KR20200138445A - 입양 세포 요법 생성물을 생성하기 위한 유도 만능 줄기 세포의 응용 - Google Patents

입양 세포 요법 생성물을 생성하기 위한 유도 만능 줄기 세포의 응용 Download PDF

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immune
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로렌스 제이.엔. 쿠퍼
히로키 토리카이
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보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

입양 세포(adoptive cell) 요법 생성물을 생성하기 위한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 응용 및 면역 수용체의 잠재적인 독성을 스크리닝하기 위한 iPSC의 용법이 본원에 기재되어 있다. 일부 양태에서, HLA 유전자 (예를 들면, HLA-A)를 발현하지 않는 iPSC 및 이로부터 분화된 세포가 제공된다.

Description

입양 세포 요법 생성물을 생성하기 위한 유도 만능 줄기 세포의 응용{APPLICATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS TO GENERATE ADOPTIVE CELL THERAPY PRODUCTS}
본원은 2014년 4월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/983,722호의 우선권의 이익을 주장하고, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록의 편입
2 KB (Microsoft Windows®로 측정됨)이고 2015년 4월 15일에 생성된 파일명 "UTFCP1235WO_ST25.txt"에 포함된 서열목록이 본원과 함께 전자적 제출에 의해 제출되고, 이는 본원에 참조로 포함된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 의약, 세포 생물학, 및 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 분야는 면역요법과 관련된다. 더 상세하게는, 이는 면역요법 및 재생 의약을 위한 그리고 면역 수용체의 잠재적 독성을 스크리닝하기 위한 입양 세포 요법 생성물에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
자가조직 또는 인간 백혈구 항원 (HLA)-매칭된 동종 공여체 세포를 사용한 세포 요법은 암을 포함하는 많은 유형의 질환 및 재생 의약에 대해 유망한 요법이다. 그러나, 자가조직 세포는 때때로 특히 암을 가진 환자에서의 독성 약물의 반복 투여 또는 질환 그 자체로 인해 기능적 결함이 일어난다. 동종 세포의 경우, 환자는 동종 면역 반응을 회피하기 위해 적합한 HLA-매칭된 공여체를 찾을 필요가 있다. 예를 들면, 동종 조혈 줄기 세포 (HSC)는 도입되어 수용자에서의 결핍되거나 기능이상의 HSC를 복원하거나 대체하고, 특정 조혈 세포를 생성하기 위한 공급원으로서 역할을 한다. 그러나, 다양한 HLA 시스템은 HLA-적합 공여체를 찾는데 어려움을 일으키고, 이는 인종의 유전적 다형성의 영향으로 인해 악화된다. 환자에 대한 적합한 HLA-매칭된 생성물을 제공하기 위해, 많은 수의 공여체가 필요로 된다. 심지어 사전보관된 제대혈 (UCB) 단위 및 국립 골수 기증 프로그램 (NMDP)을 통한 등록된 성체 공여체에 대해 접근에도 불구하고, 적합한 HLA-매칭된 생성물을 찾는 것은 많은 수용자, 특히 공여체 집단에서 소수인 인종 및 소수 민족의 개체들에게 극복과제로 남아 있다. 사실상, NMDP에 등록된 9백만 공여체는 미국 인구를 포용하기에 충분하지 않다. 게다가, 세포 요법 생성물을 준비하는데 상당한 시간과 자본이 소요된다. 이와 같이, 동종 면역 세포-매개 거부반응을 회피하고 환자로부터 세포 배양물을 증식할 필요 없이 환자로 도입될 수 있는 세포 생성물이 필요로 된다.
본 개시물은 면역요법 재생 의약 및 면역 수용체의 잠재적인 독성의 스크리닝을 위한 입양 세포 요법 생성물을 생성하는 유도 만능 줄기 세포의 응용을 위해 제공된다.
일 구현예에서, 본 방법은 HLA-Aneg, HLA-동종접합성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)을 생성하기 위해 제공되고, 이는 (a) HLA-동종접합성 공여체로부터의 세포 집단을 수득하는 단계, (b) 세포가 HLA-A를 발현하지 못하게 하여 이에 의해 HLA-Aneg 세포를 생성하도록 세포를 조작하는 단계; 및 (c) HLA-Aneg 세포를 재프로그래밍하여 iPSC를 발생시키고, 이에 의해 HLA-Aneg iPSC를 생성하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 세포 집단은 제대혈 세포 집단일 수 있다. 일 양태에서, 공여체는 HLA-B, HLA-C, 및 HLA-DRB1에서 HLA-동종접합성일 수 있다.
일부 양태에서, HLA-A를 발현하지 않도록 세포를 조작하는 단계는 세포로 HLA-A 유전자좌(HLA-A locus)를 특이적으로 표적화하는 인공 뉴클레아제를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 인공 뉴클레아제는 아연 핑거뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9일 수 있다. 다양한 양태에서, 세포로 인공 뉴클레아제를 도입하는 단계는 인공 뉴클레아제를 암호화한 mRNA를 세포로 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 세포를 (예를 들면, HLA-Aneg 세포) 재프로그래밍하는 단계는 Sox2, Oct3/4, Nanog, Lin-28, Klf4, myc (예를 들면, 형질전환시 결핍된 C-myc, L-myc, 또는 myc 돌연변이체) 및/또는 SV40LT로 이루어진 군으로부터 선택된 재프로그래밍 인자를 세포로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 세포, 예컨대 HLA-Aneg 세포를 재프로그래밍하는 단계는 재프로그래밍 인자 Oct3/4, KLF4, Sox2, 및 c-myc 단백질을 세포로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 재프로그래밍은 mRNA를 암호화한 Oct3/4, KLF4, Sox2, 및 c-myc를 세포로 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 추가의 양태에서, 재프로그래밍은 Oct3/4, KLF4, Sox2, 및 c-myc를 암호화한 하나 이상의 발현 카세트를 세포에 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 하나 이상의 발현 카세트(expression cassette)는 하나 이상의 에피솜 벡터에 포함될 수 있다. 하나 이상의 발현 카세트는 하나 이상의 바이러스 벡터 (예를 들면, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 센다이 바이러스 벡터)에 포함될 수 있다.
특정 양태에서, 본 방법은 추가로 단계 (b)의 세포로 자살 유전자, 예컨대, 예들 들면, 유도성 카스파제 9 (iCasp9)를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 도입 단계는 유전자 전달을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 도입 단계는 트랜스포존/전위효소 시스템, 예컨대 잠자는 미녀 트랜스포존/전위효소 시스템(Sleeping Beauty transposon/transposase system)을 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 방법은 추가로 유전적으로 안전한 하버 프로파일(genetically safe harbor profile)을 갖는 HLA-Aneg, HLA-동종접합성 iPSC를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "세이프 하버" 프로파일은 외부 유전자 물질의 이식유전자 발현이 지속되고 (즉, 침묵화되지 않음), 내인성 유전자의 발현을 방해하지 않는 부위에서의 게놈으로의 삽입을 지칭한다. 예를 들면, "유전적으로 안전한 하버 프로파일"은 내인성 유전자의 암호화 및 발현 조절 영역의 외부에 배치되는 형질전환 조작(transgenic event)과 관련될 수 있다. 일부 양태에서, 식별 단계는 전체의 게놈 서열분석 또는 통합 부위 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 양태에서, 본 방법은 추가로 HLA-Aneg, HLA-동종접합성 iPSC를 분화시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 분화시키는 단계는 인공 항원 제시 세포 (aAPC)의 사용을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, aAPC는 유전적으로 변형된 K562 세포일 수 있다.
일부 양태에서, iPSC는 면역 세포, 예컨대, 예들 들면, T 세포, NK 세포, iNKT 세포로 분화될 수 있다. 일부 양태에서, 면역 세포는 종양 특이적 또는 바이러스-특이적 TCRαβ를 더 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 면역 세포는 종양 특이적 키메라성 항원 수용체를 더 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 면역 세포는 추가로 유전적으로 수정되어 면역 억제 분자 (예를 들면, PD-1 또는 CTLA-4)를 제거할 수 있다. 일부 양태에서, iPSC는 조혈 줄기 세포로 분화될 수 있다. 일부 양태에서, iPSC는 심근세포, 폐 상피 세포, 베타 소도 세포, 신장 세포, 또는 신경 세포로 분화될 수 있다.
추가 구현예에서, 단리된 포유동물 세포 (예를 들면, 인간 세포)가 제공되고, 상기 세포는 적어도 한 세트의 동종접합성 HLA 대립형질 (예를 들면, 동종접합성 HLA-B, HLA-C 및/또는 HLADRB1 대립형질) 및 HLA-Aneg 표현형을 포함한다. 일부 양태에서, HLA-Aneg 표현형을 포함하는 세포는 하나 이상의 HLA-A 유전자의 모두 또는 일부의 결실을 포함하거나 또는 유전자 또는 유전자 생성물 모두를 비기능화하는 HLA-A에서의 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 일부 양태에서, HLA-A 유전자 중 하나 또는 둘 모두는 유전자 또는 유전자 생성물을 비기능화하는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 발생될 결실을 포함한다. 추가 양태에서, 적어도 한 세트의 동종접합성 HLA 대립형질을 포함하는 구현예의 세포는 적어도 2개 또는 3개의 세트의 동종접합성 HLA 대립형질을 포함한다. 예를 들면, 세포는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질, 동종접합성 HLA-B 및 HLA-DRB1 대립형질, 동종접합성 HLA-C 및 HLA-DRB1 대립형질 또는 동종접합성 HLA-B, HLA-C 및 HLA-DRB1 대립형질을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 구현예의 적어도 한 세트의 동종접합성 HLA 대립형질 및 HLA-Aneg 표현형을 포함하는 단리된 포유동물 세포는 배아 줄기 세포, iPS 세포, 제대혈, 표피 세포, 췌장 세포, 간 세포, 조혈 세포, 간엽 세포, 신경 세포 또는 면역 세포, 예컨대 NK 세포 또는 T-세포 (예를 들면, CD4 또는 CD8 양성 T 세포)이다. 다른 추가의 양태에서, 구현예의 세포 집단이 제공된다. 예를 들면, 일부 양태에서, 구현예의 약 1 x 103 내지 1 x 104, 1 x 106, 1 x 106, 또는 1 x 107 세포 집단이 제공된다.
일부 양태에서, 구현예의 적어도 한 세트의 동종접합성 HLA 대립형질 및 HLA-Aneg 표현형을 포함하는 단리된 포유동물 세포는 이식유전자를 더 포함한다. 예를 들면, 세포는 리포터를 암호화한 이식유전자, 약물 선택 마커, 키메라성 항원 수용체 (CAR) 및/또는 자살 유전자 (예를 들면, 티미딘 키나제 또는 유도성 카스파제 9 (iCasp9)를 포함할 수 있다. 다른 추가의 양태에서, 구현예의 포유동물 세포는 추가로 하나 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 또는 활성을 포함한다. 예를 들면, 일부 양태에서, 상기 세포는 발현이 결핍되거나, 또는 하나 이상의 면역 억제 분자, 예컨대 PD-1 또는 CTLA-4의 감소된 발현을 가진다. 또 다른 추가의 양태에서, 상기 세포는 발현이 결핍되거나, 또는 하나 이상의 T 세포 수용체 성분의 감소된 발현을 가진다. 예를 들면, 일부 양태에서, 상기 세포는 발현이 결핍되거나 또는 TCRα, TCRβ 또는 TCRα 및 TCRβ의 감소된 발현을 가진다.
또 다른 추가의 구현예에서, 적어도 제1 및 제2 유도 만능 줄기 세포주를 포함하는 시험관내 세트의 세포주가 제공되고, 여기서 상기 제1 및 제2 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질을 포함하고, 제1 세포주의 동종접합성 HLA-B 및/또는 HLA-C 대립형질은 제2 세포주의 동종접합성 HLA-B 및/또는 HLA-C 대립형질과 상이하고, 제1 및 제2 세포주 모두는 HLA-Aneg이다. 특정 양태에서, 상기 세트의 세포주는 추가로 적어도 5개 내지 10개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 독특한 조합을 포함하고, 여기서 각각의 주는 HLA-Aneg이다. 특정 양태에서, 상기 세트의 세포주는 적어도 20개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 각각의 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 독특한 조합을 포함하고, 여기서 각각의 주는 HLA-Aneg이다. 특정 양태에서, 상기 세트의 세포주는 적어도 27개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 각각의 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 독특한 조합을 포함하고, 여기서 각각의 주는 HLA-Aneg이다. 일 양태에서, 상기 세트의 세포주는 적어도 27개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 각각의 주는 표 1에 따른 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 독특한 조합을 포함하고, 여기서 각각의 주는 HLA-Aneg이다.
일부 양태에서, 각각의 주는 추가로 자살 유전자, 예컨대 유도성 카스파제 9 (iCasp9)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 세포주는 본 구현예의 방법에 따라 제조될 수 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 (a) 본 구현예에 따른 시험관내 세트의 iPSC 주를 얻는 단계; (b) 임의로 계통-특이적 세포로 iPSC를 분화시키는 단계; (c) iPSC 또는 계통-특이적 세포를 관심 면역 수용체를 발현하는 T 세포에 노출시키는 단계; 그리고 (d) iPSC 또는 계통-특이적 세포 및 관심 면역 수용체를 발현하는 T 세포 간의 상호작용을 검출하여, 이에 의해 면역 수용체 특이성에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 면역 수용체 특이성을 스크리닝하기 위해 제공된다.
일부 양태에서, T 세포는 관심 면역 수용체에 대한 표적 항원을 인식한 이후 단지 GFP만을 발현하는 T-급성 림프구성 백혈병 세포주일 수 있다. 이러한 양태에서, 단계 (d)는 T-급성 림프구성 백혈병 세포주에서 GFP의 발현을 검출하고 이에 의해 표적 항원을 발현하는 iPSC 또는 계통-특이적 세포를 식별하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 방법은 추가로 단계 (a)의 세포로 세포사 리포터 작제물(cell death reporter construct)를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 세포사 리포터 작제물은 카스파제-3 활성화의 검출을 가능하게 할 수 있다. 이들 양태에서, 단계 (d)는 세포사 리포터 작제물을 검출하고, 이에 의해 면역 수용체 특이성에 대해 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 본 방법은 추가로 단계 (a)의 세포로 계통-특이적 전사 인자 프로모터-유도 리포터 유전자를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 본 양태에서, 단계 (d)는 리포터 유전자의 발현의 손실을 검출하고, 이에 의해 면역 수용체 특이성에 대해 스크리닝하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 관심 면역 수용체는 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라성 항원 수용체 (CAR)일 수 있다. 일부 양태에서, TCR은 클로닝되거나 조작될 수 있다.
일 구현예에서, 본 방법은 필요로 하는 환자에게 질환을 치료하기 위해 제공되고, 이는 (a) 환자에 대해 HLA-매칭된 본 구현예 중 임의의 하나에 따라 세포주의 시험관내 세트로부터 세포주를 선택하는 단계; (b) 계통-특이적 세포에 대해 선택된 세포주를 분화시키는 단계; 그리고 (c) 치료적 유효량의 분화된 세포를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 본 방법은 면역요법을 제공하는 방법일 수 있다. 일부 양태에서, 계통-특이적 세포는 조혈 줄기 세포 또는 면역 효과기 세포일 수 있다. 일부 양태에서, 질환은 암, 자가면역 질환, 또는 감염성 질환일 수 있다. 일부 양태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포, NK 세포, 및 iNKT 세포일 수 있다.
특정 양태에서, 본 방법은 추가로 단계 (a)의 세포로 키메라성 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체를 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 질환은 암일 수 있고, 그리고 CAR은 암 세포 항원, 예컨대, 예들 들면, CD19, CD20, 암종배아 항원, 알파태아단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 흑색종-관련된 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 엽산 결합 단백질, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메오테린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 사슬, 람다 사슬, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 또는 VEGFR2에 대해 표적화될 수 있다.
일부 양태에서, 질환은 자가면역 질환일 수 있고, CAR은 자가면역 세포에 대해 표적화될 수 있다. 자가면역 질환의 예는 비제한적으로 만성적 소화장애증, 진성 당뇨병 1형 (IDDM), 전신 홍반성 낭창 (SLE), 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증 (MS), 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 특발성 혈소판감소성 자반병, 류마티스성 관절염 (RA), 급성 특발성 혈소판감소성 자반병, 만성적 특발성 혈소판감소성 자반병, 피부근염, 시데남 무도병, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 낭창성 신염, 류마티스성 열, 다선상 증후군, 수포성 유천포창, 진성 당뇨병, 헨노흐-숀라인 자반병, 후-연쇄상구균신염, 결절 홍반(erythema nodosurn), 다카야수 동맥염, 애디슨병, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 유육종증, 궤양성 대장염, 홍반 다형성, IgA 신병증, 결절성 다발동맥염, 강직 척추염, 굿파스투어 증후군, 폐색성 혈전 혈관염(thromboangitisubiterans), 쇼그렌 증후군, 원발성 담도성 간경변증, 하시모토 갑상선염, 갑상선중독증, 경피증, 만성적 활동 간염, 다발성근염/피부근염, 다연골염, 심상성 천포창(pamphigus vulgaris), 베게너 육아종증, 막성 신병증, 근위축 측삭 경화증, 척수매독, 거대세포 동맥염/다발근육통, 악성빈혈, 급속 진행 사구체신염, 건선, 및 섬유성폐포염을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 질환은 병원체 (예를 들면 진균, 바이러스, 또는 박테리아 병원체)에 의해 야기된 감염성 질환일 수 있고, CAR은 병원체 항원에 대해 표적화될 수 있다.
특정 양태에서, 본 방법은 재생 의약의 제공 방법일 수 있다. 본 양태에서, 계통-특이적 세포는 심근세포, 뉴런, 베타 소도 세포, 신장 세포, 폐 세포, 표피 세포, 췌장 세포, 간 세포, 조혈 세포 또는 간엽 세포일 수 있다.
