CN101432031A - 结膜组织系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开描述了具有结膜细胞包括结膜干细胞的组织系统。所述结膜组织系统来自包含结膜细胞的分离组织，并且适于恢复眼表面损伤，特别是由受损或患病结膜所导致的损伤。所述组织系统是使用简便的单一培养基培养方案和支持材料例如人羊膜而产生的。产生的结膜组织系统适用于移植以治疗受试者受损或患病的眼睛的眼表面。

Description

结膜组织系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年2月24日提交的印度申请No.267/MUM/2006的临时提交日的权益，其全部内容以参考的方式并入本文。

发明背景

技术领域

本发明公开涉及组织系统、产生组织系统的方法和使用包含结膜细胞的组织系统恢复受损或患病的眼表面的治疗方法。本发明公开的组织系统包括哺乳动物结膜细胞，优选地是来源于结膜的穹窿区域的祖结膜细胞(progenitor conjunctival cell)。本发明特别涉及在受控的培养条件下在合适的支持材料例如羊膜上培养祖结膜细胞。

背景技术

干细胞负责生物体一生中的细胞替代和组织再生。干细胞是产生特化细胞的非特化细胞，并且具有广泛的增殖潜能。取决于干细胞的类型，这些细胞可以分化成多种细胞谱系(cell lineage)和/或在移植中重构组织。胚胎干(ES)细胞是具有无限自我更新和多能性的典型干细胞，来自囊胚期胚胎的内细胞团。成体干细胞是特化的未分化干细胞，在出生后的成体阶段保持在生物体内替换细胞和再生细胞的能力。通常认为，与ES细胞相比，成体干细胞的自我更新能力较低，尽管它们可以分化成多种细胞谱系，但不是通常所说的多能性。细胞治疗有可能用于治疗与细胞功能失常或损伤相关的任何疾病，其包括但不局限于操作干细胞(无论是ES细胞或者成体干细胞)的潜能以修复或者替代患病的或者受损的组织。这种潜能极大地振奋了科学、医疗和生物技术领域。

已经在成体的多种组织中发现成体干细胞(也称为“组织特异干细胞”)，包括骨髓(Weissman，Science 287：1442-1446，2000)、神经组织(Gage，Science287：1433-1438，2000)、胃肠组织(Potten，Phil Trans R Soc Lond.B.353：821-830，1998)、表皮组织(Watt，Phil Trans R Soc Lond.B.353：831，1997)、肝脏组织(Alison and Sarraf，J Hepatol.29：678-683，1998)以及间充组织(Pittenger et al.，Science 284：143-147，1999)。在哺乳动物眼睛的角巩膜缘中发现的成体干细胞是维持健康眼表面所必需的，并且其参与健康眼和角膜表面的动态平衡。

眼睛的表面由角膜、结膜和两者之间的边缘构成，该边缘称为角巩膜连接或膜缘。视觉表面具有两个基本的上皮表面，即角膜上皮和结膜上皮。结膜是从粘膜皮肤连接延伸的2-3层的上皮，开始于眼睑内表面的睫毛，覆盖于眼睛周围而终止于膜缘。已经发现连续替换结膜上皮的干细胞位于结膜穹窿中。Wei et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci.34：1814-28，1993。已知位于巩膜和眼睑之间的穹窿连接处的结膜的最上端和最下端区域的干细胞是结膜干细胞或祖结膜细胞。

结膜的一个主要功能是通过产粘蛋白的杯状细胞所产生的泪液提供眼表面的水化和润滑，所述产粘蛋白杯状细胞是高度特化的上皮细胞，其散布在结膜上皮细胞之间。粘蛋白是主要由结膜中的杯状细胞分泌的高度糖基化的蛋白质。由杯状细胞分泌的眼粘蛋白的水平影响结膜表面的完整性。产生粘蛋白是结膜细胞的主要特性。多层的成层结膜上皮和散布的杯状细胞的连续再生，维持了眼表面的功能完整性(Kessing，SV，Acta Ophthalmol 44：439-453，1996；Lemp，et al.，Arch Ophthalmol.83：89-94，1970)。

在碱灼伤(alkali burns)、化学和热灼伤(chemical and thermal burns)、斯-约综合征(Stevens-Johnson syndrome，SJS)、神经营养性角膜炎(neurotrophickeratitis)和眼瘢痕性类天疱疮(Ocular Cicatricial Pemphigoid，OCP)中检测到粘蛋白的缺损(deficiency)。参见Gilbard and Rossi，Ophthalmol.97：308-312，1990；Lemp，Int Ophthalmol Clin.13：185-189，1973；Tseng et al.，Ophthalmol.91：545-552，1984。结膜也提供了光滑湿润的细胞表面以支持角膜表面上的泪膜，该泪膜转而产生了光学澄清的视觉表面和清晰的视野。因此，结膜维持角膜上皮的健康。因为角膜上皮维持清晰的视野依赖于健康的结膜上皮，因此许多眼表面疾病都伴随结膜损伤开始，然后继发次生膜缘角膜损伤。成层的上皮是自我更新的组织，处于持续的重构，是终末分化的表层细胞的连续损失所必需的，并由基底细胞增生所平衡。因此，为了维持健康的上皮结构，必须始终维持细胞增生和分化之间的关键性平衡。

组织培养技术已经被广泛应用于成层的上皮(如表皮和角膜)以开始鉴定那些在角化细胞增殖和成熟期间十分重要的因子。该领域中的研究者们使用培养的兔和牛结膜上皮细胞，并且开发出几种用于正常人结膜角化细胞培养的模型。使用含培养基的血清(有时还含成纤维细胞饲养层)，已在来自尸体眼睛的长期培养物中繁殖出初级人结膜角化细胞。(Lindberg K，Brown ME，Chaves HV，Kenyon KR，Rheinwald JG.In vitro propagation of human ocularsurface epithelial cells for transplantation.Invest Opthalmol Vis Sci.1993；34：2672-2679.Tsai RJ，Ho YS，Chen JK.The effects offibroblasts on the growthand differentiation of human bulbar conjunctival epithelial cells in an in vitroconjunctival equivalent.Invest Opthalmol Vis Sci.1994；35：2865-2875)。

在眼损伤的临床实践中，通过将球结膜和穹窿结膜划分成象限并确定有关的区域来确定结膜损害。球结膜和穹窿结膜的损伤被认为对眼损伤或眼疾病后的最终结果很重要。Argueso et al.，Invest Ophthalmol Vis Sci.43：1004-1011，2002；Dua et al.，Br J Ophthalmol.845：1379-1383，2001；Pfister，Ophalmology 90：1246-53，1983。例如在4、5和6级眼灼伤中，其中存活的角膜和结膜上皮薄到完全为零，理想的眼处理是通过接连重建角膜和结膜上皮两者来尝试可恢复的、重建式的干预(参见Dua，Br J Ophthalmol.82：1407-11，1998)。在Nakamura et al.，Invest Ophthamol Vis Sci 44(1)：106-116，2003中，通过将培养的缘干细胞转移到具有良好预后的人羊膜(human amnioticmembrane，HAM)上来试图重构角膜环境(mileu)。也参见Shimazaki et al.，Ophthalmology 109(7)：1285-1290，2003；Tseng et al.，Arch Ophthalmol.116：431-41，1998；Koizumi et al.，Ophthalmology 108(9)：1569-1574，2001。文献中也有报道关于结膜自体移植和在HAM中培养球和穹窿区域的祖细胞(参见Grueteterich et al.，Surv Ophthalmol.48(6)：631-46，2003；Wei et al.，InvestOphthalmol Vis Sci 34：1814-1828，1993)。

对于结膜组织的替代物(conjunctival tissue equivalents)，美国专利号7,049,139公开了使用3种不同的培养基以多步骤程序(multiple-step process)在HAM上培养结膜细胞，来产生结膜组织的替代物。用于产生该组织替代物的3个不同的步骤包括在初级培养基、增殖培养基和分化培养基中培养结膜细胞。所公开的3种培养基类型中的2种包括霍乱毒素作为培养基的成分之一。作为有效的致癌物，霍乱毒素能引起对眼睛的刺激。多步骤程序用以增强该组织替代物用于临床移植的稳定性。研究了移植体在移植到几个具有不同结膜表面病症的患者之后，在无血清条件下培养HAM上的结膜组织替代物的功效。研究了上皮形成和移植体的完整性。Tan et al.，Transplantation77(11)：1729-1734，2004。也可参见Ang et al.，(2004)Invest Ophthalmol Vis Sci45(6)：1789-1795。该专利描述了3个步骤，即培养、增殖和分化，并且每一步使用了不同的培养基。用于分化的培养基包括高浓度钙和霍乱毒素。

多数对组织替代物或组织系统的研究集中在重构产生原组织的结构和功能特性的组织替代物的能力。其已通过分化培养细胞而实现，例如通过改良培养条件和气升(air-lifting)。终末分化的细胞具有有限的长期增殖能力，然而其在移植后产生更低的再生潜能。另外，使用上皮组织结构体用于眼表面移植需要细胞充分粘附到下层基质(substrate)上，使得这些细胞在外科移植期间或之后不被直接的机械或剪切力所蜕去。因此，需要一种精细的平衡以保护移植细胞的增殖潜能，而同时确保移植细胞具有组织器官的必要功能性特征。理想的组织结构体是其转移的细胞具有用于细胞更新和组织替换的长期再生能力的组织结构体。

