CN102266587A - 一种含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含杯状细胞的重组结膜上皮膜片的制备方法，是用γ-分泌酶抑制剂来诱导杯状细胞的分化。本发明的制备方法以自体结膜或异体结膜为原材料，培养制备含杯状细胞的重组结膜上皮膜片。与以往的结膜上皮膜片制备方法相比，本发明的培养方法能在早期促进结膜上皮细胞的增殖，形成的结膜上皮复层更加均匀；以羊膜嵌套式培养模具为培养支架，羊膜培养面很平坦，分化的杯状细胞存在于结膜上皮间，具有功能，临床应用方便且羊膜不易破裂；并且可增加重组结膜上皮膜片中杯状细胞的密度和分泌黏蛋白的能力，更符合临床需求。
Description
技术领域
本发明属于眼表结膜上皮制备技术领域，具体涉及到一种含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法。
背景技术
结膜杯状细胞是单细胞黏液腺，位于结膜上皮层，其主要功能是分泌黏蛋白，其所分泌的黏蛋白是泪膜最内层的主要成分，对维持眼表功能起重要作用。但是，若杯状细胞受到破坏，泪液成分即出现异常，引起角结膜干燥症，轻者感觉不适，重者导致失明。因此，在结膜大范围损伤后，即使采用口唇粘膜、羊膜移植等种种方法克服睑球粘连问题，也会因为不能恢复正常的杯状细胞密度和功能，不能建立后期角膜移植术恢复视力的基础。因此，制备含杯状细胞的重组结膜上皮膜片，用以重建结膜结构和功能，恢复作为泪液中黏蛋白主要来源的杯状细胞，已成为眼表重建手术一个新的发展方向，其临床应用将为眼表疾病的治疗开辟广阔前景，具有深远意义。但目前对含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的构建中还存在许多难题亟待解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法，即在结膜上皮膜片构建的后期，采用γ-分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化，增加重组眼结膜上皮膜片中杯状细胞的密度，促进其成熟分化，得到含正常功能和密度杯状细胞的重组结膜上皮膜片，以弥补现有技术的不足。
本发明的含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法，其特征在于，是用γ-分泌酶抑制剂来诱导重组眼结膜上皮膜片中杯状细胞的分化。
本发明的制备方法，包括有1)眼结膜上皮膜片的培养制备和2)杯状细胞诱导分化成熟步骤，其特征在于，上述2)杯状细胞诱导分化成熟步骤是在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100～400nm/L的γ-分泌酶抑制剂来诱导杯状细胞的分化。
上述的步骤1)眼结膜上皮膜片的培养制备，其步骤如下：
首先将制备好的羊膜嵌套式培养模具放入已铺有饲养层的培养板中，然后再将处理好的结膜上皮组织接种于培养板中，再添加结膜上皮细胞培养液进行培养。
所述的饲养层制备方法如下：用丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞后，再消化接种到细胞培养用的6孔板中制备小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。
步骤2)杯状细胞诱导分化成熟，其步骤如下：将结膜上皮组织接种于培养板中培养至结膜上皮细胞融合度达到80～90％后，在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100～400nm/L的γ-分泌酶抑制剂，诱导分化结膜上皮细胞1～7天，制得含杯状细胞的眼重组结膜上皮膜片。
在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为200nm/L的γ-分泌酶抑制剂，结膜杯状细胞明显增殖，具有最好的诱导效果。
本发明的制备方法以自体结膜或异体结膜为原材料，培养制备含杯状细胞的重组结膜上皮膜片，用于移植治疗因为杯状细胞缺乏或功能障碍为特征的眼表疾病。本发明以γ-分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化，与以往的结膜上皮膜片制备方法相比，本发明的培养方法具有如下优点：1)含饲养层细胞培养，早期促进结膜上皮细胞的增殖，形成的结膜上皮复层更加均匀；2)以羊膜嵌套式培养模具为培养支架，羊膜培养面很平坦，分化的杯状细胞存在于结膜上皮间，具有功能，临床应用方便且羊膜不易破裂；3)γ-分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化，可增加重组结膜上皮膜片中杯状细胞的密度和分泌黏蛋白的能力，更符合临床需求。
