CN105473708A - 用于使衍生自多能哺乳动物干细胞的心肌细胞成熟的培养基组合物 - Google Patents

用于使衍生自多能哺乳动物干细胞的心肌细胞成熟的培养基组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种培养基，使用所述培养基从多能胚胎干细胞(ESC)和/或(诱导)多能干细胞(iPSC)，尤其从分化为(胎儿)心肌细胞的干细胞产生成体样心肌细胞的不同方法，以及包含培养基，或者包含培养基连同衍生自多能胚胎干细胞(ESC)和/或(诱导)多能干细胞(iPSC)的分化的(胎儿)心肌细胞的试剂盒。

Description

用于使衍生自多能哺乳动物干细胞的心肌细胞成熟的培养基组合物
技术领域
本发明通常涉及细胞培养和干细胞生物学领域，更具体地说，本发明涉及衍生多能胚胎干细胞(PESC)的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟。尤其是，本发明提供了用于在体外从哺乳动物PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生成体样心肌细胞的化学上定义的组合物和方法。在本发明的一些方面，提供了使用本发明化学上定义的组合物在体外从衍生自哺乳动物PESC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生成体样心肌细胞的方法。化学上定义的培养基组合物、产生的成体样心肌细胞，和本发明的方法可应用于药物发现、药物引起的心脏毒性试验、预测毒理学筛选试验、候选药物的临床前筛选、心血管研究和心脏疾病模拟、再生医学和其它旨在模拟或治疗成人心脏疾病的应用的领域。
背景技术
医学多个领域(即心理健康，心脏病，免疫等等)需要新的和更有效的药物，这些领域的进展被在药物开发途径中与多个候选先导化合物相关的不希望的药物引起的不良反应所造成的极端成本所严重地阻碍。对于所有的药物开发而言，当前药物开发过程的主要弊端是，由无法预料的药物不良反应，尤其是心脏毒性反应引起的先导化合物的高消耗率经常在药物开发途径的后期阶段而不是早期阶段被发现。药物引起的心脏毒性的预防，其可自身表现为心律失常，代表了管理机关和(生物)制药公司的当务之急，因为这种类型毒性的表现是直接危及生命的。已表明，在临床研究中33％的不利安全事故通常是归因于心脏的心律失常影响，其可导致个体突然死亡或严重的心脏并发症(Mordwinkinetal(2013)Journalofcardiovasculartranslationalresearch,Vol:6(1):22-30)。
因此，迫切需要新的符合成本效益的策略来提高药物开发/发现的传统方法，例如消除药物引起的心脏毒性反应。尤其是，在药物途径开发中迫切需要在早期阶段预测药物引起的心脏毒性，但这一需要未得到满足。在过去的十年间，大量的研究工作致力于实现这个目标。例如，已经开发多个生物模型和工具，包括多能干细胞、离子通道分析和计算工具的使用。尤其是，在开发创新预测分析以改正药物开发期间心脏毒性相关问题中，衍生自多能干细胞的心肌细胞的使用是目前关注的焦点。
多能干细胞，例如多能胚胎干细胞(PESC)和诱导多能干细胞(iPSC)，是用于在体外培养中产生心肌细胞的细胞潜在来源。心肌细胞的使用不仅对开发用于预测所有开发中的药物的药物引起的毒性的分析是重要的，而且通常对于心脏的研究以及对新的心脏药物的开发也是重要的，其中，心肌细胞可用于发现新的药物靶标和评估心脏药物安全性。在体外从PESC和/或iPSC产生心肌细胞的能力也开创了其它治疗途径，例如再生医学，其中，例如，PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞可用于直接修复需要它们的病人的受损的心脏组织。
在药物开发/发现、药物安全性分析、心脏疾病模拟、心脏研究、再生医学和其它生物目的中使用心肌细胞的能力，主要取决于培养和获得衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的心肌细胞的能力，这些心肌细胞必须满足某些表型要求，例如，一定水平的功能特性(例如成体样电生理模式)和/或遗传图谱(例如细胞命运特异性(fate-specific)遗传标记的成体样表达)，和/或形态学方面(如成体样形状和组织学特性)。
在这方面，本领域的主要局限是用于从体外培养的PESC和/或iPSC产生心肌细胞的当前方法和培养基组合物产生的结果，这些结果是次优的和不匹配或只部分匹配应用(例如药物开/发现、药物安全性分析、心脏疾病模拟、心脏研究、再生医学)的需要，这些应用中需要适合于“现实”环境(即成体样状态)的心肌细胞。这是因为当前的方法和培养基组合物产生不成熟的心肌细胞，其类似于胎儿的(胎儿样)心肌细胞。这样的心肌细胞不适合用于诸如药物开发/发现、药物安全性分析，心脏疾病模拟、心脏研究、再生医学和其它旨在模拟或治疗通常在成人期而不在早期发育阶段发生的心脏疾病的目的应用中。因此，成体样(成熟的)心肌细胞比不成熟的心肌细胞或胎儿样心肌细胞更适合这些目的。
因此，需要改进的方法和培养基组合物用于从体外培养的PESC和/或iPSC产生成体样心肌细胞(而不是不成熟的心肌细胞)。也需要改进的方法和培养基组合物以产生更大量的(更大的产量)衍生自胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成体样心肌细胞，在体外干细胞分化的中，它们本身衍生自PESC和/或iPSC。
本发明的目的是通过提供促进本身衍生自体外培养的多能胚胎干细胞的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟的化学上定义的培养基组合物，和用于在体外培养中产生所述成体样心肌细胞的方法，以克服本领域的主要限制，该方法更有效率而且支持满足心脏研究和临床应用的总体要求的成体样心肌细胞的更大规模生产。
发明详述
一般定义
在下面的描述和实施例中使用了一些术语。为了提供对说明书和权利要求书，包括这些术语给定的范围的清楚和一致的理解，提供了下面的定义。除非本文另外定义，使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献的公开内容通过引用的方式整体并入本文。
本文使用的术语“干细胞”指的是通过它们在单个细胞水平自我更新和分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非自我更新的祖细胞和末端分化细胞。干细胞具有在培养时无限期分裂的能力。干细胞的特点也在于它们在体外从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成不同细胞谱系的功能细胞的能力，以及在移植后产生多胚层组织的能力和在注射入囊胚后显著有助于大部分(如果不是所有)组织的能力。干细胞分类为成体(somatic)(成体(adult))干细胞或胚胎干细胞。成体干细胞是在分化组织中发现的未分化细胞，可自我更新(克隆)和(有一定的限制)分化以获得它所起源的组织的所有特定细胞类型。
本文使用的术语“胚胎干细胞”，在本领域中也缩写为“ES细胞”或ESC(或如果是人源的，则为‘hES细胞’或‘hESCs细胞’)是技术人员通常理解的，并且指的是衍生自囊胚的内细胞团的多能胚胎干细胞(PESC)。技术人员理解如何获得这样的胚胎干细胞，例如Chung所描述的(Chungetal(2008)StemCellLines,Vol2(2):113-117)，其采用不引起供体胚胎破坏的技术。
本文使用的术语“多能性”是技术人员通常理解的，并且指的是具有分化为组成一种或多种组织或器官的所有细胞潜能的多能干细胞的属性，例如，三个胚层中的任何一个：内胚层(例如，内部的胃黏膜，胃肠道，肺)，中胚层(例如心脏，肌肉，骨头，血液，泌尿生殖道)，或外胚层(例如表皮组织和神经系统)。
本文使用的术语“多能胚胎干细胞”，缩写为“PESC”，指的是衍生自早期胚胎的多能干细胞。PESC可分化为衍生自三个胚层中的任何一个胚层的细胞。可通过标记或谱系特异性标记的使用(包括但不限于Oct-4、Nanog、GCTM-2、SSEA3和SSEA4)区别PESC与其它类型的细胞。
本文使用的术语“诱导多能干细胞”，通常缩写为iPSC，指的是通过被迫表达对保持胚胎干细胞的“干性(stemness)”重要的因子而重编程以进入胚胎干细胞样状态的成体(成体)细胞。通常，iPSC通过以下方式由非多能性细胞(如成人体细胞，或末端分化细胞)，例如纤维原细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等人工制备，即通过将所述非多能性细胞引入重编程因子，或使所述非多能性细胞与所述重编程因子接触。术语“诱导多能干细胞(iPSC)”不包括胚胎干细胞。
本文使用的术语“甲状腺激素样化合物”指的是甲状腺激素(也称为三碘甲状腺氨酸(T3))，以及类似于甲状腺激素T3或模仿甲状腺激素T3行为的化合物。甲状腺激素样化合物的非限制性实例包括甲状腺激素受体激动剂化合物如DIPA(也称为3,5-二碘甲状腺丙酸或DITPA)、GC-1化合物(其是来自Bristol-MyersSquibb的甲状腺激素受体亚型β(TRβ))选择性激动剂)、RO化合物(其来自RochePharmaceuticals的甲状腺激素受体亚型β1(TRβ))选择性激动剂)、CO23化合物(其是来自KaroBio的甲状腺激素受体亚型α1(TRα1)选择性激动剂)、KB2115(其是来自KaroBio的甲状腺激素受体亚型β(THβ)选择性激动剂)。
在本发明中，本文使用的术语“增殖(proliferation)”或“倍增(multiplication)”或“扩增(expansion)”指的是生物过程，其中体外培养时，在控制条件下，在指数过程中一个PESC或一个iPSC(“母细胞”)生长和分裂，产生两个PESC或两个iPSC细胞(“子细胞”)等。在PESC或iPSC增殖或扩增或倍增的过程中，可以理解的是PESC或iPSC正自我更新。细胞的自我更新是给定的细胞经过细胞分裂的多个周期，同时保持未分化状态的能力。
在本发明中，本文使用的术语“分化”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的PESC或iPSC获得特化细胞(例如的心脏细胞(例如心肌细胞)、肝细胞或肌细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。在某些实施方案中，多能干细胞(例如PESC或iPSC)可暴露于本发明的培养基组合物和方法，以便促进多能干细胞分化为胎儿样心肌细胞。心脏分化(cardiacdifferentiation)可通过使用标记(选自，但不限于NKX2-5、GATA4、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链、α-辅肌动蛋白、肌钙蛋白和原肌球蛋白)来检测(Burridgeetal(2012)StemCellCell,Vol.10(1):16-28,US2013/0029368)。
技术人员知道获得干细胞(例如PESC-和/或iPSC)衍生的心肌细胞的多种方法。当干细胞从分化抑制的条件中移除和/或在称为拟胚体的悬浮聚合物(suspensionaggregates)中生长时，自发分化为三个胚层的细胞。心肌细胞起源于中胚层，因此干细胞分化为心肌细胞需要向中胚层细胞谱系有效的分化。心脏谱系的这种定向分化主要通过多种策略实现，包括在已知的影响心脏发育的生长因子和抑制剂的存在下拟胚体的形成(参见,例如Kehatetal.,Clin.Invest.2001；108,407–414)、对在胚胎形成过程中内胚层对心脏分化的影响的依赖(Mummeryetal,,Circulation.2003；107,2733–2740)，例如，通过共培养干细胞与小鼠END-2获得干细胞衍生的心肌细胞，或通过使用接种于基质胶(Matrigel))、同时用激活素A和BMP4相继处理的的高密度干细胞的单层培养(Laflammeetal.2007；Nat.Biotechnol.25,1015–1024)。
本文使用的术语“未分化的”指的是未发展更特化细胞的特性的PESC和/或iPSC。本领域技术人员应认识到，术语“未分化的”和“分化的”彼此是相对的。“分化的”PESC和/或PSC具有更特化细胞的特性。分化的细胞和未分化的细胞彼此通过多个完善的标准相区别，所述标准包括形态特性例如相对大小和形状、核体积与细胞质体积的比值，和表达特性，如可检测到存在分化的已知(基因)标记。
在本发明中，本文使用的术语“成熟”指的是生物过程，其中需要衍生自表现不成熟发育状态(或胎儿状态)的PESC或iPSC的分化细胞，以在体外培养时，在控制条件下获得更具功能性或全功能性的(包括基因的和形态的)发育状态。因此，PESC-和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟，可能伴随有胎儿基因/蛋白质表达、胎儿形态特征和相关的功能特性的损失，和与成体(或成体样)细胞或成熟细胞相关的基因表达、形态特征和功能特性的获得。使PESC衍生的和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞“成熟”的过程导致PESC-和/或iPSC衍生的心肌细胞具有更成体样或更成熟的发育状态。
本文使用的术语“心肌细胞(cardiomyocytes)”或“心肌细胞(cardiacmyocytes)”通常指的是任何心肌细胞谱系细胞，并且，除非另有说明，可适用于处于心肌细胞个体发育的任何阶段的细胞。例如，心肌细胞可同时包括心肌细胞前体细胞(不成熟的心肌细胞或胎儿心肌细胞)和成熟的心肌细胞(成体样心肌细胞)。进一步的，心肌细胞可被细分成亚型包括，但不限于，窦房心肌细胞、心室心肌细胞、窦房结(SA)节点心肌细胞、外围SA节点心肌细胞或中央SA节点心肌细胞。
