JP2020536551A - 一時的かつ一過性プラスミドベクター発現システムを用いる細胞のリプログラミング - Google Patents

一時的かつ一過性プラスミドベクター発現システムを用いる細胞のリプログラミング Download PDF

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Abstract

短命な導入遺伝子の一過性かつ一時的発現を提供するベクターシステムを使用して、望ましい特性を有するｉＰＳＣへの非多能性のリプログラミングを誘導するための方法および組成物が提供される。また、リプログラミング方法および組成物を使用して、リプログラミング細胞およびｉＰＳＣ集団またはクローン細胞株が提供される。さらに、ゲノム操作したｉＰＳＣと、そこから再分化して１つ以上の選択されたゲノム遺伝子座での挿入および欠失に関わる標的編集を含む、由来細胞とが提供される。【選択図】図１

Description

関連出願
この出願は、２０１７年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５７１，１０５号の優先権を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された配列表の参照
この出願は、この出願とともに提出されたＡＳＣＩＩテキスト形式の配列表のＣｏｍｕｐｔｅｒ Ｒｅａｄａｂｌｅ Ｆｏｒｍ（ＣＲＦ）を参照として組み込んでおり、タイトルは１３６０１−１８７−２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔで、２０１８年１０月９日に作成され、サイズは９，６００バイトである。
本開示は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣまたはｉＰＳ細胞）を生成する分野に広く関係している。より具体的には、本開示は、プラスミドベクターの組み合わせを使用して、高い効率で望ましい特性を有するフットプリントフリーのｉＰＳＣを得ることに関係する。
ｉＰＳＣはもともと、主要な転写因子を発現するための組み込みウイルスシステムを使用して生成された。ポリシストロン性および誘導性システムを含むレトロウイルスおよびレンチウイルスシステムは、現在ｉＰＳＣの生成で成功裏に採用されている。ただし、ｉＰＳＣ分化後の挿入変異と外因性遺伝子再活性化の可能性による永続的なゲノム変化は、これらの方法によって生成された細胞の後続の薬剤スクリーニングと治療用途に潜在的な問題を提示する可能性がある。実際、同じウイルスシステムを使用して生成されたｉＰＳＣクローン間の有意差とともに、げっ歯類で分化したニューロスフェアとして移植されるとクローン化された大部分が腫瘍を形成することが、報告されている。研究では、同じウイルス手法を使用して生成されたｉＰＳＣが、分化すると異なる動作をする可能性があることが示唆されている。異所性遺伝子組み込み部位の違いは、異なる挿入変異と導入遺伝子の発現のエピジェネティック制御をもたらす可能性がある。組み込みシステムを含むｉＰＳＣ生成方法の場合、多能性状態と分化状態の両方で安定しているクローンを特定するために、多くのクローンを誘導させおよびスクリーニングする必要がある。
ｉＰＳＣ生成のためのさまざまな非組み込みシステムが実証されており、これにはウイルス法と非ウイルス法が含まれる。リプログラミングのための非組み込みウイルスシステムには、アデノウイルスベクター、センダイウイルスベクター、およびエプスタインバーウイルスベースのエピソームベクターが含まれる。リプログラミングのための非組み込み非ウイルスシステムの例には、ミニサークルベクター（最小ＤＮＡベクター）、ＰｉｇｇｙＢａｃ（トランスポゾン）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）、およびタンパク質（組み換えポリペプチド）が含まれる。
当技術分野では、好ましくは多能性の「ナイーブ」または「基底」状態で、好ましくは規定の培養条件で、フットプリントのないｉＰＳＣの均質な集団の効率的な生産がかなり必要とされている。多能性の「ナイーブ」または「基底」状態は、高いクローン性、持続的な自己再生、最小限の自発的分化もしくはゲノム異常、および解離した単一細胞としての高い生存率を含むがこれらに限定されない、ｉＰＳＣの品質を与える。本発明の方法および組成物、具体的には新規プラスミドベクターシステムは、この必要性に対処し、細胞リプログラミングの分野で他の関連する利点を提供する。
宿主ゲノム組み込みの確率を下げるため外因性遺伝子の存在を最小限に抑える、効率的だが一過性かつ一時的な発現システムを使用することにより、本開示の目的は、リプログラミングの誘導のために非多能性細胞に導入された外因性ＤＮＡを含まない、ｉＰＳＣを生成するのに効率的な方法および組成物を提供することである。本開示の目的は、多能性および／または高クローン性の「ナイーブ」または「基底」状態のｉＰＳＣを効率的に産生する組み合わせプラスミドシステムを提供することである。基底状態の多能性を備えたｉＰＳＣは、単一細胞の解離したｉＰＳＣの長期生存と遺伝的安定性を可能にし、そのため単一細胞の選別および／または枯渇、クローンｉＰＳＣを標的としたゲノム編集、ならびにｉＰＳＣの均質集団の指示された再分化、などのバンキング（ｂａｎｋｉｎｇ）および操作に適したクローンｉＰＳＣ系統の生成を可能にする。したがって、本開示の目的は、ポリヌクレオチドの挿入、削除、および置換を含む、選択された部位に１つまたはいくつかの遺伝子修飾を含み、その修飾が保持され、分化、脱分化、リプログラミング、増加、継代および／または移植後に引き続く由来細胞において機能的であり続ける、単一細胞由来のｉＰＳＣクローン系統、またはそれからの由来細胞を生成する方法および組成物を提供することでもある。
本出願の一態様は、非多能性細胞をリプログラミングして多能性細胞またはその集団を生成する方法を提供し、この方法は、非多能性細胞を１つ以上の第１のプラスミドでトランスフェクトすることであって、第１のプラスミドは複製起点および１つ以上のリプログラミング因子をコードするが、ＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つは、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含み、１つ以上の第１のプラスミドの導入が、リプログラミングプロセスを誘導する、トランスフェクトすることと、任意選択的に、下記の、ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点、またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない、第２のプラスミド、ＥＢＮＡ ｍＲＮＡ、およびＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つを非多能性細胞に導入することと、を含む。次いで、トランスフェクトされた細胞を培養して、開始非多能性細胞からの形態学的変化を含み、ＥＢＮＡを本質的に含まないが、多能性細胞形態を欠き、内在性ＯＣＴ４発現を含まない、リプログラミング細胞を生成する。リプログラミング細胞がさらに十分な時間培養されると、１つ以上の多能性細胞が生成される。本明細書で提供されるリプログラミング方法は、細胞ゲノムに組み込まれ、再活性化して由来細胞を生成する場合には脱分化を誘発するか、臨床の環境で使用される場合に腫瘍形成の傾向を高める可能性がある、外因性導入遺伝子の発現への多能性細胞の曝露を最小限に抑える。
一実施形態では、リプログラミング方法は、リプログラミングを誘導するためにプラスミドの組み合わせを非多能性細胞に最初に導入することを含む。前記プラスミドの組み合わせは、１つ以上の第１プラスミドを含み、この第１プラスミドは、複製起点と、１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドと、を含み、かつ、少なくとも１つの第１プラスミドはＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む。１つ以上の第１のプラスミドを含むプラスミドの前記組み合わせは、ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むが、複製起点またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない第２のプラスミドをさらに含む。リプログラミングを誘導するために非多能性細胞にプラスミドシステムを導入した後、細胞を培養して、プラスミドの組み合わせが導入される開始非多能性細胞からの形態学的変化を含む、リプログラミング細胞を生成する。形態学的変化を示すリプログラミング細胞は、本質的にＥＢＮＡを含まなくなるが、多能性細胞の形態を欠いており、内在性のＯＣＴ４発現を含まない。提供されるリプログラミングの方法では、前記リプログラミング細胞は、１つ以上の多能性細胞を生成するのに十分な時間さらに培養される。いくつかの実施形態では、リプログラミング細胞の培養は、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つを含む小分子化合物の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、小分子化合物は、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、上記の一般的な方法は、多能性細胞を解離して、単一細胞の解離した多能性細胞を得るステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、単一細胞の解離した多能性細胞を培地に懸濁させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の多能性マーカーを発現する細胞を選択および単離して、選択されたマーカー（複数可）を発現する多能性細胞を濃縮することにより、単一細胞の解離した多能性細胞を選別する。いくつかの他の実施形態では、多能性細胞、またはそこから懸濁、選別、または濃縮された単一解離細胞は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つを含む小分子化合物の存在下で多能性を維持するために培養される。いくつかの実施形態では、長期の多能性維持は、少なくとも５、１０、１５、または２０継代、またはそれ以上である。
いくつかの実施形態では、上記の方法は、体細胞、前駆細胞、または多分化能細胞のリプログラミングを誘導するために使用される。本方法のいくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞はヒト細胞である。本方法のいくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は免疫細胞である。いくつかの他の実施形態では、リプログラミングのための免疫細胞は、患者特異的、薬物応答特異的、または疾患状態特異的であり得る。一実施形態では、開示される方法を使用してリプログラミングするための非多能性細胞が、リプログラミング細胞によって示される形態学的変化は、ＭＥＴ（間葉から上皮への転換）の形態学的変化である。
前記方法の一実施形態では、リプログラミング細胞は、第２のプラスミドによって運ばれるＥＢＮＡを本質的に含まない。一実施形態では、リプログラミング細胞は第２のプラスミドを本質的に含まない。本方法のいくつかの実施形態は、約４〜１０日間（すなわち、プラスミドのトランスフェクション後４〜１０日）、５〜１０日間、６〜１０日間、またはその間の任意の日数間のプラスミドの組み合わせから誘導されているリプログラミング細胞を提供する。この方法のいくつかの実施形態は、トランスフェクション後４〜１２日、またはその間の任意の日数間のリプログラミング細胞を提供する。本方法のさらにいくつかの実施形態は、トランスフェクション後４〜１４日、またはその間の任意の日数間のリプログラミング細胞を提供する。本方法のさらに他のいくつかの実施形態は、トランスフェクション後４〜２１日もしくは４〜２５日、またはその間の任意の日数間のリプログラミング細胞を提供する。
いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、ｏｒｉＰおよびＥＢＮＡの両方を含む追加のプラスミドを導入した細胞と比較して、多能性復帰または自発的分化が低減している多能性細胞を産生する。いくつかの他の実施形態では、前記方法は、プラスミド組み合わせのポリヌクレオチドを本質的に含まない多能性細胞を産生する。いくつかの実施形態では、プラスミドのポリヌクレオチドを本質的に含まない多能性細胞は、多能性細胞の選択または広範な継代を必要とせずに産生される。一実施形態では、本方法は、以下の特性：高いクローン性、遺伝的安定性、および基底状態の多能性、のうちの少なくとも１つを有する多能性細胞を生成する。いくつかの実施形態では、本方法は、胚体外細胞に関連する再活性化遺伝子を含む多能性細胞を生成する。
いくつかの実施形態では、本方法は、高い損失率を有する第２のプラスミドの使用に関連し、このため第２のプラスミドによるＥＢＮＡの発現は、ＥＢＮＡが急速に失われ、細胞質内で、ｉＰＳＣ形態または内在性多能性遺伝子発現の出現前に発現されるという意味で、短命で、一過性で、一時的である。本方法のいくつかの実施形態において、第１および第２のプラスミドにそれぞれ含まれる複製起点および／またはＥＢＮＡは、ＥＢＶベースである。本方法のいくつかの実施形態では、リプログラミングプロセスは、フィーダーフリー条件下で、すなわちフィーダーフリーの培地で行われる。本方法のいくつかの他の実施形態では、培地に含まれるＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。
本出願の別の態様は、１つ以上の第１のプラスミドであって、第１のプラスミドが、複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、１つ以上の第１のプラスミドの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に、ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない第２のプラスミド、ＥＢＮＡ ｍＲＮＡ、およびＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、で非多能性細胞をトランスフェクトした後に得られる、リプログラミング細胞またはその集団を提供し、このリプログラミング細胞は、プラスミドの組み合わせの導入前の非多能性細胞からの形態学的変化を含み、本質的にＥＢＮＡまたはその誘導体を含まず、リプログラミング細胞は（ｉ）多能性細胞形態、および（ｉｉ）内在性ＯＣＴ４発現を含まず、かつ、リプログラミング細胞は、多能性細胞を生成するのに十分な時間を与えられると、安定した多能性を確立することができる。一実施形態では、ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドを使用して、リプログラミング細胞およびｉＰＳＣを生成し、第２のプラスミドは、複製起点またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない。一実施形態では、第２のプラスミドの代わりに、ＥＢＮＡ ｍＲＮＡを１つ以上の第１のプラスミドとともに使用して、リプログラミングを誘導し、開示された特性を有するリプログラミング細胞およびｉＰＳＣを生成する。別の実施形態では、ＥＢＮＡタンパク質またはポリペプチドを１つ以上の第１のプラスミドとともに使用して、リプログラミングを誘導し、開示された特性を有するリプログラミング細胞およびｉＰＳＣを生成する。
リプログラミング細胞またはその集団のいくつかの実施形態では、細胞は約４〜１０、１２、１４、２１、２５日間、またはその間の任意の日数間まで誘導されている。いくつかの実施形態では、リプログラミング細胞またはその集団は、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で培養される。いくつかの他の実施形態では、リプログラミングの形態学的変化がＭＥＴ（間葉から上皮への転換）の形態学的変化を含むように、リプログラミング細胞またはその集団は線維芽細胞から誘導される。いくつかの実施形態では、リプログラミング細胞またはその集団は、第１および第２のプラスミドを本質的に含まない。いくつかの実施形態において、リプログラミング細胞は、選択または多能性細胞の広範な継代を必要とせずに、プラスミドのポリヌクレオチドを本質的に含まない多能性細胞を生じさせる。いくつかの他の実施形態にでは、リプログラミング細胞またはその集団は、例えば、ｏｒｉＰおよびＥＢＮＡの両方を含む追加のプラスミドで導入された細胞と比較して、多能性復帰または自発的分化が低減している多能性細胞を生じさせる。さらにいくつかの他の実施形態では、リプログラミング細胞またはその集団は、以下の特性：高いクローン性、遺伝的安定性、および基底状態の多能性のうちの少なくとも１つを有する多能性細胞を生じさせる。さらに別の実施形態では、リプログラミング細胞またはその集団は、胚体外細胞に関連する再活性化遺伝子を含む多能性細胞を生じさせる。
したがって、本出願の別の態様は、上記のリプログラミング細胞またはその集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地をさらに含む。一実施形態では、組成物の培地に含まれるＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビビンである。他の実施形態では、培地はフィーダーフリーである。本出願のさらなる態様は、本明細書に開示された前記方法によって産生された単離した多能性細胞または多能性細胞株を提供する。いくつかの実施形態において、そのように産生された単離した多能性細胞または多能性細胞株は、さらにゲノム操作されおよび／または非天然由来細胞に再分化され得る。いくつかの実施形態では、単離した多能性細胞または多能性細胞株から再分化した非天然由来細胞は、ＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、および免疫制御性細胞、を含むがこれらに限定されない免疫細胞である。いくつかの実施形態では、多能性細胞または多能性細胞株に由来する非天然細胞は、以下の特性：ヘテロクロマチンの全体的な増加、ミトコンドリア機能の改善、ＤＮＡ損傷応答の増加、テロメアの伸長と短いテロメアの割合の減少、老化細胞の部分の減少、天然の細胞対応物と比較して、増殖、生存、持続、または記憶様機能（ｍｅｍｏｒｙ ｌｉｋｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に対する高い可能性、のうちの少なくとも１つを含む若返り細胞（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ ｃｅｌｌ）である。
本出願のさらなる態様は、本明細書に記載の方法により得られた多能性細胞、および任意選択的に１つ以上の追加の治療薬を含む治療的使用のための組成物を提供する。また、本明細書に記載の方法により得られる請求項のゲノム操作した多能性細胞または由来非天然細胞、および任意選択的に１つ以上の追加の治療薬を含む治療的使用のための組成物も提供される。いくつかの実施形態において、治療的使用のためのこれらの組成物は、治療が必要な対象の治療に使用するためのものである。本出願はまた、細胞ベースの治療に適用するための多能性細胞の製造に使用するための組成物を提供する。いくつかのの実施形態では、多能性細胞は同種異系である、すなわち、細胞ベースの治療を受ける対象とは異なる対象からの細胞からリプログラミングされ、または自己である、すなわち、細胞ベースの治療を受ける同じ対象の細胞からリプログラミングされる。
上記の方法により得られた多能性細胞を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットに含まれる多能性細胞はゲノム操作されている。また、前記方法により得られた多能性細胞に由来する非天然細胞を含むキットも提供される。
本出願のさらに別の態様は、非多能性細胞でリプログラミングを開始するためのインビトロシステムを提供し、システムは、（１）１つ以上の第１のプラスミドであって、第１のプラスミドは複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に（２）（ｉ）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない、第２のプラスミド、（ｉｉ）ＥＢＮＡ ｍＲＮＡ、（ｉｉｉ）ＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、を含む。いくつかの実施形態では、システムの第２のプラスミドは高い損失率を有し、第２のプラスミドによるＥＢＮＡの発現は短命で、一過性でかつ一時的である。いくつかの他の実施形態では、システムは、核内で、ＥＢＮＡ複製および／または連続発現を提供しない。一実施形態において、システムは、短期間、かつ多能性細胞形態の出現および内在性多能性遺伝子の誘導発現の前に、ＥＢＮＡの一過性／細胞質発現を可能にし得る。いくつかの実施形態では、ＥＢＮＡ発現ための短期間は、トランスフェクション後約４、５、６、７、または８日であるが、トランスフェクション後１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２２、２３、２４または２５日以下である。いくつかの他の実施形態では、システムは、短期間、かつ多能性細胞形態の出現および内在性多能性遺伝子の誘導発現の前に、第１のプラスミド（複数可）に含まれる１つ以上のリプログラミング因子の一過性／細胞質発現も可能にする。
このシステムの一実施形態では、第１のプラスミド（複数可）の複製起点は、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、およびＧａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅウイルスからなる群から選択されるものである。いくつかの実施形態では、複製起点は、ＳＶ４０、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、またはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からなる群から選択されるものである。特定の一実施形態では、複製起点は、ＥＢＶの野生型複製起点に対応するか、または由来する。いくつかの他の実施形態では、システム内の第２のプラスミドのＥＢＮＡはＥＢＶベースである。いくつかの実施形態では、システムは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、およびＬ１ＴＤ１のうちの１つ以上を含むリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチドを集合的に含む１つ以上の第１のプラスミドを提供する。いくつかの実施形態では、リプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、第１のプラスミドのポリシストロン性構築物または非ポリシストロン性構築物に含まれる。ポリシストロン性構築物の一実施形態では、単一のオープンリーディングフレームまたは複数のオープンリーディングフレームを含む。システムが２つ以上の第１のプラスミドを含む実施形態では、各第１のプラスミドは、ポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーによりコードされる同じまたは異なるリプログラミング因子を含み得る。システムが２つ以上の第１のプラスミドを含むこれらの実施形態では、システムはリプログラミング因子の化学量論の制御を提供する。
システムのいくつかの実施形態では、第１のプラスミドは、リプログラミング因子をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含み、隣接するポリヌクレオチドは、自己切断ペプチドまたはＩＲＥＳをコードするリンカー配列により作動可能に連結される。一実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２ＡおよびＴ２Ａを含む群から選択される２Ａペプチドである。別の実施形態では、第１のプラスミド構築物に含まれる２Ａペプチドは同じであっても異なっていてもよい。システムのプラスミドが複数の２Ａを含むさらに別の実施形態では、隣接する位置の２つの２Ａペプチドは異なる。システムのいくつかの他の実施形態では、第１および第２のプラスミドはそれぞれ、リプログラミング因子およびＥＢＮＡの発現のための１つ以上のプロモーターを含み、１つ以上のプロモーターはＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、および構成的、誘導的、内因的に調節された、または時間特異的、組織特異的もしくは細胞型特異的な他の適切なプロモーターのうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、第１および第２のプラスミドはそれぞれＣＡＧプロモーターを含む。
本明細書に記載のインビトロシステムを含むキットも提供される。
本方法および組成物の使用の様々な目的および利点は、本発明の特定の実施形態を例示および例として示す添付図面と併せて以下の説明から明らかになるであろう。
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）を含むこの特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な手数料を支払うことにより、官庁から提供される。
ＳＴＴＲ（短命一過性および一時的リプログラミング）システムで使用されるベクター１およびベクター２のＤＮＡ構築物の図と、ＥｍＴＴＲ（ＥＢＮＡ−媒介一過性および一時的リプログラミング）システムのためにベクター１およびベクター２とともに使用される追加のベクター３のＤＮＡ構築物の図を示す。 ＥｍＴＴＲシステムを使用する線維芽細胞のトランスフェクション後１５日目のＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋多能性マーカー発現のフローサイトメトリー分析を示す。 ＥｍＴＴＲシステムを使用するｉＰＳＣマーカーを発現するコロニーの出現を確認するための、トランスフェクション後３０日目の多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１８１、ＳＳＥＡ４染色を示す。 ＳＴＴＲシステムを使用する線維芽細胞のトランスフェクション後１５日目のＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋多能性マーカー発現のフローサイトメトリー分析を示す。 ＳＴＴＲシステムを使用するｉＰＳＣマーカーを発現するコロニーの出現を確認するための、トランスフェクション後３０日目の多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１８１、ＳＳＥＡ４染色を示す。 ＳＴＴＲ由来の集団の大部分が多能性の３つのマーカーすべての発現を維持しているのに対し、ＥｍＴＴＲ誘発集団はトランスフェクションの２５日後にＣＤ３０発現の大幅な低下が示すように多能性を失っているようである、ことを示す。 連続継代後２８日目の、ＥｍＴＴＲとＳＴＴＲから得られたｉＰＳＣコロニーで多能性の安定性が異なることを示す。Ａ：両方の集団での培養中のｉＰＳＣコロニーの形態と分化したクラスター。Ｂ：ＳＴＴＲ集団は最小限の自発的分化でｉＰＳＣコロニーを維持したが、ＥｍＴＴＲ集団はわずかなｉＰＳＣコロニーが存在するだけで高レベルの自発的分化を示した。 ベクター２に保有されたＥＢＮＡの遺伝子発現解析と、ＳＴＴＲシステムを使用する線維芽細胞の細胞リプログラミング中の細胞集団における内在性ＯＣＴ４発現を示す。 マウスにおける多能性発現と奇形腫形成の実証に対するＳＴＴＲを使用して得られたｉＰＳＣの特性評価を示す。Ａ． ｉＰＳＣクローンの位相画像。Ｂ． ＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋多能性マーカー発現のフロー分析。Ｃ．多能性マーカーＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＴＲＡ１８１、およびＳＳＥＡ４のクローンの免疫蛍光染色Ｄ．内胚葉、中胚葉、外胚葉の３つの胚葉に分化するｉＰＳＣクローンの能力。 追加のリプログラミング因子とともにＳＴＴＲシステムを用いる線維芽細胞のトランスフェクション後１５日目のＳＳＥＡ４＋／ＴＲＡ１８１＋多能性マーカー発現のフローサイトメトリー分析を示す。
