KR20240056604A - 수임 심장 전구세포의 제조 방법 - Google Patents

수임 심장 전구세포의 제조 방법 Download PDF

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차드 쿤스
메간 보이어
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후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드
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Abstract

수임 심장 전구세포에 대한 다능성 줄기 세포의 분화를 위한 방법이 본원에 제공된다. 심장 장애의 치료에서 수임 심장 전구세포의 용도를 위한 방법이 본원에 추가로 제공된다.

Description

수임 심장 전구세포의 제조 방법
우선권 주장
본 출원은 2021년 9월 13일에 출원된 미국 가출원 제63/243,606호의 우선권의 이익을 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 더 특히, 이것은 수임 심장 전구세포에 대한 다능성 줄기 세포의 분화에 관한 것이다.
심장 전구세포(cardiac progenitor cell, CPC)는 성숙 심근세포로 분화하는 능력을 갖는다. 이 CPC는 심근세포로의 최근의 헌신 단계를 나타낸다. 따라서, 이 세포는 재생 의학을 위한, 예컨대 심근 경색 및 울혈성 심부전의 치료를 위한 약물 개발 분야에서 매력적인 표적이다.
다능성 줄기 세포로부터 심근세포를 제조하기 위한 현재의 방법은 심근세포의 안정한 수축을 위해 긴 시간 기간 동안 배양을 요한다. 따라서, 배양에 더 적은 시간을 요하는 더 효율적인 방식으로 다능성 줄기 세포로부터 수임 심장 전구세포를 제조하는 개선된 방법이 필요하다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) 분화를 개시하기 위한 Wnt 작용제, 및 세포 응집물을 형성하기 위해 생존 제제의 존재 하에 PSC를 배양하는 단계; (b) 중배엽 세포의 집단을 제조하기에 충분한 시간의 기간 동안 Wnt 작용제의 존재 하에 세포 응집물을 추가로 배양하는 단계; 및 (c) 심장 특이성을 촉진하기 위해 Wnt 억제제의 존재 하에 중배엽 세포의 집단을 분화시켜, 수임 심장 전구세포의 집단을 제조하는 단계를 포함하는 인간 다능성 줄기 세포(PSC) 유래된 수임 심장 전구세포를 제조하기 위한 시험관내 방법을 제공한다.
일부 양태에서, PSC는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)이다. 소정의 양태에서, PSC는 단계 (a) 전에 세포외 기질에 의해 코팅된 표면에서 배양되었다. 일부 양태에서, 세포외 기질은 비트로넥틴, 콜라겐, 라미닌, MatrigelTM 및/또는 피브로넥틴을 포함한다.
소정의 양태에서, 생존 제제는 Rho 연관된 키나제(ROCK) 억제제 또는 미오신 II 억제제이다. 예를 들면, ROCK 억제제는 H1152 또는 Y-27632이다. 특정 양태에서, 미오신 II 억제제는 블레비스타틴이다.
일부 양태에서, 상기 방법은 현탁 배양에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 현탁 배양은 하나 이상의 생물반응기, 예컨대 수직 휠 생물반응기에서 수행된다.
소정의 양태에서, 단계 (a)의 Wnt 작용제는 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십(Tideglusib), SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314 또는 IM-12이다. 특정한 양태에서, Wnt 작용제는 CHIR 99021이다. 특정 양태에서, CHIR 99021은 약 1 μM 내지 10 μM, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μM, 특히 약 2 μM의 농도로 배양물에 존재한다.
일부 양태에서, 단계 (a)는 1일 내지 2일, 예컨대 약 22시간, 23시간, 24시간, 25시간 또는 26시간, 특히 약 24시간이다. 특정 양태에서, 단계 (b)의 배양물은 인슐린을 포함하지 않거나 본질적으로 인슐린을 갖지 않는다.
소정의 양태에서, 단계 (b)의 Wnt 신호전달 작용제는 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314 또는 IM-12이다. 특정한 양태에서, 단계 (b)의 Wnt 신호전달 작용제는 CHIR 99021이다. 일부 양태에서, CHIR 99021은 1 μM 내지 10 μM, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μM, 특히 약 4 내지 5 μM, 예컨대 약 4.4 μM의 농도로 배양물에 존재한다.
일부 양태에서, 단계 (b)의 배양물은 액티빈/노달(Activin/Nodal) 작용제 및/또는 BMP를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 액티빈/노달 작용제는 액티빈 A 또는 Nodal이다. 소정의 양태에서, 단계 (b)는 1일 내지 5일, 예컨대 약 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일, 특히 약 1일 또는 2일 동안 수행된다.
일부 양태에서, 중배엽 세포는 KDR, PDGFRα, CXCR4 및/또는 CD56을 발현한다. 특정한 양태에서, 중배엽 세포의 집단의 적어도 5%(예를 들면, 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 또는 55%)는 단계 (c) 전에 또는 동안에 CD56을 발현한다. 일부 양태에서, 중배엽 세포의 집단의 적어도 40%(예를 들면, 적어도 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75%)는 단계 (c) 전에 또는 동안에 KDR 및 PDGFRα를 발현한다. 특정한 양태에서, 세포는 단계 (c)가 개시된 후 KDR을 발현한다. 소정의 양태에서, 중배엽 세포의 집단은 단계 (c) 전에 CXCR4 및 CD56에 양성이다. 일부 양태에서, 단계 (c) 전에 중배엽 세포의 집단의 적어도 30%(예를 들면, 적어도 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%) 양성은 CXCR4에 양성이고, 중배엽 세포의 집단의 60% 미만(예를 들면, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 45, 40 또는 30% 미만)은 CD56에 양성이다.
일부 양태에서, 단계 (c) 전에 중배엽 세포의 집단의 세포의 적어도 20%(예를 들면, 적어도 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%)는 CXCR4에 양성이고, 중배엽 세포의 집단의 60% 미만(예를 들면, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 45, 40 또는 30% 미만)은 CD56에 양성이다. 소정의 양태에서, 단계 (c)는 중배엽 세포의 집단의 적어도 20%(예를 들면, 적어도 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 또는 80%) 양성이 CXCR4에 양성이고, 중배엽 세포의 집단의 60% 미만(예를 들면, 미만 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 45, 40 또는 30% 미만)이 CD56에 양성일 때 Wnt 억제제를 첨가하는 것을 포함한다.
소정의 양태에서, 단계 (c)의 Wnt 억제제는 XAV939, IWR1, IWR2, IWR3, IWR4, ICG-001, IWR-1-엔도, Wnt-C59, LGK-974, LF3, CP21R7, NCB-0846, PNU-74654 또는 KYA179K이다. 특정한 양태에서, Wnt 억제제는 XAV939이다. 특정 양태에서, XAV939는 5 μM 내지 10 μM, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μM의 농도로 배양물에 존재한다. 일부 양태에서, 단계 (c)의 배양물은 TGFβ 억제제, 예컨대 SB431542, LDN-193189, LY2157299, LY2109761, SB525334, SIS HCl, SB505124, GW788388 또는 LY364947을 추가로 포함한다. 특정한 양태에서, TGFβ 억제제는 SB431542이다. 특정 양태에서, SB431542는 1 μM 내지 5 μM, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 μM의 농도로 배양물에 존재한다. 일부 양태에서, 단계 (c)의 배양물은 인슐린을 포함한다. 일부 양태에서, 단계 (c)의 배양물은 BMP 억제제 또는 AMPK 억제제를 추가로 포함한다. 소정의 양태에서, BMP 억제제는 도르소모르핀, LDN193189, DMH1, DMH2 또는 ML 347이다. 일부 양태에서, 단계 (c)는 1일 내지 6일, 예컨대 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일, 예컨대 1일 내지 3일, 특히 약 2일 동안이다.
특정한 양태에서, 상기 방법은 무혈청이다. 일부 양태에서, 배양은 규명된 배지에서 수행된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 내약성 선택을 수행하는 단계를 포함하지 않는다. 소정의 양태에서, 수임 심장 전구세포는 전이유전자를 발현하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 방법은 적어도 1x107 내지 1x1010개의 수임 심장 전구세포를 제조한다.
소정의 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단의 20% 미만(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10 또는 5%)은 EpCAM을 발현한다. 소정의 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단의 세포의 10% 미만(예를 들면, 9, 8, 7, 6 또는 5% 미만)은 EpCAM을 발현한다. 일부 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단의 20% 미만(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10 또는 5%)은 KDR, CXCR4 및/또는 SAA에 양성이다. 일부 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단의 적어도 80%(예를 들면, 81, 82, 83, 84, 85, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%)는 PDGFRα 및 CD56에 양성이다. 일부 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단의 20% 미만(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10 또는 5%)은 EpCAM 및 SAA에 양성이다.
특정한 양태에서, 상기 방법은 우수 제조 기준(GMP) 준수이다. 일부 양태에서, 상기 방법은 예컨대 수임 심장 전구세포의 집단이 PDGFRα에 대해 적어도 70%(예를 들면, 71, 72, 73, 74, 75, 75, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%) 양성이고, KDR에 대해 40% 미만(예를 들면, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10 또는 5%) 양성이고, EpCAM에 대해 20% 미만(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10 또는 5%) 양성이고, SAA에 대해 20% 미만(예를 들면, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 10 또는 5%) 양성이면 수임 심장 전구세포의 집단을 저온보존하는 단계를 추가로 포함한다.
추가적인 양태에서, 상기 방법은 심근세포를 제조하기 위해 수임 심장 전구세포의 집단을 성숙시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단은 단층에서 배양된다. 소정의 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단은 세포외 기질에 의해 코팅된 표면에서 배양된다. 일부 양태에서, 세포외 기질은 비트로넥틴, 콜라겐, 라미닌, MatrigelTM 및/또는 피브로넥틴을 포함한다. 특정 양태에서, 세포외 기질은 비트로넥틴을 포함한다.
일부 양태에서, 심근세포는 CTNT, MHC, MLC, CTNI 및/또는 사르코머 알파 액티닌(sarcomeric alpha actinin)을 발현한다. 소정의 양태에서, 세포의 적어도 80%(예를 들면, 81, 82, 83, 84, 85, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%)는 사르코머 알파 액티닌에 양성이다.
소정의 양태에서, 성숙을 위한 배양물은 Wnt 억제제 또는 TGFβ 억제제를 포함하지 않는다. 일부 양태에서, 성숙을 위한 배양물은 2일 내지 30일, 예컨대 2일 내지 20일, 예컨대 5일 내지 10일 동안이다.
특정한 양태에서, 상기 방법은 분화를 개시하기 위해 Wnt 작용제의 존재 하에 현탁액 중에 PSC를 배양하는 단계, 세포 집단이 CD56에 대해 양성인 약 60% 미만의 세포를 포함하고, 프라이머 심장 전구세포의 집단을 제조하기 위해 CXCR4에 대해 양성인 적어도 약 20%의 세포가 PDGFRα에 대해 적어도 약 70% 양성, KDR에 대해 약 40% 미만 양성, EPCAM에 대해 약 20% 미만 양성 및 SAA에 대해 약 20% 미만 양성일 때 Wnt 억제제의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 프라이밍된 심장 전구세포의 집단은 저온보존될 수 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 수임 심장 전구세포의 집단을 혈관 내피 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 분화는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및/또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 존재 하에 수임 심장 전구세포의 집단을 배양하는 것을 포함한다. 소정의 양태에서, 혈관 내피 세포는 CD33 및 CD144에 양성이다. 일부 양태에서, 혈관 내피 세포의 집단의 세포의 적어도 20%(예를 들면, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70% 또는 초과)는 CD33 및 CD144에 양성이다.
일부 양태에서, 상기 방법은 수임 심장 전구세포의 집단을 평활근 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 양태에서, 분화는 FGF 및/또는 VEGF의 존재 하에 수임 심장 전구세포의 집단을 배양하는 것을 포함한다. 소정의 양태에서, 평활근 세포의 집단은 CD140b 및 CD90에 대해 양성인 적어도 50%(예를 들면, 55%, 60%, 70%, 75%, 80% 또는 초과)의 세포이다.
본 실시형태 및 이의 양태의 방법에 의해 제조된 수임 심장 전구세포의 집단이 본원에 추가로 제공된다. 본 실시형태 및 이의 양태의 방법에 의해 제조된 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포의 집단이 본원에 또한 제공된다.
또 다른 실시형태는 CD56의 적어도 90%(예를 들면, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 발현, PDGFRα의 적어도 80%(예를 들면, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%)의 발현 및 CXCR4, KDR 및 EpCAM의 10% 미만(예를 들면, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 미만)의 발현을 갖는 수임 심장 전구세포의 집단을 제공한다. 특정한 양태에서, 수임 심장 전구세포는 본 실시형태 및 이의 양태의 방법에 의해 제조된다. 특정한 양태에서, 수임 심장 전구세포의 집단은 GMP 준수이다. 일부 양태에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이다.
추가의 실시형태는 본 실시형태 및 이의 양태의 유효량의 수임 심장 전구세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 심장 장애의 치료를 위한 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 수임 심장 전구세포는 심장에 직접 투여된다. 소정의 양태에서, 투여는 심근내 카테터를 사용함으로써이다. 일부 양태에서, 세포는 예컨대 1% 내지 10%, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10%, 특히 약 5%의 농도로 인간 알부민(예를 들면, FLEXBUMINTM)을 포함하는 현탁액에서 투여된다.
일부 양태에서, 투여된 수임 심장 전구세포는 생착, 세포 생존 및 심근세포로의 성숙을 보여준다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다. 특정한 양태에서, 심장 장애는 심근 경색, 심장근육병증, 울혈성 심부전, 심실 중격 결손, 심방 중격 결손, 선천성 심장 결손, 심실류, 소아 기원인 심장 장애, 심실 재구성을 요하는 심실류 또는 심장 장애이다.
추가의 실시형태는 다능성 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계, 심장 분화를 개시시키기 위해 Wnt 작용제의 존재 하에 현탁액 중에 PSC를 배양하는 단계 및 세포 집단이 튼튼한 심장 특이성을 촉진하기 위해 60% 미만의 CD56 양성 세포 및 30% 초과의 CXCR4 양성 세포로 이루어질 때 Wnt 억제제를 첨가하여서 심장 전구세포의 집단을 제조하는 단계를 포함하는 심장 전구세포를 생성하는 방법을 제공한다.
일부 양태에서, 심장 전구세포는 불충분한 심장 기능을 특징으로 하는 장애의 치료에 유용하다. 소정의 양태에서, 심장 전구세포는 생체내 심근세포, 내피 및 혈관 평활근 계통의 분화를 할 수 있다. 일부 양태에서, 심장 특이성은 수임 심장 전구세포(CTC4)의 집단을 제조한다. 특정한 양태에서, 분화는 생물반응기에서 발생한다.
소정의 양태에서, 상기 방법은 세포 집단이 PDGFRα에 대해 70% 초과 양성, KRD에 대해 40% 미만 양성, EPCAM에 대해 20% 미만 양성 및 사르코머 알파 액티닌에 대해 20% 미만 양성이면 이것을 저온보존하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, CTC4 세포는 저온보존될 수 있다. 소정의 양태에서, 수임 심장 전구세포는 대상체의 심장에 직접 투여된다. 일부 양태에서, Wnt 억제제의 존재 하의 분화는 TGFβ 억제제를 추가로 포함한다. 소정의 양태에서, Wnt 억제제의 존재 하의 분화는 BMP 억제제를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 무혈청 배지를 포함한다. 일부 양태에서, 상기 방법은 내약성 선택을 수행하는 단계를 포함하지 않는다.
일부 양태에서, 상기 방법은 심근세포를 제조하기 위해 수임 심장 전구세포의 집단을 성숙시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 성숙을 위한 배양물은 Wnt 억제제 또는 TGFβ 억제제를 포함하지 않는다. 특정한 양태에서, 세포는 VEGF의 첨가에 의해 내피 세포 또는 평활근에 추가로 규정할 수 있다.
본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 자명할 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명하므로 상세한 설명 및 특정 예가 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서 오직 예시의 방식으로 주어진다는 것이 이해되어야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 소정의 양태를 추가로 나타내도록 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명과 조합되어 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1: (도 1A) 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터의 심근세포 수임 심장 전구세포(CTC4)의 분화를 위한 예시적인 프로토콜을 도시하는 도식. 상기 공정은 iPSC의 응집물 형성, 중배엽 유도 및 심장 특이성의 초기 단계를 포함한다. (도 1B) 심장 분화를 위한 배양 방법(플레이팅된 대 현탁) 및 개발 마일스톤의 공정 일자 설명.
도 2: (도 2A) 심장 분화를 위한 배양 방법(플레이팅된 대 현탁) 및 개발 마일스톤의 공정 일자 설명. (도 2B) iPSC의 스케일 및 다층 CELLSTACK® 용기 및 PBS3 VERTICAL-WHEELTM 생물반응기를 사용한 분화를 도시하는 도식. 세포는 예컨대 Aseptic Technologie AT CLOSED-VIALS®에 의한 대규모 저온보존(예를 들면, 바이알당 30000만개의 세포)을 겪을 수 있다.
도 3: (도 3A) 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터의 심근세포 수임 심장 전구세포(CTC4)의 분화를 위한 예시적인 프로토콜을 도시하는 도식. 상기 공정은 iPSC의 응집물 형성, 중배엽 유도 및 심장 특이성의 초기 단계를 포함한다. (도 3B) 3개의 상이한 PBS3 생물반응기를 분화 제2일 내지 5일에 샘플링하고, CXCR4 및 CD56에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다. (도 3C) 수임 심장 전구세포를 3개의 PBS3 생물반응기로부터 수확하고, 혼주하고, CXCR4 및 CD56에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다.
