JP7061961B2 - 多能性幹細胞の免疫細胞への分化を誘導する方法 - Google Patents

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Description

本出願は、参照により両方の全開示内容が本明細書に組み入れられる２０１５年１０月２０日出願の米国仮特許出願第６２／２４４，１０１号明細書及び２０１６年１０月５日出願の同第６２／４０４，４７０号明細書の優先権の利益を主張するものである。
本発明は、概して、分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、体細胞由来誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からの免疫細胞の産生のための方法及び組成物に関する。
細胞療法は、腫瘍、ウイルス、及び細菌性病原体に対する宿主免疫応答を増強するために開発されてきた。細胞療法は、多くの場合、ｅｘ－ｖｉｖｏでのＴ細胞の活性化及び増殖を含む。これらのタイプの治療の例としては、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、増殖腫瘍流入領域リンパ節細胞（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｔｕｍｏｒ ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ ｃｅｌｌ）、及び様々な他のリンパ球製剤の使用が挙げられる。造血幹細胞及び造血前駆細胞のかなりの医学的可能性のため、造血前駆細胞の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞への分化のための方法を改善しようとしてかなりの研究が行われてきた。
ヒトでは、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、一般的に皮膚線維芽細胞から作製される。しかしながら、皮膚生検の要件、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの数世代の継代培養のために線維芽細胞を増殖する必要があるため、ｉＰＳ細胞は、患者特異的幹細胞の作製では面倒な供給源である。さらに、ヒト体細胞のリプログラミングのための以前の方法は、ヒト対象から直接体細胞を得るか、又は労働集約的細胞培養系で細胞を維持する必要があるために不便である。従って、簡単で便利であり、且つ容易にアクセス可能な代替供給源から多能性幹細胞を誘導する方法を開発する必要がある。従って、患者又は健康な個体から血液を採取して中央施設で貯蔵するか、又は例えば１つ以上の遠隔地への分配のために中央施設から移送することができるため、血液試料は、このような供給源であり得る。従って、現在、体細胞からｉＰＳ細胞をリプログラミングし、次いで体細胞由来ｉＰＳ細胞を免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、及び樹状細胞に効率的に分化させる方法が明らかに必要である。
本開示の第１の実施形態は、免疫細胞を産生する方法であって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を得ること（ここでＰＳＣは体細胞集団からリプログラミングされる）、このＰＳＣを造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化させること、及び免疫細胞の分化を促進する条件下でＨＰＣを培養し、それにより免疫細胞を産生することを含む、免疫細胞を産生する方法を提供する。
一部の態様では、ＰＳＣは、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の態様では、ＰＳＣは、胚性幹細胞（ＥＣＳ）である。一部の態様では、ＰＳＣは、組み込まれた外因性ウイルス要素を本質的に含まない。
ある態様では、免疫細胞は、リンパ細胞である。特定の態様では、リンパ細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／又はＮＫ細胞である。一部の態様では、免疫細胞は、骨髄細胞である。特定の態様では、骨髄細胞は、樹状細胞である。
ある態様では、体細胞集団は、哺乳動物のものである。特定の態様では、体細胞集団は、ヒトのものである。一部の態様では、体細胞集団は、血液細胞集団又は皮膚細胞集団である。一部の態様では、血液細胞集団は、外部から適用されるＧ－ＣＳＦで動員されていない。ある態様では、血液細胞集団は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／又はＮＫ細胞を含む。一部の態様では、血液細胞集団は、前駆血液細胞、末梢血単核細胞、又はリンパ芽球様細胞としてさらに定義される。ある態様では、血液細胞集団は、末梢血、臍帯血、又はリンパ系組織から単離される。特定の態様では、リンパ系組織は、骨髄、リンパ節、又は胎児肝臓を含む。特定の態様では、血液細胞集団は、Ｔ細胞を含む。一部の態様では、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体の存在下で培養される。特定の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞である。一部の態様では、Ｔ細胞は、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞、Ｔヘルパー２（ＴＨ２）細胞、ＴＨ１７細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、又はγδＴ細胞である。
ある態様では、リプログラミングは、リプログラミング因子を体細胞集団に導入することを含む。一部の態様では、リプログラミングは、ＲＮＡ、タンパク質、又は小分子を体細胞集団に導入することを含む。
特定の態様では、体細胞集団は、赤血球又は皮膚細胞である。一部の態様では、リプログラミング因子は、１つ以上の発現カセットによってコードされる。ある態様では、リプログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、及びＬｉｎ２８からなる群から選択される２つ以上の遺伝子を含む。一部の態様では、リプログラミング因子は、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃＭｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、及びＬｉｎ２８からなる群から選択される３つ、４つ、５つ、又は６つの遺伝子を含む。ある態様では、１つ以上の発現カセットは、ウイルスベクター、エピソームベクター、及びトランスポゾンからなる群から選択されるリプログラミングベクターに含まれる。一部の態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターとしてさらに定義される。特定の態様では、エピソームベクターは、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクターとしてさらに定義される。一部の態様では、リプログラミングは、規定されたフィーダーフリー条件下で細胞を培養することを含む。
一部の態様では、ＨＰＣは、１つのＨＰＣ当たり少なくとも２０の免疫細胞、例えば、１つのＨＳＣ当たり少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、７０、９０、又は１００以上の免疫細胞に分化する。一部の態様では、ＰＳＣは、１つのＰＳＣ当たり少なくとも２０の免疫細胞、例えば、１つのＰＳＣ当たり少なくとも３０、４０、又は５０以上の免疫細胞に分化する。
ある態様では、ＰＳＣをＨＰＣに分化させることは、複数の実質的に未分化の多能性細胞を、少なくとも１つの増殖因子を含む第１の規定された(defined)培地で培養又は維持すること、ＩＬ－３、Ｆｌｔ３リガンド、及びＧＭ－ＣＳＦを含まない又は本質的に含まない第２の規定された培地で細胞をインキュベートすること、複数の細胞の増殖又はその分化を促進するのに十分なＢＭＰ４、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦを含む第３の規定された培地で細胞を培養すること、及び複数の細胞の増殖又はその分化を促進するのに十分なＩＬ－３及びＦｌｔ３リガンドを含む第４の規定された培地で細胞を培養することの一連の工程を含む。一部の態様では、複数の多能性細胞がＨＰＣに分化される。一部の態様では、第２の規定された培地は、ブレビスタチンを含む。ある態様では、第２の規定された培地は、ＧＳＫ３阻害剤をさらに含む。一部の態様では、ＧＳＫ３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。一部の態様では、第２の規定された培地は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２をさらに含む。ある態様では、細胞は、第２の規定された培地で細胞をインキュベートする前に個別化される。一部の態様では、細胞を第２の規定された培地でインキュベートすること、第３の規定された培地で細胞を培養すること、及び第４の規定された培地で細胞を培養することは、アミン培養プレートを用いて行われる。ある態様では、第２の規定された培地は、ＶＥＧＦ及びＦＧＦ２をさらに含む。特定の態様では、第４の規定された培地は、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＢＭＰ４からなる群から選択されるサイトカインの１つ以上をさらに含む。一部の態様では、第４の規定された培地は、ヘパリンを含む。一部の態様では、この方法は、酸素が２５％未満、例えば、酸素が２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満の大気圧で細胞を培養することを含む。一部の態様では、複数の多能性細胞は、胚様体（ＥＢ）を形成する。ある態様では、ＨＰＣは、ＣＤ３４を発現する。特定の態様では、ＨＰＣは、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４１、ＣＤ２３５、及びＣＤ４５からなる群からの少なくとも２つのマーカーを発現する。
一部の態様では、免疫細胞の分化を促進する条件は、リンパ系分化を促進する条件としてさらに定義される。ある態様では、ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現するＨＰＣは、リンパ系分化を促進する条件下で培養される。一部の態様では、リンパ球への分化を促進するために細胞を培養することは、規定された培地において、マトリックス及びＮｏｔｃｈリガンドで被覆された表面上でＨＰＣを培養すること（ここで、ＨＰＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４３、ＣＤ７、ＤＬＬ４、ＣＤ１４４、及びＣＤ２３５からなる群から選択される細胞表面マーカーの１つ以上を発現する）、及び１つ以上のサイトカインの存在下で培養を維持し、それによりリンパ細胞を産生することを含む。一部の態様では、ＨＰＣは、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ７を発現する。特定の態様では、ＨＰＣは、ＣＤ１４４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ７を発現する。
さらなる態様では、リンパ系分化の第１の工程は、１つ以上の細胞表面マーカーを発現するＨＰＣを単離することをさらに含む。一部の態様では、単離することは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含む。ある態様では、細胞は、酸素が５％未満の大気圧で培養される。ある態様では、細胞は、酸素が約５％の大気圧で培養される。一部の態様では、規定された培地は、アスコルビン酸及び／又はニコチンアミドを含む。ある態様では、アスコルビン酸は、５０μＭ～１ｍＭ、例えば、９０μＭ～１００μＭの濃度で存在する。一部の態様では、ニコチンアミドは、０．１ｍＭ～５ｍＭの濃度で存在する。ある態様では、ニコチンアミドは、ニコチン酸である。一部の態様では、マトリックスは、細胞外マトリックスタンパク質である。一部の態様では、マトリックスは、レトロネクチン、コラーゲン、ラミニン、又はフィブロネクチンである。特定の態様では、マトリックスは、レトロネクチンである。一部の態様では、Ｎｏｔｃｈリガンドは、ＤＬＬ４である。ある態様では、ＤＬＬ４は、ＤＬＬ４：Ｆｃキメラタンパク質である。特定の態様では、１つ以上のサイトカインは、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－７、及びＦｌｔ－３からなる群から選択される。一部の態様では、第２の工程は、１～６週間、例えば、２～４週間である。一部の態様では、リンパ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ４、及びＣＤ３からなる群から選択されるマーカーの１つ以上を発現する。一部の態様では、リンパ細胞の５％超は、マーカーの少なくとも２つに対して陽性である。特定の態様では、リンパ細胞の１０％超は、マーカーの少なくとも２つに対して陽性である。
一部の態様では、免疫細胞分化を促進する条件は、骨髄系分化を促進する条件としてさらに定義される。ある態様では、骨髄系分化を促進する条件下でＨＰＣを培養することは、ＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＦｌｔ３リガンドを含む第１の規定された培地でＨＰＣを培養し、それにより骨髄細胞集団を産生すること、及びＴＰＯ、ＳＣＦ、及びＦｌｔ３リガンドを本質的に含まない第２の規定された培地で細胞をインキュベートし、それにより骨髄細胞の濃縮集団を産生することを含む。一部の態様では、第１の規定された培地は、ＩＬ－６及びＩＬ－３をさらに含む。ある態様では、第２の規定された培地は、ＧＭ－ＣＳＦを含む。特定の態様では、第１の工程で形成される骨髄細胞集団の少なくとも５０％は、ＣＤ４５、ＣＤ４３、及びＣＤ３１に対して陽性である。一部の態様では、ＣＤ４５、ＣＤ４３、及びＣＤ３１に対して陽性の骨髄細胞集団は、ＣＤ３４の発現を本質的に有していない。特定の態様では、骨髄細胞の濃縮集団の少なくとも８０％は、ＣＤ４３+、ＣＤ４５+、ＣＤ３１+、及びＣＤ３４-である。一部の態様では、第２の工程は、５～１０日間である。
ある態様では、この方法は、骨髄細胞の濃縮集団を樹状細胞に分化させることをさらに含む。一部の態様では、骨髄細胞の濃縮集団を樹状細胞に分化させることは、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、及びＴＮＦαを含む規定された培地で骨髄細胞の濃縮集団を培養し、それにより樹状細胞を産生することを含む。一部の態様では、規定された培地は、リポタンパク質をさらに含む。ある態様では、樹状細胞は、ＣＤ２０９、ＣＤ１ａ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ８３、及びＣＤ８６からなる群から選択されるマーカーの１つ以上を発現する。特定の態様では、樹状細胞は、ＣＤ１２の発現を本質的に有していない。
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更形態及び修正形態がこの詳細な説明から当業者に明らかであるため、単なる例として示されることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を構成し、本発明のある態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することにより、よりよく理解できるであろう。
（Ａ）ｉＰＳＣからＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ／Ｔ細胞を誘導するためのフィーダーフリー方法の概略図である。ｉＰＳＣは、３Ｄプロセスによってリンパ系及び骨髄系分化能を有するＨＰＣに分化され、次いで、７～１０日目の前駆細胞が２Ｄ分化プロセスを受けてＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ／Ｔ細胞を産生する。 （Ｂ）ｉＰＳＣから樹状細胞を誘導するためのフィーダーフリー方法の概略図である。ｉＰＳＣは、３Ｄプロセスによってリンパ系及び骨髄系分化能を有するＨＰＣに分化され、次いで、１２日目の前駆細胞がさらに分化して骨髄前駆細胞を産生し、及び段階的な３Ｄ分化プロセスにより樹状細胞が産生される。 （Ｃ）ＨＰＣが分化の１２日目に様々な血液細胞由来ｉＰＳＣ細胞株から産生され、フローサイトメトリーによって定量されたＣＤ４３+／ＣＤ３４+細胞のパーセンテージが示されている。 （Ｄ）１２日目のｉＰＳＣからのＨＰＣ産生の効率がｉＰＳＣの投入数当たりの産生ＨＰＣの絶対数の比として示されている。
７～１０日目のＨＰＣのリンパ系分化中のリンパ系及びリンパ－骨髄集団を同定するフローサイトメトリー散乱プロットが示されている。プレＴ細胞、プレＮＫ細胞、及びプレＮＫ／Ｔ細胞の存在を決定した。
（Ａ）臍帯血由来のｉＰＳＣ、ウイルスリプログラミングＴ細胞ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）、及びエピソームリプログラミング前駆血液細胞ｉＰＳＣ（０１２７９．１０７．３９０８）を含む、ウイルス及びエピソームリプログラミングｉＰＳＣからのリンパ細胞の出現を検出するための代表的な染色プロフィールである。細胞を、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ５６、及びＣＤ８を含む様々なマーカーの表面発現について染色した。細胞のパーセンテージをＦＳＣ－ＳＳＣ及びリンパ系散乱ゲート（ｓｃａｔｔｅｒ ｇａｔｅ）下でのフローサイトメトリーにより定量した（ＥＢ７＝７日目、ＥＢ８＝８日目、ＥＢ９＝９日目、ＥＢ１０＝１０日目、及びＥＢ１１＝１１日目）。 （Ｂ）ＴｉＰＳＣから分化した７～１１日目のＨＰＣ（上：合計ＨＰＣ；下：ＣＤ４３+ＣＤ３４+ＨＰＣ）をリンパ細胞にさらに分化させ、ＣＤ４５、ＣＤ７、及びＣＤ５の表面発現について染色した。細胞のパーセンテージをＦＳＣ－ＳＳＣ及びリンパ系散乱ゲートの下側のフローサイトメトリーにより定量した。 （Ｃ）ＴｉＰＳＣから産生された７～１１日のＨＰＣ（上：合計ＨＰＣ；下：ＣＤ４３+ＣＤ３４+ＨＰＣ）を低酸素条件下で分化させ、ＣＤ５６、ＣＤ８、及びＣＤ３の表面発現について染色した。 （Ｃ）ＴｉＰＳＣから産生された７～１１日のＨＰＣ（上：合計ＨＰＣ；下：ＣＤ４３+ＣＤ３４+ＨＰＣ）を低酸素条件下で分化させ、ＣＤ５６、ＣＤ８、及びＣＤ３の表面発現について染色した。 （Ｄ）ＴｉＰＳＣからリンパ細胞を産生する効率が示されている（左：合計ＨＰＣ；右：ＣＤ４３+ＣＤ３４+ＨＰＣ）。
ＴｉＰＳＣ（例えば、ウイルスリプログラミングＴｉＰＳＣｓ１Ｅ又はエピソームリプログラミング０１２７９．１０７．３９０２）から分化した７～１１日目のＨＰＣを、ＨＰＣ分化の７日目から１１日目までの別々の日におけるＣＤ４３／ＣＤ３４、ＣＤ３４、Ｄｌｌ４、Ｄｌｌ４／ＣＤ１４４、ＣＤ３１／ＣＤ１４４、及びＣＤ２３５の発現について分析した。各マーカーセットに対して陽性の細胞のパーセンテージが示されている。ＣＤ４３／ＣＤ３４の発現は左の棒で示され、ＣＤ３４は右の棒で示され、ＤＬＬ４／ＣＤ１４４は下側の線で示され、ＣＤ３１／ＣＤ１４４は真中の線で示され、及びＣＤ２３５は上側の線で示されている。
ＨＰＣ分化中のリンパ系前駆細胞を検出するための磁気選別戦略の概略図である。対象となるマーカーには、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ７、ＣＤ２３５、ＦＬＫ１（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＤ３０９としても知られる）、及びＤＬＬ４が含まれていた。分化の８日目に細胞を対象となるマーカーに基づいて様々な画分に選別し、次いでリンパ系分化プロセスを行った。
（Ａ）図５の磁気選別戦略による細胞の各陽性画分及び陰性画分におけるＣＤ３陽性細胞のパーセンテージが対照としての未選別細胞と共に示されている。 （Ｂ）ＨＰＣから産生されたＴ細胞の濃縮倍率が対照としての未選別細胞と共に、図５の磁気選別戦略による陽性画分及び陰性画分で示されている。
（Ａ）ＴｉＰＳＣからのリンパ系分化の４週間後の、図５の磁気選別による細胞の各陽性画分についてのＣＤ３陽性細胞のパーセンテージを示している。 （Ｂ）ＴｉＰＳＣｓ１Ｅ細胞からの５週間の分化のＦＡＣＳプロットである。新たなリンパ細胞の発現についてのＣＤ３陽性細胞のフローサイトメトリー分析は、ＣＤ７＋、ＣＤ５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ３３５＋、ＣＤ１６１＋、ＴＣＲαβ＋、ＴＣＲγδ－である。
（Ａ）陽性及び陰性磁気選別画分の両方の１６日目におけるＨＰＣからのＴｉＰＣリンパ系分化プロセスの効率が産出リンパ細胞に対する投入ＨＰＣの比として示されている。 （Ｂ）陽性の磁気選別画分から開始する４週間の終了時の分化プロセスの累積効率である。
（Ａ）分化４２日目のｉＰＳＣ ０２１７９（ＭｅＣＰ２ ＷＴ）由来の樹状細胞の表現型分析である。細胞は、骨髄樹状細胞マーカーＣＤ２０５、ＣＤ２０９、ＨＬＡ－ＤＲ、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＣＤ８３の細胞表面の発現について染色した。 （Ｂ）樹状細胞で発現された様々な細胞表面マーカーの発現を定量するための代表的ＦＡＣＳプロットヒストグラムである。
ＤＱ ＴＭオボアルブミン（ＤＱ－ＯＶＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌで溶解し、１００μｇ／ｍｌでｉＰＳＣ由来ＤＣに添加した。細胞を３７℃又は４℃のいずれかでインキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターで分析した。ＯＶＡの特異的取り込みが、４℃での非特異的ＯＶＡ取り込みと比較した３７℃でのｉＰＳＣ由来ＤＣによって実証された。
ｈＰＣＳのフィーダーフリー無血清Ｔ細胞及びＮＫ細胞の分化を示す図である。ＰＳＣは、９日間にわたる凝集体形成、中胚葉誘導、及びＨＰＣ分化の連続的な工程によって懸濁（３Ｄ）胚体（ＥＢ）培養でＣＤ３４＋造血前駆細胞（ＨＰＣ）に最初に分化した。ＣＤ３４+細胞を、直接ＣＤ３４常磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＭＡＣＳによって単離し、２週間にわたりＴ／ＮＫ分化のためにＤＬＬ４＋レトロネクチン被覆プレートに移した。Ｔ細胞は、単独又は他のＴ細胞増殖促進サイトカイン（ＩＬ７、ＩＬ１５、ＩＬ２１）と組み合わせてＩＬ２が添加されたＴ－ＥＭ（ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ－ＸＦ Ｔ細胞増殖培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中の抗ＣＤ３ ｍＡｂ（ＯＫＴ３）＋レトロネクチン被覆（両方とも０．５μｇ／ｃｍ2）プレート上において、２週間の培養中にさらに増殖させることができた。略語：ＳＦＤＭ、無血清分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞増殖培地；ＭＡＣＳ、磁気活性化細胞選別。
Ｔ／ＮＫ分化培養のフローサイトメトリー分析である。Ｔ／ＮＫ分化条件における２週間後のＰＳＣ（１Ｃ ＴｉＰＳＣ）由来ＣＤ３４＋細胞は、低いＦＳＣ／ＳＳＣパラメーターによって定義される典型的なリンパ細胞集団を産生する（左側のドットプロット）。このリンパ系集団は、大部分がＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ５６＋ＣＤ３－ＮＫ細胞を含む（中央のドットプロット）。Ｔ細胞集団には、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の単一及び二重陽性細胞、並びにかなりの割合の二重陰性細胞が含まれる（右側のドットプロット）。
分化全体にわたる異なる細胞集団の収率である。各細胞型の収率が、図に示されている細胞誘導の各段階における投入絶対細胞数に対する産出量の比として表されている。例えば、１．５のＣＤ３４＋細胞収率は、１つの（投入）ＰＳＣ細胞から平均１．５（産出）のＣＤ３４＋細胞を誘導できることを示している。従って、１０２のＴ細胞収率は、１つの（投入）ＣＤ３４＋細胞から１０２の（産出）Ｔ細胞を誘導できることを示している。
ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型である。４週間にわたり分化及び増殖したＰＳＣ由来Ｔ細胞（ＣＤ３＋）は、α／βＴＣＲ（γ／δでも、不変Ｖα２４ ＮＫＴ ＴＣＲでもない）及び典型的なＴ細胞マーカーＣＤ５、ＣＤ２７、ＣＤ７を発現する。これらはまた、ＮＫ関連（ＣＤ１６１、ＣＤ９４）マーカー及び活性化（ＣＤ６９）マーカーを発現する。
ＰＳＣ由来Ｔ細胞の増殖である。固定化抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）が、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の増殖を達成するために最小限必要であり且つ十分である（棒グラフ）。水溶性刺激ＣＤ３及びＣＤ２８ ｍＡｂ（ｓＣＤ３、ｓＣＤ２８）は、単独（不図示）又は併用（ｓＣＤ３＋ｓＣＤ２８）、又はｉＣＤ３（ｉＣＤ３＋ｓＣＤ２８）に添加された場合のいずれにおいても有効でなかった。増殖培養で増殖するＴ細胞は、不規則な形状のリンパ芽球の特徴的な形態を獲得する（写真）。比較的不均一な投入細胞集団とは対照的に、２週間のＴ細胞増殖から収集された細胞は、本質的に純粋なＣＤ３＋Ｔ細胞であり、ＣＤ５６も発現し、ＣＤ８発現を獲得する（フローサイトメトリードットプロット）。