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、以下の用語を下記に定義する。冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
代替の使用（例えば、「または」）は、代替の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。「および／または」という用語は、選択肢の一方または両方を意味すると理解されるべきである。
本明細書で使用される「約」または「およそ」という用語は、基準となる量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量（ａｍｏｕｎｔ）、重量、または長さと比較して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％程度変化する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「約」または「およそ」という用語は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さに関して、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％を指す。
本明細書で使用される「実質的に」または「本質的に」という用語は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上である量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、「本質的に同じ」または「実質的に同じ」という用語は、基準となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとほぼ同じ、量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
本明細書で使用する場合、「実質的に含まない」および「本質的に含まない」という用語は互換的に使用され、細胞集団または培地などの組成物を説明するために使用される場合、特定の物質またはその供給源を含まない、例えば特定の物質またはその供給源を９５％含まない、９６％含まない、９７％含まない、９８％含まない、９９％含まない、または従来の手段で測定した場合、検出できない、組成物を指す。組成物中の特定の成分または物質を「含まない」または「本質的に含まない」という用語は、そのような成分または物質が（１）組成物にいかなる濃度でも含まれない、または（２）組成物に機能的に不活性であるが低濃度で含まれることも意味する。同様の意味は、組成物の特定の物質またはその供給源の不在を指す「不在の」という用語に適用することができる。
本明細書で使用する場合、「単離した」などの用語は、その元の環境から分離されている細胞または細胞集団を指し、すなわち、単離した細胞の環境は、「単離していない」参照細胞が存在する環境で見出される少なくとも１つの成分を実質的に含まない。この用語には、その自然環境、例えば組織、生検で見られる一部またはすべての成分から取り出された細胞が含まれる。この用語はまた、細胞が非天然起源の環境、例えば培養、細胞懸濁液に見られる少なくとも１つ、いくつかまたはすべての成分から取り出された細胞を含む。したがって、単離した細胞は、自然界に見られる、または非天然起源の環境で成長、保存、もしくは維持される他の物質、細胞、または細胞集団を含む少なくとも１つの成分から部分的または完全に分離される。単離した細胞の特定の例には、部分的に純粋な細胞、実質的に純粋な細胞、および非天然起源の培地で培養された細胞が含まれる。単離した細胞は、所望の細胞、またはその集団を環境中の他の物質または細胞から分離することにより、または環境から１つ以上の他の細胞集団または亜集団を除去することにより得られ得る。
本明細書で使用される場合、「精製する」などの用語は、純度を高めることを指す。例えば、純度を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％に高めることができる。
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉は、述べられたステップもしくは要素またはステップもしくは要素のグループの包含を意味するが、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素のグループの除外ではないことが理解される。特定の実施形態では、用語「含まれる」、「有する」、「含有する」、および「含む」は同義的に使用される。
「からなる」とは、「からなる」という語句に続くものを含むこと、およびそれに限定されることを意味する。したがって、「からなる」という語句は、列挙された要素が所要または必須であり、他の要素が存在し得ないことを示す。
「から本質的になる」とは、語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で指示された活動または作用を妨害または貢献しない他の要素に限定される。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙された要素が所要または必須であることを示すが、他の要素は任意ではなく、列挙された要素の活動または作用に影響するかどうかに応じて存在する場合と存在しない場合がある。
本明細書を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特別な実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」または「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせへの言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態で任意の適切な様式で組み合わせることができる。
「エクスビボ」という用語は、一般に、好ましくは自然状態の最小限の変更で、生体外の人工環境内の生体組織内または生体組織上で行われる実験または測定など、生体外で起こる活動を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、通常滅菌状態下で、典型的には数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて、最大時間４８または７２時間以上の間実験装置で培養される生細胞または組織を含む。一定の実施形態では、そのような組織または細胞を収集して凍結し、その後にエクスビボ治療のために解凍することができる。生きた細胞または組織を使用して数日以上続く組織培養実験または手順は、通常「インビトロ」と見なされるが、一定の実施形態では、この用語はエクスビボと交換可能に使用できる。
「インビボ」という用語は一般に、生物の内部で起こる活動を指す。
本明細書で使用する「リプログラミング」または「脱分化」または「分化能を高める」または「発生能を高める」という用語は、細胞の多能性を高めるか、または細胞をより小さい分化状態に脱分化させる方法またはプロセスを指す。例えば、細胞の多能性が高められた細胞は、非リプログラミング状態の同じ細胞と比較して、より多くの発生上の可塑性を有している（すなわち、より多くの細胞型に分化できる）。換言すれば、リプログラミングした細胞は、非リプログラミング状態の同じ細胞よりも分化状態が低い細胞である。リプログラミングした細胞と対比して「リプログラミングしている細胞」とは、多能性幹細胞の形態またはＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、ＣＤ３０および／またはＣＤ５０などの安定した内在性多能性遺伝子発現を含む、多能性細胞の特徴を持たずに移行形態（すなわち、形態の変化）を示す、多能性状態へのリプログラミング／脱分化を受けている非多能性細胞を指す。リプログラミングしている細胞の移行形態は、リプログラミング誘導前の開始非多能性細胞と、ならびに胚幹細胞の特徴的な形態を有するリプログラミングした細胞と、区別される。例えば、線維芽細胞をリプログラミングする場合、リプログラミングしている細胞の形態学的変化はＭＥＴ（間葉から上皮への転換）を含む。当業者は、リプログラミングが誘導される様々なタイプの体細胞のこのような移行形態を容易に理解および特定する。いくつかの実施形態では、リプログラミングしている細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８日以上、ただし２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３５、４０日以下の、またはそれらの間の任意の日数の間でリプログラムするように誘導された中間細胞であって、この細胞は自己維持ｓｅｌｆ−ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ）または自己持続的多能性状態になっていないものである。非多能性細胞は、細胞に１つ以上のリプログラミング因子が導入されると、リプログラミングするように誘導される。１、２、３、または４日間リプログラミングするように誘導されたリプログラミングしている細胞は、リプログラミング因子の形質導入後１、２、３、または４日の細胞である（形質導入の日は０日目である）。リプログラミング因子の外因性発現に曝される前の体細胞とは異なり、リプログラミングしている細胞はリプログラミングプロセスを進行させて安定した多能性状態に到達し、十分な時間が与えられている限り、外因性発現リプログラミング因子が存在しなくてもリプログラミングした細胞になる。
本明細書で使用する「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、幹細胞が、中胚葉、内胚葉、および外胚葉の３つ全ての胚葉または皮層の組織に分化できる細胞に誘導または変化されている（すなわち、リプログラミングした）、分化した成人、新生児または胎児細胞から産生されることを意味する。
本明細書で使用される「胚性幹細胞」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊の天然起源の多能性幹細胞を指す。胚性幹細胞は多能性であり、発達中に外胚葉、内胚葉、および中胚葉の３つの主要な胚芽のすべての誘導物を発生させる。それらは、胚体外膜または胎盤に寄与せず、全能性ではない。
本明細書で使用する「多分化能幹細胞」という用語は、３つすべてではなく１つ以上の胚葉（外胚葉、中胚葉および内胚葉）の細胞に分化する発生能を有する細胞を指す。したがって、多分化能細胞は「部分的に分化した細胞」とも呼ばれ得る。多分化能細胞は当技術分野で周知であり、多分化能細胞の例には、例えば造血幹細胞および神経幹細胞などの成体幹細胞が含まれる。「多分化能」は、細胞が特定の系統で多くの種類の細胞を形成する可能性があるが、他の系統の細胞は形成できないことを示す。例えば、多分化能造血細胞は、さまざまな種類の血液細胞（赤血球、白血球、血小板など）を形成できるが、ニューロンを形成することはできない。したがって、「多分化能」という用語は、全能性および多能性よりも低い発生能の程度を有する細胞の状態を指す。
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、細胞が体または体細胞のすべての系統（すなわち、胚本体（ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｐｅｒ））を形成する能力を指す。たとえば、胚性幹細胞は、３つの胚葉、外胚葉、中胚葉、および内胚葉のそれぞれから細胞を形成できる多能性幹細胞の一種である。多能性は、完全な生物を生じさせることができない、不完全または部分的な多能性細胞（例えば、胚盤葉上層幹細胞またはＥｐｉＳＣ）から、完全な生物を生じさせることができるより原始的でより多能性の細胞（例えば、胚性幹細胞）に及ぶ発生能の連続体である。
多能性は、一部には、細胞の多能性特性を評価することにより決定できる。（ｉ）多能性幹細胞の形態、（ｉｉ）無制限の自己再生の可能性、（ｉｉｉ）ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０および／またはＣＤ５０を含むがこれらに限定されない多能性幹細胞マーカーの発現、（ｉｖ）３つの体細胞系統すべて（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力、（ｖ）３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、（ｖｉ）３つの体細胞系統の細胞からなる胚様体の形成、が含まれる。
２種類の多能性が既に記載されており、後期胚盤胞の胚盤葉上層幹細胞（ＥｐｉＳＣ）に似た「プライミングした」または「準安定」状態の多能性および、初期／着床前胚盤胞の内部細胞集団に似た「ナイーブ」または「基底」状態の多能性である。両方の多能性状態は上記のような特徴を示すが、ナイーブまたは基底状態はさらに、（ｉ）雌性細胞におけるＸ染色体の不活性化前または再活性化、（ｉｉ）単一細胞培養中のクローン性と生存率の向上、（ｉｉｉ）ＤＮＡメチル化の全体的な減少、（ｉｖ）発達調節遺伝子プロモーター上のＨ３Ｋ２７ｍｅ３抑制クロマチンマーク沈着の減少、および（ｖ）プライミングした状態の多能性細胞と比較して分化マーカーの減少した発現、を示す。外因性多能性遺伝子が体細胞に導入され、発現され、その後、結果として生じる多能性細胞から発現抑制されまたは取り外される、細胞リプログラミングの標準的な方法論は、一般に、プライミング状態の多能性の特徴を有していると見られている。標準的な多能性細胞培養条件下では、外因性の導入遺伝子の発現が維持されない限り、そのような細胞はプライミング状態のままになり、基底状態の特性が観察される。
本明細書で使用される「多能性幹細胞形態」という用語は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を指す。正常な胚性幹細胞の形態は、丸くコンパクトな形状、高い核対細胞質比、核小体の顕著な存在、および典型的な細胞空間によって特徴付けられる。
「多能性因子」または「リプログラミング因子」とは、細胞の発生能を誘導または高めるために使用される薬剤または薬剤の組み合わせを指す。多能性因子には、細胞の発生能を高めることができるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および小分子が含まれるが、これらに限定されない。例示的な多能性因子には、例えば、転写因子ＯＣＴ４およびＳＯＸ２、ならびに小分子リプログラミング剤、例えばＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤が含まれる。
本明細書で使用される「分化」という用語は、特殊化していない（「コミットしていない」）またはあまり特殊化していない細胞が、例えば血液細胞または筋肉細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した細胞または分化誘導された細胞は、細胞の系統内でより特殊化した（「コミットした」）位置を占めている細胞である。「コミットした」という用語は、分化のプロセスに適用される場合、通常の状況下では特定の細胞型または細胞型のサブセットに分化し続けるポイントまで分化経路中で進行した細胞を指し、通常の状況下では、異なる細胞型に分化すること、または低分化細胞型に戻すことはできない。
多能性幹細胞の分化には、培地の刺激剤や細胞の物理的状態の変化など、培養システムの変更が必要である。最も従来の戦略は、系統特異的分化を開始するための共通かつ重要な中間体として胚様体（ＥＢ）の形成を利用する。「胚様体」は、三次元領域内に多数の系統を生じるため、胚発生を模倣することが示されている三次元クラスターである。通常、数時間から数日、分化プロセスを経て、単純なＥＢ（例えば、分化するように誘発された凝集多能性幹細胞）は成熟を続け、嚢胞性ＥＢに発達し、このとき、通常は数日から数週間、それらはさらに処理されて分化を続ける。ＥＢ形成は、多能性幹細胞を細胞の三次元多層クラスターで互いに近接させることで開始され、通常、これは、多能性細胞を液滴に沈降させること、細胞を「Ｕ」底ウェルプレートに沈降させることなどを含む、いくつかの方法の１つによって、または機械的攪拌によって達成される。多能性培養維持培地で維持された凝集体は適切なＥＢを形成しないため、ＥＢ発生を促進するために、多能性幹細胞凝集体はさらなる分化の合図（ｃｕｅ）を必要とする。そのようなものとして、多能性幹細胞凝集体は、選択された系統に向けて誘発する合図を提供する分化培地に移される必要がある。多能性幹細胞のＥＢベースの培養では、通常、ＥＢ細胞クラスター内での適度な増殖を伴う分化細胞集団（外胚葉、中胚葉、内胚葉の胚葉）が生成される。しかし、細胞分化を促進することが証明されているが、環境からの分化合図への三次元構造内の細胞の一貫性のない暴露により、ＥＢはさまざまな分化状態の異種細胞を生じさせる。さらに、ＥＢは作成と維持が困難である。さらに、ＥＢを介した細胞分化には適度な細胞増殖が伴い、これも低い分化効率に寄与する。
これに対して、「ＥＢ形成」とは異なる「凝集体形成」を使用して、多能性幹細胞由来細胞の集団を拡大することができる。例えば、凝集体ベースの多能性幹細胞の増殖中、増殖と多能性を維持するために培地が選択される。一般に、細胞増殖は凝集体のサイズを増大させて、より大きな凝集体が形成させ、これらの凝集体は、機械的または酵素的に日常的に小さな凝集体に解離して、培養内の細胞増殖を維持し、細胞数を増やすことができる。ＥＢ培養とは異なり、維持培養の凝集体内で培養された細胞は多能性のマーカーを維持する。多能性幹細胞凝集体は、分化を誘導するためにさらなる分化の合図を必要とする。
本明細書で使用される「単層分化」は、細胞の三次元多層クラスターによる分化、すなわち「ＥＢ形成」とは異なる分化方法を指す用語である。本明細書に開示される他の利点の中でも単層分化は、分化開始のためのＥＢ形成の必要性を回避する。単層培養はＥＢ形成などの胚発生を模倣しないため、特定の系統への分化は、ＥＢの３つすべての胚葉分化と比較して最小限と見なされる。
本明細書で使用する場合、「解離した」細胞とは、他の細胞または表面（例えば、培養プレート表面）から離れて実質的に分離または精製された細胞を指す。例えば、機械的または酵素的方法により、細胞を動物または組織から解離させることができる。あるいは、インビトロで凝集する細胞は、クラスター、単一細胞、または単一細胞とクラスターの混合物の懸濁液への解離などにより、酵素的または機械的に互いに解離することができる。さらに別の代替的実施形態では、接着細胞は培養プレートまたは他の表面から解離される。したがって、解離には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および基質（培養表面など）との細胞相互作用の破壊、または細胞間のＥＣＭの破壊が含まれる。
本明細書で使用される「フィーダー細胞」または「フィーダー」は、第２のタイプの細胞と共培養されて、フィーダー細胞が第２の細胞型のサポートのための成長因子と栄養分を提供するため、第２のタイプの細胞が成長できる環境を提供する、１つの型の細胞を説明する用語である。フィーダー細胞は、それらがサポートしている細胞とは異なる種に由来するものであってもよい。例えば、幹細胞を含む特定のタイプのヒト細胞は、マウス胚性線維芽細胞または不死化マウス胚性線維芽細胞の初代培養によってサポートされる。フィーダー細胞は、通常、それらがサポートしている細胞から成長するのを防ぐために、照射またはマイトマイシンなどの抗有糸分裂剤での処理により他の細胞と共培養される場合、不活性化され得る。フィーダー細胞には、内皮細胞、間質細胞（例えば、上皮細胞または線維芽細胞）、および白血病細胞が含まれ得る。前述を制限することなく、１つの特定のフィーダー細胞型は、ヒト皮膚線維芽細胞などのヒトフィーダーであり得る。別のフィーダー細胞型は、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）であり得る。一般に、多能性を維持し、特定の系統への分化を指示し、エフェクター細胞などの特殊化した細胞型への成熟を促進するために、さまざまなフィーダー細胞を部分的に使用できる。
本明細書で使用される「フィーダーフリー」（ＦＦ）環境は、フィーダー細胞を本質的に含まない、および／またはフィーダー細胞の培養によって事前調整していない培養条件、細胞培養または培地などの環境を指す。「事前調整した」培地とは、少なくとも１日などの期間、フィーダー細胞が培地内で培養された後に収集された培地を指す。事前調整した培地は、フィーダー細胞から分泌される増殖因子やサイトカインなど、多くのメディエーター物質を含有している。いくつかの実施形態では、フィーダーフリー環境はフィーダー細胞を含まず、またフィーダー細胞の培養によって事前調整もされていない。フィーダー細胞には、間質細胞、マウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、ケラチン生成細胞、および胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
「培養」または「細胞培養」とは、インビトロ環境での細胞の維持、成長、および／または分化を指す。「細胞培養培地」、「培養培地」（それぞれ単数の「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」）、「サプリメント」および「培地サプリメント」とは、細胞培養を培養する栄養組成物を指す。
「培養する」または「維持する」とは、例えば滅菌プラスチック（またはコーティングされたプラスチック）細胞培養皿またはフラスコで、組織外または体外の細胞を維持、増殖（成長）および／または分化させることを指す。「培養」または「維持すること」は、細胞を増殖および／または維持するのに役立つ栄養素、ホルモン、および／または他の因子の供給源として培地を利用してもよい。
本明細書で使用する「継代」または「継代すること」とは、細胞が所望の程度まで増殖したときに、細胞を複数の細胞培養表面または培養器に細分するおよびプレーティングすることによって培養細胞を分割する行為を指す。いくつかの実施形態では、「継代」または「継代すること」とは、細胞を細分、希釈、およびプレーティングすることを指す。細胞が一次培養表面または培養器から次の表面または容器のセットに継代されるため、本明細書では後続の培養を「二次培養」または「最初の継代」などと呼ぶことがある。新しい培養器に細分およびプレーティングする各行為は、１継代と見なされる。いくつかの実施形態では、培養細胞は、１、２、３、４、５、６、７日以上ごとに継代される。いくつかの実施形態では、リプログラミング後に最初に選択されたｉＰＳＣは、３〜７日ごとに１回継代される。
ｉＰＳＣのゲノム編集または修飾、およびそこから分化した由来非多能性細胞、または非多能性細胞のゲノム編集または修飾、およびそこからリプログラミングされた由来ｉＰＳＣ、の文脈で使用される「機能的」とは、（１）遺伝子レベルでの、成功したノックイン、ノックアウト、ノックダウン遺伝子発現、トランスジェニックまたは制御遺伝子発現、例えば、直接的なゲノム編集または修飾によって、または最初にゲノム操作された開始細胞からの分化またはリプログラミングを介する「伝達（ｐａｓｓｉｎｇ−ｏｎ）」によって達成される所望の細胞発達段階での誘導性または一時的発現、を指すか、または（２）細胞レベルでの、（ｉ）直接ゲノム編集により前記細胞内で得られた遺伝子発現修飾、（ｉｉ）最初にゲノム操作された開始細胞からの分化またはリプログラミング介する「伝達」によって前記該細胞内で維持された遺伝子発現修飾、（ｉｉｉ）前記細胞の初期発生段階でのみ現れるか、分化またはリプログラミングを介して前記細胞を生じさせる開始細胞でのみ現れる、遺伝子発現修飾の結果としての前記細胞における下流遺伝子調節、または（ｉｖ）ｉＰＳＣ、前駆細胞、または脱分化細胞の起源で行われたゲノム編集または修飾から最初に誘導された、成熟細胞産物内に示される強化されたまたは新たに達成された細胞機能または属性、による、細胞機能／特性の成功した除去、追加、または変更、を指す。
本明細書で使用される「遺伝的刷り込み」という用語は、供給源細胞（ｓｏｕｒｃｅ ｃｅｌｌ）またはｉＰＳＣの優先的な治療属性に寄与し、供給源細胞由来のｉＰＳＣ、および／またはｉＰＳＣ由来の非天然造血系細胞に保持可能な遺伝的またはエピジェネティックな情報を指す。本明細書で使用される「供給源細胞」は、リプログラミングを介してｉＰＳＣを生成するために使用できる非多能性細胞であり、供給源細胞由来のｉＰＳＣのは、任意の造血系細胞を含む特定の細胞型にさらに分化し得る。供給源細胞由来のｉＰＳＣ、およびそこから分化した細胞は、状況に応じてまとめて「由来細胞」と呼ばれることがある。本明細書で使用されるように、優先的な治療属性に寄与する遺伝的刷り込み（複数可）は、ドナー、疾患、もしくは治療応答に特異的な選択された供給源細胞をリプログラミングすることによって、またはｉＰＳＣにゲノム編集を使用して遺伝子組み換えモダリティを導入することによってのいずれかでｉＰＳＣに組み込まれている。具体的に選択されたドナー、疾患または治療状況から得られた供給源細胞の態様では、優先的な治療属性に寄与する遺伝的刷り込みは、根底にある分子事象が識別されているかどうかに関係なく、選択された供給源細胞の由来細胞に伝達される、保持可能な表現型、すなわち優先的な治療属性を明示する任意の状況に特異的な遺伝的またはエピジェネティックな修飾を含み得る。ドナー、疾患、または治療応答に特異的な供給源細胞は、ｉＰＳＣおよび由来造血細胞に保持可能な遺伝的刷り込みを含むことができ、遺伝的刷り込みには、例えば、ウイルス特異的Ｔ細胞または不変のナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞からの予め処理された（ｐｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）単一特異性ＴＣＲ、追跡可能で望ましい遺伝子多型、例えば、選択されたドナーの高親和性ＣＤ１６受容体をコードする点突然変異のホモ接合体、および所定のＨＬＡ要件、すなわち、増加した集団のハプロタイプを示す選択されたＨＬＡマッチした（ＨＬＡ−ｍａｔｃｈｅｄ）ドナー細胞が含まれるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、優先的な治療属性には、由来細胞の、改善された生着、輸送、ホーミング、生存率、自己再生、持続性、免疫応答制御および調節、生存、ならびに細胞毒性が含まれる。優先的な治療属性は、抗原ターゲティング受容体発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導と免疫調節、オフ腫瘍効果（ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ）の低減を伴う改善されたオンターゲット特異性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）、化学療法などの治療に対する耐性、にも関連し得る。