本文使用的术语“胎儿样心肌细胞”或“不成熟的心肌细胞”指衍生自体外培养PESC和/或iPSC的心肌细胞，其不具有有关成体或成体样心肌细胞的所需表型和/或基因型。例如，这样的胎儿样(不成熟的)心肌细胞可展示自动性(自发性收缩)和/或胎儿型离子通道表达，和/或胎儿型电生理信号，和/或胎儿样基因表达模式，和/或胎儿型生理表型。胎儿样(不成熟的)心肌细胞可以，例如，通过使用标记或谱系特异性标记(包括，但不限于，MYH6、TNNT2、TNNI3、MLC2V、EMILIN2、SIRPA、VECAM，和其它适合于评价胎儿或胎儿样发育阶段的标记)区别于其它细胞类型(Burridgeetal.(2012)StemCellCell,Vol.10(1):16-28)。新陈代谢的成熟可通过技术人员已知的方法确定，例如检查这些细胞的表型、形态学、基因表达、新陈代谢标记、细胞表面标记、电生理特性和/或细胞功能分析的方法。例如，对于成熟者可测定与“胎儿”状态或心脏肥大状态(hypertrophyicstate)(例如，NPPA(BNA))和NPPB(BNP))相关的基因的低表达，或优选地，测定成熟干细胞衍生的心肌细胞的电生理特性，其中对于更成熟的干细胞衍生的心肌细胞，可以看到更成体或更成体样心肌细胞的特性，如本文中详细讨论的。
此外，干细胞衍生的心肌细胞的相对成熟，可通过与胎儿状态相关的基因表达降低的存在来测定，例如NPPA、NPPB、平滑肌肌动蛋白和骨骼肌动蛋白，或通过成体基因/蛋白质表达增加来测定，如肌球蛋白轻链2V肌集钙蛋白和鱼尼丁受体。
本文使用的术语“成体样心肌细胞”或“成熟的心肌细胞”指的是具有有关成体心肌细胞的所需表型和/或基因型的心肌细胞。在一个实施方案中，成熟的细胞有以下细胞的表型和/或基因型：成体心肌细胞或心房心肌细胞或心室心肌细胞或SA节点心肌细胞或外围SA节点心肌细胞或中央SA节点心肌细胞，但不限于此。在其他实施方案中，与衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞相比，“成体样心肌细胞”或“成熟的心肌细胞”展现出更成熟的电生理学模式和/或更成熟的钙处理模式，和/或更成体型离子通道表达，和/或更成体型电生理信号，和/或更成体样收缩性能，和/或更成体样基因表达模式，和/或更成体型生理(形态)表型。成体样心肌细胞也可包含更大程度的肌原纤维组织和肌节纹理(sarcomericstriations)，其特点是在衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞中发育不良或不充分。
技术人员知道如何评价体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞的成熟，例如通过使用与特定的发育阶段相关的已知的心肌细胞特异性标记或谱系特异性标记以及本领域可用的方法，从而区分成体样(成熟的)心肌细胞和胎儿样(不成熟的)心肌细胞。在本发明中，评价体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞的成熟的方法是，评价与胎儿(不成熟的)状态(例如但不限于NPPA、NPPB、平滑肌肌动蛋白和骨骼肌动蛋白)相关的基因标记的表达。一个或多个所述胎儿(不成熟的)标记(基因)的表达降低会指示成体样(成熟的)状态。另一种评价体外培养的PESC衍生的和/或iPSC衍生的心肌细胞成熟的方法是，评价与成体样(成熟的)状态(例如，(但不限于)肌球蛋白轻链2V、肌集钙蛋白和鱼尼丁受体)相关的基因标记的表达。一种或多种所述成体样(成熟的)标记(基因)表达的增加会指示成体样(成熟的)状态(Burridgeetal.,(2012),StemCellCell,Vol.10(1):16-28)。
另一种评价体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞成熟的方法是评价它们的电生理特性，例如，细胞在体外产生和/或传播动作电位的能力。体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞的电生理的成熟，可以例如通过膜片钳技术以及其它技术评价。与胎儿样(不成熟的)电生理表型相比，指示成体样(成熟的)电生理表型的变化，包括(但不限于)，最大上升速率增加、静止膜电位降低和动作电位的振幅增强，这些都是成体心肌细胞的印记。
另一种评价体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞成熟的方法是，评价它们的代谢型(metabolicprofile)，例如，在体外培养中线粒体的活性。体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞代谢型的成熟可以，例如通过使用TMRM分析(除了别的技术外)进行评价，TMRM分析利用电位红色荧光染料四甲基罗丹明甲酯(tetramethylrhodaminemethylester)，俗称TMRM。用TMRM处理导致在健康运行的线粒体的内膜区域中由线粒体膜电位驱动的TMRM积累。与胎儿样(不成熟的)代谢型相比较，指示成体样(成熟的)代谢型的特征性变化的非限制性实例，()是TMRM在衍生自胎儿样(不成熟的)PESC和/或iPSC的成体样(成熟的)心肌细胞的线粒体中更大的积累，所述更大的积累通过在TMRM分析中TMRM相关橙色荧光的增强进行检测。
另外一种评价体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞成熟的方法是评价它们的形态特征，例如，细胞骨架的形状和/或超结构组织。体外培养的PESC和/或iPSC衍生的心肌细胞形态特征的成熟，可以例如通过免疫组织化学技术(除了其它技术外)进行评价，例如采用免疫荧光(Cy3或Alexa-Fluor647)和针对细胞骨架基本成分(integralconstituents)的抗体，例如α-辅肌动蛋白。与胎儿样(不成熟的)代谢型相比较，指示成体样(成熟的)形态特征的特征性变化的非限制性实例是，细胞极化的更大、肌节组织化(sarcomericorganization)增加和形状延长。
在本发明中，本文使用的术语“标记”或“谱系特异性标记”指的是与目的谱系细胞的表型特别相关的特性，并且可用于评价未定型细胞向目的谱系的分化。例如，“标记”或“谱系特异性标记”可以指在目的细胞中差异表达的核酸或多肽分子。与其它细胞相比，标记核酸或多肽的检测水平在目的细胞中显著较高或较低，以致目的细胞可以采用本领域已知的各种方法中的任何一种来鉴定和与其它细胞相区分。
本文使用的术语“水性组合物”指基于水的组合物或溶剂为水的组合物。例如，将(任何)水溶性物质溶解到水中可得到水性组合物。
本文使用的术语“固体组合物”指的是固体形式的任何组合物。术语“固体组合物”还包括半液体形式或半固体形式的组合物。例如，固体组合物可以是粉末、颗粒、片剂、糊剂、浆(puree)、湿混合物、丸、冻干形式、冷冻干燥形式等形式。在本发明的一些实施方案中，固体组合物可被溶解于适量溶剂例如水中，以便获得本文所教导的水性组合物。
本文使用的术语“脂质(lipid)”或“脂质(lipids)”指的是包括脂肪、蜡、甾醇、脂溶性维生素(如维生素A、维生素D、维生素E和维生素K)、单甘酯、双甘酯、甘油三脂、磷脂质等的一组分子。脂质可分成若干类，包括脂肪酸，甘油糖酯，甘油磷脂，鞘脂类，糖酯类和聚酮化合物(源自酮脂酰亚基的缩合)；和甾醇脂质和异戊烯醇脂质(prenollipids)(源自异戊二烯亚基的缩合)。术语“脂质”也包括如脂肪酸及其衍生物(包括三甘酯、二甘酯、单甘酯和磷脂质)的分子，以及其它包含甾醇的代谢物(例如胆固醇)。脂质的进一步非限制性实例包括亚麻酸、亚油酸和棕榈酸(palmiticacid)、花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸(palmitoleicacid)、普朗尼克(pluronic)F-68、硬脂酸、吐温80等。本文使用的术语“脂质混合物”指的是至少两种或更多种脂质的组合。
本文使用的术语“无血清培养基”，通常为技术人员所理解，并且指基本上无血清的培养基。按照定义，无血清培养基缺乏作为成分的全血清，但是它可能不是完全不含血清衍生的产品，例如高度纯化形式的白蛋白，例如牛或甚至人(重组)白蛋白可包括在这样的无血清培养基中。例如，它可包含高达10wt％，优选地高达5wt％，甚至更优选地高达2wt％，高达1wt％，高达0.5wt％，或最优选地高达0.25wt％的白蛋白，例如来自Bovogen的BovostarBSA(WilliamsAveKeilorEastVIC3033,Australia)。使用血清的技术缺点包括血清的不确定性，在成分上批次与批次间的差异，和污染的风险。由于存在这样定义的血清衍生产品(如高纯度的白蛋白)，这样的缺点不会再引入无血清培养基中。
本文使用的术语“哺乳动物”指的是哺乳纲的任何成员，包括，但不限于：人类和非人灵长类，如黑猩猩和其它猿类和猴类；农场动物如牛、羊、猪、山羊和马；家畜如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年的和新生个体，以及胎儿，无论雌雄，旨在包括在该术语的范围内。
本文使用的单数形式的术语“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“所述(the)”包括复数形式，除非上下文清楚地规定。例如，用于分离“一个/种(a)”DNA分子的方法，包括分离多个/种分子(例如数十(10's)、数百(100's)、数千(1000's)、数万(10'softhousands)、数十万(100'softhousands)、数百万，或更多的分子)。
本文使用的术语“约(about)”，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。
本文使用的术语“和/或”，指一种或多种所述情况可单独发生，或可与所述情况中的至少一种乃至与所有情况组合发生的情形。
本文使用的术语“至少”指特定值与所述特定值相同或比所述特定值大的情形。例如，“至少2”被理解为与“2或更多”相同，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15等。
本文使用的术语“包含(comprising)”或“包含(tocomprise)”和它们的动词变化形式，指的是其中所述术语以其非限制性意义用来表示包括该词后面的项目，但不排除未特别提到的项目的情形。它也包含更限制性的动词“由…组成”。另外，提到用不定冠词“a(一个/种)”或“an(一个/种)”限定的元素不排除存在一个/种以上所述元素的可能性，除非上下文清楚地要求有一个且只有一个所述元素。因此，不定冠词“a(一个/种)”或“an(一个/种)”通常意味着“至少一个/种”。进一步理解，当本文提及“序列”时，通常指的是有一定顺序亚基(例如氨基酸)的实际物理分子。
本文使用的术语“常规技术”指实施本发明方法中用到的常规技术的方法，对技术人员是显而易见的情况。在分子生物学、生物化学、细胞培养、基因组学、测序和相关领域中常规技术的实践，对本领域技术人员而言是众所周知的，且例如，在下面的参考文献中有讨论：HumanEmbryonicStemCell:ThePracticalHandbook(人类胚胎干细胞：实用手册).Publisher:JohnWiley&Sons,LTD,Editors(Sullivan,S.,Cowan,C.A.,Eggan,K.)HarvardUniversity,Cambridge,MA,USA(2007)；HumanStemCell,aLaboratoryGuide(2ndEdition)(人类干细胞，实验室指南，第二版)byPeterson,S.,andLoring,J.F.(2012)。
本文使用的术语“常规的科学术语”，除非明确定义外，指的是本文使用的技术和科学术语，其和本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。Singletonetal.,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology(微生物学和分子生物学字典)2nded.,J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1994)；March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure(高级有机化学反应：机制和结构)4thed.,J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1992)以及SambrookandRussel,MolecularCloning:ALaboratoryManual3rded.(分子克隆：实验室手册),ColdSpringHarborLaboratoryPress(ColdSpringHarbor,N.Y.2001)为本领域技术人员提供了用于本申请的许多术语的普遍指导。本领域技术人员应意识到许多方法和材料类似或等同于本文所描述的那些，其可用于本发明的实践中。的确，本发明决不限于描述的方法和材料。
本文使用的术语“少于”或“高达”等，指的是从0直至并包括提供的数值的范围。例如，“少于10”和“高达10”被理解为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