도 4: (도 4A) 3개의 상이한 PBS3 생물반응기를 분화 제2일 내지 5일에 샘플링하고, EPCAM에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다. (도 4B) 수임 심장 전구세포를 3개의 PBS3 생물반응기로부터 수확하고, 혼주하고, EPCAM에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다.
도 5: PBS3 생물반응기를 제4일 내지 6일에 샘플링하고, KDR 및 PDGFRα에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다. 분화의 제6일에 수확된 수임 심장 전구세포는 크게 감소된 KDR 발현을 갖는다.
도 6a-6b: (도 6a) iPSC 및 수임 심장 전구세포의 다수의 뱃지로부터의 유전자 발현을 다능성 유전자 NANOG, SOX2 및 POU5F1에 대해 Fluidigm에 의해 분석하였다. (도 6b) 수임 심장 전구세포의 다수의 뱃지로부터의 유전자 발현을 다능성 유전자 HAND2, GATA4, NKX2.5, PDGFRA 및 TBX5에 대해 Fluidigm에 의해 분석하였다.
도 7: (도 7A) CTC4 세포를 확인하기 위해 사용된 프로토콜을 도시하는 도식은 해동되고 RPMI+B27 배지에서 비트로넥틴 코팅된 용기로 플레이팅된 후 심근세포가 될 것이다. (도 7B) CTC4 세포가 심근세포가 되도록 수임되지만, 심장 마커 사르코머 알파 액티닌(SAA)의 발현을 아직 시작하지 않았다는 것을 나타내는, 대부분의 집단이 CD56pos, CXCR4neg, EpCAMneg, KDRneg, PDGFRαpos 및 SAAneg라는 것을 보여주는, 해동 후 이들 세포의 유세포분석법 규명. (도 7C) CTC4 세포가 RPMI+B27 배지를 갖는 비트로넥틴 코팅된 96웰 플레이트에서 7일 동안 배양된 후 이것의 면역세포화학 규명. 심장 특이적 전사 인자 NKX2.5는 심장 구조 단백질 사르코머 알파 액티닌(SAA), 심장 트로포닌 I(CTNI) 및 심장 트로포닌 T(CTNT)와 함께 발현된다. (도 7D) 심근세포에 대한 특이성을 나타내는, CTC4 세포가 RPMI+B27 배지를 갖는 비트로넥틴 코팅된 용기에서 7일 동안 배양된 후 SAA에 대한 유세포분석법 분석. (도 7E) CTC4 유래된 심근세포가 RPMI+B27 배지를 갖는 비트로넥틴 코팅된 용기에서 7일 동안 배양된 후 이 세포의 수축.
도 8: (도 8A) NUDE 래트 심근 경색 모델을 도시하는 도식. 5% Flexbumin에 현탁된 CTC4 세포(1e7)는 좌회선 동맥(LAD)이 수술로 결찰된 3일 후 좌심실의 경색 주변 부위로 다수의 (5회) 심근내 주사로서 투여되었다. CTC3 주사 후 30일에 심장을 가공하고 분석하였다. (도 8B) 심장마다 5개의 고리를 절단하고 파라핀에 포매함으로써 조직을 가공하였다. 각각의 심장의 각각의 고리로부터 20개의 연속 절편을 절단하고 슬라이드로 취했다. 인간 ALU에 대한 면역조직화학을 인간 세포 분포 및 생착 성공을 결정하기 위해 각각의 심장 블록에 대해 절편 1, 5, 10 및 20으로부터 슬라이드에서 수행하였다. (도 8C) 인간 세포가 검출되면, 추가적인 가공 및 규명을 위해 연속 절편을 취했다. 인간 Alu에 대한 형광 인시츄 혼성화를 사용한 다중 방법, 이어서 Ki67, 심장 트로포닌 T 또는 CX43의 검출을 위한 면역조직화학 방법을 생착된 인간 세포를 규명하기 위해 수행하였다.
도 9: (도 9A) 혈관 내피(CD31+CD144+) 및 평활근 세포(CD140b+CD90+)로 분화시키기 위해 성장 인자 FGF2 및/또는 VEGF를 포함하는 RPMI+B27 배지에서 iPSC 유래된 심장 전구세포의 배양을 도시하는 도식. (도 9B) 혈관 내피 세포에 대한 CD31 및 CD144 발현 및 평활근 세포에 대한 CD90 및 CD140b 발현의 유세포분석법.
다능성 줄기 세포의 분화는 다양한 방식으로, 예컨대 부착된 콜로니에서 또는 세포 응집물의 형성에 의해, 예를 들면 저 부착 환경에서 유도될 수 있고, 여기서 이 응집물은 배양체(embryoid body, EB)라 지칭된다. EB 내의 분자 및 세포 형태발생 신호 및 사건은 발생 배아에서 이러한 세포의 자연 개체발생의 많은 양태를 모방한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 큰 분량 및 짧은 시간 기간 동안 다능성 줄기 세포(PSC), 예컨대 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터 수임 심장 전구세포를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 이 수임 심장 전구세포는 추가적인 성장 인자 또는 소분자 신호전달 없이 심근세포가 되도록 프라이밍되지만, 내피 분화 가능성을 여전히 보유한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 분화 공정은 해동 및 플레이팅 후 빨리 안정하고 튼튼한 수축을 확립하기 위해 최적화된다.
분화 공정은 Wnt 작용제 및 응집물 형성을 촉진하기 위한 제제, 예컨대 ROCK 억제제의 존재 하에 PSC, 예컨대 iPSC로부터 응집물을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 응집물은 이후 Wnt 작용제, 예컨대 CHIR 99021의 존재 하에 중배엽 세포를 형성하기 위해 유도될 수 있다. 특정한 양태에서, 중배엽 유도 배지는 인슐린을 포함하지 않는다. 중배엽 유도 배지는 액티빈 작용제 및/또는 BMP를 추가로 포함할 수 있다. 중배엽 세포는 CXCR4, KDR, PDGFRα 및/또는 CD56의 양성 발현뿐만 아니라 다능성의 마커인 CKIT 및/또는 EPCAM의 본질적으로 비발현에 의해 확인될 수 있다. 중배엽 유도 단계는 약 1일 내지 3일 동안일 수 있다. 다음에, 중배엽 세포는 특히 인슐린과 조합되어 Wnt 억제제 및 선택적으로 TGFβ 및/또는 BMP 억제제의 존재 하에 심장 특이성으로 처리된다. 수임 심장 전구세포는 예컨대 약 1일 내지 3일 후 심장 특이성의 개시 후 제조될 수 있다. 특정 양태에서, 중배엽 단계에서의 응집물은 심장 특이성을 개시하기 위해 현탁 배양 시스템에서 유지될 수 있거나, 중배엽 세포는 개별화되고 심장 특이성의 개시 전에 단층 배양으로서 플레이팅될 수 있다. 수임 심장 전구세포는 둘 다의 배양 시스템 방법에 의해 제조될 수 있다. 수임 심장 전구세포는 심근세포를 제조하기 위해 추가로 배양될 수 있다. 특히, 분화 공정은 내약물성 또는 대사 선택이 사용되지 않는 무혈청일 수 있다.
본 연구에서, 저온보존 용기마다 1x106 내지 300x106개의 세포에서 저온보존될 수 있는 생물 반응기당 1x108 내지 3x109개의 수임 심장 전구세포(CTC4 세포)를 생성시키는 튼튼하고 확장 가능한 cGMP iPSC 유래된 심장 분화 프로토콜이 개발되었다. 이 CTC4 세포는 이전에 기재된 초기 단계 KDR+ 심장 전구세포와 구별된다. 예를 들면, CTC4 세포는 이미 빠르게 감소된 KDR 발현을 갖고, 더 이른 발생 단계 KDR+ 심장 전구세포와 동일한 분화 가능성을 갖지 않는다. 대신에, CTC4 세포는 고유한 나중의 발생 단계에서, 그러나 세포가 초기 심근세포가 되기 전에 저온보존될 수 있다.
추가의 실시형태에서, 본 저온보존된 심장 전구세포는 해동되고 고순도의 심근세포를 향해 추가로 규정하기 위해 배지, 예컨대 RPMI+B27에서 배양될 수 있다. 본 저온보존된 심장 전구세포는 대상체의 심근으로 주사되기 전에 또한 심근세포가 될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 수임 심장 전구세포는 예컨대 FGF 및/또는 VEGF를 포함하는 배지에서 혈관 내피 또는 평활근 세포로 분화될 수 있다.
게다가, 본 개시내용은 본원에 제공된 CTC4 세포를 투여하는 것을 포함하는 치료를 제공한다. CTC4 세포는 직접 주사에 의해 또는 심내막경유, 심근내 카테터 전달에 의해 전달될 수 있다. iPSC 유래된 CTC4 세포의 용량은 약 1x107 내지 1x109개의 세포일 수 있다. 본 개시내용의 CTC4 세포는 치료되는 대상체와의 적합성에 대해 HLA-적합성 iPSC로부터 제조될 수 있다. 현재의 방법은 모든 기재된 재료 및 배양 형식의 사용을 포함하는 cGMP 제조에 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 약물 개발 및 심장 재생 의학을 진전시키기 위해 세포의 튼튼하고 재현 가능하고 관련된 소스를 제공한다. CTC4 세포는 또한 약물 매개된 심장 발생 독성 문제를 확인하고 피하는 것을 돕도록 사용될 수 있다.
I. 정의
본원에 사용된 것과 같이, 규정된 성분의 면에서 "본질적으로 없는"은 규정된 성분의 어느 것도 의도적으로 조성물로 제제화되지 않고/않거나 오직 오염물로서 또는 미량으로 존재한다는 것을 의미하기 위해 본원에 사용된다. 조성물의 임의의 의도하지 않은 오염으로부터 생긴 규정된 성분의 총 양은 따라서 충분히 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 규정된 성분의 양이 표준 분석 방법에 의해 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본 명세서에 사용된 것과 같이, 단수 관사["a" 또는 "an"]는 하나 이상을 의미할 수 있다. 청구항(들)에서 본원에 사용된 것과 같이, 상기 단어["a" 또는 "an"]는 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
본 개시내용이 오직 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하지만, 청구항에서 "또는"이라는 용어의 사용은 오직 대안을 지칭하도록 명확히 표시되지 않는 한 또는 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하도록 사용된다. 본원에 사용된 것과 같이, "또 다른"은 적어도 제2 또는 이것 초과를 의미할 수 있다.
본 출원에 걸쳐, "약"이라는 용어는 값이 장치에 대한 오차의 고유한 변동을 포함한다는 것을 나타내도록 사용되고, 상기 방법은 연구 대상체 중에 존재하는 값 또는 변동을 결정하도록 사용된다. 일부 양태에서, 상기 용어는 일반적으로 기술된 값을 측정하기 위한 표준 분석 기법을 사용하여 결정되면서 기술된 값의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 상기 용어는 또한 예컨대 소정의 마커에 대한 양성 또는 음성인 집단에서 세포의 백분율에 대해 기술된 값의 플러스 또는 마이너스 5%를 지칭함으로써 사용될 수 있다.
"외인성"이라는 용어는, 세포 또는 유기체에서 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용될 때, 인공 수단 또는 자연 수단에 의해 세포 또는 유기체로 도입되는 단백질, 유전자, 핵산 또는 폴리 뉴클레오타이드를 지칭하거나, 세포와 관련하여 상기 용어는 단리되고 인공 수단 또는 자연 수단에 의해 다른 세포 또는 유기체로 후속하여 도입되는 세포를 지칭한다. 외인성 핵산은 상이한 유기체 또는 세포 기원이거나, 이것은 유기체 또는 세포 내에 자연 발생하는 핵산의 하나 이상의 추가적인 카피일 수 있다. 외인성 세포는 상이한 유기체 기원일 수 있거나, 이것은 동일한 유기체 기원일 수 있다. 비제한적인 예에 의해, 외인성 핵산은 이것이 자연 세포에서 있는 곳과 상이한 염색체 위치에 있거나, 그렇지 않으면 자연에서 발견된 상이한 핵산 서열에 의해 플랭킹된 것이다.
"발현 작제물" 또는 "발현 카세트"에 의해 전사를 지시할 수 있는 핵산 분자가 의도된다. 발현 작제물은 최소한도로 하나 이상의 원하는 세포 유형, 조직 또는 기관에서 유전자 발현을 지시하는 하나 이상의 전사 제어 요소(예컨대, 프로모터, 인핸서 또는 이의 구조 기능적 균등물)를 포함한다. 추가적인 요소, 예컨대 전사 종결 신호는 또한 포함될 수 있다.
"벡터" 또는 "작제물"(때때로 유전자 전달 시스템 또는 유전자 운반 "비히클"이라 지칭됨)은 시험관내 또는 생체내 숙주 세포로 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다.
벡터의 흔한 형태인 "플라스미드"는 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 염색체 DNA와 별개의 염색체외 DNA 분자이다. 소정의 경우에, 이것은 원형 및 이중 가닥이다.
"세포"라는 용어는 당해 분야에서 이의 가장 넓은 의미로 본원에서 사용되고, 다세포 유기체의 조직의 구조 단위가 이것을 외부로부터 분리하는 막 구조에 의해 둘러싸이고, 자가 복제하는 역량을 갖고, 이것을 발현하기 위한 유전 정보 및 기전을 갖는 살아있는 바디를 지칭한다. 본원에 사용된 세포는 자연 발생 세포 또는 인공적으로 변형된 세포(예를 들면, 융합 세포, 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다.
"줄기 세포"라는 용어는 본원에서 적합한 조건 하에 특수한 세포 유형의 다양한 범위로 분화할 수 있지만, 다른 적합한 조건 하에 자가 재생하고 필수적으로 비분화된 다능성 상태에 남을 수 있는 세포를 지칭한다. "줄기 세포"라는 용어는 또한 다능성 세포, 다분화성 세포, 전구세포 및 선조 세포를 포함한다. 예시적인 인간 줄기 세포는 골수 조직으로부터 얻은 조혈 또는 중간엽 줄기 세포, 배아 조직으로부터 얻은 배아 줄기 세포, 또는 태아의 생식기 조직으로부터 얻은 배아 생식 세포로부터 얻어질 수 있다. 예시적인 다능성 줄기 세포는 또한 다능성과 연관된 소정의 전사 인자의 발현에 의해 이것을 다능성 상태로 재프로그래밍함으로써 체세포로부터 제조될 수 있고, 이 세포는 "유도 다능성 줄기 세포" 또는 "iPSc 또는 iPS 세포"라 칭해진다.
"배아 줄기(ES) 세포"는 초기 단계에서의 배아, 예컨대 배반포 단계에서의 내부 세포 덩어리로부터 얻어지거나, 인공 수단(예를 들면, 핵 이동)에 의해 제조되고, 생식 세포(예를 들면, 정자 및 난자)를 포함하는 배아 또는 성인에서 임의의 분화된 세포 유형을 생성시킬 수 있는 비분화된 다능성 세포이다.
"유도 다능성 줄기 세포(iPSc 또는 iPS 세포)"는 인자(본원에서 재프로그래밍 인자라 지칭됨)의 조합을 발현하거나 이의 발현을 유도함으로써 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성된 세포이다. iPS 세포는 태아, 출생 후, 갓난, 청소년 또는 성인 체세포를 사용하여 생성될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 체세포를 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위해 사용될 수 있는 인자는 예를 들면 Oct4(때때로 Oct 3/4라 지칭됨), Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, 및 Lin28을 포함한다. 일부 실시형태에서, 체세포는 체세포를 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위해 적어도 2개의 재프로그래밍 인자, 적어도 3개의 재프로그래밍 인자, 적어도 4개의 재프로그래밍 인자, 적어도 5개의 재프로그래밍 인자, 적어도 6개의 재프로그래밍 인자 또는 적어도 7개의 재프로그래밍 인자를 발현함으로써 재프로그래밍된다.
"다능성 줄기 세포"는 하나 이상의 조직 또는 기관을 구성하는 모든 세포, 또는 바람직하게는, 내배엽(내부 위벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 골, 혈액, 비뇨생식기) 또는 외배엽(상피 조직 및 신경계)인 임의의 3개의 생식 층으로 분화할 가능성을 갖는 줄기 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 것과 같이, "체세포"라는 용어는 DNA를 다음 세대로 직접적으로 운반하지 않는 난자, 정자, 또는 기타와 같은 생식 세포 이외의 임의의 세포를 지칭한다. 통상적으로, 체세포는 제한된 다능성을 갖거나 다능성을 갖지 않는다. 본원에 사용된 체세포는 자연 발생이거나 유전적으로 변형될 수 있다.
"프로그래밍"은 세포가 제조할 수 있는 자손의 유형을 변경하는 과정이다. 예를 들면, 세포는 세포가 프로그래밍 없는 동일한 조건 하에 형성할 수 있는 것과 비교하여 배양물에서 또는 생체내 적어도 하나의 새로운 세포 유형의 자손을 형성할 수 있도록 변경될 때 프로그래밍된다. 이는 충분한 증식 후 본질적으로 이러한 자손이 프로그래밍 전 형성할 수 없으면 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 자손의 측정 가능한 비율이 관찰되고, 새로운 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율이 프로그래밍 전보다 더 측정 가능하다는 것을 의미한다. 이 과정은 분화, 탈분화 및 전환분화를 포함한다.
"재프로그래밍"은 재프로그래밍 없는 동일한 조건 하에 갖는 것보다 배양물에서 또는 생체내 적어도 하나의 새로운 세포 유형의 자손을 형성하는 측정 가능하게 증가된 역량을 세포에 부여하는 과정이다. 더 구체적으로는, 재프로그래밍은 다능성 가능성을 체세포에 부여하는 과정이다. 이는 충분한 증식 후 본질적으로 이러한 자손이 재프로그래밍 전 형성할 수 없으면 새로운 세포 유형의 표현형 특징을 갖는 자손의 측정 가능한 비율, 달리 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 비율이 재프로그래밍 전보다 더 측정 가능하다는 것을 의미한다.
