KR20070037451A

KR20070037451A - 각막 상피 시트 및 그 제조 방법

Info

Publication number: KR20070037451A
Application number: KR1020067027688A
Authority: KR
Inventors: 시게루 기노시타; 다카히로 나카무라
Original assignee: 아르브라스트 가부시키가이샤; 시게루 기노시타
Priority date: 2004-06-30
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2007-04-04
Also published as: WO2006003818A1; JPWO2006003818A1; CA2572803A1; US20080026030A1; EP1782846A1; CN101014375A

Abstract

본 발명은 각막 상피와 유사한 세포층을 포함하는 각막 상피 시트를 제공한다. 본 발명의 각막 상피 시트는 a) 자가 세포인 제1 세포와 상기 제1 세포와 유래가 다른 제2 세포를 각각 제조하는 단계, b) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포를 콜라겐층 위에 접종하고, 배양하는 단계 및 c) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 증식하여 세포층을 형성한 후, 상기 세포층의 최표층을 공기와 접촉시키는 단계를 수행함으로써 수득된다.

각막 상피 시트, 각막 이식

Description

각막 상피 시트 및 그 제조 방법{CORNEAL EPITHELIAL SHEET AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 각막 상피 시트 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 각막 상피 이식이 필요한 질환(안구 표면 질환)의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명은 특히 양안성 각막 질환에 대해 효과적인 치료 수단을 제공한다.

각막이 결막 상피로 덮혀 혼탁이 생기는 안구 표면 질환에 대한 외과적 치료로, 현재 각막 상피이식 기술이 행해지고 있지만, 심한 염증을 수반한 난치성 각결막 질환(Stevens-Johnson) 증후군이나 안류 천포창(ocular cicatricial pemphigoid), 각막 부식 등)에서는, 그 예후가 매우 나쁘다. 그 가장 큰 이유는 강한 항원성을 가지는 타인(allo; 이질성)의 각막 상피를 숙주의 면역계가 인식하여 거부하기 때문이다. 또한, 거부 반응을 예방하기 위해, 수술 후 다량의 면역억제제를 전신 및 국소 투여함으로써 초래되는 합병증도 그 예후를 불량하게 하는 큰 요인이 되고 있다. 한편, 이질성 각막 상피를 사용하는 경우, 기증자가 부족한 문제가 있다. 따라서, 이질성이 아니고 자신의 각막 상피조직을 사용하여 이식을 행하는 것이 이상적이라고 고려된다. 그러나, 한쪽 눈의 질환(각막 부식 등)은 건강한 안구의 각막 상피를 환자의 안구에 이식함으로써 양호한 성과를 얻을 수 있다는 것이 과거에도 보고되고 있지만, 난치성 각막 질환의 대부분은 양안성이어서, 이러한 방법을 사용할 수 없는 실정이다.

한편, 지금까지 각막 이식의 적응외로 여겨져 온 스티븐-존슨 증후군이나 안류 천포창, 화학 외상, 재발 익상편 등의 난치성 각결막 질환에 대한 외과적 치료법으로, 본 발명자들은 1999년부터 교토 부립 의과대학 윤리위원회로부터 승인받은 기질로서 양막을 이용하여 배양한 각막 상피이식 기술을 시행하였고, 비교적 양호한 치료 성과를 거두었다(비특허문헌 1-3을 참조). 또한, 2002년부터 교토 부립 의과대학의 인간을 대상으로 하는 의학 연구 심사위원회에서 승인한 자가배양 구강 점막 상피 이식 기술을 시행하여, 치료 성과를 향상시켰다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 참조).

특허문헌 1: 국제공개 제03/043542호 팜플렛

비특허문헌 1: Noriko Koizumi et al., Ophthalmology 2001;108:1569-74.

비특허문헌 2: Noriko Koizumi et al., Arch Ophthalmol 2001;119:298-300.

비특허문헌 3: Nakamura T et al., Cornea. 22;70-71:2003.

비특허문헌 4: Nakamura T et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44:106-16.

발명의 공개

발명이 해결하고자하는 과제

난치성 각결막 질환의 대부분은 양안성이기 때문에, 양막을 기질로 한 배양 각막 상피 이식 기술에 의한 치료법의 대부분은 타인(이질성)으로부터의 조직을 사용한 이식에 의지하지 않을 수 없으므로, 거부 반응이나 세균 감염증 등의 문제가 수술 후 성과에 큰 영향을 미친다. 한편, 자가배양한 구강 점막 상피 이식 기술에 의한 치료법은 자신(auto)의 구강 점막을 사용할 수 있기 때문에, 거부 반응 등의 위험성을 회피할 순 있지만, 배양 상피 시트의 투명성 문제나, 수술 후 혈관 신생 등이 발생되는 사례가 있어, 향후 새로운 치료법의 개발이 기대되어 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

이상의 상황에서, 본 발명자들은 자가조직을 사용한 안구 표면 재건 기술의 새로운 발전적인 가능성을 모색하였다. 그 결과, 자가 세포와 이와 유래가 상이한 세포를 조합 배양하여 하이브리드화하고, 이에 따라 각막 상피형의 점막 상피층을 구축하는 새로운 방법을 생각하기에 이르렀다. 따라서, 자가 세포로서 구강 점막 상피 세포를 선택하고, 또한 이와 유래가 다른 세포로 각막 상피 세포를 선택하여 각막 상피 시트 구축을 시도하였으며, 2종류의 세포 유래 세포가 하이브리드화된 세포군이 각막 상피로 유사 분화 및 중층화된 점막 상피층을 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, 이와 같이 하여 수득한 점막 상피층은 동물을 이용한 이식 실험을 통해 안구 표면의 항상성을 유지시키고 동시에, 양호한 생착성을 가지는 것으로 확인되었다.

여기서, 생체에는 여러가지 점막 상피 조직이 존재하며, 그것들은 점막 상피에 특징적인 많은 공통점을 가진다. 이를 고려하면, 예를 들면 결막 상피 세포나 비강 점막 상피 세포 등, 다른 점막 조직을 구성하는 세포도, 구강 점막 상피 세포와 마찬가지로, 상기와 같은 각막 상피형의 점막 상피층을 형성하기 위한 자가 세포로서 사용할 수 있을 것으로 생각할 수 있다. 특히, 결막 상피 세포는 각막 상피의 근린 조직을 구성하는 세포로 유효한 세포원인 것으로 생각된다.

또한, 일반적으로, 조직을 형성하는 세포는 외부 신호 등을 받아 전구 세포 또는 더욱 미분화된 세포로부터 발생된다. 이를 고려하면, 상기 세포(구강 점막 상피 세포, 결막 상피 세포 등)로의 분화 능력을 가지는 한 미분화 세포인 경우에도, 이들의 세포와 마찬가지로, 점막 상피층을 형성할 때의 자가 세포로서 사용할 수 있을 것으로 생각된다.

한편, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 인간 구강 점막 상피 세포와 인간 양막 상피 세포를 하이브리드화하였을 경우에도, 각막 상피와 유사한 점막 상피층을 형성할 수 있는 것으로 실험적으로 확인되었다. 즉, 각막 상피 세포 이외의 것을 자가 세포로서 구강 점막 상피 세포와 조합하는 세포로 사용하여 하이브리드화하였을 경우에도, 각막 상피형의 점막 상피층을 형성할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 여기서 양막 상피 세포와 동일하게 사용할 수 있는 세포로 유력한 후보 중 하나는 각막 상피의 근린 조직을 구성하는 결막 상피 세포로 추정된다.

이상과 같이, 본 발명자들이 거듭 검토한 결과, 자가 세포를 포함하는 2종류 이상의 세포를 배양하여 하이브리드화함으로써 각막 상피형의 점막 상피층을 구축할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 본 발명은 이상의 성과를 토대로 한 것으로, 이하의 구성을 제공한다.

즉, 본 발명은 제1 측면으로서, 자가 세포인 제1 세포와 상기 제1 세포와 유래가 다른 제2 세포를 포함하며 중층화된 세포층을 구비한 각막 상피 시트를 제공한다.

본 발명의 일 예에서는, 상기 제1 세포는 구강 점막 상피 유래의 세포, 결막 상피 유래의 세포, 비강 점막 상피 유래의 세포, 기타 점막 상피 유래의 세포, 및 이들 중 어느 하나의 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 자가 세포이며, 상기 제2 세포는 각막 상피 유래의 세포, 결막 상피 유래의 세포, 및 양막 상피 유래의 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포이다.

본 발명의 다른 일 예는, 상기 제1 세포가 구강 점막 상피 유래의 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 제2 세포가 타인의 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 일 예는, 상기 제2 세포가 각막 상피 유래의 세포 또는 양막 상피 유래의 세포인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 다른 형태로서, 상기 세포층과 콜라겐층을 구비한 각막 상피 시트를 제공한다. 이러한 형태에서는, 콜라겐층 위에 상기 세포층이 형성되어 있다. 콜라겐층은 양막 또는 상피를 제거한 양막으로부터 유래하는 것이 바람직하다.

