 용도에 적합한 세포를 사용한다. 예를 들면, 피부 표피조직의 재생을 위한 시트를 제조할 경우에는, 피부 표피세포(그 줄기세포, 전구세포를 포함)나 모낭 상피세포(그 줄기세포, 전구세포를 포함) 등이 바람직하게 사용된다. 마찬가지로, 각막 상피조직을 재생하기 위한 경우, 각막 상피세포(그 줄기세포, 전구세포를 포함)를 사용하는 것이 바람직하며, 점막 상피조직의 재생을 목적으로 할 경우에는 점막 상피세포(그 줄기세포, 전구세포를 포함)을 사용하는 것이 바람직하다. 점막 상피세포의 예로는 구강 점막 상피세포, 장관 점막 상피세포, 기도 점막 상피세포 등을 들 수 있다.
생체 유래 세포의 제조 방법은 피부 표피세포, 각막 상피세포, 구강 점막 상피세포, 장관 점막 상피세포 및 기도 점막 상피세포를 예로 들어 설명한다.
(피부 표피세포)
먼저, 피부를 채취할 때에는, 미리 채취 부위를 예방 차원에서 포비돈요오드 등의 소독약으로 소독하고, 항진균제의 외용 도포를 행한 후, 작은 피부편을 피부 생체 검사에 준하여 채취한다. 표피 각질형성세포를 배양할 때에는 가위를 사용하여 피부편에서 지방 조직과 진피를 할 수 있는 한 제거하고, 둘베코(Dulbecco) 인산완충액(PBS)으로 수회 세정한다. 70% 에탄올에 1분간 담가 멸균한다. 이를 직사각형으로 자르고, 디스파제 용액에 침지하여 4℃에서 하룻밤동안 방치한다. 이어 표피를 진피로부터 분리시킨다. 분리한 표피를 세정한 후, 표피편을 풀어 표피 각질형성세포 현탁액으로 준비한다. 세포는 무혈청 배지에 현탁하고, 콜라겐 막 페트리 디쉬에 접종하여 이차배양을 실시한다.
(각막 상피세포)
각막 상피세포는 각막 윤부 조직으로부터 채취할 수 있다. 예를 들면, 각막 윤부 조직으로부터 내피세포를 박리 및 제거하고, 결막을 절제하여 단일 세포 현탁액을 제조한다. 그리고 이것을 질소 탱크에서 보존시키, 이후 신속하게 37℃에서 융해시켜 각막 상피세포 현탁액을 준비한다. 필요에 따라 이차배양을 실시한다. 이차배양에는, 예를 들면, 무혈청 배지인 EpiLifeTM(Cascade Biologics), MCDB153 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.)나 이들의 배지의 아미노산 조성 등을 변형시킨 배지 등을 사용할 수 있다.
(구강 점막 상피세포)
구강 점막 상피세포로는 치근부에 존재하는 세포(구강내연점막 상피세포(oral crevicular mucosal epithelial cell)), 입술 부분의 세포, 구개부의 세포, 볼 부분의 세포 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도 구강내연점막 상피세포는 증식력이 높고, 또한 항원성이 낮아, 이것을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 구강 점막 상피세포는 목적으로 하는 세포가 존재하는 장소를 메스 등으로 절제하거나, 제거함으로써 채취할 수 있다. 구강내연점막 상피세포에서 발치에 부착되어 있는 구강점막 상피를 에나멜시멘트 전이부(enamel cement transition portion)로부터 분리하고, 이로부터 채취할 수 있다. 또한, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위해, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.
(장관 점막 상피세포)
장관 점막 상피세포는 대장 내시경을 통한 장관 상피 생체 검사 조직에서 채취, 또는 개복 수술시에 통상의 방법에서 채취된다. 또한, 조직에서 LCM(laser capture microdissection)을 통해 상피세포를 절제할 수도 있다. 식도, 위, 십이지장, 소장, 대장 등의 인간의 모든 소화관 상피세포를 사용하여 제조되는 생체 조직 시트에 대해서도 본 발명의 기술이 적용된다. 궤양이나 염증 등으로 인간의 소화관 상피가 손상되면, 골수 유래 세포가 긴급사태에 대응하는 인명 구조 역할을 수행하여 상피가 수복된다. 소화관 상피세포는, 일부이지만 골수에서 만들어진다. 이러한 의미로, 본 발명의 의의는 각막 상피세포를 사용하는 것과 동등하다고 간주할 수 있다. 통상적으로 불과 1000개에 몇 개에 불과한 골수로부터 생성된 상피세포는, 위궤양, 대장염 등으로 된 소화관 내면의 궤양(상처)이 치료되는 과정에 50배 내지 100배로 증가하고, 대략 10개에 1개의 소화관 상피세포가 골수 유래인 것이 밝혀지고 있다. 여기서 제조되는 소화관 점막 상피세포 유래 생체 조직 시트는 난치병인 것으로 여겨지는 중증 장관 감염증, 궤양성 대장염, 클론병, 베체트병 등의 장질환의 낫기 어려운 궤양, 염증에 대해서도, 장관 상피의 재생을 촉진하는 의미에서 대단한 가치가 있을 것으로 여겨진다. 장관 알레르기에 대한 유용성도 기대된다.
(기도 점막 상피세포)
기도 점막 상피세포는 기도 점막의 생체 검사 조직으로부터 용이하게 채취되며, 전술한 조직과 동일하게 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위해, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다. 기도 점막 상피세포는 β 디펜신(defensin)의 생합성 및 방출 등을 통하여, 각종 감염증의 병증 진행에 중요한 역할을 담당한다. 또한, 천식이나 알레르기 질환에서도 기도 점막 상피는 중요한 역할을 한다. 조직 장애를 받은 기도점막에 본 발명에 따른 기도 점막 상피세포로부터 제조되는 생체 조직 시트를 제공함으로써, 긴급 치료 이상의 인공 기도를 제공할 수 있다. 특히 양막 위에 제조된 시트가 가지는 면역억제 작용이 유용하다.
구강 점막 상피세포나 장관 점막 상피세포 등은, 특히, 조직 채취 후, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위해, 디스파제나 트립신 등의 효소에 의한 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.
생체 유래 세포는 생체 조직 시트의 이식을 받는 자(수용자)로부터 준비하는 것이 바람직하다. 즉, 생체 유래 세포의 제공자와 생체 이식 시트의 수용자가 동일인인 것이 바람직하다. 자가세포를 사용하면, 면역 거부 반응을 해소시킬 수 있다.
제조된 생체 유래 세포는, 양막 위에 접종(탑재)한 후(단계 b), 배양된다(단계 c).
"양막"은, 포유동물의 자궁과 태반의 최표층을 덮는 막으로서, 콜라겐이 많은 실질조직(parenchymal tissue) 위에 기저막과 상피층이 형성되어 있다. 양막은 인간 양막을 사용하는 것이 바람직하다. 인간 양막은, 예를 들면 분만시에 분만후 얻어지는 인간 태아막, 태반 등으로부터 채취할 수 있다. 구체적으로는, 분만 직후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 및 제대(탯줄)로 이루어지는 일체물을 처리 및 정제함으로써 인간 양막을 제조할 수 있다. 처리 및 정제 방법은 일본 특허 공개공보 평 5-5698호에 기재되어 있는 방법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 즉, 분만시에 얻어지는 태아막에서 양막을 박리시킨 다음, 초음파 세정 등의 물리적 처리 및 효소처리 등에 의해 잔존 조직을 제거하고, 적절한 세정 공정을 거쳐서 인간 양막을 제조할 수 있다.
이와 같이 제조한 인간 양막은, 사용시까지 동결하여 보존할 수 있다. 인간 양막의 동결은, 예를 들면 -80℃에서, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 글리세롤을 동일 부피비로 혼합한 용액으로 수행할 수 있다. 동결 보존에 의해, 조작성의 개선 및 항원성 저하를 기대할 수 있다.
양막은 그대로 사용할 수도 있지만, 양막의 제거 처리 등에 의해 상피를 제거한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기한 바와 같이 동결 보존한 인간 양막을 해동한 후, EDTA나 단백질 분해 효소로 처리하여 세포간의 접착을 늦추고, 세포 스크레이퍼(cell scraper) 등을 사용하여 상피를 제거함으로써, 상피가 제거된 인간 양막을 제조할 수 있다.
상피를 제거한 인간 양막을 사용할 경우, 상피를 제거하여 노출된 면 측(즉, 기저막 측)에 생체 유래 세포를 접종하는 것이 바람직하다. 이 면에는 IV 형태 콜라겐이 풍부하게 포함되고 있어, 접종된 생체 유래 세포의 증식 및 중층화가 양호하게 수행될 것으로 생각되기 때문이다.
생체 유래 세포는, 예를 들면 세포밀도가 약 1 x m3 개/cm2 이상, 바람직하게는 약 1 x m3 개/cm2 - 약 1 x 107 개/cm2, 더욱 바람직하게는 약 1 x 104 개/cm2 - 약 1 x 106 개/cm2로 양막 위에 접종된다.
