KR20070058584A - 인간 배아 줄기 세포의 배양 - Google Patents

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제임스 에이 톰슨
테네일 루드위그
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위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션
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Abstract

종래 인간 배아 줄기 세포 배양 방법은 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기 위해서 영양 공급 세포인 섬유아 세포나 섬유아 세포에 노출시킨 배지가 필수적이었다. 본 발명에서는 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 지질과 함께 고농도로 섬유아 세포 성장 인자를 포함하는 배지를 사용하게 되면, 영양 공급 세포나 순화 배지를 사용하지 않고도, 다수의 계대 배양을 통해서 줄기 세포를 무한하게 미분화 상태로 유지시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또한 본 발명에서는 인간 단백질로 인간화된 메트릭스를 세포 배양용 기저 메트릭스로 사용한다. 본 발명의 배양 조건, 배지 및 메트릭스를 사용하여 제조된 신생 인간 배아 줄기 세포주는 동물 세포, 동물 생성물, 영양 공급 세포 또는 순화 배지에 전혀 노출되지 않은 것이다.
인간 배아, 줄기 세포, 배양, 분화, 미분화

Description

인간 배아 줄기 세포의 배양{CULTURING HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2005년 6월29일 출원된 미국 가출원 제60/695,110호 및 2004년 9월 8일 출원된 미국 가출원 제60/608,040호를 우선권으로 주장한다.
연방정부의 지원에 의한 연구 또는 개발과 관련된 진술문
본 명세서에 기술한 연구의 일부는 미합중국 정부의 보조금을 지원받아 수행된 것이며, 일부는 보조금의 지원을 받은 것이 아니다. 본 명세서에서 기술한 신생 인간 배아 줄기 세포주를 얻는 방법에 대한 연구는 미합중국 정부의 어떠한 보조금도 지원받지 않았다. 언급한 정도로, 본 발명은 다음의 기관: NIH RR017721에서 수여하는 미합중국 정부의 지원금으로 수행되었다. 미합중국 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 갖는다.
본 발명은 인간 배아 줄기 세포의 배양에 관한 것이다.
줄기 세포는 다양한 유형의 분화 세포로 분화할 수 있는 세포로 정의된다. 배아 줄기 세포는 배아 유래의 줄기 세포로, 성체의 대부분(모두는 아님)의 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포이다. 줄기 세포는 이의 다능성을 주목할 수 있는 데, 이는 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 의미한다. 연구 집단에 게 가장 주목받는 다능성 줄기 세포 카테고리는 인간 배아 줄기 세포(본 명세서에서는 인간 ES 세포로 축약함)이며, 이는 인간 배아에서 유래한 배아 줄기 세포이다. 인간 배아 줄기 세포는 배양 중에 무한 증식이 가능하며 또한, 적어도 이론적으로는, 기능이 상실되거나 손상된 인간 조직을 대체할 수 있는 세포 및 조직을 제공할 수 있기 때문에 과학적으로 매우 흥미롭다. 배양 상태로 생존하는 인간 배아 줄기 세포는 인간 건강을 보조하기 위한 다양한 연구 프로그램 및 치료 프로토콜에서 사용가능한 인간 세포를 무한한 양으로 제공할 수 있는 잠재력을 갖는다. 미래에 치료 목적으로 인간의 몸에 이식시킬 수 있는 분화된 세포 또는 조직으로 발달하도록, 인간 배아 줄기 세포를 증식시켜서 특정 세포주로 분화시킬 수 있을 것으로 기대하고 있다.