본 발명의 각막 상피 시트에서의 세포층은 이하의 성상 또는 특성 중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다:

최표층의 세포가 각화되지 않는다;

최표층의 세포가 편평형이다 ;

경계(barrier) 기능을 갖추고 있다:

본 발명은 제2 측면으로서, 각막 상피 시트의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 제조 방법은,

a) 자가 세포인 제1 세포와 상기 제1 세포와 유래가 다른 제2 세포를 각각 제조하는 단계;

b) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포를 콜라겐층 위에 접종하여, 배양하는 단계; 및

c) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 증식하여 세포층이 형성된 후, 상기 세포층의 최표층을 공기에 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 예에서, 상기 제1 세포는 구강 점막 상피 세포, 결막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 기타의 점막 상피 세포, 및 이들 중 어느 하나의 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 자가 세포이며, 상기 제2 세포는 각막 상피 세포, 결막 상피 세포, 및 양막 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포이다.

본 발명의 다른 일 예에서, 상기 제1 세포로서 구강 점막 상피 세포를 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예에서, 상기 제2 세포로서 타인의 세포를 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 예에서, 상기 제2 세포로서 각막 상피 세포 또는 양막 상피 세포를 사용할 수 있다.

상기 단계 b)는 하기 중 어느 하나의 조건으로 실시할 수 있다.

1) 지지 세포의 공존하;

2) 지지 세포의 공존하에서, 지지 세포와 상기 콜라겐층 사이에 지지 세포가 통과할 수 없는 크기의 기공을 가진 격리 막이 존재하는 상태.

상기 콜라겐층은 양막 또는 상피를 제거한 양막에서 유래하는 것이 바람직하다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 제1 측면은 각막 상피 시트에 관한 것이다. 여기서 "각막 상피 시트"는 각막 상피와 유사한 특징을 적어도 일부 가지는 시트형의 구조체를 의미한다.

본 발명의 각막 상피 시트는 특유한 세포층을 포함한다. 상기 세포층은 자가 세포(본 명세서에서는 "제1 세포"라 함) 및 상기 자가 세포와 유래가 상이한 세포(본 명세서에서는 "제2 세포"라 함)를 포함하며, 중층화된 것을 특징으로 한다. 본 명세서에서, 이와 같이 유래가 상이한 2종류 이상의 세포를 포함하여 구성되는 것을 "하이브리드화"라고 한다. 한편, "중층화된"은 복수 개의 세포층으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 본 발명의 각막 상피 시트는 전형적으로는, 4 내지 8 층 정도의 세포층을 포함한다.

세포층에서 세포의 함유 형태(하이브리드화 상태)는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 각 세포가 산재되어 있을 수 있으며, 어느 하나의 세포(또는 복수 종의 세포)가 일정하게 통합되어 존재할 수도 있다. 또한, 각 세포의 함유율이 세포층 전체적으로 균일하지 않을 수도 있다.

본 발명에서, 제1 세포는 자가 세포이다. 본 명세서에서, "자가"는 본 발명의 각막 상피 시트를 사용하는 대상, 즉 이식을 받는 자(수용자)를 의미한다. 한편, 이러한 "자가" 이외의 자를 "타인"이라고 한다.

후술하는 제2 세포와 하이드리드화하였을 때 각막 상피형의 점막 상피층을 형성할 수 있는 경우, 제1 세포의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 제1 세포의 예로는, 구강 점막 상피, 결막 상피, 비강 점막 상피 등의 점막 상피 유래 세포, 또는 이러한 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포(즉, 점막 상피의 줄기 세포) 유래 세포를 들 수 있다. 여기서, 본 명세서에서 "유래 또는 유래의"는 출발 재료를 특정하기 위한 목적으로 사용된다. 따라서 예를 들면, 구강 점막 상피 유래(또는 유래의) 세포는 구강 점막 상피 세포를 출발 재료로 하여 수득할 수 있는 세포를 의미한다. 또한, 본 발명에서 "점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포"는 해당 점막 상피를 구성하는 세포로의 분화 능력을 가지는 세포를 의미한다. 예를 들면, 구강 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포는 구강 점막 상피 세포로 분화될 수 있는 세포를 의미한다. 미분화 세포의 구체적인 예로는 구강 점막 상피나 결막 상피 등, 특정한 조직을 구성하는 세포의 전구 또는 줄기 세포, 또는 한층 분화도가 낮은 상피계 줄기 세포 등을 들 수 있다.

본 발명에서 세포층은 다른 2종 이상의 제1 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 구강 점막 상피 유래 세포와 결막 상피 유래 세포를 포함한 상태에서 세포층을 구축하고 있을 수 있다.

본 발명에서 "구강 점막 상피"는 구강 내연 점막 상피부(oral inner marginal mucosa epithelium part), 입술부, 구개부, 볼부분 등을 포함한다. 그것이 구강 점막 상피 유래 세포인지는 구강 점막 상피에 특이적인 케라틴4, 또는 케라틴13의 발현을 지표로서 확인할 수 있다. 또는, 케라틴3이 발현되는 것을 지표로 확인할 수도 있다. 상기 케라틴3은 각막 특이적인 케라틴 중 하나로 알려져 있지만, 구강 점막 상피에 있어서도 발현되는 것으로 확인되어 있다. 또한, 이러한 각막 특이적 케라틴인 케라틴3가 발현된다는 점에서, 구강 점막 상피 세포를 각막 상피 이식용 조성물의 제조 재료로 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 구강 점막 상피 세포에 특이적인 유전자의 발현을 조사함으로써, 그것이 구강 점막 상피 유래인 것을 확인할 수 있다. 또한, 구강 점막 상피 이외의 조직으로부터 유래하는 세포의 경우도 이와 마찬가지로, 해당 조직에 특이적인 마커 또는 유전자의 발현을 조사함으로써 그 유래를 확인할 수 있다.

제2 세포의 구체적인 예로는 각막 상피, 결막 상피, 또는 양막 상피 유래 세포를 들 수 있다. 그 중에서도, 제2 세포는 각막 상피 또는 결막 상피 유래 세포가 바람직하다. 이는 안구 표면 조직 유래 세포로 구축된 세포층은 각막 상피에 가까운 특성을 구비할 수 있기 때문이다. 제2 세포가 각막 상피에 유래하는 세포인 것이 특히 바람직하다. 이는 각막 상피에 보다 근접한 특성의 세포층이 되기 때문이다.

제2 세포는 자가 세포 또는 타인의 세포 중 어느 것일 수 있다. 자가 세포에 의해 구축된 세포층의 경우, 면역 거부 문제가 없고, 또한 세포층이 적다. 타인의 세포에 의해 구축된 세포층의 경우, 원재료가 되는 세포의 입수가 용이하므로 제조 관점에서는 유리한 세포층이 된다. 본 발명의 세포층은 다른 2종 이상의 제2 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 각막 상피 유래 세포와, 결막 상피 유래 세포를 포함한 상태에서 세포층이 구축될 수도 있다.

본 발명의 각막 상피 시트에서, 세포층이 각막 상피 유래 세포인지 여부는 예를 들면, 각막 상피 특이적인 케라틴3, 또는 케라틴12가 발현되는 것을 지표로 확인할 수 있다. 또는, 케라틴4이 발현되는 것을 지표로 확인할 수도 있다. 또한, 각막 상피 이외의 조직으로부터 유래된 세포의 경우도 이와 마찬가지로, 해당 조직에 특이적인 마커 또는 유전자의 발현을 조사함으로써 그 유래를 확인할 수 있다.

본 발명의 각막 상피 시트의 세포층은 바람직하게는 이하의 성상 또는 특성들 일부를 포함한다. 특히 바람직하게는, 이하의 모든 성상 또는 특성을 포함한다.

(1) 최상층의 세포는 각화되지 않는다. 이는 각막 상피가 구비하는 하나의 특징이다. 이러한 특징이 확인되는 경우, 본 발명의 각막 상피 시트가 각막 상피와 유사하고, 각막 상피와 동일한 기능을 발휘할 것으로 기대된다. 또한, 각화는 각질화라고도 하며, 세포내에 케라틴이 생기고, 핵 등의 세포내 소기관이 소실되는 현상을 의미한다. 세포가 각화되는지 여부는, 예를 들면 세포의 편평화나 핵의 유무를 지표로 확인할 수 있다.

(2) 최상층의 세포가 편평형이다. 즉, 구강 점막 상피 세포층은 대략 원주 형상의 세포로 이루어지는 층 위에 편평형의 세포로 이루어지는 층이 형성됨으로써 구성된다. 편평형의 세포가 최상층을 덮음으로써, 세포간의 기밀성이 높아지고, 하기 경계 기능이 획득되는 것으로 생각된다. 각막 상피에서도 최상층의 세포는 편평형이다. 이러한 특징이 확인되는 경우, 본 발명의 각막 상피 시트는 각막 상피와 유사하고, 각막 상피와 동일한 기능을 발휘할 것으로 기대된다.

(3) 경계 기능을 갖추고 있다. 경계 기능은 표층으로부터의 액체, 기체 등의 침윤이나, 표층을 통한 액체의 방산 등을 방지하는 기능을 의미한다. 이와 같은 경계 기능을 가짐으로써, 이식 후 표면에 수분(눈물)을 유지할 수 있으며, 또한 필요 이상의 수분이 방산되는 것을 방지할 수 있다. 각막은 경계 기능을 갖춤으로써 표면에 수분을 유지할 수 있으며, 이에 따라 깜박거림을 견딜 수 있는 기능을 발휘한다. 따라서, 경계 기능을 갖추는 것은 각막용 이식 재료에 요구되는 중요한 특성 중 하나이다. 이러한 특징이 확인되는 경우, 본 발명의 각막 상피 시트는 각막 상피와 유사하고, 각막 상피와 동일한 기능을 발휘하는 것이 기대된다. 경계 기능을 갖추었는지 여부는, 예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase) 등의 표지 물질을 포함하는 용액의 침윤의 정도로 조사할 수 있다.