尽管可通过常规方法来移植已开发的组织替代物，例如将移植体缝合到眼睛上，但这会引起受者的不适。而且，缝合需要比缝合少的方法有更高的精确度，因为患病或受损眼睛的位点不是清晰可视的。另外，此类移植经常在位点留下疤痕。因此，少量缝合的移植相对传统方法是优选的，需要其他技术或者能够粘附到移植位点而不需要缝合的基于细胞的膜递送系统。Pfister and Sommers，Cornea 24(5)：593-598，2005，发现血纤蛋白粘合剂单独可将角膜干细胞移植体黏附于膜缘壁上。

对于更合适的结膜组织替代物的需求，本发明所公开的内容描述了具有长期再生能力的组织系统，用于眼表面受损或患病组织的细胞更新和替换。本发明所公开的结膜组织系统的具体优点是其包括比较简便的培养方案，其中其使用了单一培养基用于培养、扩展和分化，并且其避免使用毒素，例如霍乱毒素和高浓度钙。培养单一阶段的细胞是容易的，并且可在人临床试验前，在cGMP设备中将污染问题最小化，并且也可通过使用少量缝合方法而引入到眼表面。

发明概述

本发明描述了包括结膜细胞的组织系统以及用于制备这种结膜组织系统的方法，所述结膜细胞培养在合适的支持材料上，例如生物相容性膜或者胞外基质。在优选的实施方案中，将所述结膜细胞培养在羊膜上，例如人羊膜(HAM)，以产生所述结膜组织系统。优选地，本文所公开的结膜组织系统是眼表面上的结膜组织的替代物。令人吃惊的是，通过在单一培养基中培养结膜活组织而制备的本文所公开的结膜组织是十分稳定的、成层的、粘附的，其可用于临床移植。优选地，所述稳定的结膜组织系统在被引入到受者的眼睛后不太可能破裂分离，从而提高了该方法的临床成功程度，并且减少了受者的恢复时间。

制备结膜组织系统的方法包括单一培养基以培养结膜细胞，从而提供产生所需结膜组织系统的简便体系。在优选实施方案中，单一步骤培养基能够产生包含结膜细胞的多层组织系统。优选地，所述结膜组织系统具有成层的鳞状上皮，其包括多层结膜细胞。在另一个优选实施方案中，所述结膜组织系统包括多层结膜细胞，由一个或多个在每一层的相邻细胞之间形成的细胞桥粒所连接。所述结膜组织系统也可包含顶端微绒毛、细胞间连接和/或正常的细胞骨架。在其他优选实施方案中，利用简便的培养方案，通过在支持材料(例如HAM)上，用载玻片培养结膜细胞，来产生所述结膜组织系统。

如在本文中使用的，结膜细胞可以是祖结膜细胞、分化的结膜细胞或者这两种细胞类型的任何组合。在某些实施方案中，所述组织系统包含祖结膜细胞，其中在组织系统中，至少约20-90％的细胞是祖结膜细胞。优选地，所述组织系统包含最多约20％的终末分化的细胞。在本发明所公开内容的其他实施方案中，将所述结膜组织系统移植到眼表面的损伤或患病的位点，例如结膜，以治疗和/或恢复该位点处的结膜表面。在某些实施方案中，被移植的细胞从移植位点迁移到受者的细胞表面，这有助于眼表面的治疗和恢复。在其他实施方案中，使用结膜组织替代物的治疗解决了潜在的疾病和/或维持了结膜的上皮形成，同时没有显著的并发症。优选地，根据需要维持所述结膜组织系统的完整性，并且在手术后保留完好的上皮形成。首选的临床结果是被治疗的眼睛有良好的功能性和美容性结果。

在各种实施方案中，在所述组织系统中发现的结膜细胞表达一种或多种干细胞标记基因，例如Oct-4。优选地，在所述结膜组织系统中，约30-35％的细胞是Oct-4阳性的。在其他实施方案中，所述结膜组织系统包括对于细胞角蛋白标记例如是AE1、AE3、细胞角蛋白-4(K4)、细胞角蛋白-7(K7)和细胞角蛋白-19(K19)是阳性的结膜细胞。角蛋白是由上皮细胞表达的中间丝胞质蛋白质家族。细胞角蛋白AE-1和AE-3是上皮细胞的特征性中间丝蛋白质的标记。细胞角蛋白K4是非角化的、成层上皮的标记。在某些实施方案中，所述结膜组织系统包含对于粘蛋白标记例如MUC5AC和MUC4是阳性的结膜细胞。在其他实施方案中，在所述组织系统中的细胞表达细胞特异的标记，例如P63。使用一种或多种上述标记，本发明所公开的内容也提供了组织系统中结膜细胞的分子和细胞特性。在一些实施方案中，所述结膜系统组织中约1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％的细胞表达AE1、AE3、K4、K7和/或K19。优选地，本发明所公开内容中的结膜组织系统也包含杯状细胞。在所公开组织系统中的杯状细胞密度可以是约2.5±1.1个杯状细胞/100个细胞。在本发明公开内容的优选实施方案中，所述组织系统包含存活的祖结膜细胞，例如在所述组织系统中约2-2.5百万个细胞。取决于受者的需求，可以增加或者减少组织系统中祖结膜细胞的数目。根据患者的需求，细胞密度范围在1×10⁶、1.5×10⁶和2×10⁶-2.5×10⁶个细胞每培养物之间变化。

在各种实施方案中，本发明所公开的内容提供了包括用于递送结膜细胞的支持材料的组织系统。所述支持材料也可包括合适的生物相容性膜，例如羊膜(如HAM)。本发明公开的组织系统优选地包括在生物相容性膜上培养结膜细胞，所述生物相容性膜适用于眼睛，并且不干扰正常的创伤愈合过程。

尽管使用本领域中熟知的方法可将本文公开的结膜组织系统移植到眼睛的合适位点，但本发明所公开的内容也描述了用于将组织系统递送到受试者眼睛的非缝合方法。在本发明公开的内容中，术语“受试者”、“患者”和“受者”可交换使用。在优选的实施方案中，所公开的内容提供了用于将结膜组织系统递送到受试者眼睛的眼表面的非缝合递送方法。在某些实施方案中，所述组织系统使用组织粘合剂或者生物相容性胶用于将本发明公开的组织系统粘合到受者的眼睛上。在一些实施方案中，生物相容性胶包括Amcrylate或血纤蛋白密封胶。在优选的实施方案中，生物相容性胶是无菌的组织粘合剂，其选自聚乳酸、聚乳酸乙醇酸(polylactic glycolic acid)、聚乳酸和丙烯酸酯的共聚物，以及它们的任何组合。在其他实施方案中，生物相容性胶包括对受试者的眼睛是生物相容性的任何粘合剂。生物相容性胶使用是干净、轻便的，并且比缝合更安全，因此可以将培养的结膜移植体以对受者眼睛最小干扰的方式置于受伤处，同时保持至少一部分移植细胞的完整性。

附图说明

以下附图构成本发明的部分，并且并入本文以证实和表明本发明公开的重要方面。通过以下附图结合本文中具体实施方案的详细描述能够更好地理解本发明。

图1：在HAM上的结膜细胞培养物的表征。图1A显示了长出HAM的结膜细胞的3天期培养物。图1B显示了HAM上的细胞的14天期汇合培养物。图1C显示了在培养物切片上用细胞角蛋白AE-1进行的免疫荧光染色。图1D显示了在培养物切片上用细胞角蛋白AE-3进行的免疫荧光染色。图1E显示了20天期培养物整体装片的PAS染色。PAS将杯状细胞染成洋红色。

图2：MUC5AC和MUC4在结膜组织系统和结膜活检中的表达。分别用MUC5AC(103bp)(第3、7泳道)和MUC4(102bp)(第4、8泳道)标记对结膜培养的细胞和结膜活检进行RT-PCR分析。泳道1是1Kb的DNA长度标记；泳道2和6分别是培养的结膜细胞和结膜活检的GAPDH(管家基因)。泳道5是反应混合物中无cDNA添加的阴性对照。

图3：化学损伤产生和移植的兔模型，显示受损、移植和愈合。图3A显示了兔的正常眼睛。图3B显示了置于兔的结膜上的饱和的NaOH滤纸。图3C显示了就在移植前的损伤位点。图3D和3E显示了移植后的位点。图3F显示了产生并损伤的对照眼睛，显示了受伤的踪迹。图3G显示了愈合的损伤处。

图4：评估移植对损伤的作用，并检测体内保留的和存活的人细胞。图4A显示了用PAS染色的正常兔结膜切片(以检测杯状细胞)。杯状细胞染为洋红色。图4B显示了损伤位点，其显示没有杯状细胞并且上皮蜕去。图4C显示了当仅将HAM移植到眼睛上时，没有眼睛上皮的创伤愈合。图4D显示了只有损伤处但没有移植体的眼睛的创伤愈合。图4E显示了在移植了具有经培养的结膜细胞的组织系统后，损伤位点的苏木精和伊红(H&E)染色。图4F显示在移植位点移植的人和兔细胞的PAS染色。图4G和4H显示在移植位点检测到的抗人线粒体抗体阳性的褐色人细胞。图4I表示迁移至兔结膜上皮下区域的人细胞。