贯穿本发明的公开内容，当提及例如术语“2.5μg/ml胆固醇”时，技术人员应理解的是，“2.5μg/ml胆固醇”意在表示每ml的培养基中有2.5μg胆固醇。
本文使用的术语“三维培养”通常为技术人员所理解，并且指培养细胞的方法，其中细胞被植入或接种到能够支持三维组织形成的人工结构中。这些结构通常称为支架，在离体(exvivo)以及在体外对重现(recapitulating)体内环境并且允许细胞影响它们自身的微环境至关重要。
本文使用的术语“等渗溶液”，指的是这样的溶液，即其有效渗透压摩尔浓度(effectiveosmoleconcentration)与和它相比的另一溶液或另一细胞和/或组织的溶液浓度相同。例如，当水和总溶质分子的浓度在外溶液中与在细胞内容物中相同时，即发生这种情况。水分子通过细胞质膜在两个方向扩散，并且由于水扩散的速率在两个方向是相同的，细胞将不增加水也不失水。在本发明中，等渗组合物指的是一种溶液，该溶液中水和总溶质分子的浓度在外溶液中与在保藏、转置或保存于本发明组合物中的细胞的细胞内容物中相同，或与在保藏、转置或保存于本发明组合物中的部分组织和/或器官的细胞的细胞内容物中相同。
本发明使用的术语“个体”指的是任何脊椎动物，但是通常涉及哺乳动物，例如，人类患者、家畜(如狗或猫)、农场动物(如马、牛或羊)或实验室动物(如大鼠、小鼠、非人灵长类动物或豚鼠)。在优选的实施方案中，所述个体是人，优选是成人。
本发明的培养基组合物
在第一方面中，本发明涉及基于水的水性培养基组合物。尤其是，本发明涉及一种培养基组合物，其中所述培养基组合物基本上是无血清的并包含甲状腺激素样化合物、脂质混合物和肉毒碱化合物。
在制备本发明的培养基组合物时，使用(化学上定义的)无血清培养基以避免每批血清在其支持衍生自体外培养的PESC-和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟和保持的能力上的偏差，是特别有利的。(化学上定义的)无血清培养基的使用对于确保结果的再现性和保持由使体外培养的PESC和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟获得的成体样(成熟的)心肌细胞的产量和质量，也是有益的。(化学上定义的)无血清培养基的使用，对于避免潜在的病原体污染的风险和降低由体外培养的PESC和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞的免疫原性也是令人满意的。化学上定义的无血清培养基在本领域中是众所周知的，并且可在市场上买到。本领域技术人员知道如何挑选合适的(化学上定义的)无血清培养基用于本发明培养基组合物的制备。市场上可买到的和(化学上定义的)无血清培养基的非限制性实例包括，F-12营养混合物(Ham)、F-10营养混合物、LeibovitzL-15、McCoy's5A、MCDB131、G-MEM、改良的MEM、DMEM、DMEM/F12、RPMI-1640、Waymouth'sMB752/1、Williams'MediaE、IMDM、Media199、Opti-MEM、改良的Eagle培养基(MEM)、最小必需培养基(MEM)、BGJb(Fitton-Jackson改良)、CMRL、BME。一种或多种化学上规定的无血清培养基的混合物可应用于本发明的培养基组合物。两种化学上规定的无血清培养基的混合物的非限制性实例是，例如包含IMDM和F12营养物(Ham)的混合物。经证明，所述混合物特别适合于制备本发明的培养基组合物。
本发明人发现，在本发明的培养基组合物中添加甲状腺激素样化合物大大地促进和提高了由体外培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞获得的心肌细胞的成熟。特别是，发现将衍生自体外培养的PESC-和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞暴露于至少一种甲状腺激素样化合物，导致电生理属性和机械属性成熟增强(例如，心肌细胞的成体样动作电位、更低的静止膜电位和更强的节律性收缩)。也可检测到钙稳态成熟的增强(如钙电流)，心肌细胞的超微结构成熟的增强(即出现类似成体表型的组织化条纹模式(organizedstriatedpattern)和细长形状)，以及成体或成体样(成熟的)心肌细胞表型特有的其它特性如代谢过程成熟的增强(例如，线粒体活性增强)，以及成体特定阶段的基因标记(例如肌钙蛋白I和α辅肌动蛋白等)的检测。
本发明人还出人意料地发现，与本发明的培养基组合物中没有甲状腺激素样化合物存在的情况相比，在本发明的培养基组合物中添加至少一种甲状腺激素样化合物增强了成体样(成熟的)心肌细胞的存活，所述成体样(成熟的)心肌细胞由体外培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生。据观察，这种作用也全面提高由体外培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞的产量，所述成体样(成熟的)心肌细胞可通过本发明的方法得到。
用于制备本发明培养基的合适甲状腺激素样化合物包括，但不限于，T3、T4(其是甲状腺激素而不可通过5'-碘化酶转化为T3，参见下文)，DIPA，和甲状腺激素激动剂化合物例如GC-1化合物、RO化合物、CO23化合物、KB2115化合物等。T3是由甲状腺产生的基于酪氨酸的天然存在的激素，其在个体发育期间产生。甲状腺激素在血液中的另一种形式是甲状腺素(T4)，其比T3具有更长的半衰期。释放到血液中的T4与T3的比值大致为20:1。T4在细胞内通过脱碘化酶(5'-碘化酶)转化为活跃的T3(比T4有效3-4倍)。T3和T4在本领域是众所周知的，且可在市场上买到。
在一个实施方案中，甲状腺激素样化合物是三碘甲状腺氨酸(T3)和3,5-二碘甲状腺丙酸(DITPA)。
在一个实施方案中，本发明的培养基组合物包含约1.0ng/ml到约150ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约10ng/ml到约125ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约25ng/ml到约100ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约30ng/ml到约75ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约40ng/ml到约60ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约53ng/ml到约55ng/ml的甲状腺激素样化合物。
例如，可用于本文所教导的培养基组合物和/或本文所教导的方法和/或本文所教导的试剂盒的甲状腺激素样化合物浓度的非限制性实例可包括约0.0001ng/ml到约500ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约0.001ng/ml到约400ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约0.05ng/ml到约300ng/ml的甲状腺激素样化合物，优选约0.075ng/ml到约200ng/ml的甲状腺激素样化合物，更优选约0.09ng/ml到约110ng/ml的甲状腺激素样化合物。
在一个实施方案中，本发明的培养基组合物包含约25ng/ml到约150ng/ml的甲状腺激素样化合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的培养基组合物包含约50ng/ml的甲状腺激素样化合物，例如40-60ng/ml的甲状腺激素样化合物。
在一个实施方案中，本发明的培养基组合物包含约1.0ng/ml到约150ng/ml的T3，优选约10ng/ml到约125ng/ml的T3，优选约25ng/ml到约100ng/ml的T3，优选约30ng/ml到约75ng/ml的T3，优选约40ng/ml到约60ng/ml的T3，优选约53ng/ml到约55ng/ml的T3。
例如，可用于本文所教导的培养基组合物和/或本文所教导的方法和/或本文所教导的试剂盒的甲状腺激素样化合物浓度的非限制性实例可包括约0.0001ng/ml到约500ng/ml的T3，优选约0.001ng/ml到约400ng/ml的T3，优选约0.05ng/ml到约300ng/ml的T3，优选约0.075ng/ml到约200ng/ml的T3，更优选约0.09ng/ml到约110ng/ml的T3。
在实施方案中，本发明的培养基组合物包含约25ng/ml到约150ng/ml的T3。
在优选的实施方案中，本发明的培养基组合物包含约50ng/ml的T3，例如40-60ng/ml的T3。
在实施方案中，本发明的培养基组合物包含约25ng/ml到约150ng/ml的T3和/或约1μM到约2μM的DITPA。
在实施方案中，本发明的培养基组合物包含至少一种选自T3和DITPA的甲状腺激素样化合物。
本发明的一个实施方案中，T3和DITPA可在本发明的培养基组合物和/或方法中交换或组合使用。在优选的实施方案中，T3用于本发明的培养基组合物和/或方法中。
在另一个实施方案中，T3和/或DITPA可与一种或多种选自T4，甲状腺激素激动剂化合物例如GC-1化合物、RO化合物、CO23化合物、KB2115化合物等的甲状腺激素样化合物组合使用。
在另一个实施方案中，本发明的培养基组合物包含约0.01nM到约10μM的DITPA，优选约0.1nM到8μM的DITPA，优选约0.2nM到6μM的DITPA，优选0.3nM到5μM的DITPA，优选约0.4nM到4μM的DITPA，优选约0.5nM到3μM的DITPA，优选约0.6nM到2μM的DITPA，更优选约0.75nM到1.5μM的DITPA.
在实施方案中，本发明的培养基组合物包含至少约1nM的DITPA，优选地约1μM的DITPA，但优选地不多于约10μM的DITPA。
在优选的实施方案中，本发明的组合物包含约0.1ng/ml到100ng/ml的T3和约1nM到1μM的DITPA。
在实施方案中，本文所教导的培养基组合物可包含T3和DITPA。基于本文所公开的信息，技术人员可确定T3和DITPA的合适量和浓度。例如，T3和DITPA的合适浓度可为至少约0.1ng/ml的T3和至少约1nM的DITPA，更优选约100ng/ml的T3和约1μM的DITPA。合适的浓度的另一个实例可为至少约25ng/ml的T3和至少约1nM的DITPA，更优选约50ng/ml的T3和约1μM的DITPA。
其它甲状腺激素样化合物、甲状腺激素衍生物和甲状腺激素前体也可用于制备根据本文所教导的本发明的培养基组合物，但T3和/或DITPA是优选的。技术人员也知道如何选择合适和有效的甲状腺激素样化合物、甲状腺激素衍生物和甲状腺激素前体，并且知道如何根据本文公开的信息确定有效剂量。
在一个实施方案中，脂质混合物包含胆固醇和一种或多种选自亚麻酸、亚油酸和棕榈酸的脂质。
本发明人发现，将脂质混合物添加到本文所教导的培养基组合物中对培养和使衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样心肌细胞成熟为成体样(成熟的)心肌细胞和将所述成体样心肌细胞在体外培养环境中维持延长的时期是有益的。在不受任何理论约束的情况下，添加(化学上定义的)脂质混合物到本发明的培养基组合物通常认为使得所述培养基更符合体内自然环境，在该环境中PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟为成体样(成熟的)心肌细胞。本发明人发现，化学上定义的脂质混合物在本发明的培养基组合物中的存在优化了体外培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟和存活。化学上定义的脂质混合物在本发明的培养基组合物中的存在看起来特别有利于支持和调节能量代谢变化(即线粒体代谢)，这种变化发生在使由体外培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的心肌细胞成熟的过程中。
在优选的实施方案中，脂质混合物包含胆固醇、亚麻酸、亚油酸和棕榈酸。胆固醇、亚麻酸和亚油酸在本领域中是众所周知的，且可在市场上买到。
在实施方案中，本发明的培养基组合物包含约1μg/ml到约4μg/ml的胆固醇。
在实施方案中，本发明的培养基组合物包含约0.01μg/ml到5μg/ml的胆固醇，优选约0.1μg/ml到4.5μg/ml的胆固醇，优选约1.0μg/ml到4.0μg/ml的胆固醇，优选约1.5μg/ml到3.0μg/ml的胆固醇，更优选约2.0μg/ml到2.5μg/ml的胆固醇。
在本发明的一个实施方案中，培养基组合物包含约0.01μg/ml到约20μg/ml的亚麻酸，优选约0.04μg/ml到约18μg/ml的亚麻酸，优选约0.06μg/ml到约16μg/ml的亚麻酸，优选约0.08μg/ml到约14μg/ml的亚麻酸，优选约0.09μg/ml到约12μg/ml的亚麻酸，优选约0.095μg/ml到约11μg/ml的亚麻酸，更优选约0.1μg/ml到约10μg/ml的亚麻酸。
例如，可用于本文所教导的培养基组合物和/或本文所教导的方法和/或本文所教导的试剂盒的亚麻酸浓度的非限制性实例可包括约0.001μg/ml到0.5μg/ml的亚麻酸，优选约0.005μg/ml到0.4μg/ml的亚麻酸，优选约0.0075μg/ml到约0.3μg/ml的亚麻酸，优选约0.01μg/ml到0.2μg/ml的亚麻酸，更优选约0.075μg/ml到0.15μg/ml的亚麻酸.