본 발명의 각막 상피 시트는 각막이 손상 및 결손된 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체물)로 사용할 수 있다. 이식시, 수술용 봉합 실을 사용하여 이식편을 주위 조직과 고정시켜, 생존을 촉진시키는 것이 바람직하다. 또한, 이식 후, 치료용 콘텍트 렌즈로 이식부 표면을 일시적으로 피복하여 보호하는 것이 바람직하다.

본 발명의 각막 상피 시트의 일 예로, 상기 세포층이 콜라겐층 위에 형성되어 있다. 즉, 상기 예에서 세포층 뿐만 아니라 콜라겐층을 구비할 수 있다. 여기서의 콜라겐층은 양막 유래인 것이 바람직하다. 양막의 높은 생체 친화성 및 저면역원성으로 인해, 생체 친화성이 보다 우수해지고, 또한 각막 상피 시트의 면역원성이 낮아지기 때문이다. 양막 유래의 콜라겐층을 사용하는 것이 각막 상피 시트의 제조에 있어서도 바람직하다. 즉, 후술한 바와 같이, 콜라겐층을 포함하는 각막 상피 시트는 콜라겐층을 기질로 하여 그 위에 소정의 세포를 접종 및 배양함으로써 형성할 수 있으며, 양막은 그 위에서 세포가 양호하게 접착 및 증식하는 특성을 가지고 있으므로, 양막 유래의 콜라겐층을 사용하면 양호한 세포의 접착, 증식, 및 세포층의 형성이 가능해진다.

콜라겐층은 상피를 제거한 양막으로부터 유래된 것이 더욱 바람직하다. 상피 성분을 포함하지 않는 경우, 면역원성이 더욱 저하된 각막 상피 시트가 되기 때문이다. 또한, 상피가 제거된 양막 상에는 세포가 한층 양호하게 접착 및 증식하므로, 보다 단시간에 고품질의 각막 상피 시트를 구축할 수 있는 제조상의 이점도 있다.

상피를 제거한 양막을 원재료로 한 콜라겐층에 양막 상피층의 세포가 포함되어 있지 않음을 조사에 의해 확인할 수 있다. 또한, 양막으로서 인간 양막을 사용하는 것이 특히 바람직하다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 각막 상피 시트는 각막이 손상 및 결손된 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로 사용할 수 있으며, 콜라겐층을 포함하는 각막 상피 시트의 경우, 콜라겐층이 안구측에 가도록 각막 상피 결손부에 이식한다. 한편, 콜라겐층 위에 세포층을 형성한 후 콜라겐층을 제거함으로써 수득되는 각막 상피 시트의 경우, 통상적으로 콜라겐층이 존재하고 있던 측면이 안구측이 되도록 각막 상피 결손부에 이식한다.

이식시에는 수술용 봉합 실을 사용하여 이식편을 주위 조직과 고정시켜, 생존을 촉진시키는 것이 바람직하다. 또한, 이식 후, 치료용 콘텍트 렌즈로 이식부 표면을 일시적으로 피복하여 보호하는 것이 바람직하다.

본 발명의 각막 상피 시트는 이하의 방법(본 발명의 제2 측면)에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 제2 측면은 각막 상피 시트의 제조 방법에 관한 것으로, 하기의 단계를 포함하여 구성된다.

a) 자가 세포인 제1 세포와 상기 제1 세포와 유래가 다른 제2 세포를 각각 제조하는 단계.

b) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포를 콜라겐층 위에 접종하고, 배양하는 단계.

c) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 증식하여 세포층을 형성한 후, 상기 세포층의 최표층을 공기와 접촉시키는 단계.

본 발명의 제조 방법은 2종류 이상의 세포를 공동 배양하는 것을 하나의 특징으로 한다. 후술하는 실시예(구강 점막 상피 세포와 각막 상피 세포의 공동 배양)에 나타낸 바와 같이, 이러한 특징을 구비하는 방법에 의해, 양호한 세포 증식 및 그로 인한 신속한 세포층 형성이 확인되었다. 이와 같이, 2종류 이상의 세포를 공동 배양함으로써, 세포층의 형성을 보다 단시간에 실시할 수 있는 효과도 예상된다.

제1 세포로 구강 점막 상피 세포, 결막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 또는 그 밖의 점막 상피 세포, 또는 이들 중 어느 하나의 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 한편, 제2 세포로는 각막 상피 세포, 결막 상피 세포, 또는 양막 상피 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 세포는 그것이 존재하는 생체 조직으로부터 채취된다. 구체적으로는 예를 들면, 목적한 세포가 존재하는 조직의 일부를 메스 등으로 채취한 후, 결합 조직의 제거, 세포의 분리 등의 처리를 거쳐서 세포 부유액(현탁액)의 형태로 제조한다. 또한, 제1 세포로 다른 2종 이상의 세포를 사용할 수도 있다. 제2 세포에 역시 이와 동일하게 다른 2종 이상의 세포를 사용할 수도 있다.

제1 세포의 채취원으로서 바람직한 구강 점막 상피에는 줄기 세포가 존재하는 것으로 시사되고 있으므로, 상피 세포층을 형성하는 세포로 분화 유도하기 쉬울 것으로 생각된다. 또한, 구강 점막 상피 세포를 사용하는 경우, 채취가 용이하고, 다량으로 세포를 수득할 수 있으며, 또한 양안성의 환자를 치료할 경우에서도 자가 세포를 사용하여 이식 재료를 제조할 수 있는 등의 이점이 있다. 특히, 각막 상피 세포의 채취가 불가능한 환자의 경우, 자가 세포 유래의 이식 재료를 적용할 수 있다는 이점은 임상에서 매우 중요한 거부 반응의 문제를 대폭 해소시킬 수 있을 것으로 기대된다.

구강 점막 상피 세포로는 치근부에 존재하는 세포(구강 내연 점막 상피 세포), 입술 부분의 세포, 구개부의 세포, 볼 부분의 세포 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 구강 내연 점막 상피 세포는 그 증식력이 높고, 또한 항원성이 낮아, 이를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 구강 점막 상피 세포는 목적으로 하는 세포가 존재하는 장소를 메스 등으로 절제하거나, 제거함으로써 채취할 수 있다. 구강 내연 점막 상피 세포에서 발치에 부착되어 있는 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 전이부로부터 분리하고, 이로부터 채취할 수 있다. 또한, 결합 조직 등의 불순물을 제거하기 위해, 디스파제나 트립신 등의 효소 처리나, 필터 처리를 실시하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해 제조되는 각막 상피 시트를 이식할 예정인 환자 이외의 개체의 구강으로부터 채취한 구강 점막 상피 세포를 사용할 수도 있지만, 면역 거부 반응을 고려하여, 환자 자신의 구강으로부터 구강 점막 상피 세포를 채취하여, 배양하는 것이 바람직하다.

구강 점막은 증식력이 높고, 통상적으로 수술 후 몇 일간의 항생제 복용 및 이소진으로의 소독 등으로 창상이 치유되므로, 점막 채취로 인한 환자 자신의 침습은 경미한 것으로 간주된다.

한편, 제2 세포로 타인(이질성)의 각막 상피 세포를 적합하게 이용할 수 있다. 이러한 각막 상피 세포는 예를 들면, 감염증이 없는 기증자 안구를 아이 뱅크(Northwest eye bank 등)로부터 입수할 수 있다. 제2 세포로 사용 가능한 세포는 각막 상피 세포로만 한정되지 않으며, 결막 상피 세포, 양막 상피 세포 등을 사용할 수도 있다. 단, 생체에서 각막 상피를 구성하는 세포인 각막 상피 세포, 또는 그 이웃에 존재하는 결막 상피 세포를 채택하면, 각막 상피의 특성을 양호하게 재현하는 각막 상피 시트를 구축할 수 있을 것으로 생각된다. 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이 제2 세포로 각막 상피 세포를 사용한 경우, 각막 상피에 가까운 세포층을 구축할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 사실은 상기에서 예상한 바를 뒷받침할 뿐만 아니라, 제2 세포로 각막 상피 세포가 특히 바람직하다는 것을 뒷받침하는 것이다. 한편, 후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 제2 세포로서 양막 상피 세포를 사용한 경우에도, 각막으로서 요구되는 특성을 양호하게 재현하는 세포층을 형성할 수 있는 것으로 확인되었다. 이러한 사실은, 제2 세포로 양막 상피 세포도 적합하게 사용할 수 있음을 의미하는 것이다.

제2 세포로 자가 세포를 사용할 수도 있지만, 타인의 세포를 사용하면 세포를 보다 용이하게 입수할 수 있다. 예를 들면, 양안성 환자의 치료용 각막 상피 시트를 제조할 경우, 제2 세포로서 각막 상피 세포를 입수할 수 있다.

각각 제조된 제1 세포와 제2 세포(이하, 이들을 통합해서 "제1 세포 등"이라고도 함)를 콜라겐층 위에 접종하고, 배양한다(단계b). 통상적으로 세포 부유액의 형태로 제조된 제1 세포와 제2 세포를 각각 콜라겐층 위에 적하하고, 배양을 실시한다.