发明详述

本发明所公开的内容针对治疗由受损或者疾病造成的结膜上皮破坏的新型方法，该方法通过使用包含结膜细胞的组织系统来治疗，所述结膜细胞是祖结膜细胞、分化的结膜细胞或其组合。优选地，所述结膜组织系统也包括杯状细胞，其特征在于形状为椭球形并且包含含有粘蛋白的大分泌颗粒。本发明所公开的内容特别描述了结膜组织系统的分离、扩展和产生。在优选的实施方案中，所述结膜组织系统恢复受者结膜组织系统的功能完整性。优选地，本文所公开的结膜组织系统是使用简便的单一步骤方法，从包含结膜细胞(例如活检或外植体)的组织中培养的，其中离体扩展所述细胞以形成结膜组织替代物。令人惊奇的是，该方法能够产生具有临床移植体所需稳定性的组织培养物。例如，所述结膜组织系统包含细胞-细胞和细胞-基质(cell-to-substrate)的粘合结构，其保证了在手术操作和移植后的结构完整性。所述单一步骤方法优选使用能够支持细胞在结膜活检或外植体中长出、结膜细胞(包括祖结膜细胞)的扩展以及可用于治疗患病或受损结膜的组织系统的形成的培养基。在某些实施方案中，所述单一步骤方法也支持组织系统内细胞的适当水平的终末分化。另外，本发明公开描述了使用组织粘合剂或生物相容性胶将结膜组织系统递送至患者眼表面的新型方法。

在优选的实施方案中，本发明公开的结膜组织系统用于治疗性处理具有眼受损或疾病特别是结膜的眼表面损害的受试者。对眼睛的受损可以是由受伤或外伤所造成的。如在本文中所用的，“结膜组织系统”是包含在合适支持材料上的结膜细胞的细胞群，优选适用于移植至哺乳动物受试者。优选地，本文所公开的结膜组织系统是眼表面结膜组织的替代物。在优选的实施方案中，所述组织系统是具有细胞的多层集合体的移植体，例如手术移植体或合成移植体。术语“移植体”、“移植的”、“经移植的”或“移植”在本文中与术语“植入体”、“植入的”、“经植入的”、“植入”、“嫁接”、“经嫁接的”或“嫁接的”可交换使用。尽管结膜细胞，无论是祖细胞还是分化的细胞，可从任何合适的哺乳动物中获得，但人组织是特别优选的来源。

本文所公开的结膜组织系统可用于治疗具有结膜受损或疾病的受试者，例如通过恢复眼表面的水化和润滑。在优选的实施方案中，所述结膜组织系统恢复受伤或患病位点处产生粘蛋白的杯状细胞，从而通过流泪改善润滑。优选地，所述结膜组织系统可在受试者中发挥作用从而恢复光滑而湿润的细胞表面，以支持角膜表面的泪液膜，从而改善视力。在优选的实施方案中，所述结膜组织系统能够恢复支持角膜上皮的健康结膜。因此，本文所公开的结膜组织系统不仅能够用于治疗受损或患病的结膜上皮，也能够预防继发的角膜和膜缘受损，从而有力地预防继发性膜缘干细胞缺损(deficiency)。使用本文所公开的结膜组织系统的治疗优选产生很小或者没有新血管形成、慢性炎症、复发性上皮缺损或间质结疤。

在优选的实施方案中，本文所公开的结膜组织系统能够用于治疗碱灼伤、化学和热灼伤、斯-约综合征(SJS)、神经营养角膜炎、眼瘢痕性类天疱疮(OCP)、眼睛外科手术例如翼状息肉切除(pterygium excision)、青光眼手术(例如小梁切除术(trabeculectomy surgery)和切割术(section surgery))、视网膜脱落(retinal detachment)和斜视手术(squint surgery)之后的结膜重建、结膜痣(conjunctival nevus)、永久性泄漏小梁疱疹(persistent leaking trabeculectomyblebs)、前膜缘角膜结膜炎(superior limbic keratoconjunctivitis)，以及其他结膜受损的眼表面病况或受伤。所述结膜组织系统也用于治疗粘蛋白缺损的位点。在特定的实施方案中，本文所公开的结膜组织系统用于质粒眼表面病况的治疗性应用可与第二种治疗性处理相结合，以治疗角膜受损和/或膜缘干细胞缺损，例如在U.S.No 11/043,019所公开的内容，其通过引用将其全文并入本文。通过改变时间周期，如日、星期、月或年，所述结膜组织系统的治疗性应用可先于膜缘干细胞缺损的任何治疗性处理。

“结膜祖细胞”、“祖结膜细胞”和“结膜干细胞”在本文中可交换使用，并且是眼结膜的祖细胞和干细胞。已经发现结膜祖细胞的定位和分布是在小鼠和兔的结膜穹隆区域(Diebold et al.，Graefes Arch Clin Exp Opthalmol235：268-276，1997；Pellegrini et al.，J Cell Biol 145(4)：769-782，1999)。这些祖细胞似乎主要发现于巩膜和眼睑之间的弯曲连接处的结膜的最顶端和最低端区域。也认为散布于结膜表面上结膜上皮细胞之间的生产粘蛋白的杯状细胞也来自于结膜祖细胞。

在优选的实施方案中，结膜组织系统包含祖结膜细胞，其中在所述组织系统中至少约20％-90％的细胞是祖结膜细胞。优选地，所述祖结膜细胞包含至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的组织系统中的细胞。在其他实施方案中，结膜组织系统包括不多于约20％的终末分化的细胞。优选地，结膜组织系统包含最多约50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％的终末分化的细胞，其包括但不限于分化了的结膜细胞。

在各种实施方案中，在组织系统中发现的结膜细胞表达一种或多种干细胞标记基因，例如Oct-4、p63、连接蛋白43(Connexin 43)。优选地，所述结膜组织系统包含约10-20％、20-30％、30-35％、40-45％或45-50％的Oct-4阳性细胞。在其他实施方案中，组织系统中的结膜细胞是角蛋白标记(如AE1、AE3、K4、K7和K19)阳性细胞和粘蛋白标记(如MUC5AC和MUC4)阳性细胞。在某些实施方案中，结膜组织系统中约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的细胞是AE1阳性细胞、AE3阳性细胞、K4阳性细胞、K7阳性细胞、K19阳性细胞、MUC5AC阳性细胞、和/或MUC4阳性细胞。在优选的实施方案中，结膜组织细胞包含约75-80％的P63阳性细胞，以及约30-35％的Oct-4阳性细胞。在其他实施方案中，组织系统中的细胞表达一种或多种细胞特异的标记，例如P63、oct-4、连接蛋白43、ABCG2(Budak MT，Alpdogan OS，Zhou M，Lavker RM，Akinci MA，Wolosin JM.Ocular surfaceepithelia contain ABCG2-dependent side population cells exhibiting featuresassociated with stem cells.J Cell Sci.2005 Apr 15；118(Pt8)：1715-24)。优选地，结膜组织系统包含约40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％的P63阳性细胞。P63和Oct-4是祖结膜细胞的标记，这些标记在培养的细胞中出现表明是祖细胞和分化细胞的混合群体，其在优选的范围内，在组织系统中产生不多于约20％的终末分化的细胞。

在本发明公开的优选实施方案中，结膜组织系统包含杯状细胞。杯状细胞在所公开的组织系统中的密度是每100个细胞有约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5或5个杯状细胞。在某些实施方案中，组织系统包含约0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多的杯状细胞。在本发明公开的优选实施方案中，组织系统包含存活的祖结膜细胞，例如在组织系统中约2.0-2.5百万个细胞的范围内。在其他实施方案中，组织系统中祖结膜细胞的范围是约0.5-1.0百万个细胞、1.0-1.5百万个细胞、1.5-2.0百万个细胞、2.5-3.0百万个细胞或者3.0-3.5百万个细胞。在组织细胞中存在的祖细胞结膜细胞的数量依赖于受者的需求而升高或者降低。优选地，组织系统包含约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的存活的祖结膜细胞。在一些实施方案中，结膜组织系统包含约1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％或50-55％的K4阳性细胞。在其他实施方案中，结膜组织系统包含约1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％或50-55％的K7阳性细胞。在其他实施方案中，所述结膜组织系统包含约1-5％、5-10％、10-15％、15-20％、20-25％、25-30％、30-35％、35-40％、40-45％、45-50％或50-55％的K19阳性细胞。优选地，结膜组织系统不包含或者只包含低百分比的表达角蛋白K12的细胞。在其他实施方案中，本文所公开的结膜组织系统是透明的并且在其表面没有角质纹状体(cornifiedstriatum)。优选地，结膜组织系统如果包含表达细胞角蛋白K3的细胞，也是少量包含，细胞角蛋白K3是角膜特异的细胞角蛋白(Schermer et al.，J CellBiol 103：49-62，1986)。

