CN100540659C - 一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基。该培养小鼠胚胎干细胞的方法，是在滋养层细胞上，用胚胎干细胞培养液培养小鼠胚胎干细胞，其中，所述滋养层细胞为内皮细胞。该方法中所用的培养小鼠胚胎干细胞的培养基由内皮细胞和胚胎干细胞培养液组成。该胚胎干细胞培养液优选是高糖DMEM，10-20%胎牛血清或小牛血清，1.5-3.0×10-4mol/L硫代甘油(Monothioglycerol，MTG)。本发明的培养小鼠胚胎干细胞的方法，操作简便，培养成分简单，成本低廉，具有重要的应用价值和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)也称ES细胞，是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。胚胎干细胞能在体外进行培养传代，保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。小鼠胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。由于其具有全能性，故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。例如在培养液中加入不同的分化因子，可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞，甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞，或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶，经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内，并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。由于小鼠胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。
胚胎干细胞体外培养的原则是：在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。
目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类：有饲养层培养法和无饲养层培养法。无饲养层培养法则是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，如果使用这样的条件培养基培养小鼠胚胎干细胞，可以不使用饲养层细胞，能保证小鼠胚胎干细胞增殖的同时维持未分化二倍体状态。由于无滋养层细胞培养方法在大多数实验室在长时间难以维持mES多能性。目前主要使用滋养细胞培养方法。有饲养层培养法主要应用MEF和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。MEF和STO都能分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制胚胎干细胞自主分化的因子。MEF和STO培养上清中抑制胚胎干细胞自主分化因子--LIF含量在500～1000IU/ml(分泌型)，同时在MEF和STO基质上还存在LIF(基质型)。STO细胞是已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌本苷亚系(Hogan et al.1994)。它可以长期进行体外培养传代和冻存。但效果不如MEF而未能广泛使用。使用MEF作为饲养细胞培养胚胎干细胞是一种最早和常用的方法。MEF能产生抑制胚胎干细胞自主分化和促进胚胎干细胞增殖的因子，故它能有效地促进胚胎干细胞增殖并维持其未分化二倍体状态和全能性。通常准备12.5～14.5d怀孕小鼠制备MEF。因为第3～5代的MEF生长和各种因子分泌都旺盛，杂细胞也较少，因此选择第3～5代的MEF制备滋养层细胞。饲养细胞培养mES时，常要在培养液中加入抑制胚胎干细胞自主分化的因子-人工重组LIF。
小鼠胚胎干细胞的基础培养基是高糖的DMEM。培养液配制时，还要添加β-巯基乙醇(β-ME)或单硫甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重组的LIF和胎牛血清等多种成分。高糖的DMEM有助于囊胚的贴壁、内细胞团的增殖及小鼠胚胎干细胞集落的形成；胎牛血清是胚胎干细胞培养液中不可缺少的成分。在促进胚胎干细胞增殖方面起到很好的作用；β-巯基乙醇(β-ME)可以保护细胞内酶和蛋白质中的硫基不被氧化，从而促进胚胎干细胞的贴壁及克隆形成；LIF是六十年代末发现的一种多功能细胞因子。在体外具有诱导M1细胞(一种髓样白血病细胞，myeloid leukaemiccell)向正常分化和抑制胚胎干细胞自主分化能力，以及能够促进8细胞期以后的桑椹胚至着床前胚胎的发育，提高囊胚的存活率，促进滋胚层细胞增殖和内细胞团生长。许多组织和细胞都有LIF和LIF受体的表达，如子宫内膜、蜕膜、胚胎滋胚层细胞、胚胎成纤维细胞、人膀胱癌细胞等有LIF的表达；胚胎干细胞、M1髓样白血病细胞、巨噬细胞、胚胎瘤(癌)细胞、脂肪细胞、神经细胞等有LIF受体的表达。LIF分为两种类型：分泌型(D型)和基质型(M型)。D型可分泌到细胞外液中，M型则锚定到细胞外基质上。人和鼠LIF基因有78％～94％的同源性。有用人LIF培养小鼠胚胎干细胞抑制其分化的报道，但未见有用鼠LIF培养人胚胎干细胞的报道。目前，人工重组的LIF制品已被商品化，可用来制备LIF条件培养基。LIF最适用量为1000IU/ml。当LIF浓度降至50～100单位/ml时，胚胎干细胞未分化的克隆数会下降至50％～60％。