전형적으로는, 제1 세포의 접종과 제2 세포의 접종을 동시(여기서 "동시"는, 문자 그대로의 동시이며, 한쪽을 접종한 뒤에 실질적인 시간적 간격을 두지 않고 다른 쪽을 접종할 경우를 포함함)에 실시하지만, 예를 들면, 제1 세포를 접종한 후 몇 분 내지 몇 시간이 경과한 후 제2 세포를 접종하는 등의, 양자를 다른 타이밍으로 접종할 수도 있다. 이와 같이 접종 시기를 어긋나게 하는 경우, 제1 세포로부터 유래된 세포가 풍부한 영역이 국재된 세포층을 구축하는 등과 같이, 세포층의 구성 및 그로 인한 특성을 변화 또는 조정할 수 있다.

접종되는 제1 세포 등의 비율은 특별히 한정되지 않지만, 전형적으로는, 제1 세포와 제2 세포를 대략 동일한 수로 접종한다. 또한, 제1 세포로 구강 점막 상피 세포를, 제2 세포로 각막 상피 세포를 사용한 실험에서, 제1 세포의 수: 제2 세포의 수가 3:7일 경우, 5:5일 경우, 및 7:3일 경우를 비교한 결과, 세포의 증식 및 중층화 측면에서 이들 사이에 명확한 차이가 확인되지 않았다(데이터 나타내지 않음).

여기서, 콜라겐층의 원재료가 되는 콜라겐의 종류는 특별히 한정되지 않으며, I형 콜라겐, III형 콜라겐, IV형 콜라겐 등을 사용할 수 있다. 복수 종류의 콜라겐을 혼재하여 사용할 수도 있다. 이들 콜라겐은 돼지, 소, 양 등의 동물의 피부, 연골 등의 결합 조직으로부터, 산 가용화법, 알칼리 가용화법, 효소 가용화법 등에 의해 추출 및 정제할 수 있다. 또한, 항원성을 감소시킬 목적으로, 펩신이나 트립신 등의 분해 효소로 처리함으로써, 텔로펩티드(telopeptide)가 제거된 아테로콜라겐(atherocollagen)을 사용하는 것도 바람직하다.

콜라겐층으로 양막 유래, 특히 인간 양막 유래의 콜라겐을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 여기서, 양막 유래는 넓게는 양막을 출발 원료로 하여 수득되는 것을 의미한다. 인간 양막은 자궁과 태반의 최표층을 덮는 막으로서, 콜라겐이 많은 실질 조직 상에 기저막, 상피층이 형성되어 구성되어 있다. 인간 양막은, 예를 들면 분만시에 분만 후 얻어지는 인간 태아막, 태반 등으로부터 채취할 수 있다. 구체적으로는, 분만 직후에 얻어지는 인간 태아막, 태반 및 제대(탯줄)로 이루어진 일체물을 처리 및 정제함으로써 인간 양막을 제조할 수 있다. 처리 및 정제 방법은, 일본 특허 공개 번호 5-5698호에 기재된 방법 등의 공지된 방법을 채용할 수 있다. 즉, 분만시에 얻어지는 태아막으로부터 양막을 박리하고, 초음파 세정 등의 물리적 처리 및 효소 처리 등으로 잔존 조직을 제거하고, 적절한 세정 공정을 거쳐 인간 양막을 제조할 수 있다.

이와 같이 제조한 인간 양막은, 사용전까지 동결 보존할 수 있다. 인간 양막의 동결은, 예를 들면 -80℃, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 글리세롤을 동일 부피비로 혼합한 액중에서 행할 수 있다. 동결 보존함으로써 조작성 향상 뿐만 아니라, 항원성 저하를 기대할 수 있다.

양막을 그대로 콜라겐층으로서 사용할 수도 있지만, 양막으로부터 상피를 제거하여 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 상기와 같이 동결 보존한 인간 양막을 해동한 후, EDTA나 단백질 분해 효소로 처리하여 새포간의 접착을 느슨하게 하고, 세포 스크랩퍼 등으로 상피를 제거함으로써, 상피가 제거된 인간 양막을 제조할 수 있다.

콜라겐층으로서 상피가 제거된 인간 양막을 사용할 경우, 상피를 제거하여 표출된 면 측(즉, 기저막 측)에 제1 세포 등을 접종하는 것이 바람직하다. 상기 면 측에는 IV형 콜라겐이 풍부하게 포함되어 있어, 접종된 제1 세포 등의 증식, 중층화가 양호하게 실행되는 것으로 고려할 수 있기 때문이다.

각각의 제1 세포 및 제2 세포를, 세포 밀도가 약 1x10³개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1x10³개/cm² - 약 1x10⁵개/cm², 더욱 바람직하게는 약 1x10⁴개/cm² - 약 1x10⁵개/cm²이 되도록 콜라겐층 위에 접종할 수 있다.

제1 세포 등의 배양은 지지 세포의 존재하 수행하는 것이 바람직하다. 지지 세포는 피더 세포라고도 하며, 배양액에 성장 인자 등을 공급한다. 지지 세포의 공존하에 배양함으로써, 세포의 증식 효율이 향상된다. 지지 세포는 예를 들면 3T3 세포(스위스 마우스 3T3 세포, 마우스 NIH3T3 세포, 3T3J2 세포 등) 등을 사용할 수 있다. 그중에서도, 증식 효율, 취급의 용이 등의 관점에서 마우스 NIH3T3 세포를 지지 세포로서 사용하는 것이 바람직하다.

지지 세포는 미리 마이토마이신C 등에 의해 불활성화하는 것이 바람직하다. 이는 지지 세포 자체 증식에 의해 제1 세포 등의 증식이 저해되는 것을 방지하고, 제1 세포 등의 증식 효율을 상승시키기 위해서이다. 이러한 불활성화는 방사선 처리 등에 의해서도 수행할 수 있다.

지지 세포의 세포 밀도는, 예를 들면 약 1x10²개/cm² 이상, 바람직하게는 약 1x10²개/cm² - 약 1x10⁷개/cm², 더욱 바람직하게는 약 1x10³개/cm² - 약 1x10⁵개/cm²라 할 수 있다. 제1 세포 등에 대해, 사용하는 지지 세포수를, 예를 들면 제1 세포와 제2 세포의 총 수에 대해 1/10³배-1x10²배, 바람직하게는 1/10²- 1배가 되는 조건으로 배양할 수 있다. 지지 세포의 수가 적으면 제1 세포 등의 증식율이 저하되고, 지나치게 적을 경우에는 제1 세포 등의 양호한 증식 및 중층화가 얻어지지 않는다. 한편, 지지 세포의 수가 지나치게 많을 경우에는, 오히려 제1 세포 등의 증식율을 저하하므로 바람직하지 않다.

제1 세포 등의 배양을 지지 세포의 공존하에서 수행할 경우, 지지 세포와 콜라겐층 사이에 지지 세포가 통과할 수 없는 크기의 기공을 가진 격리 막을 존재시키는 것이 바람직하다. 이러한 격리 막을 이용함으로써, 배양시 콜라겐층 측(즉, 제1 세포 등 측)에 지지 세포가 침입하는 것을 방지할 수 있다. 그 결과, 최종적으로 얻어지는 각막 상피 시트에 지지 세포가 혼재될 가능성이 없어진다. 이는 지지 세포에 의한 면역 거부 문제가 없는 각막 상피 시트의 제조가 가능함을 의미하며, 임상적인 측면에서 매우 의미가 있다.

격리 막은 지지 세포가 통과할 수 없는 기공 크기를 갖는 공지된 것을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리카보네이트로 제조된 기공 크기가 약 0.4㎛ - 3.0㎛인 막을 사용할 수 있다. 격리 막의 재질은 특별히 한정되지 않으며, 폴리카보네이트 외에 폴리에스테르 등을 사용할 수 있다. 이러한 격리 막은 시판되고 있어, 용이하게 입수할 수 있다.

격리 막을 사용한 경우의 배양 방법의 예로서 이하의 방법을 들 수 있다. 먼저, 샤알레 등의 용기(제1 용기)에 불활성화된 지지 세포를 접종 및 배양하여, 용기 표면에 지지 세포층을 형성시킨다. 그 다음으로, 격리 막으로 바닥면을 형성한 제2 용기를, 제1 용기 내에 설치한다. 이때, 제2 용기의 바닥면이 배양액 내에 위치되게 제2 용기의 위치를 조정한다. 계속하여, 제2 용기의 바닥면, 즉 격리 막 위에 콜라겐층을 형성한다. 그리고, 콜라겐층 위에 제1 세포 등을 접종하고, 배양한다.

제2 용기의 바닥면에 미리 콜라겐층을 형성해 두어(예를 들면, 제2 용기의 바닥면에 상피를 제거한 양막을 싣는다. 이 상태에서 일단 건조 처리를 행할 수도 있음), 이 제2 용기를 지지 세포를 접종한 제1 용기 내에 설치하고, 그리고 콜라겐층 위에 제1 세포 등을 접종하여, 배양을 수행할 수도 있다.