일부 양태에서, 본 구현예의 방법은 추가로 항원 제시 세포 (APC)를 수득하고, 생산하거나 사용하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, APC는 수지상 세포일 수 있다. 특정 양태에서, APC는 APC로 기능하도록 조작된 인공 항원 제시 세포 (aAPC)이다. 예를 들면, 일부 양태에서, aAPC는 예컨대 조사에 의해 불활성화된다. 이러한 APC의 제조 방법은 본 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 추가로 상세되어 있다. 따라서, 일부 양태에서, 구현예의 세포 (예를 들면, HLA-Aneg 표현형을 갖는 면역 세포)가 T 세포 집단을 늘리기 위해 제한된 기간 동안 생체외에서 APC와 공동-배양된다. APC와의 세포의 공동-배양 단계는 예들 들면, 인터루킨-21 (IL-21) 및/또는 인터루킨-2 (IL-2)을 포함하는 배지에서 실시될 수 있다. 일부 양태에서, 공동-배양 단계는 약 10:1 내지 약 1:10; 약 3:1 내지 약 1:5; 또는 약 1:1 내지 약 1:3의 APC에 대한 면역 세포 (예를 들면, T 세포)의 비에서 수행된다. 예를 들면, 면역 세포 및 APC의 공동-배양은 약 1:1, 약 1:2 또는 약 1:3의 비로의 것일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 방법은 질병을 가진 개체의 치료를 위해 제공되고, 이는 일부 양태에서 한번 초과, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 간격 이상을 포함하여 본원에 기재된 세포 집단으로부터 유효량의 세포를 제공하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 질병은 암 또는 감염성 질환이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "HLA-Aneg" 표현형은 이의 표면 상에 기능적 HLA-A를 발현하지 않는 세포와 관련된다. 예를 들면, HLA-Aneg 표현형을 갖는 세포는 하나 또는 둘 모두의 HLA-A 유전자 중 모두 또는 일부의 결실을 포함할 수 있다. 예들 들면, HLA-A 유전자(들)은 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 도입된 결실을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 일부 양태에서, HLA-Aneg 표현형을 갖는 세포는 유전자 또는 유전자 생성물을 비기능화하는 하나 또는 둘 모두의 HLA-A 유전자에서의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 특정 성분과 관련되는 "본질적으로 함유하지 않는"은 본원에서 명시된 성분 중 어느 것도 목적을 위해 조성물로 제형화되지 않고 그리고/또는 단지 오염물질로서 존재하거나 미량으로 존재하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 따라서, 조성물의 임의의 비의도적인 오염물질로부터 생성되는 특정 성분은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 명시된 성분의 양이 표준 분석적 방법으로 검출될 수 없는 조성이 가장 바람직하다.
상세한 설명 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은 단수형태 ("a" 또는 "an")는 하나 이상을 의미할 수 있다. 상세한 설명 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단어 "포함함"과 결합하여 사용되는 경우, 단수 단어("a" 또는 "an")는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 상세한 설명 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은 "다른" 또는 "추가의"는 적어도 두 번째 이상의 것을 의미할 수 있다.
상세한 설명 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은, 용어 "약"은 값은 디바이스의 오차의 고유 변화값을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용되고, 본 방법이 연구 대상체 중에 존재하는 값, 또는 변동을 결정하기 위해 이용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 자명할 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 수정이 상세한 설명으로부터 본 기술분야의 당업자에게 자명할 수 있기 때문에 본 발명의 특정 구현예를 나타내는 경우 상세한 설명 및 특정 실시예는 단지 예시를 위해 주어지는 것으로 이해되어야 한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 이는 본 발명의 특정 양태를 추가로 나타내기 위해 포함된다. 본 발명은 본원에 제공되는 특정 구현예의 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 이들 도면에 대해 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a-b. NMDP에서 HLA-매칭된 공여체를 찾을 확률. 도 1a. 8/8 일치. 도 1b. 6/6 HLA-A를 사용하지 않음. 도 1c. 6/6 HLA-B를 사용하지 않음. 도 1d. 6/6 HLA-C를 사용하지 않음. 각각의 막대의 하부는 8/8 대립형질 매칭된 공여체를 찾을 확률을 나타낸다. 각각의 막대의 상부는 상응하는 HLA 유전자좌가 현재 HLA 일치 요건으로부터 제거되는 경우 6/6 대립형질 매칭된 공여체를 찾을 확률을 나타낸다. X-축은 민족 그룹을 나타낸다.
도 2. iPSC을 사용한 면역 수용체의 독성의 스크리닝. iPSC는 직접적으로 (좌측 패널) 또는 사망 리포터 유전자 (중간 패널) 또는 계통-특이적 리포터 유전자 (우측 패널)로의 변형 이후 계통-특이적 세포로 분화될 것이다. 분화된 세포의 잠재적인 인식은 면역 수용체-매개 인식 (좌측 패널)을 검출하는 리포터를 사용하거나 또는 T 세포를 발현하는 면역 수용체와 공동-배양시킴으로써 모니터링될 것이다.
도 3. HLA-Aneg HLA-B/C/DRB1 동종접합성 iPSC를 분화시키는 것에 의한 질환의 치료 방법을 예시하는 도식.
도 4a-b. SeV 벡터 매개된 리포터 유전자 발현. 도 4a. 활성화된 T-세포를 표시된 MOI 및 세포 수로 GFP를 암호화하는 SeV 벡터로 감염시켰다. 1일차의 유세포측정 데이터가 나타난다. X-축: GFP 발현, Y-축: CD3. MFI: 평균 형광 세기. 우측 상부 사분면에서의 수는 CD3+GFP+ 세포의 백분율을 나타낸다. 도 4b. 1일 내지 7일의 GFP 발현. MFI를 매일 측정하였고, 그래프 상에서 플롯화된다. 채워진 사각형: SeV 없음, 개방된 원: MOI=1, 1 × 106, 밀폐된 원: MOI=3, 1 × 106, 개방된 다이아몬드: MOI=1, 5 × 105, 폐쇄된 다이아몬드: MOI=3, 5 × 105.
도 5. iPSC로의 T 세포의 재프로그래밍. iPSC의 위상차 도면. 16일차에 TRA-1-60의 라이브 염색을 Alexa Fluor 647 항-TRA-1-60 항체를 사용하여 수행하였다.
도 6. iPS 콜로니의 면역형광 염색. 고정후, iPS 콜로니를 표시된 항체 및 Alexa 488 콘주게이트된 2차 항체로 염색하였다. DAPI 염색을 형광 현미경을 사용한 영상화 바로 직전에 수행하였다.
도 7. iPSC의 뉴클레오펙션. eGFP 리포터가 암호화된 DNA 플라스미드 또는 mRNA를 뉴클레오펙션에 의해 iPSC로 도입시켰다. 간단하게는, 백만개의 완전하게 분리된 iPSC를 20 μL의 P3 버퍼에 재현탁시켰고, mRNA 또는 DNA와 혼합시켰고, 스트립으로 이동시켰고, 4D Nucleofector (프로그램: CA-137)을 사용하여 뉴클레오텍션시켰다. iPSC에서의 1일차의 GFP 발현을 유세포측정에 의해 평가하였다. 나타낸 데이터는 TRA-1-60 양성 집단에 대해 개폐시켰다.
도 8. 아연 핑거 뉴클레아제에 의한 TRAC 및 TRBC 유전자의 손상. 겔 사진 상의 화살표는 Cel-1 효소에 의해 매개된 소화된 PCR 생성물을 나타내고, 이는 TRAC 및 TRBC 표적화된 ZFN이 ZFN 표적 부위에서 원하는 돌연변이를 도입시키는 것을 나타낸다.
도 9. 서열분석에 의한 TRAC 유전자 손상의 분석. WT = 서열식별번호: 1; #13-1 = 서열식별번호: 2; #13-2 = 서열식별번호: 3.
도 10. ssODN+ZFN에 의한 TCR 유전자의 손상. TRAC 표적 부위 내에 정지 코돈을 도입시키기 위해, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 TRAC 표적화된 ZFN를 갖는 세포로 도입시켰다. 10-14 일 동안의 배양 이후, ZFN 표적 부위에서의 의도된 돌연변이가 디지털 액적 PCR에 의해 검출되었다.
도 11. 잠자는 공주 및 렌티바이러스에 의한 CAR 도입을 위한 작제물. 도면은 iCasp9 및 CD19 표적화된 CAR을 도입시키기 위한 렌티바이러스 및 SB 시스템에 대한 플라스미드의 도식적 표현을 나타낸다.
도 12. 잠자는 공주 및 렌티바이러스에 의한 CAR 도입의 분석
도 13. iPS 세포로부터의 T 세포의 재분화에 대한 프로토콜 및 이의 분석. iPSC로부터의 조혈 줄기 세포의 시험관내 분화를 위한, 배양체를 적절한 사이토카인을 포함하는 AggreWellTM 플레이트에서의 배양액에서 형성시켰다. 13일차에 CD34pos 및 CD43pos 조혈 줄기 세포가 유세포측정에 의해 검출되었다.
예시적인 구현예의 설명
I. 구현예의 양태
환자 대집단에 적용가능한 입양 세포 요법 생성물을 생성하기 위한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 응용이 본 명세서에 기재되어 있다. 잠재적인 독성 (예를 들면, 면역 수용체의 것)을 스크리닝하기 위한 이러한 iPSC의 용법이 또한 기재되어 있다. 본원에 상세된 세포는 다양한 범위의 질환을 치료에 사용하기 위한 치료 시약을 제공한다. 특히, 세포는 이러한 사용이 사용하지 않고 치료될 수 있는 것보다 더 광범위한 환자 집단에서 허용될 수 있게 하는 변형된 HLA 유전자를 포함한다. 특정 양태에서, 구현예의 세포는 한 쌍 이상의 HLA 대립형질에서 동종접합성이고, HLA-Aneg 표현형을 포함한다. 이들 특징은 세포가 다수의 환자에 대해 유효하게 면역학적으로 일치될 수 있게 하고, 이에 의해 개개의 환자에 대해 개발된 요법에 비해 매우 낮은 비용으로 제조될 수 있는 세포-기반 요법을 제공한다.
도 3에 개략된 바와 같이, HLA-Aneg 세포, 예컨대 iCasp9+HLA-Aneg 세포는 HLA-A 암호화 유전자의 선택적 손상에 의한 HLA 동종접합성 세포로부터 발생될 수 있다. 예를 들면, iCasp9 유전자 (또는 다른 자살 유전자)를 도입하기 위한 잠자는 미녀(Sleeping Beauty) (SB) 트랜스포존/전위효소 시스템 (또는 다른 유전자 전달법) 및 ii) HLA-A를 제거하기 위한 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) 또는 다른 인공 뉴클레아제 (예를 들면, TALEN, CRISPR/Cas9)을 사용한 유전자 변형에 의한 HLA 동종접합성 제대혈 세포. 이들 세포는 (예를 들면, Oct3/4, KLF4, Sox2, 및 c-myc를 암호화한 센다이 바이러스를 사용하는) 재프로그래밍 인자의 도입에 의해 iPSC로 재프로그래밍될 수 있다. 대안적으로, iPSC 클론은 SB 및 ZFN를 사용하여 직접적으로 유전자 변형될 수 있고, 환언하면, 상기 세포는 우선 재프로그래밍되고 그 다음 유전자 변형될 수 있다. 유전적으로 안전한 하버 프로파일을 갖는 것으로 확인된 iPSC 클론을 단리시킨 이후, 세포는 계통 특이적 세포로 분화될 수 있고, 이는 면역요법 및/또는 재생 의약을 위해 환자에게로 투여될 수 있다. iPSC를 분화시키기 위한 하나의 방법은 인공 항원 제시 세포 (aAPC), 예컨대 유전적으로 변형된 K-562 세포로부터 유도된 것의 사용을 수반한다.
A. HLA-A neg HLA-동종접합성 iPSC의 생성 및 이의 사용 방법
본 발명의 구현예는 면역요법 및 재생 의약을 위한 동종 세포 요법에 관하여 동종 iPSC 은행을 제공한다. 요구에 따라 사전-준비되거나 도입될 수 있는 특성화된 생성물을 생성하는 단계는 이용가능한 경우 이외 필요로 되는 경우에서 세포-기반 요법의 전달 및 집중 제조를 가능하게 할 수 있기 때문에 큰 장점을 가진다. 게다가, iPSC의 유전자 조작 및 클론의 특성화는 다운-스트림 임상-등급 생성물이 발생될 수 있게 할 수 있을 것이다. 이러한 기술은 임상의가 요구시 동종의 치료적 세포를 도입할 수 있게 하고, 공여체-대-공여체 이종성(donor-to-donor heterogeneity)을 감소시키고, 그리고 또한 세포 요법 생성물의 제조 비용을 감소시킴으로써 세포 요법 과정을 촉진할 것이다.
현존하는 공여체 집단에 대한 접근을 개선하기 위한 방법이 임상적 효과를 가질 것으로 기대된다. 사실상, 국립 골수 기증 프로그램 (NMDP)은 미국에서의 대략 10,000명의 환자가 관련 없는 동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)으로부터의 이익을 받을 수 있다고 추산하고 있다. 동종 HSC가 HLA-A 유전자좌의 발현을 근절하도록 유전적으로 수정되는 경우 앞서 등록된 공여체의 임상적 지원이 증가할 것이다. NMDP로부터의 모델링은, HLA-A의 일치에 대한 필요성이 없어지고 단지 HLA-B, -C, 및 -DR만이 남는 경우, HLA-매칭된 공여체를 찾는 아프리카계 미국인 수용자의 기회가 18%에서 73%로 증가할 것을 나타낸다. 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) (또는 임의의 다른 인공 뉴클레아제, 예를 들면, TALEN, CRISPR/Cas9)는 유전적으로 수정된 T 세포 및 세포주에서의 HLA-A 발현을 근절할 수 있다. ZFN을 사용한 HSC에서의 HLA-A 발현의 근절은 HLA-매칭된 공여체를 찾을 기회를 증가시키기 위한 흥미로운 방법을 제공한다. 이는 특히 소수 민족 그룹에 속하는 환자에 대한 동종 HSCT의 임상 적용을 확대할 것으로 기대된다.
HLA-Aneg HLA-동종접합성 iPSC의 은행의 생성은 이것이 다수의 수용자들에게 도입될 수 있기 때문에 이들 문제를 해소할 수 있을 것이다. 이는 대략 27명의 특정 공여체 (HLA-B, -C, 및 -DRB1에서 동종접합성, 참고 표 1), 예컨대 제대혈로부터 유도된 iPSC로부터 HLA-A (예를 들면, 맞춤형 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, CRISPR/Cas9 사용)를 녹아웃시킴으로써 달성될 수 있다. 이들 iPSC 은행은 면역요법 및 재생 의약을 개선하기 위해 유전자를 삽입할 뿐만 아니라 제거하기 위해 조작될 수 있다. 이들 HLA-Aneg iPSC 및 이로분터 분화된 세포 (예를 들면, 면역 세포, 심장 세포, 신장 세포)는 면역 세포뿐만 아니라 다른 치료적 세포, 예컨대, 예들 들면, 비제한적으로, 심장 세포, 췌장, 신장, NK 세포, iNKT 세포, 및 아형을 비롯한 T 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있는 매우 귀중한 자원일 것이다. 이는 병 (예를 들면, 암, 자가면역 질환, 감염)에 대한 요법뿐만 아니라 재생 의약에 대한 요법을 생성할 것이다.
[표 1] 미국 인구를 포괄하는데 필요로 되는 특정 HLA-B, HLA-C, 및 HLA-DRB1 동형접합체
Figure pat00001
그러나, 동종 T 세포 상에 도입된 내인성 αβ T-세포 수용체 (TCR)는 이식편 대 숙주-질환 (GVHD)을 야기하는 수용자에서의 다수 및 소수의 조직적합성 항원을 인식할 수 있다. 이를 극복하기 위해서, 원치않는 동종 면역 반응을 야기하는 내인성 TCR αβ 및 γδ 발현을 근절할 수 있다. 이러한 단계는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 도입, 예를 들면, TCR α 불변 영역 또는 β 불변 영역을 표적화에 의한 것을 포함하는 임의의 적합한 방식으로 일어날 수 있다.
B. 오프-타겟 독성의 방지 및 수용자에 의한 인식을 위한 iPSC의 사용
표적 항원의 발현을 식별하기 위한 현재 스크리닝 방법은 제한적이다. 본 발명의 구현예는 면역 수용체의 잠재적인 독성을 예측하기 위한 현재 문제점을 해결할 수 있는 iPSC/iPSC-유도된 세포의 스크리닝을 위해 제공된다. 이와 같이, HLA-Aneg HLA-동종접합성 iPSC의 뱅크(bank)는 면역요법에 대한 잠재성을 가지도록 조작된 면역 세포로부터 생성되는 독성을 스크리닝하기 위한 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. iPSC를 사용하는 비의도적인 부정적 경우 (온-타겟뿐 아니라 오프-타겟 독성)에 대한 스크리닝은 내인성 또는 도입된 면역 수용체에 의한 비예측성 오프-타겟 독성의 가능성을 감소시킴으로써 (다른 면역 세포를 도입하는 요법뿐만 아니라) 입양 T-세포 요법을 개선할 것이다. 예를 들면, 이의 인간 적용 이전에, 클로닝된/조작된 T-세포 수용체 (TCR) 및 키메라성 항원 수용체 (CAR)는 잠재적 독성에 대해 스크리닝될 필요성이 있다. 이는 조작된 iPSC 및 그것의 분화된 자손의 패널을 사용하여 시험관내에서 달성될 수 있다.
II. 구현예의 세포
본 발명의 특정 구현예에서, 체세포는 재프로그래밍 인자의 도입에 의해 재프로그래밍되어 유도 만능 줄기 세포를 생성한다. 이들 세포의 자손은 하기 기술되고 본 기술분야에 익히 알려져 있는 바와 같이 다양한 양태에서 배아 줄기 세포와 동일한 것일 수 있다. 배아 줄기 세포 특성의 이해는 이들 방법에 의해 생산되는 유도 만능 줄기 세포를 선택하도록 일조할 수 있다. 줄기 세포 재프로그래밍 연구로부터 공지된 재프로그래밍 인자는 이들 방법에 대해 사용될 수 있다.