附图说明
图1：本发明的膜嵌套式培养模具的结构示意图。
图2：本发明的原代培养兔结膜上皮细胞阴性对照组处理照片。
图3：本发明的原代培养兔结膜上皮细胞200nm/L的γ-分泌酶抑制剂组处理照片。
图4：本发明的原代培养人结膜上皮细胞阴性对照组AB/PAS染色照片，红色着色为杯状细胞。
图5：本发明的原代培养人结膜上皮细胞200nm/L的γ-分泌酶抑制剂组AB/PAS染色照片，红色着色为杯状细胞。
其中：1、嵌入式培养小室2、套筒3、羊膜片。
具体实施方式
本发明以自体结膜或异体结膜组织为原材料，用γ-分泌酶抑制剂诱导杯状细胞分化来制备以羊膜为载体的结膜杯状细胞膜片，制备的含杯状细胞的眼重组结膜上皮膜片具有人结膜杯状细胞的特性，可用于结膜杯状细胞缺乏或功能障碍征疾病的移植治疗中。
本发明的制备方法：包括有1)眼结膜上皮膜片的培养制备和2)杯状细胞诱导分化成熟步骤，其特征在于，上述2)杯状细胞诱导分化成熟步骤是在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100～400nm/L的γ-分泌酶抑制剂。
本发明的1)眼结膜上皮膜片的培养可以采用已有的方法来进行，优选方法参照于中国发明专利：羊膜复合角膜缘干细胞膜片的制备方法(201110036633.4)所描述的方法，具体步骤如下：
a、羊膜嵌套式培养模具的制备：
如图1，按照常规方法制备5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮无菌羊膜片3，将该羊膜片3
上皮面朝上平铺于6孔培养板中；将上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培养小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培养模具。其中所用套筒2外径24mm，高16mm。
b、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备：
用0.01mg/ml丝裂霉素C溶液处理贴壁的小鼠胚胎成纤维细胞，37℃孵育2小时；用10ml PBS磷酸盐缓冲液仔细清洗细胞后；加1ml 0.25％胰酶/0.02％EDTA，37℃孵育3-5分钟；加9ml含血清的DMEM培养液中止消化，吹打细胞；离心收集细胞，弃上清，用10ml含胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞；细胞计数，以2.5×104细胞/cm2的细胞密度接种细胞到6孔培养板中，37℃培养过夜使其贴壁，即制备成小鼠胚胎成纤维细胞3T3饲养层。
c、结膜组织小块的制备：
将眼库来源的新鲜结膜组织环放入盛有含100u/ml青霉素和链霉素的PBS液中浸泡，冲洗3次，每次3分钟。移入含100u/ml青霉素和链霉素的DMEM培养液的培养皿中，实体显微镜下仔细剪除结膜下组织及血管组织，将结膜上皮组织修剪成大小1mm3的组织块。
d、将上述步骤一制备的羊膜嵌套式培养模具放置入铺有上述步骤二制备的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6孔板中，再将上述步骤三制备的结膜组织块接种于羊膜嵌套式培养模具羊膜面上，每个培养孔接种5-8块结膜组织块，加入少量结膜上皮细胞培养液，所述的结膜上皮细胞培养液为添加有10％FBS、20ng/mlEGF、5μg/ml胰岛素、0.1μg/ml霍乱毒素、100μg/ml青链霉素的DMEM/HamF12培养基，放置于37℃培养箱中培养。培养24小时后细胞从组织块向外爬出，培养一周左右结膜上皮细胞生长至50～60％融合，10天左右结膜上皮细胞生长至80～90％融合。
本发明的方法步骤2)杯状细胞诱导步骤：利用针对Notch通路的靶向治疗剂γ-分泌酶抑制剂诱导分化结膜上皮细胞，在原代培养的结膜上皮细胞中加入终浓度100、200、400nm/Lγ-分泌酶抑制剂，加入不含γ-分泌酶抑制剂的培养液做阴性对照，于加药后第3天，行AB/PAS染色，观察不同浓度组杯状细胞密度的差异；通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测γ--分泌酶抑制剂对杯状细胞MUC5AC、CK7基因表达的影响。结果在体外培养的兔结膜上皮细胞中存在杯状细胞，且MUC5AC、CK7mRNA表达量明显高于阴性对照组，其中200nm处理组MUC5AC、CK7mRNA表达量明显高于100、400nm组。因此，本发明确定γ-分泌酶的最佳诱导浓度为200nm/L。