제1 세포 등을 배양할 때에 사용할 수 있는 배양액은 상기 세포를 증식시키고, 중층화시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상피 세포의 성장에 통상적으로 사용할 수 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)과 햄F12 배지(Ham's F12 medium)를 소정의 비율로 섞고, FBS, 성장 인자, 항생 물질 등을 첨가한 배지를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, FBS(10%), 인슐린(5 mg/ml), 콜레라 독소(0.1 nM), 상피 세포 증식 인자(EGF)(10 ng/ml), 및 페니실린-스트렙토마이신(50 IU/ml)을 첨가한, DMEM과 햄 F12 배지의 혼합 배지(혼합 부피비 1:1)를 들 수 있다. 또한, 트리요오드타이로닌(예를 들면, 2 nM), 글루타민(예를 들면, 4 mM), 트렌스페린(예를 들면, 5 mg/ml), 아데닌(예를 들면, 0.18 mM), 및/ 는 하이드로코르티존(예를 들면, 0.4 mg/ml)을 더 첨가한 DMEM/햄 F12 혼합 배지를 사용할 수도 있다.

콜라겐층 상에서 제1 세포 및 제2 세포를 배양함으로써, 이들의 세포가 증식하여 세포층을 형성한다(이 과정에서 최소 일부의 세포가 분화되는 것으로 생각할 수 있음). 세포층이 형성된 후, 상기 세포층의 표층을 공기와 접촉시키는 단계(단계c)를 실시한다. 또한, 이 단계는 본 명세서에서 에어 리프팅(Air-lifting)이라고도 한다. 이 단계 c는 세포층을 형성하는 세포의 분화와 경계 기능의 유도를 위해 수행된다.

이 단계는 배양액의 일부를 스포이트, 피펫 등을 사용하여 일시적으로 제거하여 배양액 수위를 낮춤으로써, 세포층의 최표층을 일시적으로 배양액 밖으로 노출시킬 수 있다. 또는, 세포층을 콜라겐 층과 함께 들어올려, 최표층을 배양액 표면 위로 일시적으로 노출시킬 수도 있다. 나아가서, 튜브 등을 사용하여 공기를 배양액 내부로 주입하여 세포층의 최상층을 공기와 접촉시킬 수도 있다. 조작의 용이적인 측면에서, 배양액의 수위를 낮추어 세포층의 최표층을 노출시키는 방법을 행하는 것이 바람직하다.

단계 c의 수행 시간, 즉 중층화한 세포층의 최표층을 공기와 접촉시키는 시간은 세포의 상태나 배양 조건 등에 따라 변동하지만, 예를 들면 3일 - 2주일 정도이며, 바람직하게는 1주일 이내, 더욱 바람직하게는 3일 이내다.

이상의 본 발명의 방법에 의해, 콜라겐층 위에 제1 세포 등이 중층화된 각막 상피형의 세포층이 형성된다. 이와 같이하여 얻어진 각막 상피 시트는, 제1 세포 등의 배양 기질로 사용할 수 있는 콜라겐층과 함께 각막이 손상 및 결손된 환자에 대한 이식 재료(각막 상피의 대체)로 사용할 수 있다. 이 경우, 콜라겐층이 안구측이 되도록 각막 상피 결손부에 이식한다. 이식시, 수술용 봉합 실을 사용하여 이식편을 주위의 조직과 고정하고, 생존을 촉진시키는 것이 바람직하다. 또한, 이식 후, 치료용 콘텍트 렌즈로 이식부 표면을 일시적으로 피복하여 보호하는 것이 바람직하다.

또한, 콜라겐층을 일부 제거한 것 또는 전부를 제거한 것을 이식편으로 사용할 수도 있다. 이러한 콜라겐층의 제거는 EDTA 등에 의한 화학 처리, 단백질 분해 효소 등에 의한 효소 처리, 핀셋 등에 의한 제거 등의 물리적 처리를 적절하게 조합하여 수행할 수 있다.

구체적인 이식 기술의 일 예를 이하에 나타낸다. 먼저, 각결막 질환자의 각막 윤부에서 반흔 조직을 절개한다. 계속해서, 각막 위에 침입한 반흔 결막 조직을 절제해 각막 실질을 노출시킨 후, 윤부 보다 더 내측에서 각막 상피 시트를 봉합한다. 수술 조작은 원칙적으로, 본 발명자들의 소속 기관에서 이미 70 건 이상의 임상 응용 실적이 있는 이식 기술(각막 상피 세포를 배양하여 수득한 각막 상피 시트나, 구강 점막 상피 세포를 배양하여 수득한 각막 상피 시트에 관한 이식 기술)과 동일하며, 그 방법은 매우 안정적으로 수행할 수 있는 것으로 생각된다.

도 1은 양막 위에 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포를 배양할때 기구 등의 상태를 모식적으로 나타낸 단면도이다. 배양 접시(culture dish)(1) 안에 배양 삽입 용기(culture insert)(2)가 정치되고, 배양 접시(1) 바닥면에는 3T3 세포층(5)이 형성된다. 또한, 배양 삽입 용기(2)의 바닥면 위에 양막(3)이 정치되며, 그 위에 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포(4)가 배양되는 상태를 나타낸다. 부호 (6)은 배지이다. (1) 배양 접시(배양 접시, 제1 용기), (2) 배양 삽입 용기(배양 삽입용기, 제2 용기), (3) 양막, (4) 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포, (5) 3T3 세포층, (6) 배지.

도 2는 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포를 양막 상에서 1일간 배양한 후의 광학 현미경 사진(왼쪽), 및 형광 염색 사진(오른쪽)이다. RO는 토끼 구강 점막 상피 세포(rabbit oral epithelium)를 나타낸다. 형광 염색 사진에서는, 구강 점막 상피 세포 유래의 세포의 존재를 의미하는 Dil 신호(귤색)가 확인된다.

도 3은 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포를 양막 상에서 3일간 배양한 후의 광학 현미경 사진(왼쪽), 및 형광 염색 사진(오른쪽)이다. RO는 토끼 구강 점막 상피 세포를 나타낸다. 형광 염색 사진에서는, 구강 점막 상피 세포 유래의 세포 존재를 의미하는 Dil 신호(귤색)가 확인된다.

도 4는 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포를 양막 상에서 7일간 배양한 후의 광학 현미경 사진(왼쪽), 및 형광 염색 사진(오른쪽)이다. RO는 토끼 구강 점막 상피 세포를 나타낸다. 형광 염색 사진에서는, 구강 점막 상피 세포 유래의 세포의 존재를 의미하는 Dil 신호(귤색)가 확인된다.

도 5는 양막 위에 형성된 세포층을 면역 염색한 결과이다. 왼쪽은 케라틴1(K1) 및 10(K10)에 대한 염색성이고, 중앙은 케라틴3(K3) 및 케라틴12(K12)에 대한 염색성이고, 오른쪽은 케라틴4(K4) 및 케라틴13(K13)에 대한 염색성이다.

도 6은 실시예의 각막 상피 시트를 이식한 후 2일 경과한 시점의 안구 표면 (전안부)의 상태(왼쪽), 및 안구 표면의 플루오레세인 염색 사진(오른쪽)이다.

도 7은 실시예의 각막 상피 시트를 이식한 후 1주일 경과한 시점의 안구 표면(전안부)의 상태(왼쪽), 및 안구 표면의 플루오레세인 염색 사진(오른쪽)이다.

도 8은 실시예의 각막 상피 시트를 이식한 후 2주일 경과한 시점의 안구 표면(전안부)의 상태(왼쪽), 및 안구 표면의 플루오레세인 염색 사진(오른쪽)이다.

도 9는 이식 후 2주일 경과한 시점에서의 각막 상피 시트의 HE(헤마톡실린-에오신) 염색 사진이다.

도 10은 이식 후 2주일 경과한 시점에서의 각막 상피 시트를 면역 염색한 결과를 나타낸다. 왼쪽은 케라틴1(K1) 및 10(K10)에 대한 염색성, 중앙은 케라틴3(K3) 및 케라틴12(K12)에 대한 염색성, 오른쪽은 케라틴4(K4) 및 케라틴13(K13)에 대한 염색 사진이다.

이하, 본 발명의 실시예(실험예를 포함함)를 설명한다.

실시예 1

<하이브리드형 각막 상피 시트의 제조 및 평가>

1-1. 양막의 수득

전신성 합병증이 없는 제왕 절개 예정인 임산부에 대하여, 사전에 산부인과 의사와 함께 충분한 설명 및 동의(informed consent)를 구한 후, 수술실에서 제왕 절개 시에 양막을 회수하였다. 조작은 청결하게 수행하였으며, 수술 조작에 준해 손을 세정한 후 전용 가운을 착용하였다. 분만 전에 청결한 양막 회수용 배 트(vat)와 세정용 생리식염수를 준비하였다. 분만 후, 태반 조직을 배트에 옮기고, 손으로 양막 조직을 태반으로부터 박리하였다. 양막과 태반의 유착이 강한 부분은 가위로 절제하였다.

1-2. 양막의 처리

양막 처리 과정은 (1) 세정, (2) 트리밍(trimming), (3) 보존의 순으로 수행하였다. 모든 과정에 있어서, 조작은 청결한 드래프트 내에서 행하는 것이 바람직하고, 사용하는 용기나 기구도 모두 멸균된 것을 사용하며, 샤알레 등은 멸균된１회용(디스포저블) 타입을 사용하였다. 채취한 양막에 부착된 혈액 성분은 생리식염수로 세정하여 제거하고, 또한 충분한 양의 생리식염수(0.005% 오플록사신(ofloxacin)이 첨가됨)로 세정하였다. 다음으로, 양막을 인산완충액(PBS)이 있는 샤알레에 옮기고, 가위를 사용해서 약 4 x 3 cm의 크기로 분할하였다. 분할 후 또 몇 개의 샤알레에서 보존액에 침지하고, 그 중에서 상태가 좋은 양막을 선별하였다.