인간 배아 줄기 세포를 생성시키고 배양하는 기본 기술은 공지이다. 종래 기술이 유효하긴 하나, 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 데 현재 사용되는 많은 방법들에는 한계와 단점이 존재한다. 특히 중요한 한계가 문제가 되고 있다. 대부분의 현존하는 인간 배아 줄기 세포주는 생쥐 세포에 어느 정도 직접 노출되거나 또는 이전에 생쥐 세포를 배양했던 배지에 노출시킨 것들이다. 인간 세포에서는 정상적으로는 만들어지지 않는 시알산 잔기인 Neu5Gc가 현존하는 세포주들 중 일부 인간 ES 세포에서 나타나는 것이 발견된 사실이 언론에서 높은 주목을 받았다. 인간 배아 줄기 세포의 생성 및 배양을 위한 원천 기술은 인간 배아 줄기 세포를 배양할 수 있는 영양 공급 층의 영양 공급 세포로 생쥐의 배아 섬유아 세포(MEF)를 사용하는 것이 필수적이다. 섬유아 영양 공급 세포는 아직 완전하게 규명되지 않은 기작 을 통해서 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키는 데 도움을 준다. 이후, "순화 배지(conditioned medium)"에 줄기 세포를 노출시킨 경우에도 동일한 현상이 일어날 수 있다는 것이 밝혀졌다. 순화 배지는 영양 공급 세포, 예컨대 MEF를 사전에 배양했던 줄기 세포 배양 배지일 뿐이다. 영양 공급 세포는 배지에 특정 인자를 제공하거나 배지에서 특정 인자를 제거하지만, 결과적으로 상기 순화 배지는 분화없이 줄기 세포를 배양시키는 데 사용되어 왔다. 생쥐의 영양 공급 세포상에서 인간 ES를 직접 성장시킬 수 있는 배양 조건이나, 순화 배지를 사용하는 것은 생쥐 세포에서 인간 ES 세포로 하나 이상의 병원체 예컨대 바이러스가 전달될 수 있다는 문제가 야기된다. 인간 배아 줄기 세포의 배양 목적 중 하나가 궁극적으로 인간의 몸에 이식시킬 수 있는 조직을 생성시키고자 하는 것이라면, 다른 종의 세포 또는 다른 종의 세포를 배양한 적이 있는 배지에 줄기 세포를 노출시키지 않는 것이 매우 바람직하다. 따라서, 영양 공급 세포인 섬유아 세포층 없이 인간 배아 줄기 세포를 증식 및 배양시킬 수 있는 배양 조건을 특정화시키는 것은 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 기술을 지속적으로 발전시키는데 있어서 대단히 중요하다.
몇몇 배지 제제가 인간 ES 세포를 잠시동안 미분화 상태로 유지시킬 수 있으나, 대개는 자체로 그 상태를 유지시키는 데 실패하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 배양 용기에서 초기 종배양부터 동일한 배양 용기에 세포가 왕성하게 자라는 시기(confluence)까지의 인간 ES 세포의 성장을 "계대(passage)"로 정의한다. 본 발명자들은 1 또는 2 계대 동안에는 심한 분화없이 인간 ES 세포의 배양이 가능하나,이후, 후속 계대 시에는 세포가 빠르게 분화하게 되는 몇몇 배지 제제를 발견하였 었다. 그러나, 본 발명자들은 세포의 분화가 일어나지 않고, 순화 배지나 영양 공급 세포인 섬유아 세포 없이, 인간 ES 세포의 무한 증식을 확실하게 유지시킬 수 있는 배지가 되려면, 최소 5 계대 동안 인간 ES 세포 배양을 실질적으로 균일하게 미분화 상태로 유지시킬 수 있는 배지여야 한다고 믿게 되었다. 또한 중요한 것은 배양 기간내내 배양물이 비교적 균일하게 미분화 상태를 지속시키면서, 인간 ES 세포의 중요한 모든 특성은 계속 유지해야 한다는 것이다.
배양 중인 인간 배아 줄기 세포의 특징적인 형질은 만약 배양 조건이 덜 이상적일 경우, 세포가 분화되는 경향이 있다는 것이다. 인간 ES 세포의 분화를 유도하는 것은 쉬우나, 배양 중 미분화 상태로 인간 ES 세포를 유지시키는 것은 대단한 노력이 요구된다. 대부분의 배양 조건은 어느 정도 원치않는 분화가 일어나는데, 특히 성장하는 ES 세포 군집(colony)의 주변부에서 발생한다. 어느 정도 원치않는 분화가 일어난 상태로 ES 세포를 배양할 수 있지만, 본 발명의 목적은 배양물을 가능한 미분화상태로 지속시키면서, 즉, 가능한 세포 분화가 거의 일어나지 않도록 배양할 수 있는 배양 조건을 특정화하는 것이다. 본 발명자들은 우리가 미분화 ES 세포 배양물의 무한한 배양을 지원할 수 있는 조건을 특정화하는 데 매우 엄격한 기준을 적용해 왔다고 믿고 있다.
줄기 세포 배양물의 분화 상태는 형태적인 특징을 통해 확인할 수 있다. 미분화 줄기 세포는 특징적인 형태, 즉 세포 경계가 확실하게 구분되는 작고 조밀한 세포 형태를 가지며, 현미경을 통해서 줄기 세포 배양물을 관찰하면 이러한 형태적 특징을 쉽게 확인할 수 있다. 이와 달리, 분화된 세포는 경계가 불분명하면서 보다 크고 보다 퍼져 보인다. 일부 분화 세포가 미분화 세포 군집의 주변에서 보일 수 있으며, 그러한 것이 정상적이지만, 최적의 줄기 세포 배양은 배양 용기에서 배양물 주변부에 분화하는 것으로 보이는 세포가 단지 최소수로 증식하는 것이다. 경험적으로, 인간 ES 세포 배양물의 분화 상태 및 건강 상태는 육안으로 정확하게 구별이 가능하다.