바람직한 일 예로, 미리 제조한 인간 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 매트릭스 위에 양막을 탑재하고, 상기 양막 위에 생체 유래 세포를 접종하여, 배양한다. 즉, 상기 예에서는, 콜라겐 겔 중에 인간 섬유아세포를 배양하는 단계(단계 b-1), 및 상기 콜라겐 겔 위에 양막을 탑재한 후, 상기 생체 유래 세포를 상기 양막 위에 접종(탑재)하는 단계(단계 b-2)가 실시된다. 이러한 순서로 제조된 생체 조직 시트는, 인간 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 겔 위에 탑재된 양막 상에서, 증식시킨 생체 유래 세포를 함유하게 된다. 상기 예에 따른 생체 조직 시트는, 콜라겐 매트릭스 전체를 이식 재료로 사용할 수도 있다. 또한, 콜라겐 매트릭스를 제거한 후 이식 재료로 사용할 수도 있다. 또는, 콜라겐 매트릭스 및 양막을 제거한 후에 이식 재료로 사용할 수도 있다.
"콜라겐 겔"은 인간 섬유아세포의 배양 기질로서 기능한다. 콜라겐 겔의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 복수 종의 혼재된 콜라겐을 사용할 수도 있다. 콜라겐은 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 효소 가용화법 등에 의해 추출 및 정제할 수 있다. 또한, 항원성을 감소시킬 목적으로, 펩신이나 트립신 등의 분해 효소로 처리함으로써 텔로펩티드(telopeptide)를 제거한, 아테로콜라겐(atherocollagen)을 사용하는 것이 바람직하다. 콜라겐 겔 재료로 양막 유래, 특히 인간 양막 유래의 콜라겐을 사용할 수도 있다. 여기서, 양막 유래는 넓게는 양막을 출발 원료로 하여 얻어진 것을 의미한다.
콜라겐 겔에 함유된 인간 섬유아세포의 기원은 특별히 한정되지 않으며, 콜라겐을 생산할 수 있는 것이라면 모든 조직 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 피부조직, 구강 점막조직 등으로부터 제조한 인간 섬유아세포를 사용할 수 있다.
콜라겐 매트릭스의 구체적인 제조 방법의 예를 설명한다. 먼저, 이하의 순서로 인간 섬유아세포를 제조한다. 피부를 채취하고, 이어서 피부로부터 진피를 박리한다. 진피를 가늘게 자르고, I형 콜라겐 막 배양접시에 밀착시킨다. 정치배양하고, 진피편으로부터 이동하는 인간 섬유아세포를 계대 배양한다. 세포를 배양접시 바닥면에서 탈착시켜 세포 현탁액으로 준비한 다음, 이를 세포 배양용 배양접시에 접종한다. 적정 세포는 동결 보존(예, 액체 질소에서 보존)한다.
한편, I형 콜라겐을 사용하여 중화 콜라겐 액을 제조한다(후술하는 실시예 참조). 이를 배양 용기(예, 배양 삽입 용기(cluture insert))에 넣어, 실온에서 약 10분간 방치하여 겔화시킨다. 다음으로, 전술한 방법에 따라 미리 배양해 둔 대수 증식기의 인간 섬유아세포를 상기 겔과 혼합하여, 다시 겔화시킨다. 그 후, 정치배양한다. 상기 순서에 따라, 인간 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 매트릭스가 제조된다. 이러한 창의적 연구에 의해, 필요한 강도를 가지며, 양막층이나 생체 유래 세포를 탑재할 수 있는 콜라겐 매트릭스가 제조되는 것은, 본 발명의 주된 토대가 된다. 콜라겐 매트릭스 위에는 별도 준비한 양막을 탑재(밀착)시킨다.
양막 위에 접종한 생체 유래 세포의 배양(단계 c)은, 이종 동물세포의 비존재하에 실시한다. 본 발명에서 "이종 동물 세포의 비존재하"는, 생체 유래 세포를 배양할 때의 조건으로서, 상기 생체 유래 세포에 대하여 이종인 동물의 세포가 사용되지 않는 것을 의미한다. 구체적으로는, 생체 유래 세포로서 인간 세포(예, 인간 피부 표피세포나 인간 각막 상피세포)를 사용할 경우에, 마우스나 랫 등, 인간 이외의 동물종의 세포가 배양액 중에 존재(병존)하지 않는 조건을 말한다. 이러한 조건으로 배양을 실시함으로써, 최종적으로 얻어지는 이식 재료(즉, 생체 조직 시트)에는 이종 유래의 성분(이종 세포 자체를 포함)이 혼입될 위험성이 없어진다.
생체 유래 세포 배양용 배지는 상기 세포를 증식시키는 임의의 것으로, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, MCDB153 배지(NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD사), EpiLifeTM(Cascade Biologics), 또는 이들의 배지의 아미노산 조성 등을 변경한 배지, 상피세포의 성장에 통상적으로 사용할 수 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 햄 F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정 비율로 혼합한 배지 등을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서는 무혈청성 배지이며, 동시에 이종 동물 세포에서 유래된 단백질을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 성장 인자나 항생 물질 등이 첨가된 배지를 사용할 수도 있다. 단, 혈청을 포함하지 않는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명의 배양 방법은 무혈청 배양법을 사용하는 것이 바람직하다. 이는, 혈청 유래 성분의 혼입에 의한 면역거부 등의 문제를 피할 수 있기 때문이다. 또한, 혈청을 포함하는 배지에서 배양할 수 있지만, 이런 경우에는 동종 유래의 혈청(인간의 생체 유래 세포를 배양할 때는 인간 유래의 혈청)을 사용하거나, 자가혈청을 사용하는 것이 바람직하다. 물론, 가능하다면 면역거부 반응이 초래될 우려가 없는 자가혈청을 사용하는 것이 바람직하다.
생체 유래 세포의 양호한 증식을 목적으로, 배양 과정중에 배양 조건을 변경할 수도 있다.
단계 (c)의 결과로, 생체 유래 세포는 양막 상에서 증식된다. 이와 같이 채취한 세포층의 표층을 각화할 필요가 있을 경우(예, 피부 표피세포를 사용하여 피부 표피 시트를 제조할 경우나, 각막 상피세포를 사용하여 각막상피 시트를 제조할 경우)에는, 세포층의 표층을 공기와 접촉시키는 단계(단계 d)를 실시한다. 또한, 상기 단계는 본 명세서에서는 에어 리프팅(Air-lifting)이라고도 한다. 단계 (d)는, 세포층을 형성하는 세포의 분화 및 장벽 기능을 유도하기 위하여 수행한다.
상기 단계는 배양액의 일부를 스포이트, 피펫 등을 사용하여 일시적으로 제거함으로써 배양액의 수위를 낮추고, 이로써 세포층의 최표층을 일시적으로 배양액 외부로 노출시킴으로써 수행할 수 있다. 또는, 세포층을 양막째 들어 탑재하고, 최표층을 배양액 표면에서 일시적으로 노출시킴으로써 수행할 수도 있다. 나아가서, 튜브 등을 사용하여 공기를 배양액에 공급하여, 세포층의 최상층에 공기를 접촉시킬 수도 있다. 조작의 용이성 측면에서, 배양액 수위를 낮추어 세포층의 최표층을 노출시키는 방법을 행하는 것이 바람직하다.
단계 (d)의 실시 시간, 즉 세포층의 최표층을 공기에 접촉시키는 시간은, 세포의 상태나 배양 조건 등에 따라 변동되지만, 예를 들면 약 3일 - 3주일이며, 바람직하게는 5일-2주일, 더욱 바람직하게는 약 1주일이다.
본 발명의 일 예로, 단계 (c)(배양 단계) 이후에, (e) 상기 생체 유래 세포를 상기 양막과 함께 회수하는 단계와, (f) 회수한 상기 생체 유래 세포 및 상기 양막을, 양막이 아래쪽에 놓이도록 제2 양막 위에 탑재한 후, 상기 생체 유래 세포를 배양 및 증식시키는 단계를 추가적으로 포함한다. 단계 (e) 및 단계 (f)를 실시함으로써, 양막(제1 양막)의 한쪽면에 다른 양막(제2 양막)이 접착되고, 동시에 일부는 제1 양막을 피복하고, 다른 일부로는 제2 양막을 피복하는 세포층이 구비된 구축물이 수득된다. 또한, 제2 양막의 크기나 배양 조건 등을 적절하게 조절하여, 2가지 양막의 표면의 전체가 세포층으로 피복된 구축물, 및 제2 양막의 표면의 일부가 세포층으로 피복된 구축물들 중 어느 하나를 수득할 수 있다.