1-3. 양막의 보존

2 cc의 멸균 냉동(cryo) 튜브에 1 cc 씩 보존액을 넣고, 여기서 채취하고, 세정해서 선별한 양막을 1장씩 넣어 표시한 후, -80℃의 냉동고에 보존하였다. 보존액으로는 50% 멸균 글리세롤를 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL사)을 사용하였다. 보존된 양막의 사용 기한은 3개월로 하고 기한이 지나면 소각 처분하였다.

1-4. 양막 상피의 처리

양막은 그 상피를 처리한 후, 배양에 사용하였다. 먼저, -80℃로 저장한 양막을 실온에서 해동한 후, 샤알레 내의 멸균한 인산완충액(PBS)으로 충분히 세정하였다. 세정한 후 양막을 0.02% EDTA 용액(Nacalai tesque 사)에 2시간동안 37℃로 보존한 후, 세포 스크렙퍼(Nunc, USA)를 사용하여 기계적으로 상피를 제거하여, 배양의 기질로 사용하였다. 또한, 상기 처리 방법에 따라 단일층의 양막 상피가 완전히 제거된 것을 광학 및 전자 현미경(주사전자 현미경)으로 확인하였다.

1-5. 구강 점막 상피 세포의 회수

생후 6주 된 일본 백색 집토끼를 발치한 후, 이에 부착되어 있는 구강 점막 상피를 에나멜 시멘트 전이부로부터 조심스럽게 분리하였다. 또한, 일련의 조작은 멸균된 기구를 사용하여 가능한 멸균 상태에서 수행하였다.

채취한 구강 점막 상피를 50 IU/ml의 페니실린 스트렙토마이신, 겐타마이신을 함유하는 인산완충액(PBS)에 30분간, 실온의 조건으로 2회 침지하였다. 그 후, 조직을 1.2 U 디스파제(Nacalai tesque 사)를 함유하는 인산완충액(PBS)에 1시간동안 37℃의 조건에서 침지하고, 계속해서 0.05% 트립신-EDTA 용액(GIBCOBRL 사)에서 30분간, 침지 처리하여 세포를 분리하였다. 효소 활성은 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM에 침지시켜 정지시켰다. 그 후, 60㎛의 세포 필터에서 여분의 조직을 제거하여, 구강 점막 상피 세포(구강 내연 점막 상피 세포)를 분리하였다(구강 점막 상피 세포 부유액).

1-6. 각막 상피 세포의 회수

생후 6주 된 일본 백색 집토끼(구강 점막 상피 세포를 채취한 개체와는 다른 것)의 각막 윤부에서, 수술용 메스를 사용하여 약 5x10mm의 각막 윤부 조직편을 채취하였다.

채취한 조직편을 50 IU/ml의 페니실린 스트렙토마이신, 겐타마이신을 함유하는 인산완충액(PBS)에 30분간, 실온의 조건으로 2회 침지하였다. 그 후, 조직을 1.2 U 디스파제(Nacalai tesque 사)를 함유하는 인산완충액(PBS)에 1시간, 37℃의 조건으로 침지하고, 계속해서 0.05% 트립신-EDTA 용액(GIBCOBRL 사)에서 15분간, 침지 처리하여, 세포를 분리하였다. 효소 활성은 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 DMEM에 침지시켜 정지시켰다. 그 후, 60㎛의 세포 필터에서 여분의 조직을 제거하여, 각막 상피 세포를 분리하였다(각막 상피 세포 부유액).

1-7. 공동 배양 세포의 제조

공동 배양의 세포(지지 세포)로 NIH-3T3 세포(이하, "3T3세포"라 함)를 사용하였다. 미리 배양하여 75F 플라스크(BD Falcon 사)에서 컨플루언트(confluent)가 된 3T3 세포를 0.05% 마이토마이신 C 용액에 2시간 침지하여, 3T3의 증식 활성을 억제하였다. 계속해서 인산완충액(PBS)로 수회 세정하여 마이토마이신 C을 제거한 후, 0.05% 트립신-EDTA 용액으로 처리함으로써, 3T3 세포 부유액을 제조하였다.

1-8. 세포 배양 및 점막 상피의 유도

상피를 제거한 인간 양막을 기질로 하여, 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포를, 상기 처리를 실시한 3T3 세포와 이하의 순서대로 공동 배양하였다. 배양 기구는 6웰 배양 접시(culture dish)(Corning 사, NY)와 배양 삽입 용기(culture insert)(폴리카보네이트, 평균 기공 크기 3.0㎛, Corning사, NY)를 사용하였다.

먼저, 배양 접시 위에 약 1x10⁴개/cm²의 세포 밀도가 되도록 3T3 세포 부유액을 접종하고, 37℃, 5% CO₂의 조건 하에서 배양하였다. 또한, 배양 삽입 용기 상에 제거한 상피 측이 위로 가도록 하여 양막 기질을 정치시켜 붙이고, 실온에서 10분간 건조시켰다. 그 후, 양막을 접착시킨 배양 삽입 용기 위에 각각 약 1x10⁴개/cm²의 세포 밀도가 되도록 구강 점막 상피 세포 부유액 및 각막 상피 세포 부유액을 접종하였다.

이상의 조작 후, 도 1에 도시한 바와 같이, 배양 삽입 용기를 배양 접시 내에 설치하고, 3T3 세포, 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포를 같은 배지 중으로 배양하였다. 또한, 도 1은 배양중의 상태를 나타낸 모식 단면도이다. 배양 접시(1) 안에 배양 삽입 용기(2)가 정치되어, 배양 접시(1) 바닥면에는 3T3 세포층(5)이 형성된다. 또한, 배양 삽입 용기(2)의 바닥면 상에 양막(3)이 정치되어, 그 위에 구강 점막 상피 세포 및 각막 상피 세포(4)가 배양되는 상태가 나타난다. 부호 (6)은 배지다.

배지는 DMEM/햄 F12 혼합 배지(혼합 부피비 1:1)에, 10% FBS, 인슐린(5 mg/ml), 콜레라 독소(0.1 nM), 페니실린 스트렙토마이신(50 IU/ml), 인간 재조합 상피 세포 증식 인자(EGF)(10 ng/ml)를 첨가한 것을 사용하였다.

상기의 배지에서 약 7일간 배양하였다(Submerge). 그 후, 점막 상피의 분화를 유도하기 위해, 에어 리프팅 방법으로 약 3일간 배양하였다. 에어 리프팅 방법 은 배지의 액체 표면을 양막 상에 형성된 세포층 면까지 리프팅하여, 상기 세포층의 표면을 공기중에 노출시키는 방법이다. 침지(Submerging)하는 동안 격일로 배지를 교체하였고, 에어 리프팅 후에는 매일 배지를 교체하여 배양하였다. 이상의 방법으로 배양함으로써, 약 10일간(에어 리프팅법에 의한 3일간의 배양을 포함) 5-6층의 중층화의 세포층이 형성되었다.

1-9. 세포층을 구성하는 세포의 특정

이상의 방법으로 얻어지는, 양막 상의 세포층이 구강 점막 상피 세포와 각막 상피 세포가 하이브리드화하여 형성되어 있음을 이하의 순서로 확인하였다. 먼저, 양막 위에 접종하기 전의 구강 점막 상피 세포 부유액에 Dil 색소를 첨가하고, 실온에서 약 15분간 방치하였다(Dil 표지). 이로써 얻어진 표지한 구강 점막 상피 세포를 각막 상피 세포와 함께, 상피를 제거한 양막 위에 접종하였다. 그 후, 상기와 같은 조건으로 배양하였다. 배양 개시 후 1일, 3일, 및 7일 경과한 후, 형성된 세포층을 광학현미경 및 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 2(배양 1일), 도 3(배양 3일), 및 도 4(배양 7일)에 나타낸다. 각 도면에서 좌측은 광학 현미경 사진이고, 우측은 형광현미경 사진이다. 배양 1일째에 세포가 양호하게 증식하고 있는 것으로 관찰되었다(도 2 좌측). 또한, Dil 신호가 분산되어 있음이 확인되었으며(도 2 우측), 이는 구강 점막 상피 세포와 각막 상피 세포가 혼재한 상태임을 알 수 있다. 배양 3일째에는 세포가 규칙적으로 정렬된 상태로 관찰되었다(도 3 좌측). 또한, Dil 신호가 여전히 분산되어 있음이 확인되어(도 3 우측), 2종류의 세포(구강 점막 상피 세포와 각막 상피 세포)가 하이브리드화된 상태에서 증식하여 세포층을 형성하고 있음을 확인할 수 있다. 배양 7일째에도 배양 3일째와 동일하게 양호한 세포증식, 및 세포의 하이브리드화가 확인되었다(도 4). 또한, 세포의 증식 및 중층화에 따라, Dil 신호가 확인되는 영역이 증가하였다(도 4 우측).