下面对本发明的制备方法进行详细的描述。
实施例1体外诱导含杯状细胞的眼重组结膜上皮膜片
一、羊膜嵌套式培养模具的制备：
羊膜嵌套式培养模具的制备：
如图1，按照常规方法制备5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮无菌羊膜片3，将该羊膜片3上皮面朝上平铺于6孔培养板中；将上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培养小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培养模具。其中所用套筒2外径24mm，高16mm。
二、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备：
用0.01mg/ml丝裂霉素C溶液处理贴壁的小鼠胚胎成纤维细胞，37℃孵育2小时；用10ml PBS磷酸盐缓冲液仔细清洗细胞后；加1ml 0.25％胰酶/0.02％EDTA，37℃孵育3-5分钟；加9ml含血清的DMEM培养液中止消化，吹打细胞；离心收集细胞，弃上清，用10ml含胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞；细胞计数，以2.5×104细胞/cm2的细胞密度接种细胞到6孔培养板中，37℃培养过夜使其贴壁，即制备成小鼠胚胎成纤维细胞3T3饲养层。
三、人结膜组织小块的制备：
将眼库保存的新鲜人结膜组织放入盛有含100u/ml青霉素和链霉素的PBS液泡，冲洗3次，每次3分钟。移入含100u/ml青霉素和链霉素DMEM培养液的培养皿中，实体显微镜下仔细剪除结膜下组织及血管组织，将结膜上皮组织剪成大小1mm3的组织块。
四、人结膜上皮细胞的培养及诱导分化：
首先将制备好羊膜嵌套式培养模具放置入铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6孔板中，再将人结膜组织块接种于羊膜表面，每个培养孔接种5-8块结膜组织块，放置于37℃培养箱中培养。培养24小时后细胞从组织块向外爬出，培养至结膜上皮细胞铺满培养孔80-90％时进行杯状细胞分化诱导，利用针对Notch通路的靶向治疗剂γ-分泌酶抑制剂诱导分化结膜上皮细胞，根据前期实验结果使用γ-分泌酶抑制剂最佳浓度200nm/L，培养时间大约为两周左右。组织化学染色结果表明羊膜载体重组的结膜上皮为2-3层的复层结膜上皮，可见杯状细胞；而阴性对照组中杯状细胞的数量很少。
实施例2体外诱导含杯状细胞的兔眼重组结膜上皮膜片
二、羊膜嵌套式培养模具的制备：
羊膜嵌套式培养模具的制备：
如图1，按照常规方法制备5.0cm×5.0cm尺寸的去上皮无菌羊膜片3，将该羊膜片3上皮面朝上平铺于6孔培养板中；将上述得到的羊膜片3上皮面向下置于聚丙乙烯材料制成的套筒2的端面上，用嵌入式培养小室1扣在套筒2的羊膜片3上，即制成羊膜嵌套式培养模具。其中所用套筒2外径24mm，高16mm。
二、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备：
用0.01mg/ml丝裂霉素C溶液处理贴壁的小鼠胚胎成纤维细胞，37℃孵育2小时；用10ml PBS磷酸盐缓冲液仔细清洗细胞后；加1ml 0.25％胰酶/0.02％EDTA，37℃孵育3-5分钟；加9ml含血清的DMEM培养液中止消化，吹打细胞；离心收集细胞，弃上清，用10ml含胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞；细胞计数，以2.5×104细胞/cm2的细胞密度接种细胞到6孔培养板中，37℃培养过夜使其贴壁，即制备成小鼠胚胎成纤维细胞3T3饲养层。
三、兔结膜组织小块的制备：
将眼库保存的新鲜兔结膜组织放入盛有含100u/ml青霉素和链霉素的PBS液泡，冲洗3次，每次3分钟。移入含100u/ml青霉素和链霉素DMEM培养液的培养皿中，实体显微镜下仔细剪除结膜下组织及血管组织，将结膜上皮组织剪成大小1mm3的组织块。
四、兔结膜上皮细胞的培养及诱导分化：