（Ａ）８日目のＨＰＣ培養物の代表的な写真であり、ＨＰＣは下層の内皮層から出芽する。 （Ｂ）２Ｄ ＨＰＣ分化プロセスの概略図である。 （Ｃ）分化の７～１０日目における０１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ ＫＯ）細胞株からのＨＰＣの産生である。 （Ｄ）分化の７～１０日目におけるＴｉＰＳＣｓ１Ｅ細胞株からのＨＰＣの産生である。細胞を収集し、ＣＤ４３／ＣＤ３４細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって定量した。 （Ｅ）ｉＰＳＣからのＨＰＣ産生の効率である。このプロセスの効率は、産生ＨＰＣの絶対数をｉＰＳＣの投入数で除すことによって計算される。 （Ｆ）プレＴ細胞及びプレＮＫ細胞の分析である。ｉＰＳＣ ０．１２７９．１０７．３９０２（ＭｅＣＰ２ ＫＯ）で産生されたＨＰＣを７～１０日目に収集し、凍結保存した。ＨＰＣを解凍し、レトロネクチン－ＤＬＬ４被覆プレート上で２５Ｋ／ｃｍ2の密度でプレーティングした。細胞を、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ペニシリンストレプトマイシン、９５μＭ Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸、５０ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３）、及びＩＬ－７を含む無血清の規定された（ＳＦＤ）培地に入れて、低酸素条件下でリンパ系分化を刺激した。４８時間ごとに細胞に新鮮な培地を供給し、１４日目に冷ＰＢＳを用いて収集した。ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ８、及びＣＤ３の表面発現について細胞を染色した。リンパ球散乱ゲートの下側のフローサイトメトリーによって細胞のパーセンテージを定量した。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ／Ｔ細胞の存在を定量した。 （Ｇ）プレＴ及びプレＮＫ細胞の分析である。ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ８、及びＣＤ３の表面発現について細胞を染色した。リンパ球散乱ゲートの下側のフローサイトメトリーによって細胞のパーセンテージを定量した。 （Ｈ）ＨＰＣからのＴ細胞の産生の効率である。このプロセスの効率は、産生されたＴ細胞（ＣＤ３＋）の絶対数をＨＰＣ（ＣＤ４３／３４＋）の投入数で除すことによって計算される。
（Ａ）Ｅ８培地及び低酸素条件の存在下において、マトリゲル又はビトロネクチン上でのフィーダーフリー増殖に適応させたｉＰＳＣを用いた３Ｄ ＨＰＣ分化プロセスの概略図である。ＨＰＣ分化の第１の段階は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦによって４日間行われ、分化の第２の段階は、ヘパリン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ－３リガンド、ＩＬ－３、及びＩＬ－６を含む培地中に細胞を入れることによって行われる。 （Ｂ）雄ｉＰＳＣ細胞株２．０３８でＭｅＣＰ２ＫＯを産生して９００６（０１２７９．１０７．００３９０２）を作製するためのエンジニアリング戦略である。 （Ｃ）ＭｅＣＰ２ ＴＡＬＥＮＳ及びドナープラスミドｐ１５５３でトランスフェクトした０１２７９ｉＰＳＣｓに由来するＭｅＣＰ２変異体００１、００２、００５、及び００８のアミノ酸配列の表現である。全ての変異体（００１、００２、００５、及び００８）は、ＭｅｔｈｙｌＣｐＧ結合ドメインをコードしていない。
２．５×１０4／ｃｍ2の密度でリンパ系分化を開始するためにＲｅｔ－ＤＬＬ４被覆プレート上に置かれた、ＨＰＣ分化の７～１１日目に収集されたプレＴ細胞及びプレＮＫ細胞のｉＰＳＣ Ｔｉｐｓ１Ｅの定量化である。低酸素条件下で維持した０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞（Ａ）及び酸素正常条件下で維持した０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞（Ｂ）、並びに０１２７９．１０７．３９０２細胞（ＭｅＣＰ２Ｋ０）（Ｃ）におけるＣＤ８＋ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ５６＋／ＣＤ８＋（ＮＫ細胞）、及びＣＤ５６＋／ＣＤ３＋（ＮＫ／Ｔ細胞）のパーセンテージを決定した。（Ａ～Ｂ）ＮＫ細胞は、陽性細胞のパーセンテージが最も高く、ＮＫ／Ｔ細胞、及びＴ細胞がこれに続く。（Ｃ）７日目から１０日目まで、陽性細胞のパーセンテージは、上から下にＴ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、及びＮＫ細胞である。１１日目では、陽性細胞のパーセンテージが最も高いのは、ＮＫ細胞、続いてＮＫ／Ｔ細胞、及びＴ細胞の順である。 ２．５×１０4／ｃｍ2の密度でリンパ系分化を開始するためにＲｅｔ－ＤＬＬ４被覆プレート上に置かれた、ＨＰＣ分化の７～１１日目に収集されたプレＴ細胞及びプレＮＫ細胞のｉＰＳＣ Ｔｉｐｓ１Ｅの定量化である。低酸素条件下で維持した０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞（Ａ）及び酸素正常条件下で維持した０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞（Ｂ）、並びに０１２７９．１０７．３９０２細胞（ＭｅＣＰ２Ｋ０）（Ｃ）におけるＣＤ８＋ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ５６＋／ＣＤ８＋（ＮＫ細胞）、及びＣＤ５６＋／ＣＤ３＋（ＮＫ／Ｔ細胞）のパーセンテージを決定した。（Ａ～Ｂ）ＮＫ細胞は、陽性細胞のパーセンテージが最も高く、ＮＫ／Ｔ細胞、及びＴ細胞がこれに続く。（Ｃ）７日目から１０日目まで、陽性細胞のパーセンテージは、上から下にＴ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、及びＮＫ細胞である。１１日目では、陽性細胞のパーセンテージが最も高いのは、ＮＫ細胞、続いてＮＫ／Ｔ細胞、及びＴ細胞の順である。 ２．５×１０4／ｃｍ2の密度でリンパ系分化を開始するためにＲｅｔ－ＤＬＬ４被覆プレート上に置かれた、ＨＰＣ分化の７～１１日目に収集されたプレＴ細胞及びプレＮＫ細胞のｉＰＳＣ Ｔｉｐｓ１Ｅの定量化である。低酸素条件下で維持した０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞（Ａ）及び酸素正常条件下で維持した０１２７９（ＭｅＣＰ２ＷＴ）細胞（Ｂ）、並びに０１２７９．１０７．３９０２細胞（ＭｅＣＰ２Ｋ０）（Ｃ）におけるＣＤ８＋ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ５６＋／ＣＤ８＋（ＮＫ細胞）、及びＣＤ５６＋／ＣＤ３＋（ＮＫ／Ｔ細胞）のパーセンテージを決定した。（Ａ～Ｂ）ＮＫ細胞は、陽性細胞のパーセンテージが最も高く、ＮＫ／Ｔ細胞、及びＴ細胞がこれに続く。（Ｃ）７日目から１０日目まで、陽性細胞のパーセンテージは、上から下にＴ細胞、ＮＫ／Ｔ細胞、及びＮＫ細胞である。１１日目では、陽性細胞のパーセンテージが最も高いのは、ＮＫ細胞、続いてＮＫ／Ｔ細胞、及びＴ細胞の順である。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたリンパ細胞を同定するためのゲーティング戦略である。（Ａ）ヒト成人末梢血由来のリンパ球の一般的な散乱プロフィールである。（Ｂ）分化１８日目のリンパ細胞の散乱プロフィールである。ＦＳＣ－ＳＳＣゲート及びリンパ系ゲートが例示されている。（Ｃ）ヨウ化プロピジウムを用いたＦＳＣ－ＳＳＣ散乱及びリンパ系散乱内の生細胞のゲーティングである。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで産生されたリンパ細胞を同定するためのゲーティング戦略である。分化１８日目のリンパ細胞の分散プロフィールが示されている。ＦＳＣ－ＳＳＣゲート及びリンパ系ゲートが例示されている。ヨウ化プロピジウムを用いてＦＳＣ－ＳＳＣ散乱及びリンパ系散乱内で生細胞をゲーティングし、続いてフローサイトメトリーによってＣＤ７及びＣＤ５陽性細胞について染色した。
２．５×１０4／ｃｍ2の密度でリンパ系分化を開始するためにＲｅｔ－ＤＬＬ４被覆プレート上に置かれた、ＨＰＣの分化の７～１１日目のＮＫ（ＣＤ３－／ＣＤ５６＋）細胞の定量である。全生存ＦＳＣ－ＳＳＣゲートの下側（Ａ）及びリンパ系ゲートの下側（Ｂ）の二重陽性ＣＤ５６＋／ＣＤ３－のパーセンテージを、ＭｅＣｐ２ ＷＴ及びＭｅＣｐ２ＫＯ状態を含むｉＰＳＣクローンについて決定した。 ２．５×１０4／ｃｍ2の密度でリンパ系分化を開始するためにＲｅｔ－ＤＬＬ４被覆プレート上に置かれた、ＨＰＣの分化の７～１１日目のＮＫ（ＣＤ３－／ＣＤ５６＋）細胞の定量である。全生存ＦＳＣ－ＳＳＣゲートの下側（Ａ）及びリンパ系ゲートの下側（Ｂ）の二重陽性ＣＤ５６＋／ＣＤ３－のパーセンテージを、ＭｅＣｐ２ ＷＴ及びＭｅＣｐ２ＫＯ状態を含むｉＰＳＣクローンについて決定した。
本開示は、体細胞（例えば、血液細胞）の開始集団からリプログラミングされた誘導多能性幹細胞から免疫細胞を産生するための高効率の方法を提供することにより、現在の技術に関連する問題を克服する。現在の方法によって産生される免疫細胞には、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、及び樹状細胞が含まれ得る。一部の態様では、体細胞の開始集団はＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、様々な供給源、例えば、血液試料から単離することができる。
体細胞集団は、例えばウイルス又はエピソームベクターを介した、リプログラミング因子の導入によってｉＰＳＣにリプログラミングされる。次いで、これらの体細胞由来ｉＰＳＣ（例えば、Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ））は造血前駆細胞に分化する。１つの方法では、分化プロセスは、ＷＮＴの活性化、造血誘発性サイトカインでの培養、及びＣＤ３４+細胞の単離を含む。従って、最後に、ＨＰＣは、免疫細胞、例えば、リンパ細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ／ＮＫ細胞）及び骨髄細胞（例えば、樹状細胞）に分化する。
リンパ細胞への分化は、フィーダーフリーマトリックスとしてＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ及びＤＬＬ－４の使用によるものであってもよい。Ｔ細胞分化は、効率及び成熟度を高めるためのアスコルビン酸の使用、並びに低酸素条件下での培養によってさらに増強することができる。興味深いことに、本発明者らは、リンパ系分化能のためのＨＰＣ分化中の最適な時間枠（例えば、７～１１日）を決定した。リンパ系分化能を有するこれらのＨＰＣは、ＣＤ３４及びＣＤ４３の発現によって同定することができる。加えて、リンパ系分化能が増強されたＨＰＣは、マーカーＣＤ１４４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ７の２つ以上に対して陽性である細胞の画分の選別によって単離することができる。一部の態様では、樹状細胞の誘導のための前駆体は、ＨＰＣ分化の約１６日目に出現する共通骨髄前駆細胞である。
体細胞由来ＰＳＣから産生されるリンパ細胞には、例えば遺伝子追跡マーカーとして又はヒトＴ細胞の開発を研究する再分化実験に利用することができる特性である、特徴的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再構成を保持したＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ／ＮＫ細胞が含まれ得る。本開示の特定の利点は、分化Ｔ細胞中に保持され得るＴ細胞受容体の再構成されて減少したＶ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、Ｊ遺伝子セグメントにある。これは、Ｔ細胞由来ｉＰＳ細胞の異なるクローン集団の特定の特徴又は「バーコード」として役立ち、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えが起きていない多能性幹細胞からのｉＰＳ細胞の分化も促進する。
従って、本開示の方法は、幅広い適用、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの安定移植、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化合物のスクリーニング、並びに血液疾患及び傷害の機構解明のために無制限の数の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、及び樹状細胞を提供することができる。
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、特定の成分に関する「本質的に含まない」は、本明細書では、特定の成分が組成物に意図的に全く配合されておらず、及び／又は単に汚染物質として若しくは微量で存在するという意味で用いられる。従って、あらゆる意図しない組成物の汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０５％を遥かに下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、特定の成分の量を標準的な分析方法で検出することができない組成物である。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書の請求項で、用語「含む」と合わせて使用される場合、単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。
請求項における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すことを明示的に示す場合を除いて、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物及び「及び／又は」のみを指すという定義を支持する。本明細書中で使用される「もう１つの」は、少なくとも２番目以上を意味し得る。
本出願を通して、「約」という用語は、値が、装置の固有の誤差のばらつきを含むことを示すために使用され、値又は研究対象間に存在するばらつきを決定するための方法が利用される。
細胞又は生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドに関して使用される「外因性」という用語は、人工又は天然の手段によって細胞又は生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドを指すか、又は細胞に関して、この用語は、単離され、続いて人工又は天然の手段によって他の細胞又は生物に導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物又は細胞由来であってもよく、又は生物若しくは細胞内で自然に発生する核酸の１つ以上のさらなるコピーであってもよい。外因性細胞は、異なる生物に由来してもよく、又は同じ生物に由来してもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然の細胞に存在するはずの位置と異なる染色体位置にある核酸、又は天然に存在するものと異なる核酸配列が隣接している核酸である。
「発現構築物」又は「発現カセット」とは、転写を誘導することができる核酸分子である。発現構築物は、最小限でも、１つ以上の所望の細胞型、組織、又は器官において遺伝子発現を誘導する１つ以上の転写調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、又はそれらの機能的に均等な構造）を含む。追加的な要素、例えば、転写終結シグナルも含まれ得る。
「ベクター」又は「構築物」（ときに遺伝子送達系又は遺伝子導入「ビヒクル」と呼ばれる）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子又は分子の複合体を指す。
一般的なタイプのベクターである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは別の、染色体ＤＮＡとは独立に複製することができる染色体外ＤＮＡ分子である。場合により、プラスミドは、環状且つ二本鎖である。
「複製の起点」（「ｏｒｉ」）又は「複製起点」は、細胞内のプラスミド中に存在する場合、プラスミドに及び／又はＤＮＡ合成が開始される部位若しくはその近傍に連結配列を維持することができるＤＮＡ配列、例えば、リンパ球指向性ヘルペスウイルスにおけるものである。一例として、ＥＢＶ（エプスタイン－バーウイルス）のｏｒｉは、ＦＲ配列（３０ｂｐ反復の２０の不完全なコピーである）、好ましくはＤＳ配列を含むが、ＥＢＮＡ－１に結合するＥＢＶの他の部位、例えば、Ｒｅｐ＊配列が複製起点としてＤＳを置換することができる（Ｋｉｒｓｈｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｕｇｄｅｎ，１９９８）。従って、ＥＢＶの複製起点は、ＦＲ、ＤＳ、又はＲｅｐ＊配列、又は核酸の改変若しくはこれに由来する合成の組み合わせによる任意の機能的に均等な配列を含む。例えば、本開示は、Ｌｉｎｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８に具体的に記載されているように、個々の要素の挿入又は突然変異などによる、ＥＢＶの遺伝子組換え複製起点を使用することもできる。
特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、又は「導入遺伝子」は、転写された核酸分子であり、任意選択により、適切な調節配列の制御下にある場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子産物、例えば、ポリペプチドに翻訳もされる。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれかの形態で存在し得る。ＤＮＡの形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（即ち、センス鎖）又は二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。遺伝子は、限定されるものではないが、原核又は真核ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核又は真核ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、通常、遺伝子配列の３’に位置する。
「制御要素」という用語は、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、スプライス部位などをまとめて指し、レシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写、転写後プロセッシング、及び翻訳をまとめて行う。選択されたコード配列が適切な宿主細胞において複製、転写、及び翻訳され得る限り、これらの制御要素の全てが存在する必要はない。
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用されるその通常の意味では、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指し、この調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。プロモーターは、調節タンパク質及び分子、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子が結合して核酸配列の特定の転写を開始し得る遺伝因子を含み得る。「機能的に配置された」、「機能的に連結された」、「制御下にある」、及び「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するために核酸配列に対して正しい機能的な位置及び／又は向きにあることを意味する。
「エンハンサー」とは、プロモーターに近接して配置された場合、エンハンサードメインの非存在下でプロモーターから生じる転写活性に対して転写活性を増大させる核酸配列を意味する。
核酸分子に関して「機能的に連結された」又は共発現される」とは、２つ以上の核酸分子（例えば、転写されるべき核酸分子、プロモーター、及びエンハンサー要素）が、核酸分子の転写を可能にするような方法で連結されていることを意味する。ペプチド及び／又はポリペプチド分子に関して「機能的に連結された」又は「共発現される」とは、２つ以上のペプチド及び／又はポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、即ち、融合ポリペプチドを生じるような方法で連結され、融合体の各ペプチド及び／又はポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有することを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくはキメラであり、即ち、異種分子から構成される。
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の同一性のパーセントを指す。１つの配列と別の配列との間の一致は、当技術分野で公知の技術によって決定することができる。例えば、相同性は、配列情報を整列させて、容易に利用可能なコンピュータプログラミングを使用することにより、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定することができる。別法では、相同性は、相同領域間の安定な二重鎖の形成、これに続く一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、及び消化された断片のサイズ決定を促進する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって決定することができる。２つのＤＮＡ配列又は２つのポリペプチド配列は、ヌクレオチド又はアミノ酸の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％がそれぞれ上記の方法を使用して決定される分子の定義された長さにおいて一致する場合、互いに「実質的に相同」である。
「細胞」という用語は、本明細書では、当技術分野のその最も広い意味で使用され、且つ多細胞生物の組織の構造単位であり、それを外部から隔離する膜構造によって取り囲まれ、自己複製の能力を有し、且つ遺伝子情報及びそれを発現するための機構を有する生体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞又は人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であり得る。
「幹細胞」という用語は、本明細書では、適切な条件下で多様な範囲の特殊化した細胞型に分化することができ、他の適切な条件下では自己複製し、本質的に未分化多能性状態を維持することができる細胞を指す。「幹細胞」という用語は、多能性細胞、多分化能細胞、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、及び前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）も包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血又は間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、又は胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から得ることができる。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連するある転写因子の発現によってそれらを多能性状態にリプログラミングすることによって体細胞から産生され得る。これらの細胞は、「誘導多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ若しくはｉＰＳ細胞」と呼ばれている。
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期段階の胚、例えば、胚盤胞期の内部細胞塊から得られるか、又は人工的手段（例えば、核移植）によって作製される未分化多能性細胞であり、生殖細胞（例えば、精子及び卵）を含む、胚又は成体における任意の分化細胞型を生じさせることができる。
「誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ又はｉＰＳ細胞）」は、因子（本明細書ではリプログラミング因子と呼ばれる）の組み合わせを発現させるか又は発現を誘導することにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児、出生後、新生児、若年、又は成体の体細胞を用いて作製することができる。ある実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用できる因子には、例えば、Ｏｃｔ４（ときにＯｃｔ３／４と呼ばれる）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８が含まれる。一部の実施形態では、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、少なくとも４つのリプログラミング因子、少なくとも５つのリプログラミング因子、少なくとも６つのリプログラミング因子、又は少なくとも７つのリプログラミング因子を発現させることによってリプログラミングされる。