在优选的实施方案中，培养基组合物包含约0.1μg/ml的亚麻酸，例如0.05-0.3μg/ml的亚麻酸。
在本发明的实施方案中，培养基组合物包含约0.01μg/ml到约20μg/ml的亚油酸，优选约0.04μg/ml到约18μg/ml的亚油酸，优选约0.06μg/ml到约16μg/ml的亚油酸，优选约0.08μg/ml到约14μg/ml的亚油酸，优选约0.09μg/ml到约12μg/ml的亚油酸，优选约0.095μg/ml到约11μg/ml的亚油酸，更优选约0.1μg/ml到约10μg/ml的亚油酸。
例如，可用于本文所教导的培养基组合物和/或本文所教导的方法和/或本文所教导的试剂盒的亚油酸浓度的非限制性实例可包括约0.001μg/ml到0.5μg/ml的亚油酸，优选约0.005μg/ml到0.4μg/ml的亚油酸，优选约0.0075μg/ml到0.3μg/ml的亚油酸，优选约0.01μg/ml到0.2μg/ml的亚油酸，更优选约0.075μg/ml到0.15μg/ml的亚油酸。
在优选的实施方案中，培养基组合物包含约0.1μg/ml的亚油酸，例如0.05-0.3μg/ml的亚油酸。
在本发明的实施方案中，培养基组合物包含约0.01μg/ml到约20μg/ml的棕榈酸，优选约0.04μg/ml到约18μg/ml的棕榈酸，优选约0.06μg/ml到约16μg/ml的棕榈酸，优选约0.08μg/ml到约14μg/ml的棕榈酸，优选约0.09μg/ml到约12μg/ml的棕榈酸，优选约0.095μg/ml到约11μg/ml的棕榈酸，更优选约0.1μg/ml到约10μg/ml的棕榈酸。
例如，可用于本文所教导的培养基组合物和/或本文所教导的方法和/或本文所教导的试剂盒的棕榈酸浓度的非限制性实例可包括约0.001μg/ml到0.5μg/ml的棕榈酸，优选约0.005μg/ml到0.4μg/ml的棕榈酸，优选约0.0075μg/ml到0.3μg/ml的棕榈酸，优选约0.01μg/ml到0.2μg/ml的棕榈酸，更优选约0.075μg/ml到0.15μg/ml的棕榈酸。
在优选的实施方案中，培养基组合物包含约0.1μg/ml的棕榈酸，例如0.05-0.3μg/ml的棕榈酸。
在实施方案中，本发明人发现，当本发明的培养基组合物包含约2.2μg/ml的胆固醇、约0.1μg/ml的亚麻酸、约0.1μg/ml的亚油酸和约0.1μg/ml的棕榈酸时，与其中本发明的培养基组合物缺少这种特定脂质混合物的情况相比，本发明的培养基组合物在使衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟为成体样(成熟的)心肌细胞中特别有效。
在实施方案中，通过将其它脂质添加到本发明的培养基组合物中以扩大脂质混合物可能是有益的，尽管不是必需的。
在一个实施方案中，脂质混合物可进一步包含一种或多种选自花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、普朗尼克F-68、硬脂酸和吐温80的成分。
在实施方案中，脂质混合物进一步包含两种或更多种选自花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、普朗尼克F-68、硬脂酸和吐温80的脂质。本发明人发现，在本文所教导的培养基组合物中加入选自花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、普朗尼克F-68、硬脂酸和吐温80的两种或更多种脂质，与本文所教导的培养基组合物不包含这种特殊的脂质混合物的情况相比，导致培养基组合物在促进和增强体外培养的PESC和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟的能力方面更有效。
在优选的实施方案中，脂质混合物包含胆固醇、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、普朗尼克F-68、硬脂酸和吐温80。
本发明人发现，与其中本发明的培养基组合物缺少特殊的脂质混合物的情况相比，在本文所教导的培养基组合物中添加包含胆固醇、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、普朗尼克F-68、硬脂酸和吐温80的脂类混合物，导致对体外培养的PESC和/或iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟有更大影响，从而获得成体样(成熟的)心肌细胞。
技术人员知道如何利用本文公开的信息制备合适的脂质混合物。包含胆固醇、亚油酸、亚麻酸、棕榈酸、花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、普朗尼克F-68、硬脂酸和吐温80的化学上定义的脂质混合物，在本领域中是众所周知的，且可从供应商处购买。市场上可买到的脂质混合物的非限制性实例，适合于本发明的是Gibco化学上定义的脂质浓缩物(Gibco’sChemicallyDefinedlipidConcentrate)(目录号：11905-031，总量:100mL)，其特征是它包含2.0mg/L的花生四烯酸、220mg/L的胆固醇、70mg/L的DL-α-醋酸生育酚、置信度(confidentiallevels)为100％的乙醇、10mg/L的亚油酸、10mg/L的亚麻酸、10mg/L的肉豆蔻酸、10mg/L的油酸、10mg/L的棕榈酸、10mg/L的棕榈油酸、90000mg/L的普朗尼克F-68、10mg/L的硬脂酸、2200mg/L的吐温而且，包含不同成分的脂类和其衍生物的其它脂质混合物，以相似或不同的浓度存在，也可用于本发明的培养基组合物，但优选使用本文所教导的脂质混合物。技术人员知道如何制备可选的脂质混合物，知道如何选择单个的脂质和其衍生物，并且知道如何选择合适的有效剂量，以便保持如本文所公开的根据本发明的培养基的功效。
在制备本文所教导的培养基组合物时，将肉毒碱添加到所述培养基组合物中可能会特别有利。在不受任何理论约束的情况下，本发明人发现，在衍生自体外培养的PSC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的分化和成熟期间，肉毒碱对促进生物能量学途径(例如线粒体活性)是有益的。
在一个实施方案中，本发明的培养基组合物可包含约0.5mM到约3.5nM的肉毒碱。
在另一个实施方案中，本发明的培养基组合物可包含约0.01到5mM的肉毒碱，优选约0.1mM到4mM的肉毒碱，优选约0.5mM到3mM的肉毒碱，优选约1.0mM到2.5mM的肉毒碱，更优选约1.5mM到2.25mM的肉毒碱。
在一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物可进一步包含肌酸化合物和牛磺酸化合物。
在不受任何理论约束的情况下，本发明人发现，在本发明的培养基组合物中添加肉毒碱是有益的，从而预防或减轻细胞死亡，和添加牛磺酸是有益的，从而预防或减轻在体外培养中由局部缺血引起的细胞坏死和细胞凋亡。本发明人还观察到，在本发明的培养基组合物中存在T3、肉毒碱、肌酸和牛磺酸代表了一个强大的组合，这是就以下而言，即本文所教导的培养基组合物中所述组合的存在增强了衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟，同时促进了它们在体外培养时的存活。这种影响也与通过本文所教导的方法由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞获得的成体样(成熟的)心肌细胞的产量增加(较大数量)相关。
在一个实施方案中，本发明的培养基组合物可包含约3.0mM到约7.0mM的肌酸。
在实施方案中，本发明的培养基组合物可包含约2.0mM到约7.0mM的肌酸。
在实施方案中，本发明的培养基组合物可包含约1-10mM的肌酸，优选约2-8mM的肌酸，优选约3-7mM的肌酸，优选约3.5-6.0mM的肌酸，更优选约4.5-5.5mM的肌酸。
在实施方案中,本发明的培养基组合物可包含约1.0到约25mM的牛磺酸，优选约2.0到约20mM的牛磺酸，优选约3到约15mM的牛磺酸，优选约4.0到约10mM的牛磺酸，优选约4.5到约7mM的牛磺酸，更优选约5mM的牛磺酸。
例如，可用于本文所教导的培养基组合物和/或本文所教导的方法和/或本文所教导的试剂盒的牛磺酸浓度的非限制性实例可包含约0.01mM到约5mM的牛磺酸，优选约0.1mM到约4mM的牛磺酸，优选约0.5mM到约3mM的牛磺酸，优选地约1.0mM到约2.5mM的牛磺酸，更优选约1.5mM到约2.25mM的牛磺酸。
在优选的实施方案中，本发明的培养基组合物可包含约0.01mM到5mM的肉毒碱，优选约0.1mM到4mM的肉毒碱，优选约0.5mM到3mM的肉毒碱，优选约1.0mM到2.5mM的肉毒碱，更优选约1.5mM到2.25mM的肉毒碱，和约1mM到10mM的肌酸，优选约2mM到8mM的肌酸，优选约3mM到7mM的肌酸，优选约3.5mM到6.0mM的肌酸，更优选约4.5mM到5.5mM的肌酸，和约1.0mM到25mM的牛磺酸，优选约2.0mM到20mM的牛磺酸，优选约3mM到15mM的牛磺酸，优选约4.0mM到10mM的牛磺酸，优选约4.5mM到7mM的牛磺酸，更优选约5mM的牛磺酸。
在本发明优选的实施方案中，据发现，当本文所教导的培养基组合物包含约2mM的肉毒碱，约5mM的肌酸，和约5mM的牛磺酸时获得最佳结果，还发现，L-肉毒碱特别适合制备本文所教导的培养基组合物。
在实施方案中，本发明的培养基可进一步包含约1mg/L到约50mg/L的胰岛素，优选约3mg/L到约40mg/L的胰岛素，优选约5mg/L到约30mg/L的胰岛素，优选约7mg/L到约20mg/L的胰岛素，优选约9mg/L到约12mg/L的胰岛素，优选约9.5mg/L到约10.5mg/L的胰岛素，更优选约10mg/L的胰岛素。
在另一个实施方案中，本发明的培养基可进一步包含约1mg/L到约25mg/L的转铁蛋白，优选约1.5mg/L到约20mg/L的转铁蛋白，优选约2mg/L到约15mg/L的转铁蛋白，优选约2.5mg/L到约10mg/L的转铁蛋白，优选约3mg/L到约8mg/L的转铁蛋白，优选约3.5mg/L到约7mg/L的转铁蛋白，优选约4mg/L到约6mg/L的转铁蛋白，优选约4.5mg/L到约5.7mg/L的转铁蛋白，更优选5.5mg/L的转铁蛋白。
在进一步的实施方案中，本发明的培养基可进一步包含约0.001mg/L到约0.01mg/L的硒(或亚硒酸钠)，优选约0.002mg/L到约0.009mg/L的硒(或亚硒酸钠)，优选约0.003mg/L到约0.008mg/L的硒(或亚硒酸钠)，优选约0.004mg/L到约0.0075mg/L的硒(或亚硒酸钠)，优选约0.005mg/L到约0.007mg/L的硒(或亚硒酸钠)，优选约0.006mg/L到约0.0069mg/L的硒(或亚硒酸钠)，优选约0.0065mg/L到约0.0068mg/L的硒(或亚硒酸钠)，更优选约0.0067mg/L的硒(或亚硒酸钠)。
在优选的实施方案中，本发明的培养基可进一步包含约5mg/L到约15mg/L的胰岛素，和约3mg/L到约8mg/L的转铁蛋白，和约0.005mg/L到约0.0075mg/L的硒(或亚硒酸钠)。
在优选的实施方案中，本文所教导的培养基组合物可包含约10mg/L的胰岛素，约5.5mg/L的转铁蛋白和约0.0067mg/L的硒(或亚硒酸钠)。
胰岛素、转铁蛋白和硒在本领域中是众所周知的，且可市场上买到。包含胰岛素、转铁蛋白和硒的市场上可买到的制剂的非限制性实例是Gibco的胰岛素-转铁蛋白-硒的乙醇胺溶液(Gibco’sInsulin-Transferrin-SeleniumEthanolamineSolutio)(ITS-X)制剂(目录#51500，总量：10mL)。其特点是它包含1000mg/L(0.17mM)的胰岛素，550mg/L(6.87mM)的转铁蛋白，0.67mg/L(0.0038mM)的亚硒酸钠，200mg/ml(3.27mM)的乙醇胺。
在一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物可进一步包含一种或多种微量元素。本发明人发现，与本文所教导的培养基组合物缺少一种或多种微量元素的情况相比，在所述培养基中一种或多种微量元素的存在，特别有利于促进衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟。据发现，与本文所教导的培养基组合物缺少一种或多种微量元素的情况相比，一种或多种微量元素的存有利于将由体外培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或由体外培养的iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞维持延长的时期，例如高达几个月。本发明人还发现，与本文所教导的培养基组合物缺少一种或多种微量元素的情况相比，一种或多种微量元素的添加对增加由体外培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞和/或由体外培养的iPSC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞获得的成体样(成熟的)心肌细胞的产量(数量)和质量是有益的。在不受任何理论约束的情况下，除了其它有益的生物活动外，一种或多种微量元素的存在还提供了抗氧化活性。该一种或多种微量元素优选以离子或螯合物存在。离子可以是仅包含单个元素的简单离子或可以是包含两个或更多个元素的复杂离子。离子可以是仅包含一个单个元素的简单离子或可以是包含两个或更多个元素的复杂离子。优选地，所述元素可以是过渡金属元素，例如，选自Sc、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu5Zn、Ga、As、Se、Br、Al、Si、P、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Rb、Ce、Ag、Pd、Ag、Cd、In、Sn、Sb、F、Te、Au、Pt5Bi、Ir、Os、Re、W、Ta和Hf的元素。