단계 (e)에서는, 배양 후의 생체 유래 세포와 배양 기질로서 사용한 양막을 회수한다. 예를 들면, 배양 접시에 둔 양막 상에 생체 유래 세포를 배양한 경우, 배양 후에 양막을 배양 접시에서 탈착시켜 증식한 생체 유래 세포 및 양막을 회수할 수 있다. 한편, 콜라겐 겔 위에 탑재한 양막 상에서 생체 유래 세포를 배양한 경우, 배양 후에 양막을 콜라겐 겔으로부터 박리하여, 증식한 생체 유래 세포 및 양막을 회수할 수 있다.
단계 (f)에서는, 회수한 생체 유래 세포와 양막을, 다른 양막 위에 탑재한 후, 생체 유래 세포를 다시 배양한다. 이와 같이, 일 예에서는 2단계의 배양(단계 c 및 단계 f)이 실시된다.
단계 (f)에서는 먼저, 회수한 생체 유래 세포와 양막을 포함하는 구축물(이하, "세포-양막 구축물"라고 함)을, 양막이 아래쪽에 놓이도록 하여 별도로 준비한 양막(제2 양막) 위에 탑재한다. 복수 개의 세포-양막 구축물을 제2 양막 위에 탑재할 수도 있다. 예를 들면, 단계 (c)의 배양한 후 회수한 세포-양막 구축물을 절단함으로써 복수개의 세포-양막 구축물을 얻을 수 있다. 또는, 독립적인 복수 개의 배양 시스템을 준비하고, 병행하여 단계 (c)를 실시함으로써, 복수개의 세포-양막 구축물을 수득할 수도 있다.
복수 개의 세포-양막 구축물을 제2 양막 위에 탑재할 경우, 균일하게 분산된 상태, 즉 간격이 일정하게 되도록 세포-양막 구축물을 배치하는 것이 바람직하다. 이후 배양(및 생체 이식 후)으로 세포가 증식하여 세포층이 제2 양막 주변으로 확장하는 경우, 세포층이 형성되지 않은 영역이 신속하고 효과적으로 피복될 수 있다. 즉, 전술한 방법으로, 제2 양막 상에 넓은 표면적의 세포층을 단시간에 형성시킬 수 있다. 이와 같이, 한층 효율적으로 세포층을 제조할 수 있다. 한편, 제2 양막의 표면 전체를 피복하는 세포층이 형성되기 전에, 제2 양막 전체 세포층을 생체의 조직 결손부에 이식할 수도 있으며, 이 경우 이식후에 신속한 세포층의 형성이 촉진되어서 높은 치료 효과가 얻어진다.
넓은 표면적의 세포층을 단시간에 얻을 수 있기 때문에, 이상의 방법은 배양한 표피 시트를 제조할 때에 특히 바람직하다. 또한, 세포층의 표층을 각화할 필요가 있을 경우에는, 단계 (e)전에, 단계 (e)와 단계 (f)의 사이에, 또는 단계 (f) 이후에, 전술한 방법으로 에어 리프팅(단계 d)을 실시한다.
단계 (f)에서의 배양은 상기 단계 (c)의 배양 조건과 동일한 조건으로 실시할 수 있다. 즉, 이종 동물 세포의 비존재하에 배양하는 것이 바람직하고, 배지로는 무혈청이며 동시에 이종 동물 세포에서 유래된 단백질을 포함하지 않는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 혈청을 포함하는 배지를 사용할 경우에는 동종 유래의 혈청(인간의 생체 유래 세포를 배양할 때는 인간 유래의 혈청)을 사용하거나, 자가혈청을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 단계 (c)와 동일하게, 단계 (f)도 생체 유래 세포의 양호한 증식을 목적으로 배양 과정 중에 배양 조건을 변경할 수도 있다.
본 발명의 생체 조직 시트는 제조 과정에 이종 동물 세포 유래 세포를 사용하지 않으며, 생체 유래 세포 배양시 토대로서 양막을 사용한다는 점에서, 안전성이 매우 높다. 양막의 사용은 생존성을 향상시키므로, 본 발명의 생체 조직 시트는 이식시 높은 치료 효과를 얻을 수 있다. 특히, 양막 및 콜라겐 겔을 사용하는 방법으로 제조된 생체 조직 시트에서는, 매우 조밀한 세포층이 형성되고, 이식후 생존성이 현저하게 증가된다.
본 발명의 생체 조직 시트는, 피부 표피, 모낭 상피, 각막 상피, 구강 점막 상피, 장관 점막 상피 및 기도 점막 상피 등의 재생(재건)에 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 생체 조직 시트를 생체의 조직 결손부에 직접 이식할 수 있다. 여기서의 "직접 이식"이란, 조직 결손부와 생체 조직 시트의 사이에 다른 물질을 실질적으로 개재시키지 않고 이식하는 것을 의미한다. 한편, 양자 간에 다른 물질이 개재되도록, 본 발명의 생체 조직 시트(단, 제조 과정에 있어서 제2 양막을 사용하는 것은 제외함)을, 생체의 조직 결손부에 이식할 수도 있다. 예를 들면, 배양 기질로서 사용한 양막과는 다른 양막(제2 양막)을 통하여, 조직 결손부에 생체 조직 시트를 이식할 수 있다. 구체적으로는, 조직 결손부에 대하여 양막(제2 양막)을 이식한 후, 미리 제조해 둔 생체 조직 시트를 해당 양막 위에 이식할 수 있다. 이러한 이식 방법은, 양막이 베이스로서 존재함으로써, 생체 조직 시트에 함유되어 있는 세포가 효율적으로 증식하는 동시에 주변으로 양호하게 이동할 것으로 기대된다. 즉, 생체 조직 시트를 구성하는 세포층의 신속한 신장을 기대할 수 있으며, 치료 효과가 높다. 한편, 조직 결손부는 양막으로 피복되어, 외부로부터 보호된다. 이러한 현상도 치료 효과를 향상시킨다.
또한, 본 발명은 양막 상에서는 피부 표피세포의 증식 및 이동이 양호해진다는 사실에 근거하여, 신규한 피부 표피세포의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은 다음 단계, 즉, (A) 피부 표피세포를 양막 위에 접종하는 단계, (B) 상기 피부 표피세포를 배양하여 증식시키는 단계, 및 (C) 증식한 피부 표피세포를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 제조 방법에 의하면 효율적으로 세포가 증식하고, 주변으로의 세포 이동도 양호하게 된다. 따라서, 단시간에 넓은 면적의 세포층(배양 상피)을 제조하는 것이 가능하다. 여기서, 피부 표피세포의 채취 및 배양은 통상의 방법(상기 참조)으로 행할 수 있다. 또한, 증식한 피부 표피세포의 회수에는, 물리적 수단(세포 스크레이퍼 등에 의한 박리), 효소적 수단(디스파제나 트립신에 의한 처리) 등을 사용할 수 있다. 또한, 피부 표피세포를 층 상태로 회수하거나, 또는 각각의 세포로 분리된 상태로 회수할 수도 있다.
도 1은 실시예 1의 방법으로 제조한 삼차원 구조의 배양 피부 시트(배양한 표피 시트)의 헤마톡실린·에오신 염색(에어 리프팅후 8일째) 사진이다. 상층에서 차례대로, 표피 각질형성세포층, 양막, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔(매트릭스)이다. 표피 각질형성세포층은 아래부터 차례대로 기저 세포층, 유극 세포층, 과립층, 각질층을 포함하고 있어, 인간 정상 표피에 상당히 가까운 형태를 나타내고 있다.
도 2는 실시예 2의 방법으로 제조한 삼차원 구조의 배양 피부 시트(배양한 표피 시트)의 헤마톡실린·에오신 염색 사진(에어 리프팅후 8일째)이다. 양막 위에 접종한 인간 표피 각질형성세포는 일층의 기저 세포층과 5-6층의 세포층으로 이루어져 있으며, 각질층의 형성도 확인되었고, 표피가 재구성되어 있다.
도 3은 표피 각질형성세포의 증식 및 이동에 대한 양막 효과를 나타낸 도면이다. 우측은 실험군(섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔에 밀착시킨 양막 상에, 표피 각질형성세포를 배양한 경우)의 결과(위로부터 차례로 1일째, 10일째)이다. 좌측은 대조군의 결과이다.
도 4는 표피 각질형성세포의 증식 및 이동에 대한 양막 효과를 나타낸 도면이다. 좌측은 실험군(섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔에 밀착시킨 양막 상에, 배양한 표피 시트를 탑재한 다음 배양한 경우)의 결과(위로부터 차례로 1일째, 7일째, 10일째, 및 14일째)이다. 중앙은 대조군 1(섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 배양한 표피 시트를 탑재하고, 배양한 경우)의 결과이다. 우측은 대조군 2(양막을 사용하지 않고 삼차원으로 배양하여 얻어진 세포층을, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 탑재하고, 배양한 경우)의 결과이다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예로 한정되지 않는다.