本明細書で使用する「遺伝子修飾」は、（１）再編成、突然変異、遺伝的刷り込みおよび／またはエピジェネティックな修飾からの天然に由来するもの、または（２）細胞のゲノムへの挿入、削除または置換によるゲノム工学を通じて得られるものを含む、遺伝子編集を指す。本明細書で使用される遺伝子修飾は、ドナー、疾患、または治療応答に特異的である供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性も含む。
本明細書で使用される「増強された治療特性」という用語は、同じ一般的な細胞型の典型的な細胞と比較して増強された細胞の治療特性を指す。免疫細胞の文脈において、例えば、「増強された治療特性」を有するＮＫ細胞は、典型的な、未修飾の、および／または天然起源のＮＫ細胞と比較して、増強、改善、および／または拡大された治療特性を有するであろう。免疫細胞の治療特性には、細胞生着、輸送、ホーミング、生存率、自己再生、持続性、免疫応答制御と調節、生存、細胞毒性が含まれるが、これらに限定されない。免疫細胞の治療特性は、抗原ターゲティング受容体発現、ＨＬＡの提示またはその欠如、腫瘍微小環境に対する耐性、バイスタンダー免疫細胞の誘導と免疫調節、オフ腫瘍効果の低減を伴う改善されたオンターゲット特異性、化学療法などの治療に対する耐性によっても明らかである。
「組み込み」とは、構築物の１つ以上のヌクレオチドが細胞ゲノムに安定して挿入されること、すなわち、細胞の染色体ＤＮＡ内の核酸配列に共有結合されることを意味する。「標的化された組み込み」とは、構築物のヌクレオチド（複数可）が細胞の染色体またはミトコンドリアＤＮＡの事前に選択された部位または「組み込み部位」に挿入されることを意味する。本明細書で使用される「組み込み」という用語は、組み込み部位での内在性配列またはヌクレオチドの欠失を伴うまたは伴わない、構築物の１つ以上の外因性配列またはヌクレオチドの挿入を包含するプロセスをさらに指す。挿入部位に欠失がある場合、「組み込み」は、１つ以上の挿入されたヌクレオチドで削除される内在性配列またはヌクレオチドの置換をさらに含んでもよい。
「構築物」とは、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子または分子の複合体を指す。本明細書で使用される「ベクター」とは、複製および／または発現することができる標的細胞への外来遺伝物質の送達または移入を指示することができる任意の核酸構築物を指す。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、送達される構築物を含む。ベクターは、線状または環状分子である。ベクターは、組み込みまたは非組み込み可能である。ベクターの主要な種類には、プラスミド、エピソームベクター、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「コードする」という用語は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列およびそれから生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のためのテンプレートとして役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生体システムでタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているコーディング鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用される非コーディング鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質またはその他の産物をコードするものと呼ぶことができる。
本明細書で使用される「外因性」という用語は、参照分子または参照活性が宿主細胞に導入されることを意味することを意図している。分子は、例えば、宿主染色体への組み込みなどにより、またはプラスミドなどの非染色体遺伝物質として、コード化核酸を宿主遺伝物質に導入することにより導入することができる。したがって、コード化核酸の発現に関して使用される用語は、細胞への発現可能な形態のコード化核酸の導入を指す。「内在性」という用語は、宿主細胞に存在する参照分子または活性を指す。同様に、この用語は、コード化核酸の発現に関して使用される場合、細胞内に含有され、外因的に導入されないコード化核酸の発現を指す。
本明細書で使用する「目的の遺伝子」または「目的のポリヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ＲＮＡに転写され、場合によってはポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。目的の遺伝子またはポリヌクレオチドには、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、目的の遺伝子は、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、天然のポリペプチド（すなわち、自然界に見られるポリペプチド）またはその断片、をコードし得る。バリアントポリペプチド（すなわち、天然ポリペプチドと１００％未満の配列同一性を有する天然ポリペプチドの変異体）またはその断片、操作したポリペプチドまたはペプチド断片、治療用のペプチドまたはポリペプチド、イメージングマーカー、選択可能なマーカーなど、をコードし得る。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドもしくはそれらの類似体の任意の長さのヌクレオチドの重合形態を指す。ポリヌクレオチドの配列は、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）で構成されている。ポリヌクレオチドには、遺伝子または遺伝子断片（プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグなど）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離したＤＮＡ、任意の配列の単離したＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーを含むことができる。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖と一本鎖の両方の分子も指す。
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基を有する分子を指す。ポリペプチドには少なくとも２つのアミノ酸を含有している必要があり、ポリペプチドの最大アミノ酸数に制限はない。本明細書で使用する用語は、例えば当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ポリペプチド、組み換えポリペプチド、合成ポリペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
「作動可能に連結された」とは、一方の機能が他方によって影響されるように、単一の核酸断片上の核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列または機能的ＲＮＡの発現に影響を与えることができる場合（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列または機能的ＲＮＡと作動可能に連結される。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで調節配列に作動可能に連結することができる。
本明細書で使用される場合、「エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ）」という用語は、免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球と、腫瘍細胞との間に連結を形成して、免疫細胞を活性化することができる分子、例えば融合ポリペプチドを指す。エンゲージャーの例には、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、二重特異性キラー細胞エンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラー細胞エンゲージャー、または多重特異性キラー細胞エンゲージャー、または複数の免疫細胞型と互換性のあるユニバーサルエンゲージャーが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「表面トリガー受容体」という用語は、免疫応答、例えば細胞傷害性応答を誘発または開始することができる受容体を指す。表面トリガー受容体は操作することができ、エフェクター細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球において発現できる。いくつかの実施形態において、表面トリガー受容体は、エフェクター細胞の天然受容体および細胞型とは無関係に、エフェクター細胞と特定の標的細胞、例えば腫瘍細胞との間の二重または多重特異性抗体の関与を促進する。このアプローチを使用して、ユニバーサル表面トリガー受容体を含むｉＰＳＣを生成し、そのようなｉＰＳＣを、ユニバーサル表面トリガー受容体を発現する様々なエフェクター細胞型の集団に分化させることができる。「ユニバーサル」とは、細胞型に関係なく、表面トリガー受容体を任意のエフェクター細胞で発現および活性化でき、ユニバーサル受容体を発現するすべてのエフェクター細胞が、エンゲージャーの腫瘍結合特異性に関係なく、表面トリガー受容体により認識可能な同じエピトープを有するエンゲージャーに結合または連結できることを意味する。いくつかの実施形態では、同じ腫瘍ターゲティング特異性を有するエンゲージャーが、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するのに使用される。いくつかの実施形態では、異なる腫瘍ターゲティング特異性を有するエンゲージャーが、ユニバーサル表面トリガー受容体と結合するのに使用される。そのため、１つまたは複数のエフェクター細胞型を関与させて、１つの特定の種類の腫瘍細胞を死滅させる場合もあれば、２種類以上の腫瘍を死滅させる場合もある。表面トリガー受容体は一般に、エフェクター細胞活性化のための共刺激ドメインと、エンゲージャーのエピトープに特異的な抗エピトープを含む。二重特異性エンゲージャーは、一方の端で表面トリガー受容体の抗エピトープに特異的であり、他方の端で腫瘍抗原に特異的である。
本明細書で使用される「安全スイッチタンパク質」という用語は、細胞療法の潜在毒性またはその他の有害作用を防ぐように設計された操作したタンパク質を指す。場合によっては、安全スイッチタンパク質の発現を条件付きで制御して、安全スイッチタンパク質をコードする遺伝子をそのゲノムに永続的に組み込んだ移植された操作した細胞の安全性の懸念に対処する。この条件付き調節は可変であり得、小分子を介した翻訳後活性化および組織特異的および／または一時的な転写調節による制御が含まれ得る。安全スイッチは、アポトーシスの誘導、タンパク質合成の阻害、ＤＮＡ複製、成長停止、転写および転写後の遺伝的調節、および／または抗体媒介枯渇を媒介する可能性がある。いくつかの例では、安全スイッチタンパク質は、活性化されると、アポトーシスおよび／または治療細胞の細胞死を引き起こす、外因性分子、例えばプロドラッグによって活性化される。安全スイッチタンパク質の例には、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３または７）のような自殺遺伝子、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、修飾ＥＧＦＲ、およびそれらの任意の組み合わせなどが含まれるが、これらに限定されない。この戦略では、有害事象の発生時に投与されるプロドラッグは、自殺遺伝子産物によって活性化され、形質導入細胞を死滅させる。
本明細書で使用される「薬学的に活性なタンパク質またはペプチド」という用語は、生物に対して生物学的および／または薬学的効果を達成することができるタンパク質またはペプチドを指す。薬学的に活性なタンパク質は、病気に対する治癒的または緩和的な特性を有しており、病気の重症度を寛解、緩和、和らげ、逆転または軽減させるために投与することができる。薬学的に活性なタンパク質は予防的性質も有しており、疾患の発症を予防するため、または発症した場合、そのような疾患または病状の重症度を軽減させるために使用される。薬学的に活性なタンパク質には、タンパク質またはペプチド全体またはその薬学的に活性な断片が含まれる。また、タンパク質またはペプチドの薬学的に活性な類似体、またはタンパク質またはペプチドの断片の類似体も含まれる。薬学的に活性なタンパク質という用語はまた、治療的利益を提供するために協同的または相乗的に作用する複数のタンパク質またはペプチドも指す。薬学的に活性なタンパク質またはペプチドの例には、受容体、結合タンパク質、転写および翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質、抗体またはその断片、成長因子、および／またはサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「シグナル伝達分子」という用語は、細胞シグナル伝達を調節、関与、阻害、活性化、減少、または増加させる任意の分子を指す。シグナル伝達とは、最終的に細胞内で生化学的事象を引き起こす経路に沿ったタンパク質複合体の動員による化学修飾の形での分子シグナルの伝達を指す。シグナル伝達経路は当技術分野で周知であり、Ｇタンパク質共役受容体シグナル伝達、チロシンキナーゼ受容体シグナル伝達、インテグリンシグナル伝達、トールゲートシグナル伝達、リガンド依存性イオンチャネルシグナル伝達、ＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ｃＡＭＰ依存性経路、およびＩＰ３／ＤＡＧシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「ターゲティングモダリティ」という用語は、細胞に遺伝的に組み込まれて抗原および／またはエピトープ特異性を促進する分子、例えばポリペプチドを指し、この特異性には、ｉ）それが独特のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に関連する抗原特異性、ｉｉ）それがモノクローナル抗体または二重特異性エンゲージャーに関連するエンゲージャー特異性、ｉｉｉ）形質転換細胞のターゲティング、ｉｖ）がん幹細胞のターゲティング、ｖ）特異的抗原または表面分子がない場合のその他のターゲティング戦略、が含まれるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、用語「特異的」または「特異性」は、非特異的または非特異的結合とは対照的に、標的分子に選択的に結合する分子、例えば受容体またはエンゲージャーの能力を指す。
ＨＬＡクラスＩ欠損、ＨＬＡクラスＩＩ欠損、またはその両方を含む「ＨＬＡ欠損」とは、ＨＬＡクラスＩタンパク質ヘテロダイマーおよび／またはＨＬＡクラスＩＩヘテロダイマーを含む完全なＭＨＣ複合体の表面発現レベルが欠如しているか、もはや維持されていないか、レベルが低下しており、このため減少または減少したレベルが、他の細胞によってまたは合成方法よって本来的に検出可能なレベルよりも低くなる、細胞を指す。ＨＬＡクラスＩ欠損症は、ＨＬＡクラスＩ遺伝子座（染色体６ｐ２１）の任意の領域の機能的欠失、または、ベータ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、ＴＡＰ １遺伝子、ＴＡＰ ２遺伝子およびタパシンを含むが、これに限定されない、ＨＬＡクラスＩ関連遺伝子の発現レベルの欠失もしくは減少によって構築され得る。ＨＬＡクラスＩＩ欠損症は、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５およびＲＦＸＡＰを含むがこれらに限定されないＨＬＡ−ＩＩ関連遺伝子の機能的欠失または減少によって構築され得る。本発明以前には、ＨＬＡ複合体欠損ｉＰＳＣまたは改変ｉＰＳＣが、調節された活性を保持しながら、発達し、成熟し、機能的分化細胞を生成する能力を有するかどうかは不明であった。さらに、本発明以前には、ＨＬＡ複合体欠損分化細胞をｉＰＳＣに再プログラムし、ＨＬＡ複合体欠損を有しながら多能性幹細胞として維持できるかどうかは不明であった。細胞のリプログラミング、多能性の維持および分化中の予期しない失敗は、発達段階の特異的遺伝子発現もしくはその欠如、ＨＬＡ複合体の提示の要件、導入された表面発現モダリティのタンパク質脱落、適切なおよび効率的なクローンのリプログラミングの必要性、および分化プロトコルの再構成の必要性、を含むがこれらに限定されない態様に関連している可能性がある。
本明細書で使用される「修飾ＨＬＡ欠損ｉＰＳＣ」は、改善された分化能、抗原ターゲティング、抗原提示、抗体認識、持続性、免疫回避、耐性に対する抑制、増殖、共刺激、サイトカイン刺激、サイトカイン産生（オートクリンまたはパラクリン）、走化性、および非古典的なＨＬＡクラスＩタンパク質（例えば、ＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇ）などの細胞毒性、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＢＣＬ１１ｂ、ＮＯＴＣＨ、ＲＵＮＸ１、ＩＬ１５、４１ＢＢ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２４、ＣＤ３ｚ、４１ＢＢＬ、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、およびＰＤＬ１、に関連するがこれに限定されないタンパク質を発現する遺伝子を導入することによってさらに修飾されるＨＬＡ欠損ｉＰＳＣを指す。「修飾ＨＬＡ欠損」である細胞には、ｉＰＳＣ以外の細胞も含まれる。
ＦｃＲと略される「Ｆｃ受容体」は、認識する抗体の種類に基づいて分類される。例えば、最も一般的なクラスの抗体であるＩｇＧに結合するものはＦｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）と呼ばれ、ＩｇＡに結合するものはＦｃ−アルファ受容体（ＦｃαＲ）と呼ばれ、ＩｇＥに結合するものはＦｃ−イプシロン受容体（ＦｃεＲ）と呼ばれる。ＦｃＲのクラスは、それらを発現する細胞（マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、ＴおよびＢ細胞）および各受容体のシグナル伝達特性によっても区別される。Ｆｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）など、分子構造が異なるため抗体親和性が異なるいくつかのメンバーが含まれる。
ＣＤ１６は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）の２つのアイソフォームとして同定されている。ＣＤ１６ａはＮＫ細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、標的細胞に付着した単量体ＩｇＧに結合してＮＫ細胞を活性化し、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を促進する。本明細書で使用される「高親和性ＣＤ１６」、「非切断性ＣＤ１６」、または「高親和性非切断性ＣＤ１６」は、ＣＤ１６のバリアントを指す。野生型ＣＤ１６は親和性が低く、ＮＫ細胞の活性化時に、白血球上の様々な細胞表面分子の細胞表面密度を制御するタンパク質分解的切断プロセスであるエクトドメイン（ｅｘｔｏｄｏｍａｉｎ）脱落の影響を受ける。Ｆ１７６ＶおよびＦ１５８Ｖは、高い親和性を有する例示的なＣＤ１６バリアントであり、一方、Ｓ１９７Ｐバリアントは、ＣＤ１６の非切断性バージョンの例である。
本明細書で使用される「養子細胞療法」という用語は、本明細書で使用される場合、自己または同種リンパ球の輸血に関する細胞ベースの免疫療法であって、リンパ球が、遺伝子組み換えされているか否かにかかわらず、前記輸血前にエクスビボで増加されている、ＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または、免疫制御性細胞などであるものである。
本明細書で使用される「治療上十分な量」は、その意味内に、所望の治療効果を提供することに言及している特定の治療および／または薬学的組成物の非毒性であるが十分かつ／または有効量を含む。必要な正確な量は、患者の全般的な健康状態、患者の年齢、病状の段階と重症度などの要因に応じて、対象ごとに異なる。特別な実施形態では、治療的に十分な量は、治療される対象の疾患または状態に関連する少なくとも１つの症状を寛解、減少、および／または改善させるのに十分および／または有効である。
本明細書で使用される「対象」という用語は、任意の動物、好ましくはヒト患者、家畜、または他の家畜動物を指す。
本明細書で使用する「治療する」、「治療」などの用語は、治療的治療を必要とする対象に関して使用する場合、疾患の症状の改善または排除を達成することを含むがこれに限定されない、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に防止する観点で予防的であり得、および／または症状の改善もしくは排除を達成する、または疾患および／またはその疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒を提供する観点で治療的であり得る。「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトの疾患の治療を含み、（ａ）疾患の素因となり得るが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患が発生するのを防ぐこと、（ｂ）病気を抑制する、またはその発生を阻止すること、（ｃ）疾患を緩和する、または疾患の退行を引き起こす、または疾患の症状を完全にまたは部分的に排除すること、（ｄ）造血系を再構成するなど、個体を病前状態に回復させること、を含む。
Ｉ．新規のリプログラミングシステムとそこから生成される細胞
一般に、本開示は、非多能性細胞と少なくとも１つのリプログラミング因子とを、任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の組み合わせ（ＦＲＭ、表１）の存在下で接触させることにより、開始されるリプログラミングプロセスを提供する。
本発明の一態様は、一過性かつ一時的な導入遺伝子発現を媒介するプラスミドシステムを使用して、フットプリントフリーのｉＰＳＣを得る方法を提供する。このプラスミドシステムは、複製起点およびリプログラミング因子（複数可）をコードするがＥＢＮＡを含まないポリヌクレオチドを保有する１つ以上の第１のプラスミド（Ｖ１）と、ＥＢＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むが複製起点またはリプログラミング因子コード化配列を含まない第２のプラスミド（Ｖ２）とを含む。
プラスミドの組み合わせにより、形質導入時に細胞内で一時的に導入遺伝子（ＥＢＮＡおよび外因性リプログラミング因子）の細胞質発現が可能になり、移行性形態または形態的変化（例えば間葉から上皮へ転換（ＭＥＴ））を示すが、ＯＣＴ４などの多能性細胞の形態または内在性の多能性遺伝子発現を欠く、ＥＢＮＡを含まない中間細胞の集団で、まだ安定した自己持続的多能性状態に入ることができるものが生成される。したがって、この明確な細胞集団は「リプログラミング細胞」と呼ばれる。本明細書に記載のリプログラミング細胞はまた、形態的だけでなく機能的にも、リプログラミング因子の導入前の体細胞とは異なり、リプログラミングプロセス（例えば、ＦＭＭ）をサポートする培養条件下で、十分な時間を与えれば、多能性状態にリプログラミングすることができる。したがって、本開示の一態様は、移行形態を有し、リプログラミングプロセスを実行して安定な多能性状態を確立することができるＥＢＮＡを含まないリプログラミング細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＥＢＮＡを含まないリプログラミング細胞は導入遺伝子を含まない。そのため、結果として得られるｉＰＳＣ集団とｉＰＳＣは、ＥＢＮＡに対する選択や、エピソームリプログラミングで必要なＥＢＮＡと導入遺伝子を排除するための連続継代を必要としない、フットプリントフリーである。さらに、この一過性かつ一時的な短命プラスミドシステムを使用して生成されたｉＰＳＣには、クローン性および遺伝的安定性の向上、高い均質性、高い正常核型率、最小限の復帰または自発的分化などの特性の少なくとも１つを有し、フィーダー条件の有無にかかわらず、単一細胞の生存および選別、長期的な増加および自己再生、単層分化が可能である。
ｉＰＳＣを生成するために、外因的に導入されたリプログラミング因子を少なくとも１０−１２日間発現させる必要があることは、この分野で一般に受け入れられている（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；３２２：９４９−９５３、Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２００８）；２（２）：１５１−１５９、Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２００８）；２（３）：２３０−２４０）。外因性転写因子のアデノウイルス形質導入には、非組み込みウイルスベクターによって媒介される遺伝子発現の一過性の性質のため、繰り返しトランスフェクションが必要な場合がある。さらに、アデノウイルス法を使用するリプログラミング効率は、マウスではわずか０．００１〜０．０００１％（Ｓｔａｄｔｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；３２２：９４５−９４６）、ヒト細胞では０．０００２％（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００９）；２７：２６６７−２６７４）である。センダイウイルスベクター媒介リプログラミングの場合、このウイルスベクターは長期間にわたって大量の外因性タンパク質を連続的に産生して多能性を維持するために導入遺伝子発現に特定の依存性を生成することができるため、複数の形質導入は必要ない。センダイウイルスは、新生児および成人の線維芽細胞と血球を約２５日で０．１％〜１％の高い効率でリプログラミングできる。ただし、最近リプログラミングされたｉＰＳＣからウイルスが完全に失われるには、約１０継代がかかり、これは、ＤＮＡ組み込みの可能性の増加、または多能性遺伝子の内在性回路ではなく導入遺伝子発現によってサポートされるｉＰＳＣ様クローンの選択の増加を含む、センダイベースのリプログラミングの欠点とみなされる（Ｆｕｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．（２００９）；８５：３４８−３６２、Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１０）；７：１１−１４、Ｂａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０１１）；１０８：１４２３４−１４２３９）。