在一个实施方案中,本发明的培养基组合物可包含选自Mn、Si、Mb、V、Ni、Sn、AL、Ag、Ba、K、Cd、Co、CR、F、Ge、I、Rb和Zr的一种或多种微量元素，优选所有微量元素。
在另一个实施方案中，一种或多种微量元素可选自MnSO4.H2O、Na2SiO3.9H2O、钼酸和铵盐((NH4)6Mo7O24.4H2O)、NH4VO3、NiSO4.6H2O、SnCl2(无水)、AlCl3.6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCl2、CoCl2.6H2O、CrCl3(无水)、NaF、GeO2、Kl、RbCl和ZrOCl2.8H2O。
在优选的实施方案中，本发明的培养基组合物可包含MnSO4.H2O、Na2SiO3.9H2O、钼酸铵盐((NH4)6Mo7O24.4H2O)、NH4VO3、NiSO4.6H2O、SnCl2(无水)、AlCl3.6H2O、AgNO3、Ba(C2H3O2)2、KBr、CdCl2、CoCl2.6H2O、CrCl3(无水)、NaF、GeO2、Kl、RbCl和ZrOCl2.8H2O。
适合于本文所教导的培养基制备的微量元素制剂在本领域中是众所周知的，且可市场上买到。例如，市场上可买到的微量元素制剂B(来自Corning，目录号：25-02)和微量元素制剂C(来自Corning，目录号：25-023)可用于本发明。本发明人发现，对于最佳的结果，优选制剂C和制剂B以约30:1-1:30、优选约5:1-20:1的比例混合，更优选10:1(即制剂C是制剂B的10倍)。技术人员知道如何制备微量元素混合物以及如何选择一个有效比例。例如，通过制剂C和制剂B以10:1(即制剂C是制剂B的10倍)的比例混合得到的微量元素混合物，可通过将约0.05ml到5ml的制剂B添加到10000ml的培养基中，优选将约0.01到4ml的制剂B添加到10000ml的培养基中，优选将约0.5ml到3ml的制剂B添加到10000ml的培养基中，优选将0.75ml到2ml的制剂B添加到10000ml的培养基中，更优选将约1ml的制剂B添加到10000ml的培养基中，也可通过将0.05ml到5ml的制剂C添加到1000ml的培养基中，优选将约0.01到4ml的制剂C添加到1000ml的培养基中，优选将约0.5ml到3ml的制剂C添加到1000ml的培养基中，优选将0.75ml到2ml的制剂C添加到1000ml的培养基中，更优选将约1ml的制剂C添加到1000ml的培养基中，按一定比例，例如上面给出的，例如制剂C与制剂B的比例为10:1。来源于混合其它微量元素制剂或来源于使用自制制剂或混合物的其它等同的微量元素混合物，也可用于制备本发明的培养基组合物，但本文所教导的微量元素和微量元素混合物是优选的。
在一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物可进一步包含聚乙烯醇(PVA)。在不受任何理论约束的情况下，本发明人发现，与本文所教导的培养基组合物缺少PVA的情况相比，在本发明的培养基组合物中存在PVA对促进衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞之间的三维排列的形成和保持是特别有利的。对于由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞，也观察到相同的优点。
PVA在本领域中是众所周知的，且可在市场上买到。PVA类似物或衍生物也可用于制备根据本发明的培养基，但本文所公开的PVA是优选的。技术人员知道如何制备和溶解PVA以获得合适的PVA液体形式。
在实施方案中，本发明的培养基可进一步包含2mg/ml到约7mg/ml的PVA。
在本发明的实施方案中，培养基组合物可包含约0.1mg/ml到10mg/ml的PVA，优选约3mg/ml到8mg/ml的PVA，更优选约4mg/ml到6mg/ml的PVA。
在优选的实施方案中，培养基组合物可包含至少约1.25mg/ml的PVA，优选约5mg/ml的PVA。
在实施方案中，本发明的培养基可进一步包含选自以下的一种或多种化合物：必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素、有机物、无机盐、高度纯化的牛血清白蛋白、生长添加剂(如HamF12营养物质混合物)、抗氧化剂、抗生素、单硫代甘油(monothiolglycerol)、谷氨酰胺和葡萄糖。所述培养基组合物也可进一步包含生理上可接受的盐溶液，优选等渗盐溶液。
在优选的实施方案中，本发明的培养基组合物可进一步包含牛血清白蛋白、葡萄糖、维生素、抗生素、单硫代甘油、谷氨酰胺、氨基酸和Ham的F12营养物质混合物。
本发明人发现，相对于标准的无血清培养基，使用具有更低葡萄糖浓度的无血清培养基对本发明培养基的制备是有利的。例如，标准的无血清培养基包含约3000mg/L(17.5mM)的葡萄糖。市场上可买到的低葡萄糖无血清培养基包含约1000mg/L(5.5mM)的葡萄糖。
在实施方案中，这样的低葡萄糖无血清培养基制剂可用于制备本发明培养基组合物。市场上可买到的低葡萄糖无血清培养基或任何其它自制制剂的稀释液可用于制备本发明的培养基组合物。
在实施方案中，本文所教导的培养基组合物可包含约1-10mM的葡萄糖，优选约2-8mM的葡萄糖，优选3-7mM的葡萄糖，优选4.5-6.5mM的葡萄糖，更优选约5.0-6.0mM的葡萄糖。
在一个优选的实施方案中，本文所教导的培养基组合物可包含至少约1mM的葡萄糖和不多于约5.5mM的葡萄糖。
在进一步的实施方案中，本文所教导的培养基组合物可包含约10-200μM的葡萄糖，优选约25-150μM的葡萄糖，更优选约45-120μM的葡萄糖。优选，培养基组合物包含至少约55μM的葡萄糖和不多于约111μM的葡萄糖。
在实施方案中，本发明的培养基组合物可以是无葡萄糖的。在另一个实施方案中，所述葡萄糖是D-葡萄糖。
在一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物可以是液体形式、半液体形式或固体形式或半固体形式。在优选的实施方案中，本发明的培养基组合物是液体形式。
在一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物可以是固体组合物，优选是粉末组合物，其中所述组合物可溶解于水溶液中，从而获得本文所教导的组合物。
固体形式的非限制性实例包括粉末、颗粒、片剂、糊剂、浆、湿混合物、丸、冻干形式、冷冻干燥形式等。
在优选的实施方案中，固体形式是粉末。
本文所教导的培养基组合物也可称为“成熟培养基组合物”。
本文所教导的培养基组合物可缺少甲状腺激素样化合物。换句话说，具有如上文详细描述的相同成分但没有任何甲状腺激素样化合物添加或存在的相同培养基，可用于使用本文所公开的方法或试剂盒使衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟。
本发明人发现，本发明的这种可选的培养基组合物(即无甲状腺激素样化合物)可用于使衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟，如实施例验证。但是，本发明人观察到，本文所教导的培养基组合物(但缺少甲状腺激素样化合物)对衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟的影响，没有用本发明的培养基组合物(但其包含至少一种甲状腺激素样化合物)得到的(本文所教导的)影响明显(效率较低，不太强)。该可选择的培养基，即具有正如上文详细描述的相同组分但不存在任何甲状腺激素样化合物培养基，可单独使用，或与本文所公开的但至少包含甲状腺激素样化合物的培养基组合使用。例如，在优选的实施方案中，可首先将胎儿样心肌细胞暴露于本文所公开的培养基(但没有任何甲状腺激素样化合物)，随后例如在接种1、2、3、4、5、6或7天后，将该培养基用本文所公开的但包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基替换，用于使衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟。
本发明的方法
在第二方面，本发明涉及从PESC和/或iPSC，尤其是从由所述PESC和/或iPSC分化的胎儿样心肌细胞产生成体样心肌细胞的方法，该方法包括以下步骤：
(a)提供一个或多个衍生自PESC和/或iPSC的胎儿样心肌细胞；
(b)将所述胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触从而使所述胎儿样心肌细胞成熟为成体样心肌细胞。
在步骤(a)中，胎儿样(不成熟的)心肌细胞可以从体外培养的PESC和/或iPSC获得，或者可以从其他来源比如市场上可买到的细胞系获得。技术人员知道如何获得以及如何培养所述胎儿样(不成熟的)心肌细胞，使得他们适合用于本发明的方法中。
在实施方案中，胎儿样(不成熟的(心肌细胞可以来自哺乳动物源(mammalianorigin)，例如来自小鼠、大鼠、马、狗、牛或非人灵长类动物等。
在一个优选的实施方案中，胎儿样(不成熟的)心肌细胞可以来自人源，例如，如与Chung(Chungetal.(2008)CellStemCell,Vol2(2):113-117)所描述的技术相同的技术获得。
在步骤(b)中，本文所使用的术语“接触”指本文所教导的培养基组合物和细胞(例如，心肌细胞)或细胞培养(心肌细胞培养)之间的直接相互作用。
在一个实施方案中，步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触至少约1天高达约4周。
在一个实施方案中，步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触至少约1天，优选约2天，优选约3天，优选约4天，优选约5天，优选约6天，优选约7天，优选约8天，优选约9天，优选约10天，优选约11天，优选约12天，优选约13天，优选约14天，更优选约15天。
在实施方案中，步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触至少约3天，高达约15天。
在优选的实施方案中，步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触至少约15天。
在实施方案中，步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物接触之前，所述胎儿样心肌细胞首先与本文所教导的但缺少甲状腺激素样化合物的培养基组合物接触一段时间，例如，1-10天，例如1、2、3、4、5、6、或7天。例如，步骤(b)的胎儿样心肌细胞可以在教导的但缺乏任何一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物中培养2天的时间，接着用本文所教导的但包含至少一种甲状腺激素样化合物(如T3)的培养基组合物更换所述培养基组合物，以及例如从第3天到第4天，或从第3天到第5天，或从第3天到第6天，或从第3天到第7天，或从第3天到第8天，或从第3天到第9天，或从第3天到第10天，或从第3天到第11天，或从第3天到第12天，或从第3天到第13天，或从第3天到第14天或从第3天到第15天开始，允许所述胎儿样心肌细胞与本文所教导的但包含至少一种用于治疗提醒的甲状腺激素样化合物的培养基组合物接触。换句话说，可以使用本文所教导的方法，使用缺少任何甲状腺激素样化合物的培养基组合物，开始成熟过程，同时继续随后的本文所教导的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物。
本发明人发现，在与本文所教导的但包含至少一种甲状腺激素样化合物的本发明的培养基组合物接触之前，首先将衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样心肌细胞与本文所教导的但缺少甲状腺激素样化合物的本发明的培养基组合物接触可能是有利的，从而在体外培养中提高和促进单层心肌细胞的形成。
在另一个实施方案中，将通过分化(未分化的)PESC和/或iPSC为心肌细胞获得的胎儿样心肌细胞培养在增加量的甲状腺激素样化合物例如T3的条件下。换句话说，适时增加甲状腺激素样化合物的浓度(或通过添加到培养基，或通过用本文所公开但与之前的培养基相比具有增加的T3浓度的新培养基替换之前的培养基)。例如，可首先将通过分化(未分化的)PESC和/或iPSC获得的胎儿样心肌细胞在本文公开的培养基(缺少甲状腺激素样化合物)中培养例如1天、2天、3天或4天(或更多天)。1天、2天、3天或4天(或更多天)后，该培养基被本发明含有，例如，10ng/ml的T3的培养基所替换，并额外培养1天、2天、3天或4天(或更多天)。然后该培养基被本发明的包含浓度增加的甲状腺激素样化合物例如T3的新鲜培养基替换。例如，在接下来的步骤中的培养基组合物包含50ng/ml的T3。如果要求或需要，使用与较高浓度的甲状腺激素样化合物相同浓度的额外的步骤可用于将所述细胞培养需要的任意天数。
在一个实施方案中，将步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触，其中培养基组合物在至少21℃至高达基本上不高于37℃的温度下。
