BR112020007228A2

BR112020007228A2 - reprogramação celular usando sistema de expressão de vetor plasmídeo temporal e transitório

Info

Publication number: BR112020007228A2
Application number: BR112020007228-1A
Authority: BR
Inventors: Bahram Valamehr; Megan ROBINSON
Original assignee: Fate Therapeutics, Inc.
Priority date: 2017-10-11
Filing date: 2018-10-10
Publication date: 2020-10-13
Also published as: EP3694986A1; AU2018348142A1; US20200270581A1; MX2020003739A; WO2019075057A1; IL273864A; CN111278967A; KR20200055801A; CA3078734A1; JP2020536551A; SG11202002625YA; EP3694986A4

Abstract

Trata-se de métodos e composições para induzir a reprogramação de um não pluripotente para um iPSC com propriedades desejáveis usando um sistema de vetor que fornece expressão transitória e temporal de transgênicos que são de vida curta. Também são fornecidas células de reprogramação e populações de iPSC ou linhas celulares clonais usando os métodos e composições de reprogramação fornecidos. Além disso, são fornecidos iPSCs modificados pelo genoma e células derivadas rediferenciadas para incluir edição direcionada envolvendo inserções e deleções em um ou mais locais genômicos selecionados.

Description

“REPROGRAMAÇÃO CELULAR USANDO SISTEMA DE EXPRESSÃO DE VETOR PLASMÍDEO TEMPORAL E TRANSITÓRIO” PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório nº de série U.S. 62/571.105, depositado em 11 de outubro de 2017, cuja divulgação é incorporada neste documento à título de referência na sua totalidade.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELETRONICAMENTE

[0002] Este pedido incorpora por referência uma Forma Legível por Computador (CRF) de uma listagem de sequências no formato de texto ASCII submetido com este pedido, intitulado 13601-187- 228 SEQ LISTING.txt, que foi criado em 9 de outubro de 2018 e tem 9.600 bytes de tamanho.

CAMPO DAINVENÇÃO

[0003] A presente divulgação está amplamente relacionada ao campo de geração de células-tronco humanas pluripotentes induzidas (células iPSCs ou iPS). Mais particularmente, a presente divulgação refere-se ao uso de combinações de vetores plasmídicos para obter iPSCs livres de pegadas que tenham propriedades desejáveis com uma alta eficiência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] Os iPSCs foram originalmente gerados usando sistemas virais integrados para expressar os principais fatores de transcrição. Sistemas retrovirais e lentivirais, incluindo sistemas policistrônicos e indutíveis, foram utilizados com sucesso na geração de iPSC. No entanto, alterações genômicas permanentes devido à mutagênese de inserção e o potencial para reativação de genes exógenos após a diferenciação de iPSC podem apresentar problemas potenciais para triagem de fármacos subsequente e aplicações terapêuticas de células geradas por esses métodos. De fato, foram relatadas diferenças significativas entre os clones de iPSC gerados usando os mesmos sistemas virais, com uma grande porcentagem de clones formando tumores em roedores quando transplantados como neuroesferas diferenciadas. A pesquisa sugere que os iPSCs gerados usando os mesmos métodos virais podem se comportar de maneira diferente uma vez diferenciados. Diferenças no sítio de integração gênica ectópica podem resultar em mutagênese de inserção diferente e regulação epigenética da expressão do transgene. Para métodos de geração de iPSC que incluem sistemas de integração, muitos clones podem precisar ser derivados e triados para identificar aqueles que são estáveis nos estados pluripotentes e diferenciados.

[0005] Vários sistemas não integradores para geração de iPSC foram demonstrados, incluindo métodos virais e não virais. Os sistemas virais não integrantes para reprogramação incluem o vetor adenovírus, o vetor vírus Sendai e o vetor epissomal baseado no vírus Epstein-Barr. Os exemplos de sistemas não virais não integrados para reprogramação incluem vetor de minicírculo (vetor de DNA mínimo), PiggyBac (transposão), RNA (MRNA ou miRNA) e proteína (polipeptídeos recombinantes).