首先将制备好羊膜嵌套式培养模具放置入铺有小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的6孔板中，再将兔结膜组织块接种于羊膜表面，每个培养孔接种5-8块结膜组织块，放置于37℃培养箱中培养。培养24小时后细胞从组织块向外爬出，培养至结膜上皮细胞铺满培养孔80-90％时进行杯状细胞分化诱导，利用针对Notch通路的靶向治疗剂γ-分泌酶抑制剂诱导分化结膜上皮细胞，根据前期实验结果使用γ-分泌酶抑制剂最佳浓度200nm/L，培养时间大约为两周左右。行组织化学染色，可见羊膜为载体重组的结膜上皮为2-3层的复层结膜上皮，可见杯状细胞(图3)；而阴性对照组中杯状细胞的数量很少(图2)。
实施例3：γ--分泌酶抑制剂滴眼液体内诱导鼠结膜杯状细胞分化
一、γ--分泌酶抑制剂滴眼液制备
将γ--分泌酶抑制剂使用人工泪液稀释到(终浓度分别为100nm、200nm、400nm/L)滴眼液，即得到γ--分泌酶抑制剂滴眼液。
上述人工泪液可以用替若复方氯化钠滴眼液来替代。
二、γ--分泌酶抑制剂滴眼液体内诱导鼠结膜杯状细胞分化
每眼每次点滴眼液5μl，每天点眼3次，点眼诱导3天。具体分组如下：
对照组：采用替若复方氯化钠滴眼液点眼。
诱导组：采用γ--分泌酶抑制剂滴眼液点眼。
诱导3天后，观察诱导效果，行结膜组织PAS染色，具体以不同γ--分泌酶抑制剂滴眼液浓度进行对比。其中以200nm/Lγ--分泌酶抑制剂滴眼液组PAS染色，阳性反应最多(胞浆呈红色颗粒者)。
对实施例1制备的含杯状细胞的重组结膜上皮膜片的检测
一、组织化学染色
重组结膜上皮膜片100％甲醇固定15分钟，行PAS双染后，红色颗粒者为阳性反应，表明培养的细胞中含有中性(呈红色)糖蛋白，是杯状细胞(图4、图5)。
二、免疫荧光检测
通过杯状细胞特异性表达CK7和特异性分泌的粘蛋白MUC5AC，应用免疫荧光的方法对结膜杯状细胞进行鉴定。原代培养的人结膜上皮细胞，冰甲醇固定10分钟，山羊血清封闭20分钟，以鼠单抗CK7抗体和鼠单抗MUC5AC抗体孵育1小时，滴加DAPI染核，激光共聚焦显微镜观察，呈阳性反应者为杯状细胞。
将实施例2制备的含杯状细胞的重组兔结膜上皮膜片移植治疗兔碱烧伤睑球粘连
一、首先建立兔碱烧伤动物模型
模型动物选用新西兰大白兔，全身麻醉后，用盐酸丙美卡因滴眼液点眼，将浸透1N NaOH滤纸片直接贴覆于兔角膜表面，进行碱烧伤30秒，随后立即用大于30ml生理盐水冲洗来停止烧伤。
二、重组兔结膜上皮膜片移植治疗移植治疗
再碱烧伤20-30天后，兔角膜新生血管长入，逐渐睑球粘连。将实施例2制备的含杯状细胞的重组兔结膜上皮膜片进行移植手术，结膜囊成形成功。
三、术后观察
移植手术后兔眼无感染，结膜囊活动度好，结膜杯状细胞染色阳性，证明实施例2制备的含杯状细胞的重组兔结膜上皮膜片具有很好的应用效果。
Claims (7)
1.一种含杯状细胞的重组眼结膜上皮膜片的制备方法，其特征在于，是用γ-分泌酶抑制剂来诱导重组眼结膜上皮膜片中杯状细胞的分化。
2.如权利要求1所述的制备方法，包括有1)眼结膜上皮膜片的培养制备和2)杯状细胞诱导分化成熟步骤，其特征在于，上述2)杯状细胞诱导分化成熟步骤是在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100～400nm/L的γ-分泌酶抑制剂来诱导杯状细胞的分化。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的γ-分泌酶抑制剂终浓度优选为200nm/L。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)眼结膜上皮膜片的培养制备，其具体操作如下：首先将制备好的羊膜嵌套式培养模具放入已铺有饲养层的培养板中，然后再将处理好的结膜上皮组织接种于培养板中后，再添加结膜上皮细胞培养液进行培养。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的饲养层为小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)杯状细胞诱导分化成熟步骤，其具体操作如下：将结膜上皮组织接种于培养板中培养至结膜上皮细胞融合度达到80～90％后，在结膜上皮细胞培养液中加入终浓度为100～400nm/L的γ-分泌酶抑制剂，诱导分化结膜上皮细胞1～7天后，制得含杯状细胞的眼重组结膜上皮膜片。
7.如权利要求4或权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的结膜上皮细胞培养液为添加有10％FBS、20ng/mlEGF、5μg/ml胰岛素、0.1μg/ml霍乱毒素、100μg/ml青链霉素的DMEM/HamF12培养基。
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