CN118159646A - 产生定向心脏祖细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本文所提供的是将多能干细胞分化为定向心脏祖细胞的方法。本文进一步提供了在心脏病症的治疗中使用定向心脏祖细胞的方法。

Description

产生定向心脏祖细胞的方法

优先权要求

本申请要求2021年9月13日提交的美国临时申请序列号63/243,606的优先权权益，其完整内容通过引用并入本文。

背景

1.技术领域

本发明大体涉及分子生物学领域。更具体地讲，它涉及将多能干细胞分化为定向心脏祖细胞。

2.相关技术说明

心脏祖细胞(CPC)具有分化为成熟心肌细胞的能力。这些CPC代表了向心肌细胞定向的最后阶段。因此，这些细胞在再生医学的药物开发应用如用于治疗心肌梗塞和充血性心力衰竭中是具有吸引力的靶标。

目前从多能干细胞产生心肌细胞的方法需要长时间培养才能使心肌细胞稳定收缩。因此，需要以更有效的方式从多能干细胞产生定向心脏祖细胞的改进方法，该方法所需的培养时间更短。

概述

在某实施方案中，本公开提供了一种产生人多能干细胞(PSC)衍生的定向心脏祖细胞的体外方法，包括：(a)在Wnt激动剂存在下培养PSC以启动分化，在存活剂存在下培养PSC以形成细胞聚集体；(b)进一步在Wnt激动剂存在下培养细胞聚集体一段时间，该时间足以产生中胚层细胞群；以及(c)在Wnt抑制剂存在下分化中胚层细胞群以促进心脏的特化，从而产生定向心脏祖细胞群。

在一些方面，PSC细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。在某些方面，在步骤(a)之前，将PSC培养在由细胞外基质包被的表面上。在一些方面，细胞外基质包括玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、Matrigel^TM和/或纤连蛋白。

在某些方面，存活剂是Rho相关激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白II抑制剂。例如，ROCK抑制剂是H1152或Y-27632。在具体方面，肌球蛋白II抑制剂是布比他汀(blebbistatin)。

在一些方面，该方法包括在悬浮培养中培养细胞。在具体方面，悬浮培养在一个或多个生物反应器如垂直轮生物反应器中进行。

在某些方面，步骤(a)的Wnt激动剂是CHIR 99021、SB216763、CHIR 98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314或IM-12。在特定方面，Wnt激动剂是CHIR 99021。在具体方面，CHIR 99021以约1μM至10μM的浓度存在于培养物中，如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM，特别是约2μM。

在一些方面，步骤(a)为1-2天，如约22、23、24、25或26小时，特别是约24小时。在具体方面，步骤(b)的培养不包含或基本上不具有胰岛素。

在某些方面，步骤(b)的Wnt信号传导激动剂是CHIR 99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314或IM-12。在特定方面，步骤(b)的Wnt信号传导激动剂是CHIR 99021。在一些方面，CHIR 99021以1μM至10μM的浓度存在于培养物中，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM，特别是约4至5μM，如约4.4μM。

在某些方面，步骤(b)的培养进一步包括激活素(activin)/Nodal激动剂和/或BMP。在一些方面，激活素/Nodal激动剂是激活素A或Nodal。在某些方面，步骤(b)进行1至5天，如约1、2、3、4或5天，特别是约1或2天。

在一些方面，中胚层细胞表达KDR、PDGFRα、CXCR4和/或CD56。在特定方面，在步骤(c)之前或期间，至少5％(例如，至少6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55％)的中胚层细胞群表达CD56。在一些方面，在步骤(c)之前或期间，至少40％(例如，至少45、50、55、60、65、70或75％)的中胚层细胞群表达KDR和PDGFRα。在特定方面，细胞在步骤(c)启动后表达KDR。在某些方面，在步骤(c)之前，中胚层细胞群对CXCR4和CD56呈阳性。在一些方面，在步骤(c)之前，至少30％(例如，至少31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75或80％)的中胚层细胞群对CXCR4呈阳性，以及少于60％(例如，少于59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、45、40或30％)的中胚层细胞群对CD56呈阳性。

在一些方面，在步骤(c)之前，中胚层细胞群中至少20％(例如，至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％)的细胞对CXCR4呈阳性，以及少于60％(例如，少于59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、45、40或30％)的中胚层细胞群对CD56呈阳性。在某些方面，步骤(c)包括当至少20％(例如，至少21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80％)的中胚层细胞群对CXCR4呈阳性以及少于60％(例如，少于59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、45、40或30％)的中胚层细胞群对CD56呈阳性时，添加Wnt抑制剂。

在某些方面，步骤(c)的Wnt抑制剂是XAV939、IWR1、IWR2、IWR3、IWR4、ICG-001、IWR-1-endo、Wnt-C59、LGK-974、LF3、CP21R7、NCB-0846、PNU-74654或KYA179K。在特定方面，Wnt抑制剂是XAV939。在具体方面，XAV939以5μM至10μM的浓度存在于培养物中，如5、6、7、8、9或10μM。在一些方面，步骤(c)的培养还包含TGFβ抑制剂，如SB431542、LDN-193189、LY2157299、LY2109761、SB525334、SIS HCl、SB505124、GW788388或LY364947。在特定方面，TGFβ抑制剂是SB431542。在具体方面，SB431542以1μM至5μM的浓度存在于培养物中，如1、2、3、4或5μM。在一些方面，步骤(c)的培养包含胰岛素。在一些方面，步骤(c)的培养进一步包含BMP抑制剂或AMPK抑制剂。在某些方面，BMP抑制剂是dorsomorphin、LDN193189、DMH1、DMH2或ML 347。在一些方面中，步骤(c)为1-6天，如1、2、3、4、5或6天，如1-3天，特别是约2天。

在特定方面，该方法不含血清。在一些方面，培养是在限定培养基中进行的。在一些方面，该方法不包括进行药物抗性选择。在某些方面，所述定向心脏祖细胞不表达转基因。

在一些方面，该方法产生至少1x10⁷至1x10¹⁰的定向心脏祖细胞。

在某些方面，少于20％(例如，19、18、17、16、15、14、13、12、10或5％)的定向心脏祖细胞群表达EpCAM。在某些方面，少于10％(例如，少于9、8、7、6或5％)的定向心脏祖细胞群的细胞表达EpCAM。在一些方面，少于20％(例如，19、18、17、16、15、14、13、12、10或5％)的定向心脏祖细胞群对KDR、CXCR4和/或SAA呈阳性。在一些方面，至少80％(例如，81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的定向心脏祖细胞群对PDGFRα和CD56呈阳性。在一些方面，少于20％(例如，19、18、17、16、15、14、13、12、10或5％)的定向心脏祖细胞群对EpCAM和SAA呈阳性。

在特定方面，该方法符合良好生产规范(GMP)。在一些方面，该方法还包括低温保存定向心脏祖细胞群，如当定向心脏祖细胞群的至少70％(例如，71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)对PDGFRα呈阳性、少于40％(例如，39、38、37、36、35、34、33、32、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、10或5％)对KDR呈阳性、少于20％(例如，19、18、17、16、15、14、13、12、10或5％)对EpCAM呈阳性、以及少于20％(例如，19、18、17、16、15、14、13、12、10或5％)对SAA呈阳性时。

在另外的方面，该方法进一步包括使定向心脏祖细胞群成熟以产生心肌细胞。在一些方面，将定向心脏祖细胞群在单层中培养。在某些方面，在由细胞外基质包被的表面上培养定向心脏祖细胞群。在一些方面，细胞外基质包括玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、Matrigel^TM和/或纤连蛋白。在具体方面，细胞外基质包括玻连蛋白。

在一些方面，心肌细胞表达CTNT、MHC、MLC、CTNI和/或肌节α辅肌动蛋白。在某些方面，至少80％(例如，81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的细胞对肌节α辅肌动蛋白呈阳性。

在某些方面，用于成熟的培养物不包含Wnt抑制剂或TGFβ抑制剂。在一些方面，用于成熟的培养是2-30天，如2-20天，如5-10天。

在特定方面，该方法包括产生引发的心脏祖细胞，包括在Wnt激动剂存在下悬浮培养PSC以启动分化，当细胞群包含少于约60％的CD56阳性细胞和至少约20％的CXCR4阳性细胞时，在Wnt抑制剂存在下培养细胞，以产生至少约70％的PDGFRα阳性、少于约40％的KDR阳性、少于约20％的EPCAM阳性和少于约20％的SAA阳性的引发心脏祖细胞的群。所述引发心脏祖细胞的群可以被低温保存。

在一些方面，该方法还包括将定向心脏祖细胞群分化为血管内皮细胞群。在一些方面，分化包括在成纤维细胞生长因子(FGF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)存在下培养定向心脏祖细胞群。在某些方面，血管内皮细胞对CD33和CD144呈阳性。在一些方面，血管内皮细胞群的至少20％(例如，25、30、35、40、45、50、55、60、65、70％或更高)的细胞对CD33和CD144呈阳性。

在一些方面，该方法进一步包括将定向心脏祖细胞群分化为平滑肌细胞群。在某些方面，分化包括在FGF和/或VEGF存在下培养定向心脏祖细胞群。在某些方面，平滑肌细胞群至少有50％(例如，55％、60％、70％、75％、80％或更多)的细胞对CD140b和CD90呈阳性。

本文进一步提供了通过本文的实施方案及其方面的方法产生的定向心脏祖细胞群。本文还提供了通过本文的实施方案及其方面的方法产生的心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞的群。

另一个实施方案提供了定向心脏祖细胞群，其中有至少90％(例如，91、92、93、94、95、96、97、98或99％)表达CD56，至少80％(例如81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)表达PDGFRα，以及少于10％(例如，少于9、8、7、6、5、4、3、2或1％)表达CXCR4、KDR和EpCAM。在特定方面，通过本文实施方案及其方面的方法产生定向心脏祖细胞。在特定方面，该定向心脏祖细胞群符合GMP。在一些方面，组合物是药物组合物。

另一个实施方案提供了一种用于治疗受试者心脏病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本文实施方案或其方面的定向心脏祖细胞。

在一些方面，该定向心脏祖细胞直接施用于心脏。在某些方面，通过使用心肌内导管进行施用。在一些方面，细胞在包含人白蛋白(例如FLEXBUMIN^TM)的悬浮液中进行施用，如浓度为1％至10％，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％，特别是约5％。

在一些方面，施用的定向心脏祖细胞表现出植入、细胞存活和成熟为心肌细胞。在一些方面，受试者是人类。在特定方面，心脏病症是心肌梗死、心肌病、充血性心力衰竭、室间隔缺损、房间隔缺损、先天性心脏缺损、心室壁瘤、源于儿科的心脏病症、心室壁瘤或需要心室重建的心脏病症。

另一个实施方案提供了一种产生心脏祖细胞的方法，包括提供多能干细胞(PSC)，在Wnt激动剂存在下悬浮培养PSC以启动心脏分化，以及当细胞群由少于约60％的CD56阳性细胞和多于约30％的CXCR4阳性细胞组成时，添加Wnt抑制剂以促进稳健的心脏特化，从而产生心脏祖细胞群。

在一些方面，心脏祖细胞有用于以心脏功能不足为特征的病症的治疗。在某些方面，心脏祖细胞能够体内分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌谱系。在一些方面，心脏特化产生了定向心脏祖细胞(CTC4)的群。在特定方面，分化发生在生物反应器中。

在某些方面，该方法还包括低温保存细胞群，一旦其包含超过70％的细胞呈PDGFRα阳性，少于40％的细胞呈KDR阳性，少于20％的细胞呈EPCAM阳性，以及少于20％的细胞呈肌节α辅肌动蛋白阳性。在一些方面，CTC4细胞可以被低温保存。在某些方面，将定向心脏祖细胞直接施用到受试者的心脏中。在一些方面，在Wnt抑制剂存在下的分化还包括TGFβ抑制剂。在某些方面，在Wnt抑制剂存在下的分化还包括BMP抑制剂。在一些方面，该方法包括无血清培养基。在某些方面，该方法不包括进行药物抗性选择。

在一些方面，该方法进一步包括使定向心脏祖细胞群成熟以产生心肌细胞。在一些方面，用于成熟的培养物不包含Wnt抑制剂或TGFβ抑制剂。在特定方面，细胞可以在VEGF的添加下进一步特化为内皮细胞或平滑肌。

本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中显而易见。然而，应当理解的是，详细描述和具体实例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅以说明性的方式给出，因为本发明的宗旨和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将从本详细描述中变得显而易见。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分，并被包括以进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的特定实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A-1B：(图1A)示意图描绘了从诱导性多能干细胞(iPSC)分化出心肌细胞定向的心脏祖细胞(CTC4)的示例性方案。该过程包括iPSC的聚集体形成、中胚层诱导及心脏特化的早期阶段。(图1B)用于心脏分化的培养方法(平板vs.悬浮液)和发育里程碑的进程日描述。

图2A-2B：(图2A)用于心脏分化的培养方法(平板vs.悬浮液)的发育里程碑的进程日描述。(图2B)示意图描绘了使用多层容器和PBS3 VERTICAL-WHEEL^TM生物反应器的iPSC规模和分化。可以对细胞进行大规模低温保存(例如，每小瓶3亿个细胞)，如使用Aseptic Technologies AT CLOSED-/>

图3A-3C：(图3A)示意图描绘了用于从诱导性多能干细胞(iPSC)分化心肌细胞定向的心脏祖细胞(CTC4)的示例性方案。该过程包括iPSC的聚集体形成、中胚层诱导和心脏特化的早期阶段。(图3B)在分化第2-5天对三种不同的PBS3生物反应器取样，并用流式细胞术对CXCR4和CD56进行分析。(图3C)从三个PBS3生物反应器收获定向心脏祖细胞，汇集并通过流式细胞术对CXCR4和CD56进行分析。