「造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）」又は「造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）」は、造血系統になる運命にあるが、さらに造血系に分化することができる細胞を指し、造血幹細胞、多能性造血幹細胞、共通骨髄前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、及びリンパ系前駆細胞を含む。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系（単球及びマクロファージ、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球、及び肥満細胞）、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ系統（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ－細胞）を含む全ての血液細胞型を生じさせる多能性幹細胞である（例えば、Ｄｏｕｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１２；Ｎｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１５を参照されたい）。「多リンパ系前駆細胞（ｍｕｌｔｉｌｙｍｐｈｏｉｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」（ＭＬＰ）は、全てのリンパ系統（Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞）を発生させるが、他の（骨髄系）分化能を有しても有していなくてもよい任意の前駆細胞を指すと定義され（Ｄｏｕｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ＣＤ４５ＲＡ+／ＣＤ１０+／ＣＤ７-である。いずれのＢ前駆細胞、Ｔ前駆細胞、及びＮＫ前駆細胞もＭＬＰと呼ばれることもある。「共通骨髄前駆細胞」（ＣＭＰ）は、顆粒球、単球、巨核球，及び赤血球を発生させ得るＣＤ４５＋／ＣＤ３１＋／ＣＤ４３＋／ＣＤ３４-細胞の発現によって定義される共通骨髄前駆細胞を指す。造血前駆細胞は、ＣＤ３４を発現し得る。造血前駆細胞は、ＣＤ１３３を共発現し得るが、ＣＤ３８の発現は陰性であり得る。造血前駆細胞には、ＣＤ３４+／ＣＤ４５+造血前駆細胞及びＣＤ３４+／ＣＤ４５+／ＣＤ４３+造血前駆細胞が含まれる。ＣＤ３４+／ＣＤ４３+／ＣＤ４５+造血前駆細胞は、骨髄前駆細胞で高度に濃縮され得る。造血細胞はまた、以下を含む原始造血細胞の様々なサブセットも含む：ＣＤ３４-／ＣＤ１３３+／ＣＤ３８-（原始造血前駆細胞）、ＣＤ４３（＋）ＣＤ２３５ａ（＋）ＣＤ４１ａ（＋／－）（赤血球－巨核球生成（ｅｒｙｔｈｒｏ－ｍｅｇａｋａｒｙｏｐｏｉｅｔｉｃ））、ｌｉｎ（－）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（－）（多能性）、及びｌｉｎ（－）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（＋）（骨髄性スキュー（ｍｙｅｌｏｉｄ－ｓｋｅｗｅｄ））細胞、ＣＤ１３３＋／ＡＬＤＨ＋（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）（例えば、Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．２００４；Ｃｈｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。これらの原始造血細胞型又は造血前駆細胞のいずれかが、本明細書に記載されるようにｉＰＳ細胞に変換され得ることが予想される。一部の態様では、細胞は、肥満細胞、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＣＩＫ Ｔ細胞、又はＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞の他のサブタイプを含み得る。
本明細書で使用される「免疫細胞（複数可）」という用語は、限定されるものではないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、赤血球、単球、好塩基球、好中球、肥満細胞、好酸球、及びそれらの任意の組み合わせを含む免疫系の細胞を指す。
Ｔ細胞の「アクチベーター」又はＴ細胞を活性化する条件は、Ｔ細胞を活性化する刺激を指し、且つ抗原提示細胞又は他の表面に提示され得る抗原；特異性にかかわらず多数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に結合し、且つレクチン、例えば、コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ－Ａ）及びフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、及びＴＣＲ又はＣＤ３タンパク質上の不変フレームワークエピトープに特異的に結合する抗体などの作用物質を含むポリクローナルアクチベーター；及びかなりの数のＴ細胞を刺激し、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃａｌエンテロトキシンなどのエンテロトキシンを含むスーパー抗原を含む。
「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」という用語は、互換的に使用され、１つ以上のＭＨＣ分子又は１つ以上の非古典的ＭＨＣ分子と共に抗原提示細胞又はマトリックスの表面に提示された場合に抗原を認識することができるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞を指す。
「Ｔ細胞」という用語は、当技術分野で定義されるＴリンパ球を指し、胸腺細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、静止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球を含むものとする。Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ８+Ｔ細胞、又はＣＤ４-ＣＤ８-細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞、又はＴヘルパー２（ＴＨ２）細胞、又はＴＨ１７細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、及び調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞、又はγδＴ細胞であり得る（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｗｙｎｎ，２００５；Ｌａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２００６）。ＣＤ４のような少なくとも１つのマーカーが互いに異なるＴ細胞は、本明細書ではＴ細胞の「サブセット」と呼ばれる。
「ＣＤ４+Ｔ細胞」は、その表面にＣＤ４を発現し、且つ細胞媒介性免疫反応に関連するＴ細胞のサブセットを指す。ＣＤ４+Ｔ細胞は、サイトカイン、例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、及びＩＬ－１０の分泌を含み得る刺激後の分泌プロフィールによって特徴付けられる。「ＣＤ４」は、もともとＴリンパ球上の分化抗原と定義された５５ｋＤの糖タンパク質であるが、単球／マクロファージを含む他の細胞にも見られる。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、且つＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ制限免疫反応における会合認識要素として関与している。ＣＤ４抗原は、Ｔリンパ球に対するヘルパー／誘導物質サブセットを定義する。
「ＣＤ８+Ｔ細胞」は、その表面にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ制限であり、且つ細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞上、並びに細胞傷害性及びサプレッサーＴリンパ球上に見られる分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、且つ主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ制限相互作用における会合認識要素である。
「多能性幹細胞」とは、１つ以上の組織若しくは器官、又は好ましくは３つの胚葉：内胚葉（内側胃粘膜、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、若しくは外胚葉（表皮組織及び神経系）のいずれかを構成する全ての細胞に分化する能力を有する幹細胞である。
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、生殖細胞、例えば、卵細胞又は精子など以外のあらゆる細胞を指し、そのＤＮＡを次世代に直接伝達しない。典型的には、体細胞は、多能性が限られているか又は多能性を有していない。本明細書で使用される体細胞は、天然に存在するものでもよく、又は遺伝子改変されたものでもよい。
「プログラミング」は、細胞が産生できる子孫のタイプを変化させるプロセスである。例えば、細胞がプログラミングなしの同じ条件下で産生できるはずの細胞型と比較して、細胞が培養又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで少なくとも１つの新しい細胞型の子孫を産生できるように変更された場合に細胞はプログラミングされたことになる。これは、プログラミング前に新しい細胞型の表現型特性を有する子孫を本質的に産生できなかったにもかかわらず、十分な増殖後に測定可能な割合のこのような子孫が観察されること；或いは新しい細胞型の特徴を有する割合がプログラミング前よりもかなり高いことを意味する。このプロセスには、分化、脱分化、及び分化転換が含まれる。
「分化」は、あまり特殊化されていない細胞がより特殊化した細胞型になるプロセスである。「脱分化」は、部分的に又は最終的に分化した細胞が初期発生段階、例えば、多能性又は多分化能に戻る細胞プロセスである。「分化転換」は、１つの分化細胞型を別の分化細胞型に変換するプロセスである。典型的には、プログラミングによる分化転換は、細胞が中間多能性期を経ずに起こる － 即ち、細胞は、１つの分化細胞型から別の分化細胞型に直接プログラミングされる。ある条件下では、新しい細胞型の特徴を有する子孫の割合は、より好ましくなる順に少なくとも約１％、５％、２５％、又はそれを上回り得る。
「リプログラミング」は、培養又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、リプログラミングなしで同じ条件下で有するであろう能力よりも測定可能に高い少なくとも１つの新しい細胞型の子孫を形成する能力を細胞に付与するプロセスである。より具体的には、リプログラミングは、体細胞に多能性を付与するプロセスである。これは、十分な増殖後、リプログラミング前はこのような子孫を本質的に形成できなかった場合、新しい細胞型の表現型特性を有する子孫の測定可能な割合が、そうでない場合には新しい細胞型の特性を有する割合がリプログラミング前よりも測定可能に高いことを意味する。ある条件下では、新しい細胞型の特性を有する子孫の割合は、好ましい順に少なくとも約１％、５％、２５％又はそれを上回り得る。
「フォワードプログラミング」という用語は、１つ以上の特定の系統決定遺伝子又は遺伝子産物を多分化能細胞又は多能性細胞に提供することによる、多能性を有さない分化体細胞とは対照的な多分化能細胞又は多能性細胞のプログラミングを指す。例えば、フォワードプログラミングは、ＥＳＣ又はｉＰＳＣを造血前駆細胞若しくは他の前駆細胞、又は造血細胞若しくは他の分化体細胞にプログラミングするプロセスを表し得る。
本明細書で使用される「対象」又は「それを必要とする対象」という用語は、細胞移植又は組織移植を必要とする任意の年齢の雄又は雌の哺乳動物、好ましくはヒトを指す。典型的には、対象は、障害若しくは病的若しくは望ましくない状況、状態、又は症候群、又は細胞若しくは組織移植による処置に適した身体的、形態学的、若しくは生理学的異常が原因で細胞移植若しくは組織移植（本明細書ではレシピエントとも呼ばれる）を必要とする。
本明細書で使用される場合、遺伝子の「破壊」は、破壊が存在しない遺伝子産物の発現レベルと比較した、細胞内での対象となる遺伝子によってコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現の消失又は減少を意味する。例示的な遺伝子産物には、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質産物が含まれる。破壊は、一過性又は可逆性破壊の場合もあり、又は永久的な場合もある。破壊は、切断された産物又は非機能性産物が産生され得るという事実にもかかわらず、場合により機能的又は完全長タンパク質又はｍＲＮＡの破壊である。本明細書の一部の実施形態では、発現ではなく、遺伝子の活性化又は機能が破壊される。遺伝子破壊は、一般に、人工的方法、即ち、化合物、分子、複合体、若しくは組成物の添加若しくは導入により、及び／又は例えばＤＮＡレベルでの遺伝子の核酸又はそれに関連する核酸の破壊により誘導される。遺伝子破壊の例示的な方法には、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、及び／又は遺伝子破壊技術、例えば、遺伝子編集が含まれる。例としては、アンチセンス技術、例えば、一般に一過性の発現の減少をもたらすＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又はリボザイム、並びに例えば切断及び／又は相同的組換えの導入により、標的遺伝子の不活性化又は破壊をもたらす遺伝子編集技術が挙げられる。例としては、挿入、突然変異、及び欠失が挙げられる。破壊は、典型的には、遺伝子によってコードされる正常又は「野生型」産物の発現の抑制及び／又は完全な欠如をもたらす。典型的なこのような遺伝子破壊は、遺伝子又は遺伝子の一部の挿入、フレームシフト、及びミスセンス突然変異、欠失、ノックイン、及びノックアウトであり、全遺伝子の欠失も含む。このような破壊は、コード領域、例えば、１つ以上のエクソンで起こり得、その結果、例えば、終止コドンの挿入によって完全長産物、機能的産物、又は任意の産物を産生できなくなる。このような破壊は、プロモーター又はエンハンサー、又は転写の活性化に影響を与える他の領域の破壊によっても起こり、遺伝子の転写を妨げ得る。遺伝子破壊には、相同組換えによる標的遺伝子不活性化を含む遺伝子ターゲティングが含まれる。
「Ｎｏｔｃｈリガンド」は、多くの異なる哺乳動物細胞、例えば、造血幹細胞の膜に存在するＮｏｔｃｈ受容体ポリペプチドに結合することができるタンパク質である。ヒト細胞で同定されたＮｏｔｃｈ受容体には、Ｎｏｔｃｈ－１、Ｎｏｔｃｈ－２、Ｎｏｔｃｈ－３、及びＮｏｔｃｈ－４が含まれる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、典型的には、アミノ末端における２０～２２個のアミノ酸、及び細胞外表面に３～８個のＥＧＦ様リピートを含むＤＳＬドメイン（Ｄ－Ｄｅｌｔａ、Ｓ－Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＬ－Ｌａｇ２）を有する（Ｆｕｒｉｅ ａｎｄ Ｆｕｒｉｅ，１９８８；Ｋｎｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。
ＩＩ．体細胞由来ｉＰＳＣ
Ａ．体細胞の開始集団
本開示の実施形態は、ｉＰＳＣにリプログラミングされる体細胞（例えば、赤血球又は皮膚細胞）の開始集団に関する。血液細胞集団には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血又はその画分を含む混合集団、脾細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球搬出法によって得られる細胞、生検組織、及びリンパ節、例えば、腫瘍から排出されるリンパ節が含まれ得る。適切なドナーには、免疫化ドナー、非免疫化（ナイーブ）ドナー、処置又は未処置ドナーが含まれる。「処置」ドナーは、１つ以上の生物学的修飾因子に曝露されたドナーである。「未処置」ドナーは、１つ以上の生物学的修飾因子に曝されていない。
一部の態様では、血液細胞集団はＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、精製されたＴ細胞集団であってもよく、又はＴ細胞は、異なるタイプの細胞、例えば、Ｂ細胞及び／又は他の末梢血細胞を含む集団中に存在し得る。Ｔ細胞は、Ｔ細胞のサブセット、例えば、ＣＤ４+Ｔ細胞の精製された集団であってもよく、又はＴ細胞の異なるサブセットを含むＴ細胞集団であってもよい。別の実施形態では、Ｔ細胞は、長期間にわたって培養で維持されたＴ細胞クローンである。Ｔ細胞クローンは、様々な程度に形質転換され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、培養で無限に増殖するＴ細胞クローンである。
一部の態様では、Ｔ細胞は初代Ｔ細胞である。「初代Ｔ細胞」という用語は、長期間にわたって培養されて維持されたＴ細胞とは対照的に、個体から得られたＴ細胞を含むものとする。従って、初代Ｔ細胞は、特に、対象から得られる末梢血Ｔ細胞である。初代Ｔ細胞集団は、大部分がＴ細胞の１つのサブセットから構成され得る。別法では、初代Ｔ細胞集団は、異なるＴ細胞のサブセットから構成され得る。
Ｔ細胞は、以前に保存された血液試料、健康な個体、又はある状態に侵されている個体に由来し得る。この状態は、感染症、例えば、ウイルス感染、細菌感染、又は任意の他の微生物による感染から生じる状態、又は過剰増殖性疾患、例えば、メラノーマのような癌であり得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した個体に由来する。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞は、自己免疫疾患又はＴ細胞病に罹患している対照又はこれらに罹りやすい対象に由来する。Ｔ細胞は、ヒト由来、マウス由来、又は任意の他の哺乳動物種由来であり得る。
Ｔ細胞を含む細胞集団を得る方法は、当技術分野で周知である。例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、当技術分野で公知の方法に従って、説明されているように得ることができる。このような方法の例は、実施例に記載されており、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）；Ｂｉｓｗａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって論じられている。
一部の態様では、血液細胞の開始集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。ＨＳＣは、通常、骨髄に存在するが、血液中に押し出すことができ、これは、末梢血において多数のＨＳＣを収集するために臨床的に使用されている動員とよばれるプロセスである。動員物質の選択肢の１つは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）である。末梢血中を循環するＣＤ３４+造血幹細胞又は前駆細胞は、妨害されていない状態又はＧ－ＣＳＦのような造血成長因子の外部投与後の動員後のいずれかでのアフェレーシス技術によって収集することができる。動員後に収集された幹細胞又は前駆細胞の数は、妨害されていない状態でのアフェレーシス後に得られたものよりも多い。一部の態様では、細胞集団の供給源は、造血幹細胞又は前駆細胞を濃縮する必要がないため、外的に適用された因子によって細胞が動員されていない対象である。
また、細胞集団から造血前駆細胞を得る方法も当技術分野で周知である。造血前駆細胞は、様々なサイトカイン、例えば、ｈＳＣＦ、ｈＦＬＴ３、及び／又はＩＬ－３（Ａｋｋｉｎａ ｅｔ ａｌ．，１９９６）を用いて増殖させてもよく、又はＭＡＣＳ又はＦＡＣＳを用いてＣＤ３４+細胞を濃縮してもよい。上述のように、陰性選択技術を用いてＣＤ３４+細胞を濃縮することもできる。
本明細書に記載の方法で使用される細胞集団は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、げっ歯類細胞（例えば、マウス又はラット）、ウシ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、及びネコ細胞、又はこれらの混合物であり得る。非ヒト霊長類細胞には、アカゲザル細胞が含まれる。細胞は、動物、例えば、ヒト患者から得てもよく、又は細胞株に由来してもよい。細胞が動物から得られる場合、それら自体を、例えば、単離されていない細胞（即ち、混合集団）として使用してもよく；それらは、例えば、形質転換によって最初に培養で樹立してもよく；又はそれらは、予備的な精製方法を施してもよい。例えば、細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づいた陽性若しくは陰性選択によって操作してもよく；ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで１つ以上の抗原を用いて刺激してもよく；ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで１つ以上の生物学的修飾因子で処理してもよく；又はこれらのいずれか又は全ての組み合わせでもよい。例示的な一実施形態では、細胞集団は、非Ｔ細胞及び／又は特定のＴ細胞のサブセットの欠乏について陰性選択が行われる。陰性選択は、Ｂ細胞マーカー、例えば、ＣＤ１９及びＣＤ２０；単球マーカーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ５６を含む様々な分子の細胞表面の発現に基づいて行うことができる。別法では、細胞集団は、非ＣＤ３４+造血細胞及び／又は特定の造血細胞のサブセットの欠乏について陰性選択を行うことができる。陰性選択は、例えば、ＭＡＣＳ又はカラム分離による他の細胞型の分離に使用することができる様々な分子、例えば、抗体のカクテル（例えば、（例えば、巨核球系統の細胞の）ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２３５ａ、及びＣＤ４１）の細胞表面の発現に基づいて行うことができる。
また、対象から細胞試料を得、次いでそれを所望の細胞型に濃縮することも可能である。例えば、ＰＢＭＣ及び／又はＣＤ３４+造血細胞は、本明細書に記載されるように血液から単離することができる。向流遠心分離（水簸法）を使用して、ＰＢＭＣからＴ細胞を濃縮することができる。また、様々な技術、例えば、所望の細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体を用いた単離及び／又は活性化を用いて、細胞を他の細胞から単離することができ、例えば、ある種のＴ細胞単離キットは、抗体結合ビーズを使用して細胞を活性化させ、それにより同じビーズを用いたカラム分離を可能にする。使用できる別の方法には、受容体の結合によって細胞を活性化させることなく、細胞表面マーカーに対する抗体を用いて特定の細胞型を選択的に濃縮する陰性選択が含まれる。
骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又、は他の髄腔から得ることができる。骨髄を患者から採取し、様々な分離及び洗浄手順によって単離することができる。骨髄細胞の単離のための既知の手順は、以下の工程を含む：（ａ）骨髄懸濁液を３つの画分に遠心分離して、中間画分又はバフィーコートを収集すること；（ｂ）工程（ａ）からのバフィーコート画分を、一般にはＦｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＡＢの商標）である分離流体でもう１回遠心分離し、及び骨髄細胞を含む中間画分を収集すること；及び（ｃ）工程（ｂ）からの収集した画分を、再輸血可能な骨髄細胞にするために洗浄すること。
Ｔ細胞で濃縮された細胞集団を使用することを望む場合、このような細胞集団は、連続フローセルセパレーターを用いる白血球搬出法及び機械的アフェレーシスによって細胞の混合集団から得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅ（商標）勾配での分離、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配での分離、又は水簸法を含む任意の公知の方法によってバフィーコートから単離することができる。
ある態様では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体に結合する作用物質によって活性化して、Ｔ細胞活性化のシグナル伝達カスケードを引き起こす。例えば、ＣＤ３抗体を使用することができる。Ｔ細胞をかなりの数まで増殖させてリプログラミングのための増殖状態にするために、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２を使用することもできる。ある態様では、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の両方を、共刺激を伴うＴ細胞の活性化に用いることができる。代替の一態様では、抗ＣＤ３の架橋、例えば、プレートに結合した抗ＣＤ３を適用することができる。可溶性抗ＣＤ３を用いてＰＢＭＣ中でＴ細胞を活性化する場合、可溶性抗ＣＤ３抗体をＰＢＭＣ中でＡＰＣに結合することができ、次いでこの抗体をＴ細胞に提示する。可溶性抗ＣＤ３抗体のみを精製Ｔ細胞集団に使用する場合、上述の理由からアネルギーが生じるはずである。ある実施形態は、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及びＩＬ２の存在下でＴ細胞を培養することを含み、これは、費用のかかる煩雑なビーズ又はプレート結合抗体を使用する必要がないため、有利で便利であり；ＯＫＴ３及びＩＬ２を加えた後、ＰＢＭＣの細胞環境がＴ細胞の活性化を促進するはずである。次いで、Ｔ細胞が選択的増幅によりＰＢＭＣ培養物中の他の細胞型を過密状態にする。
ある態様では、血液細胞の開始集団は、例えばリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）に由来するリンパ芽球様細胞を含む。例えばＢ細胞のエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）での感染によるＬＣＬの作製は、当技術分野で公知である（Ｆｒｉｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐａｒｔ ＩＩＩ，１２５－１２７，２００１）。
Ｂ．リプログラミング因子
ある実施形態では、体細胞の開始集団は、リプログラミング因子の導入によってｉＰＳ細胞にリプログラミングされる。ｉＰＳ細胞の作製では、導入に用いられるリプログラミング因子が重要である。以下の因子又はその組み合わせを、本開示で明らかにされる方法で使用することができる。ある態様では、Ｓｏｘ及びＯｃｔ（特にＯｃｔ３／４）をコードする核酸は、リプログラミングベクターに含まれる。例えば、１つ以上のリプログラミングベクターは、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及び任意選択によるＬｉｎ２８をコードする発現カセット、又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、及び任意選択によるｃ－Ｍｙｃをコードする発現カセット、又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、及び任意選択によるＥｓｒｒｂをコードする発現カセット、又はＳｏｘ２、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及び任意によるＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする発現カセットを含み得る。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、同じ発現カセット、異なる発現カセット、同じリプログラミングベクター、又は異なるリプログラミングベクターに含めることができる。
Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ遺伝子ファミリーのあるメンバー（Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、及びＳｏｘ１５）は、導入プロセスに関与する重要な転写調節因子として同定されており、これらが存在しないと導入が不可能となる。しかしながら、Ｋｌｆファミリー（Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及びＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（ｃ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、及びＮ－Ｍｙｃ）、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のあるメンバーを含む追加の遺伝子は、導入効率を高めることが明らかにされた。
Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）は、八量体（「Ｏｃｔ」）転写因子のファミリーの１つであり、多能性の維持に重要な役割を果たす。Ｏｃｔ４+細胞、例えば、割球や胚性幹細胞中にＯｃｔ４が存在しないと、栄養膜が自然に分化し、Ｏｃｔ４が存在すると、胚性幹細胞の多能性及び分化能が生じる。Ｏｃｔ４の近縁のＯｃｔ１及びＯｃｔ６を含む「Ｏｃｔ」ファミリーの様々な他の遺伝子は、誘導を導くことができず、これは、Ｏｃｔ－４が導入プロセスにとって唯一のものであることを実証している。
Ｓｏｘファミリーの遺伝子は、多能性幹細胞でのみ発現されるＯｃｔ４とは対照的に多能性及び単分化能幹細胞に関連しているが、Ｏｃｔ４と同様に多能性の維持に関与している。Ｓｏｘ２は、導入をリプログラミングするために使用された最初の遺伝子であったが、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も導入プロセスで同様に機能することが分かった。Ｓｏｘ１は、Ｓｏｘ２と同等の効率でｉＰＳ細胞を発生させ、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、及びＳｏｘ１８も、効率は低いがｉＰＳ細胞を発生させる。
胚性幹細胞において、Ｎａｎｏｇは、Ｏｃｔ４及びＳｏｘ２と共に多能性の促進に必要である。従って、Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．が、Ｎａｎｏｇが誘導に必要ではないと報告したのは驚きであったが、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．が、因子の１つとしてＮａｎｏｇでｉＰＳ細胞の作製が可能であると報告している。
Ｌｉｎ２８は、胚性幹細胞並びに分化及び増殖に関連する胚性癌細胞で発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質である。Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｌｉｎ２８が、なくてもよいがｉＰＳの発生における因子であることを実証した。
Ｋｌｆファミリーの遺伝子であるＫｌｆ４は、最初にＹａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７によって同定され、Ｊａｅｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８によってマウスｉＰＳ細胞の発生の因子として確認され、及びＹａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７によってヒトｉＰＳ細胞の発生の因子として実証された。しかしながら、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．は、Ｋｌｆ４がヒトｉＰＳ細胞の発生に不要であり、実際にヒトｉＰＳ細胞の産生に失敗したと報告した。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ４は、ｉＰＳ細胞を発生させることができる因子であることが分かり、効率は低いが関連遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５も同様であった。
Ｍｙｃファミリー遺伝子は、癌に関与する癌原遺伝子である。Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７及びＪａｅｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９８８は、ｃ－ＭｙｃがマウスｉＰＳ細胞の発生に関与する因子であることを実証し、及びＹａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，２００７は、ｃ－ＭｙｃがヒトｉＰＳ細胞の発生に関与する因子であることを実証した。しかしながら、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．及びＹａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．は、ｃ－ＭｙｃがヒトｉＰＳ細胞の発生に不要であると報告した。ＳＶ４０ラージ抗原を使用して、ｃ－Ｍｙｃが発現されるときに起こり得る細胞毒性を軽減又は予防することができる。
本開示で使用されるリプログラミングタンパク質は、ほぼ同じリプログラミング機能を有するタンパク質相同体によって置き換えることができる。これらの相同体をコードする核酸もリプログラミングに使用することができる。保存的アミノ酸置換、例えば、極性酸性アミノ酸としてはアスパラギン酸－グルタミン酸；極性塩基性アミノ酸としてはリジン／アルギニン／ヒスチジン；非極性又は疎水性アミノ酸としてはロイシン／イソロイシン／メチオニン／バリン／アラニン／グリシン／プロリン；極性又は非荷電親水性アミノ酸としてはセリン／トレオニンが好ましい。保存的アミノ酸置換には、側鎖に基づく分類も含まれる。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；及び硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。例えば、ロイシンのイソロイシン又はバリンでの置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での置換、トレオニンのセリンでの置換、又はアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での同様の置換は、得られるポリペプチドの特性に大きい影響を与えないと予想するのが妥当である。アミノ酸の変化により機能的ポリペプチドが生じるか否かは、ポリペプチドの特異的活性をアッセイすることによって容易に判定することができる。
Ｃ．体細胞のリプログラミング
本開示のある態様では、リプログラミング因子は、１つ以上のベクター、例えば、組み込みベクター又はエピソームベクターに含まれる発現カセットから発現される。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質は、タンパク質導入によって体細胞に直接導入することができる。
当業者であれば、標準的な組換え技術（例えば、共に参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）によってベクターを構築するための十分な知識を備えているであろう。ベクターには、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来）、その複製可能型、複製欠損型、及び無活力（ｇｕｔｌｅｓｓ）型を含むアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン－バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが含まれる。
１．ウイルスベクター
ウイルスベクターは、本開示のある態様で提供することができる。組換えウイルスベクターの作製では、非必須遺伝子は、典型的には、異種（又は非天然）タンパク質の遺伝子又はコード配列で置換される。ウイルスベクターは、ウイルス配列を利用して核酸及び場合によりタンパク質を細胞に導入するある種の発現構築物である。受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞に感染する又は細胞に侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれてウイルス遺伝子を安定且つ効率的に発現させるあるウイルスの能力により、このようなあるウイルスは、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移入するための魅力的な候補となる。本開示のある態様の核酸を送達するために使用することができるウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、多量の外来遺伝子材料を移入し、広範囲の種及び細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングする能力により、遺伝子送達ベクターとして有望である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
レトロウイルスベクターを構築するために、あるウイルス配列の代わりに核酸をウイルスゲノムに挿入して、複製欠損ウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を作製する（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共に、特別な細胞株に導入される場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物のウイルス粒子へのパッケージングを可能にし、これらのウイルス粒子が培地中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意選択により濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込み及び安定発現には宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５）。
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは、当技術分野で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号明細書及び同第５，９９４，１３６号明細書を参照されたい）。
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方の遺伝子導入及び核酸配列の発現のために使用することができる。例えば、適切な宿主細胞が、パッケージング機能、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、さらにｒｅｖ及びｔａｔを有する２つ以上のベクターでトランスフェクトされた非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９９４，１３６号明細書に記載されている。
２．エピソームベクター
プラスミド又はリポソームベースの染色体外（即ち、エピソーム）ベクターの使用も本開示のある態様で提供することができる。このようなエピソームベクターは、例えば、ｏｒｉＰベースのベクター、及び／又はＥＢＮＡ－１の誘導体をコードするベクターを含み得る。これらのベクターにより、ＤＮＡの大きい断片を細胞に導入し、染色体外で維持し、細胞周期ごとに１回複製し、効率的に娘細胞に分裂させることができ、免疫応答を実質的に誘発しない。
特に、ｏｒｉＰベースの発現ベクターの複製に必要とされる唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ－１は、ＭＨＣクラスＩ分子上でのその抗原提示に必要なプロセシングを迂回するための効率的な機構を開発したため、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。さらに、ＥＢＮＡ－１は、トランスで作用してクローニングされた遺伝子の発現を増強し、いくつかの細胞株において最大１００倍までクローニングされた遺伝子の発現を誘導することができる（Ｌａｎｇｌｅ－Ｒｏｕａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。最後に、このようなｏｒｉＰベースの発現ベクターの製造は安価である。
他の染色体外ベクターには、他のリンパ指向性ヘルペスウイルスベースのベクターが含まれる。リンパ指向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）で複製し、その自然のライフサイクルの一部としてプラスミドになるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ指向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ指向性ヘルペスウイルスには、限定されるものではないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）及びマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が含まれる。エピソームベースのベクターの他の供給源、例えば、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、又はＢＰＶも企図される。
当業者であれば、標準的な組換え技術（例えば、共に参照により本明細書に組み入れられるＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照されたい）によってベクターを構築するための十分な知識を備えているであろう。
ベクターはまた、遺伝子送達及び／若しくは遺伝子発現をさらに調節するか、又はそうではない場合に標的細胞に有益な特性を付与する他の成分若しくは機能性も含み得る。このような他の成分には、例えば、細胞（細胞型又は組織特異的結合を媒介する成分を含む）への結合又は標的化に影響を与える成分；細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を与える成分；取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を与える成分（例えば、核局在化を媒介する薬剤）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を与える成分を含む。
このような成分はまた、マーカー、例えば、ベクターによって送達された核酸を取り込んで発現している細胞を検出又は選択するために使用することができる検出可能なマーカー及び／又は選択マーカーを含み得る。このような成分は、ベクターの天然の特徴（例えば、結合及び取り込みを媒介する成分又は機能性を有するあるウイルスベクターの使用）として提供することができ、又はベクターは、このような機能を提供するように改変することができる。様々なこのようなベクターは、当技術分野で公知であり、一般に入手可能である。ベクターが宿主細胞内に維持される場合、ベクターは、自律的構造として有糸分裂中に細胞によって安定に複製されるか、宿主細胞のゲノム内に組み込まれるか、又は宿主細胞の核若しくは細胞質に維持され得る。
３．トランスポゾンベースの系
ある態様では、プログラミング因子の送達は、トランスポゾン－トランスポザーゼ系を使用することができる。例えば、トランスポゾン－トランスポザーゼ系は、周知のＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン－トランスポザーゼ系（後者の説明については、例えば、欧州特許第１５０７８６５号明細書を参照されたい）、又はＴＴＡＡ特異的トランスポゾンＰｉｇｇｙＢａｃ系であり得る。
トランスポゾンは、単一細胞のゲノム内の異なる位置に移動することができるＤＮＡの配列であり、この移動は、転移と呼ばれるプロセスである。このプロセスでは、トランスポゾンは、突然変異を引き起こしてゲノム中のＤＮＡの量を変化させ得る。トランスポゾンは、ジャンプ遺伝子と呼ばれた時期もあり、可動遺伝因子の例である。
様々な可動遺伝因子が存在し、これらは、その転移機構に基づいて分類することができる。クラスＩ可動遺伝因子、即ち、レトロトランスポゾンは、最初にＲＮＡに転写され、次いで逆転写酵素によってＤＮＡに逆転写され、次いでゲノム内の別の位置に挿入されることによって自己複製する。クラスＩＩ可動遺伝因子は、それら自体を「カットアンドペースト」するために、トランスポザーゼを用いてゲノム内である位置から別の位置に直接移動する。
特定の実施形態では、本開示で提供される構築物（例えば、多系統構築物）は、ＰｉｇｇｙＢａｃ発現系を使用する。ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ＤＮＡトランスポゾンは、トランスポゾン自体によってコードされるトランスポザーゼ酵素（ＰＢトランスポザーゼ）がゲノム内の他の部位でトランスポゾンを切り出して再組み込みする「カットアンドペースト」機構を介して移動する。ＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンに隣接するＰＢ逆方向末端反復（ＩＴＲ）を特異的に認識し、これらの配列に結合し、トランスポゾンの切り出しを触媒する。次いで、ＰＢは、比較的ランダムな様式でゲノム全体にわたってＴＴＡＡ部位に組み込まれる。遺伝子トラップ突然変異の作製のために（又はトランスジェニック動物の作製に適合させるために）、トランスポザーゼは、１つのプラスミドにトランスで供給され、トランスポザーゼの結合部位（ＩＴＲ）に隣接した遺伝子トラップを含む組換えトランスポゾンであるドナートランスポゾンを含むプラスミドと同時にトランスフェクトされる。トランスポザーゼは、プラスミドからのトランスポゾンの切り出し及びその後のゲノムへの組み込みを触媒する。コード領域内での組み込みは、遺伝子トラップ発現に必要な要素を捕捉する。ＰＢは、いくつかの理想的な特性を有する：（１）遺伝子内に選択的に挿入する（挿入の５０～６７％が遺伝子を攻撃する）、（２）局所的なホッピング（ｌｏｃａｌ ｈｏｐｐｉｎｇ）（広範囲のゲノムカバー）を示さない、（３）高レベルのトランスポザーゼが転位を減少させるような過剰産生阻害に感受性がない、４）ドナー部位からクリーンに切り出され、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙと異なり、「フットプリント」を残さない。
４ 調節要素
本開示に有用なリプログラミングベクターに含まれる発現カセットは、好ましくは、（５’から３’の方向に）タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列に機能的に連結された真核生物転写プロモーターを含む。
ａ．プロモーター／エンハンサー
本明細書で提供される発現構築物は、プログラミング遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターを含む。プロモーターは、一般に、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を定めるように作用する配列を含む。最もよく知られているこの例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスが欠損した一部のプロモーター、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位自体を覆う別々の要素が開始部位を固定するのに役立つ。追加的なプロモーター要素は、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能要素を含むように示されている。コード配列をプロモーターの制御下に置くために、選択されたプロモーターの「下流」（即ち、３’側）の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を配置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促進する。
プロモーター要素間の間隔は、多くの場合に柔軟であり、それにより要素が互いに反転又は移動してもプロモーター機能が保たれる。ｔｋプロモーターでは、活性が低下し始める前にプロモーター要素間の間隔を５０ｂｐまで広げることができる。プロモーターに依存して、個々の要素が協同的又は独立に機能して転写を活性化することができるように思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と併用してもよく、併用しなくてもよい。
プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得ることができる、核酸配列に自然に結合したプロモーターであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ぶことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する核酸配列に自然に結合したエンハンサーであり得る。別法では、その自然環境において核酸配列と通常結合していないプロモーターを指す組換え又は異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを置くことによってある利益が得られる。組換え又は異種エンハンサーも、その自然環境において核酸配列と通常結合していないエンハンサーを指す。このようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他のウイルス、若しくは原核細胞若しくは真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在しない」、即ち、異なる転写調節領域の異なる要素及び／又は発現を変化させる突然変異を含むプロモーター又はエンハンサーを含み得る。例えば、組換えＤＮＡの構築に最も一般的に使用されるプロモーターには、β－ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に作製することに加えて、配列は、本明細書に開示された組成物に関連した、ＰＣＲ（商標）を含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を用いて作製することができる（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第４，６８３，２０２号明細書及び同第５，９２８，９０６号明細書を参照されたい）。さらに、非核細胞小器官、例えば、ミトコンドリア及び葉緑体などの中での配列の転写及び／又は発現を誘導する制御配列も利用できると考えられる。
当然、発現のために選択された細胞小器官、細胞型、組織、器官、又は生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に誘導するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の分野の技術者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの使用を理解している（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．１９８９を参照されたい）。利用されるプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を誘導する適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、及び／又は有用であり得、従って組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模製造において有利である。プロモーターは、異種性であっても内因性であってもよい。
加えて、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）を用いて発現を駆動することもできる。Ｔ３、Ｔ７、又はＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌性連鎖が送達複合体の一部として又は追加的な遺伝子発現構築物として提供される場合、ある細菌プロモーターからの細胞質転写を支持することができる。
プロモーターの非限定的な例には、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、β－アクチンプロモーター（Ｎｇ，１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｅｒｃｏｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｒｉｃｈａｒｄｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４）など；及び連結応答要素プロモーター、例えば、サイクリックＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）、及び最小ＴＡＴＡボックスに近接した応答要素プロモーター（ｔｒｅ）が含まれる。また、ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに記載のヒト成長ホルモン最小プロモーター、アクセッション番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３～３４１）又はマウス乳癌プロモーター（ＡＴＣＣから入手可能であり、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＴＣＣ ４５００７）を使用することも可能である。