또한, 새로운 인간 ES 세포주의 유도를 지원할 수 있는 배지의 충분조건은 줄기 세포 배양 조건에 대한 충분 조건보다도 염격한 기준이 적용된다. 현행 줄기 세포주의 증식 및 성장을 지원하는 일부 배양 조건들은 새로운 인간 ES 세포주 유도에서 그 유용성이 충분한지 증명되지 않았다. 신생 줄기 세포주의 개시(initiation)를 지원하는 능력은 모든 줄기 세포 배양 조건이 특징으로 하는 능력은 아니다.
- 본 발명의 요약 -
본 발명은 영양 공급 세포 또는 순화 배지를 필요로 하지 않는 인간 배아 줄기 세포의 배양 방법에 관한 것으로, 다수의 계대 배양에 걸쳐서 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기에 모두 충분한 양으로 염, 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아세포 성장인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 염 및 지질을 포함하는 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 영양 공급 세포인 섬유아 공급 세포 또는 순화 배지의 필요없이 미분화 상태로 줄기 세포를 무한 배양할 수 있도록 섬유아 성장 인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 염 및 지질을 고농도로 포함하는 배지에서 배양 한 인간 배아 줄기 세포의 시험관 내 세포 배양물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 동물 생성물, 영양 공급 세포, 또는 순화 배지에 노출된 적이 없는 신생 인간 배아 줄기 세포주의 생성에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 영양 공급 세포이든지 또는 줄기 세포를 배양한 순화 배지를 위해서 든지, 동물 세포를 사용하지 않는 인간 배아 줄기 세포를 장기 배양하기 위한 조건을 특정화하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 동물 세포 또는 동물 단백질에 노출되는 것을 피하면서 가능한 특정화된 인간 배아 줄기 세포를 위한 배양 조건을 특정화하는 데 있다.
본 발명의 기타 목적, 특징 및 장점은 이하 명세서를 통해서 분명해 질 것이다.
본 발명자들은 미분화 상태로 인간 배아 줄기 세포를 무한 배양 및 증식시킬 수 있으며, 또한 영양 공급 세포 및 순화 배지가 전혀 없는 다수의 배양 조건 및 배지를 발견하였다. 본 발명의 배양 조건 및 배지는 동물 생성물을 전혀 함유하지 않으며 모든 단백질이 인간으로부터 유래한 것들이다. 본 발명의 배지 및 배양 조건의 개발을 통해서 어떠한 종류의 동물 세포에도 직접 또는 간접적으로 노출되지 않으면서 특정화되고 제어된 조건에서 인간 ES 세포주를 유도 및 유지시킬 수 있으며, 또한 동물 세포 또는 동물 세포를 배양했던 배지에 전혀 노출되지 않은 새로운 인간 ES 세포주를 유도시키는 것이 가능하다. 본 발명의 배지는 동물 생성물 또는 단백질을 함유하지 않는다. 본 발명의 배지는 최소한 25 계대에 걸쳐서 미분화 상태의 ES 세포 증식을 지원할 수 있는 것으로 증명되었으며, 이는 상기 배지가 이러한 배양물들을 무한하게 지원할 수 있다는 확실한 증거이다. 상기 바람직한 배지는 또한 새로운 인간 ES 세포주의 유도를 지원하며, 이들 새로운 세포주들을 10 계대 이상 지속시킬 수 있음이 충분히 증명되었다.
과거에는 종종 습관적으로 순화 배지의 사용을 "영양 공급 세포-무함유" 배양 조건을 생성하는 의미로 사용되었다. 그러나, 특정 유형의 영양 공급 세포가 아직도 "순화 배지" 조건에 요구되기 때문에, 이는 잘못된 표현이다. 본 발명에서 기술하는 배양 조건은 인간 ES 세포의 "영양 공급 세포-비의존적" 배양이 가능하다. "영양 공급 세포 비의존적"이라함은 인간 또는 동물이든지 어떠한 종류의 영양 공급 세포도 과정상 어느 부분에서도 필요로하지 않으며 배양이나 배지 조건에서도 요구되지 않는다는 것을 의미한다. 영양공급 세포 비의존적 조건은 어떠한 목적으로도 영양 공급 세포를 전혀 필요로 하지 않는다.