용어 "세포"는 본원에서 본 기술분야에서의 이의 가장 넓은 의미로 사용되고, 다중세포 유기체의 조직의 구조 단위인 살아있는 신체와 관련되고, 이는 외부로부터 이를 분리하는 막 구조로 둘러싸여 있고, 이는 자체 복제의 능력을 가지고, 이를 발현하기 위해 유전적 정보 및 기전을 가진다. 본원에서 사용되는 세포는 자연 발생 세포 또는 인공적으로 변형된 세포 (예를 들면, 융합 세포, 유전적으로 변형된 세포 등)일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "분화된 세포"는 비특화된 표현으로부터 특화된 표현형까지 발달되는 세포를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 배아 세포는 장 내벽의 상피 세포로 분화될 수 있다. 분화된 세포는 태아 또는 예를 들면 살아있는 태어난 동물로부터 단리될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "미분화된 세포"는 비특화된 표현형을 갖고 분화될 수 있는 전구체 세포와 관련된다. 미분화된 세포의 예는 줄기 세포이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "줄기 세포"는 자가 복제 및 만능분화능이 가능한 세포와 관련된다. "만능(pluripotent)"은 세포가 이의 자손을 통해 생식세포 및 모든 3개의 배엽층: 내배엽 (내부 위벽, 위장관, 폐), 중배엽 (근육, 골, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽 (표피 조직 및 신경계)을 비롯하여, 성체 동물을 포함하는 모든 세포형을 일으킬 수 있는 것을 의미한다. 본원에서 줄기 세포는 비제한적으로, 배아 줄기 (ES) 세포, 조직 줄기 세포 (또한 소위 조직-특이적 줄기 세포, 또는 체세포 줄기 세포), 또는 유도 만능 줄기 세포일 수 있다. 상기-기재된 능력을 가지는 임의의 인공적으로 생산된 세포 (예를 들면, 융합 세포, 재프로그래밍된 세포, 또는 본원에서 사용되는 것)가 줄기 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "배아 줄기 (ES) 세포"는 시험관내 세포 배양에서 유지되는 배아로부터 단리된 만능 세포와 관련될 수 있다. 이러한 세포는 생식세포를 비롯하여, 성체 동물을 포함하는 모든 세포형을 생체내에서 생성하는 능력을 배양액에서 유지하는 배양된 배아로부터 단리된 급속하게 분할된 배양 세포이다. 배아 줄기 세포는 둥근 세포 형태학을 가질 수 있고, 이는 영양세포층 상의 둥근 세포 응집체에서 성장될 수 있다. 배아 줄기 세포는 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
조직 줄기 세포는 세포가 유도되는 부위, 예컨대 진피 시스템 (예를 들면, 표피 줄기 세포, 모낭줄기 세포 등), 소화계 (예를 들면, 췌장 (공통의) 줄기 세포, 간 줄기 세포 등), 골수 시스템 (예를 들면, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 등), 신경계 (예를 들면, 신경 줄기 세포, 망막 줄기 세포 등) 등에 기초한 카테고리로 구분된다.
iPS 세포 또는 iPSC로서 통상적으로 약칭되는 "유도 만능 줄기 세포"는 재프로그래밍 인자를 발현시킴으로써 비-만능 세포, 전형적으로 성체 체세포, 또는 말단 분화된 세포, 예컨대 섬유아세포, 조혈 세포, 근세포, 뉴런, 표피 세포 등으로부터 인공적으로 제조되는 일 유형의 만능 줄기 세포와 관련된다.
"자가-재생"은 미분화된 상태를 유지하면서도 세포 분열의 다수의 사이클을 진행하는 능력과 관련된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "체세포"는 다음 발생으로의 이의 DNA를 직접적으로 전사시키지 않는 생식세포, 예컨대 난자, 정자 등 이외의 임의의 세포와 관련된다. 전형적으로, 체세포는 제한된 만능분화능(pluripotency)을 가지거나 가지지 않는다. 본원에서 사용되는 체세포는 자연 발생되거나 유전적으로 변형된 것일 수 있다.
세포와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "배양됨"은 시험관내 환경에서 세포 분열을 진행하거나 세포 분열을 진행하지 않는 하나 이상의 세포와 관련될 수 있다. 시험관내 환경은 세포를 시험관내에서 유지하기에 적합한 본 기술분야에 공지된 임의의 배지, 예컨대, 예를 들면 적합한 액체 배지 또는 한천일 수 있다.
본 구현예에 따른 배지는 혈청-함유 또는 혈청-무함유 배지일 수 있다. 혈청-무함유 배지는 미가공되거나 미정제된 혈청을 가진 배지와 관련되고, 따라서 이는 정제된 혈액-유도된 성분 또는 동물 조직-유도된 성분 (예컨대 성장 인자)를 갖는 배지를 포함할 수 있다. 이종성 동물-유도된 성분으로의 오염을 방지하기 위한 양태로부터 혈청은 줄기 세포(들)의 것과 동일한 동물로부터 유도될 수 있다.
본 구현예에 따른 배지는 혈청에 대한 임의의 대체물을 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있다. 혈청에 대한 대체물은 알부민 (예컨대 지질-풍부 알부민, 알부민 대체물 예컨대 재조합 알부민, 식물 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해물), 트랜스페린 (또는 다른 철 수송체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-머캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 이의 등가물을 적절하게 함유하는 물질을 포함할 수 있다.
A. 줄기 세포
줄기 세포는 모두는 아니지만 대부분의 다중 세포 유기체에서 발견되는 세포이다. 이는 유사분열 세포 분열을 통해 스스로를 재생하는 능력 및 특화된 세포 유형의 분화 범위로 분화하는 것으로 특정된다. 2개의 넓은 유형의 포유동물 줄기 세포는 하기와 같다: 배반포에서 발견되는 배아 줄기 세포 및 성체 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포. 배아 발달시, 줄기 세포는 모든 특화된 배아 조직으로 분화될 수 있다. 성체 유기체에서, 줄기 세포 및 전구 세포는 특화된 세포를 보충하는 신체에 대한 복구 시스템으로서 작용하나, 또한 재생 기관, 예컨대 혈액, 피부 또는 장 조직의 정상적인 턴오버(turnover)를 유지한다.
줄기 세포가 성장되어 세포 배양을 통해 다양한 조직, 예컨대 근육 또는 신경의 세포와 일치되는 특성을 갖는 특화된 세포로 변형될 수 있고, 의료 요법에서의 이의 용도가 제안되고 있다. 성체 세포의 유도 만능 줄기 세포로의 재프로그래밍은 막대한 잠재성을 가진다.
현재까지의 거의 모든 연구는 마우스 배아 줄기 세포 (mES) 또는 인간 배아 줄기 세포 (hES)를 사용하여 실시되었다. 이 둘은 필수적인 줄기 세포 특성을 가지고, 그러나 이들은 미분화된 상태를 유지하기 위해 매우 상이한 환경을 요구한다. 마우스 ES 세포는 젤라틴의 층에서 성장될 수 있고, 백혈병 억제 인자 (LIF)의 존재를 필요로 한다. 인간 ES 세포는 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)의 영양세포층(feeder layer) 상에서 성장될 수 있고, 대개 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF 또는 FGF-2)의 존재를 필요로 한다. 최적의 배양 조건 또는 유전자 조작 (Chambers et al., 2003) 없이, 배아 줄기 세포는 급속하게 분화될 것이다.
인간 배아 줄기 세포는 또한 다수의 전사 인자 및 세포 표면 단백질의 존재에 의해 정의될 수 있다. 전사 인자 Oct4, Nanog, 및 Sox2는 만능분화능의 유지 및 분화를 야기하는 유전자의 억제를 보장하는 중심 조절 네트워크를 형성한다 (Boyer et al., 2005). hES 세포를 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포 표면 항원은 당지질 SSEA3 및 SSEA4 및 케라탄 설페이트 항원 Tra-1-60 및 Tra-1-81을 포함한다.
B. 재프로그래밍 인자
iPS 세포의 발생은 유도를 위해 사용되는 유전자에 좌우된다. 하기 인자 또는 이의 조합이 사용될 수 있다: Oct3/4, KLF4, Sox2, 및/또는 c-myc. 이들 재프로그래밍 인자가 암호화된 핵산은 단일시트론성 또는 다시트론성 발현 카세트에 포함될 수 있다. 마찬가지로, 상기 단일시트론성 또는 다시트론성 발현 카세트가 암호화된 핵산은 하나의 재프로그래밍 벡터 또는 다중 재프로그래밍 벡터에 포함될 수 있다.
Oct3/4는 만능분화능을 유지하는데 결정적인 역할을 한다. Oct3/4+ 세포, 예컨대 난할구 및 배아 줄기 세포에서의 Oct3/4의 부재는 자발적인 영양막 분화를 야기하고, Oct3/4의 존재는 배아 줄기 세포의 만능분화능 및 분화 잠재성을 일으킨다.
유전자의 Klf 부류의 KLF4는 마우스 iPS 세포의 발생을 위한 인자로서 초기에 확인되었고, 이는 이후 인간 iPS 세포의 발생을 위한 인자로 입증되었다. Klf2 및 Klf4는 iPS 세포를 생성할 수 있는 인자인 것으로 밝혀졌고, 관련된 유전자 Klf1 및 Klf5는 감소된 효율이지만 이와 같이 작용하였다.
Sox 부류의 유전자는 Oct3/4와 유사한 만능분화능을 유지하는 것과 관련되고, 한편 이는 만능 줄기 세포에서 배타적으로 발현되는 Oct3/4와 대조적으로 다분화능 및 단분화능 줄기 세포와 관련된다. Sox2는 문헌 [Yamanaka et al. (2007), Jaenisch et al. (1988) 및 Yu et al. (2007)]에 의한 유도를 위해 사용되는 초기 유전자인 한편, Sox 부류에서의 다른 유전자는 유도 과정에서 마찬가지로 작용하는 것으로 발견되었다. Sox1은 Sox2와 유사한 효율을 갖는 iPS 세포를 생성하고, 유전자 Sox3, Sox15, 및 Sox18은 또한 감소된 효율이지만 iPS 세포를 생성한다.
Myc 부류의 유전자는 암과 연루되는 원암 유전자이다. 문헌 [Yamanaka et al. (2007) 및 Jaenisch et al. (1988)]는 c-myc가 마우스 iPS 세포의 발생과 연루된 인자인 것을 입증하였고, 문헌 [Yamanaka et al. (2007)]은 이것이 인간 iPS 세포의 발생과 연루된 인자인 것으로 입증하였다. N-myc 및 L-myc는 c-myc와 유사한 효율을 가진 만능분화능을 유도하는 것으로 확인되었다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 가진 세포를 도입하는 것 이외, 세포를 하기를 포함하는 재프로그래밍 배지로 처리한다: HDAC 저해제, Wnt 경로 저해제, Oct4 활성제, 하이드로코르티손, 줄기 세포 인자, EPO, IL-3, CHIR99021, A-83-01, hLIF, 및/또는 bFGF. 이러한 분자의 사용은 개선된 재프로그래밍 효율 및 동력학을 야기하여, 이에 의해 일차 재프로그래밍 배양에서의 iPS 세포 식별을 용이하게 하고, iPS 세포 클론성을 보존할 수 있다.
C. 유도 만능 줄기 세포를 생성하기 위한 방법
iPS 세포는 전형적으로 특정 줄기 세포-관련된 유전자를 비-만능 세포, 예컨대 성체 섬유아세포 또는 제대혈로의 형질감염에 의해 유도된다. 형질감염은 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스를 통합시키거나 또는 바이러스 벡터, 예컨대 센다이 바이러스를 통합시키지 않는 것을 통해 달성될 수 있다. 과도기(critical period) 이후, 적은 수의 형질감염된 세포가 만능 줄기 세포와 형태적으로 및 생화학적으로 유사하게 되기 시작되고, 이는 형태적 선택, 배가 시간, 리포터 유전자 발현, 및/또는 항생제 내성을 통해 단리될 수 있다.
KLF4, cMYC, OCT4, SOX2를 암호화한 레트로바이러스 벡터를 사용한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 선구적 발생 이후, 다양한 방법이 많은 종류의 세포로의 이들 인자의 도입을 위해 개발되었다. 이들 중에서, 센다이 바이러스 (SeV) 벡터가 사용되어 분화된 T 세포로부터 iPSC를 효과적으로 생성시켰다. SeV는 ~15 kb의 단일가닥의 네거티브-센스의 비분절된 RNA 게놈을 갖는 외피보유 바이러스이다. 재조합 센다이 바이러스 벡터는 감염된 세포의 세포질에서만 복제되고, DNA 기를 진행하지 않고 호스트 게놈으로 통합되지 않는다. SeV 벡터는 이의 유지 과정에서 iPSC로 T 세포를 재프로그래밍시킨 이후 줄어들 것이다.
유도 만능 줄기 세포의 발생을 위한 과정이 느려지고 비효율적이고, 대부분 세포가 불능이 된다. 이러한 과정의 효율을 개선하기 위해서, 재프로그래밍 인자 및 임의로 리포터를 함유하는 작제물을 이용하는 벡터가 사용되어 리포터의 존재에 대해 우선 선택되고 이후 이식유전자 침묵이 만능 세포에서 매우 효과적인 리포터 유전자 발현에 대해 선택함으로써 형질감염 효율을 최적화하기 위해 사용될 수 있다.
이소성 재프로그래밍 인자(ectopic reprogramming factor)의 강제적인 지속적 발현은 종양 형성의 증가된 빈도와 연결될 수 있고, 이러한 문제점의 해결책은 이식유전자-무함유 iPS 세포의 발생이다. 한 세트의 도입된 유전자는 재프로그래밍 과정을 시작하기 위해 필요할 수 있고, 그러나 점차적으로 세포 그 자체의 내인성 만능분화능 유전자가 활성화되어, 도입된 유전자는 확률적 재활성화(stochastic reactivation)에 대한 잠재성을 가진 채로 침묵화된다. 외인성 인자는 자가-유지 만능 상태로 들어가는 세포에 대해 최소 약 10-16일이 필요로 될 수 있다 (문헌 [Brambrink et al., 2008; Stadtfeld et al., 2008]). 이식유전자 발현의 최소 길이의 결정은 iPS 세포를 유도하는 비-통합 전달 방법의 진행을 가능하게 한다.
인간 체세포로부터의 만능 줄기 세포의 유도는 재프로그래밍 유전자의 이소성 발현을 위한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 달성되었다. 재조합 레트로바이러스, 예컨대 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스는 역전사효소의 기능으로 인해 안정한 방식에서 호스트 게놈으로 통합하는 능력을 가진다. 렌티바이러스는 하위부류의 레트로바이러스이다. 이는 비분열된 것뿐만 아니라 분열된 세포의 게놈으로 통합하는 이의 능력으로 인해 벡터로서 널리 적용된다. 바이러스 벡터를 사용하는 iPS 세포의 재프로그래밍으로부터의 방법은 본 기술분야에 널리 알려져 있다.
통합된 바이러스 벡터의 사용은 내인성 유전자의 돌연변이를 야기할 수 있거나, 바이러스 벡터가 숙주세포의 염색체의 무작위 위치로의 유전자의 통합을 중재하기 때문에 내인성 종양유전자의 활성화를 야기할 수 있다. 따라서, iPS 세포는 게놈 통합 재프로그래밍 인자를 사용하지 않고 제조될 수 있다. 이러한 방법은 미국특허 제8,546,140호 및 제8,268,620호에 기재되어 있고, 이는 본원에 그 전문이 참조로 포함되어 있다. 예를 들면, EBV 또는 이의 변이체를 포함하는 에피솜 벡터 요소가 사용될 수 있다. 추가의 양태에서, iPS 세포에서의 에피솜 벡터 요소가 재프로그래밍 이후 제거될 수 있다.
표적 세포로의 외인성 유전자 변형을 도입하는 것을 회피하기 위한 가능한 하나의 방법은 전달된 유전자로부터의 전사에 의존하는 것보다는 세포로 직접적으로 재프로그래밍 단백질을 전달하는 것일 것이다. 이전의 연구는 다양한 단백질이 단백질 형질도입을 중재하는 짧은 펩타이드 예컨대 HIV Tat 및 폴리-아르기닌을 이들과 컨쥬게이션시킴으로써 시험관내 및 생체내에서 세포로 전달될 수 있음을 실증하고 있다. 최근 연구는 쥣과 섬유아세포가 재조합 재프로그래밍 단백질의 직접적인 전달에 의해 만능 줄기 세포로 완전하게 재프로그래밍될 수 있다는 것을 입증하고 있다 (문헌 [Zhou et al., 2009]).
개시 세포(starting cell) 및 분화된 세포는 일반적으로 배양 배지 및 조건에 대해 차별화된 요건을 가진다. 개시 세포의 성장에 적합한 것으로 알려진 배양 조건 하에 그리고 배지의 존재 하에, 분화 인자의 도입 이후 적어도 배양의 초기 단계가 실시되는 것이 일반적이다. 이는 이후 분화된 세포에 대해 적합한 것으로 알려진 조건 하에 그리고 분화 배지의 존재 하에 배양의 차후 기간이 후속된다. 분화를 위한 충분한 시간 이후, 분화된 세포는 증식 배지 중의 분화된 세포의 증식을 위해 추가로 배양될 수 있다. 이러한 증식 배지는 하나 이상의 신호전달 저해제를 포함할 수 있거나 이는 이들 저해제를 본질적으로 함유하지 않는 배양 배지를 포함할 수 있다. 분화 조건은 공급 세포를 본질적으로 함유하지 않을 수 있다. 추가의 양태에서, 분화 배지는 화학적으로 정의될 수 있다.
D. 재프로그래밍된 세포의 선택
구현예의 특정 양태에서, 재프로그래밍 벡터가 체세포로 도입된 이후, 이들 세포는 증식을 위해 배양될 것이다. 세포는 형질감염된 세포를 농축시키기 위해 벡터 요소, 예컨대 리포터 또는 선택 마커의 존재에 대해 선택될 수 있다. 재프로그래밍 벡터는 이들 세포에서 재프로그래밍 인자를 발현시킬 것이고 세포 분열에 따라 복제되고 분할될 것이다. 이들 발현된 재프로그래밍 인자는 자가-유지 만능 상태를 확립하기 위해 체세포 게놈으로 재프로그래밍될 것이고, 벡터의 존재의 양성 선택의 제거와 동시에 또는 그 이후에, 외인성 유전 인자가 비-통합 벡터가 사용되는 구현예에서 서서히 손실될 것이다. 이식유전자 발현의 이러한 침묵화는 다른 배아 줄기 세포 특성 (예를 들면, 형태학, 성장 특성, 줄기 세포 마커, 줄기 세포 유전자, 텔로머라제 활성, 만능분화능, 기형종 형성, 배양체 형성, 배반포 주사, 프로모터 데메틸화, 및 히스톤 데메틸화)와 함께 또는 단독적으로 리포터 유전자 발현을 중지함으로써 유도 만능 줄기 세포의 선택을 가능하게 하고, 이는 이들이 만능 배아 줄기 세포와 실질적으로 동일한 것으로 예상되기 때문이다. 추가의 음성 선택 단계가 또한 이용되어 재프로그래밍 벡터 DNA의 부재를 시험하거나 선택 마커를 사용함으로써 외인성 유전 인자를 본질적으로 함유하지 않는 iPS 세포의 선택을 신속하게 하거나 보조할 수 있다.