自从mES建系以来20多年时间内，尽管小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，但是上述培养体系仍存在如下缺点：(1)操作复杂：mES体外培养过程包括12.5～14.5d怀孕小鼠的准备、MEF的分离和培养、MEF滋养层细胞制备、条件培养基配制、mES的传代等。(2)MEF生命期有限，不能在体外长期传代。在体外传代时间太长，其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失。这就需要经常准备12.5～14.5d怀孕小鼠制备MEF。(3)种植胚胎干细胞前，如果用丝裂霉素-C处理MEF，清洗不彻底时，残余的丝裂霉素-C会影响胚胎干细胞的增殖。(4)在胚胎干细胞培养过程中，死亡的MEF细胞的染色体释出可能会引起胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。(5)培养液成分复杂：在mES培养体系中，除基础培养基DMEM、胎牛血清外，需要添加β-巯基乙醇(β-ME)或硫代甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重组的LIF。同时，其中氨基酸成分、重组LIF等长时间放置易导致生物活性丧失。(6)传统的培养方法中使用孕鼠、各种氨基酸、人工重组LIF等具有非常高昂费用的生物材料和试剂，对于我国科研经费相对缺乏的国情，使得有关mES的研究工作受到极大的限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、有效、低成本的培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基。
本发明所提供的培养小鼠胚胎干细胞(mES)的方法，是在滋养层细胞上，用胚胎干细胞培养液培养小鼠胚胎干细胞，其中，所述滋养层细胞为上皮或内皮细胞。
所述上皮细胞或内皮细胞可来源于人和哺乳动物上皮细胞或内皮细胞。
所述上皮细胞或内皮细胞具体可来源于人和哺乳动物上皮组织或内皮细胞且具有自发分泌LIF的功能(包括自发分泌基质型LIF和分泌型LIF)。
所述上皮细胞和内皮细胞包括已建系的上皮细胞系、内皮细胞系和原代培养获得的上皮细胞及内皮细胞。
所述内皮细胞优选为人脐静脉内皮细胞、心血管内皮细胞、骨髓组织内皮细胞等；所述上皮细胞优选为人膀胱上皮组织、泌尿生殖道上皮组织、呼吸道、消化道等组织来源上皮细胞。
所述人膀胱癌上皮细胞系可为人膀胱癌上皮细胞T24；所述人脐静脉内皮细胞为人脐静脉内皮细胞系ECV-304。
人脐静脉内皮细胞系ECV-304源自1984年日本科学家从新生男婴脐静脉分离的，具有永生特性并不依赖任何细胞因子的内皮细胞系，后来证实ECV-304细胞系来自人膀胱癌上皮细胞系T24。
因上述动物上皮细胞和内皮细胞具有类似MEF滋养层细胞特性如：均具有自发分泌LIF的功能，为小鼠胚胎干细胞自我更新、细胞分裂和增殖提供必需的基质成分和必要的细胞因子，故可作为培养小鼠胚胎干细胞的滋养层细胞。
上述方法中，所述胚胎干细胞培养液可为基础培养基是高糖的DMEM，添加β-巯基乙醇(β-ME)或硫代甘油、和胎牛血清等多种成分。
所述培养液优选是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的质量百分含量为10-20％，硫代甘油的含量为1.5-3.0×10-4mol/L。
本发明选择上皮细胞和内皮细胞作为滋养层细胞，用于mES细胞培养，建立了一种新型的mES培养体系。这种体系不依赖于外源的人工重组LIF，同时也不需要利用小鼠胚胎成纤维细胞MEF作为滋养层细胞。而传统的饲养细胞培养mES时，在培养液中加入抑制胚胎干细胞自主分化的因子-人工重组LIF。本发明利用上皮细胞和内皮细胞自发分泌LIF的特点，可以避免增加外源的人工重组的LIF。本发明所提供的mES培养体系无需孕鼠、无需谷氨酰胺、无需非必需氨基酸、无需人工重组的LIF。传统培养体系因制备MEF不定期需要孕鼠，需具备养饲小鼠的设备和条件；同时传统培养体系需要多种氨基酸和重组LIF。本发明使得mES的培养成本大大降低。利用本发明的方法，mES可以稳定传代20代以上，并能够保持mES未分化的二倍体状态和多能性，维持自我更新和快速增值。本发明的培养小鼠胚胎干细胞的方法，操作简便，培养成分简单，成本低廉，具有重要的应用价值和经济价值。
附图说明
图1为ECV-304细胞为滋养层细胞，培养2天的复苏的小鼠胚胎干细胞R1照片
图2为人膀胱癌上皮细胞T24为滋养层细胞，培养2天的复苏的小鼠胚胎干细胞R1照片
图3为RT-PCR检测mES干性分子表达
图4A为未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的Oct3/4的免疫荧光检测照片