在所述组织系统中存在大量或者高百分比的结膜组细胞明显有助于所述组织系统在移植至哺乳动物受试者之后恢复受损或患病眼表面的能力。另外，组织系统中高比例的结膜祖细胞通过用存活的结膜祖细胞连续重构眼表面使得该系统在更长的时间内是稳定的，所述存活的结膜祖细胞对于眼表面的健康机能是必须的。在某些实施方案中，组织系统是包含胞外基质例如羊膜(例如HAM)的复合移植体，其具有大量的结膜祖细胞和终末分化细胞，其中在胞外基质上离体培养大量的结膜祖细胞。在其他实施方案中，所述组织系统包含生物相容性多聚体上的结膜细胞。在其他实施方案中，使所述结膜细胞在能够支持上皮组织的人工基质上生长。优选地，所述基质用于支持结膜细胞的生长和所述组织系统的形成，促进组织成层。在某些实施方案中，所述基质也支持终末分化。在优选的实施方案中，用于产生膜组织系统的结膜细胞供体也可以是组织系统移植体的受者(即，自体组织系统)。可选地，所述结膜组织活检供体可以不是结膜组织系统的受者(即异源组织系统)。在异源组织系统中，优选的供体是生物相容性供体，例如是受者的近亲，或者所述活检也可来自生物相容性(例如组织相容性)尸体(即，同种异源组织系统)。为了避免组织排斥的问题，通常需要移植的细胞或组织与移植体的受者是遗传上相同的。

为了产生本文所公开的组织系统，首先必须收集或分离包含结膜细胞的活检，可选地，通过本领域技术人员已知的方法分离结膜细胞。用于产生组织系统的结膜组织分离自任何合适的哺乳动物，其中人组织是特别优选的来源。例如，结膜组织分离自人眼的穹窿区域，例如穹窿结膜。优选地，从这种分离的组织中培养结膜祖细胞。根据本文所公开的方法产生的组织系统适用于移植至受者，特别是1只或两只眼睛中具有粘蛋白缺损或者其他受伤或疾病的受者。在其他优选的实施方案中，受者和供体是同一个。

使用结膜组织作为产生本文所公开的组织系统的来源的一个优点是从供体获得结膜组织是相对容易的。另一个优点是活检的获取会对造成任何后续角膜或膜缘受损的风险最小。该过程只需要少量的手术，并且是安全、简便而有效的，并且只需要少量的结膜组织活检。在无菌和经局部麻醉条件下进行该过程。优选地，所述活检分离自高至结膜上穹或低至结膜下穹。这些位置提供了最大密度的祖结膜细胞。从例如进行鼻翼状息肉(Girolamo et al.，Br Ophthalmol.83：1077-1082，1999)或白内障的常规手术的患者获得人结膜活检样品。为获得活检，从距离膜缘10-15mm处的前球体区域摘取小块正常结膜(例如1×3mm大小)。也可得到另一个相似体积的活检以提供另外的、备选的结膜细胞来源。例如在移植至所述组织系统之前的2周或2周以上，收集结膜活检以产生所述结膜组织系统。分离活检之后，将下面的基质切除，然后将活检置于转移培养基中，送到制备组织系统的实验室。

从供体除去包含结膜细胞的组织后，必须将其转移到例如设备中，使得所述活检能够经培养产生本文所公开的组织系统。重要的是在转移期间保持足够比例的活检存活，从而能从其中得到组织系统。经设计用于维持细胞生存力的转移装置的实例公开于美国申请11/385,017中，通过引用将其并入本文。优选地，将所述活检转移或保存在支持该活检生存力的培养基中。应当在收集后尽快处理所述结膜组织活检。所述活检可以以完整的外植体来培养，或者在置于培养基之前切成几个小片或小块。在优选实施方案中，合适的支持材料有助于所述组织活检中的结膜细胞的结合，从而有助于所述结膜细胞的生长。在一个实施方案中，将活检从转移容器中移取后，置于PBS中。使用精制的镊子和解剖刀，将所述结膜活检切成多个小片(例如外植体)，例如大小为0.5mm。随后将外植体置于支持材料上进行培养，并小心地浸入培养基中。当用羊膜例如HAM作为支持材料时，将外植体置于羊膜的基膜这一面。随后定期更换培养基，小心不要移出外植体。使来自所述外植体的细胞生长，直到在支持材料上汇合，这通常是在培养几天之后。

在产生组织系统的上述方法的优选实施方案中，将结膜组织培养于支持结膜细胞优选结膜祖细胞生长的培养基中。在优选实施方案中，将分离的结膜细胞在单一培养基中培养、扩展并分化，从而避免了复杂的培养基成分和涉及培养基转移的步骤。优选地，培养基使用非致癌、非刺激性成分。培养基优选维持所述活检中结膜细胞的生存力和增殖，以及祖结膜细胞的分化能力。培养基也优选支持结膜细胞例如祖结膜细胞的优先生长。在某些实施方案中，培养基也可包含促进细胞分化以表达上皮细胞表型的因子。本文所公开的、用于制备结膜组织系统的培养方法避免使用任何饲养细胞或饲养层。

在优选的实施方案中，通过用于培养、扩展和分化结膜细胞的单一培养基来获得本发明公开的组织系统。本文公开的、用于产生所述结膜组织系统的程序优选产生适宜移植的组织系统形式的大量结膜细胞。所述结构有序的结膜组织替代物通常包含多层排列的结膜细胞，优选具有散布在所述结膜细胞中的杯状细胞。可使用任何本领域技术人员已知的适宜基础培养基来生成培养所述结膜组织系统的培养基。用于培养所述结膜组织的优选培养基是达尔伯克改良必需培养基(Dulbecco’s Modified Essential Medium，DMEM)、DMEM:F-12(1:1)培养基或者Ham’s F-12(1:1)培养基(Ham’s F-12(1:1)medium)，优选地补充了营养血清，例如提供有效维持细胞生长和生存力的营养物质的血清或基于血清的溶液(例如敲除血清(knock-out serum)、热灭活人血清、人脐带血血清、人血清白蛋白)。培养基中营养血清的优选百分比是约0.5％-25％，更优选约15％-20％。

也可向培养基中补充生长因子。如本文所用的，术语“生长因子”是指与细胞表面的受体结合其主要结果是活化细胞增殖和分化的蛋白质。优选地，用于在任何阶段培养所述结膜细胞的生长促进试剂是人来源的或人重组来源的。用于培养结膜组织的优选生长因子选自表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)(例如，人EGF、重组人EGF)，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰岛素、亚硒酸钠或人运铁蛋白，及其组合。各种生长因子的优选浓度如下：(1)约5-15ng/ml EGF，更优选约10ng/ml EGF，(2)约2-10ng/ml bFGF，更优选约4ng/ml bFGF，(3)约1-10μg/ml胰岛素，更优选约5μg/ml胰岛素，(4)约1-10μg/ml运铁蛋白，更优选约5μg/ml运铁蛋白，(5)约1-10μg/ml亚硒酸钠，更优选约5μg/ml亚硒酸钠，以及(6)约1-10μg/ml氢化可的松，更优选约0.5μg/ml氢化可的松。

优选地，培养基还包含抗生素，例如青霉素、链霉素或其组合。对于在所述培养基中所用的抗生素，抗生素或多种抗生素的混合物优选地包含约40-60IU/ml的青霉素、约40-60μg/ml的链霉素、约40-60μg/ml的庆大霉素、和/或约40-60ng/ml的两性霉素B。在某些实施方案中，培养基包含50U/ml的青霉素-链霉素。在其他实施方案中，组织系统使用不包括致癌物质的培养基成分，例如霍乱毒素等等，其可导致眼睛刺激。

在某些实施方案中，培养基可包含DMEM或DMEM：F-12，还添加有营养血清，例如胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、人血清白蛋白或人脐带血血清。优选地，所述培养基添加有一种或多种可溶解因子，例如0.1％二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、10ng/ml重组人表皮生长因子(rhEGF)、5μg/ml胰岛素、5μg/ml亚硒酸钠、5μg/ml运铁蛋白、5μg/ml氢化可的松、4ng/ml bFGF和一种或多种抗生素。在其他实施方案中，用于制备组织系统的培养基，包括用于转移结膜组织活检的培养基、用于培养活检的培养基和用于转移组织系统的培养基，不包含非人类动物来源的任何血清或其他因子。这有助于使异种组分污染所述组织系统的风险最小化，从而使所述组织系统对人类施用更安全。

在某些实施方案中，将结膜组织培养于合适的支持材料上，例如胞外基质或其他生物相容性多聚物，其可具有生物涂敷的表面，例如胞外基质载体或生物涂敷的皮氏培养皿(Petri dishes)。优选地，所述胞外基质是羊膜，更优选地是HAM。支持材料涂敷有一种或多种粘附因子，包括但不局限于纤维蛋白原、层粘连蛋白、胶原蛋白IV、腱生蛋白、纤连蛋白、胶原、牛垂体抽提物、EGF、肝细胞生长因子、角化细胞生长因子、氢化可的松或其任意组合。在其他实施方案中，将支持材料置于硝酸纤维素滤纸上以促进产生结膜组织系统自身。硝酸纤维素薄膜也对所述结膜组织系统提供了另外的支持。当所述支持材料是羊膜时，可将其置于基膜一面朝上的硝酸纤维素滤纸上。在使用前，将所述膜与分散酶(dispase)一起温育，以协助除去任何羊膜上皮细胞，该上皮细胞能够干扰随后的结膜细胞生长。