실시예 1
양막을 이용한 삼차원 구조의 배양 피부 시트(배양한 표피 시트)의 제조
1. 양막의 제조
1-1. 양막의 채취
전신성 합병증이 없는 제왕 절개 예정의 임산부에 대하여, 사전에 산부인과 의사와 함께 충분한 설명하여 동의(informed consent)를 구한 후, 수술실에서 제왕 절개 시에 양막을 회수하였다. 조작은 청결하게 수행하였으며, 수술 조작에 준하여 손을 세정한 후 전용 가운을 착용하였다. 분만 전에 청결한 양막 회수용 배트(vat)와 세정용 생리식염수를 준비하였다. 분만 후, 태반 조직을 배트에 옮기고, 손으로 양막 조직을 태반으로부터 박리하였다. 양막과 태반의 유착이 강한 부분은 가위로 절제하였다.
1-2. 양막의 처리
양막 처리의 과정은 (1) 세정, (2) 트리밍(trimming), (3)보존의 순서로 수행하였다. 모든 과정에서, 조작은 청결한 후드(배기되는 곳)에서 행하는 것이 바람직하고, 사용하는 용기나 기구도 모두 멸균된 것을 사용하며, 페트리 디쉬 등은 멸균된 １회용 타입을 사용하였다. 채취한 양막에 부착된 혈액 성분은 생리식염수로 세정하여 제거하고, 또한 충분한 양의 생리식염수(0.005%의 오플록사신(ofloxacin) 첨가됨)로 세정하였다. 이어서, 페니실린-스트렙토마이신(50 IU)을 첨가한 인산완충액(PBS)으로 총 3회 세정하였다. 그 다음으로, 양막을 페트리 디쉬 에 옮기고, 가위를 이용하여 약 4 x 3 cm의 크기로 분할하였다. 분할 후, 형상이나 두께 등을 기준으로 상태가 좋은 양막을 선별하였다.
1-3. 양막의 보존
2 cc의 멸균 냉동(cryo) 튜브에 1 cc 씩 보존액을 넣고, 여기에 채취하고, 세정하여 선별된 양막을 1장씩 넣어 라벨링한 후, -80℃의 냉동고(deep freezer)에 저장하였다. 보존액으로는 50% 멸균된 글리세롤을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCOBRL사)을 사용하였다. 보존된 양막의 사용 기한은 3개월로 하여, 기한이 지나면 소각 처분하였다. 또한, 이러한 보존 처리를 행하지 않고, 이하의 상피를 처리할 수도 있다.
1-4. 양막 상피의 처리
-80℃로 저장한 양막을 실온에서 해동한 후, 페니실린-스트렙토마이신(50IU)이 첨가된 인산 완충액(PBS)으로 2회 세정하였다. 세정한 후 양막을 0.02% EDTA 용액(Nacalai tesque)에 침지하고(100 mm 배양 접시), CO2 배양기에서 37℃로, 1시간 반응시켰다. 반응 후, 양막을 충분한 양의 PBS으로 2회 세정하고, 실체 현미경하에서 세포 스크레이퍼(Nunc, USA)를 이용하여 수동으로 상피를 제거하였다. 또 한, 상기 처리로 단일 층의 양막 상피가 완전히 제거되었음을 광학적 및 전자 현미경(주사전자 현미경)으로 확인하였다(데이터 나타내지 않음).
2. 표피 각질형성세포의 제조
2-1. 피부의 채취
미리 채취 부위를 약 3일간 예방 차원으로 포비돈 요오드로 소독하고, 항진균제를 외용 도포한 후, 작은 피부편을 피부 생체 검사에 준하여 채취하였다.
2-2. 표피 각질형성세포의 무혈청 배양법
가위로 피부편에서 지방 조직과 진피를 할 수 있는 한 제거하고, 둘베코의 인산완충액(PBS)으로 수 회 세정한 다음, 70% 에탄올에 1분간 담가 멸균하였다. PBS로 세정한 후, 폭 3 mm 길이 10 mm 정도의 직사각형으로 잘라, 디스파제 용액(디스파제 II, Goudou Shusei, 250 단위/ml Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 침지하여 4℃에서 하룻밤(18-24시간)동안 방치하였다. 다음날, 핀셋을 사용하여 진피로부터 표피를 박리하였다. 박리한 진피는 섬유아세포의 배양에 사용하였다. 박리한 표피는 DMEM으로 세정하고, 이어 PBS로 세정한 후, 0.25% 트립신 용액에 침지하여, 37℃, 10분간의 처리하였다. 표피를 트립신 중화액이 있는 플라스틱 페트리 디쉬에 옮겨 핀셋로 표피편을 풀고, 50 ml의 멸균 튜브로 옮겼다. 여기에 PBS를 첨가하여, 표피 각질형성세포의 현탁액을 준비하였다. 세포수를 측정한 다음 1000 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상청을 흡입시킨 후, 세포는 무혈청 배지인 MCDB153 배지에 현탁하여, 100 mm의 콜라겐막 페트리 디쉬(ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION, type I collagen coated dish; 4010-010)당 2 - 3 x 106 세포/10 ml 배양액의 비율로 접종하였다. 다음날 배양액을 교체하고, 이후 2일마다 배양액을 교체하였다. 세포밀도가 약 70-80% 정도가 되는 시점에 이차배양을 수행하였다.
3. 섬유아세포의 제조
박리한 진피를 DMEM으로 세정한 후, 한 변이 1-2 mm가 되도록 메스를 사용하여 가늘게 자른다. 가늘게 자른 진피편을 I형 콜라겐막 배양접시에 약 1 cm의 간격으로 밀착시켰다. CO2 배양기에 30분간 정치시켜 완전히 밀착시킨 후, 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 약 5 ㎖첨가하여 7일간 방치하였다. 7일째에 첫 배양액 교체를 수행하였다. 진피편으로부터 섬유아세포가 이동해 오는 것을 확인하였다. 세포가 증식하여, 진피편의 주변 5 mm까지 이동하는 단계에서, 계대를 수행하였다. 이를 PBS으로 세정한 후, 0.125% 트립신, 0.05% EDTA를 포함하는 용액 3 ㎖을 첨가하여, 37℃에서 3분간 처리하였다. 세포가 배양접시 바닥면으로부터 박리된 것을 현미경으로 확인한 후, 3 ㎖의 트립신 저해제를 첨가하여 세포를 회수한 다음 50 ㎖의 튜브로 옮겼다. PBS를 사용하여 나머지 세포를 회수하여, 1000 rpm에서 5분간의 원심분리로 세포를 침전시키고, 상청을 흡입시킨 다음 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 첨가하여, 세포 현탁액을 준비하고, 세포배양용 배양 접시에 접종하였다. 계대의 세포밀도는 대체로 1:3로 하였다. 세포는 적절하게 동결 보존하였다. 동결 보존액은 10% 글리세롤, 20% FCS, 70% DMEM을 사용하였고, 액체 질소에서 보존하였다.
4. 중화 콜라겐 겔의 제조
I형 콜라겐 용액(세포 매트릭스 타입 1A: 3 ㎎/㎖: Nitta Gelatin Inc.) 6 부피에 대하여, 0.1N NaOH 1 부피, 8X DMEM 1 부피, 및 20% FCS/DMEM 10 부피비로 중화 콜라겐 액(콜라겐의 최종 농도: 1 ㎎/㎖)을 4℃에서 제조하고, 직경 24 mm의 배양삽입 용기(Corning-Costar)에 1 ㎖씩 첨가하고, 실온에서 10분간 방치하여 겔화시켰다. 미리 배양해 둔 대수 증식기의 섬유아세포(디스파제 처리해 표피를 박리한 나머지의 진피로부터 부수 배양법(outgrowth)으로 배양하여, 5-10대 계대한 세포를 사용함)를 5 x 105 세포/㎖ 및 10% FCS/DMEM의 농도에 조정하고, 이 세포현탁액 2 부피에 대하여 중화 콜라겐 액 8 부피로 혼합하여, 세포를 포함하는 중화 콜라겐 용액을 제조하였다(콜라겐의 최종 농도: 0.8 ㎎/㎖). 이 용액을 각 배양 삽입 용기에 3.5 ㎖씩 첨가하고, CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에 방치하였다. 약 30분간 겔화된 것을 확인한 후, 10% FCS/DMEM을 겔이 잠기는 정도(배양 삽입 용기 내측에 3 ㎖, 배양 삽입 용기 외측에 3 ㎖)로 첨가하여 5일간 정치 배양하였다. 배양 2일째부터 겔은 수축되기 시작하였고, 섬유아세포의 증식을 위상차 현미경으로 관찰할 수 있었다.