图4B为未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的SSEA-1的免疫荧光检测照片
图4C为用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的Oct3/4的免疫荧光检测照片
图4D为用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的SSEA-1的免疫荧光检测照片
图5为ECV-304细胞为滋养层细胞培养的mES经过20代后形成4天的EB
图6A为Real-time RT-PCR检测形成的EB中的Neuro D的表达
图6B为Real-time RT-PCR检测形成的EB中的Sox17的表达
图6C为Real-time RT-PCR检测形成的EB中的Brachyury(T)的表达
具体实施方式
本发明所提供的培养小鼠胚胎干细胞的方法无需反复多次准备孕鼠，无需反复多次制备MEF，无需反复多次准备MEF滋养层细胞。本发明方法直接用上皮细胞或内皮细胞按一定密度(与传统的mES培养体系中要求接种的MEF滋养层细胞密度一致)接种在经过明胶处理后的培养器皿中后，通过或不经过丝裂霉素处理，接种mES(接种密度与传统的mES培养体系中要求接种的mES密度一致)。共同培养2-4天后按照1∶2-5的比例传代继续培养。传代时，如开始的上皮或内皮滋养层细胞未用丝裂霉素处理，只需按照普通贴壁细胞培养方式对滋养层细胞和mES同时进行传代培养；如在开始对上皮或内皮滋养层细胞使用丝裂霉素处理(处理方法与传统的mES培养体系中要求的处理方法一致)，消化、收集mES前，准备上皮或内皮滋养层细胞，而消化和收集mES的方法同传统的mES培养方法。如使用的为已建系的上皮或内皮细胞作为滋养层细胞，可以将此上皮或内皮细胞系进行冻存和复苏。未用丝裂霉素处理的上皮或内皮细胞系和mES共培养时，连同共培养的上皮或内皮细胞系和mES同时冻存和复苏。
为了简化研究系统，以人脐静脉内皮细胞系ECV-304(日本DSMZ公司，DSMZno.ACC310)或人膀胱癌上皮细胞系T24(美国ATCC公司，ATCC no.HTB-4TM)为滋养层细胞，以小鼠胚胎干细胞R1(美国ATCC公司。
Number：SCRC-1011)作为mES。以下实验是在该体系中进行的研究工作，其研究结果说明了本发明，同时不限制本发明的范围(包括已建系的上皮或内皮细胞和原代培养获得的上皮或内皮细胞及其他类型的mES)。另外，下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。下述实施例中，除了CO2的百分含量为体积百分含量外，其它百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、以人脐静脉内皮细胞系ECV-304作为滋养层细胞培养小鼠胚胎干细胞
一、ECV-304滋养层细胞的制备
1、ECV-304细胞培养
主要实验材料：
细胞：人脐静脉内皮细胞系ECV-304(日本DSMZ公司，DSMZ no.ACC310)，以下简称ECV-304。
细胞培养液：在高糖DMEM(Hyclone公司的产品，货号为：SH30243.01)中添加小牛血清和硫代甘油(MTG)，使小牛血清的质量百分含量为10％，使硫代甘油的含量为1.5×10-4mol/L。
消化液：0.25％胰蛋白酶以1∶1的体积比加入0.02％EDTA得到的溶液。
2、ECV-304细胞复苏：
(1)细胞复苏：自冻存液氮罐中取出冻存细胞，迅速置入37℃-42℃水浴中，使细胞快速融化；离心去除冻存液，加入ECV-304细胞培养液，置在37℃、5％(体积比)CO2、饱和湿度培养箱培养。
(2)ECV-304细胞培养：复苏的细胞在24小时后换液，继续培养3-4天，待细胞生长达到70％融合时，按1∶3～1∶6传代培养。
2、ECV-304滋养层细胞的制备
主要实验材料：
丝裂霉素-C：丝裂霉素-C 2mg溶解于4ml的0.01mol/L、pH为7.2-7.5PBS中，配制成0.5mg/ml的母液；4℃避光保存。使用前，用上述细胞培养液配成终浓度为10ug/ml。稀释后4℃保存，不超过一周。
0.1％明胶水溶液：明胶0.1g，超纯水100ml。稍加热溶解后高压灭菌45min。4℃保存备用。
(1)未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞制备：将ECV-304细胞在传代后2-3天制备滋养层细胞。用上述消化液消化ECV-304细胞，用上述细胞培养液制备成细胞悬液，种植到预先用0.1％明胶水溶液处理过的培养瓶(皿)内。种植的细胞密度为1×104个/cm2。将制备好的饲养单层在37℃、5％(体积比)CO2、饱和湿度培养箱内过夜培养，第二天备用。
(2)用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞制备：
A.当ECV-304细胞生长连成一片时，在培养上清中加入丝裂霉素-C，使终浓度为10ug/ml，放回培养箱作用2～3hr。
或当ECV-304细胞生长连成一片时，用γ-射线照射，照射量为3000～10000rad。