組織特異的導入遺伝子の発現は、特に、造血細胞及びプログラミングに由来する造血細胞の前駆体でのレポーター遺伝子の発現は、誘導された造血細胞及び前駆体を同定する方法として望ましいであろう。特異性及び活性の両方を高めるために、シス作用性調節要素の使用が企図される。例えば、造血細胞特異的プロモーターを使用することができる。多くのこのような造血細胞特異的プロモーター、例えば、表１に示される造血遺伝子のプロモーターが当技術分野で公知である。
ある態様では、本開示の方法は、エンハンサー配列、即ち、プロモーターの活性を増大させ、且つそれらの向きに関係なく、たとえ比較的長い距離（標的プロモーターから最大数キロ塩基離れている）であてもシスで作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかしながら、エンハンサーの機能は、エンハンサーが所与のプロモーターに密接しても機能し得るため、必ずしもこのような長い距離に限定されるものではない。
多くの造血細胞プロモーター及びエンハンサー配列が同定されており、これらは、本方法に有用であり得る。例えば、米国特許第５，５５６，９５４号明細書；米国特許出願公開第２００２００５５１４４号明細書；同第２００９０１４８４２５号明細書を参照されたい。
ｂ．開始シグナル及び連結された発現
特定の開始シグナルは、コード配列の効率的な翻訳のために本開示で提供される発現構築物で使用することもできる。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルを提供する必要があり得る。当業者であれば、容易にこれを決定して必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームを有する「インフレーム」でなければならないことは周知である。外因性の翻訳調節シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることによって高めることができる。
ある実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素が、多重遺伝子又はポリシストロン性メッセージを生成するために用いられる。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳ要素（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）及び哺乳動物メッセージ（Ｍａｃｅｊａｋ ａｎｄ Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）からのＩＲＥＳが記載されている。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、それぞれをＩＲＥＳによって分離し、ポリシストロニックメッセージを生成する。ＩＲＥＳ要素により、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子を効率的に発現させて、単一プロモーター／エンハンサーを使用して単一のメッセージを転写することができる（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９２５，５６５号明細書及び同第５，９３５，８１９号明細書を参照されたい）。
加えて、ある２Ａ配列要素を用いて、本開示で提供される構築物においてプログラミング遺伝子の連結された発現又は共発現を実現することができる。例えば、切断配列を用いて、オープンリーディングフレームを連結して単一シストロンを形成することによって遺伝子を共発現させることができる。例示的な切断配列は、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）又は「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）（Ｍｉｎｓｋａｉａ ａｎｄ Ｒｙａｎ，２０１３）である。特定の実施形態では、Ｆ２Ａ切断ペプチドが、多系統構築物における遺伝子の発現を連結するために使用される。
ｃ．複製起点
宿主細胞内でベクターを増殖させるために、ベクターは、１つ以上の複製部位の起点（多くの場合に「ｏｒｉ」と呼ばれる）、例えば、上述したＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、又は複製が開始される特定の核酸配列である、プログラミングにおいて類似若しくは高い機能を有する遺伝子操作されたｏｒｉＰを含み得る。別法では、上記のような他の染色体外複製ウイルスの複製起点又は自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
ｄ．選択マーカー及びスクリーニング可能なマーカー
ある実施形態では、核酸構築物を含む細胞は、発現ベクター中にマーカーを含めることによってｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで同定することができる。このようなマーカーは、識別可能な変化を細胞に与えて発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にするはずである。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであり、陰性選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬剤耐性マーカーである。
通常、薬物選択マーカーを含めることは、形質転換体のクローニング及び同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、その基礎が比色分析であるＧＦＰのようなスクリーニング可能なマーカーを含む他のタイプのマーカーも企図される。別法では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような陰性選択マーカーとしてのスクリーニング可能な酵素を利用することができる。当業者であれば、場合によりＦＡＣＳ分析と共に免疫学的マーカーを使用する方法も理解しているであろう。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現できる限り、重要であるとは考えられない。選択マーカー及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
本方法による造血前駆細胞にプログラミングされる多能性幹細胞への核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡの導入は、本明細書に記載されるか又は当業者に公知であろう細胞の形質転換のための核酸送達用の任意の適切な方法を使用することができる。このような方法には、限定されるものではないが、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏトランスフェクション（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８９）による、微量注入（Ｈａｒｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５；参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，７８９，２１５号明細書）を含む注入（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９９４，６２４号明細書；同第５，９８１，２７４号明細書；同第５，９４５，１００号明細書；同第５，７８０，４４８号明細書；同第５，７３６，５２４号明細書；同第５，７０２，９３２号明細書；同第５，６５６，６１０号明細書；同第５，５８９，４６６号明細書、及び同第５，５８０，８５９号明細書）による；エレクトロポレーション（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，３８４，２５３号明細書；Ｔｕｒ－Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４）による；リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０）による；ＤＥＡＥ－デキストラン及びそれに続くポリエチレングリコールの使用（Ｇｏｐａｌ，１９８５）による；直接音波負荷（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７）による；リポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ ａｎｄ Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）及び受容体媒介トランスフェクション（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８８）による；微粒子銃（それぞれ参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ国際特許国際公開第９４／０９６９９号パンフレット及び同９５／０６１２８号明細書；米国特許第５，６１０，０４２号明細書；同第５，３２２，７８３号明細書、同第５，５６３，０５５号明細書、同第５，５５０，３１８号明細書、同第５，５３８，８７７号明細書、及び同第５，５３８，８８０号明細書）；炭化ケイ素繊維での撹拌（それぞれ参照により本明細書に組み入れられるＫａｅｐｐｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号明細書及び同第５，４６４，７６５号明細書）による；アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９１，６１６号明細書及び同第５，５６３，０５５号明細書）による；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込み（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５）による、並びにこのような方法の任意の組み合わせによるＤＮＡの直接送達が含まれる。これらのような技術の適用により、細胞小器官、細胞、組織、又は生物は、安定的に又は一時的に形質転換することができる。
ＩＩＩ．免疫細胞の産生
Ａ．ＨＰＣの産生
本開示の実施形態は、体細胞由来ＰＳＣのＨＰＣへの分化に関する。体細胞由来ＰＳＣは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，３７２，６４２号明細書に記載されているような当技術分野で公知の方法によってＨＰＣに分化させることができる。例えば、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３、及びＧＭ－ＣＳＦの組み合わせを使用して造血分化を促進することができる。ある実施形態では、分化のためのＰＳＣを調製するための第１の培地、並びにＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦを含む第２の培地への細胞培養物の連続的な曝露、続くＦｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ－３、及びＩＬ－６を含む第３の培地中での培養により、多能性細胞を造血前駆細胞及び造血細胞に分化させることができる。第２の規定された培地は、ヘパリンも含み得る。さらに、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦを含有する培地にＦＧＦ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）を含めることにより、多能性細胞から造血前駆細胞を発生させる効率を高めることができる。加えて、第１の規定された培地にグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、及びＳＢ－２１６７６３）を含めることにより、ＨＰＣの発生をさらに促進することができる。
多能性細胞の造血前駆細胞への分化は、規定された条件又は規定されていない条件を用いて行うことができる。一般に、規定された条件は、得られる細胞をヒト対象に投与することを目的とする実施形態で一般に好ましいことが理解されるであろう。造血幹細胞は、規定された条件下（例えば、ＴｅＳＲ培地を用いる）で多能性幹細胞から誘導することができ、及び造血細胞は、多能性細胞に由来する胚様体から産生され得る。他の実施形態では、多能性細胞は、ＯＰ９細胞又はマウス胚性線維芽細胞上で共培養し、その後、分化させることができる。
多能性細胞は、分化プロセスの一部としての胚様体の形成又は凝集を可能にし得る。分化を誘導するための「胚様体」（ＥＢ）又は増殖細胞のクラスターの形成は、一般に、ヒト多能性幹細胞のＥＢへのｉｎ ｖｉｔｒｏ凝集を含み、内胚葉、外胚葉、及び中胚葉起源を表す複数の組織型へのヒト多能性幹細胞の自然且つランダムな分化を可能にする。従って、３次元ＥＢを使用して、造血細胞及び内皮細胞のいくつかの画分を生成することができる。
ＥＢは、以下のプロトコルを用いて形成することができる。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）被覆プレートでのフィーダーフリー増殖に適合された未分化ｉＰＳＣを、室温で約８～１０分間の０．５Ｍ ＥＤＴＡ処理を用いて集密状態で収集することができる。インキュベーション後にＥＤＴＡを吸引し、ｒｏｃｋ阻害剤又はブレビスタチンを含むＳＦＤ培地での細胞を凝集させることよってＥＢを形成することができる。翌日、培地を、異なるサイトカイン製剤を含むＥＢ１分化培地に交換してもよい。細胞を、凝集体の形成を促進するために１ｍｌ当たり２５万～５０万個の細胞密度でプレーティングする。
凝集体の形成を促進するために細胞を低付着プレートに移して、７５％ ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＲＡ補助剤を含まない０．０５％ Ｎ２及びＢ－２７が添加された２５％ Ｈａｍ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、２００ｍＭ １－グルタミン、０．０５ｍｇ／ｍｌアスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム塩（Ａｓｃ ２－Ｐ）（ＷＡＫＯ）、及び４．５×１０-4のＭＴＧからなる無血清分化（ＳＦＤ）培地中で一晩インキュベートすることができる。翌日、細胞を各ウェルから収集し、遠心分離することができる。次いで、細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌ骨形成因子（ＢＭＰ－４）、約５０ｎｇ／ｍｌ血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び５０ｎｇ／ｍｌ ｚｂ ＦＧＦが添加されたＳＦＤ基礎培地からなる「ＥＢ分化培地」に分化の最初の４日間再懸濁することができる。４８時間ごとに細胞に半分供給される。分化の５日目、この培地を、５０ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）、約５０ｎｇ／ｍｌ Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－６（ＩＬ－６）、５０ｎｇ／ｍｌインターロイキン－３（ＩＬ－３）、５０ｎｇ／ｍｌトロンボポイエチン（ＴＰＯ）が添加されたＳＦＤ培地からなる第２の培地と交換する。新鮮な分化培地が４８時間ごとに細胞に半分供給される。培地交換は、分化培養物を３００ｇで５分間遠心分離し、且つ分化培養物から半量を吸引し、且つ新鮮な培地を補充することによって行われる。ある実施形態では、ＥＢ分化培地は、ＢＭＰ４（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば、約５０ｎｇ／ｍｌ）、及び任意選択によるＦＧＦ－２（例えば、約２５～７５ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌ）を含み得る。上清を吸引し、新鮮な分化培地と交換してもよい。別法では、２日ごとに新鮮な培地を細胞に半分供給してもよい。細胞は、分化プロセス中の異なる時点で収集することができる。
造血前駆細胞は、規定された培地を用いて多能性幹細胞から培養することができる。規定された培地を用いて多能性細胞を造血ＣＤ３４+幹細胞に分化させるための方法は、例えば、放棄されることなく参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第１２／７１５，１３６号明細書に記載されている。これらの方法は、本開示と共に使用できると考えられる。
例えば、規定された培地を使用して造血ＣＤ３４+の分化を誘導することができる。規定された培地は、増殖因子ＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３、及び／又はＧＭＣＳＦを含み得る。多能性細胞は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及び任意選択によるＦＧＦ－２を含む第１の規定された培地で培養し、次いで（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３、及びＧＭＣＳＦ）又は（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＴＰＯ）のいずれかを含む第２の培地で培養することができる。第１及び第２の培地は、ＳＣＦ、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ－２、及び／又はＴＰＯの１つ以上も含み得る。実質的な低酸素条件（例えば、２０％未満のＯ２）は、造血又は内皮分化をさらに促進し得る。
細胞は、機械的又は酵素的手段によって（例えば、トリプシン又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いて）実質的に個別化することができる。ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｈ１１５２又はＹ－２７６３２）も培地に含めることができる。これらのアプローチは、例えば、ロボット自動化を使用して自動化できると考えられる。
ある実施形態では、実質的な低酸素条件を用いて多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進することができる。当業者が認識し得るように、約２０．８％未満の大気酸素含有量が低酸素と考えられる。培養中のヒト細胞は、環境空気と比較して酸素含有量が低い大気の状態で増殖し得る。この相対的低酸素は、培養培地に曝露される大気中の酸素を減少させることによって達成することができる。胚性細胞は、典型的には、二酸化炭素が環境レベルで、一般に約１％～約６％の大気酸素の低酸素条件下でｉｎ ｖｉｖｏで発生する。理論に拘束されることを望むものではないが、低酸素状態は、ある胚発生条件の側面を模倣できると予想される。下記の実施例に示されるように、ある実施形態において、低酸素条件を使用して、さらなる多能性細胞、例えば、ｉＰＳＣ又はｈＥＳＣのより分化した細胞型、例えば、造血前駆細胞へのさらなる分化を促進することができる。
以下の低酸素条件を使用して多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進することができる。ある実施形態では、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％の大気酸素含有量を使用して造血前駆細胞への分化を促進することができる。ある実施形態では、低酸素雰囲気は約５％の酸素ガスを含む。
あらゆる造血前駆細胞の増殖に使用される特定の培地であってもなくても、使用される培地は、好ましくは、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬ、より一般的には１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの濃度の少なくとも１つのサイトカインが添加される。適切なサイトカインには、限定されるものではないが、ｃ－ｋｉｔリガンド（ＫＬ）（ｓｔｅｅｌ因子（ＳｔＩ）、肥満細胞増殖因子（ＭＧＦ）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）とも呼ばれる）、ＩＬ－６、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１１ＭＩＰ－１α、ＬＩＦ、ｃ－ｍｐｌリガンド／ＴＰＯ、及びｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド（Ｆｌｔ２Ｌ又はＦｌｔ３Ｌ）が含まれる（Ｎｉｃｏｌａ ｅｔ ａｌ．，１９７９；Ｇｏｌｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９８０；Ｌｕｓｉｓ，１９８１；Ａｂｂｏｕｄ ｅｔ ａｌ．，１９８１；Ｏｋａｂｅ，１９８２；Ｆａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１）。特に、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＴＰＯの少なくとも１つを含むであろう。より詳細には、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＴＰＯを含むであろう。
一実施形態では、サイトカインは培地に含まれ、培地灌流によって補充される。別法では、バイオリアクターシステムを使用する場合、培地潅流なしで、サイトカインを別個の入口ポートから濃縮溶液として別々に添加することができる。灌流なしでサイトカインが添加される場合、サイトカインは、典型的には、バイオリアクターの容量の１０分の１～１００分の１に等しい量で１０倍～１００倍溶液として添加され、新鮮なサイトカインが約２～４日ごとに添加される。さらに、潅流培地中のサイトカインに加えて、新鮮な濃縮サイトカインを別々に添加することもできる。
一部の実施形態では、ＨＰＣは、破壊されたメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を示し、且つ骨髄系分化又はリンパ系分化を促進する条件下で培養される。一部の態様では、ＨＰＣは、本質的にメチル化ＤＮＡに結合しない非機能性ＭｅＣＰ２を発現する。ある態様では、ＨＰＣは、ＭｅＣＰ２ ＤＮＡ結合活性を生じさせるのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない。特定の態様では、ＭｅＣＰ２は、ＭｅＣＰ２遺伝子における切断又は突然変異によって非機能性である。一部の態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を示すＨＰＣを得ることは、ＨＰＣをｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はＭｅＣＰ２の小分子阻害剤に接触させることを含む。
Ｂ．リンパ細胞分化
次いで、体細胞由来ＰＳＣから分化したＨＰＣを、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ／ＮＫ細胞を含むリンパ系統細胞にさらに分化させることができる。一部の態様では、分化中のＨＰＣは、リンパ細胞への分化のために７日目～１２日目、例えば、８日目～１１日目に単離される。この段階でのＨＰＣは、ＣＤ３４及びＣＤ４３の発現によって同定することができる。加えて、リンパ系分化能を有するＨＰＣは、低レベルでＣＤ１４４、ＤＬＬ４、ＣＤ７及びＣＤ２３５を発現することができ、この発現は１１日目に減少し、これらのマーカーのある閾値レベルの発現がＤＬＬ４の存在下での細胞をリンパ系分化に向かわせるために必要であることを意味する。
一部の態様では、分化プロセスの７～１１日目、例えば、７日目、８日目、９日目、１０日目、又は１１日目に単離されたＨＰＣは、リンパ細胞、例えば、Ｔ細胞及びＮＫ細胞に分化され得る。一部の態様では、リンパ系前駆細胞の発生のタイミングは、ＨＰＣ分化中の血管内皮（ｈｅｍａｔｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）前駆細胞の減少及び赤血球前駆細胞の出現に一致する。特定の態様では、９日目のＨＰＣは、Ｔ細胞の産生において高い効率を有し得る。リンパ系に分化することができるＨＰＣは、あるマーカーの発現によって単離及び／又は同定することができる。例えば、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４３の表面発現を有する細胞をリンパ系分化のために選択することができる。リンパ系前駆細胞を検出するためのさらなるマーカーには、ＤＬＬ４、ＣＤ１４４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３lo、ＣＤ４５lo/-、ＣＤ２３５、ＣＤ７、Ｆｌｋ－１、ＡＰＮＬＲが含まれる。特定の態様では、ＣＤ３４／ＣＤ７、ＣＤ２３５／ＣＤ７、ＤＬＬ４／ＣＤ３４、ＤＬＬ４／ＣＤ３１、ＤＬＬ４／ＣＤ１４４、又はＣＤ３４／ＣＤ４３lo二重陽性集団の存在がリンパ系前駆体の同定に使用される。ＨＰＣ上でのＣＤ１４４の発現は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、及びＤＬＬ４と共染色する。ＨＰＣ上でのＣＤ７発現は、ＣＤ２３５、ＣＤ３４、及びＣＤ４３と共染色する。従って、ＣＤ１４４及びＣＤ７を共発現するＨＰＣは、血管内皮マーカーと共に膜結合ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ４）を発現するリンパ系分化能獲得前駆体を証明し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで限定的な造血系統を発生させることができる新たなリンパ系前駆細胞の表現型シグネチャ（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）を生成する。特定の態様では、ＨＰＣは、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ６、ＣＤ３３５、Ｆｌｋ－１、及びＤＬＬ４を含む表面マーカーの選別により、リンパ系分化能が増強された細胞にさらに選別することができる。一部の態様では、ＨＰＣのＣＤ１１４／ＣＤ３４、ＣＤ１４４／ＣＤ４５、ＣＤ１４４／ＣＤ７、及びＣＤ１４４／ＣＤ３４／ＣＤ４５／ＣＤ７の陽性画分はリンパ細胞に分化する。特定の態様では、ＨＰＣのＣＤ１４４／ＣＤ７陽性画分はリンパ細胞に分化する。