在另一个实施方案中，将步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触，其中培养基组合物在约30℃的温度，优选约31℃，优选约32℃到约33℃，优选约34℃，优选约35℃，优选约36℃，更优选约37℃下。在优选的实施方案中，将步骤(b)的胎儿样心肌细胞与本文所教导的培养基组合物接触，其中培养基组合物在约37℃的温度下。
在一个实施方案中，在本文所教导的处理持续期间，每天补充本文所教导的培养基组合物。
在优选的实施方案中，在本文所教导的处理持续期间，每2天或3天补充本文所教导的培养基组合物。
在实施方案中，步骤(b)的培养基组合物是固体形式，优选粉末形式，其可溶解于水溶液中，从而获得步骤(b)的液体培养基。
在一个实施方案中，由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞的成熟，可通过评价所述成体样(成熟的)心肌细胞的形态特征，并将结果与从成人个体(或其它来源，例如细胞系)获得的成体心肌细胞的形态特征以及与衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的形态特征相比来确定，所述胎儿样心肌细胞暴露于本文所教导的但缺少至少一种甲状腺激素样化合物培养基组合物。评价细胞形态特征(例如形状)和/或组织学特征(例如存在某些结构或细胞成分，细胞骨架组织等)以便获得关于给定细胞的形态和外观的信息的方法，在本领域中是众所周知的。例如，在本发明中，免疫组织化学技术可用于检测或揭示心肌细胞特定的细胞标记或细胞骨架标记。这样的标记的代表性的非限制性实例是α-辅肌动蛋白。标记的其它非限制性实例包括肌钙蛋白C、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、肌球蛋白重链6、肌球蛋白重7、肌球连接蛋白-C基因、肌球蛋白轻链、原肌球蛋白、肌联蛋白、肌间蛋白等。
本发明人发现，暴露于本文所教导的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞，成熟为成体样心肌细胞，这可由其让人联想到成体(或成体样)阶段的形态特征变化所证明，例如细胞极化、肌节组织化增加和形状延长。这样的形态特征变化在体外培养成熟过程中没有暴露于至少一种甲状腺激素样化合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞中较少观察到。
在另一个实施方案中，通过本文所教导的方法由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞的成熟，可通过评价所述成体样心肌细胞的功能特性，并将结果与从成人个体(或其它来源，例如细胞系)获得的成体心肌细胞的功能特性以及与衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的功能特性相比来确定，所述胎儿样心肌细胞暴露于本文所教导的但缺少至少一种甲状腺激素样化合物培养基组合物中。评价细胞(例如心肌细胞)的功能特性以便获得关于给定细胞的功能特性的信息的方法，在本领域中是众所周知的。例如在本发明中，电生理技术(除了其它技术外)可用于检测或揭示细胞(例如心肌细胞)的特定功能或功能表型。这类生理学技术的非限制性实例是所谓的“膜片钳”技术。
膜片钳技术是众所周知的实验室技术，其允许研究细胞的单个或多个离子通道。这种技术可用于各种细胞，在可兴奋细胞(例如神经元、心肌细胞、肌纤维和胰岛β-细胞)的研究中特别有用。在本发明中，这类技术可用于研究所谓的“动作电位”的特性，其作为细胞(例如心肌细胞)从一个细胞到另一个细胞传达电脉冲能力的指示。例如，关于最大上升速率、动作电位持续时间、静止膜电位和动作电位的振幅的信息可通过使用膜片钳技术获得。
本发明人发现，暴露于本文所教导的包含至少一种甲状腺激素样化合物培养基组合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞，成熟为成体样心肌细胞，这可以由其让人联想到成体(或成体样)阶段的电生理特征变化证明，例如最大上升速率增加、静止膜电位降低和动作电位的振幅增强。这样的电生理特性变化，在体外培养时在成熟过程中没有暴露于至少一种甲状腺激素样化合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞中较少观察到。
在进一步的实施方案中，由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞的成熟，可通过评价所述成体样心肌细胞的代谢过程，并将结果与从成人个体(或其它来源，例如细胞系)获得的成体心肌细胞的代谢过程以及与衍生自体外培养的PESC和/或iPS的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的代谢过程相比来确定，所述胎儿样心肌细胞暴露于本文所教导的但其缺少至少一种甲状腺激素样化合物培养基组合物。评价细胞(例如心肌细胞)的代谢过程以便获得关于给定细胞的代谢功能或途径的效率和成熟度的信息的方法，在本领域中是众所周知的。例如，在本发明中，所谓的“TMRM分析”可用于检测或揭示给定细胞中(例如心肌细胞)线粒体活性的水平。技术人员熟悉TMRM分析，并且知道如何实施这样的分析以获得关于体外培养中心肌细胞的线粒体活性水平的信息。
本发明人发现，暴露于本文所教导的包含至少一种甲状腺激素样化合物培养基组合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞，成熟为成体样心肌细胞，这可由其让人联想到成体(或成体样)阶段的代谢变化证明，例如线粒体活性增强。这样的代谢过程变化在体外培养时、在成熟过程中没有暴露于至少一种甲状腺激素样化合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞中较少观察到。
在又一个实施方案中，由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞的成熟，可通过评价所述成体样心肌细胞的基因表达谱，并将结果与从成人个体(或其它来源，例如细胞系)获得的成体心肌细胞的基因表达谱以及与衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的基因表达谱相比来确定，所述胎儿样心肌细胞暴露于本文所教导的但缺少至少一种甲状腺激素样化合物培养基组合物。评价细胞(例如心肌细胞)的基因表达谱以便获得关于给定基因标记存在(缺失)的信息以及获得关于给定细胞(例如心肌细胞)的给定基因标记的表达水平的信息的方法，在本领域中是众所周知的。例如，在本发明中，原位杂交技术和/或所谓的“基因芯片”分析可用于检测和/或测量针对某些发育阶段(例如胚胎和成体阶段)的基因标记的表达水平。例如，在本发明中，指示成体或成体样阶段的基因标记可用于建立衍生自体外培养的PESC和/或iPSC并暴露于本文所教导的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞是否已成熟为成体样(成熟的)心肌细胞。指示成体(或成体样)阶段的基因标记的非限制性实例包括肌球蛋白轻链2V、肌集钙蛋白和鱼尼丁受体等。一种或多种所述成体样(成熟的)标记(基因)表达的增加将指示成体样(成熟的)阶段。
指示胎儿样(不成熟的)阶段的基因标记也可用于建立衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞是否已成熟(或未成熟)为成体样(成熟的)心肌细胞。通常，衍生自体外培养的PESC和/或iPSC并暴露于本文所教导的但缺少至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物的胎儿样(不成熟的)心肌细胞，将表达指示胎儿样(不成熟的)阶段的基因标记。指示胎儿样(不成熟的)阶段的基因标记的非限制性实例包括NPPA、NPPB、平滑肌肌动蛋白和骨骼肌动蛋白。一种或多种所述胎儿样(不成熟的)标记的(基因)表达的减少，将指示胎儿样(不成熟的)状态。
在一个实施方案中，在本文所教导的方法的步骤(a)之前，未分化的PESC和/或iPSC可用作用于产生成体样心肌细胞的原始材料，以获得适合用于本发明方法的适量胎儿样(不成熟的)心肌细胞。
胎儿样(不成熟的)心肌细胞可通过将未分化的PESC和/或iPSC暴露于适合将未分化的PESC和/或iPSC分化为胎儿样(不成熟的)心肌细胞的分化培养基组合物，从所述未分化的PESC和/或iPSC获得。技术人员非常熟悉适合在体外培养中将未分化的PESC和/或iPSC分化为胎儿样(不成熟的)心肌细胞的方法和培养基组合物。例如在本发明中，适合将未分化的PESC和/或iPSC分化为胎儿样(不成熟的)心肌细胞的基本分化培养基组合物是无血清的，包含(重组)白蛋白和抗坏血酸，以及进一步包含脂质混合物、胰岛素、转铁蛋白和硒以及一种或多种微量元素的培养基组合物。
在另一个实施方案中，本文所教导的基本分化培养基组合物可进一步包含氨基酸、牛血清白蛋白、葡萄糖、维生素、抗生素、硫代甘油、谷氨酰胺和生长因子或小分子(例如骨形态发生蛋白4(BMP4)、激活素A(ACT-A)、干细胞因子(SCF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Chir99021(GSK3β抑制剂))，和其它成分。技术人员知道什么成分或物质(以及以什么剂量)添加到本文所教导的基本分化培养基，从而其适合将未分化的PESC和/或iPSC分化为胎儿样(不成熟的)心肌细胞，其进而适用于本发明的方法中。
本发明人观察到，本文所教导的但缺少甲状腺激素样化合物的培养基组合物也导致几个如上文描述的成体样特征的发育，但比使用本文所教导的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物获得的成体样特征的程度低(效率较低，不太强)。
在一个实施方案中，例如，未分化的PESC和/或iPSC可从市场商购的来源(例如完善的细胞系)获得。技术人员知道如何获得以及如何培养所述未分化的PESC和/或iPSC，以便它们适用于本发明的方法。
在实施方案中，未分化的PESC和/或iPSC可来自哺乳动物源，例如来自小鼠、大鼠、马、狗、牛、或非人灵长类动物等。
在优选的实施方案中，胎儿样(不成熟的)心肌细胞可以来自人源，例如，如通过Chung(Chungetal,(2008)CellStemCell,Vol2(2):113-117)所描述的方法获得。
在一个实施方案中，使用在自旋拟胚体(EB)中实施分化过程的技术，未分化的PESC和/或iPSC可分化为适用于本文所教导的方法的胎儿样(不成熟的)心肌细胞。技术人员熟悉在自旋EB中实施的分化技术。
在另一个实施方案中，使用在单层实施分化过程的技术，未分化的PESC和/或iPSC可分化为适用于本文所教导的方法的胎儿样(不成熟的)心肌细胞。技术人员也熟悉在单层实施的分化技术。
本发明的培养基组合物的合适用途
在第三方面，本发明涉及本文所教导的培养基组合物的合适用途。
在一个实施方案中，通过本发明的方法，本文所教导的培养基组合物适用于在体外培养中使衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞成熟为成体样(成熟的)心肌细胞。
在实施方案中，PESC和/或iPSC细胞可以从哺乳动物源，优选从人源获得。也可以使用由哺乳动物源、优选人源建立的PESC系。例如，各种小鼠PESC细胞系和人PESC系在本领域中是已知的，并且已经很好地限定了它们生长和增殖条件。技术人员知道如何获得适合的PESC系(来自人或其他哺乳动物)，例如通过与Chung(Chungetal(2008)CellStemCell,Vol.2(2):113-117)描述的方法类似的方法或者与Chung等(如上)的方法类似的任何其他方法。
在另一个实施方案中，使用iPSC。技术人员知道如何获得和如何培养iPSC，以便它们适合用于本发明的方法。
在实施方案中，iPSC可来自哺乳动物源，优选来自人源。
在实施方案中，本发明的培养基组合物可用于将由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞维持延长的时期，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、6周和高达6个月。本发明人发现，本文所教导的培养基组合物随着时间的推移提高由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞通过本文所教导的方法产生的成体样(成熟的)心肌细胞的存活(即预防或减少细胞死亡)。该效果还与通过本发明的方法的所述体外培养的成体样心肌细胞的产量增加(较大量)相关联。
在一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物通常可适用于体外细胞培养，优选适用于三维培养。
在另一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物可用于加强或提高由体外培养的PESC衍生的胎儿样(未成熟的)心肌细胞和/或iPSC衍生的胎儿样(未成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞的存活，同时促进所述胎儿样(未成熟的)心肌细胞成熟为成体样(成熟的)心肌细胞。的确，本发明人出人意料地发现，本文所教导的培养基组合物不仅促进和提高衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞成熟为成体样心肌细胞，而且还增加它们在体外培养中的存活。也发现该效果与使用本发明教导的方法的体外培养的成体样(成熟的)心肌细胞的产量增加相关联。