"분화"는 덜 특수화된 세포가 더 특수화된 세포 유형이 되는 과정이다. "탈분화"는 부분적으로 또는 말단으로 분화된 세포가 더 초기의 발달 단계, 예컨대 다능성 또는 다분화력으로 되돌아가는 세포 과정이다. "전환분화"는 하나의 분화된 세포 유형을 또 다른 분화된 세포 유형으로 전환시키는 과정이다. 통상적으로, 프로그래밍에 의한 전환분화는 중간 다능성 단계를 통해 계대배양하는 세포 없이 발생하고, 즉 세포는 하나의 분화된 세포 유형으로부터 또 다른 분화된 세포유형으로 직접적으로 프로그래밍된다. 소정의 조건 하에, 새로운 세포 유형의 특징을 갖는 자손의 비율은 증가하는 선호도의 순서로 적어도 약 1%, 5%, 25% 또는 초과일 수 있다.
"정방향 프로그래밍"이라는 용어는 다분화력 또는 다능성 세포에 대한 하나 이상의 특정 계통 결정 유전자 또는 유전자 산물의 제공에 의해 다능성을 갖지 않는 분화된 체세포와 반대로 다분화력 또는 다능성 세포의 프로그래밍을 지칭한다. 예를 들면, 정방향 프로그래밍은 조혈 전구세포 또는 다른 전구세포, 또는 조혈 세포 또는 다른 분화된 체세포로의 ESC 또는 iPSC의 프로그래밍의 과정을 기술할 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "대상체" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"라는 용어는 포유류, 바람직하게는 세포 또는 조직 이식을 필요로 하는 임의의 연령의 인간, 남성 또는 여성을 지칭한다. 통상적으로, 대상체는 세포 또는 조직 이식을 통한 치료에 수정 가능한 장애, 또는 병리학적 또는 바람직하지 않은 병태, 상태 또는 증후군, 또는 신체적, 형태학적 또는 생리학적 비정상으로 인해 세포 또는 조직 이식(본원에서 또한 수혜자라 지칭됨)을 필요로 한다.
"생존 제제"는 세포 배양 배지에 첨가될 때 세포 생존을 촉진하고/하거나 지지하는 제제를 지칭한다. 예를 들면, Rho 연관된 키나제(ROCK) 억제제 또는 미오신 II 특이적 억제제는 생존 제제로서 사용될 수 있다. 특정한 양태에서, 이 생존 제제는 배양에서 세포의 응집을 촉진한다.
"ROCK 억제제"로 축약된 "Rho 연관된 키나제 억제제"는 세포에서 Rho 연관된 키나제 또는 이의 신호전달 경로의 기능을 억제하거나 감소시키는 임의의 물질, 예컨대 소분자, siRNA, miRNA, 안티센스 RNA 또는 기타를 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같이 "ROCK 신호전달 경로"는 세포에서 ROCK 관련된 신호전달 경로, 예컨대 Rho-ROCK-미오신 II 신호전달 경로, 이의 상류의 신호전달 경로 또는 이의 하류의 신호전달 경로에 관여된 임의의 신호 프로세서를 포함할 수 있다. ROCK 억제제의 예는 Rho 특이적 억제제, ROCK 특이적 억제제, MRLC(미오신 조절 중쇄) 특이적 억제제 또는 미오신 II 특이적 억제제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"수임된 심장의 전구세포(CPC), 프라이밍된 CPC 또는 CTC4 세포"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 이것이 심근세포로 아직 완전히 분화되지 않았지만 분화가 심장 계통을 향해 조작되는 세포를 지칭한다. 따라서, 이 CPC는 심근세포가 되도록 프라이밍된다. 수임 심장 전구세포는 저온보존될 수 있고, 플레이팅되거나 생체내 주사될 때 추가적인 성장 인자 또는 소분자 신호전달 없이 90% 초과의 심근세포로 분화할 것이다. 수임 심장 전구세포 마커의 예는 PDGFRα 및 CD56을 포함한다. 특정한 양태에서, 수임 심장 전구세포는 CXCR4, KDR, CKIT, EPCAM 및/또는 사르코머 알파 액티닌을 발현하지 않는다. 이 수임 CPC 또는 CTC4 세포는 다능성이고, 또한 예컨대 성장 인자의 존재 하에 배양함으로써 다른 세포 계통, 예컨대 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포로 추가로 분화될 수 있다.
"심근세포" 또는 심장 근육 세포는 심장 근육을 구성하는 근육세포를 지칭한다. 심장 특이적 마커의 예는 α-사르코머 액티닌, 트로포닌, 미오신 중쇄 또는 L-유형 칼슘 전류를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "투여하는"은 당업자에게 알려진 임의의 다양한 방법 및 전달 시스템을 사용하여 영향을 받거나 수행되는 방식으로 전달하는 것을 의미한다. 투여는 예를 들면 정맥내로, 경구로, 임플란트를 통해, 점막경유로, 피부경유로, 근육내로 또는 피하로 수행될 수 있다. 구체적으로는, 국소 투여가 고완된다. "투여"는 또한 예를 들면 1회, 복수 횟수로 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
"슈퍼 공여자"는 본원에서 소정의 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 동형접합성인 개체를 지칭한다. 이 동형접합성 개체는 슈퍼 공여자로서 작용할 수 있고, 이들의 세포를 포함하는 조직 및 다른 재료를 포함하는 이들의 세포는 그 일배체형에 동형접합성 또는 이형접합성인 개체에서 이식될 수 있다. 슈퍼 공여자는 각각 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ 유전죄위/유전좌위 대립유전자에 대해 동형접합성일 수 있다.
II. 다능성 줄기 세포
본 개시내용의 소정의 실시형태에서, 다능성 줄기 세포로부터 심장 전구세포를 제공하기 위한 개시된 방법 및 조성물이 있다. 다능성 줄기 세포는 비제한적인 예로서 유도 다능성 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포일 수 있다.
특정한 양태에서, 본원에 사용된 다능성 줄기 세포는 본 개시내용의 심장 전구세포를 포함하는 신체의 모든 세포 유형으로 분화하는 가능성을 보유하면서 시험관내 장기간 증식을 할 수 있는 인간 배아 줄기 세포(ESC) 또는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC)이다. 따라서, 이 세포는 약물 개발 및 치료학적 사용 둘 다를 위해 환자 특이적 기능적 심장 전구세포의 비제한적인 공급을 잠재적으로 제공할 수 있었다.
A. 배아 줄기 세포
소정의 양태에서, 다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포(ESC)이다. ES 세포는 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래되고, 높은 시험관내 분화 역량을 갖는다. ES 세포는 발생 배아의 외부 영양외배엽 층을 제거하고 이후 비성장 세포의 피더 층에서 내부 덩어리 세포를 배양함으로써 단리될 수 있다. 재플레이팅된 세포는 ES 세포의 새로운 콜로니를 계속해서 증식시키고 생산할 수 있고, 이 세포는 제거되고, 해리되고, 다시 재플레이팅되고, 성장하도록 허용될 수 있다. 비분화된 ES 세포의 "하위배양"의 이 과정은 비분화된 ES 세포를 함유하는 세포주를 제조하기 위해 수회 반복될 수 있다(미국 특허 제5,843,780호; 제6,200,806호; 제7,029,913호). ES 세포는 이의 다능성을 유지하면서 증식할 가능성을 갖는다. 예를 들면, ES 세포는 세포 및 세포 분화를 제어하는 유전자에서의 조사에서 유용하다. 유전 조작 및 선택과 조합된 ES 세포의 다능성은 형질전환, 키메라 및 넉다운 마우스의 생성을 통해 생체내 유전자 분석 연구에 사용될 수 있다.
마우스 ES 세포를 제조하는 방법은 잘 알려져 있다. 하나의 방법에서, 마우스의 129 균주로부터의 전이식 배반포를 영양외배엽을 제거하기 위해 마우스 항혈청으로 처리하고, 내부 세포 덩어리를 소 태아 혈청을 함유하는 배지에서 화학적으로 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포의 피더 층에서 배양한다. 발생하는 비분화된 ES 세포의 콜로니를 ES 세포의 집단을 제조하기 위해 소 태아 혈청의 존재 하에 마우스 배아 섬유아세포 피더 층에서 하위배양한다. 일부 방법에서, 마우스 ES 세포는 혈청 함유 배양 배지에 사이토카인 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor, LIF)를 첨가함으로써 피더 층의 존재 하에 성장할 수 있다(Smith, 2000). 다른 방법에서, 마우스 ES 세포는 골 형성 단백질 및 LIF의 존재 하에 무혈청 배지에서 성장할 수 있다(Ying et al., 2003).
인간 ES 세포는 정자 및 난자 세포의 융합, 핵 이동, 발병 또는 염색질의 재프로그래밍 및 이전에 기재된 방법(Thomson and Marshall, 1998; Reubinoff et al., 2000)에 의해 배아 세포를 제조하기 위해 플라스마 막으로의 재프로그래밍된 염색질의 후속하는 혼입에 위해 제조된 접합자 또는 배반포 단계 포유류 배아로부터 제조되거나 유래될 수 있다. 하나의 방법에서, 인간 배반포는 항인간 혈청에 노출되고, 영양외배엽 세포는 용해되고 마우스 배아 섬유아세포의 피더 층에서 배양된 내부 세포 덩어리로부터 제거된다. 추가로, 내부 세포 덩어리로부터 유래된 세포의 클램프는 화학적으로 또는 기계적으로 해리되고 재플레이팅되고, 비분화된 형태를 갖는 콜로니는 마이크로 피펫에 의해 선택되고 해리되고 재플레이팅된다. 일부 방법에서, 인간 ES 세포는 기본 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에 섬유아세포의 피더 층에서 ES 세포를 배양함으로써 혈청 없이 성장할 수 있다(Amit et al., 2000). 다른 방법에서, 인간 ES 세포는 기본 섬유아세포 성장 인자를 함유하는 "조건" 배지의 존재 하에 MATRIGELTM 또는 라미닌과 같은 단백질 기질에서 세포를 배양함으로써 피더 세포 층 없이 성장할 수 있다(Xu et al., 2001).
ES 세포는 또한 이전에 기재된 방법(Thomson and Marshall, 1998; Thomson et al., 1995; Thomson and Odorico, 2000; 미국 특허 제5,843,780호)에 의해 레서스 원숭이 및 마모셋을 포함하는 다른 유기체뿐만 아니라, 확립된 마우스 및 인간 세포주로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 확립된 인간 ES 세포주는 MAOI, MA09, ACT-4, HI, H7, H9, H13, H14 및 ACT30을 포함한다. 추가의 예로서, 확립된 마우스 ES 세포주는 마우스 균주 129 배아의 내부 세포 덩어리로부터 확립된 CGR8 세포주를 포함하고, CGR8 세포의 배양물은 피더 층이 없는 LIF의 존재 하에 성장할 수 있다.
ES 줄기 세포는 전사 인자 Oct4, 알칼리 포스파타제(AP), 단계 특이적 배아 항원 SSEA-1, 단계 특이적 배아 항원 SSEA-3, 단계 특이적 배아 항원 SSEA-4, 전사 인자 NANOG, 종양 거부 항원 1-60(TRA-1-60), 종양 거부 항원 1-81(TRA-1-81), SOX2 또는 REX1을 포함하는 단백질 마커에 의해 검출될 수 있다.
B. 유도 다능성 줄기 세포
다른 양태에서, 본원에 사용된 다능성 줄기 세포는 유도 다능성 줄기(iP) 세포, 흔히 축약된 iP 세포 또는 iPSC이다. 다능성의 유도는 원래 다능성에 연결된 전사 인자의 도입을 통해 체세포의 재프로그래밍에 의해 마우스 세포를 사용하여 2006년(Yamanaka et al. 2006)에 그리고 인간 세포를 사용하여 2007년(Yu et al. 2007; Takahashi et al. 2007)에 달성되었다. iPSC의 사용은 ES 세포의 대규모 임상 사용과 연관된 윤리적 문제 및 실질적 문제의 대부분을 우회하고, iPSC 유래된 자가유래 이식물을 갖는 환자는 이식편 거부를 방지하기 위해 평생 동안의 면역억제 치료를 요하지 않을 수 있다.
생식 세포의 배제에 의해, 임의의 세포는 iPSC에 대한 출발점으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포 유형은 각질 세포, 섬유아세포, 조혈 세포, 간엽성 세포, 간 세포 또는 위 세포일 수 있었다. T 세포는 또한 재프로그래밍을 위한 체세포의 소스로서 사용될 수 있다(미국 특허 제8,741,648호; 미국 공보 제2015/0191697호). 세포 분화의 정도 또는 세포가 수집된 동물의 연령에 대한 제한은 없고, 심지어 비분화된 전구세포(줄기 체세포를 포함) 및 마지막으로 분화된 성숙 세포는 본원에 개시된 방법에서 체세포의 소스로서 사용될 수 있다. iPS 세포는 인간 ES 세포를 특정 세포 유형으로 분화시키고, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81을 포함하는 인간 ES 세포 마커를 발현하는 것으로 알려진 조건 하에 성장할 수 있다.
체세포는 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 iPS 세포를 제조하도록 재프로그래밍될 수 있다. 당업자는 iPS 세포를 용이하게 제조할 수 있고, 예를 들면, 공개 미국 특허 출원 제2009/0246875호, 공개 미국 특허 출원 제2010/0210014호; 공개 미국 특허 출원 제2012/0276636호; 미국 특허 제8,058,065호; 미국 특허 제8,129,187호; PCT 공보 WO 2007/069666호 A1, 미국 특허 제8,268,620호; 미국 특허 제8,546,140호; 미국 특허 제9,175,268호; 미국 특허 제8,741,648호; 미국 특허 출원 제2011/0104125호 및 미국 특허 출원 제8,691,574호를 참조하고, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 일반적으로, 핵 재프로그래밍 인자는 체세포로부터 다능성 줄기 세포를 제조하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Lin28의 적어도 3개 또는 적어도 4개가 사용된다. 다른 실시형태에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 사용되거나 Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Lin28이 사용된다.
이 핵 재프로그래밍 물질의 마우스 및 인간 cDNA 서열은 WO 2007/069666호 및 미국 특허 제8,183,038호에 언급된 NCBI 수탁 번호를 참조하여 이용 가능하고, 이들은 본원에 참고로 포함된다. 하나 이상의 재프로그래밍 물질 또는 이 재프로그래밍 물질을 암호화하는 핵산을 도입하는 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들면 미국 특허 제8,268,620호, 제8,691,574호, 제8,741,648호, 제8,546,140호, 공개 미국 특허 제8,900,871호 및 미국 특허 제8,071,369호에 개시되어 있고, 이들 둘 다는 본원에 참고로 포함된다.
iPSC는 유래되면 다능성을 유지시키기에 충분한 배지에서 배양될 수 있다. iPSC는 미국 특허 제7,442,548호 및 미국 특허 공보 제2003/0211603호에 기재된 것과 같이 다능성 줄기 세포, 더 구체적으로는, 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 개발된 다양한 배지 및 기법에 의해 사용될 수 있다. 마우스 세포의 경우에, 배양은 보통의 배지에 대한 분화 억제 인자로서의 백혈병 억제 인자(LIF)의 첨가에 의해 수행된다. 인간 세포의 경우에, 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 LIF 대신에 첨가되는 것이 바람직하다. 당해 분야에 알려진 것처럼 iPSC의 배양 및 유지를 위한 다른 방법은 본원에 개시된 방법에 의해 사용될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 비한정된 조건이 사용될 수 있고, 예를 들면, 다능성 세포는 비분화된 상태로 줄기 세포를 유지시키기 위해 섬유아세포 피더 세포 또는 섬유아세포 피더 세포에 노출된 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 피더 세포로서 세포 분열을 종결시키기 위해 방사선 또는 항생제에 의해 처리된 마우스 배아 섬유아세포의 공동존재 하에 배양된다. 대안적으로, 다능성 세포는 한정된 피더 독립적 배양 시스템, 예컨대 TESRTM 배지(Ludwig et al., 2006a; Ludwig et al., 2006b) 또는 E8TM/Essential 8TM 배지(Chen et al., 2011)를 사용하여 본질적으로 비분화된 상태로 배양되고 유지될 수 있다.
플라스미드는 조절된 높은 카피수의 달성 및 박테리아에서의 플라스미드 불안정성의 잠재적인 원인의 회피 및 인간 세포를 포함하는 포유류 세포에서의 사용과 적합한 플라스미드 선택에 대한 수단의 제공과 같은 마음에 있는 다수의 목적에 의해 설계된다. 인간 세포에서의 사용에 대해 플라스미드의 이중 요건에 특별한 주의가 기울어져야 한다. 처음에, 이것은 다량의 DNA가 제조되고 정제될 수 있도록 이 콜라이에서의 유지 및 발효에 적합하다. 둘째로, 이것은 인간 환자 및 동물에서의 사용에 안전하고 적합하다. 제1 요건은 박테리아 발효 동안 선택되고 비교적 쉽게 안정하게 유지될 수 있는 높은 카피수 플라스미드를 요구한다. 제2 요건은 선택 가능한 마커 및 다른 암호화 서열과 같은 요소에 대한 주의를 요구한다. 일부 실시형태에서, 마커를 암호화하는 플라스미드는 (1) 높은 카피수 복제 기원, (2) 선택 가능한 마커, 예컨대 비제한적인 예로서 카나마이신에 의한 항생제 선택을 위한 neo 유전자, (3) 티로시나제 인핸서를 포함하는 전사 종결 서열 및 (4) 다양한 핵산 카세트의 혼입을 위한 멀티클로닝 부위; 및 (5) 티로시나제 프로모터에 작동 가능하게 연결된 마커를 암호화하는 핵산 서열로 이루어진다. 특정한 양태에서, 플라스미드는 티로시나제 인핸서 또는 프로모터를 포함하지 않는다. 단백질을 암호화하는 핵산을 유도하기 위한 당해 분야에 알려진 많은 플라스미드 벡터가 있다. 이들은 미국 특허 제6,103,470호; 미국 특허 제7,598,364호; 미국 특허 제7,989,425호; 및 미국 특허 제6,416,998호 및 미국 출원 제12/478,154호에 개시된 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않고, 이들은 본원에 참고로 포함된다.