プロモーターと導入遺伝子（複数可）を含有するプラスミドは、核内への取り込みが悪く、複製可能ではなく、トランスフェクトされた細胞から急速に失われる。ｉＰＳ細胞を生成するために使用した場合、ミニサークルＤＮＡベクター（細菌ＤＮＡを含まない、最小プラスミド）を含むプラスミドベクターは、フィーダー条件下で許容できないほど低い効率でリプログラミングした細胞を生じ、毎日のトランスフェクションを繰り返したことによってのみ、効率的なリプログラミングが見られるが、多くの場合、トランスフェクトされた導入遺伝子の宿主ゲノム組み込みが生じる（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；３２２：９４９−９５３：毎日のトランスフェクションを繰り返して標準プラスミドを使用し、ゲノム組み込みを観察した；１０Ｅ６個の細胞から１〜４個の組み込みのないクローンを得た；Ｎａｒｓｉｎｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．（２０１１）；６（１）：７８−８８：約０．００５％の効率である）。
プラスミドと比較して、エピソームは細胞質内で自律的か、または分裂している宿主細胞の染色体とともに維持および複製できる。エピソームベクター媒介細胞のリプログラミングは、主にエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクターの適用に示される。目的の外因性遺伝子（複数可）に加えて、ＥＢＶベースのエピソームベクターは、エプスタイン−バー核抗原−１（ＥＢＮＡ１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ＥＢＶに由来する複製起点（ｏｒｉＰ）を保有する。ＥＢＮＡは細胞染色体に結合し、ベクターの核局在化とｏｒｉＰの姉妹染色分体へのテザリングを可能にする。したがって、安定的に発現されたＥＢＮＡはｏｒｉＰと共同して、分裂細胞の核内でエピソームベクターを複製および保持し、細胞内のＥＢＮＡを含む外因性遺伝子の安定的な長期発現を提供し、エピソームベクターは通常約４〜８週間持続するため、導入遺伝子組み込みの可能性を高める（Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，１９８５、Ｒｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５、Ｓｕｇｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５）。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡエピソームベクターは、プラスミドのリプログラミングと比較してリプログラミング効率を改善するが、それでも０．００６％〜０．１％の不満足な範囲である（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２０１３）；９９７：２３−３３）。
ＥＢＮＡが複製および転写されるｏｒｉＰと同じベクターで連続的にＥＢＮＡを発現する以外に、ＥＢＮＡコード化配列を宿主細胞のゲノムに組み込んで、ｏｒｉＰおよび導入遺伝子を含有するベクターのトランスフェクション率を向上させる安定的に発現するＥＢＮＡも提供できる（Ｍａｚｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ；２０４：１４３−１５１）。しかし、このような設計は、細胞をさらに操作することなく、最終的にフットプリントフリーの多能性細胞を得るという目的を達成できない。
いくつかの実施形態では、本リプログラミングシステムは、少なくとも１つの第１のプラスミドおよび少なくとも１つの第２のプラスミドを含み、第１のプラスミドは、ｏｒｉＰと１つ以上のリプログラミング因子を提供するが、ＥＢＮＡを提供しない構築物を有し、第２のプラスミドは、ＥＢＮＡを提供するが、ｏｒｉＰまたはリプログラミング因子を提供しない構築物を有する。いくつかの実施形態では、リプログラミングシステムは２つ以上の第１のプラスミドを含み、各第１のプラスミドは同じまたは異なるリプログラミング因子またはそれらの組み合わせを提供する。このプラスミドシステムを使用するリプログラミングは、この分野で知られている従来のプラスミドのリプログラミング方法とは異なり、細胞への複数のトランスフェクション、導入遺伝子のゲノム組み込みは不要であり、しかも非常に高いリプログラミング効率を備えている。ＥＢＮＡとリプログラミング因子（複数可）が同じ発現カセットに配置され、同じベクターにｏｒｉＰが存在するエピソームリプログラミングと比較して、いくつかの実施形態のプラスミドシステムは、ＥＢＮＡ複製および／または核内のＥＢＮＡおよび導入遺伝子の連続発現を提供しないが、ただし、短期間、かつ多能性細胞形態の出現およびＯＣＴ４などの内在性多能性遺伝子の誘導発現の前の一過性／細胞質発現を可能にする。したがって、本開示は、エピソームの再プログラミングでフットプリントのないｉＰＳＣを取得するためのｉＰＳＣのポジティブセレクションまたは連続継代を除外する、初期段階（例えば、通常２１〜３２日のリプログラミングプロセスのトランスフェクション後４〜６日前後）でＥＢＮＡ発現のないリプログラミング細胞から生成されるフットプリントフリーのｉＰＳＣを提供する。いくつかの実施形態では、ＥＢＮＡ発現ための短期間は、トランスフェクション後約４、５、６、７、または８日であるが、トランスフェクション後１４、１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２２、２３、２４または２５日以下である。
複製起点（ｏｒｉＰ）は、ＤＮＡ複製が開始する部位またはその近くの部位であり、２つのシス作用配列：ＦＲ（繰り返しのファミリー）、これはＥＢＮＡ（エプスタイン−バー核抗原）−結合部位として、またシスのプロモーターについての転写エンハンサーとしても機能する、およびＤＳ（２分子対称性要素）、これはＦＲのＥＢＮＡ時のＤＮＡ合成の開始のためのもので、宿主細胞複製システムによって制御される、で構成される。ＦＲサイトへのＥＢＮＡの結合は、細胞周期ごとに１回複製した後のｏｒｉＰプラスミドの効率的な分配に影響し、ｏｒｉＰプラスミドを核に局在化させ、親細胞分裂時に両方の娘細胞でプラスミドの保持を維持する。一実施形態では、ｏｒｉＰは、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスまたはヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスの複製起点であり得る。いくつかの実施形態では、ｏｒｉＰは、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、またはＧａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅウイルスの複製起点であり得る。いくつかの他の実施形態では、ｏｒｉＰは、ＳＶ４０、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、またはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の複製起点であり得る。一実施形態では、ｏｒｉＰは、ＥＢＶの野生型複製起点に対応するか、または由来する。一実施形態では、ＥＢＮＡは、ＥＢＶのＥＢＮＡ−１に対応する野生型タンパク質に対応するポリペプチドまたは誘導体である（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受入番号：Ｐ０３２１１；配列番号１）。ＥＢＮＡ−１の誘導体は、対応する野生型ポリペプチドと比較して、ＥＢＮＡ−１の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入または置換を含む修飾アミノ酸配列を有するポリペプチドである。一実施形態では、ＥＢＮＡの誘導体は、野生型ＥＢＮＡと比較してトランケーションを含む。一実施形態では、トランケートしたＥＢＮＡタンパク質は配列番号２のポリペプチドを有する。他の実施形態では、ＥＢＮＡ−１の誘導体は、ＥＢＮＡ−１の残基約１〜約９０、残基１〜約４０、残基約４１〜約９０、残基約９１〜約３２４（ＧＡリッチリピート領域）、残基約３２５〜約３７７、残基約３７８〜約３８６、残基約４５１〜約６０８、および／または残基約６０９〜約６４１と、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする。
この分野での幹細胞のリプログラミングで知られているリプログラミング因子はすべて、本リプログラミングシステムおよび方法で使用できる。一実施形態では、リプログラミング因子には、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、およびＬ１ＴＤ１が含まれるが、これらに限定されない。これらのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、ｏｒｉＰを含有するがＥＢＮＡを含まない同じプラスミド構築物（すなわち、同じ第１のプラスミド）に含まれてもよい。これらのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、それぞれがｏｒｉＰを含有するがＥＢＮＡを含まない少なくとも２つのプラスミド構築物（すなわち、複数の第１のプラスミド）に含まれ得る。これらのリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドは、ポリシストロン性構築物（すなわち、１つのプロモーターによって制御される複数のコード配列）または非ポリシストロン性構築物（一部は１つのプロモーターによって制御され、一部は異なるプロモーターによって制御される複数のコード配列）に含まれてもよい。プロモーターは、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、および構成的、誘導的、内因的に制御された、または時間特異的、組織特異的もしくは細胞型特異的な他の適切なプロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターはＣＡＧである。別の実施形態では、プロモーターはＥＦ１αである。いくつかの実施形態では、ポリシストロン性構築物は、単一のオープンリーディングフレーム（例えば、２Ａなどの自己切断性ペプチドコード化配列によって複数のコード配列が機能的に連結されている）または複数のオープンリーディングフレーム（例えば、内部リボソームエントリーサイト、またはＩＲＥＳによって連結された複数のコード配列）を提供できる。
本出願のプラスミドシステムのいくつかの実施形態では、１つ以上のプラスミド構築物（第１のプラスミド）は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、およびＬ１ＴＤ１からなる群から選択される１つ以上のリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを集合的に含む。いくつかの実施形態では、ただ１つの第１のプラスミド構築物のみがシステム内にあり、選択されたすべてのリプログラミング因子を提供する。いくつかの他の実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子を提供する２つ以上の第１のプラスミド構築物があり、各構築物はポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーによりコードされる同じまたは異なるリプログラミング因子を含む。一実施形態では、システム内の１つ以上の第１のプラスミド構築物は、少なくともＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、１つ以上の第１のプラスミド構築物は、ＯＣＴ４をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチドを集合的に含む。別の実施形態では、１つ以上の第１のプラスミド構築物は、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２をコードするポリヌクレオチドを集合的に含む。一実施形態では、１つ以上の第１のプラスミド構築物は、ＯＣＴ４をコードするがｃ−ＭＹＣをコードしない少なくとも１つのポリヌクレオチドを集合的に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の第１プラスミド構築物は、ＯＣＴ４をコードする少なくとも２つのポリヌクレオチド、およびＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、およびＬ１ＴＤ１のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを集合的に含む。
第１のプラスミド構築物がリプログラミング因子をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含む場合、隣接するポリヌクレオチドは、自己切断性ペプチドまたはＩＲＥＳをコードするリンカー配列により作動可能に連結される。自己切断性ペプチドは２Ａペプチドであってもよい。２Ａペプチドは、ＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）、ＥＲＡＶ（ウマ鼻炎Ａウイルス）、ＰＴＶ−１（ブタテスコウイルス−１）、またはＴａＶ（トーシーアシグナウイルス（ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ ｖｉｒｕｓ））に由来するものでよく、これらはそれぞれＦ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＴ２Ａと呼ばれる。第１のプラスミド構築物中の複数の２Ａペプチドは同じでも異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、２つの最も近くに隣接する２Ａペプチドは異なり、例えば、ＲＦ−２Ａ１−ＲＦ−２Ａ２−ＲＦ−２Ａ１であり、ここで２Ａ１と２Ａ２は異なる。
第１のプラスミド構築物のライブラリを事前構築することができ、各構築物は、リプログラミング因子の様々な数、種類、および／または組み合わせをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有する。リプログラミングは、待ち時間が長く、非効率的で確率的なプロセスであることが知られている。発現のタイミングとレベル、およびリプログラミング因子の化学量論は、リプログラミングのさまざまな段階でのリプログラミング動態を促進させ、リプログラミングを受けている細胞の中間状態がリプログラミングの完了を決定する。リプログラミング因子の化学量論はまた、リプログラミング効率に影響し、プライミングした状態対基底状態の多能性などのさまざまな品質のｉＰＳＣ、およびｉＰＳＣのクローン性、自己再生、均質性、および多能性の維持（自発的分化とは対照的）などの関連する生物学的特性を生成する。化学量論は、反応プロセスにおける試薬間の定量的関係を測定し、特定の反応に必要な試薬の量、および時には生成される生成物の量を決定するために使用される。化学量論は、化学量論量の試薬または化学量論比の試薬の両方を考慮し、これは反応を完了するための最適な量または試薬（複数可）の比率である。本出願の一態様は、１つ以上の第１のプラスミドをライブラリから好都合に選択し、様々うまく組み合わせ（ｍｉｘ−ａｎｄ−ｍａｔｃｈｅｄ）、用量調整、および同時トランスフェクトすることにより、リプログラミング因子の化学量論を評価または利用するシステムおよび方法を提供する。
本リプログラミングシステムの第２のプラスミドは、プロモーターおよびＥＢＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを提供し、発現カセットも第２のプラスミドもリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない。第２のプラスミドに含まれるプロモーターは、例えば、ＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、および構成的、誘導的、内因的に制御された、または時間特異的、組織特異的もしくは細胞型特異的な他の適切なプロモーターであり得る。一実施形態では、プロモーターはＣＡＧである。別の実施形態では、プロモーターはＥＦ１αである。上記の少なくとも１つの第１プラスミドと第２プラスミドの組み合わせで非多能性細胞を同時トランスフェクトすることにより、スタンドアロンのＥＢＮＡとｏｒｉＰが少なくとも１つのリプログラミング因子とともに非多能性細胞に導入され、リプログラミングを開始する。
いくつかの実施形態では、リプログラミングは、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む小分子化合物の組み合わせの存在下で開始され、ｉＰＳＣは十分な期間後に生成される。いくつかの実施形態では、リプログラミングは、フィーダーフリー条件下で行われる。特別な実施形態では、フィーダーフリー環境は、ヒトフィーダー細胞を本質的に含まず、マウス胚性線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、ケラチノサイト、および胚性幹細胞を含むがこれらに限定されないフィーダー細胞によって事前調整されない。
いくつかの実施形態では、約７〜３５、１０〜３２、１５〜３１日間、約１７〜２９日間、約１９〜２７日間、または約２１〜約２５日間誘導された後の細胞は、細胞が単一細胞の懸濁液に解離されるように酵素的または機械的手段のいずれかによって、任意選択的に解離にかけられる。解離細胞は、細胞を維持するため、または細胞選別を実行するための任意の適切な溶液または培地に再懸濁され得る。いくつかの実施形態では、単一解離細胞の懸濁液はＲＯＣＫ阻害剤を含む。いくつかの他の実施形態では、単一解離細胞の懸濁液は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む。特別な実施形態では、単一細胞の懸濁液は、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲｏｃｋ阻害剤を含有し、ＴＦＧβ阻害剤を欠く。特定の実施形態では、ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１であり、ＭＥＫ阻害剤はＰＤ０３２５９０１であり、および／またはロック阻害剤はチアゾビビンである。
いくつかの実施形態では、単一解離細胞の懸濁液をさらに選別することができる。一実施形態では、濃縮は、比較的短い時間でクローンｉＰＳＣコロニーを誘導する方法を提供し、それによりｉＰＳＣ生成の効率を改善する。濃縮は、多能性のマーカーを発現する細胞を特定および取得することにより、細胞の集団を選別し、それにより、濃縮された多能性細胞の集団を取得することを含み得る。追加の濃縮方法論は、分化、非リプログラミング細胞または非多能性細胞のマーカーを発現する細胞の枯渇を含む。いくつかの実施形態では、選別のための細胞は多能性細胞である。いくつかの実施形態では、選別のための細胞はリプログラミング細胞である。いくつかの実施形態では、選別のための細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８日以上、ただし２５、２６、２８、３０、３２、３５、４０日以内、またはその間の任意の日数間リプログラミングするように誘導されている。いくつかの実施形態では、選別のための細胞は、約２１〜２５日間、約１９〜２３日間、約１７〜２１日間、約１５〜約１９、または約１６〜約１８日間リプログラミングするように誘導されている。
細胞は、磁気ビーズまたはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）選別など、細胞を選別する適切な方法で選別できる。細胞は、ＳＳＥＡ３／４、ＴＲＡ１−６０／８１、ＴＲＡ１−８５、ＴＲＡ２−５４、ＧＣＴＭ−２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミニン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＳＳＥＡ１（マウス）、ＣＤ３０、ＳＳＥＡ５、ＣＤ９０および／またはＣＤ５０の発現を含むがこれらに限定されない１つ以上の多能性のマーカーに基づいて選別することができる。様々な実施形態において、細胞は、多能性のマーカーの少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つに基づいて選別される。特定の実施形態では、細胞はＳＳＥＡ４の発現に基づいて選別され、特定の特別な実施形態では、ＴＲＡ１−８１および／またはＴＲＡ１−６０と組み合わせたＳＳＥＡ４の発現に基づいて選別される。特定の実施形態では、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１、またはＴＲＡ１−６０、および／またはＣＤ３０発現に基づいて選別される。一実施形態において、細胞は、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１およびＣＤ３０に基づいて選別される。別の実施形態では、細胞はＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−６０およびＣＤ３０に基づいて選別される。特定の実施形態では、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ４６およびＣＤ７を含むがこれらに限定されない分化細胞の１つ以上の表面マーカーを使用して、細胞を非リプログラミング細胞について最初に枯渇させ、その後、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１および／またはＣＤ３０のような多能性マーカーについて濃縮させる。
リプログラミング後、ｉＰＳＣは維持、継代および増加される。いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、維持培地、例えば表１に示されるようなＦＭＭ中で長期間にわたって単一細胞として培養、すなわち維持、継代および増加される。ＦＭＭで培養されたｉＰＳＣは、未分化で基底のまたはナイーブなプロファイル、培養物の洗浄または選択を必要としないゲノム安定性を維持し続けることが示され、および３つのすべての体細胞系統、胚様体または単層を介したインビトロでの分化（胚様体の形成のない）、および奇形腫形成によるインビボでの分化を容易に生じさせる。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第６１／９４７，９７９号および米国特許出願公開第２０１７００７３６４３号を参照されたい。本リプログラミングシステムおよび方法を使用してリプログラミングするのに適した細胞は、一般に、任意の非多能性細胞を含む。非多能性細胞には、最終的に分化した細胞、または多分化能もしくは前駆細胞が含まれるが、これらに限定されず、これらは、３種類すべての胚葉系統細胞を生じさせることはできない。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、初代細胞、すなわち、ヒトまたは動物の組織から直接単離した細胞である。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、例えばドナー、疾患、もしくは治療応答に特異的な、供給源特異的細胞である。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は初代免疫細胞である。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞自体が、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞を含む多能性細胞に由来する。いくつかの実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、由来免疫細胞、例えば、ｉＰＳＣ由来の非天然ＴまたはＮＫ様細胞である。
いくつかの他の実施形態では、リプログラミングのための非多能性細胞は、ゲノムが改変された初代細胞または誘導由来細胞である。非多能性細胞に含まれる遺伝的修飾には、遺伝子発現のノックイン、ノックアウト、またはノックダウンにつながるゲノムへの挿入、欠失、または置換が含まれる。リプログラミングのための非多能性細胞における改変された発現は、構成的または誘導的であり得る（例えば、発達段階、組織、細胞、または誘導因子に特異的）。いくつかの実施形態では、挿入または置換は、遺伝子座に特異的な標的化組み込みである。いくつかの実施形態では、組み込みのために選択された遺伝子座は、セーフハーバー（ｓａｆｅ ｈａｒｂｏｒ）遺伝子座または目的の内在性遺伝子座である。セーフハーバー遺伝子座には、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＲＯＳＡ２６、コラーゲン、ＨＴＲＰ、Ｈ１１、ベータ２ミクログロブリン、ＧＡＰＤＨ、ＴＣＲまたはＲＵＮＸ１、およびゲノムセーフハーバーの基準を満たすその他の遺伝子座が含まれる。組み込み部位が潜在的なセーフハーバー遺伝子座であるためには、以下を含むがこれらに限定されない基準を満たすことが理想的である：配列アノテーションによって判断されるように、調節エレメントまたは遺伝子の破壊がないこと、遺伝子の密集した領域内の遺伝子間領域、または反対方向に転写された２つの遺伝子間の収束位置であること、ベクターにコード化された転写活性化因子と隣接する遺伝子のプロモーターとの、特に癌関連遺伝子とマイクロＲＮＡ遺伝子との間の長距離相互作用の可能性を最小限に抑えるために距離を保つこと、ユビキタス転写活性を示す広範な空間的および時間的発現シーケンスタグ（ＥＳＴ）発現パターンによって反映されるように、明らかなユビキタスな転写活性を有すること。この後者の特徴は、多能性細胞に関して特に重要であり、分化中にクロマチン再構築は通常、いくつかの遺伝子座のサイレンシングおよび他の遺伝子座の活性化の可能性につながる。外因性の挿入に適した領域内で、挿入に選択される正確な遺伝子座には、反復エレメントと保存配列がなく、相同性アームの増幅用のプライマーを簡単に設計できるはずである。一例では、本システムおよび方法を使用してリプログラミングするための非多能性細胞は、内在性ＴＣＲ遺伝子座にＣＡＲを含むＴ細胞であり、ＣＡＲ組み込みの結果としてＴＣＲ発現が破壊される。