인간 ES 세포의 배양 및 증식을 위해 특정화되고 인간화된 배지는 통상적으로 염, 비타민, 에너지 공급원 예컨대 포도당, 미네랄 및 아미노산을 포함한다. 배지를 보충하고 세포 성장을 지원하는 조건을 공급하기 위해서, 초기 줄기 세포 배지는 하나의 공급원 또는 다른 공급원에서 유래한 혈청을 포함한다. 또한 섬유아 세포 성장 인자와 혈청 대체 첨가물을 부가하여 혈청없이 인간 ES 세포를 배양할 수 있다는 것은 이미 알려져 있었다. 혈청 대체물로는 이를 목적으로 판매중인 제품을 사용하거나 단백질, 예컨대 혈청, 알부민, 비타민, 미네랄, 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 및 인슐린 또는 인슐린 대체물 등의 제제화된 혼합물을 사용할 수 있다. 또한 이러한 혈청 대체 성분은 셀레늄 및 지질 혼합물로 보충될 수 있다. 혈청 성분의 이형성 문제를 피하고 가능한 특정화된 배지를 사용하기 위해서, 인간 ES 세포 배양 시 임의 공급원으로부터 유래한 혈청 대신 특정화된 혈청 대체 첨가물 믹스를 사용하는 것이 본 발명에서는 바람직하다. 배양 배지에 첨가하여 이로운 것으로 확인된 기타 성장 인자로는 GABA, 피페콜산, 염화 리튬, 및 전환 성장 인자 베타(TGFβ)가 있는데, TGFβ는 배지에 첨가되는 FGF의 농도가 증가된 경우에는 필요치 않을 수 있다.
이전에는 인간 ES 세포를 미분화 상태로 유지시키는 데 필수적이라고 여겨지던, 영양 공급 세포인 섬유아 세포 층의 필요성을 없애기 위해서, 본 발명에서 기술한 바와 같이 고농도의 FGF(10 내지 1000 ng/㎖)를 감마-아미노부티르산(GABA), 피페콜산, 염화리튬 및 TGF-베타와 함께 조합한 배지를 사용하면 미분화 줄기 세포 성장 지원이 가능하게 된다. 이들 첨가물들의 조합을 통해서 영양 공급 세포나 순화 배지에 노출없이도 무한하게 인간 ES 세포 배양물을 미분화 상태로 충분히 유지시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 그러나, 이들 모두가 모든 배지 제제에 필수적인 것은 아니다. 이들 첨가물의 선택적 제거를 통해서, 소정의 배지에서 상기와 같은 결과를 얻기 위해서 이들 중 하나 또는 그 이상이 필수적인지 아닌지를 경험적으로 판단할 수 있다. 첨가물들 중 하나 또는 그 이상을 선택적으로 제거할 수 있다. 하지만, 이러한 조합이 영양 공급 세포나 순화 배지없이 미분화 인간 ES 세포의 장기 배양 및 증식을 지원할 수 있는 다양한 종류의 배지로 충분하다는 것은 분명하다.
이들 성분들에 다소 변화를 줄 수 있다. 예를 들어, LiCl은 wnt 경로를 자극하기 때문에 배지에 사용하게 된다. LiCl이 상기 목적으로 가장 경제적인 작용제이긴 하지만, LiCl 동등물로서 Wnt 자체 또는 기타 이의 경로 자극인자 예컨대 액티빈을 대신 사용할 수 있다. 이와 유사하게, GABA는 GABA 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있으며, 과학 문헌등에 동일 수용체의 길항제로 동정된 몇몇 분자들이 기재되어 있으며, 이들을 GABA 동등물로 배지에 대신 사용할 수 있다. 한편, PA도 GABA 수용체와 상호작용하는 것으로 알려져 있다. PA 및 GABA는 모두 본 발명에서 사용하는 농도로 배지에 존재하는 경우 유용한 것으로 확인되었으며, 다른 것들에 대한 필요성을 없애기 위해 이들 성분들 중 하나 또는 나머지의 농도를 상당히 증가시키는 것을 또한 고려할 수 있다.
고농도(40 내지 100 ng/㎖)로 섬유아세포 성장 인자를 사용하게 되면 영양 공급 세포의 필요성을 제거하는 듯하다. 바람직한 FGF는 염기성 FGF(bFGF 및 FGF2라고도 함)이나, 적어도 FGF4, FGF9, FGF17 및 FGF18을 포함하는 다른 FGF도 이러한 목적을 만족시킨다. 다른 FGF도 높은 농도에서 이긴 하지만, 효과가 있다.