ＨＰＣは、リンパ系分化のために、規定されたフィーダーフリー条件下で培養することができる。培養培地は、１つ以上のマトリックス成分、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、フィブロネクチン、又はＲＧＤペプチドを含み得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、マトリックス成分は、胚性幹細胞の増殖のための固体支持体を提供し得る。ある実施形態では、マトリックス成分は、細胞を培地に播種する前に培養表面に適用して培養培地に接触させることができる。例えば、細胞は、フィブロネクチン又はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）で被覆されたプレート上の規定された培地（例えば、ＴｅＳＲ培地）で培養してから、細胞を機械的に凝集塊に分離する又は細胞を個別化して造血前駆細胞への分化を誘導することができる。
様々なマトリックス成分を使用して、コラーゲン（例えば、ＩＶ型コラーゲン）、ラミニン、ビトロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ゼラチン、ポリリジン、トロンボスポンジン（例えば、ＴＳＰ－１、ＴＳＰ－２、ＴＳＰ－３、ＴＳＰ－４、及び／又はＴＳＰ－５）、及び／又はＰｒｏＮｅｃｔｉｎ－Ｆ（商標）を含めて、多能性細胞を培養することができる。ある実施形態では、ＴｅＳＲを用いて事前に培養された細胞とＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、コラーゲンＩＶ、又はラミニンのみとの使用は、細胞生存性に対する有害な影響の可能性により回避され得るが；これらの組成物は、他のマトリックス成分と組み合わせて有利に使用することができる。これらのマトリックス成分の組み合わせは、細胞増殖及び細胞の生存を促進するさらなる利点を提供することができる。ある実施形態では、上記のマトリックス成分の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ以上を、例えば造血分化前に細胞の培養に使用することができる。
リンパ系分化のための例示的なフィーダーフリーマトリックスが実施例４に開示されている。特定の態様では、非組織培養処理プレートは、ＨＰＣのリンパ系分化に使用するために、ＤＬＬ４：Ｆｃキメラタンパク質及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（フィブロネクチン断片ＣＨ－２９６；Ｔａｋａｒａ Ｓｈｕｚｏ，Ｊａｐａｎ）で被覆することができる。
一部の実施形態では、アスコルビン酸は、リンパ系分化を促進するために使用することができる。規定された培地には、約１０μＭ～約１ｍＭ、例えば、約５０μＭ～約１００μＭ、例えば、約９５μＭアスコルビン酸を添加することができる。アスコルビン酸は、様々なアスコルビン酸塩、例えば、アスコルビン酸リン酸マグネシウムから選択することができる。一部の実施形態では、ニコチンアミド（例えば、ニコチン酸）は、例えば約０．１ｍＭ～約５ｍＭの濃度でリンパ系分化を促進するために使用することができる。
一部の態様では、ＨＰＣは、対象におけるＮｏｔｃｈリガンドの産生を増加させる物質の投与によりＮｏｔｃｈリガンドの内因性活性を変更することにより、リンパ細胞、例えば、Ｔ細胞に分化させる。本方法はまた、培地で細胞を培養することを含み、この培地は、有効量のｎｏｔｃｈリガンド並びにＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３、及びＩＬ－３からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを含む。一部の特定の実施形態では、培地は、ＩＬ－６をさらに含み得る。一部の実施形態では、ｎｏｔｃｈリガンドは、δ４ｎｏｔｃｈリガンド（ＤＬＬ４）、例えば、ＤＬＬ４：Ｆｃキメラである。
Ｔ細胞系統の細胞の分化及び増殖を促進及び維持するＮｏｔｃｈリガンドが選択される。Ｎｏｔｃｈリガンドは、ヒト由来であってもよく、又は哺乳動物種、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、及び霊長類を含む他の種に由来してもよい。Ｎｏｔｃｈリガンドの特定の例には、Ｄｅｌｔａファミリーが含まれる。Ｄｅｌｔａファミリーには、Ｄｅｌｔａ－１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ００３５２２、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、Ｄｅｌｔａ－３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８４５７６、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、Ｄｅｌｔａ様１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５６１８及びＮＰ＿００５６０９、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ８０９０３、Ｉ４８３２４、ハツカネズミ（Ｍ． ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、Ｄｅｌｔａ様３（Ｇｅｎｂａｎアクセッション番号ＮＭ＿０５３６６６、Ｎ＿４４６１１８、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、Ｄｅｌｔａ－４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２７３４５４、ＢＡＢ１８５８０、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ２７９３０５、ＡＡＦ８１９１２、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））、及びＤｅｌｔａ様４（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ９ＮＲ６１、ＡＡＦ７６４２７、ＡＦ２５３４６８、ＮＭ＿０１９０７４、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）；Ｇｅｎｂａｎアクセッション番号ＮＭ＿０１９４５４、ハツカネズミ（ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ））が含まれる。Ｎｏｔｃｈリガンドは、市販のものでもよく、又は組換えＤＮＡ技術によって作製して様々な程度に精製してもよい。
本方法は、分化したＮＫ細胞を産生するのに十分な期間にわたって上記の培養液にＨＰＣ細胞を維持することをさらに含む。一部の実施形態では、分化したＮＫ細胞は、Ｔ細胞と共に培養物中に現れるが、ＮＫ細胞は、６週間後に増殖を停止し得る。一般に、ＮＫ細胞数の増加及び／又はその分化状態の決定は、当業者に公知の従来の方法を用いて評価される。例えば、培養細胞は、抗ＣＤ５６及び抗ＣＤ３抗体で細胞を染色することによるＮＫ細胞の発生についてのフローサイトメトリーによって監視することができる。ＣＤ５６+／ＣＤ３-である細胞は、分化したＮＫ細胞を示すはずである。
Ｃ．骨髄系分化
体細胞由来ＰＳＣから産生されるＨＰＣは、例えば、骨髄系分化培地を用いて骨髄細胞に分化させることができる。骨髄系分化培地は、無血清培地又は規定された培地であり得、この培地は、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、インスリン、デキサメタゾン、又はヒドロコルチゾン、及び／又はトランスフェリンを含み得る。骨髄細胞は、樹状細胞、マクロファージ、好中球、単球、好塩基球、好中球、肥満細胞、及び／又は好酸球であり得る。特定の態様では、骨髄細胞は樹状細胞である。例示的な骨髄系分化培地及び増殖培地は、例えば、表４～６に記載されている。
例示的な一方法では、ＨＰＣは、低付着プレートに載せて、ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ヘパリン（例えば、１～１０Ｕ／ｍＬ、例えば、５Ｕ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、ＴＰＯ（例えば、５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）、ヒト組換えＳＣＦ（例えば、５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）、ＦＬＴ３Ｌ（例えば、５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－３（例えば、１～２０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ）、及びＩＬ－６（例えば、１～２０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ）を含む培地に移す。約５～１５日後、例えば８日後、骨髄細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ（例えば、２５～１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＳＦＥＭ培地で増殖する。最後に、ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｅｘｃｙｔｅ（例えば、０．１％～２％、例えば、１％）、ＧＭ－ＣＳＦ（２５～１５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（１０～３０ｎｇ／ｍＬ、例えば、２０ｎｇ／ｍＬ）、及びＴＮＦα（０．５～５ｎｇ／ｍＬ、例えば、２．５ｎｇ／ｍＬ）を含む培地で細胞をさらに１～２週間培養して、樹状細胞を産生する。樹状細胞は、ＣＤ２０９+、ＣＤ１ａ+、ＨＬＡ－ＤＲ+、ＣＤ１１ｃ+、ＣＤ１４+、ＣＤ８３+、及びＣＤ８６+からなる群から選択される１つ以上のマーカーの発現によって特徴付けることができる。これらのマーカーは、主として骨髄ＤＣを染色し、形質細胞様ＤＣ（ＣＤ１２３+）を染色しない。ライト染色をサイトスピン試料で行って、樹状細胞の古典的な形態を確認することができる。
Ｄ．細胞培養
ある実施形態では、実質的な低酸素条件を使用してＨＰＣの骨髄又はリンパ系統への分化を促進することができる。ある実施形態では、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％の大気酸素含有量を使用して造血前駆細胞への分化を促進することができる。ある実施形態では、低酸素雰囲気は約５％の酸素ガスを含む。
本明細書に記載されるように、１つ以上の規定された培養培地を有利に使用してＨＰＣの骨髄及びリンパ系統への分化を促進することができる。特に、動物製品、例えば、血清及びマウスフィーダー層の除去は、細胞の動物製品への曝露に関連するリスクを低減することができ、ヒト対象により安全に投与することができる細胞の産生を可能にする。伝統的な幹細胞培養の開発は、幹細胞を様々な細胞型に分化させるための血清製品及びマウスフィーダー層に依存しているため、これらの伝統的な方法は、分化を行うことができる規模を制限し、生物学的変動及び潜在的な汚染を増加させ、及び通常、これらが有用性を証明することになる翻訳療法（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）でのＥＳ細胞の使用を著しく妨げた。
一般に、本開示の細胞は、細胞増殖を維持することができる栄養豊富な緩衝液である培地で培養される。本明細書に記載の方法に従った、多能性幹細胞の単離、増殖、並びに造血前駆細胞及び造血細胞への分化に適した培養培地には、限定されるものではないが、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ－１５、ＲＰＭＩ １６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）が含まれる。最小必須培地、例えば、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘＣｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須及び非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、及びマイトジェンが添加されたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）を含む化学的に規定された培地も適している。本明細書で使用される「マイトジェン」は、細胞の分裂を刺激する作用物質を指す。作用物質は、細胞分裂の開始を細胞に促し、有糸分裂を誘発する、通常、タンパク質のある種の化学物質であり得る。一実施形態では、無血清培地、例えば、米国特許出願第０８／４６４，５９９号明細書及び国際公開第９６／３９４８７号パンフレットに記載されている無血清培地、及び米国特許第５，４８６，３５９号明細書に記載されている「完全培地」は、本明細書に記載の方法との使用が企図される。一部の実施形態では、培養培地には、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト自己血清、ヒトＡＢ血清、又はヘパリンが添加された（２Ｕ／ｍｌ）多血小板血漿が添加される。
免疫細胞は、細胞の骨髄又はリンパ系統への分化を促進するのに十分なほどに因子の細胞内レベルを増加させる条件下で、培地で多能性幹細胞又は造血前駆細胞を培養することによって産生することができる。培地はまた、様々な種類の成長因子のような１つ以上の造血細胞分化及び成熟剤も含み得る。これらの分化及び成熟剤は、細胞をより成熟した表現型になるように誘導することを促進するか － 又は成熟細胞の生存を選択的に促進することを補助するか － 又はこれらの両方の効果の組み合わせを有するかのいずれかであり得る。分化及び成熟剤は、造血細胞系統の細胞の増殖を促進することができる可溶性増殖因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド－受容体複合体、及び他の化合物）を含み得る。このような作用物質の非限定的な例としては、限定されるものではないが、造血又は内皮成長因子、例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＬＴ－３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、又は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、又はこれらのアイソフォーム又は変異体が挙げられる。
ＩＶ．免疫細胞の使用
ある態様の方法及び組成物によって提供される免疫細胞は、様々な適用で使用することができる。これらには、限定されるものではないが、少数の例を挙げると、ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の移植又は注入；ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性化合物、発癌物質、変異誘発物質成長／調節因子、医薬化合物などのスクリーニング；血液疾患及び傷害の機構の解明；薬物及び／又は成長因子が作用する機構の研究；患者の癌の診断及び監視；遺伝子治療；及び生物学的に活性な製品の生産が含まれる。
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本開示の免疫細胞を使用して、本明細書で提供されるリンパ細胞の特性に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、小分子薬物、ペプチド、及びポリヌクレオチド）又は環境条件（例えば、培養条件又は操作）をスクリーニングすることができる。
本開示の特定のスクリーニングの適用は、薬物研究における医薬化合物の試験に関する。読者は、一般に、標準的な教科書Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７及び米国特許第５，０３０，０１５号明細書を参照するものとする。ある態様では、骨髄細胞及びリンパ細胞は、短期培養における造血細胞及び前駆細胞に対して既に行われたように、標準的な薬物スクリーニング及び毒性アッセイの試験細胞の役割を果たす。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、ある態様で提供される造血細胞又は前駆体を候補化合物と組み合わせること、（不活性化合物で処理された細胞又は未処理細胞と比較した）その化合物に起因する細胞の形態、マーカー表現型、又は代謝活性のあらゆる変化を決定すること、及びその化合物の影響を観察された変化と関連付けることを含む。化合物が造血細胞又は前駆体に対する薬理学的効果を有するように設計されるため、又は他で効果を有するように設計された化合物が造血細胞又は前駆体に対して意図しない効果を有し得るためにスクリーニングを行ってもよい。（同時又は連続的に細胞と組み合わせることによって）２つ以上の薬物を組み合わせて試験して、起こり得る薬物と薬物との相互作用効果を検出することができる。
Ｂ．造血細胞療法
本開示は、恐らく血液疾患又は障害又は傷害によりそのような治療を必要とする対象の機能をある程度回復させるための、本明細書で提供される免疫細胞の使用も提供する。例えば、本明細書に開示される方法によって誘導される免疫細胞を使用して、血液疾患及び障害、例えば、異常ヘモグロビン症、貧血などを処置することができる。このような細胞は、細胞抑制療法、例えば、化学療法によって引き起こされる造血細胞欠乏の処置に有用であり得る。
治療への応用のために本明細書で提供される細胞の適合性を決定するために、細胞をまず適切な動物モデルで試験することができる。あるレベルにおいて、細胞がｉｎ ｖｉｖｏで生存してその表現型を維持する能力について評価する。本明細書で提供される細胞は、免疫不全動物（例えば、ＮＯＧマウス、又は化学的に若しくは照射により免疫不全にされた動物）のさらなる観察に好適な部位、例えば、腎臓被膜の下、脾臓中、肝小葉中、又は骨髄中に投与する。数日から数週間以上経過してから組織を採取し、及び開始細胞型、例えば、赤血球が依然として存在するか否かについて評価する。これは、投与される細胞に検出可能な標識（例えば、緑色蛍光タンパク質、又はβ－ガラクトシダーゼ）を供給することにより、又は投与されるヒト細胞に特異的な構成的マーカーを測定することにより行うことができる。本明細書で提供される細胞がげっ歯類モデルで試験される場合、投与される細胞の存在及び表現型を、ヒト特異的抗体を用いる免疫組織化学法若しくはＥＬＩＳＡにより、又は増幅がヒトポリヌクレオチド配列に特異的であるようにするプライマー及びハイブリダイゼーション条件を用いるＲＴ－ＰＣＲ分析により評価することができる。ｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで遺伝子発現を評価するための適切なマーカーは、本開示の別の箇所に示される。
本開示の方法によって提供される免疫細胞は、血液疾患及び外傷を処置するそれらの能力について種々の動物モデルで試験することができる。例えば、鎌状赤血球貧血マウスモデル又はＴ／Ｂ細胞欠損Ｒａｇ－２ノックアウトマウスは、本明細書に開示される骨髄細胞及びリンパ細胞の試験に特に有用な動物モデルであり得る。
動物モデルにおいて望ましい機能的特徴又は有効性を実証する本開示のある態様で提供される免疫細胞は、それを必要とするヒト対象への直接投与にも適し得る。止血の目的で、循環への適切なアクセスを有する任意の部位に細胞を投与することができる。造血細胞又はその前駆体はまた、傷害又は疾患の部位で送達することもできる。
本開示のある態様で提供される細胞は、それを必要とするあらゆる対象の処置に使用することができる。このような処置に適し得るヒトの状態には、種々の貧血及び異常ヘモグロビン症、並びに造血細胞数の減少によって特徴付けられる疾患（例えば、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、好中球減少症、無顆粒球症、グランツマン血小板無力症、血小板減少症、及び後天性免疫不全症候群）が含まれる。ヒト治療に関して、用量は、一般に、約１０9～１０12の細胞、典型的には約５×１０9～５×１０10の細胞であり、対象の体重、苦痛の性質及び重症度、並びに投与される細胞の複製能力に合わせて調整される。処置の方法及び適切な用量を決定する最終的な責任は、管理する臨床医にある。
Ｃ．商業目的、治療目的、及び研究目的での分配
製造目的、分配目的、及び使用の目的で、本開示の免疫細胞が、典型的には、等張性賦形剤又は培地中の細胞培養物又は懸濁物の形態で供給され、任意選択により輸送又は貯蔵を容易にするために凍結される。
また、製造、流通、又は使用中の任意の時点で存在する細胞のセット又は組み合わせを含む異なる試薬系も本明細書で提供される。細胞のセットは、未分化幹細胞、体細胞由来造血細胞、又は他の分化細胞型と組み合わせられる、例としてはプログラミング由来細胞（造血系列細胞、それらの前駆体及びサブタイプ）であるがこれに限定されない、本開示で説明される２つ以上の細胞集団の任意の組み合わせを含む。セット内の細胞集団は、ときに同じゲノム又はその遺伝的に改変された形態を共有する。セット内の各細胞型は、同一事業体又は取引関係を共有する異なる事業体の管理下において、同じ又は異なる時期に同一の施設内で又は異なる場所でまとめて包装してもよく、別々の容器に入れてもよい。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために包含される。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが発明者によって見出された技術を代表しており、このため、本発明の実践において好ましい方法を構成すると見なすことができることを当業者は理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、本開示から考えて、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更形態が可能であり、それでもなお同様又は類似の結果が得られることが理解されるであろう。
実施例１ － Ｔ細胞由来ＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）の産生
ｉＰＳ細胞の産生のために、血液試料からＴ細胞を単離してｉＰＳＣへのレトロウイルスリプログラミング前に活性化させた。最初に末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、新しく調製したＡＩＭ－Ｖ培地＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／グルタミン（ＡＩＶ－Ｖ／ｐｓ／ｓ／ｇ培地）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋３００ＩＵ／ｍｌ ｒｈＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）及び１０ｎｇ／ｍｌ可溶性抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３クローン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び抗ＣＤ２８抗体で増殖させた。活性化の数日後、ＣＥＤＥＸ細胞カウントを用いて指数増殖を確認した。培養の３日後、細胞をＴ細胞表現型についてアッセイし、次いでリプログラミング因子で形質導入した。
レトロウイルスベクターＮａｎｏｇ ＲＦＰ、Ｌｉｎ２８ ＲＦＰ、Ｏｃｔ４ ｅＧＦＰ、及びＳｏｘ２ ｅＧＦＰを前述のように構築した（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第６１／０８８，０５４号明細書を参照されたい）。レトロウイルスベクターｃ－Ｍｙｃ ＲＦＰ、Ｋｌｆ４ ＲＦＰ、Ｏｃｔ４ ｅＧＦＰ、及びＳｏｘ２ ｅＧＦＰを同様に構築した。
ＣＤ３及びＣＤ２８活性化末梢単核細胞を、２％ヒトＡＢ血清及び１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２を含むＡＩＭ－Ｖ培地を含むＴ細胞培地で培養した。６日目、Ａｍａｘａ Ｕ－０１４プログラム（１～５×１０6細胞／トランスフェクション、Ａｍａｘａ Ｔ細胞トランスフェクション溶液）を用いたエレクトロポレーションにより、６つのリプログラミング因子でＴ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションから２５日目まで、細胞を１ウェル当たり１回のトランスフェクションで６ウェルプレートのレトロネクチン（０．３μｇ／ｃｍ2）及びビトロネクチン（０．２μｇ／ｃｍ2）被覆ウェルで培養し、１４日目から、Ｔ細胞培地からＥ８ ＰＳＣ培地に徐々に移した。
活性化して増殖しているＴ細胞は、特徴的な細胞形態及びクラスター形成挙動を示した。レトロウイルス形質導入効率の検出が最初の形質導入から７２時間後のＧＦＰ及びＲＦＰ発現によって判定され、導入遺伝子が約３週間にわたってサイレンシングされ、ｈＥＳ細胞表現型を示す。明確なｉＰＳ細胞コロニーは、２３日目に出現し始めた。ＧＦＰ及びＲＦＰサイレンシングを蛍光顕微鏡で確認し、コロニーをピペットチップで摘まんで解剖フードに入れた。次いで、コロニー片を新鮮な６ウェルプレートに移した。コロニーの数をカウントし、投入されプレーティングされた細胞の数を考慮して、リプログラミング効率を推定した。この時点から、クローンコロニーに毎日供給し、手動でもう１回継代してから増殖させてＴｉＰＳＣ株を作製した。
実施例２ － ＴｉＰＳＣの造血前駆細胞（ＨＰＣ）への分化
実施例１のＴｉＰＳＣを含む様々なエピソーム及びウイルスによりリプログラミングされたｉＰＳＣ（表１）にＨＰＣの産生のために３Ｄ分化プロトコルを行った（図１）。最初に、ｉＰＳＣを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はビトロネクチン被覆超低付着（ＵＬＡ）プレート上において、フィーダーフリー条件下で５～１０回継代するために低酸素条件に馴化させた。凝集体は、５ｕＭブレビスタチンが添加された無血清の規定された（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５万～５０万細胞／ｍｌの密度でサブコンフルエントなｉＰＳＣから作製した。このプロセスは、７５％ ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２２００－０６９）（グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ Ｈａｍｓ Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ １０－０８０－ＣＶ）、０．５％ Ｎ２添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０２－０４８）、レチノイン酸を含まない１％ Ｂ２７添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５８７－０１０）、０．０５％ ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、及び４．５×１０-4Ｍモノチオグリセロールを含むＳＦＤ基礎培地中の超低付着（ＵＬＡ）プレート又はスピーナ－フラスコで行った。