검출가능한 신호가 다수의 방식 중 임의의 하나에서 발생될 수 있고, 이는 본 구현예의 방법에서 이용되는 리포터 유전자의 특성에 좌우된다. 예를 들면, 검출가능한 신호는 형광성 신호, 예를 들면, GFP일 수 있다. 유세포측정, 예들 들면, 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)는 리포터 유전자 발현에 기초한 검출가능한 신호에 대해 선택하기 위해 통상적으로 사용된다. 루시퍼라아제는 또한 검정의 기초로 사용될 수 있다. 효소-기반 검정은 루시퍼라아제-기반 검정과 유사한 방식으로 수행되고, 단, 검출은 필수적으로 발광을 통한 것은 아니다. 검출 기술은 효소에 좌우될 것이고, 따라서 (예컨대 β-갈락토시다아제의 경우에서) 광학적인 것일 수 있다. 물리적 및 생화학적 방법은 또한 구현예의 리포터 유전자의 발현을 식별하거나 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.
iPSC에 대한 체세포의 재프로그래밍 이후, 세포 집단으로부터 세포의 하나 이상의 하위-집단으로 실질적으로 정제하거나 분리하는 것이 요구될 수 있다. 유세포측정을 사용한 세포의 분리, 예컨대 FACS 또는 자성 활성화된 세포 분류를 위한 방법은 이종성 세포 집단으로부터 iPS 세포를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 세포 분리 프로토콜은 또한 하기 실시예에 나타나 있다.
E. 재프로그래밍된 세포의 배양
만능 세포는 다양한 방법을 사용하여 미분화된 상태로 배양되거나 유지될 수 있다. 특정 구현예에서, 만능 세포는 정의된, 공급물-독립적 배양 시스템(feeder-independent culture system), 예컨대 TeSR 또는 E8 배지 (예를 들면, 참조로 포함된 문헌[Chen et al. (2011)] 참조)를 사용하여 본질적으로 미분화된 상태로 배양되어 유지될 수 있다. 예를 들면, TeSR 배지는 미분화된 인간 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있는 정의된 배지이다. TeSR 배지는 TeSR1 배지 및 mTeSR 배지 모두를 포함한다. TeSR은 bFGF, LiCl, γ-아미노부티르산 (GABA), 피페콜산 및 TGFβ를 포함하고, TeSR을 이용하는 다양한 방법이 예를 들면 미국특허 제7,449,334호 및 문헌 [Ludwig et al. (2006a; 2006b)]에 선행하여 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 대안적으로, 미정의된 조건이 사용될 수 있고; 예를 들면, 만능 세포는 섬유아세포 공급 세포 또는 줄기 세포를 미분화된 상태로 유지하기 위해 섬유아세포 공급 세포에 노출되어 있는 배지에서 배양할 수 있다.
공급물-독립적 배양 시스템 및 배지가 만능 세포, 예컨대 hESC 또는 iPSC를 배양하고 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 이 방법은 인간 배아 줄기 세포를 마우스 섬유아세포 "영양세포층"에 대한 필요성 없이 본질적으로 미분화된 상태로 유지할 수 있게 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 변형이 원하는 바와 같이 비용을 감소시키기 위해 이들 방법에 대해 이루어질 수 있다.
일부 양태에서, 기질 성분은 실질적으로 또는 본질적으로 미분화된 상태로 만능 세포를 배양하고 유지하기 위한 정의된 배지에 포함될 수 있다. 적합한 반-고체 기질에서 배양되는 경우, 콜로니-형성 세포 (CFC)로 지칭되는 개체 전구세포는 증식되어 별개의 세포 클러스터 또는 콜로니를 형성할 수 있다. CFC 검정은 반-고체 배지, 예컨대 영양소 및 사이토카인이 보충된 메틸셀룰로오스 또는 콜라겐에 세포 현탁액을 배치시키고, 그 다음 예를 들면, 약 37℃에서의 배양시켜 실시될 수 있다.
다양한 기질 성분이 만능 세포, 예컨대 hESC 또는 iPSC를 배양하거나 유지시키기 위해 사용될 수 있다. 조합되는 예들 들면, 콜라겐 IV, 파이브로넥틴, 라미닌, 및 빈트로넥틴이 문헌 [Ludwig et al. (2006a)]에 기재된 바와 같이 배아 세포 배양 및 유지를 위한 고체 지지체를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
MatrigelTM이 세포 배양 및 만능 세포의 유지를 위한 기질을 제공하기 위해 사용될 수 있다. MatrigelTM은 마우스 종양 세포에 의해 분비된 젤라틴성 단백질 혼합물이고, 이는 BD Biosciences (New Jersey, USA)로부터 상업적으로 이용가능하다. 혼합물은 많은 조직에서 볼 수 있는 복합적인 세포외 환경과 비슷하고, 이는 세포 배양을 위한 기질로서 세포 생물학자에 의해 사용된다. MatrigelTM이 함유된 정의된 배지에서의 인간 배아 줄기 세포 배양 및 유지를 위한 방법은 예를 들면 문헌 [Ludwig et al. (2006a)]에 기재되어 있고, 이는 만능 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에게 알려져 있는 바와 같이 인간 배아 줄기 세포의 배양 및 유지를 위한 추가의 방법은 본 구현예와 함께 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
F. 재프로그래밍된 세포의 분화
"분화"는 덜 특화된 세포가 이것이 분화되지 않고 동일한 조건 하에서 가질 수 있는 것보다 배양액 또는 생체내에서 더 특화된 세포가 될 수 있는 과정이다. 특정 조건 하에서, 더 특화된 세포의 특성을 갖는 덜 특화된 세포로부터 형성된 자손의 비율이 선호도를 증가시키기 위해 적어도 약 1%, 5%, 25% 이상일 수 있다.
다양한 방법이 본 구현예에 따라 사용되어 비제한적으로, 조혈 줄기 세포, 면역 효과기 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포, iNKT 세포), 근세포 (예를 들면, 심근세포), 뉴런, 베타 소도 세포, 신장 세포, 폐 세포, 섬유아세포 및 표피 세포, 및 이로부터 유도된 조직 또는 기관을 포함하는 세포 계통으로 iPS 세포를 분화시킬 수 있다.
1. 조혈 줄기 세포
iPSC는 조혈 전구 세포, 또는 조혈 줄기 세포로 배양되고/되거나 분화될 수 있다. 그러나, 당업자는 다양한 방법이 만능 세포로부터 조혈 전구 세포를 발생시키기 위해 사용될 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 예를 들면, 본원에 참조로 포함된 미국특허 제8,372,642호는 조혈 전구 세포를 발생시키기 위한 고효율 배양 시스템을 상세하고 있다.
조혈 전구 세포는 정의된 배양 조건을 사용하고 공급 세포를 사용하여 발생시킬 수 있다. 예를 들면, 만능 세포를 부분적으로, 본질적으로, 또는 완전하게 분리하거나 개별화한 이후, 세포를 정의된 배지에서 추가로 배양하여 조혈 분화를 촉진할 수 있다. 성장 인자의 특정 조합이 실질적으로 조혈 전구체 및 조혈 세포 계통으로의 만능 세포의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 발견하였다. 성장 인자의 특정 조합의 순차적인 응용이 사용되어 만능 세포의 분화를 추가로 촉진할 수 있다. 특정 구현예에서, 성장 인자의 특정 조합은 만능 세포의 조혈 분화를 위해 중요하다. 예를 들면, BMP4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3, 및 GMCSF의 조합이 사용되어 조혈 분화를 촉진할 수 있다. 특정 양태에서, BMP4 및 VEGF (및 임의로 FGF-2)을 포함하는 제1 배지에 대한 세포 배양물의 순차적인 노출, 그 다음 Flt3 리간드, IL-3, 및 GMCSF를 포함하는 제2 배지에서의 배양은 조혈 전구체 세포 및 조혈 세포로의 만능 세포의 분화를 증가시킬 수 있다.
조혈 전구 세포로의 만능 세포의 분화가 정의되거나 미정의된 조건을 사용하여 수행될 수 있는 한편, 정의된 조건이 일반적으로 생성된 세포가 인간 대상체에게 투여되는 것으로 의도되는 구현예에서 바람직할 것으로 이해될 수 있을 것이다. 조혈 줄기 세포는 정의된 조건 (예를 들면, TeSR 배지 및 기질 성분 예컨대 MatrigelTM 또는 E8 배지를 사용함) 하에 만능 줄기 세포로부터 배양될 수 있다.
예들 들면, 정의된 배지는 조혈 CD34+ 분화를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 상술되는 바와 같이, 정의된 배지는 성장 인자 BMP-4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3 및/또는 GMCSF를 함유할 수 있다. 실질적인 저산소 조건 (예를 들면, 20% O2 미만)은 추가로 조혈 또는 내피 분화를 촉진할 수 있다.
조혈 전구체 세포로의 만능 세포의 분화에 대해 정의된 방법의 사용이 특정 예에서 바람직할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 미정의된 방법이 다양한 구현예에서 사용될 수 있다. iPSC로부터의 조혈 줄기 세포의 분화를 위한 미정의된 하나의 방법은 공급 세포, 예컨대 CD34+로의 강한 분화를 유도하는 마우스 기질 세포주 OP9 또는 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 영양세포층 상에서 iPSC를 배양하는 단계를 수반한다. 정의된 조건과 대조하여, OP9 세포의 사용은 일반적으로 CD34+ 분화를 유도하기 위한 추가의 성장 인자를 요구하지 않는다.
2. 조혈 세포
만능 줄기 세포, 예컨대 iPSC는 적절한 조건 하에 분화하도록 유도되거나 지지되는 경우, 골수, 적혈구, 및 거핵구성 조혈 세포 계통을 유도하는 능력을 보유하면서도 비제한된 자가-재생을 가능하게 할 수 있다.
조혈 세포로의 iPS 세포 분화의 예시적인 방법은 예를 들면 본원에 그 전문이 참조로 포함된 미국특허 제8,557,580호 및 제8,372,642호 및 WO 12/109208, 또는 다른 방법 (문헌 [Chadwick et al., 2003; Ng et al., 2005])에 개시된 방법을 포함할 수 있다. 파이브로넥틴 분화 방법이 또한 문헌 [Wang et al. (2007)]에 예시된 바와 같은 계통 분화를 위해 사용될 수 있다. 조혈 세포는 또한 미국특허 공보 제2003/0153082호에 개시된 바와 같이 혈행성 사이토카인 및 골 형성 단백질과 함께 줄기 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
a. 키메라성 항원 수용체 및 T-세포 수용체
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체 또는 T-세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 추가로 B 및/또는 T 림프구의 생성을 야기하는 체액성 면역 반응 및/또는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 용어 "종양-관련 항원" 및 "암 세포 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 각 경우에 상기 용어는 암 세포에 의해 특이적으로 또는 우선적으로 발현되는 단백질, 당단백질 또는 탄수화물과 관련된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "키메라성 항원 수용체 (CAR)"는 예를 들면, 인공 T-세포 수용체, 키메라성 T-세포 수용체, 또는 키메라성 면역수용체와 관련될 수 있고, 이는 특정한 면역 효과기 세포 상에 인공적 특이성을 그라프팅하는 조작된 수용체를 포함한다. CAR은 T 세포에 대해 단클론성 항체의 특이성을 부여하여, 이에 의해 예를 들면 입양 세포 요법에서 사용하기 위해 다수의 특이적 T 세포를 발생시키는데 이용될 수 있다. 특정 구현예에서, CAR은 예를 들면 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성을 유도한다. 일부 구현예에서, CAR은 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포내 활성화 도메인, 막통과 도메인, 및 세포외 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, CAR은 CD3-제타 막통과 도메인 및 엔도도메인에 융합되는, 단클론성 항체로부터 유도된 단일-사슬 가변성 단편 (scFv)의 융합을 포함한다. 다른 CAR 구조의 특이성은 수용체 (예를 들면, 펩타이드)의 리간드로부터 또는 패턴-인식 수용체, 예컨대 덱틴(Dectin)으로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, B-계통 분자, CD19에 대해 특이적인 CAR을 사용함으로써 T 세포의 특이성을 재유도하여 악성 B 세포를 표적화할 수 있다. 특정 경우에서, 항원-인식 도메인의 간격은 변형되어 활성화-유도 세포사를 감소시킬 수 있다. 특정 경우에서, CAR은 추가의 공동-자극 신호전달을 위한 도메인, 예컨대 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10, 및/또는 OX40을 포함한다. 일부 경우에서, 상기 분자는 공동-자극 분자, (예를 들면, 양전자 방출 단층촬영)를 위한 리포터 유전자, 프로-드러그의 부가시의 T 세포를 조건적으로 제거하는 유전자 생성물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 및 사이토카인 수용체를 비롯한 CAR과 함께 공동-발현될 수 있다.
본 발명의 구현예는 하나 이상의 신호전달 모티프를 포함하는 세포내 신호전달 도메인, 막통과 도메인, 및 세포외 도메인을 포함하는 면역원성 (hCAR)을 감소시키기 위해 인간화된 CAR을 비롯한 항원-특이적 키메라성 항원 수용체 (CAR) 폴리펩타이드를 암호화한 핵산을 포함하는 핵산을 수반한다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원들 사이에 공유된 공간에 포함되는 에피토프를 인식할 수 있다. 패턴 인식 수용체, 예컨대 덱틴-1은 탄수화물 항원에 대한 특이성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 단클론성 항체의 상보적 결정 영역, 단클론성 항체의 가변 영역, 및/또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이러한 특이성은 수용체에 결합되는 펩타이드 (예를 들면, 사이토카인)로부터 유도된다. 상보성 결정 영역 (CDR)은 항원을 보충하여 이에 따라 이러한 특정 항원에 대한 특이성을 수용체에 제공하는 항원 수용체 (예를 들면, 면역글로불린 및 T-세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견되는 짧은 아미노산 서열이다. 항원 수용체의 각각의 폴리펩타이드 사슬은 3개의 CDR (CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 함유한다. 항원 수용체는 전형적으로 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성되기 때문에, 항원과 접촉될 수 있는 각각의 항원 수용체에 대해 6개의 CDR가 존재하고 - 각각의 중쇄 및 경쇄는 3개의 CDR을 함유한다. 면역글로불린 및 T-세포 수용체와 관련된 대부분의 서열 변화가 CDR에서 발견되기 때문에, 이들 영역은 종종 초가변성 도메인으로서 지칭된다. 이들 중에서, CDR3는 VJ (중쇄 및 TCR αβ 사슬의 경우 VDJ) 영역의 재조합에 의해 이것이 암호화되기 때문에 가장 큰 가변성을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "T-세포 수용체 (TCR)"는 일부 세포에서 TCR이 감마 및 델타 (γ/δ) 사슬로 구성되지만, 알파 (α) 및 베타 (β) 사슬의 이종이량체로 구성되는 T 세포 상의 단백질 수용체와 관련된다. 본 발명의 구현예에서, TCR은 예를 들면 보조 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 T 세포, 및 감마 델타 T 세포를 비롯한, TCR을 포함하는 임의의 세포에 대해 변형될 수 있다. "키메라성 TCR"은 세포내 신호전달, 막통과, 및 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 의미하고, 상기 세포외 도메인은 MHC 비제한적 방식으로 상기 방식에서 T-세포 수용체에 의해 일반적으로 결합되지 않는 항원을 특이적으로 결합할 수 있다. 적절한 조건 하에서의 항원에 의한 T 세포의 자극은 세포의 증식 (팽창) 및/또는 IL-2의 생성을 야기한다. 본 방법은 표적 항원, 키메라성 TCR 예컨대 HER2/Neu, ERBB2, 엽산 결합 단백질, 신장 세포 암종, 및 HIV-1 엔빌로프 당단백질 gp120 및 gp41에 대해 특이적인 키메라성 TCR과의 형질감염에 응용될 수 있다. 다른 세포-표면 표적 항원은, 비제한적으로, CD20, 암종배아 항원, 메소텔린, ROR1, c-Met, CD56, GD2, GD3, 알파태아단백질, CD23, CD30, CD123, IL-11R알파, 카파 사슬, 람다 사슬, CD70, CA-125, MUC-1, EGFR 및 변이체, 상피성 종양 항원 등을 포함한다.
인간화된 CAR 핵산이 인간 환자에 대한 세포성 면역요법을 향상시키기 위해 인간 유전자로부터 유도되는 것이 고려된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 전장 CAR cDNA 또는 암호화 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 특정 인간 단클론성 항체, 예컨대 본원에 참조로 포함된 미국특허 제7,109,304호에 기재된 것으로부터 유도되는 단일-사슬 가변성 절편 (scFv)의 VH 및 VL 사슬의 절편을 포함할 수 있다. 상기 절편은 또한 임의의 수의 인간 항원-특이적 항체의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 보다 특정한 구현예에서, 상기 절편은 인간 세포에서의 발현을 위한 인간 코돈 용법(human codon usage)을 위해 최적화된 서열에 의해 암호화된 항원-특이적 scFv이다.
배열은 다량체, 예컨대 디아바디 또는 다량체일 수 있다. 다량체는 대부분 디아바디로부터의 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 교차 페어링(cross pairing)에 의해 형성될 수 있다. 상기 작제물의 힌지 부분은 완전히 제거되는 것으로부터, 세린 치환이 아닌 프롤린에 대해 제1 시스테인을 유지시키는 것, 제1 시스테인까지 절단되는 것까지의 다수의 대안을 가질 수 있다. Fc 부분은 제거될 수 있다. 안정한 그리고/또는 이량체화된 임의의 단백질이 이러한 목적의 역할을 할 수 있다. 단지 하나의 Fc 도메인, 예를 들면, 인간 면역글로불린으로부터의 CH2 또는 CH3 도메인을 사용할 수 있다. 이량체화가 개선되도록 변형된 인간 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 또한 사용할 수 있다. 또한, 면역글로불린의 단지 힌지 부분을 사용할 수 있다. 또한 CD8알파의 부분들을 사용할 수 있다.