B.用明胶预先处理培养瓶(皿)。处理方法是：将0.1％明胶水溶液吸入培养瓶(皿)内，以能覆盖培养瓶(皿)表面即可，在室温下静置2hr以上。使用前，吸弃多余的明胶水溶液，用PBS洗涤一次。
C.弃含有丝裂霉素-C的饲养细胞培养上清。用PBS洗涤五次；若用γ-射线处理，则省去用PBS洗涤。
D消化饲养细胞。用上述细胞培养液制备成3×105个/ml密度的细胞悬液，种植到预先用明胶处理过的培养瓶(皿)内。种植的细胞数为：7.5×104～1×105个/cm2。
E.在37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内培养。
F.待细胞贴壁后进行观察，若发现细胞过稀，补加处理过的细胞，以保证细胞能连成一片而没有间隙。
G.将制备好的饲养单层放置在培养箱内备用。当细胞贴壁后即可使用(处理的细胞约需6-8小时即可贴壁)，使用前要更换细胞培养液。丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞与小鼠胚胎干细胞共培养时间不超过2天，必须对小鼠胚胎干细胞传代，否则，因ECV-304滋养层细胞死亡导致小鼠胚胎干细胞的分化或凋亡。
二、已建系的胚胎干细胞体外培养
1.胚胎干细胞R1在未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中的培养：
(1)将复苏的小鼠胚胎干细胞R1用上述细胞培养液重悬或将已在传统的mES培养体系MEF滋养层细胞上培养2-4d、生长旺盛的胚胎干细胞R1克隆消化成单细胞悬液，用于传代。
(2)重悬复苏的小鼠胚胎干细胞R1直接接种到步骤一制备的新的未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304饲养单层细胞上(饲养单层细胞密度为1×104/cm2)。需传代的小鼠胚胎干细胞R1用ECV-304细胞培养液以1∶3～1∶6比例转种到步骤一制备的新的未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304饲养单层细胞上(饲养单层细胞密度为1×104/cm2)。37℃、5％(体积比)CO2、饱和湿度培养箱内继续培养，每天换液。结果表明无论是复苏的小鼠胚胎干细胞R1，还是传代的小鼠胚胎干细胞R1，2天后均观察到mES有胚胎干细胞样小集落出现，3-4天增大。图1显示的是培养2天的小鼠胚胎干细胞R1照片。与传统的培养方法培养2天的小鼠胚胎干细胞R1相同。
(3)培养2-4天后，将培养的ECV-304滋养层细胞和上述mES细胞同时按常规细胞传代方法消化，以1∶3～1∶6比例将两种细胞同时转接种到用0.1％明胶预处理过的培养器皿中。此过程无需再制备ECV-304滋养层细胞。
(4)按上述方法连续传代。3-4代后，根据ECV-304滋养层细胞密度变化，适当增加ECV-304滋养层细胞，保持细胞密度≥7.5×104个/cm2。过低密度的ECV-304滋养层细胞不易保持mES的多能性。
(5)冻存和复苏：
细胞冻存：用消化液消化ECV-304滋养层细胞和上述mES细胞5-15分钟，加入上述细胞培养液终止反应，离心后去除上清，用冻存液---上述细胞培养液含有10-15％DMSO(体积比)，重悬细胞至4.0-6.0×106个/ml，每个冻存管加入1ml细胞悬液，按照4℃放置0.5-2小时，-20℃放置2小时，-80℃放置24小时，冻入液氮罐中。
ECV-304滋养层细胞和上述mES细胞的复苏按照上述“ECV-304细胞复苏”的方法操作。
2.胚胎干细胞在用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中的培养：
(1)将步骤一制备的用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞接种到用0.1％明胶预处理的培养器皿中，接种密度为7.5×104个/cm2，作为饲养单层。
(2)第二天，将复苏的小鼠胚胎干细胞R1用上述细胞培养液重悬或将已在传统的mES培养体系MEF滋养层细胞上培养2-4d、生长旺盛的小鼠胚胎干细胞R1克隆分别消化成单细胞后用上述细胞培养液重悬。
(3)将重悬的mES接种到用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中，37℃、5％(体积比)CO2、饱和湿度培养箱内继续培养，每天换液。
结果表明无论是复苏的小鼠胚胎干细胞R1，还是在传统的mES培养体系MEF滋养层细胞上培养的小鼠胚胎干细胞R1，2天后均观察到mES有胚胎干细胞样小集落出现，3-4天增大。它们的增殖速度和胚胎干细胞克隆的形态均与图1显示的在未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中培养2天的复苏的小鼠胚胎干细胞R1相同。
(4)培养2-4天后，按传统mES培养方法继续传代。但需在传代的前一天制备ECV-304滋养层细胞：
A.将已培养2～3d、生长旺盛的胚胎干细胞克隆消化成单细胞悬液。消化方法同前。
B.添加上述细胞培养液，以1∶3-1∶6比例转种到新的饲养单层上。
C.37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内继续培养。
(5)冻存和复苏：同步骤1的(5)。