ＥＢが形成されたら、最初の４日間、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２をＳＦＤ基礎培地に添加することによって分化を開始させた。ＥＢの分化の５日目に培養物をそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、及びＴＰＯ、並びに５０００単位のヘパリン存在下に置いた。分化プロセス中、低酸素条件下での分化の１２～１６日目まで、サイトカインを含む新鮮な分化培地の半量をＥＢ培養物に２日ごとに添加した。分化プロセス後に細胞を収集し、表現型をフローサイトメトリーにより評価し、及びＣＦＵアッセイを用いて機能を評価した。細胞を収集し、ＣＤ４３／ＣＤ３４細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーにより定量した（図１Ｂ）。プロセスの効率を、産生されたＨＰＣの絶対数をｉＰＳ細胞の投入数で除すことによって計算した（図１Ｃ）。
Figure 0007061961000001
フローサイトメトリー分析のために細胞を収集し、培地で１回洗浄した。細胞ペレットを、ＴｒｙｐＬＥ（商標）又は０．５％トリプシンを用いて３７℃のインキュベーター内で５～１０分間消化し、次いで培地で洗浄し、７０μｍ細胞ストレーナーに通した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液を含むＰＢＳ－ＦＢＳに再懸濁し、細胞生存率を推定するためにカウントし、蛍光色素コンジュゲートモノクローナル抗体；抗ヒトＣＤ４３（１Ｇ１０）、抗ヒトＣＤ３１（ＷＭ－５９）、抗ヒトＣＤ４１（ＨＩＰ８）；抗ヒトＣＤ４５（ＨＩ３０）；抗ヒトＣＤ３４（５８１、８Ｇ１２）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）；及び抗ヒトＣＤ２３５で染色した。非生存細胞は、７－アミノアクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で排除した。生細胞の分析をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）又はＡｃｃｕｒｉフローサイトメーター及びＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェアで行った。
クローン原性造血前駆体アッセイ（ＣＦＵアッセイ）のために、ＥＢを、ＴｒｙｐｌＥ又は０．５％トリプシン／ＥＤＴＡを使用して単一細胞懸濁液に分散させた。生細胞を定量し、プレーティングし（５０，０００～３００，０００細胞／ｍＬ）、及び５０ｎｇ／ｍＬ幹細胞因子（ＳＣＦ）、３Ｕ／ｍＬエリスロポエチン（ＥＰＯ）、１０ｎｇ／ｍＬ顆粒球－マクロファージコロニー－刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、１０ｎｇ／ｍＬインターロイキン－３（ＩＬ－３）を含むヒトメチルセルロース完全培地（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、加湿チャンバー内で造血ＣＦＣを分析した。１４日後、コロニーをそれらの形態に従って記録し、プレーティングされた１０5細胞ごとにコロニーを定量した。
実施例３ － 改変ｉＰＳＣの造血前駆細胞（ＨＰＣ）への分化
１Ｃ Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ、レトロウイルスリプログラミングによって誘導）を凝集体懸濁（３Ｄ）培養によってＣＤ３４+造血前駆細胞に分化させた。１Ｃ細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はビトロネクチン被覆６ウェルプレート上においてフィーダーフリー条件下で維持した。凝集体は、５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ－３阻害剤）、及び１０μＭブレビスタチン（ミオシン－ＩＩ阻害剤）が添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ ３（Ｅ３）培地（Ｅ８培地の８成分のうちの３成分のみ：ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地、アスコルビン酸２－リン酸マグネシウム、及び亜セレン酸ナトリウムを含む）において、５０万～１００万細胞／ｍｌの密度でサブコンフルエント（８０％未満のコンフルエンス）な１Ｃ細胞から形成した。凝集体形成は、ロッカープラットフォーム上での１５ｒｐｍでの連続撹拌下、超低付着（ＵＬＡ）フラスコ内での２４時間の培養中に生じた（その後の培養工程を全て含む）。
形成された細胞凝集体（即ち、胚様体－ＥＢ）をさらに、造血中胚葉（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍｅｓｏｄｅｒｍ）を誘導するサイトカイン－２５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５０ｍｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、及び５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２が添加された無血清分化培地（５０％ ＩＭＤＭ、５０％ Ｈａｍｓ Ｆ１２培地、１００μｇ／ｍｌポリビニルアルコール、１００μｇ／ｍｌ組換えヒト血清アルブミン、１×非必須アミノ酸添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１×化学的に規定された脂質添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１２５μＭアスコルビン酸２－リン酸マグネシウム、０．２５μＭリノール酸、微量元素添加剤Ａ（０．３×）、Ｂ（０．２×）、及びＣ（０．１×）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、５ｍＭ塩化ナトリウム、１００μＭモノチオグリセロール、２０μＭエタノールアミン、１００ｎｇ／ｍｌヘパリン、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１）に移した。培養は４日間続け、２日目に完全培地に交換した。
造血ＣＤ３４＋前駆細胞の分化及び増殖を支援するために、細胞凝集体をさらに、造血を支援するサイトカイン－５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｍｇ／ｍｌ ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４が添加された（上記の）無血清分化培地に移した。培養は４日間続け、２日目に完全培地に交換した。
分化プロセスの７～９日目にわたって培養物を収集した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（又はＡｃｃｕｍａｘ）溶液中の分化細胞凝集体を３７℃で１５～２０分間消化して単一細胞懸濁液を得た。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（例えば、５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中で洗浄し、７０μＭ細胞ストレーナーに通して濾過し、直接ＣＤ３４常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で４℃において３０分間標識した。ＣＤ３４+細胞を、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の推奨に従ってＭＳ又はＬＳ磁気カラム、適切な磁石、及び標準的な分離手順を用いて単離した。単離されたＣＤ３４+細胞をＴ／ＮＫ分化培養物にプレーティングするか、又は単離から１時間以内後の使用のために凍結保存した。
実施例４ － ＨＰＣのリンパ系分化
実施例２及び実施例３のＨＰＣのリンパ系分化のためのパラメーターを決定するために、細胞株をＴ細胞分化及びＮＫ細胞分化の培養条件に曝露した。最初に、いくつかの変数を間質依存プロトコルでＴ細胞分化について試験した。１２日目、異なる細胞株由来のＨＰＣを、ＯＰ９骨髄間質細胞及びＭＳ５マウス骨髄間質細胞を含む間質系でのＴ細胞分化能について試験した。細胞を、２０％ ＦＢＳ、１０ｎｇ／ｍＬ ＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３、及び５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７を含むαＭＥＭ培地で培養した。細胞を週に３回、培地を半分交換して新鮮にした。Ｔ細胞の存在についての細胞の分析により、骨髄細胞が発生する傾向にあり、ＣＤ３+細胞の存在は検出できなかった。加えて、間質共培養は、低酸素条件下ではそれほど機能しなかった。
Figure 0007061961000002
Figure 0007061961000003
そこで、フィーダーフリーＴ細胞分化プロトコルを開発した。ＨＰＣを、０．５μｇ／ｃｍ2のレトロネクチン及びＮｏｔｃｈ ＤＬＬ４で被覆された未処理組織培養プレートに約５，０００～約２５，０００細胞／ｃｍ2の細胞密度でプレーティングした。ＨＰＣを、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリンストレプトマイシン、９５μＭアスコルビン酸（ＷＡＫＯ ｌａｂｓ）、並びに５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３、及びＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が添加されたＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で培養した。培地を４８時間ごとに補充し、２週間後、細胞を新しいリガンド被覆プレートに分割した。加えて、２～３週間にわたり、細胞を細胞表面マーカーＣＤ５及びＣＤ７によってプレＴ細胞の存在について分析した。４週間後、細胞を細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４，及びＣＤ８によってＴ細胞の存在について分析した。６～８週間後、細胞表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ９４、及びＣＤ５６を用いてＴ細胞及びＮＫ細胞の存在について細胞を分析した。
Ｔ細胞分化に対するその影響について試験したパラメーターの１つは、培養プレートに被覆するマトリックスの選択であった。プレーティングの３週間後、臍帯血細胞を含むＮｏｔｃｈ ＤＬＬ４との様々なマトリックスの組み合わせを用いて、無血清条件下でのプレＴ細胞の出現を分析することによって比較を行った。この結果、レトロネクチンとＤＬＬ４との組み合わせが、ビトロネクチン又はテネイシンとの組み合わせよりも臍帯血細胞からプレＴ細胞への分化においてより効果的であることが示された（表２）。
驚くべきことに、低酸素条件は、フィーダーフリーＴ細胞分化を促進することが分かった。特に、低酸素条件では、酸素正常条件下で分化した細胞と比較して、ＣＤ８陽性細胞のパーセンテージが増加し、ＣＤ４陽性細胞のパーセンテージが減少することが観察された（表３）。
血液細胞由来ｉＰＳＣのリンパ系統への分化効率を、実施例２に記載されたＨＰＣ分化の５日目、７日目、９日目、及び１１日目に様々な細胞株を収集することによって分析した。ＨＰＣ細胞を解凍し、レトロネクチン及びＤＬＬ４被覆プレートにプレーティングした。２日ごとに新鮮な培地を細胞に供給し、ＨＰＣ細胞を解凍してから２週間後にプレＴ細胞マーカー、４週間後にＴ細胞マーカー、及び６週間後にＴ細胞及びＮＫ細胞マーカーについて分析した。Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ／Ｔ細胞の存在について、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ５６（図３Ａ）、ＣＤ４５、ＣＤ７、ＣＤ５（図３Ｂ）、及びＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ３（図３Ｃ）の表面発現について細胞を染色した。ＴｉＰＳＣ及びエピソームによりリプログラミングされた３９０８細胞は、７～１１日目にリンパ系分化能が上昇したことが観察された（図３Ａ）。
表面マーカーを使用してリンパ系分化の効率を高めることができるか否かを判定するために、ＴｉＰＳＣｓ１Ｅ株及びエピソーム３９０２株の両方に対してＣＤ４３／ＣＤ３４、ＣＤ３４、ＤＬＬ４、ＣＤ３１／ＣＤ１４４、及びＣＤ２３５の分析を行った（図４）。ＤＬＬ４の発現及びＣＤ２３５のレベルが分化の１１日目に低下するが、分化の日数と共にＣＤ３４の発現が減少し、ＣＤ４３の発現が増加することが見出された。分化の１１日目にリンパ細胞が存在しないため、ＤＬＬ４の存在下でリンパ系分化を誘導するために、これらのマーカーのある閾値レベルの発現が不可欠であることを意味する。
ＨＰＣ分化中のリンパ系前駆細胞のさらなる分析を表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ６、ＣＤ３３５、Ｆｌｋ－１及びＤＬＬ４の磁気選別によって行った。８日目のＨＰＣをＣＤ１１４／ＣＤ３４、ＣＤ１４４／ＣＤ４５、ＣＤ１４４／ＣＤ７、及びＣＤ１４４／ＣＤ３４／ＣＤ４５／ＣＤ７陽性及び陰性画分並びに非選別対照に選別した（図５）。次いで、これらの画分にリンパ系分化プロセスを行い、１６日目にＣＤ３+細胞の存在について分析した（図６Ａ）。陽性画分は、それぞれ陰性画分及び非選別対照と比較して有意に増加したリンパ系分化能を示すことが観察された。これは、陽性画分磁気選別によるＴ細胞発生のフォールドエンリッチメントの増加によってさらに裏付けられた（図６Ｂ）。陽性画分を新鮮なＲｅｔ－ＤＬＬ４表面に戻してさらに２週間プレーティングした。
リンパ系分化の４週間後、８日目のＣＤ１４４+／ＣＤ７+及びＣＤ１４４＋／ＣＤ４５＋ ＨＰＣは、図７ＡにおけるＣＤ３陽性細胞のパーセンテージによって示されているようにｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞の産生を維持した。ＣＤ３細胞は、ＣＤ３３５陽性、ＣＤ１６１陽性、及び不変Ｔ細胞受容体（６Ｂ１１）陰性であった。従って、後期培養物は、新たなＮＫ／Ｔ細胞表現型を有する。加えて、ＣＤ１４４+／ＣＤ７+ ＨＰＣは、１６日目のＴ細胞の生産量に対するＨＰＣの投入の比率によって測定されるＴ細胞の産生で高い効率を有することが示された。しかしながら、４週間の終了時におけるプロセスの累積効率は、ＣＤ１４４／ＣＤ３４／Ｃｄ４５／ＣＤ７陽性画分で最も高いことが示された。
実施例５ － ＨＰＣの骨髄系分化
実施例２及び３のＣＤ３４+ ＨＰＣをヒト樹状細胞（ＤＣ）の比較的純粋な集団の形成のために骨髄系分化させた。細胞を全プロセスにわたって低付着組織培養プレート又はフラスコ上で培養した。細胞を５０ｎｇ／ｍＬ Ｆｌｔ－３リガンド（Ｆｌｔ－３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍＬ幹細胞因子（ＳＣＦ）、５０ｎｇ／ｍＬトロンボポエチン（ＴＰＯ）、５０ｎｇ／ｍＬインターロイキン－３（ＩＬ－３）、及び５０ｎｇ／ｍＬインターロイキン－６（ＩＬ－６）を含む無血清培地において、０．５～１×１０6細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。
骨髄系分化を開始するために、細胞を２５万～５０万細胞／ｍＬの密度で骨髄前駆細胞培地（表４）に播種し、約２週間増殖させた。４日目及び８日目、細胞をＣＤ３４+／ＣＤ４５+／ＣＤ４３+の生存度及び発現について監視した。ＣＤ３４+集団の減少が観察され、培養物中にＣＤ４５+／ＣＤ４３+／ＣＤ３１+集団が出現した。この段階での培養物の表現型は、主にＣＤ４３+／ＣＤ４５+／ＣＤ３１+／ＣＤ３４Loであった。
Figure 0007061961000004
細胞がＣＤ４３+／ＣＤ４５+／ＣＤ３１+／ＣＤ３４-細胞表面マーカーの５０％を超える発現を示したら、これらの細胞を骨髄増殖培地（表５）に入れて８日間維持した。新鮮な培地を１日おきに細胞に供給した。８日目の終わりに、培養細胞は、８０～９０％のＣＤ４３+／ＣＤ４５+／ＣＤ３１+／ＣＤ３４-を示す骨髄細胞の濃縮集団を有していた。この骨髄増殖期の終わりに細胞数、生存率、及び純度を測定した。
Figure 0007061961000005
最後に、１６日間の培養の終了時、培養物を樹状細胞濃縮培地（表６）に入れた。細胞密度を５０万～１００万細胞／ｍＬに維持し、回転ステップなしで４日ごとに新鮮な培地を細胞に供給した。この分化段階では、増殖が殆ど観察されなかった。代わり、細胞が低付着プレートに付着して大きくなることが観察された。１週間の終わりに試料を収集し、フローサイトメトリーによってＣＤ２０９+、ＣＤ１ａ+、ＨＬＡ－ＤＲ+、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１４+、ＣＤ８３+、及びＣＤ８６+の存在について試験した（図９～１０）。これらのマーカーは、主として骨髄性ＤＣを染色し、プラスモサイトイドＤＣ（ＣＤ１２３+）を染色しない。細胞を樹状細胞濃縮培地で維持し、且つ収率及び純度を定量するために様々な時点で分析した。樹状細胞の古典的形態を確認するために、サイトスピン試料でライト染色を行った。
Figure 0007061961000006
実施例６ － ＰＳＣの分化及びＴ細胞の増殖の方法
ＣＤ３４＋リンパ造血前駆細胞へのＰＳＣの分化：１Ｃ Ｔ細胞由来ｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ、レトロウイルスリプログラミングにより誘導）を凝集体懸濁（３Ｄ）培養によってＣＤ３４＋造血前駆細胞に分化させた。１Ｃ細胞をＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はビトロネクチンで被覆された６ウェルプレート上においてフィーダーフリー条件下で維持した。凝集体は、５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、２μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ－３阻害薬）、及び１０μＭブレビスタチン（ミオシン－ＩＩ阻害薬）が添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ ３（Ｅ３）培地（Ｅ８培地の８つの成分のうちの３つの成分：ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地、アスコルビン酸２－リン酸マグネシウム、及び亜セレン酸ナトリウムのみを含む）において、５０万～１００万細胞／ｍｌの密度でサブコンフルエントな１Ｃ細胞（８０％未満のコンフルエンス）で形成した。凝集体の形成は、１５ｒｐｍでのロッカープラットフォーム上での連続撹拌下の、超低付着（ＵＬＡ）フラスコ内での２４時間の培養中で行った（その後の培養工程を全て含む）。
形成された細胞凝集体（胚様体－ＥＢ）をさらに、造血中胚葉を誘導するサイトカイン－２５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４、５０ｍｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ、及び５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２が添加された無血清分化培地（５０％ ＩＭＤＭ、５０％ Ｈａｍｓ Ｆ１２培地、１００μｇ／ｍｌポリビニルアルコール、１００μｇ／ｍｌ組換えヒト血清アルブミン、１×非必須アミノ酸添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１×化学的に規定された脂質添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１２５μＭアスコルビン酸２－リン酸マグネシウム、０．２５μＭリノール酸、微量元素添加剤Ａ（０．３×）、Ｂ（０．２×）、及びＣ（０．１×）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、５ｍＭ塩化ナトリウム、１００μＭモノチオグリセロール、２０μＭエタノールアミン、１００ｎｇ／ｍｌヘパリン、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１）に移した。培養は４日間続け、２日目に完全培地に交換した。
造血ＣＤ３４＋前駆細胞の分化及び増殖を支援するために、細胞凝集体をさらに、造血を支援するサイトカイン－５０ｎｇ／ｍｌ ＳＣＦ、２０ｍｇ／ｍｌ ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＬＴ３Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３、及び２５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４が添加された（上記の）無血清分化培地に移した。培養は４日間続け、２日目に完全培地に交換した。
分化プロセスの１＋４＋４日（合計９日）後に培養物を収集した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（又はＡｃｃｕｍａｘ）溶液中の分化した細胞凝集体を３７℃で１５～２０分間消化することにより、単一細胞懸濁液を得た。細胞をＭＡＣＳ緩衝液（５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中で洗浄し、７０μＭ細胞ストレーナーに通して濾過し、直接ＣＤ３４常磁性マイクロビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で４℃において３０分間標識した。ＣＤ３４＋細胞を、製造業者（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）の推奨に従ってＭＳ又はＬＳ磁気カラム、適切な磁石、及び標準的な分離手順を用いて単離した。単離されたＣＤ３４＋細胞をＴ／ＮＫ分化培養物にプレーティングするか、又は単離後１時間以内後の使用のために凍結保存した。
Ｔ／ＮＫ分化培養：Ｔ／ＮＫ分化のために、非組織培養処理したプラスチックプレートを、ＰＢＳで希釈したＮｏｔｃｈリガンドｈＤＬＬ４－Ｆｃキメラタンパク質及びレトロネクチン（それぞれ０．５μｇ／ｃｍ2）で被覆した。細胞播種前に被覆溶液を吸引し、プレートを細胞培養基礎培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はその他）で１回洗浄し、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＧｌｕｍａＭａｘ（１／１００）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（１／２００）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム（２５０μＭ）、ニコチンアミド（２ｍＭ）、並びにサイトカインＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、及びＩＬ７（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）からなる０．２５ｍｌ／ｃｍ2のＴ細胞分化培地（ＴＣＤＭ）で満たした。単離したＰＳＣ由来ＣＤ３４＋細胞を５０００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングし、低酸素（５％ Ｏ2）ＣＯ2インキュベーターで２週間培養し、３日目と６日目とに新鮮なＴＣＤＭを培養容量加え、３日ごとに半分の培養容量を交換した。全分化細胞を、穏やかな再懸濁及び非付着細胞の収集、及びこれに続くＰＢＳ－ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）での１０～１５分間の処理による付着細胞の剥離によって回収した。
Ｔ細胞増殖培養：Ｔ細胞の増殖のために、組織培養プラスチックプレートを、ＰＢＳで希釈した抗ＣＤ３ ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３）及びレトロネクチン（それぞれ０．５μｇ／ｃｍ2）で被覆した。細胞播種前に被覆溶液を吸引し、プレートを細胞培養基礎培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はその他）で２回洗浄し、及びＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＸＦ培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＧｌｕｍａＭａｘ（１／１００）、ＰｅｎＳｔｒｅｐ（１／２００）、及びサイトカインＩＬ２及びＩＬ７（それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ）からなる０．２ｍｌ／ｃｍ2 Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＥＭ）で満たした。増殖を改善するためにＩＬ１５及び／又はＩＬ２１も加えることができる。Ｔ／ＮＫ分化培養物から収集した細胞を２００００細胞／ｃｍ2の密度でプレーティングし、低酸素（５％ Ｏ2）ＣＯ2インキュベーターで２週間培養し、３日目に新鮮なＴＣＥＭを培養容量加え、３日ごとに半分の培養容量を交換した。増殖させたＴ細胞を非接着性細胞の穏やかな再懸濁及び収集によって回収した。
実施例７ － ＨＰＣを産生するための２Ｄプロトコル