에피솜 유전자 전달 시스템은 플라스미드, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 기반 에피솜 벡터(미국 특허 제8,546,140호), 효모 기반 벡터, 아데노바이러스 기반 벡터, 유인원 바이러스 40(SV40) 기반 에피솜 벡터, 소 유두종 바이러스(BPV) 기반 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA 기반 또는 DNA 기반 바이러스 벡터일 수 있다(PCT/JP2009/062911호, PCT/JP2011/069588호).
C. 체세포 핵 이동에 의해 유래된 배아 줄기 세포
조혈 전구세포를 제조하기 위한 다능성 줄기 세포는 공여자 핵이 방추사가 없는 난모세포로 이동되는 체세포 핵 이동의 수단에 의해 또한 제조될 수 있다. 핵 이동에 의해 제조된 줄기 세포는 공여자 핵과 유전적으로 동일하다. 하나의 방법에서, 레서스 마카크의 피부 섬유아세포로부터의 공여자 섬유아세포 핵은 전기융합에 의해 방추사가 없는 성숙 중기 II 레서스 마카크 난모세포의 세포질로 도입된다(Byrne et al., 2007). 융합된 난모세포는 이오노마이신에 대한 노출에 의해 활성화되고, 이후 배반포 단계까지 배양된다. 이후, 선택된 배반포의 내부 세포 덩어리는 배아 줄기 세포주를 제조하도록 배양된다. 배아 줄기 세포주는 정상 ES 세포 형태를 보여주고, 다양한 ES 세포 마커를 발현하고, 시험관내 및 생체내 다수의 세포 유형 둘 다로 분화한다.
D. MHC 일배체형 일치
주요 조직적합성 복합체는 동종이계 기관 이식의 면역 거부의 주요 원인이다. 3개의 주요 클래스 I MHC 일배체형(A, B 및 C) 및 3개의 주요 MHC 클래스 II 일배체형(DR, DP 및 DQ)이 있다. HLA 유전좌위는 고도로 다형성이고 염색체 6에서 4 Mb에 걸쳐 분포된다. 그 영역 내에 HLA 유전자를 일배체형화하는 능력은 이 영역이 자가면역 및 감염성 질환과 연관되고 공여자와 수혜자 사이의 HLA 일배체형의 적합성이 이식의 임상 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 임상적으로 중요하다. MHC 클래스 I에 상응하는 HLA는 세포 내부로부터의 펩타이드를 제시하고, MHC 클래스 II에 상응하는 HLA는 T-림프구에 세포의 외부로부터의 항원을 제시한다. 이식편과 숙주 사이의 MHC 일배체형의 부적합성은 이식편에 대한 면역 반응을 촉발하고 이의 거부를 발생시킨다. 따라서, 환자는 거부를 방지하기 위해 면역억제제로 치료될 수 있다. HLA 일치된 줄기 세포주는 면역 거부의 위험을 극복할 수 있다.
이식에서의 HLA의 중요성 때문에, HLA 유전좌위는 보통 양호한 공여자-수혜자 쌍을 확인하기 위해 혈청학 및 PCR에 의해 타이핑된다. HLA 클래스 I 및 II 항원의 혈청학적 검출은 정제된 T 또는 B 림프구에 의한 보체 매개된 림프구세포독성 시험을 사용하여 달성될 수 있다. 이 절차는 HLA-A 및 HLA-B 유전좌위를 일치시키기 위해 주로 사용된다. 분자 기반 조직 타이핑은 혈청학 시험보다 대개 더 정확할 수 있다. PCR 산물이 일련의 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대해 시험되는 SSOP(서열 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브) 방법과 같은 저해상 분자 방법은 HLA 항원을 확인하기 위해 사용될 수 있고, 현재 이 방법은 클래스 II-HLA 타이핑에 대해 사용되는 가장 흔한 방법이다. PCR 증폭을 위한 대립유전자 특이적 프라이머를 이용하는 SSP(서열 특이적 프라이머) 방법과 같은 고해상 기법은 특이적 MHC 대립유전자를 확인할 수 있다.
공여자와 수혜자 사이의 MHC 조직적합성은 공여자 세포가 HLA 동형접합성이면, 즉 각각의 항원 제시 단백질에 대해 동일한 대립유전자를 함유하면 유의미하게 증가한다. 대부분의 개체는 MHC 클래스 I 및 II 유전자에 대해 이형접합성이지만, 소정의 개체는 이들의 유전자에 동형접합성이다. 이 동형접합성 개체는 슈퍼 공여자로서 작용할 수 있고, 이들의 세포로부터 생성된 이식편은 그 일배체형에 동형접합성 또는 이형접합성인 모든 개체에서 이식될 수 있다. 더욱이, 동형접합성 공여자 세포가 집단에서 높은 빈도로 발견된 일배체형을 가지면, 이 세포는 매우 많은 개체에 대한 이식 치료에서 적용을 가질 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 방법의 iPSC는 치료되는 대상체 또는 환자의 HLA 유형과 동일하거나 실질적으로 동일한 HLA 유형을 갖는 또 다른 대상체의 체세포로부터 제조될 수 있다. 하나의 경우에, 공여자의 주요 HLA(예를 들면, HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR의 3개의 주요 유전좌위)는 수혜자의 주요 HLA와 동등하다. 일부 경우에, 체세포 공여자는 슈퍼 공여자일 수 있고, 따라서 MHC 동형접합성 슈퍼 공여자로부터 유래된 iPSC는 수임 심장 전구세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 슈퍼 공여자로부터 유래된 수임 심장 전구세포는 그 일배체형에 동형접합성 또는 이형접합성인 대상체에서 이식될 수 있다. 예를 들면, 수임 심장 전구세포는 2개의 HLA 대립유전자, 예컨대 HLA-A 및 HLA-B에서 동형접합성일 수 있다. 그러므로, 슈퍼 공여자로부터 제조된 수임 심장 전구세포는 아주 많은 수의 잠재 적인 수혜자를 잠재적으로 "일치"시킬 수 있는 수임 심장 전구세포를 제조하기 위해 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용의 소정의 실시형태는 HLA 동형접합성 수임 심장 전구세포의 레퍼토리(예를 들면, 라이브러리)를 제공한다. 대상체 라이브러리에서 나타난 HLA 일배체형은 인간 집단에서 발견된 가장 흔한 HLA 일배체형, 예를 들면 흔한 코카시안 HLA 일배체형, 아프리카 자손의 개체에서 발견된 흔한 HLA 일배체형, 흔한 아시아인 HLA 일배체형, 흔한 히스패닉 HLA 일배체형, 흔한 아메리카 원주민 HLA 일배체형 등에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 단일의 풍부한 일배체형이 집단의 상당한 비율에 존재할 수 있어서, 단일의 HLA 동형접합성 세포주가 상당한 퍼센트의 환자에 대한 조직적합성 공여자를 제공하도록 한다 라이브러리는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 10 내지 15개, 15 내지 20개, 20 내지 25개, 25 내지 30개 또는 30개 초과의 HLA 동형접합성 세포의 상이한 유형을 포함한다. 대상체 라이브러리는 제1 HLA 일배체형에 동형접합성인 제1 HLA 동형접합성 세포 및 제2 HLA 일배체형에 동형접합성인 적어도 제2 HLA 동형접합성 세포일 수 있다. 대상체 라이브러리는 단일 세포 유형을 포함할 수 있거나, 2개 이상의 상이한 세포 유형을 포함할 수 있다. 대상체 라이브러리는 예를 들면 조사 가능한 컴퓨터 데이터베이스에 의해 카테고리화될 수 있고, 여기서 HLA 일배체형에 관한 정보 및 선택적으로 추가적인 정보, 예컨대 세포 표면 마커, 핵형 정보 및 기타가 저장되고 조사될 수 있다.
본원에 기재된 HLA 동형접합성 수임 심장 전구세포는 세포 및/또는 조직의 이식을 수반하는 임상 분야의 넓은 어레이에서 사용될 수 있다. HLA 동형접합성 수임 심장 전구세포는 수혜자와 적합한 HLA이고, 따라서 면역억제 치료의 필요 없이 또는 적어도 면역억제 치료에 대한 필요 감소로 수혜자로 도입될 수 있다. 표준 면역억제 약물 섭생은 매달 수천 달러의 비용이 들고, 대개 삶을 위협하고 치료하기에 비싼 감염 및 암을 포함하는 바람직하지 않는 부작용을 가질 수 있다. 본 HLA 동형접합성 수임 심장 전구세포는 따라서 임상 분야에 대한 인간 세포의 사용을 현재 제한하는 장애의 일부를 극복한다.
III. 수임 심장 전구세포(CTC4)로의 분화
본 개시내용의 실시형태는 심근세포로 더 분화하도록 수임되거나 프라이밍된 심장의 전구세포로의 PSC, 특히 iPSC의 분화에 관한 것이다. 도 1A에서의 도식은 생물반응기에서 분화, 예컨대 대규모 분화를 개시하기 전에 Essential 8 배지를 갖는 비트로넥틴 코팅된 용기에서 확장된 iPSC를 사용하여 시작하는 예시적인 6일 분화 공정을 보여준다.
일부 양태에서, 본 방법은 완전 현탁 생물반응기 공정에서의 Wnt 신호전달의 조절을 수반한다. 심장 발생 동안 중배엽에서의 Wnt의 신호 전달은 추가의 심장 특이성을 유발하도록 신속히 조절될 수 있다. 현재까지, Wnt 신호전달이 감소해야 하는 시기는 잘 기재되어 있지 않다. 본 연구에서, 2개의 세포 표면 마커, CXCR4 및 CD56의 발현이 추적되었다. 심장 분화는 매일 이들 2개의 마커를 분석함으로써 추적될 수 있고, 튼튼한 심장 분화를 갖도록 발현 프로파일에 기초하여 이루어질 수 있다. 초기 중배엽 단계는 CXCR4의 발현의 소실 및 CXCR4-CD56+ 수임 심장 전구세포의 생성 전에 CXCR4+CD56- 집단, 이어서 이중 양성 CXCR4+CD56+ 세포에 의해 표시된다.
Wnt 신호전달은 도 3B에 도시된 것과 같이 세포가 심근세포가 되도록 유도하는 튼튼한 심장 특이성을 갖기 위해 억제될 수 있다. 바람직하게는, 제3일 배양은 CXCR4에 적어도 30% 양성이고, CD56에 60% 미만 양성이다. Wnt 신호전달이 억제되기 전에 배양이 60% 초과 양성 CD56이 되면, 심장 세포의 튼튼한 특이성이 없을 수 있고, 따라서 심근세포가 되는 것의 낮은 효율을 가질 수 있다. 게다가, 배양이 이미 20% 초과의 CXCR4-CD56+이 되어서 CXCR4 발현의 소실을 나타내면, 튼튼한 심장 특이성을 위해 Wnt 신호전달을 억제하는 것이 또한 늦을 수 있다.
A. 응집물 형성
다능성 줄기 세포는 Wnt 작용제, 예컨대 CHIR 99021에 의한 분화를 개시하는 것과 함께 처음에 응집물의 형성을 유도함으로써 세포로 분화된다. 응집 시, 분화는 개시되고, 세포는 배아 발생을 제한된 정도로 되풀이하기 시작한다. 이것이 (태반을 포함하는) 영양외배엽 조직을 형성할 수 없지만, 유기체에 존재하는 실질적으로 모든 다른 유형의 세포가 발생할 수 있다. 본 개시내용은 응집물 형성 후 심장 분화를 추가로 촉진할 수 있다.
다능성 세포는 분화 과정의 일부로서 배양체 또는 응집물을 형성하도록 허용될 수 있다. "배양체"(EB) 또는 성장하는 세포의 클러스터의 형성은 분화를 유도하기 위해 일반적으로 EB로의 인간 다능성 줄기 세포의 시험관내 응집을 수반하고, 내배엽, 외배엽 및 중배엽 기원을 나타내는 다수의 조직 유형으로의 인간 다능성 줄기 세포의 자발적이고 무작위한 분화를 허용한다.
특정한 실시형태에서, 다능성 줄기 세포는 Wnt 경로를 자극하기 위해 ROCK 억제제 및 Wnt 경로의 화학 작용제, 예컨대 GSK3 억제제(예를 들면, CHIR 99021)의 존재 하에 배양될 수 있다. Wnt 경로의 작용제는 CA 853220-52-7(2-아미노-4-(3,4-(메틸렌디옥시)벤질아미노)-6-(3-메톡시페닐)피리미딘), SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314 또는 IM-12를 포함할 수 있다. 배지는 약 1 내지 10 μM, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μM의 농도로 Wnt 작용제, 예컨대 CHIR 99021을 포함할 수 있다. 특정한 양태에서, 배지는 약 4.4 μM의 농도로 Wnt 작용제, 예컨대 CHIR 99021을 포함한다. 특정한 양태에서, 상기 방법은 중배엽 유도를 위해 응집물 형성, 예컨대 제0일 내지 제1일 동안 Wnt 작용제의 약 2 μM 및 이후 예컨대 제1일 내지 제3일 동안 약 4.4 μM의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
ROCK 억제제는 다능성 줄기 세포의 배양 및 계대배양 및/또는 줄기 세포의 분화를 위해 사용될 수 있다. 따라서, ROCK 억제제는 다능성 줄기 세포가 성장하거나 해리하거나 응집물을 형성하거나 분화를 겪는 임의의 세포 배양 배지, 예컨대 부착성 배양물 또는 현탁 배양물에 존재할 수 있다. Rho 특이적 억제제, 예컨대 클로스트리듐 보툴리눔 C3 세포외효소 및/또는 미오신 II 특이적 억제제는 또한 본 개시내용의 소정의 양태에서 ROCK 억제제로서 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 미오신 II 억제제, 예컨대 블레비스타틴은 응집물 형성을 유도하도록 사용될 수 있다.
예시적인 ROCK 특이적 억제제는 ROCK1을 선택적으로 표적화(그러나 또 ROCK2를 표적화)할 뿐만 아니라, TNF-α 및 IL-1β를 억제하는 Y-27632이다. 이것은 세포 투과성이고 ATP와 경쟁함으로써 ROCK1/ROCK2(IC50=800 nM)를 억제한다. 다른 ROCK 억제제는 예를 들면 H1152, Y-30141, Wf-536, HA-1077, 하이드록실-HA-1077, GSK269962A 및 SB-772077-B를 포함한다. 특정한 양태에서, 본 방법에 사용된 ROCK 특이적 억제제는 H1152이다. 일부 양태에서, H1152는 50 내지 200 μM, 예컨대 약 100 μM의 농도로 배양물에 존재한다.
ROCK 억제제의 다른 비제한적인 예는 ROCK에 대한 안티센스 핵산, RNA 간섭 유도 핵산(예를 들면, siRNA), 경쟁적 펩타이드, 길항제 펩타이드, 억제 항체, 항체-ScFV 단편, 이의 우성 음성 변이체 및 발현 벡터를 포함한다. 추가로, 다른 저분자 화합물은 ROCK 억제제로서 알려져 있으므로, 이러한 화합물 또는 이의 유도체는 또한 실시형태에서 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 공보 제20050209261호, 제20050192304호, 제20040014755호, 제20040002508호, 제20040002507호, 제20030125344호 및 제20030087919호 및 국제 특허 공보 제2003/062227호, 제2003/059913호, 제2003/062225호, 제2002/076976호 및 제2004/039796호를 참조하고, 이들은 본원에 참고로 포함된다). 본 방법에서, ROCK 억제제의 1개 또는 2개 또는 초과의 조합이 또한 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, PSC는 배지에서 ROCK 억제제로 처리될 수 있다. 이로써, 본 개시내용의 방법에 사용된 배지는 이미 ROCK 억제제를 함유할 수 있거나, 대안적으로 본 개시내용의 방법은 배지에 ROCK 억제제를 첨가하는 단계를 수반할 수 있다. 배지에서의 ROCK 억제제의 농도는 이것이 줄기 세포의 개선된 생존율과 같은 원하는 효과를 달성할 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 이러한 ROCK 억제제, 예를 들면, Y-27632, HA-1077 또는 H-1152는 적어도 또는 약 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 500 내지 약 1000 μM 또는 이것 내에 유래 가능한 임의의 범위의 효과적인 농도로 사용될 수 있다. 이 양은 개별적으로 또는 하나 이상의 ROCK 억제제와 조합되어 ROCK 억제제의 양을 지칭할 수 있다.
예를 들면, Y-27632가 ROCK 억제제로서 사용될 때, 이것은 약 0.01 내지 약 1000 μM, 더 구체적으로는 약 0.1 내지 약 100 μM, 추가로 더 구체적으로는 약 1.0 내지 약 30 μM 및 가장 구체적으로는 약 2.0 내지 20 μM 또는 이것 내에 유래 가능한 임의의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 파수딜(Fasudil)/HA1077이 ROCK 억제제로서 사용될 때, 이것은 상기 언급된 Y-27632 농도의 약 2배로 사용될 수 있다. H1152가 ROCK 억제제로서 사용될 때, 이것은 상기 언급된 Y-27632 농도의 약 1/50으로 사용될 수 있다.