在进一步的实施方案中，本文所教导的培养基组合物可用于运输通过本发明的方法由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞产生的或从其他来源获得的成体样(成熟的)心肌细胞。例如，本发明的培养基组合物可以尤其适用于在容器比如管、培养皿、微量离心管(eppendorfs)、烧瓶等中运输。
在实施方案中，通过本发明的方法由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞，可用于在体外筛选心脏药物以及其他药物。
在另一个实施方案中，通过本发明的方法由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞，可以用于预测毒理学筛选试验。
在进一步的实施方案中，通过本发明的方法由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞，可以用于心血管研究。
在又一个实施方案中，通过本发明的方法由衍生自体外培养的PESC和/或iPSC的胎儿样(未成熟的)心肌细胞产生的成体样(成熟的)心肌细胞，可以用于治疗心脏病或其他疾病，以及用于治疗有需要个体的心脏组织损伤或心脏受损或处于发展为心血管疾病或紊乱风险的个体和/或遭受心脏组织损伤或受损的个体。
在本发明的一个实施方案中，所述个体可为哺乳动物，例如非人灵长类动物、狗、猫、牛、小鼠、大鼠、马等。
在优选的实施方案中，所述个体可为人类个体，优选成人个体。
心脏疾病和心脏失调的非限制性实例包括，但不限于，动脉粥样硬化、中风、先天性心脏病、充血性心力衰竭、心绞痛、心肌炎、冠状动脉疾病、心肌病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心内膜炎、心肌梗死(心脏病发作)、舒张期功能障碍、脑血管疾病、瓣膜疾病、高血压(highbloodpressure)(高血压(hypertension))、二尖瓣脱垂和静脉血栓栓塞。处于危险中的个体包括那些有家族史(高血压，心脏病)、遗传易感性(高胆固醇血症)的个体，或遭受了心脏疾病或心脏失调的早期痛苦的个体。处于危险中的个体进一步包括那些由于遗传易感性或饮食(例如高脂肪)或环境暴露(例如吸烟者)而患有或存在高血压或高胆固醇风险的个体。
本发明的试剂盒
在第四方面，本发明涉及适用于在体外培养中产生成体样心肌细胞的试剂盒，该试剂盒包含本文所教导的培养基组合物。
在实施方案中，本文所教导的试剂盒可进一步包含本文所教导的但缺乏任何甲状腺激素样化合物的培养基组合物。
在一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物，其包含在本文所教导的试剂盒中，可以液体形式提供。
在另一个实施方案中，本文所教导的培养基组合物，其包含在本文所教导的试剂盒中，可以固体形式提供，优选粉末形式。
在进一步的实施方案中，本文所教导的试剂盒可进一步包含(PESC和/或iPSC衍生的，优选人)胎儿样心肌细胞，即试剂盒可包含本文公开的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物和(PESC和/或iPSC衍生的)胎儿样心肌细胞，或例如试剂盒可包含本文公开的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物，和(PESC和/或iPSC衍生的)胎儿样心肌细胞，以及本文所教导的缺乏任何甲状腺激素样化合物的培养基组合物。
在一个实施方案中，胎儿样心肌细胞可衍生自PESC和/或iPSC以及可来自哺乳动物源(例如，大鼠、小鼠、狗、马、牛和非人灵长类动物)，优选地来自人源。
在实施方案中，本文所教导的试剂盒可进一步包含未分化的PESC和/或iPSC。
在一个实施方案中，未分化的PESC和/或iPSC可从哺乳动物源(例如，大鼠、小鼠、狗、马、牛和非人灵长类动物)获得，优选地从人源获得。
在另一个实施方案中，本文所教导的试剂盒可进一步包含关于如何根据本发明的方法使用衍生自PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞作为原始材料产生成体样心肌细胞的说明。
在另一个实施方案中，本文所教导的试剂盒可进一步包含关于如何根据本发明的方法使用未分化的PESC和/或未分化的iPSC作为原始材料产生成体样心肌细胞的说明。
例如，根据原始材料是衍生自PESC和/或iPSC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞或是未分化的PESC和/或未分化的iPSC，可提供关于在体外培养中如何培养、扩增或增殖、分化、成熟、维持和/或保存成体样(成熟的)心肌细胞的说明。
在又一个实施方案中，本文所教导的试剂盒可进一步包含本文所教导的可用于使体外培养的未分化的PESC和/或未分化的iPSC分化为胎儿样(不成熟的)心肌细胞的基本分化培养基组合物。
在实施方案中，可将本文所教导的试剂盒成分提供在合适的包装材料中。本文使用的术语“包装材料”指的是容纳所述试剂盒成分的物理结构。包装材料可将所述成分保持于无菌条件，并可由通常用于这样目的的材料(例如，纸、玻璃、塑料、箔、安瓿等)制成。例如，本文所教导的培养基组合物可包装在小瓶，艾本德(eppendorfs)塑料瓶或玻璃瓶或任何其它通常用于这样目的的合适的载体中。
可将通过本文所教导的方法获得的或从其它来源获得的成体样(成熟的)心肌细胞包装在组织培养皿、管、烧瓶、滚瓶或滚板(例如单个多孔板或盘例如8、16、32、64、96、384和1536多孔板或盘)或任何通常用于这样目的合适载体中，以及同样包括在本文所教导的试剂盒中。
在一个实施方案中，本文所教导的试剂盒可进一步包含附加成分，例如细胞生长培养基组合物、缓冲剂、防腐剂、细胞稳定剂等。
在一个实施方案中，本文所教导的试剂盒的每个成分可提供在单独的容器或分配器中，或可以以混合物提供。进一步在另一个实施方案中，根据商业和非商业目的，本文所教导的试剂盒中所有的各种容器或分配器可在单个或多个包装中提供。
附图说明
图1显示了T3对衍生自体外培养的人多能胚胎干细胞(PESCs)的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟的影响。PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟通过它们的形态特征揭示，所述形态特征通过免疫组织化学(免疫荧光)技术使用针对α-辅肌动蛋白的抗体评价。图板A和图板B显示在本文所教导的但缺少T3的基本分化培养基中培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的形态特征(对照情况1)。图板C和图板D显示在本文所教导的但缺少T3的培养基组合物(或成熟培养基组合物)中培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的形态特征(对照情况2)。图板E和图板F显示在本发明的包含100ng/ml的T3的培养基组合物中培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的形态特征。图B、图板D和图板F分别表示图板A、图板C和图板E的放大。结果显示，与对照情况1和2(参见图板A-D)相比，在本发明的包含T3的培养基组合物中培养的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞(参见图板E和图板F)呈现最让人联想到或最接近于成体心肌细胞表型的形态特征，包括细胞极化，肌节组织化增加，以及形状延长。注意到与对照1相比(参见图板A和图板B)，在本文所教导的缺少T3的培养基组合物(对照1，参见图板C和D)中培养的心肌细胞也呈现让人联想到成体样心肌细胞的形态特征，但比在T3存在下观察到的形态特征的程度低(效率较低，不太强)(参见图板E和图板F)。
图2描述了T3对衍生自体外培养的人多能胚胎干细胞(PESCs)的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟的影响。PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟通过它们的电生理特性揭示，所述电生理特性通过膜片钳技术评价。PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞或在本文所教导的缺少T3的培养基中(对照情况，参见图中的黑条)或在本文所教导的包含100ng/ml的T3的培养基中(参见图中的白条)培养12天。图板A显示了T3对最大上升速率的影响。图板B显示了T3对静止膜电位的影响。图板C显示了T3对动作电位振幅的影响。结果表明，与对照情况相比，用T3处理的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞显示多个电生理参数的改善，包括较大的最大上升速率(参见图板A)、更低的静止膜电位(参见图板B)和更大的动作电位振幅(参见图板C)。数据表示为平均值±SEM。
图3显示了T3对衍生自体外培养的PESC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞成熟的影响。PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞的成熟通过它们的代谢特性揭示，所述代谢特性使用利用电位红色荧光染料四甲基罗丹明甲酯，俗称TMRM的TMRM分析评价。用TMRM处理导致在健康运行线粒体的内膜区域中由线粒体膜电位驱动的TMRM积累。PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞或在本文所教导的缺少T3(对照情况)的培养基组合物(CM)中或在本文所教导的包含100ng/mlT3的培养基组合物(CM)(也称为成熟培养基(MM))中培养17天。两个处理组经过TMRM分析。结果显示，与对照情况相比，用T3处理的PESC衍生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞显示TMRM相关的橙色荧光的增强更大，这表示线粒体活性增强。
实施例
通过下面的实施例进一步阐明了本发明，但不限于此。根据上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的必要特征，并且在不背离其教导和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和变化，以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文显示和描述的这些之外，根据上文描述，本发明的各种变化对于本领域技术人员而言是显而易见的。这样的变化也落入所附权利要求的范围之内。
实施例1.自旋拟胚体(EB)的分化
将人PESC(hPESC)或人iPSC(hiPSC)在有丝分裂灭活小鼠成纤维细胞上的干细胞培养基中培养，并且使用TrypLESelect(Invitrogen)传代。干细胞培养基含有DMEM/F12(Gibco,目录号：11320-033)、20％(v/v)的敲除血清替代物(Gibco,目录号：10828-028)、10mM的非必需氨基酸(Gibco,目录号：11140-050)、2mM的L-谷氨酰胺(Gibco,目录号：25030-081)，2b-巯基乙醇(Gibco,目录号：21985-023)、10ng/ml人bFGF。
分化前一天，在干细胞培养基中以1×106细胞/孔的密度将细胞传代至基质胶包被的6孔板上。
细胞在拟胚体(EB)中分化。第0天，收集细胞并且在本文所教导的基本分化培养基(无血清)中以6×104个细胞/ml重悬浮，所述基本分化培养基包含脂质混合物(2.2μg/ml的胆固醇、0.1μg/ml的亚油酸、0.1μg/ml的亚麻酸和0.1μg/ml的棕榈酸)、胰岛素(1mg/L)、转铁蛋白(0.55mg/L)、硒(0.00067mg/L)、本文描述的微量元素混合物B(0.01％)、本文描述的微量元素混合物C(0.1％)、20ng/ml的BMP4(R&DSystems)和30ng/ml的激活素A(R&DSystems)、30ng/ml的VEGF(R&Dsystems)、40ng/ml的SCF(R&Dsystems)和1.5μM的Chir99021(Axonmedchem)。将50μl量的该混合物放置在96孔的圆底非粘附板的各个孔中，得到由3,000细胞组成的EB。第3、7、10、14和17天，将所述培养基替换为不含生长因子的分化培养基。
通过该方法产生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞适用于本文所教导的本发明的方法中，即所述胎儿样(不成熟的)心肌细胞可使用本文所教导的培养基组合物以及产生成体样(成熟的)心肌细胞的方法成熟为成体样(成熟的)心肌细胞。
实施例2.单层分化
根据Dambrot等(Dambrotetal(2014),Exp.Cell.Res.(在出版中))(http://dx.doi.org/10.1016/j.yexcr.2014.05.001)描述的方法，单层培养人PESC(hPESC)或人iPSC。简而言之，根据生产商(StemCellTechnologies)的规定，将细胞在mTeSR1中的基质胶(BDBiosciences)包被的组织培养皿上培养。为了开始分化为心肌细胞，将细胞分为小的细胞团并接种于mTeSR1中基质胶包被的细胞培养皿。3天后(分化第0天(d))，所述培养基用低胰岛素(1mg/l)(LI)-BPEL培养基替换并且补充BMP4(第0天–第3天)、激活素A(第0天至第3天)、CHIR99021(第0天至第3天)，和XAV939(第3天至第6天)。从第6天起，培养基中不存在BMP4、激活素A、CHIR99021和XAV939。