一実施形態では、遺伝子組み換えの非多能性細胞のリプログラミングは、同じ遺伝子修飾（複数可）を含むゲノム操作したｉＰＳＣを取得することである。そのため、他のいくつかの実施形態では、１つ以上のそのようなゲノム編集は、ゲノム操作したｉＰＳＣを得るためのリプログラミング後にｉＰＳＣに導入され得る。一実施形態では、ゲノム編集のためのｉＰＳＣは、クローン系またはクローンｉＰＳ細胞の集団である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的遺伝子編集を含むゲノム操作したｉＰＳＣは、ＭＥＫｉ、ＧＳＫｉ、およびＲＯＣＫｉを含み、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ５阻害剤を含まない、または本質的に含まない培地で維持、継代および増加され、このｉＰＳＣは、選択した部位で無傷かつ機能的な標的編集を保持する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集により、安全スイッチタンパク質、ターゲティングモダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質またはペプチド、薬物標的候補、ならびに多能性細胞および／またはその由来細胞の、生着、輸送、ホーミング、腫瘍浸潤、生存率、自己再生、持続性、および／または生存を促進するタンパク質、のうちの１つ以上を導入する。一実施形態では、ゲノム操作したｉＰＳＣは、カスパーゼ９（またはカスパーゼ３または７）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、Ｂ細胞ＣＤ２０、修飾ＥＧＦＲ、およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない１つ以上の自殺遺伝子媒介安全スイッチを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム操作されたｉＰＳＣは、キメラ受容体、ホーミング受容体、抗炎症性分子、免疫チェックポイントタンパク質、サイトカイン／ケモカインデコイ受容体、成長因子、変更された炎症誘発性サイトカイン受容体、ＣＡＲ、または二重または多重特異的もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体の、導入もしくは増加した発現、または共刺激遺伝子の減少もしくは抑制した発現、を含む少なくとも１つのゲノム修飾を有する。いくつかの実施形態において、ゲノム操作したｉＰＳＣは、ターゲティングモダリティとして高親和性および／または非切断性ＣＤ１６を含む。いくつかの他の実施形態において、ゲノム操作したｉＰＳＣに含まれるターゲティングモダリティは、Ｔ細胞特異的、またはＮＫ細胞特異的、またはＴおよびＮＫ細胞の両方に適合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
いくつかの実施形態では、ゲノム操作したｉＰＳＣは、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドまたは１つ以上の内在性遺伝子のインデル（ｉｎ／ｄｅｌ）を含む。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子に含まれるインデルは、遺伝子発現の破壊をもたらす。いくつかの実施形態において、内在性遺伝子に含まれるインデルは、編集した遺伝子のノックアウトをもたらす。いくつかの実施形態では、内因性内在性遺伝子に含まれるインデルは、編集した遺伝子のノックダウンをもたらす。いくつかの実施形態では、選択された部位（複数可）に１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むゲノム操作したｉＰＳＣは、選択された部位（複数可）にインデルを含む１つ以上の標的編集をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、インデルは、免疫応答制御および媒介に関連する１つ以上の内在性遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは１つ以上の内因性内在性チェックポイント遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは１つ以上の内在性Ｔ細胞受容体遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは１つ以上の内在性ＭＨＣクラスＩサプレッサー遺伝子に含まれる。いくつかの実施形態では、インデルは、主要な組織適合性複合体に関連する１つ以上の内在性遺伝子に含まれる。一実施形態では、修飾ｉＰＳ細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意のＨＬＡ遺伝子のうちの少なくとも１つに欠失または減少した発現を含む。別の実施形態では、修飾ｉＰＳ細胞は、ＨＬＡ−ＥまたはＨＬＡ−Ｇの発現の導入または増加を含む。さらにいくつかの他の実施形態では、ゲノム操作したｉＰＳ細胞は、中断されたＴＣＲ遺伝子座を含む。
ｉＰＳＣのさまざまな標的遺伝子編集方法、特に、複数遺伝子座ターゲティング戦略での複数遺伝子を用いた単一細胞レベルでｉＰＳＣを効果的に操作するための方法には、例えば、国際出願公開ＷＯ２０１７／０７９６７３に記載されている方法が含まれ、この開示は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明はまた、体細胞をより低い分化（ｌｅｓｓ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）状態にリプログラミングする薬剤を同定する方法、およびこのように同定された薬剤を提供する。一実施形態では、方法は、本明細書に開示されるリプログラミング組成物および方法を使用して体細胞をリプログラミングすることを含み、少なくとも１つのベクターが候補薬剤を含み、多能性細胞形態の出現およびＯＣＴ４などの少なくとも１つの内在性多能性遺伝子の誘導発現を有する細胞を選択する。適切な選択マーカーを発現する細胞の存在は、薬剤が体細胞をリプログラミングすることを示す。このような薬剤は、この出願の目的のためのリプログラミング剤と見なされる。さらなる実施形態において、方法は、本明細書に開示されるリプログラミング組成物および方法を使用して、体細胞を候補薬剤と接触させること、適切な選択マーカーを発現する細胞を選択すること、および多能性特性についてそのように選択された細胞を評価することを含む。多能性特性の完全なセットの存在は、薬剤が体細胞をリプログラミングして多能性になるようにすること示す。本発明で使用される候補薬剤は、多くの化学薬品クラスを包含するが、典型的には、それらは小有機化合物を含む有機分子である。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、核酸および誘導体、構造類似体またはそれらの組み合わせを含む生体分子にも見られる。候補薬剤は、自然発生する、組み換え、または実験室で設計されたものであってよい。候補薬剤は、微生物、動物、または植物から単離され得るか、または組み換えにより産生され得るか、または当該分野で公知の化学的方法により合成され得る。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、本発明の方法を使用して合成または天然化合物のライブラリから単離される。例えば、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムで指向性のある合成のための多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリが入手可能であるか、容易に生成される。さらに、天然または合成的に生成されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段により容易に変更され、組み合わせライブラリを生成するために使用され得る。既知の薬物は、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化を含む、指向的またはランダムな化学修飾を受けて、構造的類似体を生成し得る。たとえば、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ ＤＩＶＥＲＳｅｔＴＭなど、数多くの市販の化合物ライブラリがある。
上記のスクリーニング方法は、細胞で実施されるアッセイに基づく。これらの細胞ベースのアッセイは、当技術分野で記載されているハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）形式で実施することができる。例えば、Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．は、翻訳後修飾を含む小型化した哺乳動物細胞ベースのアッセイにおける小分子のハイスループットスクリーニングについて説明した（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。同様に、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．は、抗癌剤のハイスループットスクリーニングのための白血病細胞ベースのアッセイを説明した（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。両方の参考文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
ＩＩ．インビトロで得られたｉＰＳＣ由来細胞
本発明は、いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるシステムおよび方法を使用して得られたｉＰＳＣに由来する非多能性細胞をさらに提供する。いくつかの実施形態では、由来非多能性細胞を生成するためのｉＰＳＣは、ｉＰＳＣの標的編集を通じて、または部位特異的組み込みまたはインデルを有するゲノム操作した非多能性細胞のリプログラミングを通じて、ゲノム操作される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来非多能性細胞は、前駆細胞または完全に分化した細胞である。いくつかの実施形態では、ゲノム操作したｉＰＳＣに含まれる同じ標的編集を保持するｉＰＳＣ由来細胞は、非天然の中胚葉細胞、ＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、造血幹細胞または前駆細胞、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、免疫制御性細胞、または任意の胚葉系統の任意の細胞である。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の非天然免疫制御性細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞または間葉系間質細胞を含み、これらはＮＫ、Ｂ、およびＴ細胞の強力な免疫調節因子である。
ドナーの供給源からの分離によって得るのが難しい、特定のタイプまたはサブタイプの細胞の無制限の数を生成することに加えて、ヒトｉＰＳＣ由来の系統は胎児期の細胞の特性を示すため、リプログラミングプロセスは、細胞の運命（特定／分化から多能性への）だけでなく、最初の体細胞ドナーの年齢とは無関係にドナー細胞集団の年代順の年齢特性もリセットすることが示されている。神経細胞、心臓細胞、または膵臓細胞が含まれるｉＰＳＣ由来の系統で観察される胎児様特性以外に、老化の細胞の顕著な特徴は、リプログラミングプロセス後のｉＰＳＣからの再分化細胞の若返りを示す測定可能な変化を示している。高齢ドナー線維芽細胞集団で発現した年齢関連パラメーターは、ｉＰＳＣ誘導およびｉＰＳＣ由来線維芽細胞様細胞への分化後にリセットされた（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。Ｔ細胞クローンからリプログラミングされたｉＰＳＣから分化したｉＰＳＣ由来の抗原特異的Ｔ細胞は、元のＴ細胞クローンよりも長いテロメアによる若返りを示す。若返りプロセスを示す完全に分化した細胞の追加の変化には、ヘテロクロマチンの全体的な増加、ミトコンドリア機能の改善（ＲＯＳの減少、ｍｔＤＮＡ突然変異の減少、超微細構造の存在）、ＤＮＡ損傷応答の増加、テロメアの伸長および短いテロメアの割合の減少、および老化細胞の割合の減少が含まれるが、これらに限定されない。（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。これらのさまざまな年齢関連の側面における正のリセットは、増殖、生存、持続性、および記憶様機能の可能性がより高い非天然細胞をもたらす。したがって、リプログラミングと再分化を介した若返りは、完全に分化したｉＰＳＣ由来細胞に多くの分子的、表現型的および機能的特性を与え、それらの非天然特性により、細胞系統におけるそれらの類似性にもかかわらず、初代細胞の対応物とは異なっている。
ｉＰＳＣ由来の造血細胞系統を得るための適用可能な分化方法および組成物には、例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４４１２２に示されるものが含まれ、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。提供されているように、造血細胞系統を生成するための方法と組成物は、無血清、フィーダーフリー、および／または間質フリーの条件下で、およびＥＢ形成の必要がないスケーラブルな単層培養プラットフォームでのｉＰＳＣを含む、多能性幹細胞に由来する最終的な造血性内皮（ＨＥ）によるものである。提供された方法に従って分化され得る細胞は、多能性幹細胞から、特定の最終分化細胞および分化転換細胞にコミットする前駆細胞、多能性中間体を経由せずに造血性の運命に直接移行したさまざまな系統の細胞に及ぶ。同様に、幹細胞の分化によって生成される細胞は、多分化能幹細胞または前駆細胞から最終分化幹細胞、およびすべての介在する造血細胞系統までに及ぶ。
単層培養における造血系統の細胞を多能性幹細胞から分化および増加させる方法は、多能性幹細胞をＢＭＰ経路活性化因子、および任意でｂＦＧＦと接触させることを含む。提供されるように、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく多能性幹細胞由来の中胚葉細胞が得られ、増加される。その後、多能性幹細胞から胚様体を形成することなく、中胚葉細胞をＢＭＰ経路活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＷＮＴ経路活性化因子と接触させて、最終的な造血性内皮（ＨＥ）ポテンシャルを有する増加した中胚葉細胞を取得する。ｂＦＧＦ、および任意でＲＯＣＫ阻害剤、および／またはＷＮＴ経路活性化因子とのその後の接触により、最終的なＨＥポテンシャルを有する中胚葉細胞は最終的なＨＥ細胞に分化し、これはまた分化中に増加もする。
本明細書で提供される造血系統の細胞を取得する方法は、ＥＢ形成が、中程度から最小限の細胞増加をもたらし、均質な増加、および集団内の細胞の均質な分化を必要とする多くの用途にとって重要である単層培養を可能とせず、面倒で低効率であるため、ＥＢ媒介多能性幹細胞分化よりも優れている。
提供された単層分化プラットフォームは、造血幹細胞と、Ｔ、Ｂ、ＮＫＴ、ＮＫ細胞、制御性細胞などの分化した子孫の誘導をもたらす最終的な造血性内皮への分化を促進する。単層分化戦略は、分化効率の向上と大規模な増加を組み合わせることで、さまざまな治療用途向けの治療上適切な数の多能性幹細胞由来の造血細胞の送達を可能にする。さらに、本明細書で提供される方法を使用する単層培養は、インビトロでの分化、エクスビボでの調節、およびインビボでの長期造血自己再生、再構成および生着の全範囲を可能にする機能的造血系統細胞をもたらす。提供されているように、ｉＰＳＣ由来の造血系統細胞には、限定されないが、最終的な造血性内皮、造血多分化能前駆細胞、造血幹細胞および前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、調節性マクロファージ、調節性樹状細胞、および間葉系間質細胞が含まれる。
多能性幹細胞の最終的な造血系統細胞への分化を指示する方法であって、この方法は、（ｉ）多能性幹細胞を、ＢＭＰ活性化因子、および任意にｂＦＧＦを含む組成物と接触させて、多能性幹細胞から中胚葉細胞の分化および増加を開始させることと、（ｉｉ）中胚葉細胞を、ＢＭＰ活性化因子、ｂＦＧＦ、およびＧＳＫ３阻害剤を含む組成物であって、任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、中胚葉細胞から最終的なＨＥポテンシャルを有する中胚葉細胞の分化および増加を開始させることと、（ｉｉｉ）最終的なＨＥポテンシャルを有する中胚葉細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＩＬ６、およびＩＬ１１からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインと、任意選択的に、Ｗｎｔ経路活性化因子とを含む組成物であって、任意選択的にＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、最終的な造血性内皮ポテンシャルを有する多能性幹細胞由来中胚葉細胞からの最終的な造血性内皮の分化および増加を開始させることと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、多能性幹細胞をＭＥＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む組成物であって、ＴＧＦβ受容体／ＡＬＫ阻害剤を含まない組成物と接触させて、多能性幹細胞を播種および増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、ｉＰＳＣ、またはナイーブｉＰＳＣ、または１つ以上の遺伝的刷り込みを含むｉＰＳＣであり、ｉＰＳＣに含まれる１つ以上の遺伝的刷り込みが、そこから分化した造血細胞に保持される。多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示する方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化は、胚様体の生成がなく、単層培養形態である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、得られた多能性幹細胞由来の最終的な造血性内皮細胞はＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態では、得られた最終的な造血性内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４３−である。いくつかの実施形態では、最終的な造血性内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４３−ＣＸＣＲ４−ＣＤ７３−である。いくつかの実施形態では、最終的な造血性内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＸＣＲ４−ＣＤ７３−である。いくつかの実施形態では、最終的な造血性内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４３−ＣＤ９３−である。いくつかの実施形態では、最終的な造血性内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９３−である。いくつかの実施形態では、最終的な造血性内皮細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９３−ＣＤ７３−である。
上記の方法のいくつかの実施形態では、この方法は、さらに（ｉ）多能性幹細胞由来の最終的な造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインと、任意選択的にＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、最終的な造血性内皮のプレＴ細胞前駆細胞への分化を開始させることと、任意選択的に、（ｉｉ）プレＴ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、およびＩＬ７からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインを含むが、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤の１つ以上を含まない組成物と接触させて、プレＴ細胞前駆細胞のＴ細胞前駆細胞またはＴ細胞への分化を開始させることと、を含む。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞はＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。この方法のいくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞前駆細胞はＣＤ４５＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＴ細胞は、ドナー供給源から単離された初代Ｔ細胞よりもはるかに高いγδＴ細胞の割合を含む。
多能性幹細胞の造血系統の細胞への分化を指示するための上記方法のさらにいくつかの実施形態では、方法はさらに、（ｉ）多能性幹細胞由来の最終的な造血性内皮を、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＩＬ３、ＩＬ７、およびＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインと、任意選択的に、ＢＭＰ活性化因子とを含む組成物と接触させて、最終的な造血性内皮のプレＮＫ細胞前駆細胞への分化を開始させることと、任意選択的に、（ｉｉ）多能性幹細胞由来のプレＮＫ細胞前駆細胞を、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１５からなる群から選択される１つ以上の成長因子とサイトカインを含む組成物と接触させて、（ここで、培地は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＰＯ、ＢＭＰ活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの１つ以上を含まない）、プレＮＫ細胞前駆細胞のＮＫ細胞前駆細胞またはＮＫ細胞への分化を開始させることと、を含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ前駆細胞はＣＤ３−ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ７＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞はＣＤ３−ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞は、ＮＫｐ４６（ＣＤ３３５）、ＮＫｐ３０（ＣＤ３３７）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ５７およびＣＤ１６のうちの１つ以上によって任意にさらに定義される。
本方法の別の実施形態において、本方法は、多能性幹細胞由来の最終的ＨＥを、ＲＯＣＫ阻害剤と、ＭＣＳＦと、ＧＭＣＳＦと、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、およびＦＬＴ３Ｌからなる群から選択される１つ以上の成長因子およびサイトカインと、任意選択的に、ＡｈＲアンタゴニストおよびプロスタグランジン経路アゴニストの一方または両方とを含む、培地と、接触させることから、免疫制御性細胞を産生することを可能にする。
いくつかの実施形態では、由来免疫制御性細胞は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。一実施形態では、由来免疫制御性細胞の集団はＣＤ４５＋ＣＤ３３＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、由来免疫制御性細胞の集団は単球を含む。いくつかの実施形態では、単球はＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋細胞を含む。さらにいくつかの他の実施形態では、由来免疫制御性細胞の集団は、ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＰＤＬ１＋細胞を含む。本発明の一態様は、ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋、ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＣＤ１４＋、またはＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＰＤＬ１＋細胞を含むｉＰＳＣ由来免疫制御性細胞の濃縮細胞集団または亜集団を提供する。いくつかの他の実施形態では、由来免疫制御性細胞の集団は、ＣＤ３３＋ＣＤ１５＋ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ−細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＭＤＳＣを含む由来免疫制御性細胞の集団は、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．１％未満の赤血球、リンパ球、顆粒球、ＣＤ４５−ＣＤ２３５＋細胞、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋細胞、またはＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＣＤ６６ｂ＋細胞を含む。いくつかの実施形態において、由来免疫制御性細胞の集団は、赤血球、リンパ球、顆粒球、ＣＤ４５−ＣＤ２３５＋細胞、ＣＤ４５＋ＣＤ７＋細胞、またはＣＤ４５＋ＣＤ３３＋ＣＤ６６ｂ＋細胞を本質的に含まない。
ＩＩＩ．ｉＰＳＣおよびそこからの由来免疫細胞の治療的使用