图4A-4B：(图4A)在分化第2-5天对三个不同的PBS3生物反应器取样，并用流式细胞术对EPCAM进行分析。(图4B)从三个PBS3生物反应器中收获定向心脏祖细胞，汇集并通过流式细胞术对EPCAM进行分析。

图5：在第4-6天对PBS3生物反应器取样，并用流式细胞术对KDR和PDGFRα进行分析。在分化第6天收获的定向心脏祖细胞已经大大降低了KDR的表达。

图6A-6B：(图6A)通过Fluidigm对来自多批iPSC和定向心脏祖细胞的多能基因NANOG、SOX2和POU5F1的基因表达进行了分析。(图6B)通过Fluidigm对来自多批定向心脏祖细胞的心脏基因HAND2、GATA4、NKX2.5、PDGFRA和TBX5的基因表达进行了分析。

图7A-7E：(图7A)示意图描述了用于确认CTC4细胞在解冻以及铺板到玻连蛋白包被的容器中的RPMI+B27培养基中后，将变成心肌细胞的方案。(图7B)解冻后CTC4细胞的流式细胞术表征显示，细胞群的大多数是CD56^pos、CXCR4^neg、EpCAM^neg、KDR^neg、PDGFRα^pos和SAA^neg，表明这些细胞定向于成为心肌细胞，但尚未开始表达心脏标志物肌节α辅肌动蛋白(SAA)。(图7C)CTC4细胞在具有RPMI+B27培养基的玻连蛋白包被的96孔板上培养7天后的免疫细胞化学表征。心脏特异性转录因子NKX2.5与心脏结构蛋白肌节α辅肌动蛋白(SAA)、心脏肌钙蛋白I(CTNI)和心脏肌钙蛋白T(CTNT)一起表达。(图7D)将CTC4细胞在具有RPMI+B27培养基的玻连蛋白包被的容器上培养7天后，对SAA的流式细胞术进行分析，表明了向心肌细胞的特化。(图7E)在具有RPMI+B27培养基的玻连蛋白包被的容器上培养细胞7天后，CTC4衍生的心肌细胞的收缩。

图8A-8C：(图8A)示意图描绘了NUDE大鼠心肌梗塞模型的图示。在手术结扎左前降支动脉(LAD)三天后，将悬浮在5％ Flexbumin(1e7)中的CTC4细胞分多次(5次)心肌内注射，施用到左心室的梗塞周围区域。CTC3注射后30天时对心脏进行处理和分析。(图8B)通过将每颗心脏切成5个环并包埋在石蜡中，对组织进行处理。从每颗心脏的每个环中切取20个连续切片并放到玻片上。对每个心脏切块的1、5、10和20号切片的载片进行人ALU的免疫组化，以确定人细胞的分布和植入成功情况。(图8C)一旦检测到人细胞，就取连续切片用以进一步的处理和表征。进行多重方法来表征植入的人细胞，其采用针对人Alu的荧光原位杂交，然后用免疫组化方法对Ki67、心脏肌钙蛋白T或CX43进行检测。

图9A-9B：(图9A)示意图描绘了iPSC衍生的心脏祖细胞在含有生长因子FGF2和/或VEGF的RPMI+B27培养基中培养以分化为血管内皮细胞(CD31+CD144+)和平滑肌细胞(CD140b+CD90+)。(图9B)针对血管内皮细胞的CD31和CD144表达以及针对平滑肌细胞的CD90和CD140b表达的流式细胞术。

说明性实施方案的描述

多能干细胞的分化可通过多种方式诱导，如在附着的集落中或通过形成细胞聚集体，例如在低附着环境中，其中这些聚集体被称为胚状体(EB)。EB内分子和细胞的形态发生信号和事件模拟了发育胚胎中这类细胞的天然个体发生的许多方面。在某些实施方案中，本公开提供从多能干细胞(PSC)例如诱导性多能干细胞(iPSC)大量且在短时间内产生定向心脏祖细胞的方法。这些定向心脏祖细胞无需额外的生长因子或小分子信号传导即可以被引发成为心肌细胞，但仍保留内皮分化潜力。在一些实施方案中，本文提供的分化过程经过优化，以在解冻和铺板后迅速建立稳定且稳健的收缩能力。

分化过程可包括在Wnt激动剂和促进聚集体形成的试剂(如ROCK抑制剂)存在下，由PSC(如iPSC)形成聚集体。然后，可在Wnt激动剂(如CHIR 99021)存在下诱导聚集体以形成中胚层细胞。在特定方面，中胚层诱导培养基不包含胰岛素。中胚层诱导培养基可进一步包含激活素激动剂和/或BMP。中胚层细胞可通过CXCR4、KDR、PDGFRα和/或CD56的阳性表达，以及多能性标志物CKIT和/或EPCAM的基本无表达来识别。中胚层诱导步骤可以持续约1-3天。接下来，在Wnt抑制剂和任选地TGFβ和/或BMP抑制剂的存在下(尤其是与胰岛素结合使用时)，对中胚层细胞进行心脏特化。在心脏特化开始后例如约1-3天后，可产生定向心脏祖细胞。在特定方面，处于中胚层阶段的聚集体可被保存在悬浮培养系统中以启动心脏特化，或者在心脏特化启动之前可以将中胚层细胞个体化并铺板为单层培养。这两种培养系统方法都可以制造出定向心脏祖细胞。可对定向心脏祖细胞进行进一步培养以产生心肌细胞。尤其是，分化过程可以是无血清的，不使用耐药性或代谢选择。

在本研究中，开发了一种稳健的且可调整规模的cGMP iPSC衍生的心脏分化方案，该方案可使每个生物反应器中产生1x10⁸-3x10⁹个定向心脏祖细胞(CTC4细胞)，该细胞可以以每个低温保存容器中1x10⁶-300x10⁶个细胞进行低温保存。这些CTC4细胞不同于先前描述的早期KDR⁺心脏祖细胞。例如，CTC4细胞具有已迅速减少的KDR表达，并且不具备与更早期发育阶段的KDR⁺心脏祖细胞相同的分化潜力。相反，CTC4细胞可以在独特的更后期发育阶段，但在细胞变成为早期心肌细胞之前，进行低温保存。

在另外的实施方案中，所述低温保存的心脏祖细胞可以被解冻并在培养基(如RPMI+B27)中进行培养，以进一步以高纯度朝向心肌细胞特化。所述低温保存的心脏祖细胞也可以在被注射到受试者的心肌膜中后变成为心肌细胞。

在另外的方面，所述定向心脏祖细胞可以分化为血管内皮细胞或平滑肌细胞，如在包含FGF和/或VEGF的培养基中。

此外，本公开提供了包括施用本文提供的CTC4细胞的疗法。CTC4细胞可以通过直接注射或通过经心内、心肌内导管递送来递送。iPSC衍生的CTC4细胞的剂量可以约是1x10⁷至1x10⁹个细胞。本公开的CTC4细胞可由HLA相容的iPSC制造，以与待治疗的受试者相容。目前的方法可用于cGMP制造，包括使用所有描述的材料和培养形式。因此，本公开提供了稳健的、可重复的和相关的细胞来源，如用于推进药物开发和心脏再生医学。CTC4细胞也可用于识别以及帮助避免药物介导的心脏发育毒性问题。

Ⅰ.定义

如本文所使用，“基本上不含”，就特定成分而言，在本文指的是该特定成分没有被有意配制到组合物中和/或仅以污染物或微量存在。因此，由组合物的任何意外污染产生的该特定成分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选是其中用标准分析法检测不出任何该特定成分的量的组合物。

如本说明书中所使用，“一个”或“一种”可指一个/种或多个/种。如权利要求中所使用，当与"包括/包含"一词一起使用时，“一个”或“一种”可指一个/种或多于一个/种。

权利要求中术语“或”的使用是指“和/或”，除非明确指出仅指备选或备选相互排斥，尽管本公开支持仅指备选和“和/或”的定义。如本文所使用的“另一个/种”可指至少第二或更多个/种。

在整个申请中，术语“约”用于表示值包括了设备、用于确定该值的方法的固有误差变化或研究对象之间存在的变化。在一些方面，该术语通常可以指在如使用标准分析技术测量所述值确定的所述值的标准差内。该术语也可用于指所述值(如细胞群中对某标志物呈阳性或阴性的细胞的百分比)的加或减5％。

当术语“外源的”用于细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸相关时，是指通过人工或天然方式引入细胞或生物体中的蛋白质、基因、核酸或多核苷酸；或与细胞相关时，该术语是指被分离出来并且随后通过人工或天然方式引入其他细胞或生物体中的细胞。外源核酸可以来自不同的生物体或细胞，也可以是在生物体或细胞内天然存在的核酸的一个或多个额外拷贝。外源细胞可以来自不同的生物体，也可以来自同一生物体。举一个非限制性的例子，外源核酸是一种染色体位置不同于其在天然细胞中的位置的核酸，或者以其他方式被不同于在自然界中发现的核酸序列侧接的核酸。

“表达构建体”或“表达盒”是指能够指导转录的核酸分子。表达构建体至少包括一个或多个转录控制元件(如启动子、增强子或其功能等同的结构)，其指导在一种或多种所需细胞类型、组织或器官中的基因表达。还可以包括其他元件，如转录终止信号。

“载体”或“构建体”(有时称为基因递送系统或基因转移“媒介物”)是指大分子或分子复合物，其包含要体外或体内递送到宿主细胞的多核苷酸。

“质粒”是载体的一种常见类型，它是一种与染色体DNA分开的染色体外DNA分子，能够独立于染色体DNA进行复制。在某些情况下，它是环状的和双链的。

本文使用的术语“细胞”在本领域中具有最广义的含义，并且指的是作为多细胞生物的组织的结构性单元的活体，被将其与外界隔离的膜结构包围，具有自我复制能力，并具有遗传信息和将其表达的机制。本文所用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如，融合细胞、基因修饰的细胞等)。

术语“干细胞”在本文中是指在合适的条件下能够分化成为多种范围内的特定细胞类型，而在其他合适条件下能够自我更新并保持基本上未分化的多能状态的细胞。“干细胞”一词还包括多能(pluripotent)细胞、多潜能(multipotent)细胞、前体细胞和祖细胞。示例性的人干细胞可以由以下获得：从骨髓组织中获得的造血干细胞或间充质干细胞、从胚胎组织中获得的胚胎干细胞、或从胎儿的生殖组织中获得的胚胎生殖细胞。示例性多能干细胞也可以由体细胞产生，其通过与多能干性相关的某些转录因子的表达将体细胞重编程为多能状态；这些细胞被称为“诱导性多能干细胞”或“iPSC或iPS细胞”。

“胚胎干(ES)细胞”是一种未分化的多能细胞，其从早期阶段的胚胎如胚泡期的内细胞团中获得，或通过人工手段(如核移植)产生，并且可以产生胚胎或成体内的任何分化细胞类型，包括生殖细胞(例如精子和卵子)。

“诱导性多能干细胞(iPSC或iPS细胞)”是通过表达或诱导表达因子的组合(本文称为重编程因子)，对体细胞进行重编程而产生的细胞。iPS细胞可以使用胎儿、出生后、新生儿、幼年或成体的体细胞产生。在某些实施方案中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct3/4)、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog和Lin28。在一些实施方案中，通过表达至少两种重编程因子、至少三种重编程因子、至少四种重编程因子、至少五种重编程因子、至少六种重编程因子或至少七种重编程因子来重编程体细胞，以将体细胞重编程为多能干细胞。

“多能干细胞”是指具有分化为构成一个或多个组织或器官的所有细胞的潜力的干细胞，或者优选分化为三种胚层中的任何一种的潜力的干细胞：内胚层(内层胃黏膜、胃肠道、肺)、中胚层(肌肉、骨、血液、泌尿生殖器)或外胚层(表皮组织和神经系统)。

如本文所用，术语“体细胞”是指除生殖细胞如卵子、精子等以外的任何细胞，它们不直接将其DNA传到下一代。通常情况下，体细胞的多能性有限或没有多能性。本文所用的体细胞可以是天然存在的或经基因修饰的。

“编程”是改变细胞可产生的后代类型的过程。例如，当细胞被改变使其能够在培养中或体内形成至少一种新细胞类型的后代时，该细胞就被编程了，与之相比的是，没有编程的情况下在相同条件下该细胞本来能够形成的类型。这意味着，在经过充分增殖后，如果在编程前基本上不可能形成这样的后代的话，则观察到具有新细胞类型的表型特征的后代的可测量比例；或者，具有新细胞类型特征的比例比编程前可测量到的要多。这一过程包括分化、去分化和转分化。

“重编程”是一个过程，它赋予细胞在培养中或体内形成至少一种新细胞类型的后代的可测量的增强的能力(与在相同条件下没有重编程的情况下相比)。更具体地说，重编程是赋予体细胞多能行潜力的过程。这意味着在充分增殖之后，如果在重编程之前基本上没有形成这样的后代，则会有可测量比例的后代具有新细胞类型的表型特征；或者，具有新细胞类型的特征的比例会可测量地多于重编程之前。

“分化”是不太特化的细胞变成更加特化的细胞类型的过程。“去分化”是部分分化或终末分化的细胞恢复到早期发育阶段(如多能性或多潜能性)的细胞过程。“转分化”是将一种分化的细胞类型转化为另一种分化的细胞类型的过程。通常，通过编程进行的转分化发生在细胞不经历中间多能性阶段的情况下，即细胞直接从一种分化的细胞类型编程为另一种分化的细胞类型。在某些条件下，具有新细胞类型特征的后代的比例可以至少约为1％，5％，25％或更多(按照偏好递增的顺序)。

术语“正向编程”是指通过向多潜能或多能细胞提供一种或多种特定的谱系决定基因或基因产物，来编程多潜能或多能细胞，而不是编程没有多能性的分化的体细胞。例如，正向编程可以描述将ESC或iPSC编程为造血前体细胞或其他前体细胞的过程，或编程为造血细胞或其他分化的体细胞的过程。