또한 인간 ES 세포를 위한 배양 조건으로 배양 용기에 생물학적 메트릭스를 포함시키는 것도 유용하다. 종래 사용되었던 이러한 물질로는 Matrigel™이 있는데, 이는 생쥐 세포 유래의 인공 기저막(basement membrane)으로, 생쥐 세포 무함유 제품으로 공급된다. 그러나, Matrigel을 사용하면 특정화되지 않은 생쥐 유래의 물질을 포함하는 물질이 배양물에 유입될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 Matrigel을 완전하게 대체할 수 있는 인간 단백질의 생물학적 메트릭스를 생성시키는 방법에 대해서도 기술하였다. 본 발명의 메트릭스는 4종의 인간 단백질: 인간 태반에서 분리한 콜라겐, 인간 혈장에서 분리한 피브로넥틴, 인간 플라스마에서 분리한 비트로넥틴 및 인간 태반에서 분리한 라미닌으로 구성된다. 상기 4 종의 단백질 조합으로 충분하나, 인간 ES 세포의 성장 및 배양을 지원하는데 4 종 모두를 사용할 필요는 없다. 비트로넥틴, 피브로넥틴 또는 라미닌 중 하나가 없고, 다른 3 종의 단백질은 포함한 메트릭스를 사용하여 ES 세포 배양을 지원할 수 있으나, ES 세포 배양물의 분화 상태의 순도에는 다소 손실이 있을 수 있다. ES 세포 성장용 메트릭스의 제조방법은 하기 실시예에서 기술할 것이다.
상기 언급한 배지 첨가물을 얻기 위해서 80 종 이상의 개별 성장 인자에 대한 방법론적 실험을 수행하였다. 일부 첨가물은 최소 몇 계대 동안 인간 ES 세포 배양물의 성장을 지원하는 듯하였으나, 대부분 이후의 후속 계대 배양에서 ES 세포를 미분화 상태로 유지시키는 데는 실패하였다. 본 발명자들은 하기 실시예에 기술한 결과를 나타내는 배지 첨가물을 제공하는 인자들의 조합을 확인하였다.
단지 영양 공급 세포인 섬유아 세포가 존재하거나 또는 순화 배지에서 배양시킬 경우에만 인간 배아 줄기(ES) 세포 배양물이 미분화 상태를 유지한다는 이전의 관찰 결과는 섬유아 세포가 ES 세포의 분화를 억제하는 작용을 하는 인자를 배지로 방출한다는 고찰로 이어졌다. 그러나, 하기 나타낸 결과는 그렇지 않다는 것을 증명한다. 그러나, 배지에 미치는 영양 공급 세포인 섬유아 세포에 의해 매개되는 효과가 어떠한 것이든지, 하기에 기술한 배지가 그 효과를 대체한다는 것은 이제 분명하다. 하기에 기술한 배지는 특정화된 것으로, 동물 세포를 함유하지 않으며, 미분화 상태로 인간 ES 세포를 장기 배양하는 것이 가능하다. 하기 실시예에 기술한 배지에서 배지내 단백질은 모두 인간 유래이며, "인간화" 배지 및 메트릭스는 동물 유래의 세포내(subcellular) 생성물에 대해 야기될 수 있는 어떠한 문제도 해결할 수 있다.
또한 하기 기술한 배지를 사용하여 새로운 인간 배아 줄기 세포주를 유도할 수 있다. 따라서, 새로운 인간 ES 세포주는 영양 공급 세포, 순화 배지, 동물 생성물 또는 동물 단백질에 전혀 노출되지 않은 것이다. 종래 인간 ES 세포주들은 배양중이거나 또는 생체 내의 인간 세포에서는 원래 존재하지 않는 시알산 형태(Neu5Gc)가 나타나는 것으로 알려져 있었다. 종래 인간 ES 세포주는 생쥐의 성분들을 포함하는 배양 조건에서 Neu5Gc를 획득한 것이기 때문에, 본 발명에서 기술한 새로운 인간 ES 세포주는 Neu5Gc를 전혀 함유하지 않는다.
도 1은 본 발명의 실시예의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예의 결과를 그래프로 부가하여 나타낸 것이다.
달리 언급하지 않으면 본 발명에서는 TeSR1 배지를 사용하였으며, 그 성분들은 하기 표 1에 나타내었다. 본 발명자들의 사전 실험을 통해서 미분화 인간 ES 세포 증식은 pH는 7.2, 삼투몰 농도는 350 mOsMol, 그리고 대기 조건은 10%CO2/5%O2인 경우가 최적인 것으로 확인되었다. 상기 조건을 이하 기술할 모든 후속 배양 조건 으로 사용하였다.