いくつかの実施形態では、本発明は、開示される方法および組成物を使用して、ｉＰＳＣおよび／または前記ｉＰＳＣに由来している免疫細胞の単離した集団または亜集団を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｉＰＳＣ由来免疫細胞で保持可能な１つ以上の標的遺伝子編集を含み、遺伝子操作されたｉＰＳＣおよびその由来細胞は、細胞ベースの養子療法に適している。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のＨＳＣ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のｐｒｏＴまたはＴ細胞を含む。一実施形態では、遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来のｐｒｏＮＫまたはＮＫ細胞を含む。一実施形態において、遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、ｉＰＳＣ由来の免疫制御性細胞または骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子操作された免疫細胞は、改善された治療可能性のためにエクスビボでさらに調節される。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来している遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、増加した数または比率の、ナイーブＴ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、および／またはセントラルメモリーＴ細胞を含む。一実施形態では、ｉＰＳＣに由来している遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、増加した数または比率のＩ型ＮＫＴ細胞を含む。別の実施形態では、ｉＰＳＣに由来している遺伝子操作された免疫細胞の単離した集団または亜集団は、増加した数または比率の適応ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または骨髄由来サプレッサー細胞の、単離した集団または亜集団は、同種異系である。いくつかの他の実施形態では、ｉＰＳＣ由来の遺伝子操作されたＣＤ３４細胞、ＨＳＣ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＭＤＳＣの単離した集団または亜集団は、自己由来である。
いくつかの実施形態では、分化のためのｉＰＳＣは、エフェクター細胞に望ましい治療属性を伝える遺伝的刷り込みを含み、その遺伝的刷り込みは、前記ｉＰＳＣに由来する分化した造血細胞で保持され機能する。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞の遺伝的刷り込みは、（ｉ）非多能性細胞をｉＰＳＣにリプログラミングする間またはリプログラミングした後、多能性細胞のゲノムへのゲノム挿入、欠失、または置換によって得られる１つ以上の遺伝子組み換えモダリティ、または（ｉｉ）ドナー、疾患、もしくは治療応答に特異的な供給源特異的免疫細胞の１つ以上の保持可能な治療属性、を含み、多能性細胞は、供給源特異的免疫細胞からリプログラミングされ、ｉＰＳＣは、供給源の治療属性を保持し、これらは、ｉＰＳＣ由来の造血系統細胞にも含まれる。
いくつかの実施形態では、遺伝子組み換えモダリティは、安全スイッチタンパク質、ターゲティングモダリティ、受容体、シグナル伝達分子、転写因子、薬学的に活性なタンパク質およびペプチド、薬物標的候補、または、ｉＰＳＣもしくはその由来細胞の生着、輸送、ホーミング、生存率、自己再生、持続性、免疫応答制御および調節、および／または生存を促進するタンパク質のうちの１つ以上を含む。いくつかの他の実施形態では、遺伝子組み換えモダリティは、（ｉ）Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＮＬＲＣ５、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、またはＲＦＸＡＰ、および染色体６ｐ２１領域の任意の遺伝子の欠失または減少した発現、（ｉｉ）ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＨＡＣＤ１６、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ、Ｆｃ受容体、または二重または多重特異的もしくはユニバーサルエンゲージャーと結合するための表面トリガー受容体の導入または増加した発現、のうちの１つ以上を含む。
さらにいくつかの他の実施形態では、造血系統細胞は、（ｉ）抗原ターゲティング受容体発現、（ｉｉ）ＨＬＡ提示またはその欠如、（ｉｉｉ）腫瘍微小環境に対する耐性、（ｉｖ）バイスタンダー免疫細胞の誘導および免疫調節、（ｉｖ）オフ腫瘍効果（ｏｆｆ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ）の低減を伴う改善されたオンターゲット特異性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（ｖ）化学療法などの治療に対する耐性（ｖｉ）ホーミング、持続性および細胞毒性の改善、の１つ以上に関連する供給源特異的免疫細胞の治療属性を含む。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣおよびその由来造血細胞は、Ｂ２Ｍヌルまたは低（ｎｕｌｌ ｏｒ ｌｏｗ）、ＨＬＡ−Ｅ／Ｇ、ＰＤＬ１、Ａ２ＡＲ、ＣＤ４７、ＬＡＧ３ヌルまたは低、ＴＩＭ３ヌルまたは低、ＴＡＰ１ヌルまたは低、ＴＡＰ２ヌルまたは低、タパシン ヌルまたは低、ＮＬＲＣ５ヌルまたは低、ＰＤ１ヌルまたは低、ＲＦＫＡＮＫヌルまたは低、ＣＩＩＴＡヌルまたは低、ＲＦＸ５ヌルまたは低、ＲＦＸＡＰヌルまたは低の１つ以上を含む。修飾ＨＬＡクラスＩおよび／またはＩＩを有するこれらの細胞は、免疫検出に対する耐性が増加しているため、インビボでの持続性が向上する。さらに、そのような細胞は、養子細胞療法におけるＨＬＡマッチングの必要性を回避することができ、したがって、普遍的な市販の治療レジメンの供給源を提供する。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣおよびその由来造血細胞は、ｈｎＣＤ１６（高親和性の非切断性ＣＤ１６）、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、４１ＢＢＬ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４７、ＣＤ１１３、ＣＤ１３１、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＰＤＬ１、Ａ２Ａ Ｒ、ＣＡＲ、またはＴＣＲのうちの１つ以上を含む。そのような細胞は、改善された免疫エフェクター能力を有する。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣおよびその由来造血細胞は抗原特異的である。
養子細胞療法に適した対象に本発明の免疫細胞を導入することにより、さまざまな疾患を寛解することができる。疾患の例としては、様々な自己免疫障害であって、円形脱毛症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、若年性特発性関節炎のいくつかの形態、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、心筋炎のいくつか形態、多発性硬化症、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症／全身性硬化症、シェーグレン症候群、全身性ループス、エリテマトーデス、甲状腺炎のいくつかの形態、ブドウ膜炎のいくつかの形態、白斑、多発性血管炎を伴う肉芽腫症（ウェゲナー病）、を含むがこれらに限定されないもの、血液悪性腫瘍であって、急性および慢性白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫および骨髄異形成症候群を含むがこれらに限定されないもの、固形腫瘍であって、脳、前立腺、乳房、肺、結腸、子宮、皮膚、肝臓、骨、膵臓、卵巣、精巣、膀胱、腎臓、頭、首、胃、子宮頸部、直腸、喉頭、または食道、の腫瘍を含むがこれらに限定されないもの、および感染症であって、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）の、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）の、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）の、アデノウイルスのおよびＢＫポリオーマウイルスの、関連障害を含むが、これらに限定されないもの、が含まれる。
いくつかの実施形態によれば、本発明は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来造血細胞を含む治療的使用ための組成物をさらに提供し、ここで、医薬組成物は、薬学的に許容される培地をさらに含む。一実施形態では、治療的使用ための組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＴ細胞を含む。一実施形態では、治療的使用のための組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＮＫ細胞を含む。一実施形態では、治療的使用のための組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＣＤ３４＋ＨＥ細胞を含む。一実施形態では、治療的使用のための組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＨＳＣを含む。一実施形態では、治療的使用のための組成物は、本明細書に開示される方法および組成物によって作製された多能性細胞由来のＭＤＳＣを含む。
さらに、本発明は、いくつかの実施形態では、養子細胞療法に適した対象に組成物を導入することによる上記治療用組成物の治療的使用を提供し、対象は自己免疫障害、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、または、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、アデノウイルス、またはＢＫポリオーマウイルスに関連する感染を有する。
単離した多能性幹細胞由来の造血系統細胞は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞または間葉系間質細胞を有することができる。いくつかの実施形態では、単離した多能性幹細胞由来の造血系統細胞は、約９５％〜約１００％のＴ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞を有する（ＭＤＳＣ）、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞または間葉系間質細胞を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、精製した、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞、または間葉系間質細胞を有する治療用組成物、例えば細胞療法を必要とする対象を治療するための、約９５％の、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ｐｒｏＴ細胞、ｐｒｏＮＫ細胞、ＣＤ３４＋ＨＥ細胞、ＨＳＣ、Ｂ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性マクロファージ、制御性樹状細胞または間葉系間質細胞、の単離した集団を有する組成物、を提供する。
本明細書に開示される実施形態の由来造血系統細胞を使用する治療は、症状が生じた場合、または再発予防のために実施することができよう。「治療する」、「治療」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患を完全にまたは部分的に予防するという観点で予防的であり得、および／または疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒の観点で治療的であり得る。本明細書で使用する「治療」は、哺乳動物における疾患のあらゆる治療を包含し、および、病気に罹りうるが、まだそれを有していると診断されていない対象に疾患が発生するのを予防すること、病気を抑制すること、すなわちその発生を阻止すること、または病気を緩和すること、すなわち病気を後退させること、を含む。治療薬または組成物は、疾患または損傷の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減する進行中の疾患の治療も特に興味深い。特別な実施形態では、治療を必要とする対象は、細胞療法により少なくとも１つの関連する症状を治療、寛解、および／または改善することができる疾患、状態、および／または傷害を有する。特定の実施形態は、細胞療法を必要とする対象が、骨髄または幹細胞移植の候補、化学療法または放射線療法を受けた対象、過剰増殖性障害または癌、例えば、造血系の過剰増殖性障害または癌に罹患しているまたは有するリスクがある対象、腫瘍、例えば固形腫瘍を有するまたは発症するリスクがある対象、ウイルス感染またはウイルス感染に関連する疾患を有するまたは有するリスクがある対象を含むが、これらに限定されないことを企図する。
開示されているように由来造血系統細胞を含む治療用組成物は、他の治療の前、最中、および／または後に対象に投与することができる。したがって、併用療法の方法は、追加の治療薬の使用前、使用中、および／または使用後のｉＰＳＣ由来免疫細胞の投与または調製を含み得る。上記のように、１つ以上の追加の治療薬は、ペプチド、サイトカイン、マイトジェン、成長因子、低分子ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、単核血球、フィーダー細胞、フィーダー細胞成分またはその置換因子（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）、１つ以上の目的のポリ核酸を含むベクター、抗体、化学療法薬または放射性成分（ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｏｉｅｔｙ）、または免疫調節薬（ＩＭｉＤ）を含む。ｉＰＳＣ由来の免疫細胞の投与は、追加の治療薬の投与から数時間、数日、または数週間で時間的に分離することができる。追加的または代替的に、投与は、抗腫瘍剤、手術などの非薬物療法などであるがこれらに限定されない他の生物活性剤またはモダリティと組み合わせることができる。
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は抗体または抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラ抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体または抗体断片は、ウイルス抗原に特異的に結合する。他の実施形態では、抗体または抗体断片は、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍またはウイルス特異的抗原は、投与されたｉＰＳＣ由来の造血系統細胞を活性化して、それらの殺傷能力を増強する。いくつかの実施形態では、投与されるｉＰＳＣ由来の造血系統細胞に対する追加の治療薬としての併用治療に適した抗体には、抗ＣＤ２０（レツキシマブ、ベルツズマブ、オファツムマブ、ユブリツキシマブ、オカラツズマブ、オビヌツズマブ）、抗Ｈｅｒ２（トラスツズマブ）、抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）、抗ＥＧＦＲ（セルツキシマブ（ｃｅｒｔｕｘｉｍａｂ））、および抗ＣＤ３８（ダラツムマブ、イサツキシマブ、ＭＯＲ２０２）、およびそれらのヒト化およびＦｃ修飾バリアントが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、１つ以上の化学療法薬または放射性成分を含む。化学療法薬とは、細胞傷害性抗腫瘍薬、すなわち、腫瘍細胞を優先的に死滅させるか、急速に増殖する細胞の細胞周期を破壊する化学物質、または幹癌細胞を根絶することが見出された化学物質、腫瘍細胞の成長を予防または減少させるために治療的に使用される化学物質を指す。化学療法薬は、抗腫瘍薬または細胞毒性薬または薬剤と呼ばれることもあり、当技術分野で周知である。
いくつかの実施形態では、化学療法薬は、アントラサイクリン、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有剤、インターフェロン、およびインターロイキンを含む。例示的な化学療法薬には、アルキル化剤（シクロホスファミド、メクロレタミン、メファリン（ｍｅｐｈａｌｉｎ）、クロラムブシル、ヘアメチルメラミン（ｈｅａｍｅｔｈｙｌｍｅｌａｍｉｎｅ）、チオテパ、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン）、アニメタボライト（ａｎｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）（メトトレキサート、フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリンチン、チオグアニン、ペントスタチン）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン）、エピポドフィロトキシン（エトポシド、エトポシドオルトキノン、およびテニポシド）、抗生物質（ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、ビスアンスレン（ｂｉｓａｎｔｈｒｅｎｅ）、アクチノマイシンＤ、プリカマイシン、ピューロマイシン、グラミシジンＤ）、パクリタキセル、コルヒチン、サイトカラシンＢ、エメチン、マイタンシン、およびアムサクリン、が含まれるが、これらに限定されない。追加の薬剤には、アミングルテチミド（ａｍｉｎｇｌｕｔｅｔｈｉｍｉｄｅ）、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、アルトレタミン、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、アレムツザマブ、アルトレタミン、アナストロゾール、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバシズマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、セレコキシブ、セツキシマブ、クラドリビン、クロフラビン（ｃｌｏｆｕｒａｂｉｎｅ）、シタラビン、ダカルバジン、デニロイキンディフティトックス、ディーチルスチルベストロール（ｄｉｅｔｈｌｓｔｉｌｂｅｓｔｒｏｌ）、ドセタキセル、ドロモスタノロン、エピルビシン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エチニルエストラジオール、エキセメスタン、フロクスウリジン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フルタミド、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ（２ａ、２ｂ）、イリノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、メクロレタミン、メゲストロール、メルファリン（ｍｅｌｐｈａｌｉｎ）、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、ナンドロロン、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ）、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペガデマーゼ、ペグアスパラガーセ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ポリフェプロサン、ポルフィマー、プロカルバジン、キナクリン、リツキシマブ、サルグラモスチム、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、トペテカン（ｔｏｐｅｔｅｃａｎ）、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビノレルビン、ゾレドロネート、が含まれる。他の適切な薬剤は、化学療法薬または放射線療法薬として承認され、当技術分野で知られているものを含む、ヒトでの使用が承認されているものである。このような薬剤は、多くの標準的な医師および腫瘍医の参考文献（例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ´ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）を介して、または国立がん研究所のウェブサイト（ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｒｎｅ．ｈｔｍ）を介して参照でき、両者は随時更新される。
サリドマイド、レナリドマイド、およびポマリドマイドなどの免疫調節薬（ＩＭｉＤ）は、ＮＫ細胞とＴ細胞の両方を刺激する。本明細書で提供されるように、ＩＭｉＤは、癌治療のためにｉＰＳＣ由来の治療用免疫細胞とともに使用され得る。
当業者が理解するように、本明細書の方法および組成物に基づくｉＰＳＣに由来する自己および同種造血系統細胞の両方は、上記の細胞療法で使用することができる。自家移植の場合、由来造血系統細胞の単離した集団は、患者と完全または部分的にＨＬＡマッチである。別の実施形態では、由来造血系統細胞は、対象にＨＬＡマッチしていない。
いくつかの実施形態では、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量あたり、少なくとも０．１ｘ１０５細胞、少なくとも１ｘ１０５細胞、少なくとも５ｘ１０５細胞、少なくとも１ｘ１０６細胞、少なくとも５ｘ１０６細胞、少なくとも１ｘ１０７細胞、少なくとも５ｘ１０７細胞、少なくとも１ｘ１０８細胞、少なくとも５ｘ１０８細胞、少なくとも１ｘ１０９細胞、または少なくとも５ｘ１０９細胞である。いくつかの実施形態では、治療組成物中の由来造血系統細胞の数は、用量あたり約０．１ｘ１０５細胞〜約１ｘ１０６細胞、用量あたり約０．５×１０６細胞〜約１×１０７細胞、用量あたり約０．５ｘ１０７細胞〜約１ｘ１０８細胞、用量あたり約０．５ｘ１０８細胞〜約１ｘ１０９細胞、用量あたり約１ｘ１０９細胞〜約５ｘ１０９細胞、用量あたり約０．５ｘ１０９細胞〜約８ｘ１０９細胞、用量あたり約３ｘ１０９細胞〜約３ｘ１０１０細胞、またはその間の範囲である。通常、６０ ｋｇの患者の場合、１ｘ１０８細胞／用量は１．６７ｘ１０６細胞／ｋｇに換算される。
一実施形態において、治療用組成物中の由来造血系統細胞の数は、血液の部分的もしくは単一のさい帯血（ｃｏｒｄ ｏｆ ｂｌｏｏｄ）中の免疫細胞の数であるか、または少なくとも０．１ｘ１０５細胞／体重ｋｇ、少なくとも０．５ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも５ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも１０ｘ１０５細胞／ｋｇ体重、少なくとも０．７５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１．２５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１．５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１．７５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも２ｘ１０６細胞／ｋｇ体重、少なくとも２．５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも３ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも４ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１０ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも１５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも２０ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも２５ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、少なくとも３０ｘ１０６細胞／体重ｋｇ、１ｘ１０８細胞／ｋｇ体重、５ｘ１０８細胞／ｋｇ体重、または１ｘ１０９細胞／ｋｇ体重である。
一実施形態では、由来造血系統細胞の用量が対象に送達される。例示的な一実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、すべての介在する用量の細胞を含めて、少なくとも２ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９ｘ１０６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、すべての介在する用量の細胞を含めて、約２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約９ｘ１０６細胞／ｋｇ、または約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇである。
別の例示的な実施形態では、対象に提供される細胞の有効量は、すべての介在する用量の細胞を含めて、約２×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ〜約１０×１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、または６ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、である。
投与量のいくらかの変動は、治療される対象の状態に応じて必然的に発生する。いずれにしても、投与の責任者は個々の対象について適切な用量を決定する。
いくつかの実施形態では、由来造血系統細胞の治療的使用は単回投与治療である。いくつかの実施形態において、由来造血系統細胞の治療的使用は、複数回投与治療である。いくつかの実施形態では、複数回投与治療は、毎日、３日ごと、７日ごと、１０日ごと、１５日ごと、２０日ごと、２５日ごと、３０日ごと、３５日ごと、４０日ごと、４５日ごと、５０日ごと、またはその間の任意の日数ことに、１回の投与である。
本発明の由来造血系統細胞の集団を含む組成物は、無菌にでき、ヒト患者への投与に適切であり、すぐに投与できる（すなわち、さらなる処理なしで投与できる）。投与の準備ができている細胞ベースの組成物は、組成物が対象への移植または投与の前にさらなる治療または操作を必要としないことを意味する。他の実施形態では、本発明は、１つ以上の薬剤で投与する前に増加および／または調節した由来造血系細胞の単離した集団を提供する。組み換えＴＣＲまたはＣＡＲを発現するように遺伝子操作された由来造血系統細胞については、例えば米国特許第６，３５２，６９４号に記載されている方法を使用して、細胞を活性化および増加させることができる。