实施例2、以人膀胱癌上皮细胞T24为滋养层细胞培养小鼠胚胎干细胞
一、T24滋养层细胞的制备
除了实验材料中的细胞和细胞培养液外，其它实验材料和实验方法均同实施例1的步骤一。
细胞为人膀胱癌上皮细胞T24(美国ATCC公司，ATCC no.HTB-4TM)；
细胞培养液为T24细胞培养液：在高糖DMEM(Hyclone公司的产品，货号为：SH30243.01)中添加胎牛血清和硫代甘油(MTG)，使胎牛血清的质量百分含量为20％，使硫代甘油的含量为3.0×10-4mol/L。
二、已建系的胚胎干细胞体外培养
除了滋养层细胞为人膀胱癌上皮细胞T24、细胞培养液为T24细胞培养液外，其它实验材料和实验方法均同实施例1的步骤二。
结果表明，以用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞，与未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为为滋养层细胞，培养复苏或传代的小鼠胚胎干细胞，2天后均观察到mES有胚胎干细胞样小集落出现，3-4天增大。图2显示的是用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞，培养2天的小鼠胚胎干细胞R1照片。与传统的培养方法培养2天的小鼠胚胎干细胞R1相同。
实施例3、以ECV-304或人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞培养的mES干性标记分子检测。
一.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测mES干性分子标记在mRNA水平表达：
1.小鼠胚胎干细胞干性分子(标记分子)：转录因子Oct3/4，Nanog，Sox2。
2.RT-PCR反应引物：逆转录合成cDNA使用通用引物OligodT，PCR扩增上述基因引物序列分别是：OctP1：5’AATGCCGTGAAGTTGGAG3’，OctP2：5’GAAGCGACAGATGGTGGT3’；NanogP1：5’GCCCTGATTCTTCTACCA3’，NanogP2：5’AGATGCGTTCACCAGATAG3’；Sox2P1：5’CCCGTGGTTACCTCTTCC3’，Sox2P2：5’TTCTCCAGTTCGCAGTCC3’；内参基因β-actin P1：5’GCTGTCCCTGTATGCCTCT3’，β-actin P5’TTGATGTCACGCACGATTT3’。其中，OctP1和OctP2是扩增转录因子Oct3/4的引物，NanogP1和NanogP2是扩增转录因子Nanog的引物，Sox2P1和Sox2P2是扩增转录因子Sox2的引物。
3.收集在上述ECV-304滋养层细胞或人膀胱癌上皮细胞T24中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1，常规方法提取细胞总RNA，并按照常规方法进行RT-PCR扩增。PCR扩增条件如下：94℃4分钟变性；(94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒)40个循环；最后72℃延伸10分钟。进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。
同时以按照下述方法得到的传统mES培养体系培养的小鼠胚胎干细胞R1作为对照：
(1)用丝裂霉素-C或γ-射线处理已生长成片的MEF饲养细胞，制备成饲养单层。制备方法同实施例1。
(2)将已培养2～3d、生长旺盛的胚胎干细胞R1克隆消化成单细胞悬液。消化方法同实施例1。
(3)添加胚胎干细胞培养液：DMEM中添加15％小牛血清(FBS)、1000IU/ml LIF、0.1mM β-琉基乙醇(β-ME)或0.15mM单硫甘油(monothioglycerol)、2mM L-谷氨酰胺、2mM非必需氨基酸、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml，以1∶3～1∶6比例转种到新的饲养单层上。
(4)37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱内继续培养。
结果表明，在下述滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中，均扩增得到198bp的Oct3/4条带，383bp的Nanog条带和221bp的Sox2条带：a、在未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；b、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；c、未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞；d、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞。说明在上述滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1有Oct3/4，Nanog，Sox2分子的表达。传统mES培养体系和本发明的mES培养体系培养的小鼠胚胎干细胞仍具有相同的干性。