5. 양막의 접착 배양
개시 후 5일 후, 콜라겐 겔의 바닥면은 멤브레인에 밀착되어 있었지만 콜라겐 겔 상부는 수축되어 두께가 2-3 mm로 되어 있었다. 보존하고 있었던 양막(상피를 제거한 양막)을 PBS으로 2회 세정한 다음 각화 세포용 배양액으로 1회 세정하였 다. 양막의 실질 세포측을 아래로 하여 배양 삽입 용기에 옮기고, 핀셋을 사용하여 콜라겐 겔과 밀착시켰다. 핀셋으로 주름이 없도록 핀 다음, 배양 삽입 용기의 측벽에 양막의 주변을 밀착시켰다. 이를 CO2 배양기에 옮겨, 37℃에서 30분간 방치하였다.
6. 각화 세포의 접종
2-2.에서 제조한 각질형성세포를 트립신-EDTA를 사용하여 배양접시에서 박리하여, 회수하였다. 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상청을 제거한 다음, 200 만개/0.25 ㎖의 농도가 되도록 세포를 현탁하였다. 배양 삽입 용기 내측의 양막 위에 0.25 ㎖의 세포 현탁액을 접종하고, CO2 배양기에 옮겨 각질형성세포가 양막에 밀착되도록 1.5-2.0 시간동안 배양기에 방치한 후, 1 ㎖의 표피세포 증식용 배지를 배양 삽입 용기 내측에 서서히 첨가하고, 또 배양 삽입 용기 외측에 1 ㎖ 첨가하였다. 다음날 표피세포 증식용 배지를 배양 삽입 용기 내측에 서서히 추가하고, 또 배양 삽입 용기 외측에도 1 ㎖ 추가하였다.
7. 기상하 배양(Culture under vapor phase condition)
표피세포를 양막에 접종한지 3일째에 에어 리프팅을 수행하였다. 에어 리프팅용의 유지 용기에 멸균한 여과지를 설치하고, 중층화용 배지를 여과지가 잠기는 정도(약 9 ㎖)로 첨가하였다. 배양 삽입 용기 내측의 배양액을 조심스럽게 제거하고, 배양 삽입 용기를 여과지 위에 옮겨, CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2일마다 교체해 주었다. 7-14일간의 에어 리프팅으로 삼차원 구조의 배양 피부가 완성되었다. 중층화용 배지는 이하처럼 조정하였다. DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) : F-12 배지 = 1:1, 칼슘 농도; 1.95 mM, 모노에탄올아민; 0.1 mM, 0-포스포에탄올아민; 0.1 mM, 인슐린; 5 ㎍/㎖, 하이드로코르티손(hydrocortisone); 0.4 ㎍/㎖, L-글루타민; 4 mM, 아데닌; 0.18 mM, 트랜스페린; 5 ㎍/㎖, 셀레늄산; 53 nM, 트리요오도티로닌(triiodothyronine); 20 pM, 세린; 1 mM, 콜린 클로라이드; 0.64 mM, 리놀레익산; 2 ㎍/㎖, FCS; 2%.
상기한 방법으로 제조된 배양한 표피 시트는, 배양접시 바닥면으로부터 또는 콜라겐 매트릭스로부터 용이하게 박리된다. 종래 기술에서는 시트의 수축이 일어나기 때문에, 키틴막(BESCHITIN W)을 지지체로서 사용하여야 하며, 또한 파손되는 것도 많았지만, 이상의 방법은 견고한 시트가 제조되어, 시트의 수축도 확인되지 않으므로, 지지체의 사용도 불필요하였다.
8. 조직학적 분석
이상의 방법으로 배양한 표피 시트를 제조한 경우, 에어 리프팅한 후 7일째에 표피는 5-8층이 되고, 각질층의 형성이 확인되었고, 정상 인간 피부와 거의 동일한 구조를 나타내었다. 중층화된 각화 세포의 조직을 보면, 단일층의 기저세포형의 세포와 그 위에 5-8층의 중층화된, 분화된 세포 구축이 확인되었다(도 1). 3대 계대한 세포로 배양한 표피 시트를 제조한 경우, 피부를 채취한 후 약 4주일째에 배양한 표피 시트를 사용할 수 있게 되었으며, 배양면 표면적은 계산상, 수 천 배 증가하였다.
한편, 에어 리프팅 전후에 경시적으로 표본을 제조하고, HE 염색을 시행하였 다. 에어 리프팅후 9일째의 표본으로부터 동결 조직 절편을 제조하고, Histofine SAB - AP 키트 (NICHIREI CORPORATION)를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행하였으며, 기질로는 뉴 푸크시아(New fuchsia)를 사용하였다. 사용한 항체는 다음과 같다. 단일 클론 항체; 라미닌 5(GB3, Sera Lab), IV형 콜라겐(MAB1910, Chemicon), VII형 콜라겐(LH 7.2, YLEM), β4 인테그린(MAB 1964, Chemicon), β1 인테그린(P4C10, Gibco BRL), 데스모글레인 1(DG 3.10, Progen), 플라코글로빈/프로스타글라딘(PG 5.1, Progen), 데스모플라킨(DP-2.15, Progen), E 카드헤린(HECD-1, Takara), Pan-케라틴(Dako), EGF 리셉터(Ab3, Oncogene Science), 다클론성 항체; 임폴실린(Biomedical Technologies Inc.), 데스모글레인 3(Serotec). 유천포창 항원(pemphigoid antigen)의 확인에는 유천포창 환자 혈청을 사용하고, FITC 표지된 항-인간 IgG 항체를 사용하여, 형광 현미경으로 관찰하였다. 전자 현미경 조사에서는 에어 리프팅후 9일째의 표본을 일반적인 방법으로 고정 및 포매하여, 전이 전자 현미경(Hitachi ltd.)으로 관찰하였다.
에어 리프팅 전의 HE를 보면, 각화 세포는 1-2층이고, 각질층의 형성은 관찰되지 않았으며, 에어 리프팅후 4일째에 각질형성세포의 중층화가 관찰되고, 3-4층의 유극층과 명확한 각질층의 형성이 나타났다. 7일 후에는 유극층은 약 5-8층이 되었고, 이 상태는 14일경까지 확실하게 유지되었다. 종래의 배양한 표피 시트와 비교하였을때, 명확히 견고한 시트를 형성하고 있었으며, 지지체를 사용하지 않아도 조작이 용이하여 취급하기 매우 쉽운 것으로 생각되었다. 면역조직학적으로, 라미닌 5, IV형 콜라겐, VII형 콜라겐, β4 인테그린의 발현은 기저층의 표피 기저 세포를 중심으로 보여져, 생체 내 표피의 발현 형식과는 상이하였다. 세포간 접착 분자인 E 카드헤린, 데스모글레인 1, 데스모글레인 3, 하부 단백질인 데스모플라킨과 플라코글로빈은 기저층에서 유극층까지 발현되어 있었다. EGF 리셉터, β1 인테그린은 기저층에서 준-기저층(para-basal layer)에 걸쳐서 발현되어 있었다. 유천포창 항원의 발현은 기저막 부분에서 선상으로 확인되었다. 면역조직 소견을 종합하여 보면, 세포 간의 접착 분자, 분화 마커는 대체적으로 생체 내 표피와 동일한 발현을 보였지만, 기저막의 구성 성분의 발현은 불충분한 것으로 보였다. 전자 현미경을 통한 분석에서는 데스모좀이 양호하게 형성되어 있었다. 기저막 부분에서의 헤미데스모좀의 형성은 대체로 양호하였지만, 기저판의 형성은 일부 확인되거나, 단편적이었다. 고정 섬유(anchoring fibers)의 형성은 단편적이었다.
9. 시트의 보존
제조한 배양한 표피 시트는 담체나 또는 담체없이 소량의 보존액을 사용하여 동결가능하다. 구체적으로는, 먼저, -80℃의 냉동기로 동결보존한 다음, 다음날 -150℃의 초저온 냉동기에서 보존하였다. -150℃ 보존은 시트의 형태를 장기간 보존시킬 수 있어, 실제로 치료 효과가 충분하다. 그 이외에도, 생체 조직의 보존에 사용할 수 있는 보존액을 사용하여 4℃로 보존할 수 있으며, 이 경우에는 항산화 물질을 첨가하는 것이 바람직하다.
10. 배양한 표피 시트의 이식
박리한 시트를 플레이트에 부착하고 있었던 면이 상처 표면을 덮도록 이식하고, 압박 및 고정시켰다. 통상적으로 테이프 고정과 붕대에 의한 압박으로 충분하 다. 배양 시트 이식도 통상의 피부이식과 마찬가지로, 자신의 세포를 사용한 자가 이식과 타인의 세포를 사용한 타가이식으로 분류된다. 자가이식은 생존성이 뛰어나지만 제조에 시간이 걸리며, 타가이식은 생존하지 않지만 생물학적 드레싱으로서의 효과가 있어, 언뜻 보면 생존하는 것 같이 보이는 것도 있다. 시트의 보존이 가능해져, 한번에 대량으로 타가배양 시트를 제조해두고 필요 시에 즉시 사용할 수 있는 이점이 있다. 이러한 이유로, 타가배양 시트는 주로 급성기의 화상 환자에게 적용되고 있다. 임상적인 적용시, 화상, 하퇴 궤양(ulcus cruris), 선천성 표피 수포증(epidermolysis bullosa hereditaria), 수피형 모반, 반흔, 분층 피부(split-layer skin) 부위가 피복 등의 대상이 된다.