特定の実施形態では、由来造血系統細胞に対する一次刺激性シグナルおよび共刺激性シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。たとえば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中に存在するか、表面に結合する。表面に結合する場合、薬剤は同じ表面（すなわち、「シス」形成）に、または別々の表面（すなわち、「トランス」形成）に結合できる。あるいは、１つの薬剤を表面に結合させ、他の薬剤を溶液に結合させることができる。一実施形態では、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合することができ、一次活性化シグナルを提供する薬剤は溶液中にあるか、表面に結合している。特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中にあり得る。別の実施形態では、薬剤は可溶性形態であってよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞または抗体または米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および第２００６００３４８１０号に開示されているような本発明の実施形態におけるＴリンパ球の活性化および増加における使用が企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）についての薬剤に結合する他の結合剤などの表面に架橋することができる。
患者への投与に適した治療用組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤（たとえば、薬学的に許容される培地、たとえば細胞培養培地）、または他の薬学的に許容される成分を含むことができる。薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、投与される特定の組成物によって、ならびに治療用組成物を投与するために使用される特定の方法によってある程度決定される。したがって、本発明の治療用組成物の多種多様な適切な製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈｅｄ．１９８５、を参照、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
特別な実施形態では、ｉＰＳＣ由来の造血系統細胞の単離した集団を有する治療用細胞組成物はまた、薬学的に許容される細胞培養培地、または薬学的に許容される担体および／または希釈剤も有する。本明細書に開示されるｉＰＳＣ由来の造血系統細胞の集団を含む治療用組成物は、静脈内、腹腔内、経腸、または気管投与方法により個別に、または所望の治療目標を達成する他の適切な化合物と組み合わせて投与することができる。
これらの薬学的に許容される担体および／または希釈剤は、治療用組成物のＰＨを約３〜約１０に維持するのに十分な量で存在することができる。このため、緩衝剤を、全組成物の重量対重量ベースで約５％程度の量にできる。塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどであるがこれらに限定されない電解質も治療用組成物に含めることができる。一態様では、治療用組成物のＰＨは約４〜約１０の範囲にある。あるいは、治療用組成物のＰＨは、約５〜約９、約６〜約９、または約６．５〜約８の範囲にある。別の実施形態では、治療用組成物は、前記ＰＨ範囲うちの１つのＰＨを有する緩衝液を含む。別の実施形態では、治療用組成物は約７のＰＨを有する。あるいは、治療用組成物は、約６．８〜約７．４の範囲のＰＨを有する。さらに別の実施形態では、治療用組成物は約７．４のＰＨを有する。
本発明はまた、一部では、本発明の特定の組成物および／または培養物における薬学的に許容される細胞培養培地の使用を提供する。そのような組成物は、ヒト対象への投与に適している。一般的に言えば、本発明の実施形態によるｉＰＳＣ由来の免疫細胞の維持、成長、および／または健康を支援する任意の培地は、薬学的細胞培養培地としての使用に適している。特別な実施形態では、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清および／またはフィーダーフリー培地である。様々な実施形態において、無血清培地は動物を含まず、任意選択的にタンパク質を含まなくてもよい。任意選択的に、培地は生物学的に許容される組み換えタンパク質を含有することができる。動物を含まない培地とは、成分が非動物源に由来する培地を指す。組み換えタンパク質は、動物を含まない培地で天然の動物タンパク質に置き換わり、栄養素は合成、植物または微生物源から得られる。対照的に、無タンパク質培地は、実質的にタンパク質を含まないと定義される。当業者は、上記の培地の例は例示であり、本発明での使用に適した培地の配合を決して限定しないことを理解するであろう。
配列表
配列番号１
長さ：６４１
タイプ：ＰＲＴ
生物：ヒトヘルペスウイルス４
ＭＳＤＥＧＰＧＴＧＰＧＮＧＬＧＥＫＧＤＴＳＧＰＥＧＳＧＧＳＧＰＱＲＲＧＧＤＮＨＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＧＧＲＰＧＡＰＧＧＳＧＳＧＰＲＨＲＤＧＶＲＲＰＱＫＲＰＳＣＩＧＣＫＧＴＨＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧＲＧＲＧＧＳＧＧＲＧＲＧＧＳＧＧＲＧＲＧＧＳＧＧＲＲＧＲＧＲＥＲＡＲＧＧＳＲＥＲＡＲＧＲＧＲＧＲＧＥＫＲＰＲＳＰＳＳＱＳＳＳＳＧＳＰＰＲＲＰＰＰＧＲＲＰＦＦＨＰＶＧＥＡＤＹＦＥＹＨＱＥＧＧＰＤＧＥＰＤＶＰＰＧＡＩＥＱＧＰＡＤＤＰＧＥＧＰＳＴＧＰＲＧＱＧＤＧＧＲＲＫＫＧＧＷＦＧＫＨＲＧＱＧＧＳＮＰＫＦＥＮＩＡＥＧＬＲＡＬＬＡＲＳＨＶＥＲＴＴＤＥＧＴＷＶＡＧＶＦＶＹＧＧＳＫＴＳＬＹＮＬＲＲＧＴＡＬＡＩＰＱＣＲＬＴＰＬＳＲＬＰＦＧＭＡＰＧＰＧＰＱＰＧＰＬＲＥＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶＬＫＤＡＩＫＤＬＶＭＴＫＰＡＰＴＣＮＩＲＶＴＶＣＳＦＤＤＧＶＤＬＰＰＷＦＰＰＭＶＥＧＡＡＡＥＧＤＤＧＤＤＧＤＥＧＧＤＧＤＥＧＥＥＧＱＥ
配列番号２
長さ：４２２
タイプ：ＰＲＴ
生物：ヒトヘルペスウイルス４
ＭＳＤＥＧＰＧＴＧＰＧＮＧＬＧＥＫＧＤＴＳＧＰＥＧＳＧＧＳＧＰＱＲＲＧＧＤＮＨＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＧＧＲＰＧＡＰＧＧＳＧＳＧＰＲＨＲＤＧＶＲＲＰＱＫＲＰＳＣＩＧＣＫＧＴＨＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＧＲＧＲＧＧＳＧＧＲＧＲＧＧＳＧＧＲＧＲＧＧＳＧＧＲＲＧＲＧＲＥＲＡＲＧＧＳＲＥＲＡＲＧＲＧＲＧＲＧＥＫＲＰＲＳＰＳＳＱＳＳＳＳＧＳＰＰＲＲＰＰＰＧＲＲＰＦＦＨＰＶＧＥＡＤＹＦＥＹＨＱＥＧＧＰＤＧＥＰＤＶＰＰＧＡＩＥＱＧＰＡＤＤＰＧＥＧＰＳＴＧＰＲＧＱＧＤＧＧＲＲＫＫＧＧＷＦＧＫＨＲＧＱＧＧＳＮＰＫＦＥＮＩＡＥＧＬＲＡＬＬＡＲＳＨＶＥＲＴＴＤＥＧＴＷＶＡＧＶＦＶＹＧＧＳＫＴＳＬＹＮＬＲＲＧＴＡＬＡＩＰＱＣＲＬＴＰＬＳＲＬＰＦＧＭＡＰＧＰＧＰＱＰＧＰＬＲＥＳＩＶＣＹＦＭＶＦＬＱＴＨＩＦＡＥＶＬＫＤＡＩＫＤＬＶＭＴＫＰＡＰＴＣＮＩＲＶＴＶＣＳＦＤＤＧＶＤＬＰＰＷＦＰＰＭＶＥＧＡＡＡＥＧＤＤＧＤＤＧＤＥＧＧＤＧＤＥＧＥＥＧＱＥ
以下の実施例を、限定ではなく例示として提供する。
実施例１−材料と方法
単一細胞の解離 すべてのリプログラミング培養を、トランスフェクション後１４日目にＦＭＭに切り替えた。ＦＭＭに入ったら、すべてのリプログラミング培養を維持し、アキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）を使用して分離した。次に、単一細胞をマトリゲルまたはビトロネクチンでコーティングした表面で継代した。次いで、単一細胞の解離細胞をＦＭＭで増加させ、フローサイトメトリーによる選別まで維持した。
フローサイトメトリー分析と選別 単一細胞が解離したリプログラミングプールを、冷却された染色緩衝液に再懸濁させた。ＳＳＥＡ４−ＦＩＴＣ、ＴＲＡ１８１−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−６４７およびＣＤ３０−ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む結合一次抗体を細胞溶液に添加し、氷上で１５分間インキュベートした。すべての抗体は、１００万個の細胞あたり１００μＬの染色緩衝液中７〜１０μＬで使用した。染色緩衝液中の再懸濁された解離単一細胞をスピンダウンし、今回はＲＯＣＫ阻害剤を含有する染色緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリー選別のために氷上で維持した。「結果」セクションで説明したゲーティング戦略を使用して、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーでの選別を実行した。選別された細胞を、ウェルあたり３および９イベントの濃度で９６ウェルプレートに直接排出させた。各ウェルにはＦＭＭが事前に充填された。選別が完了したら、９６ウェルプレートをコロニー形成と増加のためにインキュベートした。選別後７〜１０日で、細胞を継代した。ＦＭＭの後続の継代は、７５〜９０％のコンフルエンシーで定期的に行った。Ｇｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅ ８ ＨＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でフローサイトメトリー分析を実行し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ ４（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して分析した。
導入遺伝子の存在の試験 ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ＫｉｔおよびプロテイナーゼＫ消化（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを単離した。１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、リプログラミング因子とＥＢＮＡ１を含む導入遺伝子に特異的なプライマーセットを使用して増幅した。ＰＣＲ反応は次のように３５サイクル行った：９４℃で３０秒間（変性）、６０〜６４℃で３０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長）。レンチウイルス法を使用して生成された線維芽細胞およびｈｉＰＳＣからのゲノムＤＮＡを陰性対照として使用した。エピソーム構築物のＤＮＡを陽性対照として使用した。
アルカリホスファターゼ染色細胞を４％ｖ／ｖパラホルムアルデヒド（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）で固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、アルカリホスファターゼ染色キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で染色した。簡単に説明すると、２部のファストレットバイオレット、１部のナフトールＡＳ−ＢＩホスフェート（Ｐｈｏｓｐｈａｓｔｅ）、１部の水を混合し、固定細胞に加え、２５℃で１５分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄した。
核型分析 細胞遺伝学的分析は、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により、Ｇバンド中期細胞で実施された。各核型分析には最小数２０スプレッドが含まれ、最初の２０で非クローン異常が特定された場合、分析は４０スプレッドに拡張される。
奇形腫の形成 ２００μＬ溶液（１００μＬのＦＭＭおよび１００μＬのマトリゲル）あたり５０万および３００万細胞の濃度の単一細胞解離ｈｉＰＳＣをＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｎｕｌｌマウスに皮下注射した。５〜６週間（３００万個の細胞の注入）および７〜８週間（５０万個の細胞の注入）後、処理のために奇形腫を採取、固定、および維持した。試料は、セクショニング、染色、および検査のためにＵＣＳＤ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙに提出された。
統計分析 少なくとも３つの独立した実験が行われた。値は平均＋ＳＥＭとして報告される。統計分析は、ＡＮＯＶＡで行われ、ｐ＜０．０５が有意であるとみなされた。
培地 従来のｈＥＳＣ培養は、２０％ノックアウト血清代替物、０．１ｍＭ（または１％ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸、１〜２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび１０〜１００ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有する。対照的に、多段階培養培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤のうちの１つ以上をさらに含む。この段階特異的な培養プラットフォームは、フィーダーフリーのリプログラミングと維持もサポートする。
特定の適用では、従来の培養の成分に加えて、リプログラミング培地（ＦＲＭ）は、ＳＭＣ４：ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤の組み合わせ、を含有し、また、維持培地（ＦＭＭ）は、ＳＭＣ３：ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、およびＭＥＫ阻害剤の組み合わせ、を含有する。
実施例２−一過性かつ一時的リプログラミングシステムを使用したリプログラミング
プラスミドベクターとエピソームベクターの両方は、非組み込み染色体外ＤＮＡである。標準プラスミドには、プロモーターと発現するポリヌクレオチド（複数可）のみを含有しており、自律的にまたは宿主細胞の染色体とともに複製することはできない。したがって、プラスミドによって媒介される導入遺伝子の発現は連続的でも安定的でもなく、むしろ一過性（細胞質）および一時的（短期）であり、トランスフェクション効率、コピー数、プラスミド損失率の影響を受けやすい、生き残ったインプットベクターＤＮＡによって決まる。プラスミドベクターの毎日のトランスフェクションを繰り返すことによってのみ、リプログラミングがまだ許容できないほど低い効率で達成されたことが示されている（Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；３２２：９４９−９５３）。
プラスミドベクターと比較して、エピソームベクターは存在し、細胞質内で自律的に、または染色体の一部として複製できる。したがって、エピソームベクターによって媒介される導入遺伝子発現は、ベクターの複製により連続的で安定している。例えば、目的の導入遺伝子（複数可）に加えて、ＥＢＶベースのエピソームベクターは、エプスタイン−バー核抗原−１（ＥＢＮＡ１）タンパク質とＥＢＶに由来する複製起点（ｏｒｉＰ）の両方をコードし、分裂細胞の核でエピソームベクターを複製および保持する。エピソームベクターで発現したＥＢＮＡはｏｒｉＰに結合し、細胞ＤＮＡ複製複合体成分を動員して、ｏｒｉＰが宿主細胞の染色体複製とともにベクターＤＮＡの複製を開始できるようにする。ＥＢＮＡ−１はその後、Ｓ期に生成された娘エピソームを、ｏｒｉＰを介して宿主染色体にテザリングし、エピソームの核内保持を維持し、したがって、連続的な導入遺伝子（複数可）とＥＢＮＡ発現を維持する（Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１０１７（１０）：１２８８−１２９３）。ＥＢＮＡ媒介エピソームテザリングは、有糸分裂中に各娘細胞にエピソームの分離を与え、細胞ごとに一定数のエピソームが確保される（Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ｏｒｉＰとＥＢＮＡ−１発現カセットの両方を含有するエピソームプラスミドは、選択なしで細胞周期あたり約９５％のエピソーム保持で培養ヒト細胞の複製を持続できる（Ｇｉｌ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＥＢＶベースのエピソームベクターは、少なくとも１２日間（自己持続的多能性状態を確立するのに必要な期間、Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００８）；３２２：９４９−９５３参照、または米国特許第８，５５４６，１４０号に記載されている少なくとも８日〜少なくとも３０日）外因性のリプログラミング因子を継続的に発現する。
本出願の過渡的および時間的リプログラミングシステムを使用してリプログラミングを実行するために、表１および図１に示すようにいくつかのベクターを構築した。ベクター１（Ｖ１）は、選択されたリプログラミング因子（ＲＦ）（複数可）の発現を促進するプロモーターとｏｒｉＰを含有するプラスミドベクターである。ベクター１にはＥＢＮＡコード化配列がないため、結果として宿主細胞での保持時間が短縮されている。ベクター１はｏｒｉＰ／ＲＦプラスミドとも呼ばれる。ベクター１が１つ以上のリプログラミング因子をエンコードする場合、因子は自己切断性２Ａペプチド、またはＩＲＥＳによって分離され得る。複数のリプログラミング因子の異なる組み合わせが望ましい同時トランスフェクションには複数のＶ１を使用でき、Ｖ１の組み合わせで各リプログラミング因子の相対コピー数を制御することにより、リプログラミング因子の化学量論を事前に決定できる。ベクター２（Ｖ２）は、プロモーターとＥＢＮＡコード化配列を含有するプラスミドで、発現はプロモーターによって駆動される。さらに重要なことは、Ｖ２にはｏｒｉＰを欠くため、トランスフェクトされた宿主細胞集団のＶ２保持時間が大幅に短縮される。ベクター２はＥＢＮＡプラスミドとも呼ばれる。Ｖ２は、ＥＢＮＡ ｍＲＮＡまたはタンパク質／ペプチドに置き換えることもできる。ｍＲＮＡ媒介リプログラミングの方法と材料は、例えば、Ｗａｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１０）：７，６１８−６３０）に記載され、一方、組み換えタンパク質媒介リプログラミングについては、例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２００９）：４，３８１−３８４）に記載されており、両者は参照により本明細書に組み込まれる。ベクター３（Ｖ３）はｏｒｉＰとＥＢＮＡの両方を発現するベクターであるが、リプログラミング因子コード配列はない。これらのベクターがリプログラミングをサポートしているかどうかを調べるために、Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３を単独または異なる組み合わせでヒト線維芽細胞に形質導入した（表２を参照）。
表１−ベクター構築物
最初に試験されたのは、Ｖ１、Ｖ２、およびＶ３の組み合わせで（ＥｍＴＴＲ、ＥＢＮＡを媒介した一過性かつ一時的リプログラミングシステム）、ＥＢＮＡの長期発現、持続的な導入遺伝子の保持、および効果的なリプログラミングを誘導した。この組み合わせで使用されるリプログラミング因子には、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、およびＳＯＸ２（Ｖ１ＡおよびＶ１Ｂ）が含まれていた。トランスフェクションの１５日後（Ｄ１５）、多能性状態を示すＳＳＥＡ４とＴＲＡ１８１の両方を発現する細胞のリプログラミングプールをフローサイトメトリーで選別した。これらの多能性マーカーでは、細胞の顕著な２１．４％が二重陽性である（図２）。トランスフェクションの３０日後（Ｄ３０）、ｉＰＳＣ多能性マーカーＴＲＡ１８１、ＳＳＥＡ４およびＣＤ３０（ＮＡＮＯＧの代理マーカー）でリプログラミングプールを染色した（図３）。ＯＣＴ４およびＮＡＮＯＧの免疫蛍光染色により、ｉＰＳＣ多能性マーカーを発現するコロニーの出現が確認され、リプログラミングの成功が示される。
Ｖ３がＥｍＴＴＲシステムで超生理学的な量の導入遺伝子発現をトランスで作成する可能性を排除するために、リプログラミングを駆動する際に内在性多能性因子へのタイムリーな移行ではなく、導入遺伝子発現に過度に依存する細胞を作成し、組み合わせからＶ３を削除して、線維芽細胞をＶ１（Ｖ１Ａ＋Ｖ１Ｂ）とＶ２のみでトランスフェクトする、ＳＴＴＲ（短命一過性かつ一時的リプログラミング）と呼ばれたシステムを行った。驚くべきことに、Ｖ１とＶ２の組み合わせにより、リプログラミングが行われるだけでなく、Ｖ１とＶ２のトランスフェクションを繰り返す必要がなく、適度な効率が得られた。トランスフェクション後のＤ１５には２．３５％のＳＳＥＡ／ＴＲＡ１８１二重陽性細胞があった（図４）。トランスフェクションの２７日後、ｉＰＳＣ多能性マーカーＴＲＡ１８１、ＳＳＥＡ４およびＣＤ３０でリプログラミングプールを染色した。免疫蛍光染色により、ｉＰＳＣ多能性マーカーを発現するコロニーの出現が確認され、ＳＴＴＲシステム（Ｖ１およびＶ２のみ）を使用したリプログラミングが成功したことが示される（図５）。
これはまったく予想外の結果であった。短命の導入遺伝子の発現は期間またはタイミングのいずれにおいても十分ではないと想定されたため、ＳＴＴＲシステムはリプログラミングをサポートしないと予想されていた。
表２−リプログラミングのためのベクターの組み合わせ
１ ：Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）；３２４（５９２８）：７９７−８０１（３個のエピソームベクターの同時トランスフェクションによる７個のリプログラミング因子の移行、および従来型ｈＥＳＣ培地で調整したフィーダーを使用したリプログラミングによる３〜６個のコロニー／１０６インプット細胞の取得）。
２ ：ＡＰ染色は、リプログラミング効率の推定において二重陽性よりも厳格でない
さらに、ＥｍＴＴＲシステムによる初期リプログラミングは、二重陽性細胞の割合に基づくＳＴＴＲリプログラミングに比べてはるかに効率的に見えるが、ＳＴＴＲは、自己持続的多能性を有し、長期間維持できるｉＰＳＣの生成に向けた細胞リプログラミングをより適切にサポートする。ＥｍＴＴＲおよびＳＴＴＲシステムを使用してリプログラミングするように誘導された線維芽細胞をそれぞれ２５日間維持し、多能性マーカーＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、ＣＤ３０の発現で評価した。図６に示すように、Ｄ２５でＳＴＴＲから誘導された集団の大部分は多能性の３つのマーカーすべての発現を維持しているが、Ｄ２５でＥｍＴＴＲにより誘導された集団は、ＣＤ３０発現の大幅な低下によって示されるように多能性を失っているようであり、持続不可能または不安定な多能性状態に関連する復帰を示している。次いで、両方の集団を継代し、培養中のｉＰＳＣコロニーと分化クラスターの形態をその後観察し、Ｄ２８で比較した（図７Ａ）。ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１８１、ＣＤ３０の同時発現の維持で最初に指摘したように、ＳＴＴＲ集団は、自発的分化は最小限で主にｉＰＳＣコロニーとして維持されたが、ＥｍＴＴＲ集団は高レベルの自発的分化を示した（図７Ｂ）。
ＳＴＴＲシステムの一過性かつ一時的な性質を分析するために、定量ＲＴ−ＰＣＲを使用してトランスフェクション後の細胞集団におけるＥＢＮＡ発現を分析した。また、細胞集団における多能性状態の出現を示す内在性ＯＣＴ４発現もモニターした。図８に示すように、トランスフェクション後にＥＢＮＡの発現が現れ、Ｄ２で最高点に到達し、Ｄ４で１％未満に急激に低下し始め、これは、細胞分裂あたり９０％以上のＶ２プラスミドの損失率を反映している（ＥＢＶベースのエピソームベクターの約５％の損失率と比較して）。従来のアッセイでは、実験開始時のプラスミドの選択を排除し、長期的な集団増殖におけるプラスミドフリー細胞の出現のスクリーニングが行われる。Ｄ６までに、集団におけるＥＢＮＡ発現は本質的に検出不可能であり、一過性の発現システムを特徴付ける。ＥＢＮＡ発現のこのような急速な損失は、極端な短命で一時的な性質を決定し、核取り込みおよび染色体テザリングまたはゲノム組み込みの利益なしで細胞質内のＶ２プラスミドの一過性の保持が最も可能性が高いことを示す。さらに重要なことは、培養中にｉＰＳＣの形態が現れる前、そして確実に自己持続的多能性状態が形成される前にＥＢＮＡが失われたことである。本明細書で提供される方法は、ＥＢＮＡを介したプラスミド保持時間を短縮したが、エピソームを介したリプログラミングにおける安定したＥＢＮＡ発現の必要性とは明確に対照的である（少なくとも８日間から少なくとも３０日間の安定したＥＢＮＡ発現が必要とされるＵＳ８，５４６，１４０またはＭａｚｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７の宿主細胞での構成的発現を参照）。
Ｈｏｗｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００６（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ；１７：８３３−８４４）は、ＥＢＮＡ ｍＲＮＡをＥＢＶベースのエピソームベクターと同時トランスフェクトすると、核への取り込みが増加し、ＥＢＶベースのエピソームベクターの染色体テザリングが増加し、したがって、トランスフェクション効率は１０倍増加することを示した。本願では、ＳＴＴＲシステムでのＶ２プラスミドトランスフェクションによるＥＢＮＡ発現の一過性スパイクはＥＢＮＡ ｍＲＮＡの形状と類似している可能性があるが、ｏｒｉＰのみを含有し、ＥＢＮＡを発現しない本明細書のＶ１プラスミドは、継続的なＥＢＮＡ発現に依存してベクターＤＮＡを長期間保持および複製してトランスフェクション率に有意な影響を与えるＥＢＶベースのエピソームのテザリングメカニズムを欠く。Ｖ１などのｏｒｉＰを含有するプラスミドの細胞質から核への輸送が、２つのプラスミドの同時トランスフェクションの際に一過性に発現したＥＢＮＡプラスミドＶ２によって増加しても、Ｖ１は、Ｖ１とＶ２の間で同様の損失率で示されるように、リプログラミング因子導入遺伝子の長期的な発現をまだサポートしない。
したがって、Ｖ１およびＶ２を使用するＳＴＴＲのリプログラミングは、比較すると核に位置し長期的であるエピソームのリプログラミングとは異なり、真に一過性で（染色体外および細胞質）および一時的（持続時間が極めて短い）なものとして特徴づけられるプラスミドのメカニズムによるものである。複数のトランスフェクションを必要とせずに、Ｖ１およびＶ２が媒介したプラスミドのリプログラミングは驚くほど効率的である。さらに、プラスミドのリプログラミングは、Ｄ６までにすべてのＥＢＮＡプラスミドを失うようであり、その時点でｉＰＳＣまたは多能性状態は形成されていない。ＥＢＮＡ検出を介して、ＳＴＴＲシステムは、導入遺伝子の損失が急速であり、マーカーの１つとして高められた内在性ＯＣＴ４発現レベルを用いて、一般にＤ２１〜Ｄ３２前後の多能性状態を確立する前に有意であることを実証した。