如本文所用，术语“受试者”或“有此需要的受试者”是指需要细胞或组织移植的哺乳动物，优选任何年龄的人类，男性或女性。通常，受试者(在本文中也称为接受体)由于病症或病理性或不良病况、状态或综合征，或适合通过细胞或组织移植治疗的实体、形态学或生理性异常，而需要细胞或组织移植。

“存活剂”是指当添加到细胞培养基中时促进和/或支持细胞存活的试剂。例如，Rho相关激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白II特异性抑制剂可用作存活剂。在特定方面，这些存活剂促进细胞在培养物中的聚集。

“Rho相关激酶抑制剂”缩写为"ROCK抑制剂"，是指抑制或降低细胞中Rho相关激酶或其信号传导通路的功能的任何物质，如小分子、siRNA、miRNA、反义RNA等。本文使用的“ROCK信号传导通路”可包括参与ROCK相关信号传导通路的任何信号处理物，如细胞中的Rho-ROCK-肌球蛋白II信号传导通路、其上游信号传导通路或其下游信号传导通路。ROCK抑制剂的实例包括但不限于Rho特异性抑制剂、ROCK特异性抑制剂、MRLC(肌球蛋白调节轻链)特异性抑制剂或肌球蛋白II特异性抑制剂。

“定向心脏祖细胞(CPC)”、“引发的CPC或CTC4细胞”在本文中可互换使用，指的是其分化已被操作为朝向心脏谱系的细胞，尽管其尚未完全分化为心肌细胞。因此，这些CPC被引发成为心肌细胞。定向心脏祖细胞可以被低温保存，并且当被铺板或体内注射时，无需额外的生长因子或小分子信号传导，将分化为>90％的心肌细胞(如SAA阳性心肌细胞)。定向心脏祖细胞标志物的实例包括PDGFRα和CD56。在特定方面，定向心脏祖细胞不表达CXCR4、KDR、CKIT、EPCAM和/或肌节α辅肌动蛋白。这些定向的CPC或CTC4细胞是多潜能的，并且还可进一步分化为其他细胞谱系，如血管内皮细胞或平滑肌细胞，比如在有生长因子存在的情况下进行培养。

“心肌细胞”或心脏肌细胞是指构成心肌的肌细胞。心脏特异性标志物的实例包括α-肌节辅肌动蛋白、肌钙蛋白、肌球蛋白重链，或L型钙电流。

如本文所使用，“施用”应指以使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种来影响或实施的方式进行递送。例如，可以通过静脉内注射、口服、植入、经粘膜、经皮、肌肉内或皮下进行施用。特定地，设想的是局部施用。“施用”也可以是例如一次、多次和/或在一个或多个延长时段内进行。

“超级供体”在本文中是指对某些MHC I类和II类基因纯合的个体。这些纯合个体可作为超级供体，并且其细胞(包括包含其细胞的组织和其他材料)可以移植到针对该单体型为纯合的或杂合的个体中。超级供体可以分别对HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ基因座等位基因是纯合的。

Ⅱ.多能干细胞

在本公开的某些实施方案中，公开了从多能干细胞提供心脏祖细胞的方法和组合物。多能干细胞可以是干细胞，包括但不限于诱导性多能干细胞和胚胎干细胞。

在特定方面，本文所使用的多能干细胞是人胚胎干细胞(ESC)或诱导性多能干细胞(iPSC)，其能够体外长期增殖，同时保留分化成为身体所有细胞类型的潜力，包括本公开的心脏祖细胞。因此，这些细胞有可能为药物开发和治疗用途提供无限供给的患者特异性的功能性心脏祖细胞。

A.胚胎干细胞

在某些方面，多能干细胞是胚胎干细胞(ESC)。ES细胞来源于胚泡的内细胞团，并具有高体外分化能力。ES细胞可以通过去除发育中胚胎的外部滋养外胚层，然后在非生长细胞的饲养层上培养内细胞团来分离。重新铺板的细胞可以继续增殖并产生新的ES细胞集落，这些集落可以被取出、解离、重新铺板并被允许生长。这种“传代培养”未分化ES细胞的过程可以重复多次，以产生含有未分化ES细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。ES细胞具有增殖的潜力，同时保持其多能性。例如，ES细胞可用于研究细胞和控制细胞分化的基因。ES细胞的多能性与遗传操作和选择相结合，可用于通过产生转基因的、嵌合的和敲除小鼠，进行体内基因分析研究。

产生小鼠ES细胞的方法是众所周知的。在一种方法中，用小鼠抗血清处理来自129品系小鼠的植入前胚泡以去除滋养外胚层，并将内细胞团在含有胎牛血清的培养基中在化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上培养。在胎牛血清存在下，将发育的未分化ES细胞集落在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养，以产生ES细胞群。在一些方法中，通过将细胞因子白血病抑制因子(LIF)添加到含血清的培养基中，能使小鼠ES细胞在没有饲养层的情况下生长(Smith，2000)。在其他方法中，小鼠ES细胞可以在骨形态发生蛋白和LIF存在下在无血清培养基中生长(Ying等人，2003)。

人类ES细胞可以从受精卵或胚泡期哺乳动物胚胎中产生或衍生，所述胚泡期哺乳动物胚胎通过精子和卵细胞融合，核移植，发病机制或染色质重编程以及随后将重编程的染色质掺入质膜以产生胚胎细胞来产生，这是通过先前描述的方法进行的(Thomson和Marshall，1998；Reubinoff等人，2000)。在一种方法中，将人胚泡暴露于抗人血清，并将滋养外胚层细胞裂解和从在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养的内细胞团中去除。此外，将来源于内细胞团的细胞团块进行化学或机械解离，重新铺板，并通过微量移液管选择具有未分化形态的集落，将集落解离并重新铺板。在一些方法中，通过在碱性成纤维细胞生长因子存在下在成纤维细胞的饲养层上培养ES细胞，可以在无血清的情况下生长人ES细胞(Amit等人，2000)。在其他方法中，通过在含有碱性成纤维细胞生长因子的“条件”培养基的存在下在蛋白质基质(如MATRIGEL^TM)或层粘连蛋白上培养细胞，可以在没有饲养细胞层的情况下生长人ES细胞(Xu等人，2001)。

ES细胞也可以通过先前描述的方法(Thomson和Marshall，1998；Thomson等人，1995；Thomson和Odorico，2000；美国专利号5,843,780)来源于其他生物(包括恒河猴和狨猴)，以及来源于已建立的小鼠和人类细胞系。例如，已建立的人ES细胞系包括MAOI，MA09，ACT-4，HI，H7，H9，H13，H14和ACT30。作为另一个例子，已建立的小鼠ES细胞系包括从小鼠品系129胚胎的内细胞团建立的CGR8细胞系，且CGR8细胞的培养可以在没有饲养层的LIF存在下生长。

ES干细胞可以通过蛋白质标志物检测，包括转录因子Oct4、碱性磷酸酶(AP)、阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、阶段特异性胚胎抗原SSEA-3、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、转录因子NANOG、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)、SOX2或REX1。

B.诱导性多能干细胞

在其他方面，本文所使用的多能干细胞是诱导性多能干(iPS)细胞，通常缩写为iPS细胞或iPSC。多能性的诱导最初是在2006年使用小鼠细胞(Yamanaka等人2006)以及2007年使用人细胞(Yu等人2007；Takahashi等人2007)实现的，其通过引入与多能性关联的转录因子对体细胞重编程来进行。iPSC的使用规避了与ES细胞的大规模临床使用相关的大多数伦理和实际问题，并且具有iPSC衍生的自体移植物的患者可以不需要终身免疫抑制治疗来预防植入物排斥反应。

除生殖细胞外，任何细胞都可以用作iPSC的起点。例如，细胞类型可以是角质形成细胞，成纤维细胞，造血细胞，间充质细胞，肝细胞或胃细胞。T细胞也可以用作用于重编程的体细胞来源(美国专利号8,741,648；美国公布号2015/0191697)。细胞分化程度或被收集细胞的动物的年龄没有限制；在本文公开的方法中，甚至未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞也可以用作体细胞的来源。iPS细胞可以在已知将人ES细胞分化为特定细胞类型的条件下生长，并表达人ES细胞标志物，包括：SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和TRA-1-81。

可以使用本领域技术人员已知的方法对体细胞进行重编程以产生iPS细胞。本领域技术人员可以轻易地产生iPS细胞，例如，参见已公布的美国专利申请号2009/0246875，已公布的美国专利申请号2010/0210014；已公布的美国专利申请号2012/0276636；美国专利号8,058,065；美国专利号8,129,187；PCT公布号WO 2007/069666 A1，美国专利号8,268,620；美国专利号8,546,140；美国专利号9,175,268；美国专利号8,741,648；美国专利申请号2011/0104125和美国专利号8,691,574，其通过引用并入到本文中。通常，将细胞核重编码因子用于从体细胞产生多能干细胞。在一些实施方案中，使用Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28中的至少三种或至少四种。在其他实施方案中，使用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4或Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28。

这些细胞核重编程物质的鼠类和人类cDNA序列，可参考WO 2007/069666和美国专利号8,183,038(其均通过引用并入到本文中)中提到的NCBI登录号获取。引入一种或多种重编程物质或编码这些重编程物质的核酸的方法在本领域是已知的，并且在例如美国专利号8,268,620、8,691,574、8,741,648、8,546,140、在公布的美国专利号8,900,871和美国专利号8,071,369中公开，其均通过引用并入本文中。

一旦衍生，iPSC可以在足以维持多能性的培养基中培养。iPSC可与开发用于培养多能干细胞(更具体地说是胚胎干细胞)的各种培养基和技术一起使用，如美国专利号7,442,548和美国专利公布号2003/0211603中所述。在小鼠细胞的情况下，在普通培养基中加入白血病抑制因子(LIF)作为分化抑制因子进行培养。在人类细胞的情况下，期望添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)来代替LIF。用于培养和维持iPSC的其他方法，如本领域技术人员所知的，可以与本文公开的方法一起使用。

在某些实施方案中，可以使用未限定的条件；例如，多能细胞可以在成纤维细胞饲养细胞或已经暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基上培养，以维持干细胞处于未分化状态。在一些实施方案中，细胞是在用辐照或抗生素处理过以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞的共同存在下培养的。或者，可以使用限定的不依赖饲养层的培养系统，如TESR^TM培养基(Ludwig等人，2006a；Ludwig等人，2006b)或E8^TM/Essential 8^TM培养基(Chen等人，2011)来培养多能细胞并将其维持在基本未分化的状态。

质粒的设计考虑了许多目标，比如达到调节的高拷贝数和避免细菌中质粒不稳定的潜在原因，以及提供了与在哺乳动物细胞(包括人细胞)中的使用所相容的质粒选择的手段。特别注意了人细胞中使用的质粒的双重需求。首先，它们适合于在大肠杆菌中维持和发酵，以产出和提纯大量DNA。其次，它们是安全的且适合在人类患者和动物中使用。第一个需求要求在细菌发酵期间可以相对容易地被选择并稳定维持的高拷贝数质粒。第二个需求要求注意元件，比如可选择的标志物和其他编码序列。在一些实施方案中，编码标志物的质粒由以下组成：(1)高拷贝数复制起点，(2)可选择的标志物，比如但不限于，用卡那霉素进行抗生素选择的neo基因，(3)转录终止序列，包括酪氨酸酶增强子以及(4)用于并入各种核酸盒的多克隆位点；和(5)编码与酪氨酸酶启动子可操作地连接的标志物的核酸序列。在特定方面，所述质粒不包含酪氨酸酶增强子或启动子。本领域已知许多质粒载体用于诱导编码蛋白质的核酸。这些包括但不限于美国专利号6,103,470；美国专利号7,598,364；美国专利号7,989,425；以及美国专利号6,416,998和美国申请号12/478,154中公开的载体，它们通过引用并入本文。

附加体基因递送系统可以是质粒、基于Epstein-Barr病毒(EBV)的附加体载体(美国专利8,546,140)、基于酵母的载体、基于腺病毒的载体、基于猿猴病毒40(SV40)的附加体载体、基于牛乳头状瘤病毒(BPV)的载体或慢病毒载体。病毒基因递送系统可以是基于RNA或基于DNA的病毒载体(PCT/JP2009/062911，PCT/JP2011/069588)。

C.通过体细胞核转移获得的胚胎干细胞

还可以通过体细胞核移植的方式制备用于产生造血前体细胞的多能干细胞，其中将供体细胞核转移到无纺锤体的卵母细胞中。通过核移植产生的干细胞在遗传上与供体细胞核相同。在一种方法中，通过电融合，将来自恒河猴皮肤成纤维细胞的供体成纤维细胞的细胞核引入到无纺锤体的成熟中期II恒河猴卵母细胞的细胞质中(Byrne等人，2007)。通过暴露于离子霉素而将融合的卵母细胞激活，然后将其孵育直到胚泡阶段。接着对选定的胚泡的内细胞团进行培养以产生胚胎干细胞。胚胎干细胞系显示正常的ES细胞形态，表达各种ES细胞标志物，并体外和体内都分化成为多种细胞类型。

D.MHC单体型匹配

主要组织相容性复合体是同种异体器官移植免疫排斥反应的主要原因。存在三种主要MHCⅠ类单体型(A，B和C)和三种主要MHCⅡ类单体型(DR，DP和DQ)。HLA基因座具有高度多态性并分布在6号染色体上超过4Mb。对该区域内的HLA基因进行单体型的能力在临床上很重要，因为该区域与自身免疫和感染性疾病有关，并且供体和接受体之间HLA单体型的相容性能影响移植的临床结果。对应于MHC I类的HLA从细胞内侧呈递肽到T淋巴细胞，对应于MHCⅡ类的HLA从细胞外侧呈递肽到T淋巴细胞。植入物与宿主之间MHC单体型的不相容性引发针对移植物的免疫应答并导致其排斥。因此，患者可以通过免疫抑制剂治疗以防止排斥反应。HLA匹配的干细胞系可以克服免疫排斥的风险。