优选地，支持材料具有近似天然眼表面的特性，这些特性包括但不局限于清晰、薄、有弹性、生物相容性、无血管和/或无抗原性。另外，支持材料优选支持结膜细胞的生长，无论是祖结膜细胞或分化的结膜细胞，并支持移植后的正常分化和/或整合。在其他的优选实施方案中，支持材料在组织系统移植之后，将在体内逐渐地被吸收。另外，支持材料优选是无抗原性的。

羊膜，特别是HAM，对于培养活检的结膜组织和产生本文所公开的组织系统是优选的。制备人羊膜的方法是本领域技术人员熟知的(参阅例如美国专利号6,152,142，和Tseng et al.，(1997)Am.J.Ophthalmol.124：765-774，通过引用将每一篇并入本文)。所述羊膜可使用完整的上皮表面，或者剥离的上皮细胞。例如，以如下方法制备羊膜以增强结膜细胞的生长，通过冻融、酶促消化和/或机械刮擦来去除内源羊膜上皮细胞，其后用生长因子、胞外基质混合物和/或粘附增强分子来处理表面。羊膜是产生组织系统的优选基质，因为其是有助于结膜细胞生存力和生长的天然基质。在一个实施方案中，将基膜或间质这一面向上的羊膜光滑地附着在用于培养结膜细胞的培养平板上。从能够粘附眼睛和协助呈现经培养的细胞的材料中选择生物相容性膜。

在其他实施方案中，将所述结膜组织系统培养在合适的支持材料，例如组织基质(tissue base)上，以产生组织系统。在优选的实施方案中，组织基质是哺乳动物羊膜、Matrigel^TM、层粘连蛋白、胶原蛋白IV或胶原蛋白IV片层、健生蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白和凝血酶片层(Fibrin Sealant，Reliseal^TM)或其任意组合。组织基质也可用支持材料生物涂敷，包括但不局限于人羊膜、层粘连蛋白、胶原蛋白IV、健生蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、纤连蛋白或其任意组合。在某些优选的实施方案中，组织基质是人羊膜，更优选是生物涂敷的人羊膜。结膜组织优选地培养于使细胞扩展而基本没有分化的培养基中，例如在补充了营养血清和/或一种或多种可溶性生长因子的培养基中。

在一些实施方案中，将培养于合适的支持材料上的结膜细胞从所述支持材料上解离以分离祖结膜细胞。在其他的实施方案中，在合适的支持材料上培养之前或之后，使用本领域技术人员熟知的方法分选结膜细胞，例如磁-亲和性细胞分选(magnetic-affinity cell sorting，MACS)，或荧光-激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)，或者免疫标记或免疫荧光染色技术(例如固相吸收)，以分离结膜祖细胞群和/或分化的结膜细胞群。在分离使用上述方法之一而富集的结膜细胞群的实施方案中，优选在支持祖细胞生长和支持用于移植到受损或患病的眼睛的组织系统发育的条件和培养基中，培养分离的细胞。

优选地，将包含结膜细胞的组织培养10-20天，更优选12-14天以产生结膜组织系统。在本领域技术人员熟知的条件下培养所述细胞，例如在浸没式或气升式条件下。优选地，在这些条件下培养的组织系统包含至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的祖结膜细胞。在优选的实施方案中，在存在用于发育具有祖结膜细胞的组织系统的富集培养基的情况下，将分离的祖结膜细胞培养于支持材料上。优选地，支持材料具有与天然结膜组织相似的特性，并且也能够支持祖结膜细胞的生长以及移植后的正常分化。在产生本文公开的组织系统之后，应当将其转移到接受者的移植位置处。优选地，用于转移组织系统的方法维持了组织系统的足够生存力，从而其在移植后仍可用作移植体。

优选地，所述组织系统被移植到受损或患病的眼睛中，并能够修复眼表面损伤，特别是患有严重结膜受损或疾病的受试者。如在本文中使用的，患有严重结膜受损或疾病的受试者在受损或患病的眼睛中，完全没有结膜祖细胞。可移植结膜组织系统以在任何位置替代或支持眼表面，所述位置包括与角膜邻近的区域。在优选的实施方案中，将所述结膜组织系统移植到眼表面的巩膜、穹窿或睑板区域。也可将所述结膜组织系统与眼睑内表面上已存在的结膜放置在一起。

已经研发出多种本领域技术人员熟知的手术方法来选择、获取并转移眼组织替代物至其在接受者眼睛的适当、天然解剖位置处。在移植前，可切去患病的或者受损的结膜，将自体的或异源的结膜组织系统置于所述结膜缺损处。在无菌条件以及局部麻醉下，进行结膜组织系统的移植。其他移植体例如其他羊膜片移植体可置于所述结膜组织系统上，以作为保护片。在其他实施方案中，将隐形眼镜置于所述组织系统上以保护移植体。将组织系统移植至受者眼睛的手术方法是本领域技术人员熟知的(Nguyen DQ，Hale J，VonLany H，Harrad RA.Releasable conjunctival suture for adjustable suture surgery.J Pediatr Ophthalmol Strabismus.2007 Jan-Feb；44(1)：35-8.和Bahar I，Weinberger D，Dan G，Avisar R.Pterygium surgery：fibrin glue versus Vicrylsutrres for conjunctival closure.Cornea.2006 Dec；25(10)：1168-72)。

本领域技术人员熟知的许多缝合线和缝合技术可用于将移植体固定到眼表面。尽管通常是成功的，但将细薄组织缝合到眼组织导致有关组织与组织的接合(tissue-to-tissue apposition)、出血、炎症、明显可见(visualization)的具体难题以及由于眼表面上暴露的缝合而导致患者的不舒服。使用合适的生物相容性产品而不是缝合来实现最佳组织接合是十分需要的。另外，缩短的手术时间转化为低廉的设备费用。

尽管需要合适的组织系统协助修复眼受伤或病况，但也需要减少或替代多种眼科处理中的缝合以改善结果、使并发症最小化、使患者舒服，并缩短处理时间。因此，在某些实施方案中，本发明提供了组织系统至患者眼睛的少量缝合递送(suture-less delivery)。该过程包括使用生物相容性粘合剂，例如胶，例如amcrylate或纤维蛋白密封剂(fibrin sealant)，它们可以用作组织粘合剂。该技术可以用于将角膜以及结膜细胞递送至受损的或患病的眼睛。本文公开的组织系统的少量缝合递送也可与包含来自角膜膜缘的未分化干细胞的组织系统一起使用，如在美国序列号11/043,019中公开的，通过引用将其全文并入本文。在优选实施方案中，本发明公开提供了使用amcrylate递送包含结膜细胞的组织系统。在其他优选实施方案中，所述生物相容性粘合剂是无菌的组织粘合剂，其选自聚乳酸、聚乳酸乙醇酸(polylactic glycolicacid)、聚乳酸和丙烯酸的共聚物，以及它们的任何组合。在其他实施方案中，生物相容性粘合剂包含与眼睛生物相容并且比缝合更整洁、安全及方便的任意粘合剂，从而可以将培养的组织系统置于受伤处并且对接受者眼睛的扰动最小化。优选地，对所述组织系统使用粘合剂有利于移植的细胞与受损和患病眼睛的整合。

本文所公开的结膜组织系统可用于治疗性应用，例如作为需要治疗的受试者的移植体。本发明公开的组织系统可用于治疗任何需要治疗的受试者，包括但不局限于人、灵长类和家畜(domestic animals)、牲畜(farm animals)、宠物动物(pet animals)或运动动物(sports animals)，例如犬(dogs)、马(horses)、猫(cats)、绵羊(sheep)、猪(pigs)、牛(cattle)、大鼠(rates)、小鼠(mice)等。如在本文中所用的，术语“治疗性的”、“治疗性地”、“以治疗”、“处理”或“治疗”是指治疗性处理和预防性或防止性措施。治疗性处理包括但不局限于减少或消除特定疾病、病况、受损、受伤或病症的症状，或者减缓或缓解已有的疾病、病况、受损、受伤或病症的发展，或者将其治愈。优选地，用治疗有效量的结膜组织系治疗需要此种治疗的受试者以恢复或再生功能。如在本文中所用的，所述结膜组织系统的“治疗性有效量”是足以抑制或改善由结膜细胞或组织的损失、受损、功能障碍或退化而造成的受试者体内的生理作用。

所用的组织系统的治疗有效量依赖于本领域技术人员熟知的多种因素，例如受试者的需求、受试者的年龄、生理状况和健康状况、所需的治疗效果、靶向治疗的组织区域的大小、移植的位点、病理学程度、所选择的递送途径和处理策略。本领域技术人员能够利用这些因素以确定治疗患者所需的、本发明公开的组织系统的治疗有效量。组织系统优选地以如下方式施用至患者，该方式使得所述组织系统移植至既定位点并重建或再生功能性缺损区域。

在具体的实施方案中，本发明涉及使用载玻片，以非典型的、简便培养方案，在HAM上培养人穹隆结膜祖细胞和/或分化的细胞。针对眼结膜灼伤兔模型来表征并评估制备的组织系统的安全性，其中不涉及缝合。在此兔模型中跟踪来自结膜的、存活的、功能性移植的人细胞。参阅实施例1和2。如在本文中所述的，根据移植体下面异常血管的形成和多形核白细胞(PMN)的渗透，将所述组织系统的安全性与对照进行平行比较。通过移植具有从结膜穹隆和其他区域繁殖的杯状细胞的结膜上皮的培养物来治疗结膜上皮的严重双面破坏。Shatos et al.，IOVS 44(6)：2477-2486，2003；Zieske，Eye 8：163-169，1994；Tsai et al.，Prog Retinal Eye Res 16：227-241，1997。