[0006] Existe uma necessidade substancial na técnica de uma produção eficiente de uma população homogênea de iPSCs livres de pegadas, de preferência em um estado de pluripotência “ingênuo” ou “fundamentado” e, preferencialmente, em condições de cultura definidas. O estado de pluripotência “ingênuo” ou “fundamentado” transmite as qualidades dos iPSCs, incluindo, porém sem limitação, alta clonalidade, autorrenovação sustentável, diferenciação espontânea mínima e anormalidade genômica e alta capacidade de sobrevivência como células únicas dissociadas. Os métodos e composições, e especificamente os novos sistemas de vetores plasmídicos, da presente invenção atendem a essa necessidade e fornecem outras vantagens relacionadas no campo da reprogramação celular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0007] Ao usar um sistema de expressão eficiente, mas transitório e temporal, que minimize a presença de genes exógenos para reduzir a probabilidade de integração do genoma do hospedeiro, é um objetivo da presente divulgação fornecer métodos e composições eficientes na geração de um iPSC sem compreender DNA exógeno introduzido em um célula não pluripotente para indução de reprogramação. É um objetivo da presente divulgação fornecer um sistema plasmídico combinacional para produzir eficientemente iPSCs com um estado de pluripotência "ingênuo" ou "fundamentado" e/ou alta clonalidade. Os iPSCs com pluripotência no estado fundamental permitem a sobrevivência a longo prazo e a estabilidade genética de iPSCs dissociados de célula única e, assim, possibilitam a geração de linhas iPSC clonais adequadas para operações bancárias e manipulação, como classificação e/ou depleção de célula única, edição genômica alvejada ao iPSC e rediferenciação direcionada de uma população homogênea de iPSCs. Portanto, também é um objetivo da presente divulgação fornecer métodos e composições para gerar linhas clonais de iPSC derivadas de células únicas ou células derivadas delas, compreendendo uma ou várias modificações genéticas em sítios selecionados, que incluem inserção, exclusão e substituição de polinucleotídeos, e quais modificações são retidas e permanecem funcionais nas células derivadas subsequentemente após diferenciação, desdiferenciação, reprogramação, expansão, passagem e/ou transplante.

[0008] Um aspecto do presente pedido fornece um método de reprogramação de uma célula não pluripotente para gerar uma célula pluripotente ou uma população da mesma, cujo método compreende a transfecção de uma célula não pluripotente com um ou mais primeiros plasmídeos, em que o primeiro plasmídeo compreende uma origem de replicação e um polinucleotídeo que codifica um ou mais fatores de reprogramação, mas não codifica um EBNA ou um derivado do mesmo; em que pelo menos um dos um ou mais primeiros plasmídeos compreende um polinucleotídeo que codifica OCT4; em que a introdução de um ou mais primeiros plasmídeos induz processo de reprogramação; e opcionalmente introduzir na célula não pluripotente um dos seguintes: um segundo plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codificam fator (ou fatores) de reprogramação; um mMRNA de EBNA; e uma proteína EBNA. As células transfectadas são então cultivadas para gerar uma célula de reprogramação que compreende uma alteração morfológica a partir da célula não pluripotente de partida, é essencialmente livre de EBNA, ainda não tem a morfologia celular pluripotente e não compreende a expressão endógena de OCT4. Quando a célula de reprogramação é cultivada adicionalmente por um período de tempo suficiente, uma ou mais células pluripotentes são geradas. O método de reprogramação fornecido neste documento minimiza a exposição das células pluripotentes à expressão de transgenes exógenos que têm o potencial de integrar-se no genoma celular e reativar para provocar a desdiferenciação ao gerar células derivadas ou aumentar a propensão para oncogênese quando usados em um ambiente clínico.