상기 언급한 모든 성분들을 함유하는 배지는 충분하고 바람직하나, 모든 성분이 인간 ES 세포의 성공적인 배양을 위해서 필수적인 것은 아니다. 분화된 세포의 양에 따라서 하나는 허용가능하며, 일부 배지의 성분을 생략해도 무방하지만, 구체적으로는 단지 소수의 계대(a few passages) 동안 배지를 사용하는 경우이다. 어떠한 성분을 생략해도 되는지 조사하기 위해서, 상기 언급한 성분들 중 각각 다른 성분들이 생략된 다양한 변형 배지에서 인간 ES 세포를 배양하였다. 200,000 세포를 실험 배지에 도포하고 평판배양하여 7일간 성장시켰으며, 처리구 당 2 웰을 사용하였다. 이후 상기 세포에 대해서 미분화 세포의 인지 표지인 전사 인자 Oct4의 발현을 분석하였다. 그 결과는 도 1의 그래프로 나타내었는데, 각 실험 배지에서 Oct4 발현 세포의 수를 바람직한 배지 TeSR1의 발현 세포 수에 대한 비율로 나타내었다. 주목할 만한 것은 단기 배양 동안 적어도 고농도의 FGF 존재하에서는, TGFβ가 가장 필요성이 덜한 성분인 듯하다는 것이다. 또한 다른 성분들을 생략시킴으로서 미분화 세포의 퍼센트가 증가하였으나, 그 차이는 양적인 것이었으며, 생략된 성분들 없이, 적어도 어느 정도 제한된 세포 계대 동안 배지는 효과적이었다.
본 발명의 배지를 또한 인간으로부터 유래한 새로운 메트릭스 물질을 사용하여 인간 ES 세포를 배양하는데 사용하였다. 새로운 메트릭스는 다음의 4 종 단백질로 구성된다.
1. 최종 농도 10 ㎍/100 ㎕/㎠의 콜라겐(인간 태반에서 분리함).
2. 최종 농도 5 ㎍/100 ㎕/㎠의 피브로넥틴(인간 혈장에서 분리함).
3. 최종 농도 0.2 ㎍/100 ㎕/㎠의 비트로넥틴(인간 혈장에서 분리함).
4. 최종 농도 5 ㎍/100 ㎕/㎠의 라미닌(인간 태반에서 분리함).
이러한 메트릭스를 조립하기 위해서, 콜라겐을 6 M GuHCl(구아니딘 HCl)로 변성시키고, a.45 마이크론 필터로 여과시켜서 일정분량으로 분취하여 냉동시켰다. 해동시, 변성 콜라겐을 Ca 및 Mg 무함유 PBS로 희석하여 적정한 최종 농도로 만들어 도포하였다. 추가 메트릭스 성분을 도포하기 전에 1 시간 정도 상기 코팅된 플레이트를 실온에서 항온처리하였다. 상기의 초기 항온처리 단계 이후, 추가 메트릭스 성분(피브로넥틴, 비트로넥틴 및 라미닌)을 Ca 및 Mg 무함유 PBS로 희석하여 적절한 최종 농도로 만들어 도포하였다. 인간 ES 세포를 플레이트에 도포하여 평판배양하기 전에 1 시간 정도 상기 코팅된 플레이트를 실온에서 항온 처리하였다.
새로운 메트릭스 물질을 사용하여, 이전의 현존하는 인간 ES 세포주를 최소 10 계대 동안 미분화 상태로 지속 및 증식시키면서 배양하였다.
인간화 메트릭스의 성분에 대해 세밀하게 이들 성분의 필요성을 확인하기 위해서, 하나 또는 그 이상의 성분을 생략한 변형 메트릭스를 제제화하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 각 실험 조건은 사용한 메트릭스 단백질의 앞머리 글자로 나타내었다(C-콜라겐, F-피브로넥틴, V-비트로넥틴, L-라미닌). 주목할 만한 점은 CFV, CVL 및 CFL 막이 효과적이었고, ES 세포를 미분화 상태로 유지시킬 수 있었지만, CVFL 메트릭스 조건만큼 세포 배양물 성장에 매우 도움이 되는 것은 아니었다는 점이다.
상기 배지는 또한 새로운 인간 배아 줄기 세포의 개시를 지원할 수 있는 것 으로 확인되었다. 새로운 세포주의 유도 과정은 배지 제제에 있어서 어려운 시험이지만, 상기 특정화된 배지를 사용하여 동물 단백질 또는 메트릭스에 노출된 적이 없으며, 영양 공급 세포나 영양 공급 세포를 배양했던 배지에 노출된 적이 없는 신생 인간 배아 줄기 세포주를 생성시키는 것이 가능하다. 이는 새로운 업적으로 여겨질만한 것이다.