由于HLA在移植中的重要性，通常通过血清学和PCR对HLA基因座进行分型，以鉴定有利的供体-接受体对。对HLA I类和II类抗原的血清学检测可以利用使用纯化的T或B淋巴细胞的补体介导的淋巴细胞毒性检验来完成。该过程主要用于匹配HLA-A和B基因座。基于分子的组织分型通常可以比血清学检验更准确。低分辨率分子方法，如其中PCR产物针对一系列寡核苷酸探针进行检验的SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)方法，可以用于鉴定HLA抗原，且目前这些方法是用于II类HLA分型的最常用方法。高分辨率技术，如利用等位基因特异性引物进行PCR扩增的SSP(序列特异性引物)方法，可以鉴定特定的MHC等位基因。

如果供体细胞是HLA纯合的，即对于每种抗原呈递蛋白含有相同的等位基因，则供体和接受体之间的MHC相容性会显着增加。大多数个体对于MHC I类和II类基因是杂合的，但某些个体对这些基因是纯合的。这些纯合个体可以作为超级供体，并且可以将从其细胞产生的植入物移植到该单体型纯合的或杂合的所有个体中。此外，如果纯合供体细胞具有在细胞群中高频率发现的单体型，则这些细胞可以应用于大量个体的移植疗法。

相应地，在一些实施方案中，本方法的iPSC可以从待治疗受试者的体细胞产生，或从与该患者具有相同或基本相同的HLA类型的另一受试者产生。在一种情况下，供体的主要HLA(例如HLA-A，HLA-B和HLA-DR的三个主要基因座)与接受体的主要HLA相同。在某些情况下，体细胞供体可能是超级供体；因此，来源于MHC纯合的超级供体的iPSC可用于产生定向心脏祖细胞。因此，来源于超级供体的定向心脏祖细胞可以移植到该单体型纯合的或杂合的受试者中。例如，定向心脏祖细胞可以在两种HLA等位基因(如HLA-A和HLA-B)处是纯合的。所以，产自超级供体的定向心脏祖细胞可以用于本公开的方法中，以产生能够潜在地“匹配”大量潜在的接受体的定向心脏祖细胞。

相应地，本公开的某些实施方案提供了HLA纯合的定向心脏祖细胞的储存库(例如文库)。主题库中所代表的HLA单体型可以反映在人群中发现的最常见的HLA单倍型，例如，常见的高加索HLA单体型，在非洲血统的个体中发现的常见HLA单体型，常见的亚洲HLA单体型，常见的西班牙HLA单体型，常见的美洲原住民HLA单体型等。例如，单个丰富的单体型可以存在于很大比例的人群中，从而允许单个HLA纯合细胞系作为大比例患者的组织相容性供体。文库包括一种，两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种，10种，10-15种，15-20种，20-25种，25-30种，或超过30种不同类型的HLA纯合细胞。主题库可以包含对于第一HLA单体型纯合的第一HLA纯合细胞；以及对于第二HLA单体型纯合的至少第二HLA纯合细胞。主题库可以包含单个细胞类型，也可以包含两种或更多种不同的细胞类型。可以例如通过可搜索的计算机数据库对主题库进行编目，其中有关HLA单体型的信息以及任选地其他信息如细胞表面标志物、核型信息等，被储存且可以被搜索。

本文所述的HLA纯合的定向心脏祖细胞可用于涉及细胞和/或组织移植的广泛临床应用。HLA纯合的定向心脏祖细胞与接受体是HLA相容的，并且因此可以在不需要免疫抑制治疗或至少降低的免疫抑制治疗需要的情况下将其引入接受体。标准的免疫抑制药物治疗方案每月花费数千美元，并且可能产生不期望的副作用，包括往往会危及生命且治疗费用昂贵的感染和癌症。因此，本发明的HLA纯合的定向心脏祖细胞克服了当下限制人细胞用于临床应用的一些障碍。

Ⅲ.向定向心脏祖细胞(CTC4)的分化

本公开的实施方案涉及PSC，尤其是iPSC，向心脏祖细胞的分化，所述心脏祖细胞被定向或引发以进一步分化为心肌细胞。图1A中的示意图展示了示例性的6天分化过程，该过程始于使用iPSC，该iPSC在开始分化之前已经在玻连蛋白包被的具有Essential 8培养基的容器上扩增，如在生物反应器中的大规模分化。

在一些方面，本方法涉及在全悬浮生物反应器过程中Wnt信号传导的调节。在心脏发育过程中，中胚层中的Wnt信号传导可以被快速调节，以驱动进一步的心脏特化。迄今为止，何时Wnt信号传导必须减少的时间点尚未得到很好的描述。在本研究中，追踪了两种细胞表面标志物CXCR4和CD56的表达。心脏分化可以通过每天分析这两种标志物来追踪，并且可以基于表达谱做出决定以获得稳健的心脏分化。初始的中胚层阶段由CXCR4⁺CD56^-细胞群指示，然后是CXCR4⁺CD56⁺双阳性细胞，之后丧失CXCR4表达并产生CXCR4^-CD56⁺定向心脏祖细胞。

可以抑制Wnt信号传导以获得稳健的心脏特化，这将驱动细胞成为心肌细胞，如图3B所示。优选地，第3天的培养物中有至少30％是CXCR4阳性和少于60％是CD56阳性的。如果在Wnt信号传导被抑制之前培养物变成多于60％的CD56阳性，那么可能不会有稳健的心脏细胞的特化，因此成为心肌细胞的效率较低。此外，如果培养物已经变成了多于20％的CXCR4^-CD56⁺，则指示了CXCR4表达的丧失，那么抑制Wnt信号传导以获得稳健的心脏特化也为时已晚。

A.聚集体形成

通过首先与用Wnt激动剂(如CHIR 99021)启动分化一起诱导聚集体形成，将多能干细胞分化为CTC4细胞。聚集时，分化启动，并且细胞开始在有限程度上重现胚胎发育。虽然它们不能形成滋养外胚层组织(其包括胎盘)，但生物体内存在的几乎所有其他类型的细胞都可以发育。本公开可以在聚集体形成后进一步促进心脏分化。

作为分化过程的一部分，多能细胞可以被允许形成胚状体或聚集体。为了诱导分化，“胚状体”(EB)的形成或生长细胞的聚簇通常涉及人多能干细胞体外聚集成为EB，并允许人多能干细胞的自发和随机分化，分化为代表内胚层、外胚层和中胚层起点的多种组织类型。

在特定实施方案中，在ROCK抑制剂和Wnt通路的化学激动剂(如GSK3抑制剂(例如CHIR 99021))的存在下，培养多能干细胞以刺激Wnt通路。Wnt通路的激动剂可包括CAS853220-52-7(2-氨基-4-(3,4-(亚甲二氧基)苄基氨基)-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶)，SB216763，CHIR 98014，TWS119，Tideglusib，SB415286，BIO，AZD2858，AZD1080，AR-A014418，TDZD-8，LY2090314或IM-12。培养基可以包含例如CHIR 99021的Wnt激动剂，以约为1-10μM的浓度，比如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM。在特定方面，该培养基包含如CHIR99021的Wnt激动剂，以约为4.4μM的浓度。在特定方面，该方法包括在聚集形成期间(如第0天至第1天)在约2μM Wnt激动剂的存在下培养细胞，然后在约4.4μM存在下(如第1天至第3天)培养细胞用于中胚层诱导。

ROCK抑制剂可用于培养和传代多能干细胞和/或干细胞的分化。因此，ROCK抑制剂可以存在于其中多能干细胞生长、解离、形成聚集体或经历分化的任何细胞培养基中，比如贴壁培养或悬浮培养。Rho特异性抑制剂，如肉毒杆菌(Clostridium botulinum)C3外酶，和/或肌球蛋白II特异性抑制剂在本公开的某些方面也可用作ROCK抑制剂。在特定方面，肌球蛋白II抑制剂，比如布比他汀(blebbistatin)，可用于诱导聚集体形成。

一种示例性ROCK特异性抑制剂是Y-27632，其选择性靶向ROCK1(但也抑制ROCK2)，以及抑制TNF-α和IL-1β。它具有细胞渗透性并通过与ATP竞争来抑制ROCK1/ROCK2(IC₅₀＝800nM)。其他ROCK抑制剂包括，例如H1152，Y-30141，Wf-536，HA-1077，羟基-HA-1077，GSK269962A和SB-772077-B。在特定方面，本发明方法中使用的ROCK特异性抑制剂是H1152。在一些方面，H1152以50-200μM，比如约100μM的浓度存在于培养物中。

ROCK抑制剂的其他非限制性实例包括针对ROCK的反义核酸，RNA干扰诱导核酸(例如siRNA)，竞争性肽，拮抗肽，抑制性抗体，抗体ScFV片段，显性负效变体及其表达载体。此外，由于已知其他低分子化合物为ROCK抑制剂，所以这类化合物或其衍生物也可以用于实施方案中(例如，参考美国专利公布号20050209261、20050192304、20040014755、20040002508、20040002507、20030125344和20030087919，以及国际专利公布号2003/062227、2003/059913、2003/062225、2002/076976和2004/039796，其通过引用并入本文)。在本发明方法中，还可以使用一种或两种或更多种ROCK抑制剂的组合。

根据一些实施方案，PSC可以在培养基中用ROCK抑制剂来处理。由此，本公开的方法中使用的培养基可能已经包含了ROCK抑制剂，或者本公开的方法可能涉及将ROCK抑制剂添加到培养基中的步骤。ROCK抑制剂在培养基中的浓度尤其不受限制，只要它能达到期望效果比如提高的干细胞存活率。这样的ROCK抑制剂，例如Y-27632，HA-1077或H-1152，可以以至少或约0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、500至约1000μM的有效浓度或其中可衍生的任何范围内使用。这些量可以是指单独一种ROCK抑制剂的量或与一种或多种ROCK抑制剂组合的量。

例如，当Y-27632用作ROCK抑制剂时，它可以以约0.01至约1000μM的浓度使用，更具体地约0.1至约100μM，再更具体地约1.0至约30μM，以及最具体地约2.0至20μM，或其中可衍生的任何范围。当法舒地尔(fasudil)/HA1077用作ROCK抑制剂时，它可以以上述Y-27632浓度的约两倍使用。当H1152用作ROCK抑制剂时，它可以以上述Y-27632浓度的约1/50使用。

聚集体形成步骤以足以诱导聚集体产生的时间进行。例如，多能干细胞(如诱导性多能干细胞)可以与ROCK抑制剂接触约10、15、20、25、30分钟至数小时(例如，至少或约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、24小时、36小时、48小时，或其中可衍生的任何范围)。在特定方面，1-3天的时间(如约1天)足以诱导细胞形成聚集体。

要用ROCK抑制剂处理的干细胞的密度尤其不受限制，只要它是可以实现所需效果(如改进的干细胞存活率)的密度。例如，其约为1.0×10¹至1.0×10⁷个细胞/ml，更具体地约为1.0×10²至1.0×10⁷个细胞/ml，进一步更具体地约为1.0×10³至1.0×10⁷个细胞/ml，并且最具体地约为3.0×10⁴至2.0×10⁶个细胞/ml。

在某些实施方案中，在ROCK抑制剂存在下培养PSC以改进低密度(解离成单细胞或小聚集体)下的存活、克隆效率或传代效率。在某些实施方案中，在无饲养细胞、饲养细胞提取物和/或血清的情况下培养PSC。PSC可以在亚克隆或传代之前在ROCK抑制剂的存在下培养，例如在亚克隆或传代之前至少一小时。或者或另外地，在亚克隆或传代期间或之后，在ROCK抑制剂的存在下维持PSC。

可以使用细胞培养领域已知的任何方法将多能干细胞接种到聚集体促进培养基中。例如，多能干细胞可以作为单个集落或克隆群接种到聚集促进培养基中，并且多能干细胞还可以作为基本上是单个的细胞接种。在一些实施方案中，使用本领域已知的机械法或酶促方法将多能干细胞解离成基本上是单个的细胞。举一个非限制性实例，多能干细胞可以暴露于蛋白水解酶，该蛋白水解酶破坏细胞与培养表面之间以及细胞本身之间的连接。可用于单个化多能干细胞以用于聚集体形成和分化的酶可包括但不限于各种商业制剂的胰蛋白酶，如TrypLE，或酶的混合物，如

可以使用各种基质组分来培养多能细胞，包括胶原蛋白(例如胶原蛋白IV)，层粘连蛋白，玻连蛋白，Matrigel^TM，明胶，聚赖氨酸，血小板反应蛋白(例如TSP-1，TSP-2，TSP-3，TSP-4和/或TSP-5)，纤连蛋白和/或ProNectin-F^TM。这些基质组分的组合可以为促进细胞生长和细胞活力提供额外的好处。在某些实施方案中，上述基质组分中的1、2、3、4、5、6或更多种可用于培养细胞。在一些方面，多能细胞被培养在玻连蛋白包被的表面上。

在某些实施方案中，可以将多能细胞作为基本上是单个(或分散)的细胞添加或接种到培养基中以在培养表面上形成培养。接种细胞的培养基可以包含Essential 8(E8)培养基，存活因子(如ROCK抑制剂)和Wnt通路激动剂。在这些实施方案中，培养表面可以基本上由与本领域中的标准无菌细胞培养方法相容的任何材料构成，例如非贴壁表面。培养表面可以另外包含如本文所述的基质组分(例如玻连蛋白)。在某些实施方案中，可以在培养表面与细胞和培养基接触之前将基质组分施加到培养表面。