通过该方法产生的胎儿样(不成熟的)心肌细胞适用于本文所教导的本发明的方法中，即所述胎儿样(不成熟的)心肌细胞可使用本文所教导的培养基组合物以及产生成体样(成熟的)心肌细胞的方法成熟为成体样(成熟的)心肌细胞。
实施例3.从体外培养的胎儿样(不成熟的)心肌细胞产生成体样(成熟的)心肌细胞
室温下使用在DMEM中浓度为1/100的基质胶(Corning)将组织培养塑料包被45min(分钟)。来自分离的拟胚体、分离的单层或(市场上可获得的)冷冻胎儿样(不成熟的)心肌细胞(所有都衍生自体外培养的PESC和/或iPSC)的单细胞悬浮液，以合适的密度接种于基质胶包被的组织培养塑料(例如96孔板的每孔20000-40000个细胞，例如12孔板的每孔20000-200000个细胞)。平板接种后第一天，将胎儿样(不成熟的)心肌细胞暴露于本发明的培养基组合物，该组合物由包含50ng/ml的T3(SigmaT6397)、2mM的肉毒碱、5mM的肌酸、5mM的牛磺酸、2.2μg/ml的胆固醇、0.1μg/ml的亚油酸、0.1μg/ml的亚麻酸、0.1μg/ml的棕榈酸(脂质，例如，来自Gibco11905)、10mg/ml的胰岛素、5.5mg/ml的转铁蛋白、0.0067mg/ml的硒(胰岛素、转铁蛋白和硒来自例如Gibco51500)、0.01％的微量元素混合物B(如本文描述的；Cellgro99-175-CL)、0.1％的微量元素混合物C(如本文描述的；Cellgro99-176-CL)、0.5w/w％的抗生素(市场上可买到的Gibco公司的青霉素-链霉素混合物(Gibco12070；5000U/ML))、0.05mg/ml的抗坏血酸、2mM的Glutamax补充物(即0.85％NaCl的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽，市场上可买到的Gibco，例如Gibco35050)、0.125w/w％聚乙烯醇(PVA)、450nM的α-单硫代甘油(MTG)(市场上可买到的)、在46.5％(w/w)IMDM(Gibco21056)中的025w/w％的BSA(BovostarBSAS1.0)和46,5％(w/w)的HAMF-12和Glutamax(Gibco31765)的无血清培养基组合物组成。所有浓度都表示为在培养基组合物中的最终浓度。
第二天更新本文所教导的培养基组合物。每2-3天重复该步骤直到第15天。
可选地，使用上文刚刚描述的包含50ng/ml的T3的培养基组合物进行处理，可在平板接种胎儿样心肌细胞之后的第3天或第7天开始，并且持续该实验的其余日期，即第15天。在这种情况下，将细胞维持在本文所教导的但缺乏T3的培养基组合物中，直到开始用上文描述的包含50ng/ml的T3的培养基组合物进行处理。也可使用本文公开的培养基的范围内，但是具有不同浓度的单个组分的各种其它培养基。使用由本文所具体公开的浓度的组分组成的培养基，获得最好结果。
实施例4.评价T3对形态学特征的影响
衍生自体外培养的PESC的胎儿样(心肌细胞)被分为两个实验组。第一组暴露于本文所教导的但缺少T3的培养基组合物(对照情况)。第二组暴露于本文所教导的但包含T3(100ng/ml)的培养基组合物。两组都在它们各自的培养基组合物中培养5天。在处理期间，将来自两个实验组的心肌细胞在4％的多聚甲醛中固定，用磷酸盐缓冲液(PBS)/0.1％TritonX-100(Sigma-Aldrich)透化，并且用磷酸盐缓冲液(PBS)/0.1％TritonX-100(Sigma-Aldrich)1％BSA阻断。将样品在室温下用α-辅肌动蛋白(EptomicsAb68167)(在1/400的浓度下)的特异性一抗培养1h(小时)。用Cy3-或Alexa-Fluor647共轭的二抗(在1/250的浓度下)检测一抗。使用LeicaSP5-STED或LeicaSP5激光共聚焦扫描显微镜(LeicaMicrosystems)捕获图像。
结果呈现在图1中。具体而言，结果显示，衍生自体外培养的PESC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞，其暴露于本文所教导的包含T3的培养基组合物(参见图1中的图板E和图板F)，更有效地和更有力地成熟为成体样心肌细胞，正如它们的让人联想到成体(或成体样)阶段的形态特征变化所证明，例如细胞极化、肌节组织化增加和形状延长。这样的形态特征变化在胎儿样(不成熟的)心肌细胞(其在体外培养时在成熟过程期间没有暴露于T3)中较少清楚地观察到(参见图1中的图板A-D)，这证明T3在体外成熟过程中的重要性，尤其是T3在本文详细描述的培养基组合物中的重要性。
实施例5.评价T3对电生理学特性的影响
将衍生自体外培养的PESC的胎儿样(心肌细胞)分为两个实验组。第一组暴露于本文所教导的但缺少T3的培养基组合物(对照情况)。第二组暴露于本文所教导的但包含T3(100ng/ml)的培养基组合物。将两组在它们各自的培养基组合物中培养12天。在处理期间，来自两个实验组的胎儿样(不成熟的)心肌细胞经历膜片钳过程。
膜片钳电生理学按照BellinM.等(Bellin,M.etal,EMBOJ32,3161–3175(2013))所述实施，但有细微的改变。来自小群体细胞(5-10个细胞)的动作电位用穿孔膜片钳技术使用Axopatch200b放大器(MolecularDevices)和低电阻片移液器(1.5-2.5MΩ)测定。用pClamp10(axon仪器)和定制的软件实施动作电位的数据获得和分析。校正动作电位的经计算的液体接界电势(-15mV)。
来自自发跳动细胞的动作电位在37±0.20℃使用改良的Tyrode溶液测定，该Tyrode溶液包含(以mM计)：140NaCl、5.4KCl、1.8CaCl2、1.0MgCl2、5.5葡萄糖、5.0HEPES；pH7.2(NaOH)。移液器溶液包含(以mM计):125K-葡萄酸盐、20KCl、5NaCl、0.22两性霉素-B、10HEPES；pH7.2(KOH)。对静止膜电位(RMP)、最大上升速率(最大dV/dt)、AP振幅(以mV计)(APA)和20％、50％和90％的复极化(分别为APD50和APD90)时AP持续时间(以毫秒计)(APD)进行了分析。从电压间变化的一阶导数作为时间函数计算上升速率。因此最大上升速率(最大dV/dt)等于动作电位一阶导数的最大正值。将10个连续动作电位的数据平均。
结果如图2所示。具体而言，结果显示，与获得的胎儿样(不成熟的)心肌细胞(其在体外培养时在成熟过程期间没有暴露于T3)的数据(参见图2的图板A、B和C中的黑条)相比，衍生自体外培养的PESC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞(其暴露于本文所教导的包含T3的培养基组合物)(参见图1中的图板E和图板F)更有效和更有力地成熟为成体样心肌细胞，正如它们的让人联想到成体(或成体样)阶段的电生理特性变化所证明，例如最大上升速率增加(参见图2的图板A)、静止膜电位降低(参见图2的图板B)和动作电位振幅增强(参见图2的图板C)。
实施例6.评价T3对代谢的影响
将衍生自体外培养的PESC的胎儿样(心肌细胞)分为两个实验组。第一组暴露于本文所教导的但缺少T3的培养基组合物(对照情况)。第二组暴露于本文所教导的但包含T3(100ng/ml)的培养基组合物。将两组在它们各自的培养基组合物中培养17天。在测量前一天将5nM量的TMRM(Invitrogen)加入到各自的培养基中。细胞用5xTryple分离，但TMRM包括在所有溶液中并且存在于测量过程中。测量在MiltenyiMACSquantVYB流式细胞分析仪上实施。
结果如图3所示。具体而言，结果显示，与胎儿样(不成熟的)心肌细胞(其在体外培养时，在成熟过程期间没有暴露于T3)相比，衍生自体外培养的PESC的胎儿样(不成熟的)心肌细胞(其暴露于本文所教导的包含T3的培养基组合物)更有效和更有力地成熟为成体样心肌细胞，正如它们的让人联想到成体(或成体样)阶段的代谢变化所证明，例如增强的线粒体活性。

Claims (28)

1.一种水性培养基组合物，其中所述培养基组合物是无血清的并且包含：
-甲状腺激素样化合物；
-脂质混合物；和
-肉毒碱化合物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述甲状腺激素样化合物是三碘甲状腺氨酸(T3)和/或3,5-二碘甲状腺丙酸(DITPA)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约25ng/ml到约150ng/ml的T3和/或约1μM到约2μM的DITPA。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述脂质混合物包含胆固醇和一种或多种选自亚麻酸、亚油酸和棕榈酸的脂质。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约1μg/ml到约4μg/ml的胆固醇。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述脂质混合物进一步包含一种或多种选自花生四烯酸、DL-α-醋酸生育酚、乙醇、肉豆蔻酸、油酸、棕榈油酸、普朗尼克F-68、硬脂酸和吐温80的成分。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约0.5mM到约3.5mM的肉毒碱。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含肌酸化合物和牛磺酸化合物。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约3.0mM到约7.0mM的肌酸。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约2mM到约7mM的牛磺酸。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约5mg/L到约15mg/L的胰岛素，和约3mg/L到约8mg/L的转铁蛋白和约0.005mg/L到约0.0075mg/L的硒。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含选自Mn、Si、Mb、V、Ni、Sn、AL、Ag、Ba、K、Cd、Co、CR、F、Ge、I、Rb和Zr的一种或多种微量元素，优选所有微量元素。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约2mg/ml到约7mg/ml的聚乙烯醇(PVA)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含牛血清白蛋白、葡萄糖、维生素、抗生素、硫代甘油、谷氨酰胺、氨基酸和HamF12营养物质混合物。
15.一种固体组合物，优选粉末组合物，其中所述组合物可以溶解在水溶液中，从而获得前述权利要求中任一项所述的组合物。
16.由分化自多能胚胎干细胞(PESC)和/或诱导多能干细胞(iPSC)的胎儿样心肌细胞产生成体样心肌细胞的方法，包括以下步骤：
(a)提供一个或多个胎儿样心肌细胞；
(b)将所述胎儿样心肌细胞与权利要求1-15所述的培养基组合物接触，从而使所述胎儿样心肌细胞成熟为成体样心肌细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述胎儿样心肌细胞与所述培养基组合物接触约3天，高达约15天。
18.根据权利要求16和17所述的方法，其中所述培养基组合物为固体形式，优选粉末形式，其可溶解在水溶液中，从而获得步骤(b)所述的液体培养基。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的方法，其中在使所述胎儿样心肌细胞与权利要求1-15中任一项所述的包含至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物接触之前，使其与权利要求1-15中任一项所述的缺乏甲状腺激素样化合物的培养基组合物接触约两天。
20.权利要求1-15中任一项所述的组合物在使衍生自PESC和/或iPSC的心肌细胞在体外成熟中的用途。
21.权利要求1-15中任一项所述的缺少甲状腺样化合物的组合物在使衍生自的PESC和/或iPSC的心肌细胞在体外成熟中的用途。
22.适合在体外培养中产生成体样心肌细胞的试剂盒，其包括：
权利要求1-15中任一项所述的培养基组合物。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其包括权利要求1-15中任一项所述的但缺少至少一种甲状腺激素样化合物的培养基组合物。
24.根据权利要求22和23所述的试剂盒，其中所述培养基组合物为液体形式。
25.根据权利要求22和23所述的试剂盒，其中所述培养基组合物为固体形式，优选为粉末形式。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的试剂盒，其包含胎儿样心肌细胞。
27.根据权利要求20-25中任一项所述的试剂盒，其包含未分化的PESC和/或iPSC。
28.根据权利要求20-25中任一项所述的试剂盒，其包含如何根据权利要求16-19产生成体样心肌细胞的说明。
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