이 작업은 생명 윤리 위원회의 승인과 기증자의 동의를 얻은 후에 수행되었다. 시험관 내 수정 프로토콜을 통해 얻어진, 임상적으로 요구되는 것 이외의 잉여의 냉동 인간 배아를 기증받았다. 상기 배아를 해동시키고 시판중인 연속 배아 배양 시스템(Vitrolife-GIII 시리즈)을 사용하여 배반포 시기까지 배양하였다. 투명대(Zona Pellucida)를 제거한 후에, 인간 배반포의 내세포괴(ICM)를 면역절제술(Solter 및 Knowles, 1975, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 72:5099-5102) 또는 배양된 온조직(whole mounts)(Evans 및 Kaufman, 1981, Nature, 292154-156)으로 분리하였으며 4-웰 배양 플레이트 내의 상기 언급한 바와 같이 특정화된 인간화 메트릭스(CVFL)와 특정화된 배지 TeSR1 상에 도포하여 평판 배양하였다. 초기 48 시간 배양 후, TeSR1 배양 배지를 하루 단위로 교체해 주었다. 14 일 내지 21 일 후, 세포 덩어리들을 물리적으로 분리하고 새로운 CVFL 플레이트상에 재도포하여 평판 배양하였다. 군집들을 계대 배양한 후, 연속적인 2 내지 3 계대 동안 효소 디스파제를 사용하여 물리적 분리를 계속하였다. 새로운 군집들이 새로운 인간 배아 줄기 세포주인 것을 확인하였다.
상기 확인된 4 종의 인간 메트릭스 성분상에서 TeSR1 배지를 사용하여, 본 발명자들은 배양된 5 개의 배반포로부터 새로운 2 종의 인간 ES 세포를 유도하였다. 본 발명에 기재된 바와 같이, 현재 두 인간 ES 세포주는 연속적인 계대 배양을 통해서 6 개월 동안 계속적으로 배양 중에 있다. 상기 세포주들은 안정적이며 이전의 줄기 세포주와 형태적으로 유사하다. FACs 분석 및 RT-PCR, 그리고 웨스턴 블랏을 통해서 상기 세포가 일련의 인간 ES 세포의 특징적인 표지를 발현하는 것을 확인하였다. 이들 세포주로부터 유도된 배아체들은 3 종의 모든 배엽층 표지를 발현하였으며, SCID-베이지 생쥐에 주입하였을 때 양 세포주들은 기형종을 형성하였다. 배양 4 달 후, 한 세포주는 XXY(크라인펠터 증후군)인 것으로 확인되었 다른 하나는 정상 핵형이었다. 클라인펠터 증후군은 가장 일반적인 인간 염색체 기형 중 하나이며, 이러한 기형은 줄기 세포 배양을 개시하는 과정중 유입된 인공적인 것이라기보다는 배아 자체에 이미 존재했던 것으로 판단된다.
TeSR1 배지용 완전 제제
무기 염 염화칼슘(무수물) HEPES 염화마그네슘(무수물) 황산마그네슘(MgSO4) 염화칼륨(KCl) 중탄산나트륨(NaHCO3) 염화나트륨(NaCl) 인산나트륨,이염기성(무수물) 인산나트륨, 모노 (NaH2PO4-H2O) 미량의 미네랄 질산철(Fe(NO3)3-9H2O) 황산철(FeSO4-7H2O) 황산구리(CuSO4-5H2O) 황산아연(ZnSO4-7H2O) 암모늄 메타바나데이트 (NH4VO3) 황산망간(MnSO4H2O) 암모늄 몰리브데이트 NiSO4 6H2O 메타규산 나트륨 (Na2SiO3 9H2O) SnCl2 CdCl2 CrCl3 AgNo3 AlCl3 6H2O Ba(C2H3O2)2 CoCl2 6H2O GeO2 KBr KI NaF RbCl ZrOCl2 8H2O mM 0.8232 11.76 0.2352 0.319088 3.26144 11.2112 94.55824 0.392 0.355152 0.00009408 0.001176 4.0768E-0.6 0.001176 0.000056 1.00592E-05 1.00404E-05 4.94861E-06 0.004926108 5.32544E-06 6.21931E-05 9.41176E-06 5.00293E-06 2.4855E-05 4.99217E-05 5.0021E-05 2.5337E-05 5.04202E-06 5.12048E-06 0.000500119 5.00414E-05 9.03834E-05 아미노산 L-알라닌 L-아르기닌 염산염 L-아스파라긴-H2O L-아스파르트산 L-시스테인-HCl-H2O L-시스틴 2HCl L-글루탐산 L-글루타민 글리신 L-히스티딘-HCl-H2O L-이소류신 L-류신 L-라이신 염산염 L-메티오닌 L-페닐알라닌 L-프롤린 L-세린 L-트레오닌 L-트립토판 L-타이로신 2Na 2H2O L-발린 비타민 아스코르브산 바이오틴 염화콜린 D-판토텐산칼슘 폴산 i-이노시톨 니아신아미드 피리독신 염산염 리보플라빈 티아민 염산염 비타민 B12 mM 0.1392 0.5488 0.1392 0.1392 0.0784 0.0784 0.1392 2.96 0.296 0.1176 0.326144 0.353584 0.391216 0.090944 0.16856 0.2176 0.296 0.352016 0.0346528 0.167776 0.354368 0.375 1.12112E-05 0.0502544 0.0036064 0.004704 0.05488 0.012936 0.0076048 0.0004704 0.02460217 0.000392