B.中胚层诱导

接下来，将多能干细胞聚集体(如iPS细胞聚集体)在培养基中培养以促进中胚层诱导。聚集体可以与Wnt激动剂接触，以及任选地与激活素/Nodal激动剂和/或BMP接触。在特定方面，培养基不包含ROCK抑制剂或胰岛素。与聚集体形成步骤相比，培养基可以包含更高浓度的一种或多种Wnt激动剂。Wnt激动剂可以与聚集体形成步骤中的Wnt激动剂相同，或者可以是不同的Wnt激动剂。Wnt通路的激动剂可包括CHIR 99021，IWP-1，IWP-2，IWP-3，IWP-4，CAS 853220-52-7(2-氨基-4-(3,4-(亚甲二氧基)苄基氨基)-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶)，SB216763，CHIR 98014，TWS119，Tideglusib，SB415286，BIO，AZD2858，AZD1080，AR-A014418，TDZD-8，LY2090314或IM-12。Wnt激动剂可以是CHIR 99021，并且可以以约1-10μM的浓度存在，如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μM。在特定方面，Wnt激动剂是CHIR 99021，并且以约4-5μM的浓度存在，如约4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5μM，具体地是约4.4μM。

激活素激动剂是一种激活激活素/Nodal信号传导通路的化合物，例如通过与TGFβ或激活素受体结合。激活素激动剂的实例包括激活素A，激活素B，激活素AB，TGFβl，生长和分化因子(GDF)-3，BML-284和Nodal。例如，可以在0.1ng/mL至12ng/mL的浓度下使用激活素激动剂或BMP。

用于中胚层诱导的基础培养基可以是本领域已知的用于培养干细胞的任何培养基。示例性培养基包括E8、TeSR、BME、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、改良的MEM ZincOption、IMDM、培养基199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI 1640和Fischer’s培养基。在特定方面，基础培养基是补充有B27的RPMI。在具体方面，培养基不包含或基本上不含胰岛素。

中胚层诱导步骤可持续一段时间以足以诱导中胚层标志物，如CXCR4，KDR，PDGFRα和/或CD56，以及CKIT和/或EPCAM表达的丧失。例如，聚集体可以在Wnt激动剂、激活素/Nodal激动剂、和/或BMP的存在下培养约1-5天，如约1、2、3、4或5天。在特定方面，将聚集体培养约2-3天以进行中胚层诱导。

在特定方面，在中胚层早期比如第2天，CXCR4开始表达。接下来，随着CD56表达的开始，检测到了CXCR4的更为稳健的表达。

C.心脏特化

然后在Wnt抑制剂和任选的TGFβ抑制剂存在下，将中胚层细胞导向心脏特化。培养物可进一步包含胰岛素、激活素抑制剂和/或BMP抑制剂。心脏特化可以通过添加胰岛素来促进。一旦细胞中少于60％呈CD56阳性以及至少20％呈CXCR4阳性，就可以添加Wnt抑制剂。在Wnt抑制后，比如第4天，细胞处于早期心脏中胚层阶段，该阶段以丧失CXCR4的表达，伴随出现大多数细胞表达CD56和KDR+PDGRFα+群为表征。在第5天，观察到KDR+PDGFRα+心脏祖细胞群，伴随CD56的持续表达和CXCR4表达的丧失。然后，比如在第6天，出现了以KDR表达丧失为特征的引发的或定向的心脏祖细胞群。

在特定方面，处于中胚层阶段的聚集体可以保持在悬浮培养系统中以启动心脏特化，或者可以在启动心脏特化之前将中胚层细胞个体化并作为单层培养物进行铺板。用两种培养系统方法都可以制造CTC4细胞。CTC4细胞可以进一步被培养以产生心肌细胞。特别是，分化过程可以是无血清的，且不使用药物抗性或代谢选择。

Wnt抑制剂可以是XAV939，ICG-001，IWR-1-endo，Wnt-C59，LGK-974，LF3，CP21R7，NCB-0846，PNU-74654，IWR-1，IWR-2，IWR-3，IWR-4或KYA179K。Wnt抑制剂(如XAV939)可以以约1-25mM的浓度存在，如约5、10或15mM，特别是约10mM。

TGFβ抑制剂可以是SB431542，LDN-193189，LY2157299，LY2109761，SB525334，SISHCl，SB505124，GW788388或LY364947。TGFβ抑制剂(如SB431542)可以以约1-25mM的浓度存在，如约5、10或15mM，特别是约10mM。193189，LY2157299，LY2109761，SB525334，SIS HCl，SB505124，GW788388或LY364947。TGFβ抑制剂(如SB431542)可以以1-5μM的浓度存在，如约1、2或3μM，特别是约2μM。

BMP抑制剂可以是6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶二盐酸盐(Dorsomorphin)，4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉盐酸盐(LDN193189)，4-[6-[4-(1-甲基乙氧基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉(DMH1)，4-[6-[4-[2](4-吗啉基)乙氧基]苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉(DMH-2)和5-[6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉(ML 347)。BMP抑制剂，如dorsomorhpin，可以以约0.1μM至5μM的浓度存在，约1、2或3μM，特别是约2μM。

CTC4细胞可以在心脏特化启动后约1-4天从中胚层产生。心脏特化可以进行约1-4天，如约2或3天。然后CTC4细胞可以被低温保存或在适当的培养基(如补充有B27的RPMI)中被分化成为心肌细胞。在特定方面，一旦细胞群为至少70％的PDGFRα阳性，少于40％的KDR阳性、少于20％的EPCAM阳性、以及少于20％的SAA阳性，可以将定向心脏祖细胞分离或低温保存。

定向心脏祖细胞的聚集体可以被解离或低温保存。可以使用任何已知规程进行聚集体解离。这些规程包括用螯合剂(如EDTA)、酶(如胰蛋白酶，胶原酶)等进行处理，以及机械解离(如移液)等操作。细胞可以在如上所述的基质上培养，如在玻连蛋白包被的表面上。

D.CTC4向心肌细胞的分化

如图7A所示，CTC4细胞可以进一步成熟或分化为心肌细胞。特别是，CTC4细胞可以通过本领域已知的分化条件成熟为心肌细胞亚群，如心房、心室和起搏细胞。当铺板到各种尺寸的容器中时，CTC4细胞可以分化成高纯度和收缩的心肌细胞单层(图7C-E)。

为了促进心肌细胞表型，可以用增强心肌细胞类型细胞的增殖或存活，或抑制其他细胞类型生长的因子和因子组合来培养细胞。这种影响可能是由于对细胞本身的直接影响，或由于对另一种细胞类型的影响，这继而增强心肌细胞的形成。例如，诱导下胚层或上胚层等同细胞形成的因子或致使这些细胞产生其自身的心脏促进因素的因子，都属于用于心肌细胞分化的亲心性因子或分化因子的范畴。

例如，用于心脏分化的诱导培养基可以包括但不限于心脏前外植体，心脏前中胚层条件培养基，中胚层分泌的生长因子如HGF。在特定方面，分化因子可以是参与细胞发育的生长因子。分化因子可以包括但不限于骨形态发生蛋白，激活素A/Nodal，血管内皮生长因子(VEGF)，dickkopf同源物1(DKK1)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胰岛素生长因子(IGF)和/或表皮生长因子(EGF)的信号传导通路的一种或多种调节剂。

CTC4细胞可以在培养基中培养以促进向心肌细胞的成熟。示例性成熟培养基可包含补充有B27的RPMI。在一些方面，术语“成熟培养基”是指用于进一步分化细胞以产生多于70％为PDGFRα阳性，少于40％为KDR阳性，少于20％为EPCAM阳性，以及少于20％为肌节α辅肌动蛋白阳性的细胞群的培养基。例如，细胞可以分化成为心肌细胞或内皮细胞。

在一种方法中，CTC4细胞在如上所述的补充有Wnt抑制剂和TGFβ抑制剂的培养基中成熟为心肌细胞。例如，培养基可以是具有细胞维持混合物B(即青霉素/链霉素、胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸、BSA、亚油酸、GlutaMAX和HEPES)、Wnt抑制剂(例如XAV939)和TGFβ抑制剂(例如SB431542)的Williams E培养基。或者代替TGFβ抑制剂或除了TGFβ抑制剂以外，CTC4细胞还可以与激活素抑制剂和/或BMP抑制剂接触。细胞可以单层培养，如在细胞外基质包被(例如玻连蛋白)上培养。

E.细胞培养条件

根据本公开的培养条件将依赖于所使用的培养基和干细胞被适当地定义。根据本公开的培养基可以使用用于培养动物细胞的培养基作为其基础培养基来制备。作为基础培养基，可以使用E8，TeSR，BME，BGJb，CMRL 1066，Glasgow MEM，改良的MEM Zinc Option，IMDM，培养基199，Eagle MEM，αMEM，DMEM，Ham，RPMI 1640和Fischer’s培养基中的任何一种以及它们的任何组合，但培养基不特别地仅限于此，只要它可以用于培养动物细胞。

在特定方面，根据本公开的培养基是无血清培养基。无血清培养基是指没有未加工或未纯化的血清的培养基，由此可以包括具有纯化的血液来源成分或动物组织来源成分(如生长因子)的培养基。根据本公开的培养基可以含有或不含有血清的任何替代物。血清的替代物可以包括适当地含有白蛋白(如富含脂质的白蛋白、白蛋白替代物比如重组白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解产物)、转铁蛋白(或其他铁转运者)、脂肪酸、胰岛素、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-巯基甘油或其等效物的材料。血清替代物可以通过例如国际公布号98/30679号中公开的方法制备。或者，为了更方便，可以使用任何商用材料。可用的商用材料包括敲除血清替换品(KSR)、化学限定的浓缩脂质(Gibco)和Glutamax(Gibco)。

本公开的培养基还可以包含脂肪酸或脂质、氨基酸(如非必需氨基酸)、一种或多种维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以是例如约0.05至1.0mM，尤其是约0.1至0.5mM，但浓度不特别地仅限于此，只要其适合培养干细胞。

用于培养干细胞的培养容器可以包括但不特别限于：烧瓶、组织培养瓶、皿(dish)、培养皿(petri dish)、组织培养皿、多培养皿、微板(miro plate)、微孔板(micro-well plate)、多孔板(multi plate)、多孔板(multi-well plate)、微载玻片、腔室载玻片、管、托盘、腔室、培养袋、滚瓶和生物反应器，如PBS500和/或PBS3，只要它能够在其中培养干细胞。根据培养的需要，干细胞可以以至少或约0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50ml、100ml、150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、800ml、1000ml、1500ml、2000ml或其中可衍生的任何范围的体积进行培养。在一特定实施方案中，培养容器可以是生物反应器，其可以是指支持生物活性环境的任何装置或系统。生物反应器的体积可至少或约为2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500升，1、2、4、6、8、10、15立方米，或其中可衍生的任何范围。

培养容器可以是细胞粘附或非粘附的，并根据目的进行选择。细胞粘附性培养容器可以用任何用于细胞粘附的基底进行包被，比如用细胞外基质(ECM)去改善容器表面对细胞的粘附性。用于细胞粘附的基底可以是意在附着干细胞或饲养细胞(如果使用)的任何材料。用于细胞黏附的基底包括胶原蛋白、明胶、聚L-赖氨酸、聚D-赖氨酸、层粘连蛋白和纤连蛋白及其混合物(例如Matrigel^TM)，以及裂解的细胞膜制备物(Klimanskaya等人，2005)。

可以适当地限定其他培养条件。例如，培养温度可以是约30至40℃，例如至少或约为31、32、33、34、35、36、37、38、39℃，但特别不限于这些。CO₂浓度可以是约1％至10％，例如约2％至5％，或其中可衍生的任何范围。氧分压可以是至少或约1，5，8，10，20％，或其中可衍生的任何范围。

本公开的方法也可用于干细胞的悬浮培养，包括载体上的悬浮培养(Fernandes等人，2007)或凝胶/生物聚合物包封培养(美国专利20070116680)。术语干细胞的悬浮培养指的是干细胞在关于培养基中的培养容器或饲养细胞(如果使用)为非贴壁条件下进行的培养。干细胞的悬浮培养包括干细胞的解离培养和干细胞的聚集体悬浮培养。术语干细胞的解离培养指的是将悬浮的干细胞进行培养，并且干细胞的解离培养包括单个干细胞的解离培养或由多个干细胞组成的小细胞聚集体的解离培养(例如，约2至400个细胞)。当继续进行上述解离培养时，培养的解离细胞形成更大的干细胞聚集体，然后可以进行聚集体悬浮培养。聚集体悬浮培养包括胚状体培养方法(参见Keller等人，1995)和SFEB方法(Watanabe等人，2005)；国际公布号2005/123902号)。本公开的方法可以显著改进悬浮培养中干细胞的存活率和/或分化效率。

生物反应器可以根据一般类别进行分组，包括：静态生物反应器，搅拌瓶生物反应器，旋转壁容器生物反应器，中空纤维生物反应器和直接灌流生物反应器。在生物反应器内，细胞可以是游离的或固定的，接种在多孔三维支架(水凝胶)上。在某些方面，生物反应器是用于与均质性颗粒悬浮和低剪切应力有效混合的悬浮生物反应器。

F.GMP制造过程

本文所公开的使用的方法可以使用所有与GMP相容的材料，并且可以调整规模至多个(例如3L)生物反应器制造批次，以得到心脏细胞疗法开发所需的纯度和细胞数。如图2B所示，多层培养容器中iPSC扩增的规模产生了接种多个3L生物反应器所需的足够iPSC。制造过程中的CTC4低温保存步骤可以规模扩大到冷冻高达每瓶300x10⁶个CTC4细胞(图2C)，这可以减少在大型动物模型或未来临床研究中的临床前开发过程中的小瓶解冻和处理。