실시예 2
삼차원 구조의 배양 피부 시트(배양한 표피 시트)의 제조(콜라겐 겔을 사용하지 않는 경우)
1. 양막 및 표피 각질형성세포의 제조
실시예 1과 동일한 순서로 양막과 표피화 각질형성세포를 준비하였다.
2. 각질형성세포의 접종
보존하고 있었던 양막을 PBS에서 2회 세정한 다음 각질형성세포용 배양액으로 1회 세정하였다. 양막의 실질 세포측을 아래로 하여 배양 삽입 용기의 바닥면 위에 접착시켰다. 미리 배양해 둔 각질형성세포는 트립신-EDTA를 사용하여 배양접시에서 박리 및 회수하였다. 1000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상청을 제거하고, 200만개/0.25 ㎖의 농도가 되도록 세포를 현탁하였다. 배양 삽입 용기 내측의 양 막 위에 0.25 ㎖의 세포현탁액을 접종하고, CO2 배양기에 옮겨 각질형성세포가 양막에 밀착되도록 1.5-2.0시간동안 배양기에서 방치한 후, 1 ㎖의 표피 세포 증식용 배지를 배양 삽입 용기 내측에 서서히 첨가하고, 또한 배양 삽입 용기 외측에 1 ㎖을 첨가하였다. 다음날 표피 세포 증식용 배지를 배양 삽입 용기 내측에 서서히 추가하고, 또한 배양 삽입 용기 외측에도 1 ㎖ 첨가하였다.
3. 기상하 배양
표피세포를 양막에 접종 후 3일째에 에어 리프팅을 수행하였다. 에어 리프팅용의 유지 용기에 멸균한 여과지를 설치하고, 중층화용 배지를 여과지가 잠기는 정도(약 9 ㎖)로 첨가하였다. 배양 삽입 용기 내측의 배양액을 조심스럽게 제거하고, 배양 삽입 용기를 여과지 위에 옮기고, CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액은 2일마다 교환하였다. 7-14일간의 에어 리프팅에 의해 삼차원 구조의 배양 피부가 완성되었다. 중층화용 배지는 다음으로 조성하였다: DMEM : F-12 배지 = 1: 1, 칼슘 농도; 1.95 mM, 모노에탄올아민; 0.1 mM, 0-포스포에탄올아민; 0.1 mM, 인슐린; 5 ㎍/㎖, 하이드로코르티손; 0.4 ㎍/m1, L-글루타민; 4 mM, 아데닌; 0.18 mM, ㅌ트틀트랜스페린; 5 ㎍/㎖, 셀레늄산; 53 nM, 트리요오도티로닌; 20 pM, 세린; 1 mM, 콜린 클로라이드; 0.64 mM, 리놀레익산; 2 ㎍/㎖, FCS;2%
4. 조직학적 분석
이상의 방법으로 배양한 표피 시트를 제조하는 경우, 에어 리프팅후 7일째에 표피는 5-8층으로 중층화되었고, 각질층도 형성되어, 정상적인 인간 피부와 거의 동일한 구조를 나타내었다(도 2).
실시예 3
양막을 이용한 삼차원 구조의 각막 상피 시트의 제조
1. 양막의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 양막을 준비하였다.
2.각막 상피세포의 제조
2-1. 각막의 조달
기증자의 각막을 Northwest Lions Eye Bank(시에틀, 미국)에서 구입하였다.
2-2. 각막 상피세포의 무혈청 배양법
각막을 둘베코 인산완충액(PBS)이 있는 페트리 디쉬로 옮겨, 실체 현미경하에서 윤부를 한 변이 2-3 mm가 되도록 메스로 가늘게 잘랐다. 가늘게 자른 윤부를 수회 PBS으로 세정하고, 70% 에탄올에 1분간 담가 멸균하였다. PBS으로 세정한 후, 디스파제 용액(디스파제II, Goudou Shusei, 250 단위/㎖, Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 침지하여 4℃에서 하룻밤(18-24시간)동안 방치하였다. 다음날, 실체 현미경하에 핀셋으로 상피를 실질로부터 박리하였다. 박리한 각막 상피를, DMEM으로 세정하고, 이어 PBS으로 세정한 후, 0.25% 트립신 용액에 담가, 37℃에서 10분간 처리하였다. 표피를 트립신 중화액이 있는 플라스틱 페트리 디쉬에 옮겨 핀셋으로 표피편을 풀어, 15 ㎖의 멸균 튜브로 옮겼다. PBS를 첨가하고, 각막 상피세포 현탁액을 준비하였다. 세포수를 측정한 다음, 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 상청을 흡입하고, 세포는 무혈청 배지인 EpiLife 배지에 현탁한 다음, 60 mm의 콜라겐막 페트리 디쉬(ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION, type I collagen coated dish; 4010-020)에 1 - 2 x 106 세포/5 ㎖ 배양액을 접종하였다. 다음날 배양액을 교체하고, 이후 2일마다 배양액을 교체하였다. 세포 밀도가 70-80% 정도가 되는 시점에 이차배양을 수행하였다.
또한, 전술한 방법에서는 무혈청 배지를 사용하여 각막 상피세포를 배양하였지만, 하기 순서의 혈청 배지를 사용할 수도 있다.
(1) 각막 윤부 조직으로부터 내피세포를 박리 및 제거하고, 결막을 절제한다.
(2) 디스파제 용액(디스파제I, Goudou Shusei, 250 단위/㎖, Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에 담구어 4℃에서 하룻밤(18-24시간)동안 방치한다.
(3) 0.25%의 트립신 용액에 침지하여, 37℃에서 10분간의 처리한다.
(4) 현미경 하에서 트립신 용액 중의 상피만을 벗겨낸다.
(5) 피펫팅하고, 30%의 FCS/DMEM을 동량으로 첨가하여 현탁한다.
(6) PBS(-)로 나머지 세포를 회수하여 원심분리한다.
(7) 적량의 배양액을 사용하여 단일 세포 현탁액으로 준비한다.
제조한 각막 상피세포의, 동결 보존 조건(보존액 조성 포함함) 및 융해 조건의 일 예는 다음과 같다.
동결 보존 조건: 1℃/시간의 속도로 -20℃까지 온도를 냉각시키고, 그 후 질소 탱크에서 보존한다.
보존액 조성: 20% FCS/10% DMSO/DMEM
융해 조건: 가능한 신속하게 37℃에서 융해시키고, PBS로 10배 희석한다.
3. 섬유아세포의 제조
박리한 진피를 DMEM으로 세정한 후, 한 변이 1-2 mm가 되도록 메스를 사용하여 가늘게 잘랐다. 가늘게 자른 진피편을 I형 콜라겐막 배양접시에 약 1 cm의 간격으로 밀착시켰다. CO2 배양기에 30분간 방치하여 완전히 밀착시킨 후, 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 약 5 ㎖ 첨가하여, 7일간 방치하였다. 7일째에 첫 배양액 교체를 수행하였다. 진피편으로부터 섬유아세포가 이동해 오는 것을 확인하였다. 세포가 증식하고, 진피편 주변 5 mm까지 이동하는 시기에, 계대 배양을 수행하였다. 이를 PBS으로 세정한 후, 0.125% 트립신, 0.05% EDTA를 포함하는 용액 3 ㎖을 첨가하여, 37℃에서 3분간 처리하였다. 세포가 배양접시 바닥면에서 박리된 것을 현미경으로 확인한 후, 3 ㎖의 트립신 저해제를 첨가하여 세포를 회수하고, 이를 50 ㎖의 튜브로 옮겼다. PBS를 사용하여 나머지의 세포를 회수하고, 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상청을 흡입한 다음, 10% 소태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지를 가하여 세포 현탁액을 준비하여 세포 배양용 배양접시에 접종하였다. 계대의 세포 밀도는 약 1:3으로 하였다. 세포는 적절하게 동결 보존하였다. 동결 보존액은 10% 글리세롤, 20% FCS 및 70% DMEM을 사용하고, 액체 질소에서 보존하였다.