以下实施例示例本公开的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到实施例所公开的技术在下文中描绘了发明人所发现的、在本发明实施中良好地发挥功能的技术，并从而视为构成其实施的优选方式。然而，在本发明公开的启示下，本领域技术人员应当认识可对已经公开的具体实施方案做许多变化，并且仍能够获得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1：结膜组织系统的产生

如本实施例所公开的，从组织活检中培养结膜细胞的过程是非常简便的，并且不同于已有的插入式细胞培养皿方法(millicell method)。参阅Pellegrini et al.，J.Cell Biol 145(4)：769-782 1999；Belyakov et al.，Proc NatlAcad.Sci USA 102(40)：14203-208，2005。经伦理委员会的许可，在每一个患者和供体事先知情同意的情况下，收集所述结膜活检。以下规程依据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的原则，并获得Reliance Life Sciences(RLS)伦理委员会的许可。在印度Mumbar，Bandra的Zee眼科诊所内进行眼周手术的过程中，从穹隆处手术取下约2mm²的人结膜组织。只从眼球周围和眼睑的内表面上仔细地收集结膜。随后立即将切下的组织置于由达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagles Medium，DMEM)、5％热灭活胎牛血清(Hyclone，USA)和50μg/ml青霉素-链霉素组成的转移培养基中。所述转移培养基的pH范围为7-7.4。将所述活检储存在4℃，直至进行培养。

收集来自提供所述组织活检的同一个患者的约2-5ml血液样品，并与各自的结膜活检一起运送到集中安置的cGMP设备。直接检测血液样品的感染性疾病，包括乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(HepatitisC virus，HCV)、梅毒(Syphilis)和CMV。

随后将所述活检置于合适的基质中以培养活检中的结膜细胞。以如下描述制备基质人羊膜(HAM)。在供给者事先知情同意的情况下，依据赫尔辛基宣言的原则，在剖腹产时从血清阴性供体中获得人胎盘。用于分离HAM的方法与Tseng et al.，Arch Ophthalmol.116：431-41，1998中描述的相似，其通过引用的方式并入本文。在分布于灭菌的硝酸纤维素膜上之后，将处理过的HAM切成5×5cm²。将切成的小片在-70℃储存于含有甘油和FBS的DMEM中，直到使用。在制备当日和冷藏的第14天检查储存培养基的无菌状况。使用前，将HAM解冻，并用0.5％的胰蛋白酶-EDTA溶液处理以进行剥离，并在5×5cm²的灭菌玻璃载玻片上拉伸，所述灭菌玻璃载玻片保存在添加了足够培养基的灭菌皮氏培养皿中。

为培养和扩展结膜祖细胞，首先在立体显微镜下，从下层间质(几乎完全地)分离所述结膜活检组织的上皮。仔细地将上皮片断切成10个小块，用PBS和25U/ml Pen-Strep(Gibco-BRL，USA)预温育之后，置于剥离的、拉伸的HAM上。将包含结膜细胞的活检小块以同心环的形式置于HAM上，以使细胞通过接触抑制而分层。在第0天，用750μl由以下组成的培养基覆盖所述活检组织：DMEM:F12(1:1)、20％胎牛血清(hyclone，Logan UT)、0.1％DMSO(Sigma USA)、10ng/ml人表皮生长因子(hEGF)(Sigma USA)、4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(R&D MN)、5μg/ml胰岛素(Sigma USA)，5μg/ml运铁蛋白(Gibco-BRL，USA)和5μg/ml亚硒酸钠(Sigma USA)，0.5μg/ml氢化可的松和50U/ml Pen-Strep。在第2天，向组成中添加2.5ml所述培养基，并其后每隔一天更换培养基，直至准备移植。细胞生长在37℃和5％ CO₂中。使用该单一培养基制备所述组织系统。

令人惊奇的是，只要结构特征是该组织系统所需的，使用同一种单一步骤培养基增殖和分化结膜细胞的方法能够成功地产生用于移植的组织系统。该培养基与单一步骤培养基相组合维持了增殖和分化。本发明在同一个培养物中获得了增殖的和分化的细胞。胰岛素、hEGF和氢化可的松在培养过程中都起促进结膜上皮细胞在纤维原细胞上生长的作用。培养14天后，羊膜整个片层上覆盖并汇合了细胞。

在培养结膜组织系统的5×5cm²片层中，一半如实施例2中描述的在结膜受伤的兔模型上用做异体移植体，将另一半切成3片。一片用来收集细胞的RNA以进行RT-PCR，从而可以测量和评估特定标记的表达。第二片用来在石蜡块中切片。最后一片用做整体装片(whole mount)。

RNA分离和RT-PCR：通过TRIzol方法(Invitrogen，USA)分离培养的结膜细胞的总RNA，用RNase-OUT核糖核酸酶抑制剂(Invitrogen，USA)处理1μg分离的RNA以进行cDNA合成。使用Superscript逆转录酶II(Invitrogen，USA)和Oligo dT(Invitrogen，USA)起始逆转录反应，进行逆转录。用MUC5AC和MUC4基因进行细胞的RT-PCR以证实粘蛋白的表达。使用Abgene2×PCR反应母液(Abgene，USA)和合适的引物(Shatos et al.，IOVS 42(7)：1455-1464，2001；Shatos et al.，IVOS44(6)：2477-2486，2003；通过引用将每一个并入本文)，通过30个循环的聚合酶链式反应，扩增2μl的cDNA。该反应中使用的引物序列显示于下面表1中。

表1

 

基因	引物序列	退火温度	功能
				GAPDH	正向-5’ACCACA GTC CATGCC ATC AC 3’(SEQ ID NO：1)反向-5’TCCACC ACC CTGTTG CTG TA3’(SEQ ID NO：2)	60℃	管家基因
MUC5AC	正向-5’TCCACC ATA TACCGC CAC AGA3’(SEQ ID NO：3)反向-5’TGGACG GAC AGTCAC TGT CAA C3’(SEQ ID NO：4)	65.9℃	人结膜杯状细胞特异表达此种大的胶形成粘蛋白
				MUC4	正向-5’GCCCAA GCT ACAGTG TGA CTC A3’(SEQ ID NO：5)反向-5’ATGGTG CCG TTGTAA TTT GTT GT3’(SEQ ID NO：6)	66.6℃	膜相关粘蛋白

结膜培养物整体装片的制备：在载玻片上拉伸包含经培养的结膜细胞的组织系统小片，而不破坏该表面。去除痕量的培养基，室温下在甲醛中固定样品30分钟。其后，完全风干固定的培养物并染色。

组织标记和组织病理：为确定所述组织系统的特征，将复合的细胞培养物于室温下，在4％多聚甲醛中固定10分钟，并脱水、石蜡包埋。制备约3μm的石蜡切片。对于免疫荧光而言，脱蜡后，对切片进行抗原恢复的微波方法，并用1×PBS预温育10分钟。切片用0.2％ Triton X-100处理5分钟，并用1％ BSA封闭1小时，期间用PBS洗涤15分钟。向切片中添加一抗AE-1(1:500)和AE-3(1:500)(Chemicon，CA)，并于4℃温育过夜。在室温下，切片用各自的二抗温育1小时。用封片培养基(Sigma US)对切片进行封片，并用荧光显微镜进行检查。对于高碘酸希夫(Periodic Acid Schiff，PAS)染色，脱蜡的切片与整体装片一起在室温下用0.5％高碘酸处理5分钟，用Schiff试剂处理30分钟。用苏木精复染。

表征剥离羊膜上培养的结膜细胞：如本文所示，经鉴定细胞角蛋白和特定粘蛋白类型的标记(Ohno-Matsui et al.，Molecular Vision 11：1-10，2005)由培养的角膜细胞表达。在移植之前，将结膜组织系统进行体外分层。在将活检置于HAM上后，初始培养物在3天期的培养物中显示出初始生长，并伴有从羊膜上的外植体中长出的大细胞(图1A)。培养14天后，HAM的整个片层上覆盖并汇合了细胞(图1B)。培养20天后，培养切片的免疫荧光染色证实了AE-1和AE-3的胞质表达(图1C和1D)。在20天结束时制备的结膜组织系统整体装片的PAS染色显示了杯状细胞的生长和分布，其在组织系统中不是均一的(图1E)。检测MUC5AC和MUC4在结膜组织系统中表达的互补RT-PCR分析证实了这两个标记在所述组织系统以及在所述结膜活检中的表达。如在下述实施例2中所述，移植的结膜组织系统能够治疗结膜损伤。

实施例2

本实施例检验了使用实施例1所述的简便培养方案制备的结膜组织系统治疗兔模型受伤眼睛的能力，所述兔模型是用所述组织系统异种移植的眼结膜灼伤模型。使用组织粘合剂在兔模型中移植结膜组织系统。移植后，使用组织病理学和免疫染色跟随和评估人细胞的存活和整合。根据移植体下异常血管形成和多形核白细胞(PMN)渗透，与对照并行检查结膜组织系统的安全性。