1-10. 세포층의 조직학적 특성의 평가

상기의 방법(1-1. 내지 1-8.)으로 최종적으로 얻어진 세포층을 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 세포층의 기저측(양막측)에는 비교적 원주형을 한 기저 세포와 유사한 세포군이 존재하고 있었다. 또한, 최표층의 세포는 편평형을 나타내고 있었지만, 핵이 있어, 피부와는 상이하며, 그 표면은 각화되고 있지 않은 것으로 확인되었다. 이상으로부터, 광학현미경 관찰에서는 양막 상에 각막과 유사한 상피층(각막 상피 시트)이 형성되는 것으로 관찰되었다.

그 다음으로, 세포층의 조직학적 특성을 검토하기 위해 면역 염색을 수행하였다. 먼저, 얻어진 세포층을 양막과 함께 적절한 크기로 절제하고, OCT 컴파운드에 동결 포매하였다. 그 후, 동결 상태로 얇게 썰어 슬라이드 절편을 제조하였다. 면역 염색시, 대표적인 세포 골격 단백질인 케라틴과 관련된 검토를 수행하였다. 즉, 표피에 특이적인 케라틴1/10, 각막 특이적인 케라틴3/12, 및 점막 특이적인 케라틴4/13을 검토하였다. 방법은 이하와 같다. 슬라이드 절편을 인산완충액(PBS)로 세정한 후, 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 블록킹하여 비특이적인 항체 반응을 억제하였다. 그 후, 각 케라틴에 대한 항체(1차 항체)를 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 트리톤-X가 함유된 PBS에서 15분, 3회의 조건으로 세정하고, 계속적으로 형광 표지 항체(2차 항체)를 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후, 인산완충액(PBS)에서 15분, 3회의 조건으로 세정하고, 밀봉한 후 공초점 현미경에서 조직을 관찰하였다.

세포층에 대한 여러가지 케라틴의 항체 반응은 다음과 같다. 먼저, 표피 특이적인 케라틴1 및 10 염색성은 모두 확인되지 않았다(도 5, 좌측). 한편, 각막 특이적인 케라틴3에 대한 염색성은 광범위하게 확인되었다(도 5, 중앙 상단). 케라틴3은 각막 상피 세포 및 구강 점막 상피에서 확인되는 것이므로, 배양 조건 하에서도 그 성질이 유지되고 있는 것으로 생각할 수 있다. 또한, 케라틴3에 대한 염색성은 세포층의 상부에서 강하게 관찰되었다. 케라틴12에 대한 염색성도 광범위하게 확인되었다(도 5, 중앙 하단). 특히 세포층의 상부에서 강한 염색성이 관찰되었다. 이러한 염색성은 사용한 각막 상피 세포에 의한 것으로 생각할 수 있으며, 이는 배양 후에도 그 성질이 유지되고 있음을 시사한다.

점막 특이적인 케라틴4 및 13에 대하여도 거의 전체적으로 염색성이 확인되었다(도 5, 우측).

이상의 결과로부터, 형성된 세포층의 조직학적 성질로서 세포 골격 측면에서, 각막에 특이적인 케라틴(케라틴3 및 12)이 유지되어, 생체의 각막 상피와 유사하였다. 또한, 표피와 같이 각화되는 방향으로 분화되지 않고, 비각화형의 점막 상피로서의 성질을 가지며, 동시에 각막 특이적인 케라틴도 보유하고 있음을 알 수 있었다.

1-11. 이식 실험

상기 방법(1-1 내지 1-8.)에 따라, 양막 상에 세포층이 형성된 시트(이하, "각막 상피 시트"라고 함)를 제조하였다. 구체적으로 먼저, 생후 6주 된 일본 백색 집토끼로부터 구강 점막 상피 세포(자가 세포)를 제조하고, 동시에 다른 개체(6주 된 일본 백색 집토끼)로부터 각막 상피 세포(타인의 각막 상피 세포)를 제조하였다. 그 후, 상피를 제거한 양막 위에 양 세포를 접종하고, 계속해서 배양하여, 각막 상피 시트를 수득하였다.

한편, 구강 점막 상피 세포를 채취한 집토끼에서, 크레센트 나이프를 사용하여 윤부에서 4 mm 외측으로 각막 및 결막 상피를 100 ㎛의 두께로 모두 제거하였다. 이러한 조작에 의해 각막 상피 줄기 세포를 포함하는 상피 세포가 존재하지 않게 되므로, 인위적인 안구 표면 줄기 세포 피폐증을 재현한 것으로 생각할 수 있다. 다음으로, 전술의 각막 상피 시트를 윤부 보다 다소 내측의 영역에 이식하였다. 이식할 때는 10-0 나일론 실을 사용하여 주위 조직에 봉합하였다. 이식 후, 이식편 상에 치료용 소프트 콘택트 렌즈를 봉합하였다. 수술 후, 항생제 및 스테로이드 안 연고를 2회/일 도포하였다. 이식 후의 시점에서, 안구 표면은 이식 전의 각막 상피 이식용 시트와 같이 투명하였다(결과를 도시하지 않음).

이식 기술을 시술 안구 표면을 이식한 후 2일, 1주 및 2주에 관찰하였다. 또한, 플루오레세인 염색 시험을 실시하였다. 플루오레세인 염색 시험은 플루오레세인 시험지에 항생제의 점안(点眼) 등의 수분을 포함하도록 하여 직접 안구 표면에 도포하고, 2, 3번 깜박거림을 시킨 후, 안구 표면의 플루오레세인 염색성을 관찰함으로써 수행하였다. 각막 상피가 잔존하고 있으면, 강한 세포간 접착 구조에 의해 플루오레세인 색소는 침윤하지 않고, 플루오레세인에 의한 염색을 볼 수 없다.

이식 후 2일째에 이식편(각막 상피 시트)은 투명성을 유지하고 있었다(도 6, 좌측). 또한, 플루오레세인 염색에 의해 각막 상피 시트가 안구 표면에 결손되지 않고 잔존하고 있음을 확인하였다(도 6, 우측). 한편, 이식편(각막 상피 시트)이 플루오레세인 염색성을 나타내지 않는 것으로 보아, 각막 상피 시트가 각막 상피와 동일한 경계 기능을 갖추고 있음을 알 수 있었다. 또한, 이식편 주위에는 사방으로 플루오레세인의 염색성이 확인되어, 이식부에 존재하는 조직이 주위의 잔존 결막 상피로 오염되지 않았음을 알 수 있었다.

또한, 통상의 각막 상피에서는 세포간의 강한 접착 구조로 결합하고 있기 때문에, 그 표면에는 플루오레세인 색소가 침윤되진 않는다. 즉, 플루오레세인 염색 시험에서 염색성을 나타내지 않는다. 한편, 세포간 접착이 느슨해지거나, 세포 자체가 박리되어 경계 기능에 장해가 발생하였을 때에는, 플루오레세인 색소가 침윤되어, 조직이 염색된다. 따라서, 플루오레세인 염색에 의한 염색성을 조사함으로써, 이식한 각막 상피 시트가 각막 상피와 동일한 경계 기능을 갖추고 있는지 여부를 확인할 수 있다.

한편, 이식 후 1주째에도 이식편(각막 상피 시트)은 안구 표면에 잔존하고 있으며, 또한 이식 후 2일째의 상태와 비교하여 주위로 확장되고 있는 것으로 확인되었다(도 7, 좌측). 또한, 이식편은 플루오레세인 염색성을 나타내지 않으며, 각막 상피에 필요한 경계 기능을 유지하고 있는 것으로 확인되었다(도 7, 우측). 투 명성도 이식 후 2일째와 다르지 않아, 여전히 높은 투명성이 유지되고 있었다(도 7, 좌측). 이식 후 2주째의 안구 표면의 상태는, 이식 후 1주째와 비교하여 특별한 변화가 없었다. 즉, 이식편(각막 상피 시트)은 안구 표면에 잔존하고 있었으며, 투명성이 높았다(도 8, 좌측). 또한, 이식편은 플루오레세인 염색성을 나타내지 않았으며(도 8, 우측), 경계 기능도 유지되고 있는 것으로 확인되었다.

이상의 결과로부터, 상기 방법으로 얻어지는 각막 상피 시트는 안구 표면에서의 양호한 생존성을 구비하고 있으며, 이는 장기간 유지되는 것으로 입증되었다. 또한, 이식 후 주위로 확장되면서, 동시에, 각막 상피로서 필요한 경계 기능을 장기간에 걸쳐서 발휘하며, 더불어 높은 투명성을 유지한다는 것도 확인되었다. 즉, 상기 방법으로 얻어지는 각막 상피 시트는 각막 상피의 대체물로서 양호하게 기능하며, 각막의 손상 및 결손 등의 경우에 안구 표면을 재건하기 위한 이식 재료로서 적합하게 사용할 수 있음이 입증되었다.

1-12. 이식 후의 각막 상피 시트의 조직학적 특성 평가

다음으로, 이식 후 2주된 각막 상피 시트를 적출하고, 그 조직학적 특성을 검토하였다. 도 9에 각막 상피 시트의 HE 염색 사진을 나타낸다(우측은 확대도). 양막(기호*) 위에, 각막 상피와 마찬가지로, 세포가 규칙적으로 정렬 구성된 세포층을 확인할 수 있다. 이 세포층은 상층에 편평형의 세포가 많으며, 각막 상피와 매우 유사한 구조를 유지하고 있다.