응집물 형성 단계는 응집물의 제조를 유도하기에 충분한 시간 기간 동안 수행된다. 예를 들면, 다능성 줄기 세포, 예컨대 유도 다능성 줄기 세포는 약 10분, 15분, 20분, 25분, 30분 내지 수시간(예를 들면, 적어도 또는 약 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 24시간, 36시간, 48시간 또는 이것 내에 유래 가능한 임의의 범위) 동안 ROCK 억제제와 접촉될 수 있다. 특정한 양태에서, 1일 내지 3일, 예컨대 약 1일의 기간은 세포가 응집물을 형성하게 유도하기에 충분하다.
ROCK 억제제에 의해 치료되는 줄기 세포(들)의 밀도는 이것이 줄기 세포의 개선된 생존율과 같은 원하는 효과가 달성될 수 있는 밀도인 한 특별히 제한되지는 않는다. 이것은 예를 들면 약 1.0 x 101 내지 1.0 x 107 세포/ml, 더 특히 약 1.0 x 102 내지 1.0 x 107 세포/ml, 추가로 더 특히 약 1.0 x 103 내지 1.0 x 107 세포/ml 및 가장 특히 약 3.0 x 104 내지 2.0 x 106 세포/ml이다.
소정의 실시형태에서, PSC는 (단일 세포 또는 작은 응집물로 해리된) 저밀도에서의 생존, 클로닝 효율 또는 계대배양 효율을 개선하기 위해 ROCK 억제제의 존재 하에 배양된다. 소정의 실시형태에서, PSC는 피더 세포, 피더 세포 추출물 및/또는 혈청의 부재 하에 배양된다. PSC는 하위클로닝 또는 계대배양 전에, 예를 들면 하위클로닝 또는 계대배양 전 적어도 1시간 동안 ROCK 억제제의 존재 하에 배양될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PSC는 하위배양 또는 계대배양 동안에 또는 후에 ROCK 억제제의 존재 하에 유지된다.
다능성 줄기 세포는 세포 배양의 분야에 알려진 임의의 방법을 사용하여 응집물 촉진 배지에 시딩될 수 있다. 예를 들면, 다능성 줄기 세포는 응집물 촉진 배지로 단일 콜로니 또는 클론 집단으로서 시딩될 수 있고, 다능성 줄기 세포는 또한 본질적으로 개별 세포로서 시딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 다능성 줄기 세포는 당해 분야에 알려진 기계적 방법 또는 효소 방법을 사용하여 본질적으로 개별 세포로 해리된다. 비제한적인 예에 의해, 다능성 줄기 세포는 세포와 배양 표면 사이 그리고 세포 자체 사이의 연결을 파괴하는 단백분해 효소에 노출될 수 있다. 응집물 형성 및 분화를 위한 다능성 줄기 세포를 개별화하기 위해 사용될 수 있는 효소는 이의 다양한 상업용 제형의 트립신, 예컨대 TrypLE 또는 효소의 혼합물, 예컨대 Accutase®를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
다양한 기질 성분은 콜라겐(예를 들면, 콜라겐 IV), 라미닌, 비트로넥틴, MatrigelTM, 젤라틴, 폴리리신, 트롬보스폰딘(예를 들면, TSP-1, -2, -3, -4 및/또는 -5), 피브로넥틴 및/또는 ProNectin-FTM를 포함하는 다능성 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다 이들 기질 성분의 조합은 세포 성장 및 세포 생존능력을 촉진하기 위한 추가적인 이점을 제공할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 상기 기질 성분의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 초과는 세포를 배양하도록 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 다능성 세포는 비트로넥틴 코팅된 표면에서 배양된다.
소정의 실시형태에서, 다능성 세포는 배양 표면에서의 배양 형성을 위해 배양 배지에 본질적으로 개별 (또는 분산된) 세포로서 첨가되거나 시딩될 수 있다. 세포가 시딩된 배양 배지는 Essential 8(E8) 배지, 생존 인자, 예컨대 ROCK 억제제 및 Wnt 경로 작용제를 포함할 수 있다. 이들 실시형태에서, 배양 표면은 당해 분야에서 표준 멸균 세포 배양 방법과 적합한 본질적으로 임의의 재료, 예를 들면, 비부착성 표면으로 이루어질 수 있다. 배양 표면은 본원에 기재된 것과 같은 기질 성분(예를 들면, 비트로넥틴)을 추가적으로 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 기질 성분은 표면을 세포 및 배지와 접촉시키기 전에 배양 표면에 도포될 수 있다.
B. 중배엽 유도
다음에, 다능성 줄기 세포 응집물, 예컨대 iPS 세포 응집물은 중배엽 유도를 촉진하기 위해 배지에서 배양된다. 응집물은 Wnt 작용제 및 선택적으로 액티빈/노달 작용제 및/또는 BMP와 접촉될 수 있다. 특정한 양태에서, 배지는 ROCK 억제제 또는 인슐린을 포함하지 않는다. 배지는 응집물 형성 단계와 비교하여 하나 이상의 Wnt 작용제의 더 높은 농도를 포함할 수 있다. Wnt 작용제는 응집물 형성 단계에서 Wnt 작용제와 동일할 수 있거나 상이한 Wnt 작용제일 수 있다. Wnt 경로의 작용제는 CHIR 99021, IWP-1, IWP-2, IWP-3, IWP-4, CA 853220-52-7(2-아미노-4-(3,4-(메틸렌디옥시)벤질아미노)-6-(3-메톡시페닐)피리미딘), SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314 또는 IM-12를 포함할 수 있다. Wnt 작용제는 CHIR 99021일 수 있고, 약 1 내지 10 μM, 예컨대 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μM의 농도로 존재할 수 있다. 특정한 양태에서, Wnt 작용제는 CHIR 99021이고, 약 4 내지 5 μM, 예컨대 약 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5 μM, 구체적으로는 약 4.4 μM의 농도로 존재한다.
액티빈 작용제는 예를 들면 TGFβ 또는 액티빈 수용체에 결합함으로써 액티빈/노달 신호전달 경로를 활성화하는 화합물이다. 액티빈 작용제의 예는 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 AB, TGFβl, 성장 및 분화 인자(GDF)-3, BML-284 및 Nodal을 포함한다. 예를 들면, 액티빈 작용제 또는 BMP는 0.1 ng/mL 내지 12 ng/mL의 농도로 사용될 수 있다.
중배엽 유도를 위한 기준 배지는 줄기 세포를 배양하기 위해 당해 분야에 알려진 임의의 배지일 수 있다. 예시적인 배지는 E8, TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640 및 Fischer 배지를 포함한다. 특정한 양태에서, 기준 배지는 B27가 보충된 RPMI이다. 특정 양태에서, 배지는 인슐린을 포함하지 않거나 인슐린을 본질적으로 갖지 않는다.
중배엽 유도 단계는 중배엽 마커, 예컨대 CXCR4, KDR, PDGFRα 및/또는 CD56의 발현뿐만 아니라 CKIT 및/또는 EPCAM의 발현의 소실을 유도하기에 충분한 시간 기간 동안일 수 있다. 예를 들면, 응집물은 약 1일 내지 5일, 예컨대 약 1일, 2일, 3일, 4일 또는 5일 동안 Wnt 작용제, 액티빈/노달 작용제 및/또는 BMP의 존재 하에 배양될 수 있다. 특정한 양태에서, 응집물은 중배엽 유도를 위해 약 2일 내지 3일 동안 배양된다.
특정한 양태에서, 초기 중배엽 단계, 예컨대 제2일에, CXCR4가 발현되기 시작한다. 다음에, CXCR4의 더 튼튼한 발현은 CD56 발현의 시작에 따라 검출된다.
C. 심장 특이성
중배엽 세포는 이후 Wnt 억제제 및, 선택적으로, TGFβ 억제제의 존재 하에 심장 특이성에 관한 것이다. 배양물은 인슐린, 액티빈 억제제 및/또는 BMP 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 심장 특이성은 인슐린의 첨가에 의해 촉진될 수 있다. 세포가 CD56에 대해 60% 미만 양성이고 CXCR4에 대해 적어도 20% 양성이면 Wnt 억제제가 첨가될 수 있다. 제4일과 같은 Wnt 억제 후, 세포는 CXCR4 발현의 소실을 특징으로 하는 초기 심장 중배엽 단계에 있고, 대부분의 세포는 CD56을 발현하고, KDR+PDGRFα+ 집단이 출현한다. 제5일에, KDR+PDGFRα+ 심장 전구세포 집단은 CD56의 계속된 발현 및 CXCR4 발현의 소실과 함께 보인다. 이후, 예컨대 제6일에, 프라이밍된 또는 수임 심장 전구체 집단은 KDR 발현의 소실을 특징으로 하면서 출현한다.
특정한 양태에서, 중배엽 단계에서의 응집물은 심장 특이성을 개시하기 위해 현탁 배양 시스템에서 유지될 수 있거나, 중배엽 세포는 개별화되고 심장 특이성의 개시 전에 단층 배양으로서 플레이팅될 수 있다. CTC4 세포는 둘 다의 배양 시스템에 의해 제조될 수 있다. CTC4 세포는 심근세포를 제조하기 위해 추가로 배양될 수 있다. 특히, 분화 과정은 내약물성 또는 대사 선택이 사용되지 않는 무혈청일 수 있다.
Wnt 억제제는 XAV939, ICG-001, IWR-1-엔도, Wnt-C59, LGK-974, LF3, CP21R7, NCB-0846, PNU-74654, IWR-1, IWR-2, IWR-3, IWR-4or KYA179K일 수 있다. Wnt 억제제, 예컨대 XAV939는 약 1 내지 25 mM, 예컨대 약 5, 10 또는 15 mM, 특히 약 10 mM의 농도로 존재할 수 있다.
TGFβ 억제제는 SB431542, LDN-193189, LY2157299, LY2109761, SB525334, SIS HCl, SB505124, GW788388 또는 LY364947일 수 있다. TGFβ 억제제, 예컨대 SB431542는 약 1 내지 25 mM, 예컨대 약 5, 10 또는 15 mM, 특히 약 10 mM의 농도로 존재할 수 있다. 193189, LY2157299, LY2109761, SB525334, SIS HCl, SB505124, GW788388 또는 LY364947. TGFβ 억제제, 예컨대 SB431542는 약 1 내지 5 μM, 예컨대 약 1, 2 또는 3 μM, 특히 약 2 μM의 농도로 존재할 수 있다.
BMP 억제제는 6-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-3-(4-피리디닐)-피라졸로[1,5-a]피리미딘 디하이드로클로라이드(도르소모르핀), 4-(6-(4-(피페라진-1-일)페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일)퀴놀린 하이드로클로라이드(LDN193189), 4-[6-[4-(1-메틸에톡시)페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]-퀴놀린(DMH1), 4-[6-[4-[2-(4-모르폴리닐)에톡시]페닐]피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(DMH-2) 및 5-[6-(4-메톡시페닐)피라졸로[1,5-a]피리미딘-3-일]퀴놀린(ML 347)일 수 있다. BMP 억제제, 예컨대 도르소모르핀은 약 0.1 μM 내지 5 μM, 예컨대 약 1, 2 또는 3 μM, 특히 약 2 μM의 농도로 존재할 수 있다.
CTC4 세포는 심장 특이성의 개시 후 약 1일 내지 4일에 중배엽으로부터 제조될 수 있다. 심장 특이성은 약 1일 내지 4일, 예컨대 약 2일 또는 3일 동안 수행될 수 있다. CTC4 세포는 이후 저온보존되거나 적절한 배지, 예컨대 B27 보충제를 갖는 RPMI에서 심근세포로 분화될 수 있다. 특정한 양태에서, 세포 집단이 PDGFRα에 대해 적어도 70% 양성이고, KDR에 대해 40% 미만 양성이고, EPCAM에 대해 20% 미만 양성이고, SAA에 대해 20% 미만 양성이면 수임 심장 전구세포는 단리되거나 저온보존될 수 있다.
수임 심장 전구세포의 응집물은 해리되고 저온보존될 수 있다. 응집물 해리는 임의의 알려진 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 이 절차는 킬레이트화제(예컨대, EDTA), 효소(예컨대, 트립신, 콜라게나제) 또는 기타에 의한 처리 및 기계적 해리(예컨대, 피페팅)와 같은 조작을 포함한다. 세포는 상기에 기재된 것과 같은 기질, 예컨대 비트로넥틴 코팅된 표면에서 배양될 수 있다.
D. 심근세포로의 CTC4 분화
도 7A에 기재된 것과 같이, CTC4 세포는 심근세포로 추가로 성숙되거나 분화될 수 있다. 특히, CTC4 세포는 당해 분야에 알려진 분화 조건에 의해 심근세포, 예컨대 심방, 심실 및 페이스메이커 세포의 하위집단으로 성숙될 수 있다. CTC4 세포는 다양한 크기의 용기로 플레이팅될 때 심근세포의 고순도 및 수축 단층으로 분화할 수 있다(도 7C 내지 E).
심근세포 표현형을 촉진하기 위해, 세포는 심근세포 유형 세포의 증식 또는 생존을 향상시키거나 다른 세포 유형의 성장을 억제하는 인자 및 인자 조합에 의해 배양될 수 있다. 그 효과는 세포 자체에 대한 직접적인 효과로 인하거나 또는 또 다른 세포 유형에 대한 효과로 인하고, 이는 결국 심근세포 형성을 향상시킨다. 예를 들면, 배반엽하층 또는 배반엽 동등 세포의 형성을 유도하거나 이 세포가 그 자체의 심장 촉진 요소를 제조하게 하는 인자는 모두 심장친화성 인자 또는 심근세포 분화를 위한 분화 인자의 지시문 안에 있다.
예를 들면, 심장 분화를 위한 유도 배지는 전심장 외식편, 전심장 중배엽 조건 배지, 중배엽 분비된 성장 인자, 예컨대 HGF를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특정한 양태에서, 분화 인자는 세포 발생에 수반된 성장 인자일 수 있다. 분화 인자는 골 형성 단백질의 신호전달 경로의 조절자의 하나 이상, 액티빈A/Nodal, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), dickkopf 동족체 1(DKK1), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 인슐린 성장 인자(IGF) 및/또는 표피 성장 인자(EGF)를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
CTC4 세포는 심근세포로의 성숙을 촉진하도록 배지에서 배양될 수 있다. 예시적인 성숙 배지는 B27 보충제를 갖는 RPMI를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, "성숙 배지"라는 용어는 PDGFRα에 대해 70% 초과 양성, KRD에 대해 40% 미만 양성, EPCAM에 대해 20% 미만 양성 및 사르코머 알파 액티닌에 대해 20% 미만 양성인 세포 집단을 제조하기 위해 세포를 추가로 분할시키도록 사용된 배지를 지칭한다. 예를 들면, 세포는 심근세포 또는 내피 세포로 분화할 수 있다.
하나의 방법에서, CTC4 세포는 상기 기재된 것과 같은 Wnt 억제제 및 TGFβ 억제제가 보충된 배지에서 심근세포로 성숙된다. 예를 들면, 배지는 세포 유지 칵테일 B(즉, 페니실린/스트렙토마이신, 인슐린, 트랜스페린, 셀레노우스산, BSA, 리놀레산, GlutaMAX 및 HEPE), Wnt 억제제(예를 들면, XAV939) 및 TGFβ 억제제(예를 들면, SB431542)를 갖는 William E 배지일 수 있다. TGFβ 억제제에 대안적으로 또는 TGFβ 억제제에 추가로, CTC4 세포는 액티빈 억제제 및/또는 BMP 억제제와 접촉될 수 있다. 세포는 단층에서, 예컨대 세포외 기질 코팅(예를 들면, 비트로넥틴)에서 배양될 수 있다.
E. 세포 배양 조건
본 개시내용에 따른 배양 조건은 사용된 배지 및 줄기 세포에 따라 적절히 한정될 것이다. 본 개시내용에 따른 배지는 이의 기준 배지로서 동물 세포를 배양하기 위해 사용되는 배지를 사용하여 제조될 수 있다. 기준 배지로서, E8, TeSR, BME, BGJb, CMRL 1066, Glasgow MEM, Improved MEM Zinc Option, IMDM, Medium 199, Eagle MEM, αMEM, DMEM, Ham, RPMI 1640 및 피셔 배지 중 어느 것뿐만 아니라 이들의 조합이 사용될 수 있지만, 배지가 동물 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있는 한 이것은 특별히 제한되지는 않는다.
특정한 양태에서, 본 개시내용에 따른 배지는 무혈청 배지이다. 무혈청 배지는 비가공된 또는 비정제된 혈청을 갖지 않는 배지를 지칭하고, 따라서 정제된 혈액 유래된 성분 또는 동물 조직 유래된 성분(예컨대, 성장 인자)을 갖는 배지를 포함할 수 있다. 본 개시내용에 따른 배지는 혈청에 대한 임의의 대안물을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대안물은 적절하게 알부민(예컨대, 지질 농후 알부민, 알부민 치환물, 예컨대 재조합 알부민, 식물 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해물), 트랜스페린(또는 다른 철 수송체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티오글리세롤 또는 이에 대한 균등물을 함유하는 재료를 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대안물은 예를 들면 국제 공보 98/30679호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 임의의 상업적으로 구입 가능한 재료는 더 편리함을 위해 사용될 수 있다. 상업적으로 구입 가능한 재료는 넉아웃 혈청 대체물(KSR), 화학적으로 한정된 지질 농축(Gibco) 및 Glutamax(Gibco)를 포함한다.