按如下制备化学损伤的兔模型。从内部评审委员会(internal reviewboard，IRB)、动物伦理委员会(Institutional Animal Ethics Committee，IAEC)和控制和监督动物实验宗旨委员会(Purpose of Control and Supervision ofExperiments on Animals，CPCSEA)得到对于本文所描述的动物规程的在先许可。用氯胺酮(35mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)麻醉6只新西兰白兔(重：1.5kg；年龄：6个月)，应用支座缝合(stay sutures)来收缩眼睑。图3A显示了兔的正常眼睛。通过在眼睛的眼球-眼睑结膜处放置1N NaOH饱和的无菌滤纸(60mm²)40秒钟，在该位置产生损伤(图3B)。移除滤纸后，使用外科手术刀去除损伤区域处的残留上皮，用PBS大面积冲洗创伤位点。在动物的一只眼睛上产生损伤。15天后在相同的区域再次实施产生所述损伤的方法，其后如前再进行10天。

对于异体移植实验，有两种类型的对照。一种对照是眼睛受伤并跟踪45天(n＝2)的动物。第二种对照是眼睛受伤(图3C)，其后用其上没有培养的结膜细胞的HAM覆盖的动物(n＝2)。所述测试实验将本文所述的人结膜组织系统移植至损伤处(图3D和3E)。受伤处用培养细胞向上的结膜组织系统20mm²小片来覆盖，并且使用称为Amcrylate(由ConcordDrugs Ltd，Andhra Pradesh在印度制造)的无菌组织粘合剂固定边缘。这种多聚体是单体2-氰基丙烯酸异戊酯(isoamyl 2-cyanoacrylate)与水汽接触时发生聚合而产生，该聚合物是无毒、生物相容的惰性材料。该组织粘合剂用于将移植体粘附于裸露的结膜组织上。将4滴每滴5μl的所述组织粘合剂置于所述损伤的4个边缘上，并按使HAM与胶接触并且细胞向上的方式放置所述移植体。

在产生损伤后，每个眼睛每天用地塞米松(dexamethazone)/庆大霉素溶液处理2次，共15天。手术后，将0.5％环孢菌素A和0.05％地塞米松-庆大霉素溶液作为滴眼液，在第一周每天给药3次，其后每天给药2次。跟踪动物一个月。通过受伤位点处的杯状细胞的再上皮形成和再现，与对照动物比较来定量移植体的功效。

在动物实验结束时，处死兔子，并移除具有结膜组织的整个眼球，并在10％甲醛中固定。通过心内注射定量的硫喷妥钠溶液处死兔子。对于组织病理学评估，常规处理来自对照和处理位点的结膜组织，其中～5微米的薄切片用苏木精和伊红染色，并用显微镜观察修复的程度。对于免疫组织化学，在将切片进行抗原回收后，用含3％ H₂O₂的水对其处理15分钟。在4℃过夜温育一抗抗人线粒体抗体(Chemicon，CA)。根据所用的VectaStain Elite ABC试剂盒(Vector Laboratories，Brulingame，CA)的说明书进行剩余的染色过程。所使用的底物是二氨基联苯胺(DAB)。通过光学显微镜(Nikon E600)可视化人细胞胞质中褐色意大利面条样(spaghetti-like)阳性染色。对于高碘酸Schiff染色，将脱蜡切片和整体装片一起在室温下用0.5％高碘酸处理5分钟，并用Schiff试剂处理30分钟。对所述切片用苏木精进行复染。

损伤和移植后的临床观察：损伤后24小时，所有的眼睛在受伤位点周围显示了轻度充血，以及损伤位点处的血块。48小时之后，血块的大小缩小了(未显示数据)，充血减少，且受伤的位点可划界。移植结膜组织系统后，没有观察到过敏反应和排斥的迹象。眼睛是平静的，并且在其后没有观察到异常的血管生成。跟踪只有损伤的眼睛，直到所述实验结束当日，呈现出2/3的最初损伤(图3F)。在处死动物进行切片之前，用包含人结膜细胞的组织系统抑制的眼睛在表面完整性和所述位点处血管生成方面看上去是健康的(图3G)。

为评估结膜组织系统治愈兔模型中眼睛损伤的能力，将所述眼睛与正常兔结膜切片比较，所述正常兔结膜切片具有健康的杯状细胞群，如图4A所示。损伤后，在损伤视野内没有发现杯状细胞，并且上皮是蜕去的(图4B)。另外，来自只有损伤的对照动物的切片显示出破坏的上皮细胞和具有中度PMN渗透的充血血管。在对照兔子中，其中只有剥离HAM被移植到受伤位点，上皮没有再生，并且在大部分区域蜕去(图4C)。在所述位点处没有杯状细胞的痕迹，并且血管是充盈的，在许多位置观察到溢出的RBCs。在未接受移植体的对照兔子中，也在许多位置观察到溢出的RBCs(图4D)。在移植前，显示结膜组织系统是体外成层的。在将所述组织系统移植到所述兔模型之后1个月，发现所述细胞在应用位点处是完整的，但不是连续的(图4E和4F)。来自测试眼睛的切片，其中移植了所述的结膜组织系统，展现出散布有人和兔细胞两者的多层上皮。杯状细胞和散布的内皮细胞的再现说明在受伤位点处细胞的再生和愈合。

检测体内残留和存活的人细胞：在以下两者中鉴定出经移植的人细胞：原位组织系统的HAM上和嵌入移植了结膜组织系统的大鼠模型的表皮下区域(图4I)。观察到在移植位点处散布的人细胞，以及在动物组织内的细胞远离HMA的迁移，说明其在治愈损伤中具有重要作用。基于用抗人线粒体一抗进行的人线粒体棕褐色意大利面条样染色，检测人细胞。迁移细胞的百分比在动物间变动，没有观察到固定的迁移水平。残留的人细胞被延长，并且比动物细胞大，而且非常明显。

使用无菌组织粘合剂Amcrylate进行的组织系统的少量缝合递送证明此方法是安全方便的。这种无菌组织粘合剂不被吸收到血液中，并且被用于替代或补充美容手术中的补充缝合以再结合静脉和动脉。移植之后，显微镜下的检查显示，兔结膜切片中HAM片段下没有胶的痕迹，说明所述胶在所述移植体的整合期间已被清洗掉。通过观察移植后PMN渗透和任何诱导的异常血管形成，检查所述移植体和组织粘合剂的安全性。从分离的组织制作的切片的组织病理学评估结果显示于如下的表2中。

表2

 

只有损伤	具有HAM移植体的损伤	具有结膜组织系统的损伤
			破坏的上皮细胞	上皮从大部分区域蜕去	多层的上皮
没有观察到杯状细胞	没有观察到杯状细胞	杯状细胞再现
			具有PMN细胞渗透的充血血管	血管充盈并且在许多位置见到溢出的RBCs	上皮下的PMN细胞集中聚集，并与内皮细胞排成一排

尽管已经描述了本文所公开的结膜组织系统的基本新特性，但应当认识到，在未脱离本发明公开的精神的情况下，在形式和细节上的各种省略、取代和改变是可行的。例如，以基本上相同的方式执行基本上相同的功能而实现相同的结果的那些元素和/或方法步骤的任何组合都明显在本发明公开的范围内。

在本发明公开的启示下不需要过多的实验，能够制作和实施在本文中公开并要求保护的所有构成和方法。尽管对本发明的构成和方法以优选实施方案的形式进行了描述，但本领域技术人员显然明白，可改变本文描述的构成和/或方法以及步骤或步骤的次序，而不脱离本发明的概念、精神和范围。具体来说，明显可知化学或生理学相关的特定试剂可替代本文描述的试剂，而得到相同或相似的结果。对本领域技术人员明显可知的所有这些相似的替代和修饰都在所附权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念内。

Claims (63)

1.产生结膜组织系统的方法，其包括在支持材料上于单一培养基内培养含有结膜祖细胞的组织细胞，所述培养基包含：

(a)达尔伯克改良必须培养基(DMEM)、DMEM:F-12(1:1)培养基或者Ham’s F-12(1:1)培养基；

(b)营养血清，选自以下组成的组：敲除血清、热灭活人血清、人脐带血血清、人血清白蛋白和胎牛血清；

(c)表皮生长因子(EGF)；

(d)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；

(e)胰岛素；

(f)亚硒酸钠；

(g)运铁蛋白；以及

(h)抗生素或多种抗生素的混合物，

其中所述单一培养基支持所述结膜祖细胞在所述支持材料上的增殖和扩展以形成结膜组织系统。

2.根据权利要求1的方法，其中所述营养血清是敲除血清。

3.根据权利要求1的方法，其中所述营养血清是热灭活人血清。

4.根据权利要求1的方法，其中所述营养血清是人脐带血血清。

5.根据权利要求1的方法，其中所述营养血清是人血清白蛋白。

6.根据权利要求1的方法，其中所述营养血清是胎牛血清。

7.根据权利要求1的方法，其中所述的EGF是人EGF或重组人EGF。

8.根据权利要求1的方法，其中所述的运铁蛋白是人运铁蛋白。

9.根据权利要求1的方法，其中所述的单一培养基还包含二甲基亚砜。

10.根据权利要求1的方法，其中所述的抗生素或多种抗生素的混合物选自以下组成的组：青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B、及其组合。