4. 중화 콜라겐 겔의 제조
I형 콜라겐 용액(세포 매트릭스 타입 1A: 3 ㎎/㎖: Nitta Gelatin Inc.) 6 부피에 대하여, 0.1 N NaOH 1 부피, 8X DMEM 1 부피, 20% FCS/DMEM 10 부피비로 중화 콜라겐 액(콜라겐의 최종 농도: 1 ㎎/㎖)을 4℃에서 준비하여, 직경 24 mm의 배양 삽입 용기(Corning-Costar)에 1 ㎖씩 첨가한 다음, 실온에서 10분간 방치하여 겔화시켰다. 미리 배양해 둔 대수 증식기의 섬유아세포(디스파제를 처리하여 표피를 박리시키고 난 나머지의 진피로부터 부수 배양(outgrowth)법으로 배양한 5-10대 계대 세포를 사용함)를 5 x 105 세포/㎖ 및 10% FCS/DMEM로 준비한 다음, 이 세포 현탁액 2 부피에 대하여 중화 콜라겐 용액 8 부피비로 혼합하여, 세포를 포함하는 중화 콜라겐 용액을 제조하였다(콜라겐의 최종 농도: 0.8 ㎎/㎖). 이 용액을 각 배양 삽입 용기에 3.5 ㎖씩 첨가하여, CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에 방치하였다. 약 30분 후, 겔화를 확인하였다. 그 후 10% FCS/DMEM을 겔이 잠기는 정도(배양 삽입 용기의 내측에 3 ㎖, 배양 삽입 용기의 외측에 3 ㎖)로 첨가하여 5일간 정치 배양하였다. 배양 2일째에 겔은 수축되기 시작하였고, 섬유아세포의 증식을 위상차 현미경으로 관찰할 수 있었다.
5. 양막의 접착 배양
개시 5일 후에, 콜라겐 겔의 바닥면은 멤브레인에 밀착되어 있었지만 콜라겐 겔 상부는 수축하여 두께가 2-3 mm으로 되었다. 보존시킨 양막을 PBS으로 2회 세정한 다음 다시 각질형성세포용 배양액으로 1회 세정하였다. 양막의 실질 세포측 을 아래쪽에 놓이도록 배양 삽입 용기로 옮기고, 핀셋을 사용하여 콜라겐 겔과 밀착시켰다. 핀셋으로 주름이 없도록 펼쳐서, 배양 삽입 용기의 측벽으로 양막의 주변을 밀착시켰다. CO2 배양기에 옮겨, 37℃에서 30분간 방치하였다.
6. 각막 상피세포의 접종
2-2.에서 제조한 각막 상피세포를 트립신-EDTA를 사용하여 배양 접시에서 박리 및 회수하였다. 1000 rpm으로 5분간 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 200만개/0.25 ㎖로 세포를 현탁하였다. 배양 삽입 용기 내측의 양막 위에 0.25 ㎖의 세포 현탁액을 접종하고, CO2 배양기에 옮겨 각질형성세포가 양막에 밀착되도록 1.5 - 2.0 시간동안 배양기에 방치한 후, 표피세포증식용 무혈청 배지를 서서히 첨가하여(배양 삽입 용기 내측에 3 ㎖, 배양 삽입 용기 외측에 3 ㎖), 다시 14일간 액체 상태로 배양하였다. 각막 상피세포의 접종 3일째에 배양액을 중층화용 배양액(하기 참조)으로 바꾼 다음, 이후 이틀마다 1회 배양액을 교체하였다.
중층화용 배지는 다음과 같이 조성된다: DMEM: F-12 배지 = 1:1, 칼슘 농도; 1.95 mM, 모노에탄올아민; 0.1 mM, 0-포스포에탄올아민; 0.1 mM, 인슐린; 5 ㎍/㎖, 하이드로코르티손; 0.4 ㎍/㎖, L-글루타민; 4 mM, 아데닌; 0.18 mM, 트랜스페린; 5 ㎍/㎖, 셀레늄산; 53 nM, 트리요오도티로닌; 20 pM, 세린; 1 mM, 콜린 클로라이드; 0.64 mM, 리놀레익산; 2 ㎍/㎖ 및 FCS; 2%.
7. 기상하 배양
각막 상피세포를 접종한지 14일째에 에어 리프팅을 수행하였다. 에어 리프 팅용의 유지 용기에 멸균한 필터 파이프를 설치하고, 중층화용 배지를 여과지가 잠기는 정도(약 9 ㎖)로 첨가하였다. 배양 삽입 용기 내측의 배양액을 조심스럽게 제거하고, 배양 삽입 용기를 여과지 위로 옮겨 CO2 배양기에서 배양하였다. 배양액은 3일째에 교환하였다. 3일간의 에어 리프팅에 의해 배양 각막이 완성되었다.
8. 조직학적 분석
에어 리프팅 후 3일째에, 각막 상피는 3-4층으로 중층되었고, 각질층의 형성이 확인되었으며, 정상적인 인간 각막과 거의 동일한 구조를 나타내고 있었다.
실시예 4
양막의 세포 배양 기질로서의 특성 평가
1. 양막 상에서의 표피 각질형성세포의 증식 및 이동 시험1
섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에, 상피가 존재하고 있었던 측면이 위를 향하도록 상피가 제거된 양막을 펼친 상태로 탑재하여 밀착시켰다. 다음으로, 양막 위에 스테인레스 스틸로 제조한 도넛 형 링(내경 6 mm, 높이 2 mm)을 두고, 내부(6 mm으로 구멍이 뚫린 부분)에 표피 각질형성세포 현탁액을 접종하였다. 양막 및 표피 각질형성세포 현탁액은 실시예 1에 기재한 방법으로 제조하였다.
2일 후에 링을 제거하였고, 에어 리프팅에 의한 중층화를 개시하였다. 주변으로 표피 각질형성세포의 이동은 중층화 1일 후 및 10일 후에 관찰되었다. 양막을 사용하지 않는 것을 제외는 동일한 조건을 비교 대상(대조군)으로 하였다.
중층화 개시 1일째 및 10일째의 페트리 디쉬 내의 상태를 도 3에 나타낸다. 도 3의 우측은 시험군(섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔에 밀착시킨 양막 상에서 표피 각질형성세포를 배양한 경우)의 결과(위로부터 차례대로 1일째, 10일째)이다. 좌측은 대조군(섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 상에서 표피 각질형성세포를 배양한 경우)의 결과이다. 페트리 디쉬의 중앙에 관찰되는 원형 또는 스팟은 세포(세포층)이다.
시험군(좌측)의 경우, 1일째에서 10일째까지 세포층이 대폭 확장되었다. 즉, 세포는 양호하게 증식하였으며, 주변으로의 이동이 항진되었음을 알 수 있다. 한편, 대조군의 경우, 1일째와 10일째에 세포층의 두드러진 변화는 관찰되지 않는다. 이상의 결과로, 양막 상에서의 세포 증식율이 높으며 이동이 현저하게 항진되는 것이 명확해졌다.
2. 양막 상에서의 표피 각질형성세포의 증식 및 이동 시험2(삼차원 배양법과 병용)
먼저, 실시예 1에 기재한 순서로 삼차원 배양(콜라겐 겔에 접착시킨 양막 상에서의 표피 각질형성세포의 배양, 및 이후의 에어 리프팅)을 실시하고, 양막 위에 세포층이 형성되어 있는 배양한 표피 시트(에어 리프팅에 의한 중층화 개시후 7일째의 것)를 제조하였다. 한편, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에, 상피가 존재하고 있었던 면이 위를 향하도록 상피가 제거된 양막을 펼친 상태로 탑재하여 밀착시켰다. 이후, 배양한 표피 시트를 직경 약 8 mm의 원형으로 도려내고, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 상의 양막 위에 탑재하여, 방치하였다. 그리고, 주변으로의 표피 각질형성세포층의 확장을 1일 후, 7일 후, 10일 후 및 14일 후에 관찰 하였다. 양막을 사용하지 않는 것을 제외하고는 동일한 조건으로 실시한 것(대조군1), 및 양막을 사용하지 않고 삼차원 배양하여 얻어진 세포층(콜라겐 겔 위에 직접, 표피 각질형성세포를 접종하고, 그 후 배양하여 얻어진 세포층)을, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 직접 탑재한 실험 결과(대조군2)와 비교하였다. 또한, 양막 및 표피 각질형성세포 현탁액은 실시예 1의 방법으로 준비하였다.
배양 개시일로부터 1일째, 7일째, 10일째 및 14일째 페트리 디쉬 내 상태를 도 4에 나타낸다. 도 4의 좌측은 시험군(섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔에 밀착시킨 양막 위에 배양한 표피 시트를 탑재하여, 배양한 경우)의 결과(상단에서 하단으로 1일째, 7일째, 10일째, 및 14일째)이다. 중앙은 대조군 1(섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 배양한 표피 시트를 탑재하여, 배양한 경우)의 결과이다. 동일하게 우측은 대조군 2(양막을 사용하지 않고 삼차원 배양하여 얻어진 세포층을, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 탑재하고, 배양한 경우)의 결과이다.