０１２７９．１０７．３９０２ ＭｅＣＰ２ノックアウト細胞及びＴｉＰＳＣｓ１Ｅ細胞にＨＰＣの産生のための２Ｄ分化プロトコルを行った（図１６）。最初に、ｉＰＳＣを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地でＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はビトロネクチンが被覆された、フィーダーフリー条件下で５～１０回継代して低酸素条件に馴化させた。ｉＰＳＣを個別化し、５μＭブレビスタチンが添加された無血清の規定された（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５０００／ｃｍ2の密度でＰｕｒｅＣｏａｔ Ａｍｉｎｅで被覆された６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．）にプレーティングした。ＳＦＤ基礎培地は、７５％ ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２２００－０６９）（グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ Ｈａｍｓ Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ １０－０８０－ＣＶ）、０．５％ Ｎ２添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０２－０４８）、レチノイン酸を含まない１％ Ｂ２７添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５８７－０１０）、０．０５％ ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、並びに５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦが添加された４．５×１０－４Ｍモノチオグリセロールを含んでいた。
１日目に７５％ ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２２００－０６９）（グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ Ｈａｍｓ Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ １０－０８０－ＣＶ）、０．５％ Ｎ２添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０２－０４８）、レチノイン酸を含まない１％ Ｂ２７添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５８７－０１０）、０．０５％ ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、並びに５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦが添加された４．５×１０－４Ｍモノチオグリセロールを含むＳＦＤ基礎培地で培養して造血分化の誘導を開始した。２日目に培地を吸引し、細胞を新鮮なＥＢ１培地（７５％ ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２２００－０６９）（グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ Ｈａｍｓ Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ １０－０８０－ＣＶ）、０．５％ Ｎ２添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０２－０４８）、レチノイン酸を含まない１％ Ｂ２７添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５８７－０１０）、０．０５％ ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、並びに５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦが添加された４．５×１０－４Ｍモノチオグリセロールを含むＳＦＤ基礎培地）においてさらに４８時間置いた。
５～１０日目に培地を吸引し、細胞をＥＢ２培地に入れて４８時間維持した。ＥＢ２培地は、７５％ ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２２００－０６９）（グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ Ｈａｍｓ Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ １０－０８０－ＣＶ）、０．５％ Ｎ２添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０２－０４８）、レチノイン酸を含まない１％ Ｂ２７添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５８７－０１０）、０．０５％ ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、並びに５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、それぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、及びＴＰＯ、及び５０００Ｕ／ｍｌのヘパリンが添加された４．５×１０－４Ｍモノチオグリセロールを含む新鮮なＳＦＤ基礎培地を含んでいた。ＴｒｙｐＬＥを用いて分化の７日目、８日目、９日目、１０日目に細胞を収集し、ＨＰＣマーカー及びリンパ系前駆細胞の存在について染色した。
Ｔ細胞分化のために、ＨＰＣを約５，０００～約２５，０００細胞／ｃｍ2の細胞密度において、０．５μｇ／ｃｍ2でレトロネクチン及びＮｏｔｃｈ ＤＬＬ４で被覆された未処理組織培養プレートにプレーティングした。ＨＰＣを、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地、又は１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリンストレプトマイシン、９５μＭアスコルビン酸（ＷＡＫＯ ｌａｂｓ）、並びに５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３、及びＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）が添加されたＳＦＤで培養した。培地を４８時間ごとに補充し、２週間後、細胞を新しいリガンド被覆プレートに非酵素的に分割した。加えて、２～３週間にわたり細胞を細胞表面マーカーＣＤ５及びＣＤ７によってプレＴ細胞の存在について分析した。４週間後、細胞を細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８によってＴ細胞の存在について分析した。６～８週間後、細胞表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ９４、及びＣＤ５６を用いてＴ細胞及びＮＫ細胞の存在について細胞を分析した。
実施例８ － リンパ系分化に対するＭｅＣＰ２破壊の効果
造血分化プロセスにおけるＭｅＣＰ２の役割を決定するために、ＭｅＣＰ２ノックアウトｉＰＳＣ細胞株を作製した。雄野生型（ＷＴ）０１２７９ ｉＰＳＣ細胞株をエンジニアリングしてＭｅＣＰ２をノックアウトし、ＭｙＣｅｌｌ（登録商標）０１２７９．１０７．３９０２細胞株を作製した。ＴＡＬヌクレアーゼを用いて、ＭｅＣＰ２ ＴＡＬＥＮのトランスフェクションにより、一連の停止コドンをＭｅＣＰ２のメチルＣｐＧ結合ドメイン（図１７Ｂ）の前に挿入し、及び停止コドンを含むドナープラスミドの挿入後、ＬｏｘＰに隣接させてＰＧＫｐ－Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ－ＳＶ４０ｐＡを逆向きに挿入した。０．１２７９ ｉＰＳＣを、ＭｅＣＰ２ ＴＡＬＥＮＳ及び野生型ＥＢＮＡ１を発現するドナープラスミドｐ１５５３でトランスフェクトした。
挿入に対して陽性の細胞をピューロマイシン選択により選択し、次いでコロニーを採取し、組み込みＰＣＲ（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ＰＣＲ）によりスクリーニングした。スクリーニングしたコロニーの９６％が２つのＰＣＲスクリーニング反応により挿入に対して陽性であった。１４のクローンを増殖させて３継代でスクリーニングすると、８つのクローンが骨格プラスミドの組み込みに対して陰性であることが分かった。従って、残りのクローンの３つを挿入断片によって配列決定すると、２つがポリクローナルであることが分かった。１つのモノクローナル系０．１２７９．１０７．３０２を選択し、さらなる研究のために十分に特徴付けた。追加のクローンも得て、正確にエンジニアリングされるように特徴付けた。ＭｅＣＰ２変異体００１、００２、００５、及び００８のアミノ酸整列を図１７Ｃに示す。変異体００８は、ＭｅｔｈｙｌＣｐＧ結合ドメインをコードしていない。
実施例１の０１２７９．１０７．３９０２ ＭｅＣＰ２ノックアウト細胞及びＷＴ ０１２７９細胞にＨＰＣの産生のための３Ｄ分化プロトコルを行った（図１７Ａ）。最初に、ｉＰＳＣをＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地でＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はビトロネクチンが被覆されたフィーダーフリー条件下で５～１０回継代して低酸素条件に馴化させた。凝集体を、５μＭブレビスタチンが添加された無血清の規定された（ＳＦＤ）培地の存在下において、２５万～５０万細胞／ｍｌの密度でサブコンフルエントなｉＰＳＣから作製した。このプロセスは、７５％ ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２２００－０６９）（グルタミン及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋Ｐ／Ｓを含む）、２５％ Ｈａｍｓ Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ １０－０８０－ＣＶ）、０．５％ Ｎ２添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １７５０２－０４８）、レチノイン酸を含まない１％ Ｂ２７添加剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １２５８７－０１０）、０．０５％ ＢＳＡ、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、及び４×１０-4Ｍモノチオグリセロールを含むＳＦＤ基礎培地中の超低付着（ＵＬＡ）プレート又はスピーナ－フラスコで行った。
胚様体（ＥＢ）が形成されたら、最初の４日間、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ－４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦをＳＦＤ基礎培地に添加することによって分化を開始させた。５日目にＥＢ培養物をそれぞれ５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ－３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ヘパリン、及びＴＰＯの存在下に置いた。分化プロセス中、低酸素条件下での分化の１２～１６日目まで、サイトカインを含む新鮮な分化培地の半量をＥＢ培養物に２日ごとに添加した。
リンパ系分化のために、ＨＰＣを、０．５μｇ／ｃｍ2のレトロネクチン及びＮｏｔｃｈ ＤＬＬ４で被覆された未処理組織培養プレートに約５，０００～約２５，０００細胞／ｃｍ2の細胞密度でプレーティングした。ＨＰＣを、１％ Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ペニシリンストレプトマイシン、９５μＭアスコルビン酸（ＷＡＫＯ ｌａｂｓ）、並びに５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７、ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３、及びＴＰＯ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が添加されたＳｔｅｍＳｐａｎ Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ ＩＩ（ＳＦＥＭ； ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で培養した。培地を４８時間ごとに補充し、２週間後、細胞を新しいリガンド被覆プレートに非酵素的に分割した。加えて、２～３週間にわたり細胞を細胞表面マーカーＣＤ５及びＣＤ７によってプレＴ細胞の存在について分析した。４週間後、細胞を細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８によってＴ細胞の存在について分析した。６～８週間後、細胞表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ９４、及びＣＤ５６を用いてＴ細胞及びＮＫ細胞の存在について細胞を分析した。
リンパ系統への分化におけるＭｅＣＰ２ノックアウトクローンの効率を、ＨＰＣ分化の５日目、７日目、９日目、及び１１日目に０１２７９．１０７．３９０２クローン、０１２７９．１０７．３９０５クローン、０１２７９．１０７．３９０６クローン、０１２７９．１０７．３９０７クローン、及び０１２７９．１０７．３９０８クローンを収集することによって分析した。前述の時点で凍結保存したＨＰＣ細胞を解凍し、レトロネクチン及びＤＬＬ４被覆プレートにプレーティングした。新鮮な培地を２日ごとに細胞に供給し、及びＨＰＣ細胞を解凍した２週間後にプレＴ細胞マーカー（図１８Ａ、１８Ｂ）、及び４週間後にＴ細胞及びＮＫ細胞マーカーについて分析した。プレＴ細胞マーカーの分析では、野生型０１２７９．１０７．０９０４細胞を除く全ての細胞は、ＣＤ５+ＣＤ７+、ＣＤ７+ＣＤ４５+、及びＣＤ５+ＣＤ４５+として同定されたプレＴ細胞の存在を有していた。ＣＤ４５、ＣＤ７、及びＣＤ５（図１９）並びにＣＤ５６、ＣＤ８、及びＣＤ３（図２０）の表面発現について細胞を染色し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＮＫ／Ｔ細胞の存在を定量した。
投入細胞数が既知であるため、Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）、ＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）、及びＮＫ／Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）の絶対数を決定した。プロセスの効率を、細胞型（Ｔ、ＮＫ又はＮＫ／Ｔ）の絶対数／投入総細胞数の比により、又は細胞型の絶対数／ＨＰＣの投入数の比により計算する。Ｔ細胞（ＣＤ３+／ＣＤ８+）のパーセンテージ（図１７）及びＮＫ細胞（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）のパーセンテージ（図２１）を、ＦＳＣ－ＳＳＣゲート及びリンパ散乱ゲートの下側のフローサイトメトリーによって定量した。新たなＮＫ／Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）細胞、（ＣＤ３+／ＣＤ８+）細胞、ＮＫ／Ｔ（ＣＤ３+／ＣＤ５６+）細胞、及びＮＫ（ＣＤ３-／ＣＤ５６+）細胞の量も測定した。さらなる分析により、ＣＤ２３５／ＣＤ７、ＣＤ１４４+／Ｄｌｌ４+、及びＦｌｋ－１+／ＣＤ３４+の発現が、分化の１１日目に減少することが示された。分化の１１日目にはリンパ細胞が存在していないため、これは、これらのマーカーのある閾値レベルの発現がＤＬＬ４の存在下での細胞のリンパ系への分化の準備に不可欠であることを意味し得る。
Ｔ細胞マーカーの分析により、ＭｅＣＰ２ ＫＯ細胞株は、リンパ系分化の能力を有するが、ＭｅＣＰ２ ＷＴ細胞株は有していないことが示された。ＭｅＣＰ２ ＷＴ細胞由来の９日目のＨＰＣ前駆細胞は、本質的にＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞を有していなかったが、試験した他のＨＰＣ前駆細胞は、ＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞集団に分化した。従って、ＭｅＣＰ２のメチル結合ドメインのノックアウトは、ＨＰＣ前駆細胞のＴ細胞及びＮＫ細胞を産生する能力を高めた。
本明細書で開示され、特許請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに構築し、実施することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、変形形態が、本明細書に記載の方法及び方法の工程又は一連の工程に適用できることは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的且つ生理学的に関連するある薬剤を、本明細書に記載の薬剤の代替とすることができ、同じ又は類似の結果が達成されるはずであることは明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような同様の代替物及び変更形態は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨、範囲、及び概念内であると見なされる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載の事項を補足する例示的な手順又はその他の詳細を提供する範囲で参照により本明細書に明確に組み入れられる。
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米国特許出願公開第１２／７１５，１３６号明細書
米国特許出願公開第０８／４６４，５９９号明細書
米国特許出願第６１／０８８，０５４号明細書
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
米国特許第５，０３０，０１５号明細書
米国特許第５，３０２，５２３号明細書
米国特許第５，３２２，７８３号明細書
米国特許第５，３８４，２５３号明細書
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米国特許第５，４８６，３５９号明細書
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米国特許第５，５３８，８８０号明細書
米国特許第５，５５０，３１８号明細書
米国特許第５，５５６，９５４号明細書
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米国特許第５，５８０，８５９号明細書
米国特許第５，５８９，４６６号明細書
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米国特許第５，６１０，０４２号明細書
米国特許第５，６５６，６１０号明細書
米国特許第５，７０２，９３２号明細書
米国特許第５，７３６，５２４号明細書
米国特許第５，７８０，４４８号明細書
米国特許第５，７８９，２１５号明細書
米国特許第５，９２８，９０６号明細書
米国特許第５，９４５，１００号明細書
米国特許第５，９８１，２７４号明細書
米国特許第５，９９４，１３６号明細書
米国特許第５，９９４，６２４号明細書
米国特許第６，０１３，５１６号明細書
米国特許第８，３７２，６４２号明細書
米国特許出願公開第２００２００５５１４４号明細書
米国特許出願公開第２００９０１４８４２５号明細書
Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９：９１－１０５，２００９．
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Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１（５）：８６１－７２，２００７．

Claims (23)

  1. 免疫細胞を産生する方法であって、
    （ａ）誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を得ること（ここで、ｉＰＳＣは体細胞集団からリプログラミングされる）；
    （ｂ）ＣＨＩＲ９９０２１、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２及びブレビスタチンを含む第１の規定された培地（ここで、前記培地は、ＢＭＰ－４、ＩＬ－３、Ｆｌｔ３リガンド、及びＧＭ－ＣＳＦを含まない又は本質的に含まない）で前記ｉＰＳＣをインキュベートし、ＨＰＣ分化のための細胞を調製すること；
    （ｃ）複数の前記細胞における中胚葉誘導を促進するために、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦを含む第２の規定された培地で工程（ｂ）で生産された前記細胞を培養すること；及び
    （ｄ）複数の前記細胞が増殖し、かつ工程（ｃ）で生産された細胞と比較してＣＤ７、ＣＤ１４４、及びＣＤ２３５の一以上の発現の増加を示すＨＰＣへと分化するように、ＩＬ－３及びＦｌｔ３リガンドを含む第３の規定された培地で工程（ｃ）で生産された前記細胞を培養し、かつ前記細胞におけるＣＤ７、ＣＤ１４４、及びＣＤ２３５の一以上の発現を検出すること、及び
    （ｅ）免疫細胞分化を促進する条件下で工程（ｄ）で生産されたＨＰＣをレトロネクチン及びＮｏｔｃｈリガンド上において培養し、それにより免疫細胞を産生すること
    を含む、方法。
  2. 前記免疫細胞がリンパ細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記リンパ細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、及び／又はＮＫ細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記第１の規定された培地がＲｏｃｋ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞が工程（ｂ）～（ｄ）について凝集体として培養され、前記細胞が工程（ｅ）の前に個別化される、請求項１に記載の方法。
  6. 工程（ｂ）～（ｄ）がアミン培養プレートを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
  7. 前記第３の規定された培地が、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びＢＭＰ４からなる群から選択されるサイトカインの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記第３の規定された培地がヘパリンを含む、請求項１に記載の方法。
  9. ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現するＨＰＣが、リンパ系分化を促進する条件下で培養される、請求項２に記載の方法。
  10. リンパ系分化を促進するために前記ＨＰＣを培養することが、
    （ｉ）規定されたフィーダーフリー培地において、レトロネクチン及びＮｏｔｃｈリガンドで被覆された表面上でＨＰＣを培養すること；及び
    （ｉｉ）ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ７、及びＦｌｔ－３からなる群から選択される１つ以上のサイトカインの存在下で培養物を維持し、それによりリンパ細胞を産生すること、
    を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記規定された培地がアスコルビン酸及びニコチンアミドを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記アスコルビン酸が５０μＭ～１ｍＭの濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記ニコチンアミドが０．１ｍＭ～５ｍＭの濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
  14. 培養物が固定化抗ＣＤ３抗体をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記ＮｏｔｃｈリガンドがＤＬＬ４である、請求項１０に記載の方法。
  16. 工程（ｉｉ）が１～６週間、または２～４週間である、請求項１０に記載の方法。
  17. 前記体細胞集団が血液細胞集団である、請求項１に記載の方法。
  18. 前記血液細胞集団がＴ細胞を含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＨＰＣが１つのＨＰＣ当たり少なくとも２０の免疫細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
  20. 前記リンパ細胞の１０％超が、ＣＤ８、ＣＤ７、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ４、及びＣＤ３からなる群から選択されるマーカーの少なくとも２つに対して陽性である、請求項２に記載の方法。
  21. 前記リンパ細胞が、血液細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再構成を保持している、請求項２に記載の方法。
  22. 磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を行うことにより工程（ｅ）に先立ってＣＤ３４陽性細胞を単離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  23. ＣＤ７、ＣＤ１４４、及びＣＤ２３５の一以上が陽性である細胞を単離することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
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