본 개시내용의 배지는 또한 지방산 또는 지질, 아미노산(예컨대, 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토카인, 항산화제 물질, 2-머캅토에탄올, 피루브산, 완충제 및 무기 염을 함유할 수 있다. 2-머캅토에탄올의 농도는 예를 들면 약 0.05 내지 1.0 mM 및 특히 약 0.1 내지 0.5 mM일 수 있지만, 이 농도가 줄기 세포(들)를 배양하기 위해 적절한 한 이것에 특별히 제한되지는 않는다.
줄기 세포(들)를 배양하기 위해 사용된 배양 용기가 이것 내에 줄기 세포를 배양할 수 있는 한 이것은 플라스크, 조직 배양을 위한 플라스크, 접시, 페트리 접시, 조직 배양을 위한 접시, 멀티 접시, 마이크로 플레이트, 마이크로웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK® Chamber, 배양 백, 롤러 병 및 생물반응기, 예컨대 PBS500 및/또는 PBS3을 포함할 수 있지만, 이것에 특별히 제한되지는 않는다. 줄기 세포는 배양의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, 2000 ml 또는 이것 내에 유래 가능한 임의의 범위의 부피에서 배양될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 배양 용기는 생물학적 활성 환경을 지지하는 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있는 생물반응기일수 있다. 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 리터, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 평방 미터 또는 이것 내에 유래 가능한 임의의 범위의 부피를 가질 수 있다.
배양 용기는 세포 부착 또는 비부착일 수 있고, 목적에 의존하여 선택될 수 있다. 세포 부착 배양 용기는 세포에 대한 용기 표면의 부착성을 개선하기 위해 세포외 기질(ECM)과 같은 세포 부착을 위한 임의의 기질로 코팅될 수 있다. 세포 부착을 위한 기질은 (사용된다면) 줄기 세포 또는 피더 세포를 부착시키도록 의도된 임의의 재료일 수 있다. 세포 부착을 위한 기질은 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-리신, 폴리-D-리신, 라미닌 및 피브로넥틴 및 이들의 혼합물, 예를 들면 MatrigelTM 및 용해된 세포 막 제조물을 포함한다(Klimanskaya et al., 2005).
다른 배양 조건은 적절히 한정될 수 있다. 예를 들면, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들면, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있지만, 이들로 특별히 제한되지는 않는다. CO2 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들면, 약 2 내지 5% 또는 이것 내에 유래 가능한 임의의 범위일 수 있다. 산소 장력은 적어도 또는 약 1, 5, 8, 10, 20% 또는 이것 내에 유래 가능한 임의의 범위일 수 있다.
본 개시내용의 방법은 또한 캐리어에서의 현탁 배양(Fernande et al., 2007) 또는 겔/바이오중합체 캡슐화(미국 특허 제20070116680호)를 포함하는 줄기 세포의 현탁 배양에 사용될 수 있다. 줄기 세포의 현탁 배양이라는 용어는 줄기 세포가 배지에서 (사용되면) 배양 용기 또는 피더 세포와 관련하여 비부착성 조건 하에 배양된다는 것을 의미한다. 줄기 세포의 현탁 배양은 줄기 세포의 해리 배양 및 줄기 세포의 응집물 현탁 배양을 포함한다. 줄기 세포의 해리 배양이라는 용어는 현탁된 줄기 세포가 배양되고, 줄기 세포의 해리 배양물이 단일 줄기 세포의 것 또는 복수의 줄기 세포(예를 들면, 약 2개 내지 400개의 세포)로 이루어진 작은 세포 응집물의 것을 포함한다는 것을 의미한다. 상기 언급된 해리 배양이 계속될 때, 배양된, 해리된 세포는 줄기 세포의 더 큰 응집물을 형성하고, 이후 응집물 현탁 배양이 수행될 수 있다. 응집물 현탁 배양은 배양체 배양 방법(Keller et al., 1995 참조) 및 SFEB 방법(Watanabe et al., 2005); 국제 공보 2005/123902호)을 포함한다. 본 개시내용의 방법은 현탁 배양에서 줄기 세포의 생존율 및/또는 분화 효율을 유의미하게 개선할 수 있다.
생물반응기는 정적 생물반응기, 교반 플라스크 생물반응기, 회전 벽 용기 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기 및 직접 관류 생물반응기를 포함하는 일반 카테고리에 따라 그룹화될 수 있다. 세포는 생물반응기 내에서 다공성 3차원 스캐폴드(하이드로겔)에서 자유롭거나 부동화되거나 시딩될 수 있다. 소정의 양태에서, 생물반응기는 균질한 입자 현탁액과의 효과적인 혼합 및 저전단 스트레스를 위한 현탁 생물반응기이다.
F. GMP 제조 공정
본원에 이용된 개시된 방법은 모든 GMP 적합 재료를 사용할 수 있고, 심장 세포 치료 개발에 필요한 순도 및 세포 수를 생성하기 위해 다수의 (예를 들면, 3 L) 생물반응기 제조 뱃지로 스케일링될 수 있다. 도 2B에 도시된 것과 같이, 다층 배양 용기에서의 iPSC 팽창의 규모는 다수의 3 L 생물반응기를 시딩하기 위해 필요한 충분한 iPSC를 생성시킨다. 제조 동안 CTC4 저온보존 단계는 바이알당 300x106개의 CTC4 세포를 동결하도록 스케일링될 수 있고(도 2C), 이것은 큰 동물 모델 또는 미래의 임상 연구에서 전임상 개발 동안 바이알 해동 및 취급을 감소시킬 수 있다.
G. 수임 심장 전구세포(CTC4 세포)의 규명
본 방법에 따라 얻은 세포는 다수의 표현형 기준에 따라 규명될 수 있다. CTC4 세포는 도 6A-B에 도시되고 CD56+PDGFRA+KDR-CXCR4-EPCAM-의 고유한 세포 표면 마커 조합을 특징으로 하는 알려진 심장 유전자를 발현하면서 다능성 유전자를 하향조절할 수 있다(도 7B). 심근세포 및 다능성 줄기 세포주로부터 유래된 전구세포는 대개 다른 기원으로부터의 심근세포의 형태학적 특징을 갖는다. 이것은 스핀들, 원형, 삼각형 또는 다각형 형상일 수 있고, 이것은 면역염색에 의해 검출 가능한 사르코머 구조의 줄무늬 특징을 보여줄 수 있다. 이것은 세포의 편평해진 시트 또는 기질에 부착된 채 있거나 현탁액에서 부유하는 응집물을 형성할 수 있어서, 전자 현미경검사에 의해 검사될 때 특징적인 사르코머 및 심방 과립을 보여준다.
다능성 줄기 세포 유래된 심근세포 및 이의 전구체는 통상적으로 심장 트로포닌 I(cTnI), 횡문근 수축의 조절을 위한 칼슘 민감 분자 스위치를 제공하는 트로포닌 복합체의 아단위, 심장 트로포닌 T(cTnT) 또는 Nkx2.5, 발생 심장에 지속하는 초기 마우스 배아 발생 동안 심장 중배엽에서 발현된 심장 전사 인자를 포함하는 심근세포 특이적 마커 중 적어도 하나를 갖는다. 세포는 또한 통상적으로 심방 나트륨이뇨 인자(ANF), 미오신 중쇄(MHC), 특히 심장 특이적인 β 사슬, MLC, Titin, 트로포미오신, α-사르코머 액티닌 및 데스민을 포함하는 마커 중 적어도 하나(및 대개 적어도 1개, 5개 또는 초과)를 발현할 것이다. ANF는 발생 심장 및 태아 심근세포에서 발현된 호르몬이지만, 성인에서 하향조절된다. 이것이 골격 근육세포에서가 아니라 심장 세포에서 고도로 특이적 방식으로 발현되므로 이것은 심근세포에 대한 우수한 마커로서 고려된다. 추가적인 마커는 MEF-2A, MEF-2B, MEF-2C, MEF-2D(심장 중배엽에서 발현되고 발생 심장에서 지속하는 전사 인자), 심장 세포 중에서 부착을 매개하는 N-카드헤린, 심근세포 사이의 갭 연접부를 형성하는 코넥신 3, β1-아드레날린수용체(β1-AR), 심근 경색 후 혈청에서 상승된 크레아틴 키나제 MB(CK-MB) 및 미오글로빈, β-심장 액틴, 초기 성장 반응-I, 사이클린 D2 및 GATA-4, 심장 중배엽에서 고도로 발현되고 발생 심장에서 지속하는 전사 인자를 포함한다. 이것은 많은 심장 유전자를 조절하고, 심장발생에서 역할을 한다.
조직 특이적 마커는 임의의 적합한 면역학적 기법, 예컨대 세포-표면 마커에 대한 흐름 면역혈구계산 또는 친화도 흡착, 세포내 또는 세포-표면 마커에 대한 (예를 들면, 고정된 세포 또는 조직 절편의) 면역혈구계산, 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석 및 배지로 분비된 세포 추출물 또는 생성물에 대한 효소 결합된 면역검정을 사용하여 검출될 수 있다. cTnI 및 cTnT와 같은 심장 마커를 다른 동형과 구별하는 항체는 Sigma 및 Spectral Diagnostic과 같은 공급자로부터 상업적으로 구입 가능하다. 세포에 의한 항원의 발현은 상당히 검출 가능한 양의 항체가 선택적으로 세포의 고정 후 그리고 선택적으로 표지된 이차 항체를 사용하여 표준 면역세포화학 또는 유세포분석법 검정에서 항원에 결합하면 항체 검출 가능하다고 말해진다.
조직 특이적 유전자 산물의 발현은 또한 노던 블롯 분석, 점-블롯 혼성화 분석에 의해 또는 공공에게 이용 가능한 서열 데이터(GenBank)를 사용하여 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 사용하여 역전사효소 개시된 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 mRNA 수준에서 검출될 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출된 것과 같은 조직 특이적 마커의 발현은 그 수준이 대조군 세포, 예컨대 비분화된 다능성 줄기 세포 또는 다른 비관련된 세포 유형의 것보다 적어도 또는 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배 또는 9배 및 더 특히 10배, 20배, 30배, 40배 또는 50배 초과이면 양성으로 생각된다.
마커가 원하는 표현형의 세포의 표면에서 확인되면, 이것은 면역스패닝 또는 항체 매개된 형광 활성화 세포 분류와 같은 기법에 의해 집단을 더 농후화하기 위해 면역선택에 사용될 수 있다.
적절한 상황 하에, 다능성 줄기 세포 유래된 심근세포는 대개 자발적인 주기적 수축성 활성을 보여준다. 이는 이것이 적절한 Ca2+ 농도 및 전해질 균형을 갖는 적합한 조직 배양 환경에서 배양될 때 배양 배지에 대한 임의의 추가적인 성분을 첨가하지 않으면서 세포가 세포의 하나의 축에 걸쳐 수축하고 이후 수축으로부터 방출되는 것으로 관찰될 수 있다는 것을 의미한다. 수축은 주기적이고, 이는 이것이 일반 완충액에서 분당 약 6회 내지 200회 수축 및 대개 약 20회 내지 약 90회 수축의 빈도로 규칙적 또는 불규칙적 기준으로 반복한다는 것을 의미한다. 개별 세포는 그 자체의 자발적인 주기적인 수축성 활성을 나타낼 수 있거나, 이것은 조직, 세포 응집물 또는 배양된 세포 덩어리에서 이웃하는 세포와 협력하여 자발적인 주기적인 수축성 활성을 나타낼 수 있다.
세포의 수축성 활성은 수축의 성질 및 빈도에 대한 배양 조건의 영향에 따라 특징지어질 수 있다. 이용 가능한 Ca2+ 농도를 감소시키거나 달리 Ca2+의 막관통 수송을 방해하는 화합물은 수축성 활성에 대개 영향을 미친다. 예를 들면, L-유형 칼슘 채널 차단제 딜티아젬은 용량 의존적 방식으로 수축성 활성을 억제한다. 다른 한편, 이소프레날린 및 페닐에프린과 같은 아드레날린수용체 작용제는 양성 심박수변동 효과를 갖는다. 세포의 기능적 특성의 추가의 규명은 Na+, K+ 및 Ca2+에 대한 채널을 규명하는 것을 수반한다. 조직생리학은 심근세포 유사 행동 가능성에 대해 패치 클램프 분석에 의해 연구될 수 있다. 문헌[Igelmund et al., 1999; Wobus et al., 1995; 및 Doevendans et al., 2000]을 참조한다.
기능적 속성은 시험관내 세포 및 이의 전구체를 규명하는 방식을 제공하지만, 본 개시내용에서 언급된 용도의 일부에 필수적이지 않을 수 있다. 예를 들면, 기능적 또는 전기생리학 특성의 모두가 아니라 상기 열거된 마커의 일부를 보유하는 세포에 농후화된 혼합된 세포 집단은 이것이 손상된 심장 조직에 이식하고 심장 기능을 보충하기 위해 필요한 기능적 특성을 생체내 획득할 수 있으면 상당한 치료학적 이익을 가질 수 있다.
본 개시내용의 세포 집단 및 단리된 세포는 다능성 줄기 세포의 확립된 계통으로부터 유래되는 경우 이것이 유래된 동일한 게놈 계통을 갖는 것으로 특징지어질 수 있다. 이는 염색체 DNA가 다능성 줄기 세포와 심장 세포 사이에 90% 초과 동일할 것이라는 것을 의미하고, 이는 심장 세포가 정상 유사 분열의 과정에 걸쳐 비분화된 계통으로부터 얻어지면 추론될 수 있다. 심근세포 계통 세포가 모 세포 집단으로부터 유래된 특징은 몇몇 점에서 중요하다. 특히, 비분화된 세포 집단은 공유된 게놈을 갖는 추가적인 세포--심장 세포의 추가의 뱃지 또는 치료에서 유용할 수 있는 또 다른 세포 유형--예컨대 심장 동종이식물의 조직적합성 유형에 환자를 예비관용화할 수 있는 집단을 제조하기 위해 유용할 수 있다(US 2002/0086005호; WO 03/050251호).
IV. 사용 방법
소정의 양태의 방법 및 조성물에 의해 제공된 CTC4 세포 또는 이로부터 유래된 세포, 예컨대 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포는 다양한 분야에서 사용될 수 있다. 이는 생체내 세포의 이식 또는 주입; 시험관내 세포독성 화합물, 발암물질, 돌연변이유도물질 성장/조절 인자, 약제학적 화합물 등의 스크리닝; 심장 질환 및 손상의 기전의 설명; 약물 및/또는 성장 인자가 작동하는 기전의 연구; 환자에서의 암의 진단 및 모니터링; 유전자 치료; 및 생물학적 활성 생성물의 제조를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 CTC4 세포 또는 이로부터 유래된 세포, 예컨대 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포는 이러한 세포 및 이들의 다양한 자손의 특징에 영향을 미치는 인자(예컨대, 용매 소분자 약물, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드) 또는 환경 조건(예컨대, 배양 조건 또는 조작)을 스크리닝하기 위해 상업적으로 사용될 수 있다.
일부 양태에서, CTC4 세포 또는 이로부터 유래된 세포, 예컨대 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포는 나중 단계 심근세포 전구체 또는 말단 분화된 세포로의 성숙을 촉진하는 인자를 스크리닝 하기 위해 또는 장기간 배양에서 이러한 세포의 증식 및 유지를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 후보 성숙 인자 또는 성장 인자는 이들을 상이한 웰에서 세포에 첨가하고 이후 세포의 추가의 배양 및 사용을 위해 바람직한 기준에 따라 생성하는 임의의 표현형 변화를 결정함으로써 시험된다.
본 개시내용의 다른 스크리닝 분야는 심장 근육 조직 유지 또는 보수에 대한 이의 효과에 대한 약제학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 스크리닝은 화합물이 세포에 대한 약리학적 효과를 갖도록 설계되기 때문에 또는 다른 곳에서 효과를 갖도록 설계된 화합물이 이 조직 유형의 세포에 대한 원치 않는 부작용을 가질 수 있기 때문에 수행될 수 있다. 스크리닝은 본 개시내용의 임의의의 전구세포 또는 또는 말단 분화된 세포를 사용하여 수행될 수 있다.
독자는 일반적으로 표준 교재 문헌[In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997] 및 미국 특허 제5,030,015호를 참조한다. 후보 약제학적 화합물의 활성의 평가는 일반적으로 단독으로 또는 다른 약물과 조합되어 본 개시내용의 분화된 세포를 후보 화합물과 조합하는 것을 수반한다. 조사자는 (비처리된 세포 또는 불활성 화합물로 처리된 세포와 비교하여) 형태, 마커 표현형 또는 화합물에 기인할 수 있는 세포의 기능적 활성의 임의의 변화를 결정하고, 이후 화합물의 효과를 관찰된 변화와 상관시킨다.
세포독성은 세포 생존능력, 생존, 형태 및 소정의 마커 및 수용체의 발현에 대한 효과에 의해 처음의 경우에 결정될 수 있다. 염색체 DNA에 대한 약물의 효과는 DNA 합성 또는 보수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 특히 세포 주기에서의 비예정된 시간에서 또는 세포 복제에 필요한 수준 초과에서 [3H]-티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 효과와 일치한다. 원치 않는 효과는 또한 중기 확산에 의해 결정된 자매염색분체 교환의 이례적인 속도를 포함할 수 있다. 독자는 추가의 설명을 위해 문헌[Vickers(In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997에서 pp 375-410)]을 참조한다.