도 4에서, 페트리 디쉬의 거의 중앙에 관찰되는 것은 세포(세포층)이다. 시험군(좌측)에서는 시간의 경과에 따라 세포층이 현저하게 확장되었다. 즉, 세포가 양호하게 증식하면서 동시에 주변으로의 이동이 항진되었음을 알 수 있다. 한편, 대조군 1(중앙)에서는 시간의 경과에 따라 약간의 세포층 확장이 확인되었지만, 그 정도는 시험군의 경우와 크게 달랐다. 또한, 대조군 2(우측)에서는 관찰 기간동안 세포층의 두드러진 변화는 관찰되지 않았다. 이상과 같이, 삼차원 배양으로 제조한 배양한 표피 시트를 구성하는 세포의 경우에서도, 양막 상에서의 배양을 통해 세포 증식율이 높아지고 세포의 주변으로의 이동이 항진된다는 것이 명확 해졌다.
3. 결론
상기 1. 및 2.의 결과로부터, 양막 상에서는 표피 각질형성세포의 증식이 양호하고, 또한 세포의 이동능력도 양호하게 발휘되는 것이 확인되었다. 또한, 2.의 결과에 의하면, 섬유아세포를 포함하는 콜라겐 겔 위에 탑재한 양막 상에서 배양한 표피 각질형성세포 회수하고, 이를 미리 피부 결손부에 이식한 다른 양막 위에 이식하는 방법은, 우수한 표피 재건 기술인 것으로 생각된다. 이러한 이식 기술의 구체적인 예를 이하에 나타낸다.
(1) 피부 전층 및 피하 조직에 이르는 결손 부위에, 우선 죽은 조직을 제거하고(debridement), 괴사조직을 제거한다. 구체적으로는, 1% 자일로카인 E를 결손 부위의 주위에 주사한 후, 메스 또는 가위로 괴사 조직을 제거하고, 궤양 바닥면을 평탄하게 한다. 이후, 인공 진피를 이식하고, 타이 오버 고정(tie over fixation)을 수행한다.
(2) 1-2주 후에 타이 오버 고정을 제거하고, 인공 진피의 생존을 확인한다. 구체적으로는, 인공 진피가 궤양 바닥면에 밀착되어 있는 것을 육안으로 확인하고, 손가락으로 좌우로 움직여보아 움직이지 않는 것을 확인한다. 또한, 인공 진피 아래에 삼출액이나 혈액이 있는지를 육안으로 확인한다. 계속하여, 생존한 인공 진피 상에 양막(상피 성분을 제거하고, 세균이 음성인 것을 확인하여 동결 보존하고 있는 양막을 37℃로 따뜻하게 한 후, 멸균 생리식염수로 2회 세정한 것)을 이식하고, 붕대, 테이프, 타이 오버 등으로 고정한다.
(3) 수 일간, 고정 상태를 유지한 후, 양막이 인공 진피에서 생존하고 있는 것을 확인한다. 구체적으로는, 양막과 인공 진피의 사이에 삼출액이나 혈액이 저류하지 않음을 육안으로 확인한다. 또한, 손가락으로 좌우로 움직여 보아서 움직이지 않음을 확인한다.
(4) 미리 준비해 둔 삼차원 배양한 표피 시트(양막과 세포층으로 구성된 것, 또는 세포층만으로 구성된 것)를 패치 그래프트(patch graft)로 이식한다(예, 하나의 패치를 직경 15 mm으로 한다). 3일간 고정하고, 이후 2일에 1회의 비율로 소독(0.05% 히비텐 물, 소독용 이소딘액)한다.
(5) 양막 위에 이식하였을때 삼차원 배양한 표피 시트를 구성하는 세포가 양호하게 증식 및 이동하는 것으로 생각된다. 그 결과, 세포층이 신속하게 확장되어, 높은 치료 효과가 나타날 것으로 기대된다.
본 발명에 따른 생체 조직 시트는 넓은 피부 표피, 각막 상피, 구강 점막 상피, 기도 점막 상피 및 장관 점막 상피 등의 재생(재건)에 사용할 수 있다. 그 중에서도, 피부 표피 또는 각막 상피의 재생에 바람직하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 생체 조직 시트는 유전자 치료에 사용할 수 있다. 유전자 치료에는 크게 생체내 방법과 생체외 방법이 있는데, 전자는 유전자를 직접 생체 내에 도입하는 방법이고, 후자는 일단 세포를 꺼내어 유전자를 도입한 후 다시 체내로 되돌리는 방법이다. 유전자 치료의 현 기술 수준을 감안한다면, 배양 피부, 배양 각막 상피, 배양 장관 점막 상피 시트에 유전자를 도입한 후 바로 생체외 방 법을 수행할 수 있다. 여러가지 바이러스 벡터에 의한 각질형성세포의 유전자 도입의 유효성이 확인되고 있으며, 특히, 아데노 바이러스 벡터를 사용한 경우 거의 100%로 각질형성세포에 도입가능하다. 피부과에서의 유전자 치료의 경우, VII형 콜라겐, 라미닌 5 등의 이상이 원인인 선천성 표피 수포증 등의 유전성 질환의 치료시에도, 자가배양한 표피 시트에 정상 유전자를 도입함으로써, 효과적으로 치료할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 당뇨병 및 혈우병 등의 체내 분자의 결핍으로 인한 전신성 질환에 있어서, 배양 피부를 각질형성세포에 유전자를 도입하여 상기 결핍 분자를 생산 및 보충하는 전달 시스템으로 사용할 수 있으며, 향후 배양 생체 조직의 응용성은 점점 발전할 것으로 예상된다.
다수의 국가들에서 타가이식에 관한 윤리적인 측면과 안전성 검증면에서 문제가 되어 일반적으로는 보급되고 있지 않으며, 다만 자가이식이 추진되고 있는 상황이므로, 삼차원 구조의 배양한 생체 조직을 이용한 자가이식이 추후 진행될 것으로 생각된다.
본 발명은 상기 발명의 실시예 및 실시예의 설명으로 전혀 한정되지 않는다. 특허청구 범위의 기재를 이탈하지 않고, 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 범위내의 여러가지 변형예도 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 명시한 논문, 공개 특허공보, 및 특허공보 등의 내용은, 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

Claims (19)

  1. 이종 동물 세포(xenogeneic animal cell)의 비존재하에 양막 상에서 증식시킨 생체 유래 세포를 포함하는 생체 조직 시트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 생체 유래 세포는 인간 섬유아세포를 포함하고 있는 콜라겐 겔 위에 상기 양막을 탑재한 상태에서 증식시킨 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 생체 유래 세포는 무혈청 배지에서 증식시킨 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 생체 유래 세포는 혈청 성분으로서 수용자 유래 혈청만을 포함하는 배지에서 증식시킨 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 유래 세포는 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막, 기도 점막 또는 장관 점막 유래 세포인 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양막은 상피가 제거된 양막인 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 증식시킨 세포 및 배양 기질로서의 상기 양막을 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  8. 제 7항에 있어서, 제2의 양막을 개재시켜 조직 결손 부위에 이식되는 이식 재료인 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 동물 세포의 비존재하에 인간 섬유아세포를 함유하는 콜라겐 겔 위에 탑재한 양막 상에서 증식시킨 생체 유래 세포를, 상기 양막과 함께 제2 양막 위에 탑재하여 다시 증식시켜 수득한 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 조직 시트.
  10. (a) 생체 유래 세포를 제조하는 단계;
    (b) 상기 생체 유래 세포를 양막 위에 접종하는 단계; 및
    (c) 이종 동물 세포의 비존재하에 상기 생체 유래 세포를 배양 및 증식시키는 단계;
    를 포함하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 단계 (b)는
    (b-1) 콜라겐 겔 중에 인간 섬유아세포를 배양하는 단계; 및
    (b-2) 상기 콜라겐 겔 위에 양막을 탑재한 후, 상기 생체 유래 세포를 상기 양막 위에 접종하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서,
    (d) 상기 생체 유래 세포를 증식시킨 후, 최표층을 공기와 접촉시키는 단계
    를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
    (e) 상기 생체 유래 세포를 상기 양막과 함께 회수하는 단계; 및
    (f) 회수한 상기 생체 유래 세포 및 상기 양막을, 양막이 아래쪽에 놓이도록 제2의 양막 위에 탑재한 다음 상기 생체 유래 세포를 배양 및 증식시키는 단계;
    를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 무혈청 배지를 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  15. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 혈청 성분 으로서 수용자 유래 혈청만을 포함하는 배지를 사용하여 실시되는 것을 특징으로 하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  16. 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 유래 세포는 각막 상피, 결막 상피, 피부 표피, 모낭 상피, 구강 점막, 기도 점막 또는 장관 점막 유래 세포인 것을 특징으로 하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  17. 제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양막은 상피가 제거된 양막인 것을 특징으로 하는, 생체 조직 시트의 제조 방법.
  18. (A) 피부 표피세포를 양막 위에 접종하는 단계;
    (B) 상기 피부 표피세포를 배양 및 증식시키는 단계; 및
    (C) 증식한 피부 표피세포를 회수하는 단계;
    를 포함하는, 피부 표피세포의 제조 방법:
  19. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 따른 생체 조직 시트를 이식 재료로 사용하는 이식 방법.
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