구현예의 키메라성 수용체의 세포내 신호전달 도메인 (이는 세포질 도메인으로도 지칭됨)은 키메라성 수용체가 배치되는 면역 세포의 정상적인 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 야기할 수 있다. 용어 "효과기 기능(effector function)"은 분화된 세포의 특화된 기능과 관련된다. T 세포의 효과기 기능은 예를 들면 세포용해 활성 또는 보조 활성, 예컨대 사이토카인의 분비일 수 있다. 미성숙 메모리, 또는 메모리-유형 T 세포에서의 효과기 기능은 항원-의존적 증식을 포함한다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고 특화된 기능을 수행하도록 세포를 유도하는 단백질의 부분과 관련된다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 이용될 수 있는 한편, 많은 경우에서 전체 세포내 폴리펩타이드를 사용하는 것이 필요하지 않을 수 있다. 세포내 신호전달 도메인의 말단절단 부분은 여전히 효과기 신호를 전달할 수 있는 한 이러한 말단절단 부분은 온전한 사슬을 대신하여 사용될 수 있다. 따라서 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메일의 임의의 말단절단 부분을 포함하는 것을 의미한다. 그 예는 T-세포 수용체의 제타 사슬 또는 임의의 이의 동족체 (예를 들면, 에타, 델타, 감마, 또는 엡실론), MB1 사슬, B29, Fc RIII, Fc RI, 및 모든 또는 일부의 하나 이상의 신호전달 분자의 조합, 예컨대 CD3ζ 및 CD28, CD27, 4-1BB (CD137), DAP10, DAP12, OX40 (CD134), ICOS/CD278, IL-2R베타/CD122, IL-2R알파/CD132, CD40, 및 이들의 조합뿐 아니라 다른 유사한 분자 및 단편을 포함한다. 활성화 단백질의 부류의 다른 성분의 세포내 신호전달 부분, FcγRIII 및 FcεRI가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인에서의 내인성 T 세포 수용체 복합체의 임의의 부분을 이용한다. 소위 제3 세대 CAR이 예를 들면 부가 또는 상승 효과를 위해 함께 융합된 2개 또는 3개의 신호전달 도메인을 가지도록 하나 이상의 세포질 도메인이 이용될 수 있다.
항원-특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호전달-도메인은 막통과 도메인, 예컨대 인간 IgG4Fc 힌지 및 Fc 영역에 의해 연결될 수 있다. 대체물은 인간 CD4 막통과 도메인, 인간 CD28 막통과 도메인, 막통과 인간 CD3ζ 도메인, 또는 시스테인 돌연변이된 인간 CD3ζ 도메인, 또는 다른 인간 막통과 신호전달 단백질로부터의 다른 막통과 도메인, 예컨대 CD16 및 CD8 및 에리트로포이에틴 수용체를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 핵산은 다른 공동자극 수용체를 암호화한 서열, 예컨대 막통과 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 공동자극 수용체는, 비제한적으로, CD28, CD27, OX40 (CD134), DAP10, 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상을 포함한다. 인간 CAR에 삽입된 인간 공동자극 수용체에 의해 제공되는 추가의 신호는 T 세포의 전체 활성화에 대해 중요하고, 이는 생체내 지속성 및 입양 면역요법의 치료적 성공을 개선하도록 보조할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 CAR을 암호화하는 DNA 서열이 통합된 단리된 핵산 분절 및 발현 카세트와 관련된다. 구현예의 벡터는 주로 조절된 진핵 프로모터, 예들 들면, MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, EF1알파 프로모터, 또는 유비퀴틴 프로모터의 조절 하에서 세포로 원하는 유전자를 전달하도록 설계된다. 또한, 벡터는, 다른 이유에 대한 것이 아닌 한, 이의 시험관내 조작을 용이하게 하는 선별 마커를 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, CAR은 DNA 템플레이트로부터 시험관내 전사된 mRNA로부터 발현될 수 있다.
키메라성 항원 수용체 분자는 재조합체이고, 이는 그것의 세포질 미부(cytoplasmic tail)에 존재하는 면역수용체 활성화 모티프 (ITAM's)를 통해 활성화 신호를 전달하고 그리고 항원을 결합하는 이의 이중 능력에 의해 구별된다. (예들 들면, 단일 사슬 항체 (scFv)으로부터 발생되는) 항원-결합 모이어티를 이용하는 수용체 작제물은 이것이 HLA-독립 방식으로 표적 세포 표면 상에 천연 항원을 결합시키는데 "보편적인" 추가의 장점을 제공한다. 재유도된 T 세포 효과기 메커니즘은 CTL에 의한 용균 및 종양 인식을 포함한다.
일부 구현예에서, 키메라성 항원 수용체는 하기를 포함한다: a) 세포내 신호전달 도메인, b) 막통과 도메인, 및 c) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인. 항원 결합 영역의 공급원으로서의 인간 항체의 사용이 바람직하다. CAR에서의 인간 서열의 사용은 면역-매개 인식 및 이에 따른 HLA의 맥락에서 가공된 항원을 인식하고 수용자에 잔류하는 내인성 T 세포에 의한 제거를 회피할 수 있다.
키메라성 항원 수용체의 특정 구현예에서, 수용체의 항원-특이적 부분 (이는 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인로 지칭될 수 있음)은 임의로 패턴-인식 수용체, 예컨대 덱틴-1에 의해 인식되는 탄수화물 항원을 포함하는 병원체-특이적 항원 결합 도메인 또는 종양 관련 항원을 포함한다.
종양-관련 항원은 임의의 종류, 예컨대 종양 세포의 세포 표면 상에 발현된 것일 수 있다. 종양 관련 항원의 예시적인 구현예는 CD19, CD20, 암종배아 항원, 알파태아단백질, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피성 종양 항원, 흑색종-관련된 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras 등을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 적은 양의 종양-관련 항원이 존재시 지속성을 개선하기 위해 막-결합 사이토카인과 공동-발현될 수 있다. 예를 들면, CAR은 막-결합 IL-15와 공동-발현될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포내 종양 관련 항원, 예컨대 HA-1, 서바이빈, WT1, 및 p53이 표적화될 수 있다. 이는 HLA의 맥락에서의 세포내 종양 관련 항원으로부터 기술된 가공된 펩타이드를 인식하는 CAR에 의해 달성될 수 있다. 또한, 보편적인 T 세포는 유전자 변형되어 HLA의 맥락에서의 세포내 가공된 종양 관련 항원을 인식하는 T-세포 수용체 페어링을 발현할 수 있다.
병원체는 임의의 종류일 수 있으나, 특정 구현예에서, 병원체는 예를 들면, 진균류, 박테리아, 또는 바이러스이다. 예시적인 바이러스 병원체는 아데노비리다에, 엡슈타인-바르 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), JC 바이러스, BK 바이러스, HSV, 바이러스의 HHV 부류, 피코르나비리다에, 헤르레스비리다에, 헤파드나비리다에, 플라비비리다에, 레트로비리다에, 오토믹소비리다에, 파라믹소비리다에, 파포바비리다에, 폴리오마바이러스, 랍도비리다에, 및 토가비리다에의 부류의 것을 포함한다. 예시적인 병원성 바이러스는 천연두, 인플루엔자, 볼거리, 홍역, 수두, 에볼라, 및 풍진을 야기한다. 예시적인 병원성 진균은 칸디다, 아스페르길루스, 크립토코쿠스, 히스토플라즈마, 폐포자충, 및 스타키보트리스를 포함한다. 예시적인 병원성 박테리아는 스트렙토코쿠스, 슈도모나스, 시겔라, 캄필로박터, 스타필로코쿠스, 헬리코박터, E. 콜리, 리케차, 바실러스, 보데텔라, 클라미디아, 스피로케테스, 및 살모넬라를 포함한다. 일 구현예에서, 병원체 수용체 덱틴-1은 진균의 세포벽 상의 탄수화물 작제물을 인식하는 CAR을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 덱틴-1의 특이성에 기초하여 CAR을 발현시키도록 유전적으로 변형된 T 세포는 아스페르길루스 및 표적 균사 성장을 인식할 수 있다. 다른 구현예에서, CAR은 바이러스성 감염 및 병리학을 방해하는 바이러스 결정인자 (예를 들면, CMV 및 에볼라로부터의 당단백질)를 인식하는 항체에 기초하여 제조될 수 있다.
본 구현예에 따른 키메라성 항원 수용체는 본 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 제조될 수 있고, 한편 바람직하게는 이는 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조된다. 키메라성 수용체의 다수의 영역을 암호화한 핵산 서열이 제조되어 분자 클로닝의 표준 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머-관련 결찰(primer-assisted ligation), 효모 및 박테리아로부터의 scFv 라이브러리, 부위 지향적 돌연변이유발 등)에 의해 완전한 암호화 서열로 어셈블링될 수 있다. 생성된 암호화 영역은 발현 벡터로 삽입되어 관심 세포, 예를 들면 iPSC를 변형시킬 수 있다.
b. 항원 제시 세포
일부 경우에서, APC는 구현예의 치료적 조성물 및 세포 요법 생성물을 제조하는데 있어서 유용하다. 항원-제시 시스템, 예컨대 인공 APC를 사용하는 시스템의 준비 및 사용과 관련된 일반적인 지침에 대해서, 예를 들면, 미국특허 제6,225,042호, 제6,355,479호, 제6,362,001호, 제6,790,662호, 제7,993,638호, 및 제8,124,408호; 및 미국공개특허 제2009/0004142호를 참조한다.
APC는 통상적으로 추가의 가공 없이 MHC 분자에 대해 펩타이드를 직접적으로 결합시킬 수 있는 최적의 길이의 펩타이드와 함께 배양된다. 대안적으로, 세포는 (즉, MHC-독립적인 항원 인식의 경우) 관심 항원을 발현시킬 수 있다. 관심 펩타이드-MHC 분자 또는 항원 이외, APC 시스템은 또한 적어도 1종의 외인성 보조 분자를 포함할 수 있다. 보조 분자의 임의의 적합한 개수 및 조합이 이용될 수 있다. 보조 분자는 공동-자극 분자 및 콘주게이트 분자와 같은 보조 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 공동-자극 분자는 CD86 및 B7.1 (B7.1는 B7로서 선행하여 공지되어 있고 또한 CD80으로서 공지되어 있음)을 포함하고, 이는 무엇보다도, T 세포의 표면 상에서 CD28 및/또는 CTLA-4 분자를 결합시켜, 이에 의해 예들 들면, T-세포 팽창, Th1 분화, 단기 T-세포 생존, 및 사이토카인 분비 예컨대 인터루킨 (IL)-2에 영향을 준다 (문헌 [Kim et al., 2004)]을 참조한다). 콘주게이트 분자는 탄수화물-결합 당단백질 예컨대 셀렉틴, 막통과 결합 당단백질 예컨대 인테그린, 칼슘-의존적 단백질 예컨대 카드헤린, 및 단일-통과 막통과 면역글로불린 (Ig) 대부류 단백질, 예컨대, 예들 들면, 세포-대-세포 또는 세포-대-기질 접촉을 촉진하는 세포간 콘주게이트 분자 (ICAM)를 포함할 수 있다. 예시적인 콘주게이트 분자는 LFA-3 및 ICAMs, 예컨대 ICAM-1를 포함한다. 공동-자극 분자 및 콘주게이트 분자를 포함하는 예시적인 보조 분자의 선택, 클로닝, 제조, 및 발현에 유용한 기술, 방법, 및 시약은 예를 들면, 미국특허 제6,225,042호, 제6,355,479호, 및 제6,362,001호에 예시되어 있다.
인공 APC가 되도록 선택되는 세포는 바람직하게는 세포내 항원-가공, 세포내 펩타이드 추적, 및/또는 세포내 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자-펩타이드 부하에 있어서 결핍증을 가지고, 또한 이는 변온성이고 (즉, 포유동물 세포주보다 온도 부하에 대해 덜 민감성임), 또는 결핍증 및 변온 특성 모두를 가진다. 일부 양태에서, 인공 APC가 되도록 선택되는 세포는 세포에 도입되는 외인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및 보조 분자 성분에 대한 적어도 1종의 내인성 대응물 (예를 들면, 상기에서 기재된 바와 같은 내인성 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자 및/또는 내인성 보조 분자)을 발현하는 능력이 또한 결핍된다. 게다가, 일부 경우에서, 인공 APC는 aAPC를 생성하기 위한 이의 변형 이전에 세포에 의해 보유된 결핍증 및 변온 특성이 유지된다. 예시적인 aAPC는 항원 가공 (TAP)-결핍 세포주, 예컨대 곤충 세포주와 관련된 수송체로부터 유도되거나 구성된다. 예시적인 변온 공충 세포주는 드로소필라 세포주, 예컨대 슈나이더 2 세포주이다 (예를 들면, 문헌 [Schneider, 1972] 참조). 슈나이더 2 세포의 예시적인 제조 방법, 성장 및 배양은 미국특허 제6,225,042호, 제6,355,479호, 및 제6,362,001호에 제공되어 있다.
일 구현예에서, APC는 또한 냉동-해동 사이클에 적용된다. 예시적인 냉동-해동 사이클에서, APC는 냉동이 신속하게 일어나도록 적절한 양의 액체 질소, 고체 이산화탄소 (즉, 드라이아이스), 또는 유사한 저온 물질과 함께 APC를 포함하는 적합한 용기와 접촉시킴으로써 냉동될 수 있다. 냉동된 APC는 이후 저온 물질로부터의 APC의 제거 및 주위 실온 조건에의 노출에 의해, 또는 더 짧은 해동 시간을 촉진하기 위해 루크웜 수조(lukewarm water bath) 또는 웜 핸드(warm hand)가 이용되는 촉진된 해동 공정에 의해 해동된다. 추가적으로, APC는 냉동되어 해동 이전까지 연장된 기간 동안 저장될 수 있다. 냉동된 APC는 또한 해동되고 이후 추가의 사용전까지 동결건조될 수 있다. 바람직하게는, 냉동-해동 절차에 유해한 영향을 줄 수 있는 보존제, 예컨대 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 및 다른 보존제는 냉동-해동 사이클이 진행되는 APC 함유 배지로부터 배제하거나, 또는 이는 예컨대 이러한 보존제가 본질적으로 없는 배지로의 APC의 이동시켜 본질적으로 제거된다.
다른 특정 구현예에서, aAPC에 대해 내인성체 이종 핵산 및 핵산은 가교결합에 의해 불활성화되어 본질적으로 세포 성장, 복제 또는 핵산의 발현이 불활성화 이후 일어나지 않게 할 수 있다. 일 구현예에서, aAPC는 외인성 MHC 및 보조 분자의 발현, aAPC의 표면 상에서의 이러한 분자의 존재, 및 선택된 펩타이드 또는 펩타이드와의 존재하는 MHC 분자의 장입에 후속되는 시점에서 불활성화된다. 따라서, 본질적으로 증식 또는 복제가 불가능하게 됨과 동시에 이와 같이 불활성화되어 선택되는 펩타이드 장입된 aAPC는 선택된 펩타이드 제시 기능을 보유한다. 바람직하게는, 가교결합은 또한 aAPC의 항원-제시 세포 기능을 실질적으로 감소시키지 않고 미생물, 예컨대 박테리아 및 바이러스를 본질적으로 오염시키지 않는 aAPC를 산출한다. 따라서, 가교결합은 aAPC의 중요 APC 기능을 유지하는 한편, aAPC를 사용하여 개발된 세포 요법 생성물의 안전성에 관한 우려를 완화하는 것을 도울 수 있다. 가교결합 및 aAPC와 관련된 방법에 대해, 예를 들면, 미국특허 제8,124,408호를 참조하고, 이는 본원에 참조로 포함되어 있다.
3. 간 세포
간세포는 미국특허 제6,458,589호 및 제6,506,574호에 기재된 바와 같은 히스톤 탈아세틸화효소의 저해제를 사용하여 만능 줄기 세포로부터 분화될 수 있다. 간세포로의 만능 줄기 세포를 분화하기 위한 단계화된 프로토콜은 미국특허 제7,473,555호에 기재되어 있다. 본 발명의 특정 양태에서 간세포는 미국특허 제8,283,168호에 기재된 바와 같이 간세포로 분화를 유도하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서 간세포는 간세포로의 세포의 프로그래밍을 촉진하기에 충분하도록 간세포 프로그래밍 인자의 세포내 수준을 증가시키는 조건 하에서의 배지에서 만능 줄기 세포 또는 다른 비-간세포를 배양시킴으로써 제조될 수 있다.
4. 신경 세포
신경 세포는 미국특허 제6,833,269호 및 제7,250,294호; 미국공개특허 제2012/0276063호; 및 문헌 [Carpenter et al., 2001]에 기재된 방법에 따라 만능 줄기 세포로부터 발생될 수 있다. 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)는 만능 줄기 세포로부터 발생될 수 있고, 이는 미국특허 제7,285,415호 및 문헌 [Keirstead et al., 2005]를 참조한다. 망막 색소 상피 세포의 유도가 또한 보고된 바 있다 (문헌 [Klimanskaya et al., 2004)]).
5. 심장 세포
본원에 제공되는 iPS 세포는 미국특허 제8,415,155호에 기재된 방법에 따라 심근세포로부터 분화될 수 있다. 심근세포 또는 심근세포 전구체는 미국특허 제7,763,464호에 제공된 방법에 따라 만능 줄기 세포 예컨대 iPS 세포로부터 발생될 수 있다. iPS 세포의 심장 분화의 예시적인 방법은 배양체 (EB) 방법 (Zhang 등, 2009), OP9 간질 세포 방법 (Narazaki 등, 2008), 또는 성장 인자/화학 방법 (미국특허 제7,897,389호; 제7,955,849호; 및 제8,951,798호 참조, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 포함할 수 있다.
6. 췌장 세포
소도 세포는 만능 줄기 세포로부터 분화될 수 있다 (WO 03/050249).
7. 다른 세포 유형
간엽 전구세포 및 섬유아세포는 WO 03/004605에 기재된 방법에 따라 만능 줄기 세포로부터 발생될 수 있다. 줄기 세포-유도 간엽 세포는 이후 골형성 인자, 예컨대 골 형성 단백질 (특히 BMP4), 인간 TGF-β 수용체에 대한 리간드, 또는 인간 비타민 D 수용체에 대한 리간드를 함유하는 배지에서 골아세포 계열 세포로 추가로 분화될 수 있다 (WO 03/004605).
G. 생물반응기 및 자동화
줄기 세포, 및/또는 이로부터 분화된 세포를 배양하기 위한 하나 이상의 단계는 자동화될 수 있다. 로보트 또는 다른 자동화를 사용하는 자동화 공정은 세포의 생산, 배양, 및 분화를 위해 보다 효율적이고 경제적인 방법을 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 로보트 자동화는 유도 만능 줄기 세포의 배양, 계대배양, 배지의 부가, 분화 배지의 부가, 분화 배지에서의 배양, 및 예를 들면, 자성 분리 또는 FACS를 사용하는 세포형의 분리 중 하나 이상과 결합하여 이용될 수 있다.