G.定向心脏祖细胞(CTC4细胞)的表征

根据本文方法获得的细胞可以根据许多表型标准进行表征。CTC4细胞可以具有下调的多能基因，同时表达已知的心脏基因，如图6A-B所示，并且可以由独特的细胞表面标志物组合CD56⁺PDGFRA⁺KDR^-CXCR4^-EPCAM^-来表征(图7B)。来源于多能干细胞系的心肌细胞和前体细胞通常具有来自其他来源的心肌细胞的形态学特征。它们可以是纺锤形、圆形、三角形或多角形，并且它们可能显示出可通过免疫染色检测到的肌节结构特征性的条纹。它们可能形成扁平的细胞层，或保持附着在基质上或漂浮在悬浮液中的聚集体，当用电子显微术检查时它们显示出典型的肌节和心房颗粒。

多能干细胞衍生的心肌细胞及其前体通常具有至少一种心肌细胞特异性标志物，包括心脏肌钙蛋白I(cTnI)，肌钙蛋白复合物的一种亚基，其为横纹肌收缩的调节提供钙离子敏感性分子开关，心脏肌钙蛋白T(cTnT)，或Nkx2.5，一种在早期小鼠胚胎发育期间在心脏中胚层中表达的心脏转录因子，其持续存在于发育中的心脏内。这些细胞通常还会表达至少一种(且通常至少3、5或更多种)以下标志物，包括心房利钠因子(ANF)，肌球蛋白重链(MHC)，尤其是心脏特异性β链，MLC，Titin，原肌球蛋白，α-肌节辅肌动蛋白和结蛋白。ANF是一种在发育中的心脏和胎儿心肌细胞中表达的激素，但在成年体中被下调。它被认为是心肌细胞的良好标志物，因为它在心脏细胞而非骨骼肌细胞中以高度特异性的方式表达。其他标志物包括MEF-2A，MEF-2B，MEF-2C，MEF-2D(在心脏中胚层中表达并持续存在于发育中心脏内的转录因子)，在心脏细胞之间介导粘附的N-钙粘蛋白，形成心肌细胞之间的间隙连接的连接蛋白43，β1-肾上腺素受体(β1-AR)、肌酸激酶MB(CK-MB)和肌红蛋白(在心肌梗塞后在血清中升高)，α-心脏肌动蛋白，早期生长应答-I，细胞周期蛋白D2和GATA-4(在心脏中胚层中高度表达并持续存在于发育中心脏内的转录因子)。它调节许多心脏基因，并在心脏发生中发挥作用。

可以使用任何合适的免疫技术检测组织特异性标志物—比如对细胞表面标志物使用流式免疫细胞术或亲和吸附，对细胞内或细胞表面标志物使用免疫细胞化学(例如被固定的细胞或组织切片)，对细胞提取物使用Western印迹分析，以及对细胞提取物或分泌到培养基中的产物使用酶联免疫测定。将如cTnI和cTnT等心脏标志物与其他同等型区分开来的抗体可以从Sigma和Spectral Diagnostics等供应商获取。如果在标准免疫细胞化学或流式细胞术测定中，可选地在固定细胞后，且可选地使用被标记的二抗后，显著可检测量的抗体将与抗原结合，则称细胞的抗原表达是抗体可检测的。

还可以在mRNA水平上检测组织特异性基因产物的表达，其通过Northern印迹分析，斑点印迹杂交分析，或通过利用公开可获的序列数据(GenBank)在标准扩增方法中使用序列特异性引物由逆转录酶引发的聚合酶链反应(RT-PCR)。在蛋白质水平或mRNA水平检测到的组织特异性标志物的表达被认为呈阳性，如果该水平至少或约为对照细胞的水平的2、3、4、5、6、7、8或9倍，更甚者超过对照细胞水平的10、20、30、40或50倍，所述对照细胞比如未分化的多能干细胞或其他不相关的细胞类型。

一旦在所需表型的细胞表面鉴定出标志物，它们就可以用于免疫选择以进一步富集群体，这通过如免疫淘选或抗体介导的荧光激活的细胞分选等技术进行。

在适当的情况下，多能干细胞衍生的心肌细胞通常表现出自发的周期性收缩活性。这意味着当它们在具有适当Ca²⁺浓度和电解质平衡的合适的组织培养环境中进行培养时，无需向培养基中添加任何其他组分，就可以观察到细胞在细胞的一个轴上收缩，然后从收缩中释放。收缩是周期性的，这意味着它们定期或不定期地重复，频率为每分钟约6至200次收缩，并且在正常缓冲液中往往是每分钟约20至约90次收缩。个体细胞可能单独表现出自发的周期性收缩活性，或者它们可以与组织、细胞聚集体或培养的细胞团中的相邻细胞一起表现出自发的周期性收缩活性。

细胞的收缩活性可以根据培养条件对收缩性质和频率的影响来表征。降低可用Ca²⁺浓度或以其他方式干扰Ca²⁺跨膜转运的化合物往往会影响收缩活性。例如，L型钙通道阻断剂地尔硫卓(diltiazem)以剂量依赖性方式抑制收缩活性。另一方面，肾上腺素受体激动剂如异丙肾上腺素和苯肾上腺素具有正性变时作用。细胞功能特性的进一步表征可以涉及表征Na⁺，K⁺和Ca²⁺的通道。可以通过对心肌细胞进行膜片钳分析来研究电生理，如动作电位。参见Igelmund等人，1999；Wobus等人，1995；和Doevendans等人，2000年。

功能属性提供了一种体外表征细胞及其前体的方式，但对于本公开中提到的一些用途可能并非必需。例如，如果混合细胞群能够植入到受损心脏组织中，并能够体内获得补充心脏功能所需的功能特性，那么富含带有上述一些标志物而非所有功能性或电生理性特性的细胞的混合细胞群可能具有相当大的治疗益处。

如果来源于已建立的多能干细胞系，那么本公开的细胞群和分离的细胞可以被表征为具有与衍生其的细胞系相同的基因组。这意味着多能干细胞和心脏细胞之间的染色体DNA将超过90％相同，如果心脏细胞是在正常的有丝分裂过程中从未分化细胞系中获得的，则可以推断出这一点。心肌细胞谱系细胞来源于母细胞群的特征在几个方面很重要。特别是，未分化的细胞群可用于产生具有共享基因组的另外的细胞，可以是另一批心脏细胞或可能用于治疗的另一种细胞类型，比如使患者预先耐受心脏同种异体移植的组织相容性类型的细胞群(US2002/0086005；WO 03/050251)。

Ⅳ.使用方法

由某些方面的方法和组合物所提供的CTC4细胞或由其衍生的细胞，如心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞，可用于多种应用。这些包括但不限于体内细胞移植或植入；体外筛选细胞毒性化合物、致癌物、诱变剂生长/调节因子、药物化合物等；阐明心脏疾病和损伤的机制；研究药物和/或生长因子的作用机制；诊断和监测患者中的癌症；基因疗法；以及生物活性产品的生产。

本公开的CTC4细胞或由其衍生的细胞，如心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞，可在商业上用于筛选影响这类细胞及其各种后代的特征的因子(如溶剂、小分子药物、肽、寡核苷酸)或环境条件(如培养条件或操作)。

在一些方面，CTC4细胞或由其衍生的细胞，如心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞，被用于筛选促进成熟成为更后期的心肌细胞前体或终末分化细胞的因子，或被用于在长期培养中促进增殖和维持这类细胞。例如，通过以下来测试候选成熟因子或生长因子：将其添加到不同孔中的细胞中，然后根据进一步培养和细胞的使用的期望标准来确定所产生的任何表型变化。

本公开的其他筛选应用涉及测试药物化合物对心肌组织维持或修复的影响。可以进行筛选，因为该化合物被设计为对细胞具有药理作用，或者因为被设计为在其他地方具有作用的化合物可能对这种组织类型的细胞具有无意的副作用。可以使用本公开的任何前体细胞或终末分化细胞进行筛选。

读者通常可以参考标准教科书In vitro Methods in PharmaceuticalResearch，Academic Press，1997，以及美国专利号5,030,015。候选药物化合物活性的评估通常涉及将本公开的分化细胞与候选化合物组合，单独地或与其他药物组合地。研究者确定可归因于该化合物的细胞的形态、标志物表型或功能活性的任何变化(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞相比)，然后将该化合物的作用与观察到的变化相关联。

细胞毒性首先可以通过其对细胞活力、存活率、形态以及某些标志物和受体表达的影响来确定。药物对染色体DNA的影响可以通过测量DNA合成或修复来确定。[³H]-胸腺嘧啶或BrdU的掺入(尤其是在细胞周期的非计划时间里)或高于细胞复制所需的水平，与药物作用一致。不想要的影响还可能包括姐妹染色单体的异常交换率，这是由中期扩散决定的。读者可以参考Vickers(375-410段，In vitro Methods in Pharmaceutical Research,Academic Press,1997)以了解更多详情。

可以使用任何标准测定法以在细胞培养中或体内观察心肌细胞的表型或活性，如标志物表达、受体结合、收缩活性或电生理，从而评估对细胞功能的影响。还可以测试药物候选物对收缩活动的影响，比如它们是否增多或降低收缩的程度或频率。如果观察到影响，可以滴定化合物的浓度以确定中位有效剂量(ED₅₀)。

本公开进一步提供了筛选对人心血管祖细胞、心血管集落、心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞有影响的试剂的方法。该方法包括将来自上文所述细胞群之一的细胞与候选试剂接触，并确定该试剂是否对细胞群有影响。待测试试剂可以是天然的或合成的，是一种化合物或混合物，小分子或聚合物(包括多肽、多糖、多核苷酸等)，抗体或其片段，来自天然的或合成化合物的文库的化合物，从合理的药物设计获得的化合物(如细胞培养条件的条件)，或对细胞群的影响可以使用本领域已知的测定法进行评估的任何试剂。对细胞群的影响可以通过对表型或活性的任何标准测定法来确定，包括例如针对标志物表达、受体结合、收缩活性、电生理、细胞活力、存活、形态或DNA合成或修复的测定法。标准增殖和分化测定法如美国专利号6,110,739所描述。这类试剂可用于控制体内和体外的细胞生长、分化和存活，以及组织维持、再生和修复。

A.药物组合物

本公开进一步提供了包含定向心脏祖细胞或由其衍生的细胞(如心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞)的群的组合物。所述组合物可包含药学上可接受的载体和稀释剂。所述组合物可进一步包含促进植入的成分。包含这些细胞群的组合物可用于细胞和组织的替代和修复，以及体外和体内产生心肌细胞群。包含CTC4细胞的组合物可用于扩增祖细胞群。所述组合物可以配制成用于治疗心脏病况的药物或递送装置。

本公开的CTC4细胞或由其衍生的细胞，例如心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞，可以以药物组合物的形式提供，所述药物组合物包含在足够无菌的条件下制备的等渗赋形剂以用于人类施用。在某些方面，可能期望使用蛋白酶或通过温和的机械操作将细胞分散成为单个细胞或较小集簇的悬浮液。为了降低移植后细胞死亡的风险，可以在施用前约24小时，通过热休克处理细胞或用约0.5U/mL红细胞生成素培养细胞。

关于医药制剂的一般性原则，读者可以参考Cell Therapy:Stem CellTransplantation,Gene Therapy,and Cellular Immunotherapy,1996；以及HematopoeticStem Cell Therapy,2000。细胞赋形剂和组合物的任何伴随要素的选择将根据用于施用的途径和装置进行调整。该组合物还可以包含或伴随有一种或多种促进心肌细胞移植或功能性动员的其他成分。合适的成分包括支持或促进心肌细胞或代偿性细胞类型(尤其是内皮细胞)粘附的基质蛋白。

本公开还包括一种试剂系统，其包含存在于制造、分配或使用期间的任何时间的一组细胞或细胞组合。细胞组包括本公开所述的两种或更多种细胞群的任何组合，例如但不限于一种类型的分化细胞(心肌细胞、心肌细胞前体等)与未分化多能干细胞或其他分化细胞类型组合，通常共享相同的基因组。细胞组中的每种细胞类型可以是包装在一起的，或者是在同一设施中的分别的容器中，或者在不同的位置，在相同或不同的时间，在同一实体或共享业务关系的不同实体的控制下。

本公开的药物组合物可以任选地包装在适当的容器中，并附带有期望目的的书面说明，所述期望目的比如重建CTC4细胞或从其衍生的细胞，比如心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞，以改善疾病状况或心肌的异常。

B.治疗用途

本公开的某些方面提供的细胞可用于治疗任何有需要的受试者。可能适合这种治疗的人类病况包括心脏病症，如心肌梗塞、心肌病、充血性心力衰竭、室间隔缺损、房间隔缺损、先天性心脏缺陷、室壁瘤、源于儿科的心脏病症、室壁瘤或需要心室重建的心脏病症。

对于人体治疗，剂量通常在约10⁸至10¹²个细胞之间，往往在约2×10⁸至1×10⁹个细胞之间，根据受试者的体重、病痛的性质和严重程度，以及所施用细胞的复制能力进行调整。确定治疗模式和适当剂量的最终责任在于管理的临床医生。

某些方面还提供了使用CTC4细胞来增强心肌的组织维持或修复以满足任何所认为的需求，比如代谢功能的先天性错误，疾病状况的影响，或重大创伤的结果。

为了确定细胞组合物对于治疗施用的适用性，可以首先在合适的动物模型中测试细胞。在一个层面上，对细胞体内存活和维持其表型的能力进行评估。将细胞组合物施用于免疫缺陷动物(比如NUDE大鼠，或通过化学或辐射致使免疫缺陷的动物)。在植入一段时间后收集组织，并评估多能干细胞衍生的细胞是否仍然存在。显示CTC4细胞植入并在注射后至少30天存活(图8B)。通过将hAlu+细胞用间隙连接蛋白连接蛋白43(CX43)和结构蛋白心肌肌钙蛋白T(CTNT)共染色，如图8C所示CTC4细胞也能继续分化为心肌细胞。