图3显示的是未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1。图3中，mES：传统mES培养体系培养的小鼠胚胎干细胞R1；co-mES：未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞为滋养层细胞培养的小鼠胚胎干细胞R1。
二.细胞免疫荧光检测干性标记分子在蛋白质水平表达：
(1)小鼠胚胎干细胞干性分子：Oct3/4，SSEA-1。
(2)检测用抗体：鼠源抗鼠Oct3/4单克隆抗体(R&D公司，Cat No.MAB1759)；鼠源抗鼠SSEA-1单克隆抗体(R & D公司，Cat No.MAB2155)；FITC标记的兔抗鼠IgG(北京中杉金桥公司，Cat No.ZF-0304)。
(3)收集在上述滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞，按细胞免疫荧光常规操作染mES，并用DAPI染细胞核。
结果表明，在下述滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中，均有Oct3/4和SSEA-1分子的表达：a、在未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；b、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；c、未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞；d、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞。
图4A显示的是，未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的Oct3/4的免疫荧光检测照片；
图4B显示的是，未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的SSEA-1的免疫荧光检测照片；
图4C显示的是，用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的Oct3/4的免疫荧光检测照片；
图4D显示的是，用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304细胞作为滋养层，培养20代的小鼠胚胎干细胞R1中的SSEA-1的免疫荧光检测照片。
图4A和图4C为细胞免疫荧光法检测mES干性标记分子Oct3/4：一抗为鼠源抗鼠Oct3/4单克隆抗体，二抗为FITC标记的兔抗鼠IgG；DAPI为染色体染料。左侧图片为用FITC标记的Oct3/4的荧光图像，中间的图片为DAPI标记的细胞核图像，右侧图片为其左边两张图像的叠加。
图4B和图4D为细胞免疫荧光法检测mES干性标记分子SSEA-1：一抗为是鼠源抗鼠SSEA-1单克隆抗体，二抗为FITC标记的兔抗鼠IgG；DAPI为染色体染料。左侧图片为用FITC标记的SSEA-1的荧光图像，中间的图片为DAPI标记的细胞核图像，右侧图片为其左边两张图像的叠加。
实施例4、以ECV-304或人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞培养的mES多能性分析
一.胚胎体(embry body，EB)形成实验：
1、实验材料：
EB培养液：基础培养基IMDM，加入15％胎牛血清，50ng/ml ascorbic acid(维生素A)，0.5％-1％iron-saturated transferrin(铁离子饱和的运铁蛋白)，3.0×10-4M MTG，2mM谷氨酰胺，青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml。上述百分含量均为质量百分含量。
低黏附力φ6cm培养皿：BRAND公司，Cat No.452010。
2、制备EB。为去除混合在mES中的ECV-304细胞，将在上述滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1用消化液消化成单个细胞，PBS洗一次，用含10％小牛血清的DMEM重悬细胞，将细胞转移到普通的φ6cm培养皿中，37℃、5％(体积比)CO2、饱和湿度培养箱内静置15分钟，小心吸取悬浮细胞，转移到另一个干净的φ6cm培养皿中，重复操作一次。再小心吸取悬浮细胞(因ECV-304细胞较mES更易贴壁，两次沉降后，去除了ECV-304细胞，悬浮的细胞是mES)，计数后，离心，改用EB培养液重悬细胞。按照1.8-3.0×104个/φ6cm培养皿，将细胞接种在低黏附力φ6cm培养皿中，每个培养皿至少加入6ml EB培养液。结果表明，悬浮培养3-5天后，在下述滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1均形成胚胎体(mEB)：a、在未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；b、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；c、未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞；d、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞。