도 10에 여러가지 케라틴에 대한 염색 시험의 결과를 나타낸다. 대체적으로, 이식 전의 각막 상피 시트와 동일한 염색성을 나타내었다. 즉, 표피 특이적인 케라틴1 및 10에 대한 염색성은 확인되지 않았으며(도 10, 좌측), 각막에 특이적인 케라틴3 및 12에 대한 염색성은 확인되었으며(도 10, 중앙), 또한 점막 특이적인 케라틴4 및 13에 대한 염색성도 확인되었다(도 10, 우측). 이상과 같이, 각막 상피 시트는 이식 후에도 각막 상피 특이적인 케라틴(케라틴3 및 12)을 유지하고 있는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 각막 상피 시트가 각막 상피로서 동일한 기능을 장기간에 걸쳐 발휘하고 있음을, 조직학적 측면에서 강력하게 지지하는 것이다.

실시예 2

<인간 세포를 이용한 하이브리드형 각막 상피 시트의 제조 및 평가>

상기 1-5.(구강 점막 상피 세포의 회수)에 기재된 방법과 동일한 방법으로 동의를 구한 후, 건강한 지원자에게서 인간 구강 점막 상피 세포 부유액을 제조하였다. 한편, 아이 뱅크(Northwest eye bank)에서 입수한 각막을 상기 1-6.(각막 상피 세포의 회수)에 기재한 것과 동일한 방법으로 처리하여, 인간 각막 상피 세포 부유액을 수득하였다. 이와 같이 제조한 인간 구강 점막 상피 세포 및 인간 각막 상피 세포를 상피를 제거한 인간 양막을 기질로 하여 3T3 세포와 공동 배양한 결과, 약 14일간의 배양(에어 리프팅 방법에 의한 3일간의 배양을 포함)에 의해 각막 상피형의 세포층이 형성되었다. 또한, 상피를 제거한 인간 양막의 제조 방법 및 3T3과의 공동 배양 조건도 상기 1-1.(양막의 수득) 내지 1-4.(양막 상피의 처리)에 기재한 바에 따랐다.

수득한 세포층의 형태, 조직, 면역 염색 등을 조사한 결과, 집토끼 동물 모 델 결과와 동일하였다. 즉, 제조한 하이브리드형 배양 세포층은 4-8층으로 중층화된 세포층을 형성하고 있으며, 표피에 특이적인 케라틴1 및 10에 대한 염색성은 관찰되지 않았으며, 각막에 특이적인 케라틴3및 12에 대한 염색성이 확인되었을 뿐만 아니라, 점막에 특이적인 케라틴4 및 13에 대한 염색성도 확인되었다. 이상의 결과로, 인간 구강 점막 상피 세포와 인간 각막 상피 세포를 사용한 경우에서도, 이들이 하이브리드함으로써 각막 상피형의 세포층을 형성할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 3

<양막 상피 세포를 이용한 하이브리드형 각막 상피 시트의 제조 및 평가>

상기 1-5.(구강 점막 상피 세포의 회수)에 기재한 방법과 동일한 방법으로 동의를 구한 후, 건강한 지원자로부터 인간 구강 점막 상피 세포 부유액을 제조하였다. 한편, 상기 1-1.(양막의 수득) 및 1-2.(양막의 처리)에 기재한 방법에 따라 인간 양막을 수득하였다. 그 후, 0.05% 트립신-EDTA 용액(GIBCOBRL 사)에서 15분간 처리하여, 상피 세포를 분리하였다(인간 양막 상피 세포 부유액). 이와 같이 제조한 인간 구강 점막 상피 세포 및 인간 양막 상피 세포를 상피를 제거한 인간 양막을 기질로서 사용하여 3T3 세포와 공배양한 결과, 약 14일간의 배양(Air-lifting 방법에 따른 3일간의 배양을 포함)에 의해 각막 상피형의 세포층이 형성되었다. 또한, 상피를 제거한 인간 양막의 제조 방법 및 3T3과의 공동 배양 조건은 상기 1-1.(양막의 수득) 내지 1-4.(양막 상피의 처리)에 기재한 바를 따랐다.

수득된 세포층의 형태, 조직, 면역 염색 등을 조사한 결과, 형성된 하이브리 드형 배양 세포층은 4-8층으로 중층화된 세포층을 형성하고 있으며, 표피에 특이적인 케라틴1 및 10에 대한 염색성은 관찰되지 않았고, 각막에 특이적 케라틴3 및 12에 대한 염색성과, 점막에 특이적인 케라틴4 및 13에 대한 염색성이 확인되었다.

이상의 결과로, 인간 구강 점막 상피 세포와 인간 양막 상피 세포를 사용한 경우에서도, 이들이 하이브리드화함으로써 각막 상피형의 세포층을 형성할 수 있는 것으로 확인되었다.

본 발명의 각막 상피 시트는 각막 상피와 매우 유사한 구조를 가지며, 이식 후의 생존성이 양호하다. 또한, 각막 상피가 그 기능을 발휘하기 위해서 필요한 경계 기능도 구비하고 있으며, 또한 투명도도 높다. 이와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 각막 상피 시트는 각막 상피를 재건하기 위한 이식 재료로서 매우 우수하다.

난치성 각결막 질환에 대한 외과적 재건 기술은 근래 비약적으로 진보하여, 양막 이식, 배양 각막 이식 기술의 등장에 의해 그 방법이 거의 확립되고 있다. 그러나, 난치성 각결막 질환의 대부분이 양안성의 질환 내지는 타인(이질성)의 조직 이식이므로, 수술 후 장기간에 걸친 면역억제제의 투여에 의한 거부 반응 억제나, 세균감염 예방을 위해 수술 후 관리를 엄격하게 수행하여야 하므로, 환자의 삶의 질(Quarity Of Life, QOL)을 현저하게 저하시킨다. 본 발명의 하이브리드형 각막 상피 시트를 이용한 이식 기술은 자가(auto) 세포를 포함한 조직에 의한 안구 표면 재건 기술이므로, 수술 후 면역억제제의 투여는 한정적이며, 또한 자가 조직 을 포함하여 그 생존율도 종래의 이질성 이식보다는 양호한 것으로 생각되어, 환자의 QOL을 현저하게 향상시킬 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명은 상기 발명의 실시예 및 실시예의 설명으로 전혀 한정되지 않는다. 특허청구범위의 기재를 이탈하지 않고, 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 범위내에 포함되는 여러가지 변형예도 본 발명에 포함된다.

본 명세서에서 인용한 논문, 특허 공개 공보, 및 특허 공보 등의 내용은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

Claims

자가 세포인 제1 세포와 상기 제1 세포와 유래가 다른 제2 세포를 포함하며;

중층화된 세포층을 포함하는 각막 상피 시트.
제 1항에 있어서,

상기 제1 세포는 구강 점막 상피 유래의 세포, 결막 상피 유래의 세포, 비강 점막 상피 유래의 세포, 기타의 점막 상피 유래의 세포, 및 이들 중 어느 하나의 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포로부터 유래된 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 자가 세포이고,

상기 제2 세포는 각막 상피 유래의 세포, 결막 상피 유래의 세포, 및 양막 상피 유래의 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 각막 상피 시트.
제 2항에 있어서, 상기 제1 세포는 구강 점막 상피 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 각막 상피 시트.
제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 제2 세포는 타인의 세포인 것을 특징으로 하는 각막 상피 시트.
제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포는 각막 상피 유래의 세포 또는 양막 상피 유래의 세포인 것을 특징으로 하는 각막 상피 시트.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 콜라겐층을 추가로 포함하며, 상기 콜라겐층 위에 상기 세포층이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 각막 상피 시트.
제 6항에 있어서, 상기 콜라겐층은 양막 또는 상피를 제거한 양막으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 각막 상피 시트.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포층은 하기의 성상 또는 특성 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 각막 상피 시트:

최표층의 세포가 각화되지 않음;

최표층의 세포가 편평형임;

경계(barrier) 기능을 제공함.
a) 자가 세포인 제1 세포와 상기 제1 세포와 유래가 다른 제2 세포를 각각 제조하는 단계;

b) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포를 콜라겐층 위에 접종하고, 배양하는 단계; 및

c) 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포가 증식하여 세포층이 형성된 후, 상기 세포층의 최표층을 공기와 접촉시키는 단계를 포함하는, 각막 상피 시트의 제조 방법.
제 9항에 있어서,

상기 제1 세포는 구강 점막 상피 세포, 결막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 기타의 점막 상피 세포 및 이들 중 어느 하나의 점막 상피를 구축할 수 있는 미분화 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 자가 세포이고,

상기 제2 세포는 각막 상피 세포, 결막 상피 세포 및 양막 상피 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10항에 있어서, 상기 제1 세포는 구강 점막 상피 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10항 또는 제 11항에 있어서, 상기 제2 세포는 타인의 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 10항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 세포는 각막 상피 세포 또는 양막 상피 세포인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)가 하기 중 어느 하나의 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조 방법:

1) 지지 세포의 공존하;

2) 지지 세포의 공존하에서, 지지 세포와 상기 콜라겐층 사이에 지지 세포가 통과할 수 없는 크기의 기공을 가진 격리 막이 존재하는 상태.
제 9항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라겐층은 양막 또는 상피를 제거한 양막으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 제조 방법.