興味深いことに、ＳＴＴＲシステムを使用したリプログラミング効率はＥｍＴＴＲシステムよりも低くなったが（約２％対２１％）、ＥｍＴＴＲシステムとは異なり、ＳＴＴＲシステムで生成されたｉＰＳＣの大部分がｉＰＳＣステータスを維持し、３つの胚葉すべて、内胚葉、中胚葉、および外胚葉に分化できたため、ＳＴＴＲシステムで多能性復帰および／またはｉＰＳＣの自発的分化を検出しなかった（図９）。これは、部分的には、細胞集団への導入遺伝子曝露の短い期間に起因する可能性があり、その結果、リプログラミングは、その存在がＥｍＴＴＲに見られるように、ＥＢＮＡの長期発現によって維持され得る外因性のリプログラミング因子によって大幅に推進されるのではなく、誘導された内在性の発生システムおよび動力学の利用に傾いている。
新たに形成されたｉＰＳＣにＶ１ ＤＮＡがないことのさらなる証拠を提供するために、ハイグロマイシンの存在下での生存について複数のｉＰＳＣ系統（Ｄ２５〜Ｄ３０）で機能性試験を実施した。試験されたすべてのｈｉＰＳＣ系統は、ＳＴＴＲの遺伝的要素がまったくないことを実証し、ハイグロマイシンに耐性があることを示したが、これらは、ＳＴＴＲシステムにおけるＶ１ ＤＮＡの完全な消失のさらなる証拠である。選択されたクローンは、フィーダーフリー環境で単一細胞として継代され、未分化細胞の均質な集団を維持すると同時に、３つの体細胞系統に効率的に分化する能力が示された。核型とコピー数の変動分析により、ＦＭＭで維持される長期培養中にゲノム的に安定したｈｉＰＳＣ系統を明らかにした。さらに、選択されたクローンは、３つの胚葉の細胞を生成する能力を示し、指示された場合、ＣＤ３４＋細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞を含む造血細胞に均一に分化した。
また、ＳＴＴＲシステムは、個別のＶ１ベクターによって実行されるさまざまなリプログラミング因子の組み合わせに関係なく、リプログラミングの開始に効果的であることが示された（図１０および表３）。
表３−ＳＴＴＲシステム媒介リプログラミングに適用可能な新規リプログラミング因子の組み合わせ
本ＳＴＴＲシステムを使用したリプログラミングとＥＢＶベースのエピソームベクターを使用したリプログラミングにより、外因性ＤＮＡ含有量に関して異なるｉＰＳＣが生成される。ＥＢＶベースのエピソームリプログラミングは、フットプリントフリーのｉＰＳＣを生成することで高く評価されましたが、細胞分裂あたり約３〜５％のエピソームＤＮＡ損失の遅い速度に大きく依存している（Ｌｅｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）；２１：４１４９−４１６１）。したがって、エピソームベクターをリプログラミングに使用すると、フットプリントフリーのｉＰＳＣ集団が可能になるのは、ｉＰＳ細胞を何回も継代した後のみになる。最初に取得したｉＰＳＣを少なくとも１２〜１５継代（４〜７日ごとに分割する各培養が１継代としてカウントされる）して、選択することなく本質的にフットプリントフリーの多能性幹細胞集団を取得することが示されている（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（２０１２）；１０：３３７−３４４）。それまでは、このようにして生成されたｉＰＳＣ集団は、外因性ＤＮＡ含有量の点で非常に不均一である。ある研究では、集団のｉＰＳＣの約３分の２がトランスフェクションの約２０日後にｏｒｉＰ／ＥＢＮＡエピソームベクターを含有することが示された（Ｌｅｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）；２１：４１４９−４１６１、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）；３２４（５９２８）：７９７−８０１）。顕著なまたは高い自発的分化率を有するリプログラミングした細胞の場合、長期の自然継代プロセスを通じてフットプリントフリーのｉＰＳＣを得るのはさらに不十分である。
まとめると、データは、ここで提供される短命のプラスミドベクターの組み合わせを使用してリプログラミング遺伝子を一過性かつ一時的に発現させることにより、フットプリントフリーのｈｉＰＳＣを容易に生成できることを示し、プラットフォームは、実質的に均質なフットプリントフリーのｉＰＳＣ集団の効率的かつ迅速な生成をサポートする。いくつかの実施形態では、フットプリントフリーのｉＰＳＣ集団は、広範囲の継代を必要とせずに、任意選択的に、完全にフィーダーフリー環境で生成される。
実施例３−治療的使用のための由来細胞の供給源として単一細胞由来ｉＰＳＣバンクを生成するための一過性かつ一時的なリプログラミングシステム
ＳＴＴＲリプログラミング組成物および方法は、市販の免疫療法のための再生可能かつ信頼性の高い細胞源として使用するためのクローンマスターｉＰＳＣ系統を生成するために使用されている。ドナーが同意した線維芽細胞に、開示されているプラスミドの組み合わせをトランスフェクトした。リプログラミング細胞をクローン密度で９６ウェルプレートに選別し、単一細胞由来のｉＰＳＣクローンを増加させ、多能性、リプログラミングプラスミドの喪失、ゲノム安定性、分化能などの望ましい属性についてスクリーニングした。選択されたクローンｉＰＳＣ株は、厳格な製造およびプロセス品質管理の下で製造および凍結保存され、関連規制の下で必要とされる「マスターセルバンク」としての資格を得るために、株は広範な特性評価および試験を受けた。製造されたｉＰＳＣバンクは、現在の適正製造基準に従って、臨床的に適切な規模のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に分化された。由来細胞は、関連規制の下で必要とされる「原薬および医薬品」としての資格を得るために、さらに広範な特性評価および試験を受けた。ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞を凍結保存して、単剤療法として、または免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて、血液がんおよび固形がんの養子細胞療法で使用するために、約１ｘ１０８細胞／用量で多数の用量を生成した。通常、６０ｋｇの患者の場合、１ｘ１０８細胞／用量は１．６７ｘ１０６細胞／ｋｇに換算される。各適応症の剤形、投与経路、および投与計画は、インビトロおよびインビボの両方でのＧＬＰ（優良試験所基準）および非ＧＬＰ研究からの前臨床データに従って設計および決定された。
がんや免疫疾患を治療するためｉＰＳＣ由来の免疫細胞をサポートするだけでなく、ＳＴＴＲリプログラミングプラットフォームによって生成されたフットプリントフリーおよびフィーダー細胞フリーのマスターｉＰＳＣ株は、黄斑変性症、糖尿病、パーキンソン病、血液障害、心血管疾患に至るまでの変性疾患に対する既製の細胞療法を可能にする可能性を秘めている。
当業者は、本明細書に記載の方法、組成物、および製品が例示的な実施形態を代表するものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを容易に理解するであろう。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示された本開示に対して様々な置換および変更を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。
本明細書で言及されるすべての特許および刊行物は、本開示が関係する当業者のレベルを示す。すべての特許および刊行物は、あたかも各個々の刊行物が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に例示的に説明される本開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つまたは複数の要素、１つまたは複数の限定がなくても適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書の各例において、用語「含む」、「本質的にからなる」、および「からなる」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかに置き換えられ得る。使用されている用語と表現は説明の用語として使用されており、限定するものではなく、そのような用語と表現の使用において、示され説明された特徴の同等物またはその一部を除外する意図はないが、請求される本開示の範囲内で様々な修正が可能であることが認められる。したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示されたが、本明細書に開示された概念の修正および変形は、当業者よって行われ得ること、ならびにそのような修正および変形は添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると見なされることを理解されたい。

Claims (65)

  1. 非多能性細胞をリプログラミングして多能性細胞、その細胞株または集団を生成する方法であって、
    （ａ）第１の細胞であって、非多能性細胞である、第１の細胞に、
    １つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドは、複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含み、１つ以上の第１のプラスミドの導入が、リプログラミングプロセスを誘導する、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に、
    （１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点、またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない、第２のプラスミド、（２）ＥＢＮＡ ｍＲＮＡおよび（３）ＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、を導入することと、
    （ｂ）前記ステップ（ａ）からの細胞を培養して、第２の細胞を生成することであって、前記第２の細胞が、リプログラミング細胞であり、前記リプログラミング細胞は、前記第１の細胞からの形態学的変化を含みかつ本質的にＥＢＮＡを含まず、前記リプログラミング細胞は、
    （１）多能性細胞形態と、
    （２）内在性ＯＣＴ４発現と、を含まない、第２の細胞を生成することと、
    （ｃ）多能性細胞を生成するのに十分な時間、ステップ（ｂ）で得られた前記第２の細胞をさらに培養することと、を含む、方法。
  2. ステップ（ａ）が、ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドを前記第１の細胞に導入することを含み、前記第２のプラスミドが、複製起点、またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない、請求項１に記載の方法。
  3. 前記多能性細胞を解離して、単一細胞の解離した多能性細胞を得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記単一細胞の解離した多能性細胞を懸濁させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. １つ以上の多能性マーカーを発現する細胞を選択および単離して、前記マーカー（複数可）を発現する多能性細胞を濃縮することにより、前記単一細胞の解離した多能性細胞を選別することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で前記多能性細胞を培養して、多能性を維持することをさらに含み、前記多能性細胞は少なくとも５、１０、１５、または２０継代にわたって多能性を維持する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ステップ（ｂ）における培養が、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つの存在下で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
  8. 前記第１の細胞が体細胞、前駆細胞、または多分化能細胞である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記第１の細胞が線維芽細胞であり、前記第２の細胞の前記形態学的変化がＭＥＴ（間葉から上皮への転換）を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記第２の細胞が、ステップ（ａ）のプラスミドを本質的に含まない、請求項１に記載の方法。
  11. 前記第２の細胞が、ステップ（ａ）における１つ以上の第１のプラスミドの前記導入後、約４〜１０、１２、１４、２１、２５日、またはその間の任意の日数までのリプログラミング細胞を含む、請求項１に記載の方法。
  12. 前記多能性細胞は、多能性復帰または自発的分化が低減している、請求項１に記載の方法。
  13. 前記多能性細胞が、選択または前記多能性細胞の広範な継代を必要とせずに、前記ステップ（ａ）のプラスミドの前記ポリヌクレオチドを本質的に含まない、請求項１に記載の方法。
  14. 前記多能性細胞が、以下の特性
    （１）高いクローン性、
    （２）遺伝的安定性、および
    （３）基底状態の多能性、のうちの少なくとも１つを有する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記多能性細胞が、胚体外細胞に関連する再活性化遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
  16. 前記第２のプラスミドが、高い損失率を有し、かつ／またはＥＢＮＡの発現が一過性かつ一時的である、請求項２に記載の方法。
  17. 前記複製起点および／またはＥＢＮＡが、ＥＢＶベースである、請求項１または２に記載の方法。
  18. 前記細胞が、フィーダーフリー条件下にある、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾビビンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. １つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドが、複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に、
    （１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない、第２のプラスミド、
    （２）ＥＢＮＡ ｍＲＮＡおよび
    （３）ＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、を非多能性細胞に導入した後に得られるリプログラミング細胞またはその集団であって、
    前記リプログラミング細胞は、プラスミドの組み合わせの前記導入前の前記非多能性細胞からの形態学的変化を含み、本質的にＥＢＮＡまたはその誘導体を含まず、
    前記リプログラミング細胞は、
    （１）多能性細胞形態と、
    （２）内在性ＯＣＴ４発現を含まず、
    前記リプログラミング細胞は、多能性細胞を生成するのに十分な時間を与えられると、安定したまたは自己持続的多能性を確立することができる、リプログラミング細胞またはその集団。
  21. 前記リプログラミング細胞が、１つ以上の第１のプラスミドの前記導入後、約４〜１０、１２、１４、２１、２５日、またはその間の任意の日数までのものである、請求項２０に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
  22. 前記リプログラミング細胞が、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つの存在下で培養される、請求項２０または２１に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
  23. 前記非多能性細胞が線維芽細胞であり、前記リプログラミング細胞の前記形態学的変化がＭＥＴ（間葉から上皮への転換）を含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
  24. 前記リプログラミング細胞が第１および／または第２のプラスミドを本質的に含まない、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
  25. 前記多能性細胞が、選択または前記多能性細胞の広範な継代を必要とせずに、前記プラスミドの前記ポリヌクレオチドを本質的に含まない、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
  26. 前記多能性細胞が、多能性復帰または自発的分化が低減している、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
  27. 前記多能性細胞が以下の特性
    （１）高いクローン性、
    （２）遺伝的安定性、および
    （３）基底状態の多能性、のうちの少なくとも１つを有する、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記多能性細胞が、胚体外細胞に関連する再活性化遺伝子を含む、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
  29. 請求項２０〜２８のいずれか一項に記載のリプログラミング細胞またはその集団を含む組成物。
  30. ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地をさらに含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾビビンである、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記培地が、フィーダーフリーである、請求項３０または３１に記載の組成物。
  33. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により産生された場合の、単離した多能性細胞または多能性細胞株。
  34. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により産生された前記単離した多能性細胞または細胞株を使用して、ゲノム操作した多能性細胞またはその細胞株。
  35. 請求項３３に記載の単離した多能性細胞もしくは細胞株から、または請求項３４に記載のゲノム操作した多能性細胞もしくは細胞株から再分化した由来非天然細胞（ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｃｅｌｌ）。
  36. 前記細胞が免疫細胞様であり、前記細胞がＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または免疫制御性細胞を含む、請求項３５に記載の由来非天然細胞。
  37. 前記細胞が、その天然の細胞対応物と比較して、以下の特性：ヘテロクロマチンの全体的増加、ミトコンドリア機能の改善、ＤＮＡ損傷応答の増加、テロメアの伸長および短いテロメアの割合の減少、老化細胞の割合の減少、ならびに増殖、生存、持続、または記憶様機能に対するより高い可能性、のうちの少なくとも１つを含む若返り細胞（ｒｅｊｕｖｅｎａｔｅｄ ｃｅｌｌ）である、請求項３５または３６に記載の由来非天然細胞。
  38. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により得られた多能性細胞と、任意選択的に１つ以上の追加の治療薬とを含む、治療的使用のための組成物。
  39. 請求項３４に記載のゲノム操作した多能性細胞または請求項３５〜３７に記載の由来非天然細胞と、任意選択的に１つ以上の追加の治療薬とを含む、治療的使用のための組成物。
  40. 治療が必要な対象の治療に使用するための請求項３８または３９に記載の組成物。
  41. 細胞ベースの治療に適用するための多能性細胞の製造に使用するための組成物であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により産生された多能性細胞を含む、組成物。
  42. 前記多能性細胞が同種異系または自己である、請求項４１に記載の組成物。
  43. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により得られた多能性細胞を含む、医薬使用のためのキット。
  44. 請求項３４に記載のゲノム操作した多能性細胞または請求項３５〜３７に記載の由来非天然細胞を含む医薬使用のためのキット。
  45. 非多能性細胞でリプログラミングを開始するためのインビトロシステムであって、前記システムが、
    １つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドは、複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に、
    （１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点またはリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含まない、第２のプラスミド、
    （２）ＥＢＮＡ ｍＲＮＡおよび
    （３）ＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、を含む、インビトロシステム。
  46. 前記第２のプラスミドが、高い損失率を有し、前記ＥＢＮＡの発現は一過性かつ一時的である、請求項４４に記載のシステム。
  47. 前記システムが、核内でＥＢＮＡ複製および／または連続発現を提供しない、請求項４５または４６に記載のシステム。
  48. 前記システムが、短期間、かつ多能性細胞形態の出現および内在性多能性遺伝子の誘導発現の前に、ＥＢＮＡの一過性／細胞質発現を可能にする、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載のシステム。
  49. 前記システムが、短期間、かつ多能性細胞形態の出現および内在性多能性遺伝子の誘導発現の前に、第１のプラスミド（複数可）に含まれる１つ以上のリプログラミング因子の一過性／細胞質発現を可能にする、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載のシステム。
  50. 前記複製起点が、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、およびＧａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅウイルスからなる群より選択される、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載のシステム。
  51. 前記複製起点が、ＳＶ４０、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、またはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からなる群から選択されるものである、請求項４５〜５０のいずれか一項に記載のシステム。
  52. 前記複製起点が、ＥＢＶの野生型複製起点に対応するか、または由来する、請求項４５〜５１のいずれか一項に記載のシステム。
  53. 前記ＥＢＮＡが、ＥＢＶベースである、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載のシステム。
  54. 前記１つ以上の第１のプラスミドが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、およびＬ１ＴＤ１のうちの１つ以上を含むリプログラミング因子（複数可）をコードするポリヌクレオチドを集合的に含む、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載のシステム。
  55. リプログラミング因子をコードする前記ポリヌクレオチドが、ポリシストロン性構築物または非ポリシストロン性構築物に含まれる、請求項４５〜５４のいずれか一項に記載のシステム。
  56. 前記ポリシストロン性構築物が、単一のオープンリーディングフレームまたは複数のオープンリーディングフレームを含む、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載のシステム。
  57. 前記システムが、２つ以上の第１のプラスミドを含み、各第１のプラスミドがポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーによりコードされる同じまたは異なるリプログラミング因子を含む、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載のシステム。
  58. ２つ以上の第１のプラスミドを含む前記システムが、リプログラミング因子の化学量論の制御を提供する、請求項５６に記載のシステム。
  59. 前記第１のプラスミドが、リプログラミング因子をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含み、隣接するポリヌクレオチドが自己切断性ペプチドまたはＩＲＥＳをコードするリンカー配列により作動可能に連結される、請求項４５〜５８のいずれか一項に記載のシステム。
  60. 前記自己切断性ペプチドが、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＴ２Ａを含む群から選択される２Ａペプチドである、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載のシステム。
  61. 第１のプラスミド構築物に含まれる前記２Ａペプチドが、同じであっても異なっていてもよい、請求項４５〜６０のいずれか一項に記載のシステム。
  62. 隣接する位置にある２つの２Ａペプチドが異なる、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載のシステム。
  63. 前記第１および前記第２のプラスミドがそれぞれ、リプログラミング因子およびＥＢＮＡの発現のための１つ以上のプロモーターを含み、かつ前記１つ以上のプロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、および構成的、誘導的、内因的に調節された、または時間特異的、組織特異的もしくは細胞型特異的な他の適切なプロモーターのうちの少なくとも１つを含む、請求項４５〜６２のいずれか一項に記載のシステム。
  64. 前記第１および前記第２のプラスミドがそれぞれ、ＣＡＧプロモーターを含む、請求項４５〜６３のいずれか一項に記載のシステム。
  65. 請求項４５〜６４のいずれか一項に記載のシステムを含むキット。
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