세포 기능의 효과는 세포 배양에서 또는 생체내 심근세포의 표현형 또는 활성, 예컨대 마커 발현, 수용체 결합, 수축성 활성 또는 전기생리학을 관찰하기 위해 임의의 표준 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 약제학적 후보는 또한 수축성 활성에 대한 이의 효과, 예컨대 이것이 수축의 정도 또는 빈도를 증가시키는지 또는 감소시키는지에 대해 시험될 수 있다. 화합물의 농도는 효과가 관찰되는 경우 중앙치 유효 용량(ED50)을 결정하기 위해 적정될 수 있다.
본 개시내용은 인간 심혈관 전구세포, 심혈관 콜로니, 심근세포, 내피 세포 및 혈관 평활근 세포에 대한 효과를 갖는 제제를 스크리닝하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 상기에 기재된 세포 집단의 하나로부터의 세포를 후보 제제와 접촉시키는 것 및 그 제제가 세포 집단에 대한 효과를 갖는지를 결정하는 것을 포함한다. 시험되는 제제는 천연 또는 합성, 하나의 화합물 또는 혼합물, 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 폴리뉴클레오타이드 및 기타를 포함하는 소분자 또는 중합체, 항체 또는 이의 단편, 천연 또는 합성 화합물의 라이브러리로부터의 화합물, 합리적인 약물 설계, 세포 배양 조건과 같은 조건으로부터 얻은 화합물 또는 세포 집단에 대한 효과가 당해 분야에 알려진 검정을 이용하여 평가될 수 있는 임의의 제제일 수 있다. 세포 집단에 대한 효과는 예를 들면 마커 발현, 수용체 결합, 수축성 활성, 전기생리학, 세포 생존능력, 생존, 형태, 또는 DNA 합성 또는 보수를 포함하는 표현형 또는 활성에 대한 임의의 표준 검정에 의해 결정될 수 있다. 표준 증식 및 분화 검정은 미국 특허 제6,110,739호에 기재되어 있다. 이러한 제제는 생체내 및 시험관내 세포 성장, 분화 및 생존의 제어 및 조직 유지, 재생 및 보수에 유용하다.
A. 약제학적 조성물
본 개시내용은 수임 심장 전구세포 또는 이로부터 유래된 세포, 예컨대 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포의 집단을 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 조성물은 생착을 수월하게 하는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이들 집단을 포함하는 조성물은 세포 및 조직 대체 및 보수 및 시험관내 및 생체내 심근세포의 집단의 생성에 유용하다. CTC4 세포를 포함하는 조성물은 전구체 집단의 팽창에 유용하다. 조성물은 심장 병태를 치료하기 위한 약제 또는 전달 장치로서 제제화될 수 있다.
본 개시내용의 CTC4 세포 또는 이로부터 유래된 세포, 예컨대 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포는 인간 투여를 위한 충분히 무균인 조건 하에 제조된 등장성 부형제를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 소정의 양태에서, 프로테아제를 사용하여 또는 단일 세포 또는 더 작은 클러스터의 현탁액으로의 온화한 기계적 조작에 의해 세포를 분산시키는 것이 바람직할 수 있다. 세포는 생착 시 세포사의 위험을 감소시키기 위해 투여 전에 약 24시간 동안 열 충격에 의해 처리되거나 약 0.5 U/mL의 에리쓰로포이에틴과 배양될 수 있다.
약제 제형에서의 일반적인 원칙을 위해, 독자는 문헌[Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, 1996; 및 Hematopoetic Stem Cell Therapy, 2000]을 참조한다. 조성물의 세포 부형제 및 임의의 수반된 요소의 선택은 투여를 위해 사용된 경로 및 장치에 따라 채택될 것이다. 조성물은 또한 심근세포의 생착 또는 기능적 이동을 수월하게 하도록 하나 이상의 다른 성분을 포함하거나 이것이 수반될 수 있다. 적합한 성분은 심근세포 또는 상보성 세포 유형, 특히 내피 세포의 접착을 지지하거나 촉진하는 기질 단백질을 포함한다.
본 개시내용은 또한 제조, 배포 또는 사용 동안 임의의 시간에 존재하는 세포의 세트 또는 조합을 포함하는 시약 시스템을 포함한다. 세포 세트는 대개 동일한 게놈을 공유하는 비분화된 다능성 줄기 세포 또는 다른 분화된 세포 유형과 조합된 본 개시내용에 기재된 2개 이상의 세포 집단의 임의의 조합, 예시되지만 비제한적인 예의 분화된 세포(심근세포, 심근세포 전구체 및 기타 등등)의 유형을 포함할 수 있다. 세트에서의 각각의 세포 유형은 동일한 집합체 또는 사업 관계를 공유하는 상이한 집합체의 제어 하에 동일한 시설 또는 상이한 위치에서 동일한 시간 또는 상이한 시간에 함께 또는 별개의 용기에서 패키징될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은 심장 근육의 질환 병태 또는 비정상을 개선하기 위해 CTC4 세포 또는 이로부터 유래된 세포, 예컨대 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포의 재구성과 같은 원하는 목적을 위해 서면 설명을 갖는 적합한 용기에서 선택적으로 패키징될 수 있다.
B. 치료학적 용도
본 개시내용의 소정의 양태에서 제공된 세포는 이를 필요로 하는 임의의 대상체의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 치료에 적절할 수 있는 인간 병태는 심장 장애, 예컨대 심근 경색, 심장근육병증, 울혈성 심부전, 심실 중격 결손, 심방 중격 결손, 선천성 심장 결손, 심실류, 소아 기원인 심장 장애, 심실 재구성을 요하는 심실류 또는 심장 장애를 포함한다.
인간 치료를 위해, 용량은 일반적으로 약 108 내지 1012개의 세포 및 통상적으로 약 2Х108 내지 1Х109개의 세포이어서, 대상체의 체중, 병의 성질 및 중증도 및 투여된 세포의 복제 역량에 대해 조정을 만든다. 치료 방식 및 적절한 용량을 결정하기 위한 궁극적인 책임은 관리 임상의에 의해 있다.
소정의 양태는 또한 임의의 인지된 필요에 대해 심장 근육의 조직 유지 또는 보수, 예컨대 대사 기능에서의 선천성 결손, 질환 병태의 효과 또는 상당한 외상의 결과를 향상시키기 위한 CTC4 세포의 용도를 제공한다.
치료학적 투여에 대한 세포 조성물의 적합성을 결정하기 위해, 세포는 처음에 적합한 동물 모델에서 시험될 수 있다. 하나의 수준에서, 세포는 생존하고 생체내 이의 표현형을 유지하는 이의 능력에 대해 평가된다. 세포 조성물은 면역결핍 동물(예컨대, NUDE 래트 또는 화학적으로 또는 방사선에 의해 면역결핍된 동물)에 투여된다. 조직은 생착의 기간 후 수확되고, 다능성 줄기 세포 유래된 세포가 여전히 존재하는지에 대해 평가된다. CTC4 세포는 주사 후 적어도 30일에 생착하고 생존하는 것으로 나타났다(도 8B). CTC4 세포는 또한 hAlu+ 세포를 갭 연접 단백질 코넥신 43(CX43) 및 구조 단백질 심장 트로포닌 T(CTNT)와 공동염색함으로써 도 8C에 도시된 것과 같이 심근세포로 계속해서 분화할 수 있다.
생체내 세포를 추적하기 위한 다른 방법은 검출 가능한 라벨(예컨대, 녹색 형광 단백질 또는 또는 β-갈락토시다제)을 발현하고, (예를 들면, BrdU 또는 [3H]티미딘에 의해) 예비표지된 세포를 투여함으로써 또는 (예를 들면, 인간 특이적 항체를 사용하여) 구성적 세포 마커의 후속적인 검출에 의할 수 있다. 투여된 세포의 존재 및 표현형은 인간 특이적 항체를 사용하여 면역조직화학 또는 ELISA에 의해 또는 공개된 서열 데이터에 따라 증폭이 인간 폴리뉴클레오타이드에 특이적이게 하는 프라이머 및 혼성화 조건을 사용하여 RT-PCR 분석에 의해 평가할 수 있다.
적합성은 또한 다능성 줄기 세포로부터 유래된 심근세포의 세포 집단에 의한 처리 후 뒤따르는 심장 회복의 정도를 평가함으로써 결정될 수 있다. 다수의 동물 모델은 이러한 시험에 이용 가능하다. 예를 들면, 심장은 전방 좌심실 벽의 표면과 접촉하는 예비냉각된 알루미늄 봉을 배치함으로써 저온손상될 수 있다(Murry et al., 1996; Reinecke et al., 1999; 미국 특허 제6,099,832호; Reinecke et al., 2004). 더 큰 동물에서, 저온손상은 약 20분 동안 좌심실의 전방 벽에서 액체 N2에서 냉각된 30 내지 50 mm 구리 디스크 볼을 배치함으로써 가져와질 수 있다(Chiu et al., 1995). 경색은 왼쪽 주요 관상 동맥을 결찰함으로써 유도될 수 있다(Li et al., 1997). 손상된 부위는 본 개시내용의 세포 조제물로 처리되고, 심장 조직은 손상된 부위에서 세포의 존재에 대해 조직학에 의해 검사된다. 심장 기능은 좌심실확장말기압, 발달 압력, 압력 상승의 속도 및 압력 감소의 속도와 같은 매개변수를 결정함으로써 모니터링될 수 있다.
적절한 시험 후, 본 개시내용의 분화된 세포는 이러한 치료를 필요로 하는 인간 환자 또는 다른 대상체에서 조직 재구성 또는 재생에 사용될 수 있다. 세포를 이들이 의도된 조직 부위로 이식하거나 이동하고 기능적으로 결핍인 부위를 재구성하거나 재생하는 것을 허용하는 방식으로 투여한다. 심실, 심막 또는 원하는 위치에서의 심장 근육의 내부에 직접적으로 심장 기능을 재구성할 수 있는 세포를 투여하기 위해 채택된 특수 장치가 이용 가능하다.
다능성 줄기 세포 유래된 CTC4 세포의 동종이식물을 받은 환자는 바람직한 경우 이식된 세포의 면역 거부를 감소시키도록 치료될 수 있다. 고려되는 방법은 사이클로스포린 A와 같은 전통적인 면역억제 약물의 투여(Dunn et al., Drug 61:1957, 2001) 또는 다능성 줄기 세포 유래된 세포의 일치된 집단을 사용한 면역관용성의 유도를 포함한다(WO 02/44343호; 미국 특허 제6,280,718호; WO 03/050251호). 또 다른 접근법은 예를 들면 대상체를 알로푸리놀에 의해 처리함으로써 대상체로 이식 시 세포에 의해 제조된 요산의 양을 감소시키기 위해 CTC4 세포 집단을 채택하는 것이다. 대안적으로 또는 일치하여, 환자는 알로푸리놀 또는 요산을 대사시키는 효소, 예컨대 유레이트 산화효소를 투여함으로써 준비된다(PCT/US04/42917).
본 발명에 따라 재생 의학을 받기에 적합한 환자는 다양한 종류의 급성 및 만성 심장 병태, 예컨대 관상동맥 심장 질환, 심장병증, 심내막염, 선천성 심혈관 결함 및 울혈성 심부전을 포함한다. 치료의 효능은 반흔 조직이 점유한 면적 또는 반흔 조직의 재혈관화 및 협심증의 빈도 및 중증도의 감소; 또는 발달 압력, 수축기압, 확장기말압력의 개선, 환자 이동성 및 삶의 질과 같은 임상적으로 허용되는 기준에 의해 모니터링될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 예를 들면 선천성 심장 질환, 관상동맥 심장 질환, 심장병증, 심내막염 및 울혈성 심부전을 포함하는 불충분한 심장 기능을 특징으로 하는 장애의 치료에 유용한 세포 대체의 방법 및 조직 대체의 방법을 제공한다. 전구체 집단이 생체내 심근세포, 내피 및 혈관 평활근 계통으로의 분화를 할 수 있으므로, 분화된 세포 및 심혈관 전구세포는 둘 다 대체 치료에 유용하다. 세포는 또한 시험관내 심혈관 조직을 생성하기 위해 유용할 수 있다. 심장 조직의 조작을 위한 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들면 Birla에 의해 문헌["Stem Cell Therapy and Tissue Engineering for Cardiovascular Repair" Springer, 2006]에서 검토되어 있다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 따라 얻은 인간 심혈관 전구세포에 대해 농후화된 세포 집단으로부터 단리된 심근세포를 포함하는 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 심근세포 대체 치료의 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 개시내용은 인간 심혈관 전구세포를 포함하는 조성물을 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 불충분한 심장 기능을 특징으로 하는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 조성물은 예를 들면 주사 또는 임플란트를 포함하는 심장 조직에 대한 전달 또는 이동을 생성시키는 경로에 의해 그리고 적어도 하나의 부작용 또는 증상 또는 장애의 감소를 생성시키는 조건 하에 투여될 수 있다.
본 개시내용의 치료학적 방법과 관련하여, 포유류에 대한 CTC4 세포의 투여가 특정한 투여 방식, 투여량 또는 투약 빈도로 제한되는 것으로 의도되지 않고, 본 개시내용은 근육내, 정맥내, 관절강내, 병변내, 피하 또는 질환을 예방하거나 치료하기 위해 적절한 용량을 제공하기에 충분한 임의의 다른 경로를 포함하는 모든 투여 방식을 고려한다. CTC4 세포는 단일 용량 또는 다중 용량으로 포유류에게 투여될 수 있다. 다중 용량이 투여될 때, 그 용량은 예를 들면 1주, 1개월, 1년 또는 10년만큼 서로 분리될 수 있다. 하나 이상의 성장 인자, 호르몬, 인터류킨, 사이토카인, 소분자 또는 다른 세포는 또한 특정한 세포 유형을 향해 이들을 추가로 편향시키기 위해 세포의 투여 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있다.
V. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내도록 포함된다. 하기하는 실시예에 개시된 기법이 본 발명의 실행에서 잘 기능하도록 본 발명자들에 의해 발견된 기법을 나타내고, 따라서 이의 실행을 위해 바람직한 방식을 구성한다고 여겨질 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용의 견지에서 개시된 특정 구현예에서 많은 변화가 이루어질 수 있고, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다.
실시예 1 - iPSC 유래된 심장 전구세포
iPSC를 해동하고 무피더 단층 배양에서 3일 동안 Essential 8 Medium(E8)에서 비트로넥틴 코팅된 플레이트(2.5 μg/mL)에서 확장시켰다. 배지를 매일 교환하였다.
현탁 분화의 제0일에 응집물 형성 및 중배엽 유도는 TrypLE에 의해 iPSC를 수확하고, E8에 의해 세척하고, E8, 1 uM H1152(Rho 키나제 억제제) 및 2 uM CHIR99021(Wnt 작용제)을 포함하는 응집물 형성 배지에서 재현탁함으로써 개시되었다. 세포 밀도를 1x106개의 세포/mL로 조정하고, 생물반응기(PBS500 또는 PBS3)를 시딩하였다.
제1일에 응집물을 RPMI + B27(인슐린이 없음) 및 5 μM CHIR 99021을 갖는 배지의 80%를 교환하기 전에 응집물이 침강하게 함으로써 새로운 배지로 이행하였다. 제2에 응집물을 RPMI, B27(인슐린이 없음) 및 4.4 μM CHIR 99021을 갖는 배지의 80%를 교환하기 전에 응집물이 처음에 침강하게 함으로써 공급하였다.
심장 특이성을 위해, 제3일에 응집물을 처음에 RPMI, B27(인슐린을 가짐) 및 10 uM XAV939(Wnt 억제제)을 갖는 배지의 80%를 교환하기 전에 침강되게 하였다. 일부 경우에, 특이적 iPSC에 대해, 추가적인 소분자를 심장 특이성을 효율적으로 유도하도록 첨가하였다. 예를 들면, 이 소분자는 2 uM SB431542(TGFβ/액티빈 억제제) 및/또는 1-2 uM 도르소모르핀(BMP 억제제)을 포함하였다.
세포가 심근세포 계통을 향해 계속해서 규정하면서, 배양물을 이전의 일자와 유사하게 공급하였다. 제4일 및 5일에, 응집물은 RPMI 및 B27(인슐린을 가짐)을 갖는 배지의 80%를 교환하기 전에 처음에 침강되었다. 전체 공정은 무혈청이고, 약물 내성 선택이 사용되지 않았다.
제6일에, 세포는 수임 운명을 가졌지만, 심근세포로 아직 분화되지 않았다. 응집물을 수확하고, D-PBS(-/-)로 세척한 후, TrypLE로 해리하고, 제어 속도 동결기를 사용하여 CryoStor CS10에서 단일 세포 현탁액으로서 저온 보존하였다.
심장 전구세포를 심장 중배엽 마커(즉, KDR, CKIT 및 PDFGRα) 및 심근세포 마커(즉, SAA 및 SMA)에 대해 분석하였다. 분화 방법은 95% 초과의 SAA를 갖는 심근세포를 생성시켰다. 따라서, 본 방법은 수임 심장 전구세포 및 심근세포를 효율적으로 제조하였다.
실시예 2 - Wnt 억제를 추가하기 위한 분화 단계의 확인
Wnt 억제를 필요로 하는 심장 분화 동안 시점은 결코 잘 기재되어 있지 않다. 세포 표면 마커 CXCR4 및 CD56은 배양의 상태를 모니터링하고, Wnt 억제가 사용되어야 할 때를 결정하는 것을 돕도록 사용될 수 있다.