또한, 생물반응기가 본 구현예에 따라 세포를 배양하고, 유지하고, 그리고/또는 분화시키는 본 구현예와 결합하여 사용될 수 있다. 생물반응기는 증가된 양의 세포를 생성하기 위해 공정의 "규모 확장"을 가능하게 하는 장점을 제공한다. 회분식 생물반응기, 유가배양식 생물반응기, 연속식 생물반응기 (예를 들면, 연속 교반식-탱크 반응기 모델), 및/또는 물질환경조절장치(chemostat)를 비롯한 다양한 생물반응기가 본 구현예와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 스피너 플라스크(spinner flask)가 증가된 수의 세포의 발생을 가능하게 하는 만능 세포의 유지 및/또는 분화를 위한 규모 확장 방법에 대해 사용될 수 있다.
본 구현예와 함께 사용하기 위해 특별하게 구상된 로보트 자동화는 예를 들면 Tecan (CA, USA)으로부터 구할 수 있다. 로보트는 샘플들 간의 캐리-오버(carry-over)를 최소화하기 위해 액체 취급 장비 예컨대 캡-피어싱 프로브(cap-piercing probe) 및 일회용 팁을 포함할 수 있다. 다양한 구현예에서, 로보트는 (예를 들면, iPSC의 유지 또는 성장, 조혈 세포로의 iPSC의 분화, 또는 차후의 계통 예컨대 적혈구 등으로의 조혈 세포의 분화 과정에서) 세포를 배양하기 위한 하나 이상의 생물반응기와 함께 결합하여 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 구현예의 방법을 축소하거나 "규모 축소화"하는 것이 유용할 수 있다. 이들 방법은 예를 들면, 본 방법이 고-처리량 스크린을 포함하는 경우에 특히 유용할 수 있다. 고-처리량 스크린은 키메라성 항원 수용체의 하나 이상의 특성을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본 방법의 축소는 저-부착성 플레이트 (예를 들면, 96 웰 플레이트) 및/또는 저산소 하의 세포의 배양액 (예를 들면, 약 25% O2 또는 약 5% O2 미만) 조건의 사용을 수반할 수 있다.
본 구현예의 방법은 플레이트에 단일 세포로서 부착되는 세포를 유도하기 위한 배지에 ROCK 저해제 HA100 및/또는 H1152를 포함시켜 로보트 자동화를 사용하는 단일 세포 검정에서 이용될 수 있다. 배양 시스템에의 소분자 HA100 또는 H1152 또는 Y-27632의 부가는 iPSC를 포함하는 만능 세포의 생존력을 대폭 개선할 수 있다. 특정 구현예에서, TeSR 배지에서의 만능 세포의 생존력은 특히 세포가 응집체로부터 단백질분해로 또는 기계적으로 분리되어 개별화된 이후 ROCK 저해제 또는 PKC 저해제를 개입시켜 개선될 수 있다. ROCK 저해제는 표면에 부착시켜 성장시키기 위해 개별화된 iPS 세포를 촉진시킬 수 있다. 만능 세포로의 유지 또는 증식의 일부 또는 모든 공정뿐만 아니라 조혈 전구체 세포 또는 특이적 조혈 계통으로의 분화가 자동화될 수 있다. 모든 자동화된 방법의 일부는 정의된 조건을 이용할 수 있다.
III. 시험 방법
A. 면역계 및 면역요법
일부 구현예에서, 의료 장애는 특정 면역 반응을 유도하는 면역 효과기 세포 (예를 들면, T 세포)의 전사에 의해 치료될 수 있다. 따라서, 면역 반응에 대한 기본 이해가 필요로 된다.
적응성 면역계의 세포는 림프구로 지칭되는 백혈구의 유형이다. B 세포 및 T 세포는 주요 유형의 림프구이다. B 세포 및 T 세포는 동일한 만능 조혈 줄기 세포로부터 유도되고, 이는 이들이 분화될 때까지 서로 구분하기 어렵다. B 세포는 체액성 면역 반응에서 주요 역할을 하고, 반면에 T 세포는 세포-매개 면역 반응에 긴밀하게 관여한다. T 세포는 T-세포 수용체 (TCR)로 지칭되는 이의 세포 표면 상의 특수 수용체의 존재로 다른 림프구 유형, 예컨대 B 세포 및 NK 세포와 구별될 수 있다. 거의 모든 다른 척추동물에서, B 세포 및 T 세포는 골수에서의 줄기 세포에 의해 생성된다. T 세포는 이의 명칭이 유도된 가슴샘으로 이동되어 발달된다. 인간에서, 대략 1%-2%의 림프구 집단이 2차 림프 조직 내에서 이의 특이적 항원을 찾기 위한 항원-특이적 림프구에 대한 기회를 최적화하기 위해 매 시간 재순환된다.
T 림프구는 골수의 조혈 줄기 세포로부터 발생되고, 이는 전형적으로 흉선으로 이동되어 성숙된다. T 세포는 이의 막 상에 독특한 항원 결합 수용체 (T-세포 수용체)를 발현하고, 이는 다른 세포의 표면 상의 주요 조직적합성 복합 (MHC) 분자와 연계되는 항원을 유일하게 인식할 수 있다. 보조 T 세포 및 세포독성 T 세포로서 공지되어 있는 적어도 2개의 집단의 T 세포가 존재한다. 보조 T 세포 및 세포독성 T 세포는 주로 각각 막 결합된 당단백질 CD4 및 CD8의 이의 역할에 의해 구분된다. 보조 T 세포는 B 세포, 세포독성 T 세포, 대식세포, 및 면역계의 다른 세포를 활성화하는데 중요한 다양한 림포카인을 분비한다. 이에 반해서, 항원-MHC 복합체를 인식하는 세포독성 T 세포는 증식하여 세포독성 T 림프구 (CTL)로 지칭되는 효과기 세포로 분화된다. CTL은 세포 용해를 야기하는 물질을 생성함으로써 항원을 나타내는 신체의 세포, 예컨대 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 제거한다. 내추럴 킬러 세포 (또는 NK 세포)는 타고난 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구의 유형이다. NK 세포는 종양 및 바이러스에 감염된 세포의 거부반응에서 주요 역할을 한다. 세포는 표적 세포가 세포자멸사에 의한 사멸을 야기하는 페르포린 및 그란자임으로 지칭되는 단백질의 작은 세포질 과립을 방출함으로써 사멸된다.
대식세포, B 림프구, 및 수지상 세포를 포함하는 항원-제시 세포는 특정한 MHC 분자의 이의 발현에 의해 구분된다. APC는 항원에 침투하여 이의 외부 세포막 상의 MHC 분자와 함께 이 항원의 일부를 재발현시킨다. 주조직적합성 복합체 (MHC)는 다중 자위를 갖는 큰 유전자 복합체이다. MHC 자위(MHC loci)는 부류 I 및 부류 II MHC로 지칭되는 2개의 주요 부류의 MHC 막 분자를 암호화한다. T 보조 림프구는 일반적으로 MHC 부류 II 분자와 관련되는 항원을 인식하고, T 세포독성 림프구는 MHC 부류 I 분자와 관련된 항원을 인식한다. 인간에게서, MHC는 HLA 복합체로 지칭되고, 마우스에서 H-2 복합체로 지칭된다.
T-세포 수용체, 또는 TCR은 주조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합되는 항원을 인식하는 것과 일반적으로 관련된 T 림프구 (또는 T 세포)의 표면 상에서 발견되는 분자이다. 이는 T 세포의 95%에서 알파 및 베타 사슬로 구성되는 이종이량체이고, 한편, T 세포의 5%는 감마 및 델타 사슬로 구성되는 TCR을 갖는다. 항원 및 MHC과의 TCR의 결합은 관련된 효소, 보조-수용체, 및 특화된 부속 분자에 의해 매개되는 일련의 생화학적 반응을 통해 이의 T 림프구의 활성화를 야기한다.
자가면역 질환, 또는 자가면역은 이의 자신의 구성 부분 (하위-분자 수준 이하)을 "자기(self)"로 인식하는 것에 대한 유기체의 부전(failure)이고, 이는 이의 자신의 세포 및 조직에 대한 면역 반응을 야기한다. 이러한 비정상적인 면역 반응으로부터 발생된 임의의 질환을 자가면역 질환을 명명한다.
B. 세포의 성장 및 투여
특정 양태에서, 세포는 iPSC로부터 분화된다. 일 양태에서, iPSC로부터 분화되는 T 세포는 예들 들면, 유전자 전달에 의해 CAR 또는 TCR의 도입을 통해 재조합될 수 있다. 특정 양태에서, 세포는 유전자 전달 이후 약 1, 2, 3, 4, 5일 이상 이내로 벌크 집단로서 생체외에서 수일, 수주, 또는 수개월 동안 전파될 수 있다. 추가의 양태에서, 재조합 T 세포는 클론화될 수 있고, 단일 통합되거나 에피솜 상태로 유지되는 발현 카세트 또는 플라스미드의 존재, 및 키메라성 수용체의 발현을 입증하는 클론이 생체외에서 증식된다. 재조합 T 세포는 IL-2, 또는 일반 감마-사슬 (예를 들면, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, 및 기타)과 결합되는 다른 사이토카인으로의 자극에 의해 증식될 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포로의 자극에 의하여 확장될 수 있다. 재조합 T 세포는 인공 항원 제시 세포 상에서 또는 T-세포 표면 상의 CD3을 가교결합시키는 OKT3와 같은 항체를 사용하여 증식될 수 있다. 추가의 양태에서, 유전적으로 변형된 세포는 저온보존될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, CAR+ 세포는 이를 필요로 하는 개체, 예컨대 암, 자가면역 장애, 또는 감염을 가진 개체에게 전달된다. 세포는 이후 개체의 면역계를 강화시켜 개개의 암 또는 병원성 세포를 공격한다. 일부 경우에서, 개체는 1회 이상의 용량의 항원-특이적 CAR+ T-세포를 제공받는다. 개체가 2회 이상의 용량의 항원-특이적 CAR+ T-세포를 제공받는 경우에서, 투여들 간의 지속시간은 개체에게서 전파하기 위해 충분하여야 하고, 특정 구현예에서 투여 간의 지속시간은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상이다.
치료 효과를 위한 면역 효과기 세포의 적합한 용량은 예들 들면, 바람직하게는 일련의 투여 사이클에서 용량당 적어도 105 또는 약 105 내지 약 1010 세포일 것이다. 예시적인 투여 요법은 증가 용량의 4회의 1주 투여 사이클로 구성되고, 이는 0일차에 적어도 약 105 세포로 시작되고, 예를 들면 환자내 용량 단계적 확대 전략을 개시하여 수주 내에 약 1010 세포의 최대 표적 용량까지 증분적으로 증가된다. 적합한 투여 방식은 종양 덩어리로의 정맥내, 피하, 강내 (저장기-접근 장치(reservoir-access device)에 의함), 복강내, 및 직접적인 주사를 포함한다.
본 구현예에 따른 약제학적 조성물은 단독으로 또는 암 또는 감염성 질환에 대해 유용한 다른 완전하게 확립된 제제와 병용하여 사용될 수 있다. 단독으로 또는 다른 제제와 병용하여 전달되는지와 무관하게 본 구현예의 약제학적 조성물은 다양한 경로를 통해 포유동물, 특히 인간, 신체에서의 다양한 부위에 전달되어 특정한 효과를 달성할 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 1개 초과의 경로가 투여를 위해 사용될 수 있지만 특정한 경로가 또 다른 경로보다 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 예를 들면, 진피내 전달은 흑색종의 치료에 대해 흡입보다 유리하게 사용될 수 있다. 국소 또는 전신 전달은 체강으로의 제형의 적용 또는 점적도입, 에어로졸의 흡입 또는 취입을 포함하는 투여에 의해, 또는 근육내, 정맥내, 문내, 간내, 복막, 피하, 또는 진피내 투여를 포함하는 비경구 도입에 의해 달성될 수 있다.
본 구현예의 조성물은 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 여기서 각각의 투여 단위, 예를 들면, 주사는 예정된 양의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성제와 조합하여 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 단위 투여 형태는 인간 및 동물 대상체에 대해 일원화된 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위와 관련되고, 여기서 각각의 단위는 적절한 경우 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 비히클과 연계하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산되는 예정된 양의 본 구현예의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성제와 조합하여 함유한다. 본 구현예의 신규한 단위 투여 형태에 대한 사양은 특정 대상체에서의 약제학적 조성물과 연계되는 특정 약력학에 좌우된다.
바람직하게는, 효과적인 양 또는 충분한 수의 세포가 조성물에 제공되어 대상체로 도입되고, 이에 의해 장기간의, 특이적, 항종양 반응이 확립되어 종양의 크기를 감소시키거나 이러한 치료의 부재시에 일어날 수 있는 것에 비해 종양 성장 또는 재생을 근절시킬 수 있다. 바람직하게는 대상체로 도입되는 세포의 양은 세포가 제공되지 않은 동일한 조성물의 것과 비교하여 종양 크기에 있어서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 감소를 야기한다.
따라서, 투여되는 세포의 양은 투여 경로를 고려하여야 하고, 충분한 수의 세포가 원하는 치료적 반응이 달성되도록 도입되어야 한다. 게다가, 본원에 기재된 조성물에 포함된 각각의 활성제의 양 (예를 들면, 접촉되는 각 세포에 대한 양 또는 특정 체중에 대한 양)은 상이한 적용시 변화될 수 있다. 일반적으로, 세포의 농도는 바람직하게는 치료되는 대상체에게 적어도 약 1 × 106 내지 약 1 × 109 형질도입된 세포, 더욱더 바람직하게는, 약 1 × 107 내지 약 5 × 108 형질도입된 세포를 제공하기에 충분하여야 하고, 한편 임의의 적합한 양이 상기의 것 초과로, 예를 들면, 5 × 108 세포 초과로 또는 그 미만으로, 예를 들면, 1 × 107 세포 미만으로 이용될 수 있다. 복용 계획은 잘-확립된 세포 기반 요법 (예를 들면, 문헌 [Topalian and Rosenberg, 1987]; 미국특허 제4,690,915호 참조)에 기초할 수 있거나, 또는 대안적인 연속식 도입 전략이 이용될 수 있다.
이들 값은 본 구현예의 방법을 최적화하는 경우 의사에 의해 이용되는 세포의 범위의 일반적인 지침을 제공한다. 이러한 범위의 본원에서의 설명은 특정 응용에서 보장될 수 있는 성분의 더 높거나 낮은 양의 사용을 금지하는 것은 아니다. 예를 들면, 실제 용량 및 계획은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 병용하여 투여되는지 여부에 좌우되거나, 또는 약동학, 약물 성향, 및 대사에 있어서의 개별적 차이에 좌우될 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 용이하게 특정 상황의 긴급상황에 따라 임의의 필요한 조정을 적용할 수 있다.
IV. 벡터 작제물 및 전달
"벡터" 또는 "작제물" (때때로 유전자 이송 또는 유전자 전달 "비히클"로서 지칭됨)는 시험관내 또는 생체내에서 숙주세포로 전달되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분자의 복합체 또는 거대분자와 관련된다. "플라스미드" 유형의 벡터는 독립적으로 염색체 DNA를 복제할 수 있는 염색체 DNA와 별개의 염색체 이외의 DNA 분자이다. 특정 경우에서, 이는 원형이고, 그리고 이중-가닥이다.
특정 구현예에서, 벡터, 예컨대 재프로그래밍 벡터 또는 CAR 벡터는 세포로 이들 단백질을 발현하기 위한 바이러스 벡터, 예들 들면, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 특정 구현예에서, 벡터는 염색체-이외의 복제 벡터일 수 있고, 이는 숙주세포 게놈으로 통합될 수 없고, 이는 복제의 발생 과정에서 손실될 수 있다. 이들 벡터의 성분 및 전달 방법의 세부사항은 하기에 기재되어 있다.
당업자는 표준 재조합 기술 (참고, 예들 들면, 둘 모두 본원에 참조로 포함된 문헌 [Sambrook et al., 2001] 및 문헌 [Ausubel et al., 1994] 참조)을 통해 벡터를 구성하기 위한 장비를 잘 갖추고 있을 것이다. 벡터는, 비제한적으로, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 (예를 들면, 박테리오파아지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 인공 염색체 (예를 들면, YACs), 레트로바이러스 벡터 (예를 들면, 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스 벡터 (MoMLV), MSCV, SFFV, MPSV, SNV 등으로부터 유도됨), 렌티바이러스 벡터 (예를 들면, HIV-1, HIV-2, SIV, BIV, FIV 등으로부터 유도됨), 복제 가능, 이의 복제 결핍된 및 결실된 형태를 포함하는 아데노바이러스 (Ad) 벡터, 아데노-관련된 바이러스 (AAV) 벡터, 유인원 바이러스 40 (SV40) 벡터, 소 유두종 바이러스 벡터, 엡슈타인-바르 바이러스, 헤르페스 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 하비 쥣과 육종 바이러스 벡터, 쥣과 유선 종양 바이러스 벡터, 및 루 육종 바이러스 벡터를 포함한다.
A. 조절 인자
벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조정하거나 또는 조정됨 없이 표적화된 세포에 유리한 특성을 제공하는 다른 성분 또는 작용성을 포함할 수 있다. 이러한 다른 성분은, 예를 들면, 세포에 결합되거나 표적화에 영향을 주는 성분 (세포-유형 또는 조직-특이적 결합을 매개하는 성분을 포함함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 주는 성분; 흡수 이후 세포 내의 폴리뉴클레오타이드의 편재화에 영향을 주는 성분 (예컨대 핵 편재화 매개 제제); 및 폴리뉴클레오타이드의 발현에 영향을 주는 성분을 포함한다.
벡터에 포함되는 진핵 발현 카세트는 단백질-암호화 서열, 스플라이스 신호(splice signal) 포함 서열, 및 전사 종료/폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결되는 (5'-내지-3' 방향으로의) 진핵 전사 프로모터를 함유할 수 있다.
1. 프로모터/인핸서
"프로모터"는 개시 및 전사의 속도가 제어되는 핵산 서열의 영역인 조절 서열이다. 어구 "작동가능하게 배치됨", "작동가능하게 연결됨", "제어 하(under control)" 및 "전사 조절 하(under transcriptional control)"는 프로모터가 전사 개시 및/또는 이 서열의 발현을 조절하도록 핵산 서열과 관련하여 올바른 기능적 위치 및/또는 배향에 있는 것을 의미한다. 프로모터는 또한 "인핸서"와 결합하여 사용될 수 있거나 사용될 수 없고, 이는 핵산 서열의 전사 활성화를 수반하는 시스-작용 조절 서열(cis-acting regulatory sequence)과 관련된다.