11.根据权利要求1的方法，其中所述的单一培养基包含：

(a)15％-20％营养血清；

(b)5-15ng/ml EGF；

(c)2-10ng/ml bFGF；

(d)1-10μg/ml胰岛素；

(e)1-10μg/ml亚硒酸钠；以及

(f)1-10μg/ml运铁蛋白。

12.根据权利要求11的方法，其中所述的单一培养基包含：

(a)20％营养血清；

(b)10ng/ml EGF；

(c)4ng/ml bFGF；

(d)5μg/ml胰岛素；

(e)5μg/ml亚硒酸钠；以及

(f)5μg/ml运铁蛋白。

13.根据权利要求12的方法，其中所述的单一培养基还包含0.1％二甲基亚砜。

14.根据权利要求1的方法，其中所述的支持材料是生物相容性膜。

15.根据权利要求14的方法，其中所述的生物相容性材料是羊膜。

16.根据权利要求15的方法，其中所述的羊膜是人羊膜。

17.根据权利要求15的方法，其中所述的培养步骤在所述羊膜的基底膜一面的表面上进行。

18.根据权利要求1的方法，其中所述的培养步骤在没有饲养细胞的情况下进行。

19.根据权利要求1的方法，其中所述含有结膜祖细胞的组织是通过来自结膜穹窿区域的组织活检而分离的。

20.治疗患者眼睛受损或患病的眼表面的方法，其包括将通过权利要求1的方法产生的结膜组织系统移植至所述眼表面。

21.根据权利要求20的方法，其中所述受损或患病的眼表面产生自碱灼伤、化学灼伤、热灼伤、斯-约综合征(SJS)、神经营养性角膜炎、眼瘢痕性类天疱疮(OCP)、翼状息肉切除、青光眼手术、小梁切除术、切割术、视网膜脱落、斜视手术、结膜痣、永久性泄漏小梁疱疹或前膜缘角膜结膜炎。

22.根据权利要求21的方法，其中将所述结膜组织系统移植到角膜或角膜邻近区域。

23.根据权利要求21的方法，其中使用无菌组织粘合剂将所述移植的结膜组织系统粘合到所述患者的眼睛上。

24.根据权利要求24的方法，其中所述的无菌组织粘合剂是2-氰基丙烯酸异戊酯。

25.治疗患者眼睛受损或患病的眼表面的方法，其包括：

(i)分离含有结膜祖细胞的组织活检；

(ii)在单一培养基中，于支持材料上培养所述组织，所述单一培养基包括：

(a)达尔伯克改良必须培养基(DMEM)、DMEM:F-12(1:1)培养基或者Ham’s F-12(1:1)培养基；

(b)营养血清，其选自以下组成的组：敲除血清、热灭活人血清、人脐带血血清、人血清白蛋白和胎牛血清；

(c)表皮生长因子(EGF)；

(d)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；

(e)胰岛素；

(f)亚硒酸钠；

(g)运铁蛋白；以及

(h)抗生素或多种抗生素的混合物，

其中所述单一培养基支持所述结膜祖细胞在所述支持材料上的增殖和扩展以形成结膜组织系统；以及

(iii)将所述结膜组织系统移植至所述患者眼睛的所述受损或患病的眼表面。

26.根据权利要求25的方法，其中所述营养血清是敲除血清。

27.根据权利要求25的方法，其中所述营养血清是人血清白蛋白。

28.根据权利要求25的方法，其中所述的EGF是人EGF或重组人EGF。

29.根据权利要求25的方法，其中所述的运铁蛋白是人运铁蛋白。

30.根据权利要求25的方法，其中所述的单一培养基还包含二甲基亚砜。

31.根据权利要求25的方法，其中所述的抗生素或多种抗生素的混合物选自由以下组成的组：青霉素、链霉素、庆大霉素、两性霉素B、及其组合。

32.根据权利要求25的方法，其中所述的单一培养基包含：

(a)15％-20％营养血清；

(b)5-15ng/ml EGF；

(c)2-10ng/ml bFGF；

(d)1-10μg/ml胰岛素；

(e)1-10μg/ml亚硒酸钠；以及

(f)1-10μg/ml运铁蛋白。

33.根据权利要求32的方法，其中所述的单一培养基包含：

(a)20％营养血清；

(b)10ng/ml EGF；

(c)4ng/ml bFGF；

(d)5μg/ml胰岛素；

(e)5μg/ml亚硒酸钠；以及

(f)5μg/ml运铁蛋白。

34.根据权利要求33的方法，其中所述的单一培养基还包含0.1％二甲基亚砜。

35.根据权利要求25的方法，其中所述的支持材料是生物相容性膜。

36.根据权利要求35的方法，其中所述的生物相容性材料是羊膜。

37.根据权利要求36的方法，其中所述的羊膜是人羊膜。

38.根据权利要求36的方法，其中所述的培养步骤是在所述羊膜的基底膜一面的表面上进行的。

39.根据权利要求25的方法，其中所述组织活检是从结膜的穹窿区域分离的。

40.根据权利要求25的方法，其中所述组织活检是从所述患者分离的。

41.根据权利要求25的方法，其中所述受损或患病的眼表面产生自碱灼伤、化学灼伤、热灼伤、斯-约综合征(SJS)、神经营养性角膜炎、眼瘢痕性类天疱疮(OCP)、翼状息肉切除、青光眼手术、小梁切除术、切割术、视网膜脱落、斜视手术、结膜痣、永久性泄漏小梁疱疹或前膜缘角膜结膜炎。

42.根据权利要求25的方法，其中将所述结膜组织系统移植到角膜或角膜邻近区域。

43.根据权利要求25的方法，其中使用无菌组织粘合剂将所述移植的结膜组织系统粘合到所述受损或患病的眼表面上。

44.根据权利要求43的方法，其中所述的无菌组织粘合剂是2-氰基丙烯酸异戊酯。

45.治疗患者眼睛受损或患病的眼表面的方法，其包括：

(i)分离含有结膜祖细胞的组织活检；

(ii)在单一培养基中，于支持材料上培养所述组织，其中所述单一培养基支持所述结膜祖细胞在所述支持材料上的增殖和扩展以形成结膜组织细胞，以及

(iii)将所述结膜组织系统移植到所述患者眼睛的所述受损或患病的眼表面上，其中使用无菌组织粘合剂将所述移植的结膜组织系统粘合到所述受损或患病的眼表面上。

46.根据权利要求45的方法，其中所述单一培养基包含：

(a)达尔伯克改良必须培养基(DMEM)、DMEM:F-12(1:1)培养基或者Ham’s F-12(1:1)培养基；

(b)营养血清，其选自以下组成的组：敲除血清、热灭活人血清、人脐带血血清、人血清白蛋白和胎牛血清；

(c)表皮生长因子(EGF)；

(d)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；

(e)胰岛素；

(f)亚硒酸钠；

(g)运铁蛋白；以及

(h)抗生素或多种抗生素的混合物。

47.根据权利要求46的方法，其中所述营养血清是敲除血清。

48.根据权利要求46的方法，其中所述营养血清是人血清白蛋白。

49.根据权利要求46的方法，其中所述的单一培养基还包含二甲基亚砜。

50.根据权利要求46的方法，其中所述的单一培养基包含：

(a)15％-20％营养血清；

(b)5-15ng/ml EGF；

(c)2-10ng/ml bFGF；

(d)l-10μg/ml胰岛素；

(e)1-10μg/ml亚硒酸钠；以及

(f)1-10μg/ml运铁蛋白。

51.根据权利要求50的方法，其中所述的单一培养基包含：

(a)20％营养血清；

(b)10ng/ml EGF；

(c)4ng/ml bFGF；

(d)5μg/ml胰岛素；

(e)5μg/ml亚硒酸钠；以及

(f05μg/ml运铁蛋白。

52.根据权利要求51的方法，其中所述的单一培养基还包含0.1％二甲基亚砜。

53.根据权利要求45的方法，其中所述的支持材料是生物相容性膜。

54.根据权利要求53的方法，其中所述的生物相容性材料是羊膜。

55.根据权利要求54的方法，其中所述的羊膜是人羊膜。

56.根据权利要求54的方法，其中所述的培养步骤是在所述羊膜的基底膜一面的表面上进行的。

57.根据权利要求45的方法，其中所述组织活检是从结膜的穹窿区域分离的。

58.根据权利要求45的方法，其中所述组织活检是从所述患者分离的。

59.根据权利要求45的方法，其中所述受损或患病的眼表面产生自碱灼伤、化学灼伤、热灼伤、斯-约综合征(SJS)、神经营养性角膜炎、眼瘢痕性类天疱疮(OCP)、翼状息肉切除、青光眼手术、小梁切除术、切割术、视网膜脱落、斜视手术、结膜痣、永久性泄漏小梁疱疹或前膜缘角膜结膜炎。

60.根据权利要求45的方法，其中将所述结膜组织系统移植到所述眼表面的角膜或角膜邻近区域。

61.根据权利要求45的方法，其中所述的无菌组织粘合剂是2-氰基丙烯酸异戊酯。

62.治疗患者眼睛受损或患病的眼表面的方法，其包括将结膜组织系统移植至所述眼表面，其中使用无菌组织粘合剂将所述移植的结膜组织系统粘合到所述受损或患病的眼表面上。

63.根据上述权利要求所述的产生结膜组织系统的方法，其基本上参照实施例和附图如本文所述。

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