图5显示的是在用丝裂霉素-C处理的ECV-304滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1在EB培养液培养4天后的EB。
3、Real-time RT-PCR检测形成EB的三个胚层标记分子：
(1)三个胚层标记分子：内胚层标记分子：Sox17；中胚层标记分子：Brachyury(T)；外胚层标记分子：Neuro D。
(2)RT-PCR反应引物：逆转录合成cDNA使用通用引物OligodT，PCR扩增Sox17基因的引物是：Sox17P1：5’GCGGACTACAGCAGACAGG 3’和Sox17P2：5’AGCCACAAATGCCACAAG 3’；PCR扩增Brachyury(T)基因的引物是：TP1：5’TCCCAGACCTACAGCACC 3’和TP2：5’CATCCACATTGTTCACCC 3’；PCR扩增Neuro D基因的引物是：NeuP1：5’CTGCTGAGTCTCGGGATAGTGT 3’和NeuP2：5’TAGGGTGAAGGCGTTTGG 3’。PCR扩增内参基因β-actin的引物是β-actin P1：5’GCTGTCCCTGTATGCCTCT3’，β-actin P2：5’TTGATGTCACGCACGATTT3’。
(3)收集培养3-5天的EB，PBS洗一次，用0.25％胰酶37℃消化10-15分钟，制备单细胞悬液。提取总RNA。并按照常规方法进行Real-time RT-PCR扩增。
结果表明，在下述滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1形成的胚胎体中均有上述三个胚层的标记分子的表达：a、在未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；b、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304作为滋养层细胞；c、未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞；d、用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的人膀胱癌上皮细胞T24作为滋养层细胞。
图6A显示的是未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1来源的mEB，Neuro D在不同分化时间的表达谱；
图6B显示的是未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1来源的mEB，Sox17在不同分化时间的表达谱；
图6C显示的是未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1来源的mEB，Brachyury(T)在不同分化时间的表达谱；
图6A-C中，co2d、co3d、co4d、co5d-表示未用丝裂霉素-C处理或γ-射线照射的ECV-304滋养层细胞中培养20代的小鼠胚胎干细胞R1来源的mEB在2天、3天、4天和5天中三种基因的表达；纵坐标为检测基因与内参基因的相对表达量。
Claims (4)
1、一种培养小鼠胚胎干细胞的方法，是在滋养层细胞上，用胚胎干细胞培养液培养小鼠胚胎干细胞，其特征在于：所述滋养层细胞为人脐静脉内皮细胞系ECV-304或人膀胱癌上皮细胞系T24。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述胚胎干细胞培养液是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的质量百分含量为10-20％，硫代甘油的含量为1.5-3.0×10-4mol/L。
3、一种用于培养小鼠胚胎干细胞的培养基，由滋养层细胞和胚胎干细胞培养液组成；所述滋养层细胞为人脐静脉内皮细胞系ECV-304或人膀胱癌上皮细胞系T24。
4、根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述胚胎干细胞培养液是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的质量百分含量为10-20％，硫代甘油的含量为1.5-3.0×10-4mol/L。
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| 人胚胎干细胞体外培养和扩增的研究进展. 张文彩等.国外医学·生理、病理科学与临床分册，第25卷第1期. 2005 |
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| 小鼠胚胎干细胞培养条件的探索. 黄璟等.贵阳医学院学报，第31卷第2期. 2006 |
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