이용되는 프로모터는 예컨대 재조합 단백질 및/또는 펩타이드의 대규모 생산에서 유리하게 하는, 도입된 DNA 분절의 고수준 발현을 유도하는 적절한 조건 하에서 구성적이고, 조직-특이적이며, 유도성이며, 및/또는 유용할 수 있다. 프로모터는 이종성(heterologous)이거나 내인성(endogenous)일 수 있다. 프로모터의 비제한적인 예는 전기 또는 후기 바이러스 프로모터, 예컨대, SV40 전기 또는 후기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 전초기 프로모터, 루 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus, RSV) 초기 프로모터; 진핵 세포 프로모터 예컨대 진핵 신장 인자 1α 프로모터; 및 연쇄 반응 인자 프로모터(concatenated response element promoter)를 포함한다.
2. 개시 신호
특이적 개시 신호는 또한 암호화 서열의 효율적인 번역을 위해 필요할 수 있다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 또는 인접한 서열을 포함한다. ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 번역 조절 신호가 제공될 것이 필요로 될 수 있다. 개시 코돈이 전체 삽입체의 전사를 보장하기 위해 원하는 암호화 서열의 판독 프레임과 함께 "프레임-내(in-frame)"에 있어야 하는 것은 익히 공지된 것이다.
3. 스플라이스 부위
대부분의 전사된 진핵 RNA 분자는 1차 전사체로부터 인트론을 제거하기 위해 RNA 스플라이싱을 진행할 것이다. 게놈 진핵 서열을 함유한 벡터는 단백질 발현을 위한 전사체의 적절한 과정을 보장하기 위한 공여체 및/또는 수용체 스플라이싱 부위를 요구할 수 있다.
4. 종결 및 폴리아데닐화 신호
본 구현예의 벡터 또는 작제물은 적어도 1종의 종결 신호를 포함할 수 있다. "종결 신호" 또는 "종결부위"는 RNA 폴리머라제에 의한 RNA 전사체의 특정 종결을 수반하는 DNA 서열이 포함되어 있다. 종결부위는 요구되는 메시지 수준을 달성하기 위해 생체내에서 필요할 수 있다. 진핵 시스템에서, 종결부위 영역은 또한 폴리아데닐화 부위를 노출시키도록 신규 전사체의 부위-특이적인 절단을 가능하게 하는 특이적 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 구현예에 따라 사용되기 위해 고려되는 종결부위는 비제한적으로, 예들 들면, 유전자의 종결 서열, 예컨대, 예들 들면, 소 성장 호르몬 종결부위 또는 바이러스 종결 서열, 예컨대 예들 들면 SV40 종결부위를 포함하는 본원에 기재되거나 본 기술분야의 당업자에게 공지된 임의의 공지된 전사의 종결부위를 포함한다.
B. 다중 클로닝 부위
벡터는 다중 클로닝 부위 (MCS)를 포함할 수 있고, 이는 다중 제한 효소 부위를 함유하는 핵산 영역이고, 이들 중 임의의 것은 벡터를 절단하기 위한 표준 재조합 기술과 결합하여 사용될 수 있다. "제한 효소 절단(restriction enzyme digestion)"은 핵산 분자의 특이적 위치에서만 작용하는 효소를 사용한 핵산 분자의 촉매적 분리와 관련된다. "결찰(ligation)"은 2개의 핵산 단편 사이에서의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정과 관련되고, 이는 서로 근접시킬 수 있거나 근접시킬 수 없다. 제한 효소 및 결찰 반응을 수반하는 기술은 재조합 기술 분야의 당업자에게 익히 알려져 있다.
C. 복제의 기원
숙주세포에서 벡터를 번식시키기 위해서, 이는 하나 이상의 복제의 기원 부위 (대개 "ori"로 명명됨), 예들 들면, 상기 기재된 EBV의 oriP 또는 복제를 개시하는 특이적 핵산 서열인 재프로그래밍에서 유사하거나 증가된 기능을 갖는 유전자 조작된 oriP에 대응되는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 기재된 다른 염색체 이외 복제 바이러스 또는 자율적 복제 서열 (ARS)의 복제 기원이 이용될 수 있다.
D. 내부 리보솜 유입 부위 (IRES) 및 프로테아제 절단 부위/자가-절단 펩타이드
IRES 서열은 다시트론성 전사체가 생성될 수 있게 하는 구현예의 양태에 포함된다. IRES 서열은 단일 유전자좌로부터 다수의 단백질의 동시 발현을 가능하게 한다. IRES 성분은 이종성 개방 판독 프레임(heterologous open reading frame)에 연결될 수 있다. 다중 개방 판독 프레임은 함께, IRES에 의해 각각 별개로 전사되어 다시트론성 메시지를 생성할 수 있다. IRES 성분에 의해, 각각의 개방 판독 프레임이 효율적인 전사를 위해 리보솜에 접근가능하다. 다수의 유전자는 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 효율적으로 발현되어 단일 메시지를 전사할 수 있다. 일부 경우에서, IRES-의존적 다시트론성 시스템은 iPS 세포의 생성 효율을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
하나의 구현예는 동일한 다시트론성 전사체 내에 원하는 재조합 생성물 및 리포터 둘 모두에 대한 암호화 서열을 포함시키는 단계를 수반한다. 성공적인 형질전환 경우는 원하는 재프로그래밍 인자의 발현 및 용이하게 검출가능한 리포터 모두에 의해 표시되고, 이는 성공적으로 형질감염된 세포의 선택을 용이하게 한다.
E. 리포터
본 발명의 특정 구현예에서, 구현예의 핵산 작제물을 함유하는 세포는 발현 벡터에 마커를 포함시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 확인될 수 있다. 이러한 마커는 세포에 대한 확인가능한 변화를 줄 수 있고 이는 발현 벡터를 함유하는 세포의 용이한 확인을 가능하게 한다. 일반적으로, 선택 마커는 선택을 가능하게 하는 특성을 주는 것이다. 양성 선택 마커는 마커의 존재가 이의 선택을 가능하게 하는 것이고, 한편, 음성 선택 마커는 이의 존재가 이의 선택을 저지하는 것이다. 양성 선택 마커의 예는 약물 내성 마커(drug resistance marker)이다.
보통 약물 선택 마커의 개입은 형질전환체의 확인 및 클로닝을 보조하고, 예들 들면, 네오마이신, 퓨로마이신, 하이그로마이신, DHFR, GPT, 제오신 및 히스티디놀에 내성을 주는 유전자는 유용한 선택 마커이다. 조건의 실행에 기초하여 형질전환체의 구별을 가능하게 하는 표현형을 주는 마커 이외, 스크리닝용 마커(screenable marker), 예컨대 형광성 단백질 및 β-갈락토시다아제를 포함하는 다른 유형의 마커가 또한 고려된다. 대안적으로, 음성 선택 마커로서의 스크리닝용 효소, 예컨대 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 또는 클로르암페니콜 아세틸전달효소 (CAT)가 이용될 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 또한 가능하게는 FACS 분석과 조합하여 면역적 마커 (예를 들면, 세포 표면 단백질)와 조합하여 이용하는 방법을 알 수 있을 것이다. 사용되는 마커는 이것이 핵산 암호화된 유전자 생성물과 동시에 발현될 수 있는 한 중요하게 여겨지지 않는다. 선택 및 스크리닝용 마커의 추가의 예는 본 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 구현예의 하나의 특징은 재프로그래밍 인자가 세포의 재프로그래밍에 영향을 미친 이후 벡터-무함유 세포를 선택하기 위해 선택 및 스크리닝용 마커를 사용하는 단계를 포함한다. 추가의 이점은 침묵화된 리포터 발현을 갖는 유도 만능 줄기 세포를 강화한다는 것이다.
F. 벡터 전달
본 구현예에 따라 체세포로의 재프로그래밍 벡터의 도입은 본원에 기재된 바와 같은 또는 본 기술분야의 당업자에게 공지된 바와 같은 세포의 형질전환을 위한 핵산 전달에 관한 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은, 비제한적으로, DNA의 직접적 전달, 예컨대 생체외 형질감염에 의해; 미세도입을 포함하는 도입에 의해; 전기천공에 의해; 칼슘 포스페이트 침전에 의해; DEAE-덱스트란 그 다음 폴리에틸렌 글리콜에 의해; 직접적인 초음파 장입에 의해; 리포좀-매개된 형질감염에 의해; 수용체-매개 형질감염에 의해; 미세입자투사법(microprojectile bombardment)에 의해; 실리콘 카바이드 섬유로의 진탕에 의해; 아그로박테리움-매개 변형에 의해; 원형질의 PEG-매개 형질전환에 의해; 건조/억제-매개 DNA 흡수에 의해; 그리고 이러한 방법의 임의의 조합에 의해 것을 포함한다. 이와 같은 기술의 응용을 통해, 세포는 적절하게 또는 일시적으로 변형될 수 있다.
V. 구현예의 키트
본원에 기재된 임의의 조성물은 키트 내에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, HLA-Aneg iPSC는 키트 내에 제공되고, 이는 또한 증식하고 그리고/또는 분화하는 세포에 대해 적합한 시약, 예컨대 배지, aAPC, 성장 인자, 항체 (예를 들면, 세포를 분류하거나 특성화하기 위한 것), 및/또는 플라스미드 암호화 CAR 또는 전위효소를 포함할 수 있다.
비-제한적인 예에서, 키트는 키메라성 수용체 발현 작제물, 키메라성 수용체 발현 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 발현 작제물의 형질감염을 위한 세포, 및/또는 발현 작제물의 형질감염에 대한 동종 세포를 얻기 위한 하나 이상의 기기 (이러한 기기는 주사기, 피펫, 겸자, 및/또는 임의의 이러한 의료적으로 승인된 장치일 수 있음)를 포함한다.
일부 구현예에서, 내인성 HLA-A 발현을 근절하기 위한 발현 작제물, 상기 발현 작제물을 생성하기 위한 하나 이상의 시약, 및/또는 CAR 발현 작제물가 키트에 제공된다. 일부 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제(들), TALEN, 또는 CRISPR/Cas9를 암호화하는 발현 작제물을 포함한다.
일부 양태에서, 키트는 세포의 전기천공을 위한 시약 또는 장치를 포함한다.
키트는 본 구현예의 조성물을 생성하기 위한 시약 또는 본 구현예의 적합하게 분취된 하나 이상의 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 구성요소는 수성 배지 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 적어도 1종의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기, 또는 성분이 배치되고 바람직하게는 적합하게 분취되는 다른 용기 수단을 포함할 수 있다. 키트에 하나 초과의 구성요소가 존재하는 경우, 키트는 또한 일반적으로 추가의 구성요소가 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3, 또는 다른 추가의 용기를 함유할 수 있다. 그러나, 구성요소의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 본 구현예의 키트는 통상적으로 세포, 작제물, 및 시판을 위해 밀폐된 임의의 다른 시약 용기를 함유하기 위한 수단을 또한 포함할 수 있을 것이다. 이러한 용기는, 예를 들면, 원하는 바이알이 보유되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
VI. 실시예
하기 비-제한적인 특정 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되고, 임의의 방식으로 본 개시물을 제한하지 않는다. 추가의 노력 없이, 본 기술분야의 당업자는 본원의 설명에 기초하여 이의 최대 범위로 본 개시내용을 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 본원에 인용된 모든 공보는 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. URL 또는 다른 식별자 또는 주소에 대해 참조가 이루어지는 경우, 이러한 식별자는 변화될 수 있고, 인터넷 상의 특정 정보는 있다가 없어질 수 있으나, 동일한 정보는 인터넷을 검색하여 찾을 수 있는 것으로 이해된다. 이에 대한 참조는 이러한 정보의 이용가능성 및 공공 전파를 입증한다.
실시예 1 - HLA-A neg 조혈 줄기 세포의 생성
동종 HSC가 HLA-A 유전자좌의 발현이 근절되도록 유전적으로 수정이 이루어지는 경우, 등록된 NMDP 공여체의 임상적 사용은 현저하게 증가할 수 있다. 조작된 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) (또는 임의의 인공 뉴클레아제, 예를 들면, TALEN, CRISPR/Cas9)는 유전적으로 수정된 T 세포 및 세포주에서의 HLA-A 발현을 근절시키기 위해 사용될 수 있다. 조혈 줄기 세포 (HSC)에 대한 유전자를 수정하는 범위에서, HLA-A 발현은 이러한 유전자좌를 표적화하는 ZFN을 도입함으로써 손상되었다. 우선, CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD61, 및 CD235a (글리코포린 A)에 대한 바이오티닐화된 항-인간 항체의 혼합물을 사용하여 계통pos 세포를 결실시키고, 그리고 바이오틴-결합 상자성 비드를 사용하여 결실시킴으로써 제대혈 (UCB)로부터 CD34+계통neg　HSC (99% 순도)를 단리시켰다. 다음으로, CD34+　세포를 항-CD34 자성 비드를 사용하여 단리시켰다. HLA-A-특이적 ZFN을 암호화한 시험관내-전사된 mRNA 종의 전기-이동은 정의된 사이토카인 (FLT3-L, SCF, TPO, 및 IL-6) 및 아릴 탄화수소 수용체 길항제 (줄기 레기닌-1, SR-1)와의 1주간 생체외 배양 이후 30% HLA-Aneg HSC를 발생시켰다. DNA 서열 분석은 HLA-Aneg HSC가 ZFN 표적 부위에서의 기대된 뉴클레오타이드 변화를 보이는 것을 나타내었다. 시험관내 검정은 HLA-Apos HSC 및 HLA-Aneg HSC 사이의 계통-특이적 콜로니 형성에 있어서의 유의미한 차이가 없음을 나타내었다. 또한, NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ (NSG) 마우스를 사용하는 생체내 생착 검정은 조작된 HLA-Aneg HSC가 HLA-Aneg 다중-계통 조혈 세포로의 분화 및 생착 능력을 유지하는 것을 입증하였다.
실시예 2 - HLA-A neg iPSC의 발생
필요한 공여체의 수를 최소화하기 위한 하나의 방법은 HLA-동종접합성 공여체로부터의 하나의 HLA 유전자좌의 제거일 수 있다. 공여체 세포로부터의 HLA-A 제거가 적합한 HLA-매칭된 공여체를 찾는 기회에 유의미한 영향을 줄 수 있는 것으로 결정되었다 (도 1). 따라서, HLA 동종접합성 공여체로부터의 HLA-A 발현의 제거는 HLA-매칭된 환자로 도입될 수 있는 저장되는 iPSC의 필요한 수를 감소시킬 것이다. 원치 않는 동종 면역 반응을 야기하는 내인성 TCR αβ 및 γδ 발현의 추가의 제거는 이식편 대 숙주 질환을 줄이기 위해 수행될 수 있다. iPSC는 추가로 변형되어 자살 유전자 (예를 들면, iCasp9, 유도성 카스파제 9)를 발현하여 질환에 대한 동종 iPSC 요법 및 재생 의약의 안전성을 보장할 수 있다. 전체의 게놈 서열분석 및 통합 부위 분석 (예를 들면, 이식유전자 발현이 지속되며 내인성 유전자의 발현을 방해하지 않는 통합 부위)에 의해 분석되는 바와 같은 "세이프 하버" 유전적 프로파일 (문헌 [Papapetrou et al., 2011], 본원에 참조로 포함됨)을 갖는 iPSC 클론이 단리될 것이다. 이러한 자살 유전자+, TCRneg, HLA-Aneg, HLA-동종접합성 iPSC 은행은 다양한 범위의 환자에 유용한 동종 세포 생성물을 준비하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 iPSC 은행은 치료 잠재성을 개선할 수 있고, 이는 다수의 수용자로 투여하기 위해 세포의 제한된 출발 집단을 가능하게 한다. 이러한 iPSC의 하나의 잠재적인 즉각적 응용은 i) 면역요법을 위한 종양- 또는 바이러스-특이적 면역 수용체 (예를 들면, TCRαβ 또는 키메라성 항원 수용체 (CAR)) 를 발현하는 면역 세포 (T 세포 (Themeli 등, 2013), NK 세포 (Knorr 등, 2013), NKT 세포, 등을 포함함), 및 ii) 혈액성 악성종양 또는 선천성 장애에 대한 조혈 줄기 세포 이식일 것이다. 또한, 동종 iPSC는 사용되어 예를 들면, 재생 의약을 위한 심근세포, 폐 상피 세포, 신장 세포, 및 신경 세포를 발생시킬 수 있다. iPSC는 또한 클로닝에 대한 상대적으로 높은 효율 및 강력한 증식성으로 인해 안전한 세포성 조작을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, iPSC는 변형되어 치료적 유전자 (예를 들면, CAR)를 발현할 수 있고, 이는 또한 인공 뉴클레아제 (예를 들면, ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9)에 의해 유전적으로 수정되어 면역 억제 분자 (예를 들면, PD-1, CTLA-4, TCR 알파 불변 영역)을 제거할 수 있다.
T 세포로의 센다이 바이러스 벡터-매개 유전자 형질도입. 센다이 바이러스 벡터를 HLA 동종접합성 UCB로부터 유도된 T 세포로부터 iPSC를 생성하기 위해 사용하였다 (표 2). 우선, SeV의 효율을 GFP 리포터 유전자를 운반하는 SeV 벡터를 사용하여 T 세포에서 시험하였다. 항-CD3 단클론성 항체 (moAb) 및 항-CD28 moAb을 사용하는 T 세포의 활성화후 2일차에, 세포를 GFP-SeV 입자로 감염시켰다. SeV로부터의 GFP 발현은 극히 높았고, 이의 발현은 1주일 이후 유지되었다 (비-형질감염된 T 세포보다 거의 3 대수(log) 높은 MFI) (도 4).
[표 2] iPS에 대한 HLA 동종접합성 UCB
Figure pat00002
HLA 동종접합성 UCB로부터 유도된 T 세포로부터의 iPSC의 발생. HLA 동종접합성 UCB 단위를 MD 앤더슨 암 센터에서의 제대혈 은행으로부터 얻었다. 일 방법에서, T 세포의 단리 이후, 세포를 MOI (각각 5, 5, 3)에서 i) KLF4, OCT4, SOX2 (다시트론성 벡터), ii) cMYC, 및 iii) KLF4를 암호화한 SeV 벡터로 감염시켰다. MEF 공급 배양액 또는 매트리겔 상에서의 12일 이후, iPS 콜로니가 나타났고, 이러한 콜로니는 16일차에 TRA-1-60 염색으로 평가하였다 (도 5). MEF 공급 조건에 대한 초기 유도 이후, iPSC를 mTeSR1 배지를 가진 공급물 무함유 (매트리겔 코팅된) 플레이트 상에서 추가로 배양시켰다. 상기 조건에서 iPSC는 만능 세포 유사 형태를 유지하였고, iPSC에 의한 만능 마커의 발현을 면역형광 염색으로 확인하였다 (도 6).