体内追踪细胞的其他方法可以是通过施用表达可检测标记(比如绿色荧光蛋白或β-半乳糖苷酶)的细胞；经提前标记的细胞(比如，用BrdU或[³H]胸腺嘧啶)，或通过对组成型细胞标志物的随后检测(比如，使用人特异性抗体)。被施用细胞的存在和表型可以通过使用人特异性抗体的免疫组织化学或ELISA，或通过使用导致特异于人多核苷酸的扩增的引物和杂交条件的RT-PCR分析(根据公布的序列数据)，来进行评估。

还可以通过评估由来源于多能干细胞的心肌细胞群的治疗产生的心脏恢复程度来确定适用性。许多动物模型可用于此类测试。例如，通过将预冷的铝棒接触到左心室前壁表面，可以将心脏低温损伤(Murry等人，1996；Reinecke等人，1999；美国专利号6,099,832；Reinecke等人，2004)。在较大的动物中，可以通过将在液氮中冷却的30-50毫米铜盘探针放置在左心室前壁上约20分钟来实现低温损伤(Chiu等，1995)。梗塞可以通过结扎左主干冠状动脉来诱发(Li等，1997)。损伤部位用本公开的细胞制备物进行处理，并且通过组织学检查心脏组织，检查受损区域中是否存在细胞。可以通过确定左心室末期舒张压、发展压、压力上升率和压力衰减率等参数来监测心脏功能。

经过充分测试后，本公开的分化细胞可以用于需要这种治疗的人类患者或其他受试者中的组织重建或再生。以允许细胞植入或迁移到意图的组织部位并重建或再生功能性缺陷区域的方式施用细胞。适合于将能够重建心脏功能的细胞直接施用于所需位置的心腔、心包或心肌内部的特殊装置是可获的。

在期望的情况下，接受多能干细胞衍生的CTC4细胞同种异体移植的患者可以被治疗以减少移植细胞的免疫排斥反应。涵盖的方法包括传统免疫抑制药物如环孢菌素A的施用(Dunn等人，药物61:1957,2001)，或使用相匹配的多能干细胞衍生的细胞群来诱导免疫耐受(WO 02/44343；美国专利号6,280,718；WO 03/050251)。另一种方法是调整CTC4细胞群以减少移植到受试者体内后细胞产生的尿酸量，例如，通过用别嘌呤醇处理细胞。作为替代或相结合地，施用别嘌呤醇或代谢尿酸的酶(如尿酸氧化酶)以对患者进行准备(PCT/US04/42917)。

适合接受根据本文方法的再生药物的患者包括患有各种急性和慢性心脏病况的患者，比如冠心病，心肌病，心内膜炎，先天性心血管缺陷和充血性心力衰竭。治疗效果可以通过临床接受的标准进行监测，比如瘢痕组织所占据的面积的减少或瘢痕组织的再血管化，以及心绞痛的频率和严重程度的降低；或发展压、收缩压、末期舒张压、患者活动能力和生活质量的改善。

在另一个实施方案中，本公开提供了细胞替代方法和组织替代方法，其可用于治疗以心脏功能不足为特征的疾病，包括例如，先天性心脏病、冠心病、心肌病、心内膜炎和充血性心力衰竭。分化的细胞和心血管祖细胞都可用于替代疗法，因为祖细胞群能够体内分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌谱系。这些细胞也可用于体外产生心血管组织。工程化心脏组织的方法在本领域是已知的，例如Birla在“Stem Cell Therapy and TissueEngineering for Cardiovascular Repair”Springer，2006中进行了综述。相应地，在一个实施方案中，本公开提供了一种心肌细胞替代疗法的方法，其包括向需要这种治疗的受试者施用组合物，所述组合物包含从根据本公开获得的富含人心血管祖细胞的细胞群中分离的心肌细胞。在另一个实施方案中，本公开提供了一种治疗以心脏功能不足为特征的病症的方法，包括向需要这种治疗的受试者施用含有人心血管祖细胞的组合物。在一优选实施方案中，受试者是人。可以通过导致递送或迁移至心脏组织的途径施用该组合物，包括例如注射或移植，并且在导致至少一种不良作用或症状或病症减少的条件下施用。

关于本公开的治疗方法，并不意图将CTC4细胞对哺乳动物的施用方式限于特定的施用模式、剂量或给药频率；本公开考虑了所有施用模式，包括肌内、静脉内、关节内、病灶内、皮下或足以提供足够预防或治疗疾病的剂量的任何其他途径。CTC4细胞可以以单剂量或多剂量施用给哺乳动物。当施用多剂量时，各剂量之间可以相隔例如一周，一个月，一年或十年。也可以在施用细胞之前、期间或之后，施用一种或多种生长因子、激素、白细胞介素、细胞因子、小分子或其他细胞，以进一步使它们偏向特定细胞类型。

Ⅴ.实施例

包括了以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本发明实践中能很好地发挥作用的技术，并因此可以被认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应该明白，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施方案中进行许多更改，并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1—iPSC衍生的心脏祖细胞

将iPSC解解冻并在Essential 8培养基(E8)中的玻连蛋白包被的板(2.5μg/mL)上在无饲养层的单层培养上扩增3天。对培养基进行每天更换。

在悬浮分化的第0天，通过用TrypLE收集iPSC，用E8洗涤并重新悬浮于包含E8、1μMH1152(Rho激酶抑制剂)和2μM CHIR99021(Wnt激动剂)的聚集体形成培养基中，来启动聚集体形成和中胚层诱导。将细胞密度调节至1x10⁶个细胞/mL，并对生物反应器(PBS500或PBS3)进行接种。

在第1天，通过使聚集体沉降，然后将80％的培养基用RPMI+B27(不含胰岛素)和5μM CHIR 99021进行更换，以将聚集体转到新培养基。通过使聚集体首先沉降，然后将80％的培养基用RPMI，B27(不含胰岛素)和4.4μM CHIR 99021进行更换，以补给第2天的聚集体。

对于心脏特化，首先使第3天的聚集体沉降，然后将80％的培养基用RPMI，B27(含胰岛素)和10μM XAV939(Wnt抑制剂)进行更换。在一些情况下，对于特定iPSC，添加了另外的小分子以有效诱导心脏特化。例如，这些小分子包括2μM SB431542(TGFβ/激活素抑制剂)和/或1-2μMDorsomorphin(BMP抑制剂)。

随着细胞继续向心肌细胞谱系特化，培养物的补给与前几天相似。在第4天和第5天，首先沉降聚集体，然后将80％的培养基用RPMI和B27(含胰岛素)进行更换。整个过程是无血清的且没有使用药物抗性选择。

在第6天，细胞有了一个确定的命运，但尚未分化为心肌细胞。收获聚集体并用D-PBS(-/-)洗涤，然后用TrypLE解离，并使用可控速率的冷冻机在CryoStor CS10中以单细胞悬浮液进行低温保存。

对心脏祖细胞的心脏中胚层标志物(即KDR、CKIT和PDFGRα)和心肌细胞标志物(即SAA和SMA)进行分析。该分化方法使得心肌细胞具有多于95％的SAA。因此，本方法有效地产生了定向的心脏祖细胞和心肌细胞。

实施例2—鉴别分化阶段以添加Wnt抑制

心脏分化过程中需要Wnt抑制的时间点从未得到很好的描述。细胞表面标志物CXCR4和CD56可用于监测培养物的状态，并帮助确定何时应使用Wnt抑制。

从PBS500或PBS3生物反应器培养物中取出第1-6天的聚集体样品，对其进行解离并针对CXCR4和CD56进行染色。每天细胞群都转移为具有不同的表达谱，首先显示CXCR4的表达，然后是双阳性CXCR4^posCD56^pos细胞，并且最后到第4-6天失去CXCR4的表达。

如果培养物在第3天表达过多CD56或已经开始失去CXCR4的表达，那么抑制Wnt信号传导并使培养物特化为心肌细胞的命运就已为时已晚。然而，发现如果CXCR4阳性细胞群也刚刚开始表达CD56，则会出现有效的心脏特化。CD56的稳健表达是使用过多CHIR 99021或细胞密度过低的一个指示。

潜在的心脏分化失败的另一个指示是，在第2天表达过多的CXCR4。这是在第2天之前使用了过多的CHIR 99021的一个清晰的指示。

实施例3—分化规模

这种心脏分化最初是使用PBS500容器开发的，然而，这种规模太小而无法制造1x10⁸-1x10⁹个细胞的细胞疗法剂量(图2B)。使用PBS500形式进行体积、PBS轮速、pH和溶解氧的检查，并将其应用于使用多个PBS3生物反应器以优化临床相关的分化规模。

实施例4—低温保存规模

标准1.5-2.0ml冷冻瓶可用于低温保存iPSC衍生的产物的小规模样品。测试了多个不同尺寸的Aseptic Technologies的冷冻瓶，目的是在一个小瓶中低温保存足够的、可用作临床剂量的定向心脏祖细胞。对多种AT小瓶尺寸进行了测试，并确定了AT6小瓶允许每个小瓶具有临床相关剂量(图2C)。测试出每个小瓶冷冻多达300x10⁶个细胞，并且所得细胞通过了所有质量放行测定。

实施例4—定向心脏祖细胞表达特定标志物

进行了一项时间进程研究，该研究在分化过程中每天测试多种标志物。从第1天到第3天有明显的CXCR4和PDGFRα的诱导，表明心脏中胚层的特化(图3B)。还检测到了KDR的动态表达，其中在第4天观察到最高表达，随后在第5天和第6天迅速下调(图5A)。CD56也在第3天期间被诱导，并在整个分化过程中维持。监测到EpCAM的表达在该过程中每天都减少更多，并到第6天时产生了少于10％的阳性细胞(图4)。到第6天，心肌细胞结构蛋白的表达也最小。

实施例5—定向心脏祖细胞变为心肌细胞

将第6天的CTC4细胞解冻并铺板，以测试其心肌细胞的分化潜力。将不同密度的细胞接种到在RPMI和B27(含胰岛素)中的玻连蛋白包被的容器上，并培养约7天(图7A)。培养基每隔一天更换一次，以总体积更换。单层细胞在被铺板2-6天后开始收缩。收获收缩的细胞，并通过流式细胞术分析心肌细胞特异性标志物。所分析的细胞超过90％是肌节α辅肌动蛋白阳性的(图7D)。

第6天的CTC4细胞也被铺板培养到RPMI和B27(含胰岛素)中的玻连蛋白包被的96孔板中，并培养7天。通过免疫细胞化学对细胞进行针对各种心肌细胞标志物的染色，并对心脏肌钙蛋白T、心脏肌钙蛋白I和肌节α辅肌动蛋白的染色呈阳性。还对细胞进行了针对心脏特异性转录因子NKX2.5的染色(图7C)。

实施例6—在心肌梗塞模型中植入定向心脏祖细胞(CTC4)

使用NUDE大鼠心肌梗塞模型来测试CTC4细胞的移植和分化(图8A-C)。梗塞后三天，将CTC4细胞解冻、计数并重悬于5％的Flexbumin中。通过直接注射到多个注射部位来施用细胞。注射后一个月，收获心脏并使用免疫组织化学或人Alu的原位杂交检测方法对人细胞进行染色。一旦在大鼠心肌内的特定部位发现人细胞，将处理更多的连续切片，并使用免疫组织化学方法对心脏肌钙蛋白T(心肌细胞)、Ki67(增殖)和CX43(间隙连接)标志物进行染色。注射后一个月检测到人细胞，并且稳健表达心脏肌钙蛋白T和CX43，这表明CTC4细胞继续体内分化，并成为电偶联的心肌细胞。此外，还对少量细胞进行了Ki67染色，表明人植入物部位具有轻微扩增的潜力。

实施例7—定向心脏祖细胞分化为血管内皮细胞或平滑肌细胞

进行了研究以显示定向心脏祖细胞具有进一步分化为其他细胞谱系的潜力，如内皮细胞(CD31+CD144+)和平滑肌细胞(CD140b+CD90+)(图9)。iPSC衍生的定向心脏祖细胞在含有特定生长因子的RPMI+B27培养基中培养。将定向心脏祖细胞在含有FGF和/或VEGF的培养基中培养约7天，以产生血管内皮细胞或平滑肌细胞。

***

根据本公开，本文公开和要求保护的所有方法都可以在没有过度实验的情况下完成和执行。虽然本发明的组合物和方法已经以优选实施方案的形式进行了描述，但是对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文描述的方法进行改变，以及对方法中的步骤或步骤顺序进行改变。更具体地说，将显而易见的是，可以用某些化学和生理学上相关的试剂来替代本文所述的试剂，而达到相同或类似的效果。所有这些对本领域技术人员来说显而易见的类似替代和修改都被视为在所附权利要求书中所定义的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

以下参考文献，在提供了补充本文所述内容的示例性程序或其他细节的范围内，均通过引用并入本文。

Amit等人,Dev.Bio.,227:271-278,2000.

Byrne等人,Nature,450(7169):497-502,2007.

Doevendans等人,J.Mol.Cell Cardiol.,32:839,2000.

Dunn等人,Drugs 61:1957,2001.

Fernandes等人,J.Biotechnology,132(2):227-236,2007.Igelmund等人,Pflugers Arch.,437:669,1999.

国际专利公布号PCT/JP2009/062911

国际专利公布号PCT/JP2011/069588

国际专利公布号WO 02/44343

国际专利公布号WO 03/050251

国际专利公布号WO 03/050251

国际专利公布号WO 2007/069666

国际专利公布号WO 2007/069666

国际专利公布号WO2005/123902

国际专利公布号WO98/30679

Keller等人,Curr.Opin.Cell Biol.,7:862-869,1995.

Klimanskaya等人,Lancet.,365:P1636-1641,2005.