성장인자 GABA 피페콜산 bFGF LiCl TGF 베타 1 지질 리놀레산 리포산 아라키돈산 콜레스테롤 DL-알파 토코페롤-아세트산염 리놀렌산 미리스트산 올레산 팔미톨레인산 스테아르산 mM 0.979 0.000984 5.80E-06 0.979 2.35E-08 0.0070976 0.00039984 0.001312 0.0113798 0.02962 0.007184 0.008758 0.00708 0.007862 0.00703 에너지 기질 D-포도당 피루브산나트륨 단백질 인간 인슐린 인간 홀로-트랜스페린 인간 혈청 알부민 기타 성분 글루타티온(환원) 하이포잔틴 Na 페놀 레드 퓨트레신-2HCl 티미딘 2-머캅토에탄올 셀레늄 플루로닉 F-68 트윈 80 mM 13.72784 0.392 0.0034438 0.14 199.7 0.00592996 0.01176 0.0159936 0.000394352 0.001176 0.1 0.000177304 0.238 0.3358

Claims (12)

  1. 영양 공급 세포 또는 순화 배지를 사용하지 않고 인간 배아 줄기 세포의 새로운 배양 세포주를 개시하기 위한 방법으로서,
    증식하는 새로운 줄기 세포주를 미분화 상태로 발생시키고 유지시키기에 충분한 양으로 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아세포 성장 인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 지질을 포함하는 배지에서 배반포 세포를 평판 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 배지는 40 ng/㎖ 이상의 농도로 섬유아세포 성장인자를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 배지는 트랜스페린 및 인슐린을 더 포함하는 방법.
  4. 인간 배아 줄기 세포;
    다수의 계대 배양을 통해서 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기에 충분한 양으로 염, 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아세포 성장인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 지질을 포함하는 배양 배지; 및
    피브로넥틴, 비트로넥틴 및 라미닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 인간 단백질 및 인간 콜라겐으로 제조한 인간화 메트릭스
    를 배양 용기에 포함하며,
    상기 배지는 영양 공급 세포를 함유하지 않고, 영양 공급 세포에 노출된 적이 없는 시험관 내 세포 배양물.
  5. 제4항에 있어서, 메트릭스는 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 라미닌을 모두 포함하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 배지는 40 ng/㎖ 이상의 농도로 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 배지는 트랜스페린 및 인슐린을 더 포함하는 방법.
  8. 인간 배아 줄기 세포;
    콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 라미닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2종 이상의 인간 단백질 및 인간 콜라겐으로 제조된 인간화 메트릭스; 및
    다수의 계대 배양 동안 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기에 충분한 양으로 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아세포 성장인자, 및 지질을 포함하는 배양 배지
    를 배양 용기에 포함하며,
    상기 배지는 영양 공급 세포를 함유하지 않으며, 영양 공급 세포에 노출된 적이 없는 시험관 내 세포 배양물.
  9. (a) 배반포 시기의 배아에서 내세포괴를 분리하는 단계;
    (b) 다수의 계대 배양을 통해서 줄기 세포를 미분화 상태로 유지시키기에 충분한 양으로 비타민, 아미노산, 포도당, 섬유아세포 성장인자, 감마 아미노 부티르산, 피페콜산, 리튬 및 지질을 포함하는 배지에서 단계 (a)의 세포를 배양하는 단계;
    (c) 상기 배양 단계를 인간 단백질 메트릭스 상에서 수행하는 단계; 및
    (d) 배지 상에서 증식하는 세포를 연속적으로 증가시키는 단계를 포함하는 신생 인간 배아 줄기 세포의 배양 방법.
  10. 제11항에 있어서, 배지의 인간 단백질은 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 및 라미닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3종 이상의 단백질을 포함하는 방법.
  11. 인간 단백질 메트릭스에서 성장한 인간 배아 줄기 세포를 포함하는 세포 배양물로서,
    상기 줄기 세포는 동물 세포, 동물 단백질, 영양 공급 세포 또는 순화 배지에 노출된 적이 없는 세포주로부터 유래한 것이며, 세포의 배양 배지는 세포를 미분화 상태로 지속시키고, 세포의 다능성 및 정상 핵형을 유지시키면서 20 계대 이상의 배양을 통해서 세포를 유지시킬 수 있는 세포 배양물.
  12. 시알산 Neu5Gc를 나타내지 않는 인간 배아 줄기 세포를 포함하는 세포 배양물.
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