DNA 플라스미드 또는 iPSC로의 시험관내 전사된 mRNA의 전기 천공. 잠자는 공주 트랜스포존/전위효소 시스템을 채택하여 암에 대한 입양 면역요법을 위해 T 세포를 발현하는 키메라성 항원 수용체를 생성시켰다. 이러한 시스템은 바이러스-기반 유전자 변형보다 비용소모가 훨씬 적다. 이러한 시스템은 뉴클레오펙션에 의해 DNA 플라스미드 (또는 mRNA)의 형질감염에 의존적이며, 뉴클레오펙션은 CMV 프로모터-유도된 GFP를 암호화한 DNA 플라스미드 및 GFP를 암호화한 mRNA를 사용하여 iPSC에서 시험되었다. 4D Amaxa Nucleofector (프로그램: CA-137)를 사용하여 DNA 플라스미드 및 mRNA를 iPSC로 도입시켰다 (도 7). 이러한 높은 형질감염 효율은 스트립을 사용하는 소규모 형질감염 (20 μL)의 사용시 달성되었다.
아연 핑거 뉴클레아제에 의한 TRAC 유전자의 손상. 도 8은 mRNA-암호화된 아연 핑거 뉴클레아제의 형질감염에 의해 TRAC 유전자 (TCR 알파 불변 영역)을 손상시키는 예시적인 프로토콜을 제공한다. TRAC 유전자 손상된 iPS 클론을 단리하여 게놈 DNA 서열분석에 의해 분석하여 손상된 TRAC 유전자를 갖는 클론을 확인하였다 (도 9). TRAC 유전자 손상된 iPS 클론은 OCT3/4, Nanog, SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, 및 TRA-1-81을 포함하는 만능 마커를 발현하는 것으로 밝혀졌다.
아연 핑거 뉴클레아제에 의한 TCR 유전자의 손상. 아연 핑거 뉴클레아제를 단일가닥 공여체 올리고뉴클레오타이드 (ssODN) (Chen 등, 2011)과 결합하여 사용하여 iPS 세포의 TCR 유전자를 손상시켰다. 이후, 돌연변이체를 액적 디지털 PCR (ddPCR) (Miyakoa 등, 2014)을 사용하여 스크리닝하였다 (도 10).
CAR의 도입. CAR의 도입을 잠자는 공주 및 렌티바이러스를 사용하여 수행하였다 (도 11). SB-매개 CAR 형질도입은 iPS 세포에서의 렌티바이러스-매개 CAR 형질도입과 비슷한 것으로 밝혀졌다 (도 12). iPS 세포의 분화 또는 사멸을 유도하는 항-FC를 사용한 양성 선택 (IgG 스톡을 가진 CAR이 검출됨)이 CAR+ 집단을 강화하기 위해 사용될 수 있다.
iPS 세포로부터의 T 세포의 재분화. 도 13은 공급물 무함유 조건에서 iPS 세포로부터 조혈 전구 세포 (HPC)의 분화를 위한 예시적인 프로토콜을 제공한다.
실시예 3 - 면역 수용체의 잠재적인 오프-타겟 독성의 리포터 유전자 매개 스크리닝
종양을 표적화하는 면역 수용체를 사용하는 입양 T-세포 요법은 종양 세포를 근절하기 위한 이의 잠재성으로 인해 임상적으로 사용되고 있다. 그러나, 종양에 대해 면역 세포 특이성을 재유도하기 위한 주요 관심사는 의도되지 않고 예측될 수 없는 오프-타겟 독성이고, 이는 "종양-특이적" 입양 세포 요법을 받는 환자에게서 관찰되었다 (문헌 [Cameron et al., 2013; Morgan et al., 2010]). 조직 패널 내에서의 유전자 또는 단백질 발현의 검출에 기초한 표적 항원의 조직 분포를 예측하는 현재 방법은 이들 독성을 예측하기에 충분하지 않았다. 이러한 문제점을 극복하고 잠재적 오프-타겟 독성의 식별을 개선하기 위해, 본 발명자들은 iPSC 및/또는 iPSC-유도된 분화된 세포를 사용하여 면역 수용체의 특이성을 스크리닝할 것이다. 우선, iPSC를 건강한 공여체 세포로부터 발생시킬 것이고, 내인성 HLA 발현이 인공 뉴클레아제 (예를 들면, 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9)에 의해 제거되어 관심 면역 수용체의 배경 인식을 감소시킬 것이다. 이들 iPSC는 계통-특이적 세포로 분화되어 제거된 내인성 TCR 발현 및 관심 도입된 면역 수용체를 갖는 T-급성 림프구성 백혈병 세포주로부터 유도된 리포터 세포주를 사용하여 스크리닝될 것이다 (도 2, 좌측 패널). 이러한 리포터 세포주는 도입된 면역 수용체를 통해 표적 항원을 인식한 이후에만 GFP를 발현할 것이다. 따라서, iPSC-유도된 분화된 세포가 표적 항원을 발현하는 경우, 이들은 GFP 발현에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 사망 리포터 유전자 (도 2, 중간 패널) 또는 계통-특이적 전사 인자 프로모터-유도된 리포터 유전자 (도 2, 우측 패널)은 iPSC로 도입될 수 있다. 이들 세포는 T 세포를 발현하는 면역 수용체와 공동-배양시키는 것에 의한 면역 수용체-매개된 인식을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시물을 고려하여 과도한 실험과정 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예와 관련하여 기재되는 한편, 이는 본 기술분야의 당업자에게 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본원에 기재된 방법의 단계의 순서 또는 단계에서 그리고 방법에 대해 변형이 이루어질 수 있음은 자명한 것일 것이다. 보다 상세하게는, 화학적으로 및 생리적으로 모두 관련된 특정 제제가 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 기재된 제제에 대해 대체될 수 있음은 자명한 것일 것이다. 본 기술분야의 당업자에게 자명한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내의 것으로 여겨진다.
참조
하기 참조는, 이들이 본원에 제시된 것들에 보충되는 예시적인 절차적, 또는 다른 세부 사항을 제공하는 정도로, 본원에 구체적으로 참조로 포함된다.
미국 특허 번호 4,690,915
미국 특허 번호 6,225,042
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미국 특허 번호 6,362,001
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미국 특허 번호 8,124,408
미국 특허 번호 8,268,620
미국 특허 번호 8,283,168
미국 특허 번호 8,372,642
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미국 특허 번호 8,546,140
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Claims (82)

  1. HLA-Aneg, HLA-동종접합성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)의 제조 방법으로서,
    (a) HLA-동종접합성 공여체로부터의 세포 집단을 얻는 단계;
    (b) 세포가 HLA-A를 발현하지 못하게 하여, 이에 의해 HLA-Aneg 세포가 생성되도록 세포를 조작하는 단계; 및
    (c) 상기 HLA-Aneg 세포를 재프로그래밍하여 iPSC를 발생시키고, 이에 의해 HLA-Aneg iPSC를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 집단이 제대혈 세포 집단인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 공여체가 HLA-B, HLA-C, 및 HLA-DRB1에서 HLA-동종접합성인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 HLA-A를 발현하지 않도록 세포를 조작하는 것은 상기 HLA-A 유전자좌를 특이적으로 표적화하는 인공 뉴클레아제를 상기 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인공 뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, TALEN, 또는 CRISPR/Cas9인, 방법.
  6. 제4항에 있어서, 인공 뉴클레아제를 상기 세포로 도입시키는 것은 상기 인공 뉴클레아제를 암호화한 mRNA를 상기 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 재프로그래밍하는 것은 Oct3/4, KLF4, Sox2, 및 c-myc 단백질을 상기 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 재프로그래밍하는 것은 Oct3/4, KLF4, Sox2, 및 c-myc 암호화 mRNA를 상기 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 재프로그래밍하는 것은 Oct3/4, KLF4, Sox2, 및 c-myc를 암호화한 하나 이상의 발현 카세트를 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 카세트는 하나 이상의 에피솜 벡터에 포함되는, 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 발현 카세트는 바이러스 벡터 내에 포함되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 또는 센다이 바이러스인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 단계 (b)의 세포로 자살 유전자를 도입시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 자살 유전자는 유도성 카스파제 9 (iCasp9)인, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 도입 단계는 유전자 전달을 포함하는, 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 도입 단계는 트랜스포존/전위효소 시스템을 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 트랜스포존/전위효소 시스템은 잠자는 미녀(Sleeping Beauty) 트랜스포존/전위효소 시스템인, 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 iPSC에서 상기 TRAC 유전자를 손상시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 손상시키는 것은 상기 TRAC 유전자좌를 특이적으로 표적화하는 인공 뉴클레아제를 상기 세포로 도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제1항에 있어서, 키메라성 항원 수용체를 갖는 상기 iPSC를 형질도입시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  21. 제1항에 있어서, 유전적으로 안전한 하버 프로파일(harbor profile)을 갖는 HLA-Aneg, HLA-동종접합성 iPSC를 식별하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 식별하는 것은 전체의 게놈 서열분석 또는 통합 부위 분석에 의해 수행되는, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 HLA-Aneg, HLA-동종접합성 iPSC를 분화시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 분화시키는 것은 항원 제시 세포 (APC)의 사용을 포함하는, 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 APC는 인공 APC (aAPCs)를 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 aAPC는 유전적으로 변형된 K562 세포인, 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 iPSC는 면역 세포로 분화되는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포, NK 세포, iNKT 세포인, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 면역 세포는 종양 특이적 또는 바이러스-특이적 TCR알파베타를 더 포함하는, 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 면역 세포는 종양 특이적 키메라성 항원 수용체를 더 포함하는, 방법.
  31. 제27항에 있어서, 상기 면역 세포는 면역 억제 분자가 제거되도록 추가로 유전적으로 수정(genetically edited)되는 것인, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 면역 억제 분자는 PD-1 또는 CTLA-4인, 방법.
  33. 제27항에 있어서, 상기 iPSC는 조혈 줄기 세포로 분화되는, 방법.
  34. 제27항에 있어서, 상기 iPSC는 심근세포, 폐 상피 세포, 베타 소도 세포, 신장 세포, 또는 신경 세포로 분화되는, 방법.
  35. 단리된 포유동물 세포로서, 상기 세포는 적어도 한 세트의 동종접합성 HLA 대립형질 및 HLA-Aneg 표현형을 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 세포는 제대혈, 심근세포, 신장, 폐, 표피, 췌장, 베타 소도, 간, 조혈, 간엽, 또는 신경 세포인, 단리된 포유동물 세포.
  37. 제35항에 있어서, 상기 세포는 배아 줄기 세포 또는 iPS 세포인, 단리된 포유동물 세포.
  38. 제35항에 있어서, 상기 세포는 T-세포 또는 NK 세포인, 단리된 포유동물 세포.
  39. 제35항에 있어서, 상기 세포는 적어도 2개의 세트의 동종접합성 HLA 대립형질을 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  40. 제35항에 있어서, 상기 세포는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질, 동종접합성 HLA-B 및 HLA-DRB1 대립형질 또는 동종접합성 HLA-C 및 HLA- HLA-DRB1 대립형질을 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  41. 제35항에 있어서, 세포는 하나 이상의 HLA-A 유전자의 모두 또는 일부의 결실을 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  42. 제35항에 있어서, 세포는 유전자가 비-기능적이 되게 하는 돌연변이를 갖는 하나 이상의 HLA-A 유전자를 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  43. 제35항에 있어서, 상기 세포는 이식유전자를 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  44. 제43항에 있어서, 상기 이식유전자는 자살 유전자를 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  45. 제44항에 있어서, 상기 자살 유전자는 유도성 카스파제 9 (iCasp9)인, 단리된 포유동물 세포.
  46. 제35항에 있어서, 상기 세포는 기능성 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자가 결핍된 것인, 단리된 포유동물 세포.
  47. 제35항에 있어서, 상기 세포는 종양 특이적 또는 바이러스-특이적 TCRαβ를 더 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  48. 제35항에 있어서, 상기 세포는 키메라성 항원 수용체 (CAR)를 더 포함하는, 단리된 포유동물 세포.
  49. 제35항에 있어서, 상기 세포는 하나 이상의 면역 억제 분자의 발현이 결핍된 것인, 단리된 포유동물 세포.
  50. 제49항에 있어서, 상기 면역 억제 분자는 PD-1 또는 CTLA-4인, 단리된 포유동물 세포.
  51. 제35항의 세포 집단.
  52. 적어도 제1 및 제2 유도 만능 줄기 세포주를 포함하는 시험관내 세트의 세포주로서,
    상기 제1 및 제2 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질을 포함하고,
    상기 제1 세포주의 상기 동종접합성 HLA-B 및/또는 HLA-C 대립형질은 상기 제2 세포주의 상기 동종접합성 HLA-B 및/또는 HLA-C 대립형질과 상이하고, 상기 제1 및 제2 주 둘 모두는 HLA-Aneg 인, 시험관내 세트의 세포주.
  53. 제52항에 있어서, 적어도 5 내지 10개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 더 포함하고, 각각의 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 특이 조합을 포함하고, 각각의 주는 HLA-Aneg 인, 시험관내 세트의 세포주.
  54. 제53항에 있어서, 적어도 20개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 더 포함하고, 각각의 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 특이 조합을 포함하고, 각각의 주는 HLA-Aneg 인, 시험관내 세트의 세포주.
  55. 제54항에 있어서, 적어도 27개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 더 포함하고, 각각의 주는 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 특이 조합을 포함하고, 각각의 주는 HLA-Aneg 인, 시험관내 세트의 세포주.
  56. 제54항에 있어서, 상기 세트는 적어도 27개의 상이한 유도 만능 줄기 세포주를 포함하고, 각각의 주는 표 1에 따른 동종접합성 HLA-B 및 HLA-C 대립형질의 특이 조합을 포함하고, 각각의 주는 HLA-Aneg 인, 시험관내 세트의 세포주.
  57. 제52항에 있어서, 각각의 주는 자살 유전자를 더 포함하는 시험관내 세트의 세포주.
  58. 제57항에 있어서, 상기 자살 유전자는 유도성 카스파제 9 (iCasp9)인, 세포주.
  59. 제52항에 있어서, 상기 세포주는 제1항의 방법에 따라 제조되는, 시험관내 세트의 세포주.
  60. 면역 수용체 특이성의 스크리닝 방법으로서,
    (a) 제52항의 시험관내 세트의 iPSC 주를 얻는 단계;
    (b) 임의로 계통-특이적 세포로 상기 iPSC를 분화시키는 단계;
    (c) 관심 면역 수용체를 발현하는 T 세포에 대해 상기 iPSC 또는 상기 계통-특이적 세포를 노출시키는 단계; 및
    (d) 상기 iPSC 또는 상기 계통-특이적 세포와 관심 면역 수용체를 발현하는 상기 T 세포 사이의 상호작용을 검출하고, 이에 의해 면역 수용체 특이성을 스크리닝하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 T 세포는 상기 관심 면역 수용체에 대한 상기 표적 항원을 인식한 이후에만 GFP를 발현하는 T-급성 림프구성 백혈병 세포주인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 단계 (d)는 T-급성 림프구성 백혈병 세포주에서 GFP의 발현을 검출하고 이에 의해 상기 표적 항원을 발현하는 iPSC 또는 계통-특이적 세포를 식별하는 것을 포함하는, 방법.
  63. 제60항에 있어서, 상기 단계 (a)의 세포로 세포사 리포터 작제물을 도입시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 세포사 리포터 작제물은 카스파제-3 활성화의 검출을 가능하게 하는 것인, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 단계 (d)는 상기 세포사 리포터 작제물의 활성화를 검출하고, 이에 의해 면역 수용체 특이성에 대해 스크리닝하는 것을 포함하는, 방법.
  66. 제60항에 있어서, 상기 단계 (a)의 세포로 계통-특이적 전사 인자 프로모터-유도된 리포터 유전자를 도입시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 단계 (d)는 상기 리포터 유전자의 발현의 손실을 검출하고, 이에 의해 면역 수용체 특이성에 대해 스크리닝하는 것을 포함하는, 방법.
  68. 제60항에 있어서, 상기 관심 면역 수용체는 T-세포 수용체 (TCR) 또는 키메라성 항원 수용체 (CAR)인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 TCR은 클로닝되거나 조작되는, 방법.
  70. 질환의 치료를 필요로 하는 환자에서의 질환의 치료 방법으로서,
    (a) 상기 환자에 대해 HLA-매칭된 제52항의 시험관내 세트의 세포주로부터 세포주를 선택하는 단계;
    (b) 상기 선택된 세포주를 계통-특이적 세포로 분화시키는 단계; 및
    (c) 상기 환자에게 치료적 유효량의 상기 분화된 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 면역요법의 제공 방법인 것인, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 계통-특이적 세포는 조혈 줄기 세포 또는 면역 효과기 세포인, 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 질환은 암, 자가면역 질환, 또는 감염성 질환인, 방법.
  74. 제71항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포가 T 세포, NK 세포, 및 iNKT 세포인, 방법.
  75. 제71항에 있어서, 상기 단계 (a)의 세포로 키메라성 항원 수용체 (CAR) 또는 T-세포 수용체를 도입시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 질환은 암이고, 상기 CAR은 암 세포 항원에 대해 표적화되는 것인, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 암 세포 항원은 CD19, CD20, 암종배아 항원, 알파태아단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피성 종양 항원, 흑색종-관련된 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, ERBB2, 엽산 결합 단백질, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메오테린, GD3, HERV-K, IL-11R알파, 카파 사슬, 람다 사슬, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, 또는 VEGFR2인, 방법.
  78. 제75항에 있어서, 상기 질환은 자가면역 질환이고, 상기 CAR은 상기 자가면역 세포에 대해 표적화되는 것인, 방법.
  79. 제75항에 있어서, 상기 질환은 병원체에 의해 야기되는 감염성 질환이고, 상기 CAR은 병원체 항원에 대해 표적화되는 것인, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 병원체는 진균, 바이러스, 또는 박테리아 병원체인, 방법.
  81. 제70항에 있어서, 재생 의약의 제공 방법인 것인, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 계통-특이적 세포는 심근세포, 뉴런, 베타 소도 세포, 신장 세포, 또는 폐 세포인, 방법.
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