Ludwig等人,Nat.Biotechnol.,24:185-187,2006b.

Ludwig等人,Nat.Methods,3:637-646,2006a.

Takahashi等人,Cell,131,861-872,2007.

Thomson and Marshall,Curr.Top.Dev.Biol.,38:133-165,1998.Thomson andOdorico,Trends Biotechnol.,18(2):53-57,2000.Thomson等人Proc.Natl.Acad.Scie.USA,92:7844-7848,1995.美国申请号12/478,154

美国专利号8,546,140

美国专利号5,843,780

美国专利号5,843,780

美国专利号6,103,470

美国专利号6,110,739

美国专利号6,200,806

美国专利号6,280,718

美国专利号6,416,998

美国专利号7,029,913

美国专利号7,442,548

美国专利号7,598,364

美国专利号7,989,425

美国专利号8,058,065

美国专利号8,071,369

美国专利号8,129,187

美国专利号8,183,038

美国专利号8,268,620

美国专利号8,268,620

美国专利号8,546,140

美国专利号8,546,140

美国专利号8,691,574

美国专利号8,691,574

美国专利号8,741,648

美国专利号8,741,648

美国专利号8,741,648

美国专利号8,900,871

美国专利号9,175,268

美国专利公布号2003/0211603

美国专利公布号2009/0246875

美国专利公布号2010/0210014

美国专利公布号2011/0104125

美国专利公布号2012/0276636

美国专利公布号2015/0191697

美国专利公布号US2002/0086005

美国专利20070116680

Watanabe等人,Nature Neurosci.,8:288-296,2005.

Wobus等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.,27:752,1995.

Xu等人,Nat.Biotechnol.,19:971-974,2001.

Yu等人,Science,318:1917-1920,2007.

Claims (99)

1.一种用于产生人多能干细胞(PSC)衍生的定向心脏祖细胞的体外方法，包括：

(a)在Wnt激动剂和存活剂的存在下培养PSC，所述Wnt激动剂存在以启动分化，所述存活剂存在以形成细胞聚集体；

(b)在Wnt激动剂存在下进一步培养所述细胞聚集体达一段足以产生中胚层细胞群的时间；以及

(c)在Wnt抑制剂存在下分化所述中胚层细胞群以促进心脏特化，从而产生定向心脏祖细胞群。

2.权利要求1所述的方法，其中所述PSC是诱导性多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。

3.权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)之前，将所述PSC在由细胞外基质包被的表面上进行培养。

4.权利要求3所述的方法，其中所述细胞外基质包含玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、MATRIGEL^TM和/或纤连蛋白。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述存活剂为Rho相关激酶(ROCK)抑制剂或肌球蛋白II抑制剂。

6.权利要求5所述的方法，其中所述ROCK抑制剂为H1152或Y-27632。

7.权利要求5所述的方法，其中所述肌球蛋白II抑制剂为布比他汀(blebbistatin)。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述方法包括在悬浮培养中培养细胞。

9.权利要求8所述的方法，其中所述悬浮培养在一个或多个生物反应器中进行。

10.权利要求1-9所述的方法，其中步骤(a)的Wnt激动剂为CHIR 99021、SB216763、CHIR98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314或IM-12。

11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述Wnt激动剂为CHIR 99021。

12.权利要求11所述的方法，其中所述CHIR 99021以约1μM至10μM的浓度存在于培养物中。

13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中步骤(a)进行1-2天。

14.权利要求1-13中任一项所述的方法，其中步骤(b)的培养不包含或基本不包含胰岛素。

15.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(b)的Wnt信号传导激动剂为CHIR99021、SB216763、CHIR 98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314或IM-12。

16.权利要求1-14中任一项所述的方法，其中步骤(b)的Wnt信号传导激动剂为CHIR99021。

17.权利要求16所述的方法，其中所述CHIR 99021以1μM至10μM的浓度存在于培养物中。

18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(a)进行约24小时。

19.权利要求1-18中任一项所述的方法，其中步骤(b)的培养进一步包含激活素/Nodal激动剂，和/或BMP。

20.权利要求19所述的方法，其中所述激活素/Nodal激动剂为激活素A或Nodal。

21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中步骤(b)进行1-5天。

22.权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述中胚层细胞表达KDR、PDGFRα、CXCR4和/或CD56。

23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中至少5％的所述中胚层细胞群在步骤(c)之前或期间表达CD56。

24.权利要求1-23中任一项所述的方法，其中至少40％的所述中胚层细胞群在步骤(c)之前或期间表达KDR和PDGFRα。

25.权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述中胚层细胞群在步骤(c)之前对CXCR4和CD56呈阳性。

26.权利要求1-25中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之前，至少20％的所述中胚层细胞群对CXCR4呈阳性以及少于60％的所述中胚层细胞群对CD56呈阳性。

27.权利要求1-26中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括当至少20％的所述中胚层细胞群对CXCR4呈阳性以及少于60％的所述中胚层细胞群对CD56呈阳性时，添加Wnt抑制剂。

28.权利要求1-25中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之前，至少30％的所述中胚层细胞群对CXCR4呈阳性以及少于60％的所述中胚层细胞群对CD56呈阳性。

29.权利要求1-28中任一项所述的方法，其中步骤(c)的Wnt抑制剂为XAV939、IWR1、IWR2、IWR3、IWR4、ICG-001、IWR-1-endo、Wnt-C59、LGK-974、LF3、CP21R7、NCB-0846、PNU-74654或KYA179K。

30.权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述Wnt抑制剂为XAV939。

31.权利要求30所述的方法，其中所述XAV939以5μM至10μM的浓度存在于培养物中。

32.权利要求1-31中任一项所述的方法，其中步骤(c)的培养进一步包含TGFβ抑制剂。

33.权利要求32中任一项所述的方法，其中所述TGFβ抑制剂为SB431542、LDN-193189、LY2157299、LY2109761、SB525334、SIS HCl、SB505124、GW788388或LY364947。

34.权利要求32中任一项所述的方法，其中所述TGFβ抑制剂为SB431542。

35.权利要求34所述的方法，其中所述SB431542以1μM至5μM的浓度存在于培养物中。

36.权利要求1-35中任一项所述的方法，其中步骤(c)的培养包含胰岛素。

37.权利要求1-36中任一项所述的方法，其中步骤(c)的培养进一步包含BMP抑制剂或AMPK抑制剂。

38.权利要求37所述的方法，其中所述BMP抑制剂为dorsomorphin、LDN193189、DMH1、DMH2或ML 347。

39.权利要求37所述的方法，其中所述BMP抑制剂为dorsomorphin。

40.权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述方法是无血清的。

41.权利要求1-40中任一项所述的方法，其中在限定培养基中进行所述培养。

42.权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述方法产生至少1x10⁷至1x10¹⁰的定向心脏祖细胞。

43.权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述方法不包括进行耐药性选择。

44.权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述定向心脏祖细胞不表达转基因。

45.权利要求1-44中任一项所述的方法，其中步骤(c)进行达1-6天。

46.权利要求1-45中任一项所述的方法，其中少于20％的所述定向心脏祖细胞群表达EpCAM。

47.权利要求1-45中任一项所述的方法，其中少于10％的所述定向心脏祖细胞群表达EpCAM。

48.权利要求1-47中任一项所述的方法，其中少于20％的所述定向心脏祖细胞群对KDR、CXCR4和/或SAA呈阳性。

49.权利要求1-48中任一项所述的方法，其中少于20％的所述定向心脏祖细胞群对EpCAM和SAA呈阳性。

50.权利要求1-48中任一项所述的方法，其中至少80％的所述定向心脏祖细胞群对PDGFRα和CD56呈阳性。

51.权利要求1-50中任一项所述的方法，其进一步包括对所述定向心脏祖细胞群进行低温保存。

52.权利要求1-51中任一项所述的方法，其进一步包括对所述定向心脏祖细胞群进行低温保存，所述定向心脏祖细胞群中至少70％对PDGFRα呈阳性、少于40％对KDR呈阳性、少于20％对EpCAM呈阳性以及少于20％对SAA呈阳性。

53.权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述方法符合良好生产规范(GMP)。

54.权利要求1-53中任一项所述的方法，其进一步包括使所述定向心脏祖细胞群成熟以产生心肌细胞。

55.权利要求54所述的方法，其中所述定向心脏祖细胞群在单层中进行培养。

56.权利要求54所述的方法，其中所述定向心脏祖细胞群在由细胞外基质包被的表面上进行培养。

57.权利要求56所述的方法，其中所述细胞外基质包含玻连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白、MATRIGEL^TM和/或纤连蛋白。

58.权利要求56所述的方法，其中所述细胞外基质包含玻连蛋白。

59.权利要求54所述的方法，其中所述心肌细胞表达CTNT、MHC、MLC、CTNI和/或肌节α辅肌动蛋白。

60.权利要求54所述的方法，其中至少80％的所述细胞对肌节α辅肌动蛋白呈阳性。

61.权利要求54所述的方法，其中用于成熟的培养物不包含Wnt抑制剂或TGFβ抑制剂。

62.权利要求50所述的方法，其中用于成熟的培养进行达2-30天。

63.权利要求1-53中任一项所述的方法，其进一步包括将所述定向心脏祖细胞群分化为血管内皮细胞群。

64.权利要求63所述的方法，其中分化包括在成纤维细胞生长因子(FGF)和/或血管内皮生长因子(VEGF)存在下对所述定向心脏祖细胞群进行培养。

65.权利要求64所述的方法，其中所述血管内皮细胞对CD33和CD144呈阳性。

66.权利要求64所述的方法，其中至少20％的所述血管内皮细胞群对CD33和CD144呈阳性。

67.权利要求1-53中任一项所述的方法，其进一步包括将所述定向心脏祖细胞群分化为平滑肌细胞群。

68.权利要求67所述的方法，其中分化包括在FGF和/或VEGF存在下对所述定向心脏祖细胞群进行培养。

69.权利要求67所述的方法，其中所述平滑肌细胞群有至少50％的细胞对CD140b和CD90呈阳性。

70.通过权利要求1-62中任一项所述的方法产生的定向心脏祖细胞群。

71.通过权利要求1-62中任一项所述的方法产生的心肌细胞、血管内皮细胞或平滑肌细胞的群。

72.一种组合物，其包含至少90％表达CD56、80％对PDGFRα呈阳性以及少于10％表达CXCR4、KDR和EpCAM的定向心脏祖细胞群。

73.权利要求72所述的组合物，其中所述定向心脏祖细胞由权利要求1-62中任一项所述的方法产生。

74.权利要求72所述的组合物，其中所述定向心脏祖细胞群符合GMP。

75.权利要求72所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。

76.一种治疗受试者中心脏病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求70至75中任一项所述的定向心脏祖细胞。

77.权利要求76所述的方法，其中将所述定向心脏祖细胞直接施用到心脏。

78.权利要求77所述的方法，其中所述施用是通过使用心肌内导管进行的。

79.权利要求76所述的方法，其中所述细胞在含有人白蛋白的悬浮液中进行施用。

80.权利要求79所述的方法，其中所述人白蛋白以1％到10％的浓度存在。

81.权利要求79所述的方法，其中所述人白蛋白以5％的浓度存在。

82.权利要求76-79中任一项所述的方法，其中所施用的定向心脏祖细胞显示出植入、细胞存活、以及成熟为心肌细胞。

83.权利要求82所述的方法，其中所述受试者为人类。

84.权利要求76-83中任一项所述的方法，其中所述心脏病症为心肌梗死、心肌病、充血性心力衰竭、室间隔缺损、房间隔缺损、先天性心脏缺损、室壁瘤、源于儿科的心脏病症、心室瘤或需要心室重建的心脏病症。

85.一种产生心脏祖细胞的方法，其包括：

(a)提供多能干细胞(PSC)；

(b)在Wnt激动剂存在下悬浮培养所述PSC以启动心脏分化；以及

(c)当细胞群由少于60％的CD56阳性细胞和多于30％的CXCR4阳性细胞构成时，添加Wnt抑制剂以促进稳健的心脏特化，从而产生心脏祖细胞群。

86.权利要求85所述的方法，其中所述心脏祖细胞能用于以心脏功能不足为特征的病症的治疗。

87.权利要求85或86所述的方法，其中所述心脏祖细胞能够体内分化为心肌细胞、内皮细胞和血管平滑肌谱系。

88.权利要求85-87中任一项所述的方法，其中所述心脏特化产生定向心脏祖细胞(CTC4)的群。

89.权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述分化发生在生物反应器中。

90.权利要求85-89中任一项所述的方法，该方法进一步包括一旦所述细胞群包含多于70％的PDGFRα阳性、少于40％的KDR阳性、少于20％的EPCAM阳性以及少于20％的肌节α辅肌动蛋白阳性的细胞时，就对其进行低温保存。

91.权利要求88-90中任一项所述的方法，其中将所述CTC4细胞低温保存。

92.权利要求85-91中任一项所述的方法，其中将所述定向心脏祖细胞直接施用到受试者的心脏中。

93.权利要求85-92中任一项所述的方法，其中在Wnt抑制剂存在下的所述分化还包含TGFβ抑制剂。

94.权利要求85-93中任一项所述的方法，其中在Wnt抑制剂存在下的所述分化还包含BMP抑制剂。

95.权利要求85-94中任一项所述的方法，其中所述方法包含无血清培养基。

96.权利要求85-95中任一项所述的方法，其中所述方法不包括进行耐药性选择。

97.权利要求85-96中任一项所述的方法，其进一步包括使所述定向心脏祖细胞群成熟以产生心肌细胞。

98.权利要求97所述的方法，其中用于成熟的培养物不包含Wnt抑制剂或TGFβ抑制剂。

99.权利要求85-98中任一项所述的方法，其中所述细胞在VEGF的添加下能进一步特化为内皮细胞或平滑肌。