제1일 내지 제6일에 응집물 샘플을 PBS500 또는 PBS3 생물반응기 배양물 둘 다로부터 취하고, 해리시키고, CXCR4 및 CD56에 대해 염색하였다. 매일 세포 집단을 상이한 발현 프로파일로 옮기고, 이는 처음에 CXCR4의 발현, 이어서 이중 양성 CXCR4posCD56pos 세포 및 마지막으로 제4일 내지 제6일에 CXCR4의 발현의 소실을 보여준다.
배양물이 제3일에 너무 많은 CD56을 노출시키고 CXCR4의 발현을 이미 소실하기 시작하면, 이것은 Wnt 신호전달을 억제하고 심근세포 운명을 향해 배양물을 규정하기에 너무 늦었다. 그러나, CXCR4 양성 집단이 또한 바로 CD56을 발현하기 시작하면 효율적인 심장 특이성이 발생한다는 것이 발견되었다. CD56의 튼튼한 발현은 얼마나 많은 CHIR 99021이 사용되는지 또는 세포 밀도가 너무 낮은지의 하나의 표시였다.
잠재적인 심장 분화 실패의 또 다른 표시는 제2일에 너무 많은 CXCR4가 발현되는지였다. 이는 너무 많은 CHIR 99021이 제2일 전에 사용된다는 것의 명확한 표시였다.
실시예 3 - 분화 규모
이 심장 분화는 PBS500 용기를 사용하여 처음에 개발되었지만, 이 규모는 1x108 내지 1x109개의 세포의 세포 치료 용량을 제조하기에는 너무 작았다(도 2B). 용적, PB 휠 속도, pH 및 용존 산소는 PBS500 형식을 사용하여 조사되었고, 다수의 PBS3 생물반응기를 사용하여 임상 관련 분화 스케일을 최적화하도록 적용되었다.
실시예 4 - 저온보존 규모
표준 1.5 내지 2.0 ml의 저온바이알은 iPSC 유래된 생성물의 작은 규모 샘플을 저온보존하기 위해 사용될 수 있다. 다수의 상이한 크기의 저온바이알은 임상 용량으로서 사용될 수 있는 하나의 바이알에서 충분한 수임 심장 전구세포를 저온보존하려는 목표로 Aseptic Technologie로부터 시험되었다. 다수의 AT 바이알 크기가 시험되었고, AT6 바이알이 바이알당 임상적으로 관련된 용량에 허용되었는지가 결정되었다(도 2C). 바이알당 300x106개의 세포의 동결은 시험되었고, 생성된 세포는 모두 품질 방출 검증을 통과한다.
실시예 4 - 수임 심장 전구세포는 특이적 마커를 발현한다
분화 공정 동안 매일 다수의 마커를 시험하는 시간 과정 연구를 수행하였다. 심장 중배엽의 특이성을 나타내는 CXCR4 및 PDGFRα의 제1일 내지 제3일에 명확한 유도가 있었다(도 3B). KDR의 동적 발현을 또한 검출하였고, 여기서 가장 높은 발현은 제4일에 보였고 이어서 제5일 및 제6일 동안 신속한 하향 조절이 있었다(도 5A). CD56은 또한 제3일 동안 유도되었고, 분화 공정에 걸쳐 유지되었다. EpCAM의 발현을 공정 동안 매일 더 감소하는지 모니터링하고, 제6일에 10% 미만의 양성 세포를 생성시켰다(도 4). 심근세포 구조 단백질은 또한 제6일에 최소로 발현되었다.
실시예 5 - 수임 심장 전구세포는 심근세포가 된다
제6일에 CTC4 세포를 해동하고 이의 심근세포 분화 가능성을 시험하기 위해 플레이팅하였다. 상이한 밀도를 RPMI 및 B27(인슐린을 가짐)에서 비트로넥틴 코팅된 용기로 시딩하고, 대략 7일 동안 배양하였다(도 7A). 배지를 완전한 용적 변화로 격일로 교환하였다. 단층은 플레이팅 후 2일 내지 6일에 수축하기 시작하였다. 접촉 세포를 수확하고, 심근세포 특이적 마커에 대해 유세포분석법에 의해 분석하였다. 분석된 세포는 90% 초과의 사르코머 알파 액티닌 양성이었다(도 7D).
제6일에 CTC4 세포를 또한 RPMI 및 B27(인슐린을 가짐)에서 비트로넥틴 코팅된 96웰 플레이트에 플레이팅하고, 7일 동안 배양하였다. 세포를 다양한 심근세포 마커에 대해 면역세포화학에 의해 염색하고, 심장 트로포닌 T, 심장 트로포닌 I 및 사르코머 알파 액티닌에 대해 양성 염색하였다. 세포를 또한 심장 특이적 전사 인자 NKX2.5에 대해 염색하였다(도 7C)
실시예 6 - 수임 심장 전구세포(CTC4)는 심근 경색 모델에서 생착한다
NUDE 래트 심근 경색 모델은 CTC4 세포의 생착 및 분화를 시험하기 위해 사용되었다(도 8A-C). 경색 후 3일에, CTC4 세포를 해동하고, 계수하고, 5% Flexbumin에 재현탁하였다. 세포를 다수의 주사 부위로 직접 주사에 의해 투여하였다. 주사 후 1달에 심장을 수확하고, 인간 Alu에 대해 면역조직화학 또는 인시츄 혼성화 검출 방법을 사용하여 인간 세포에 대해 염색하였다. 인간 세포가 래트 심근 내에 특정 부위에서 발견되면 추가적인 연속 절편을 가공하고, 면역조직화학 방법을 사용하여 심장 트로포닌 T(심근세포), Ki67(증식) 및 CX43(갭 연접부) 마커에 대해 염색하였다. 인간 세포는 주사 및 튼튼하게 발현된 심장 트로포닌 T 및 CX43 후 1달에 검출되었고, 이는 CTC4 세포가 계속해서 생체내 분화하고 전기적으로 커플링된 심근세포가 된다는 것을 나타낸다. 게다가, 소량의 세포는 또한 Ki67에 대해 염색되었고, 이는 인간 이식편 부위가 약간 팽창하는 가능성을 나타낸다.
실시예 7 - 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포로의 수임 심장 전구세포 분화
연구는 수임 심장 전구세포가 다른 세포 계통, 예컨대 내피 세포(CD31+CD144+) 및 평활근 세포(CD140b+CD90+)를 더 분화시키는 가능성을 갖는다는 것을 보여주도록 수행되었다(도 9). iPSC 유래된 수임 심장 전구세포를 특이적 성장 인자를 함유하는 RPMI+B27 배지에서 배양하였다. 수임 심장 전구세포를 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포를 제조하기 위해 FGF 및/또는 VEGF를 포함하는 배지에서 약 7일 동안 배양하였다.
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본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용의 견지에서 부당한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시형태의 면에서 기재되어 있지만, 상기 방법 및 단계에서 또는 본 발명의 개념, 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법의 단계의 순서에서 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명확할 것이다. 더 구체적으로는, 화학적으로 및 생리학적으로 둘 다 관련된 소정의 제제가 동일한 또는 유사한 결과가 달성되면서 본원에 기재된 제제에 대해 치환될 수 있다는 것이 명확할 것이다. 당업자에게 명확한 모든 이러한 유사한 치환물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 정신, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 여겨진다.
참고문헌
하기 참고문헌은 이것이 예시적인 절차 또는 본원에 제시된 것에 보충적인 다른 상세내용을 제공하는 정도로 본원에 참고로 구체적으로 포함된다.

Claims (99)

  1. 인간 다능성 줄기 세포(PSC) 유래된 수임 심장 전구세포를 제조하는 시험관내 방법으로서,
    (a) 분화를 개시하기 위한 Wnt 작용제, 및 생존 제제의 존재 하에 PSC를 배양하여 세포 응집물을 형성하는 단계;
    (b) 중배엽 세포의 집단을 제조하기에 충분한 시간의 기간 동안 Wnt 작용제의 존재 하에 세포 응집물을 추가로 배양하는 단계; 및
    (c) 심장 특이성을 촉진하기 위해 Wnt 억제제의 존재 하에 중배엽 세포의 집단을 분화시켜, 수임 심장 전구세포의 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, PSC는 유도 다능성 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PSC는 단계 (a) 전에 세포외 기질에 의해 코팅된 표면에서 배양되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 세포외 기질은 비트로넥틴, 콜라겐, 라미닌, MATRIGELTM 및/또는 피브로넥틴을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 생존 제제는 Rho 연관된 키나제(ROCK) 억제제 또는 미오신 II 억제제인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, ROCK 억제제는 H1152 또는 Y-27632인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 미오신 II 억제제는 블레비스타틴인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 현탁 배양에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 현탁 배양은 하나 이상의 생물반응기에서 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)의 Wnt 작용제는 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314 또는 IM-12인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 작용제는 CHIR 99021인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, CHIR 99021은 약 1 μM 내지 10 μM의 농도로 배양물에 존재하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 1 내지 2일 동안 수행되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배양물은 인슐린을 포함하지 않거나 본질적으로 인슐린을 갖지 않는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 Wnt 신호전달 작용제는 CHIR 99021, SB216763, CHIR 98014, TWS119, 티데글루십, SB415286, BIO, AZD2858, AZD1080, AR-A014418, TDZD-8, LY2090314 또는 IM-12인, 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 Wnt 신호전달 작용제는 CHIR 99021인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, CHIR 99021은 1 μM 내지 10 μM의 농도로 배양물에 존재하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a)는 약 24시간 동안 수행되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)의 배양물은 액티빈/노달(Activin/Nodal) 작용제 및/또는 BMP를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 액티빈/노달 작용제는 액티빈 A 또는 Nodal인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)는 1일 내지 5일 동안 수행되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 중배엽 세포는 KDR, PDGFRα, CXCR4 및/또는 CD56을 발현하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 중배엽 세포의 집단의 적어도 5%는 단계 (c) 전에 또는 단계 (C) 동안에 CD56을 발현하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 중배엽 세포의 집단의 적어도 40%는 단계 (c) 전에 또는 동안에 KDR 및 PDGFRα를 발현하는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 중배엽 세포의 집단은 단계 (c) 전에 CXCR4 및 CD56에 대해 양성인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 전에 중배엽 세포의 집단의 적어도 20% 양성은 CXCR4에 양성이고, 중배엽 세포의 집단의 60% 미만은 CD56에 대해 양성인, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 중배엽 세포의 집단의 적어도 20% 양성이 CXCR4에 양성이고, 중배엽 세포의 집단의 60% 미만이 CD56에 양성일 때 Wnt 억제제를 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 전에 중배엽 세포의 집단의 적어도 30% 양성은 CXCR4에 양성이고, 중배엽 세포의 집단의 60% 미만은 CD56에 대해 양성인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 Wnt 억제제는 XAV939, IWR1, IWR2, IWR3, IWR4, ICG-001, IWR-1-엔도, Wnt-C59, LGK-974, LF3, CP21R7, NCB-0846, PNU-74654 또는 KYA179K인,방법.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 억제제는 XAV939인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, XAV939는 5 μM 내지 10 μM의 농도로 배양물에 존재하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 배양물은 TGFβ 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, TGFβ 억제제는 SB431542, LDN-193189, LY2157299, LY2109761, SB525334, SIS HCl, SB505124, GW788388 또는 LY364947인, 방법.
  34. 제32항에 있어서, TGFβ 억제제는 SB431542인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, SB431542는 1 μM 내지 5 μM의 농도로 배양물에 존재하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 배양물은 인슐린을 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 배양물은 BMP 억제제 또는 AMPK 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, BMP 억제제는 도르소모르핀, LDN193189, DMH1, DMH2 또는 ML 347인, 방법.
  39. 제37항에 있어서, BMP 억제제는 도르소모르핀인, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 무혈청인, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 배양은 규명된 배지에서 수행되는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 적어도 1x107 내지 1x1010개의 수임 심장 전구세포를 제조하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내약성 선택을 수행하는 것을 포함하지 않는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포는 전이유전자를 발현하지 않는, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)는 1일 내지 6일 동안인, 방법.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단의 20% 미만은 EpCAM을 발현하는, 방법.
  47. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단의 10% 미만은 EpCAM을 발현하는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단의 20% 미만은 KDR, CXCR4 및/또는 SAA에 대해 양성인, 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단의 20% 미만은 EpCAM 및 SAA에 대해 양성인, 방법.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단의 적어도 80%는 PDGFRα 및 CD56에 대해 양성인, 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단을 저온보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, PDGFRα에 대해 적어도 70% 양성이고, KDR에 대해 40% 미만 양성이고, EpCAM에 대해 20% 미만 양성이고, SAA에 대해 20% 미만 양성인 수임 심장 전구세포의 집단을 저온보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 우수 제조 기준(GMP) 준수인, 방법.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 심근세포를 제조하기 위해 수임 심장 전구세포의 집단을 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단은 단층에서 배양되는, 방법.
  56. 제54항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단은 세포외 기질에 의해 코팅된 표면에서 배양되는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 세포외 기질은 비트로넥틴, 콜라겐, 라미닌, MATRIGELTM 및/또는 피브로넥틴을 포함하는, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 세포외 기질은 비트로넥틴을 포함하는, 방법.
  59. 제54항에 있어서, 심근세포는 CTNT, MHC, MLC, CTNI 및/또는 사르코머 알파 액티닌을 발현하는, 방법.
  60. 제54항에 있어서, 세포의 적어도 80%는 사르코머 알파 액티닌에 대해 양성인, 방법.
  61. 제54항에 있어서, 성숙을 위한 배양물은 Wnt 억제제 또는 TGFβ 억제제를 포함하지 않는, 방법.
  62. 제50항에 있어서, 성숙을 위한 배양은 2 내지 30일인, 방법.
  63. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단을 혈관 내피 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 분화는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및/또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 존재 하에 수임 심장 전구세포의 집단을 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 혈관 내피 세포는 CD33 및 CD144에 대해 양성인, 방법.
  66. 제64항에 있어서, 혈관 내피 세포의 집단의 적어도 20%는 CD33 및 CD144에 대해 양성인, 방법.
  67. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단을 평활근 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, FGF 및/또는 VEGF의 존재 하에 수임 심장 전구세포의 집단을 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 평활근 세포의 집단은 CD140b 및 CD90에 대해 양성인 적어도 50%의 세포인, 방법.
  70. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 수임 심장 전구세포의 집단.
  71. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 심근세포, 혈관 내피 세포 또는 평활근 세포의 집단.
  72. CD56의 적어도 90%의 발현, PDGFRα에 대해 양성인 80% 및 CXCR4, KDR 및 EpCAM의 10% 미만의 발현을 갖는 수임 심장 전구세포의 집단을 포함하는, 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 수임 심장 전구세포는 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되는, 조성물.
  74. 제72항에 있어서, 수임 심장 전구세포의 집단은 GMP 준수인, 조성물.
  75. 제72항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물인, 조성물.
  76. 대상체에서 심장 장애의 치료를 위한 방법으로서, 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항의 유효량의 수임 심장 전구세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 수임 심장 전구세포는 심장에 직접 투여되는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 투여는 심근내 카테터를 사용함으로써인, 방법.
  79. 제76항에 있어서, 세포는 인간 알부민을 포함하는 현탁액에서 투여되는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 인간 알부민은 1% 내지 10%의 농도로 존재하는, 방법.
  81. 제79항에 있어서, 인간 알부민은 5%의 농도로 존재하는, 방법.
  82. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 투여된 수임 심장 전구세포는 생착, 세포 생존 및 심근세포로의 성숙을 보여주는, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
  84. 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 심장 장애는 심근 경색, 심장근육병증, 울혈성 심부전, 심실 중격 결손, 심방 중격 결손, 선천성 심장 결손, 심실류, 소아 기원인 심장 장애, 심실 재구성을 요하는 심실류 또는 심장 장애인, 방법.
  85. 심장 전구세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 다능성 줄기 세포(PSC)를 제공하는 단계;
    (b) 심장 분화를 개시하기 위해 Wnt 작용제의 존재 하에 현탁액 중에 PSC를 배양하는 단계; 및
    (c) 세포 집단이 튼튼한 심장 특이성을 촉진하기 위해 60% 미만의 CD56 양성 세포 및 30% 초과의 CXCR4 양성 세포로 이루어질 때 Wnt 억제제를 첨가하여서 심장 전구세포의 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 심장 전구세포는 불충분한 심장 기능을 특징으로 하는 장애의 치료에 유용한, 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 심장 전구세포는 생체내 심근세포, 내피 및 혈관 평활근 계통으로 분화를 할 수 있는, 방법.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 심장 특이성은 수임 심장 전구세포(CTC4)의 집단을 제조하는, 방법.
  89. 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 분화는 생물반응기에서 발생하는, 방법.
  90. 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 집단이 PDGFRα에 대해 70% 초과 양성, KRD에 대해 40% 미만 양성, EPCAM에 대해 20% 미만 양성 및 사르코머 알파 액티닌에 대해 20% 미만 양성이면 이것을 저온보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, CTC4 세포는 저온보존되는, 방법.
  92. 제85항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 수임 심장 전구세포는 대상체의 심장에 직접 투여되는, 방법.
  93. 제85항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 억제제의 존재 하의 분화는 TGFβ 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  94. 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, Wnt 억제제의 존재 하의 분화는 BMP 억제제를 추가로 포함하는, 방법.
  95. 제85항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 무혈청 배지를 포함하는, 방법.
  96. 제85항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 내약성 선택을 수행하는 단계를 포함하지 않는, 방법.
  97. 제85항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 심근세포를 제조하기 위해 수임 심장 전구세포의 집단을 성숙시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  98. 제97항에 있어서, 성숙을 위한 배양물은 Wnt 억제제 또는 TGFβ 억제제를 포함하지 않는, 방법.
  99. 제85항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 VEGF의 첨가에 의해 내피 세포 또는 평활근에 추가로 규정할 수 있는, 방법.
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