[0009] Em uma modalidade o método de reprogramação compreende primeiro a introdução na célula não pluripotente de uma combinação de plasmídeos para induzir a reprogramação. A dita combinação de plasmídeos compreende um ou mais primeiros plasmídeos, em que o primeiro plasmídeo compreende uma origem de replicação e um polinucleotídeo que codifica um ou mais fatores de reprogramação, mas não codifica um EBNA ou um derivado do mesmo, e em que pelo menos um primeiro plasmídeo compreende um polinucleotídeo codificando OCTA4. A dita combinação de plasmídeos compreendendo o um ou mais primeiros plasmídeos compreende ainda um segundo plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, mas não uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica o fator (ou fatores) de reprogramação. Depois de introduzir o sistema plasmídeo na célula não pluripotente para induzir a reprogramação, as células são cultivadas para gerar uma célula de reprogramação que compreende uma alteração morfológica da célula não pluripotente inicial, na qual é introduzida a combinação de plasmídeos. A célula de reprogramação que apresenta uma mudança morfológica torna-se essencialmente livre de EBNA, ainda não possui a morfologia celular pluripotente; e não compreende a expressão endógena de OCTA4. No método de reprogramação fornecido, adita célula de reprogramação é cultivada adicionalmente por uma quantidade de tempo suficiente para gerar uma ou mais células pluripotentes. Em algumas modalidades, a cultura da célula de reprogramação está na presença de compostos de moléculas pequenas compreendendo pelo menos um dentre um inibidor de TGFB, um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK. Em algumas modalidades, os compostos de moléculas pequenas compreendem uma combinação de um inibidor de TGFB, um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK.

[00010] Em algumas modalidades, o método geral acima compreende, ainda, uma etapa de dissociação das células pluripotentes para obter células pluripotentes dissociadas de célula única. Em algumas modalidades, as células pluripotentes dissociadas de célula única são suspensas em um meio. Em algumas modalidades, as células pluripotentes dissociadas de célula única são classificadas selecionando e isolando células que expressam um ou mais marcadores de pluripotência para enriquecer para células pluripotentes que expressam o marcador (ou marcadores) selecionado. Em algumas outras modalidades, as células pluripotentes, ou as células dissociadas únicas, suspensas, classificadas ou enriquecidas são cultivadas para manter a pluripotência na presença de compostos de moléculas pequenas compreendendo pelo menos um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK. Em algumas modalidades, a manutenção de pluripotência a longo prazo é de pelo menos 5, 10, 15 ou 20 passagens ou mais.

[00011] Em algumas modalidades, o método acima é usado para induzir a reprogramação de uma célula somática, uma célula progenitora ou uma célula multipotente. Em algumas modalidades do método, a célula não pluripotente para reprogramação é uma célula humana. Em algumas modalidades do método, a célula não pluripotente para reprogramação é uma célula imune. Em algumas outras modalidades, a célula imune para reprogramação pode ser específica do paciente, específica da resposta ao fármaco ou específica da condição da doença. Em uma modalidade, quando a célula não pluripotente para reprogramação usando o método como divulgado, uma alteração morfológica apresentada pela célula de reprogramação é a do MET (transição mesenquimal para epitelial).

[00012] Em uma modalidade do dito método, a célula de reprogramação está essencialmente livre de EBNA transportada pelo segundo plasmídeo. Em uma modalidade, a célula de reprogramação está essencialmente livre do segundo plasmídeo. Algumas modalidades do método fornecem células de reprogramação que foram induzidas por cerca de 4 a 10 dias (isto é, 4 a 10 dias após a transfecção dos plasmídeos), 5 a 10 dias, 6 a 10 dias ou por quaisquer dias intermediários, da combinação plasmídica. Algumas modalidades do método fornecem células de reprogramação de 4 a 12 dias, ou por quaisquer dias intermediários, após a transfecção. Ainda, algumas modalidades do método fornecem células de reprogramação que são de 4 a 14 dias, ou por quaisquer dias após a transfecção. Ainda, algumas outras modalidades do método fornecem células de reprogramação 4 a 21 ou 4 a 25 dias, ou por quaisquer dias intermediários, após a transfecção.

[00013] Em algumas modalidades, o método produz células pluripotentes com reversão reduzida de pluripotência ou diferenciação espontânea, por exemplo, em comparação com células introduzidas com um plasmídeo adicional compreendendo ambos oriP e EBNA. Em algumas outras modalidades, o dito método produz células pluripotentes que são essencialmente livres dos polinucleotídeos da combinação plasmídica. Em algumas modalidades, as células pluripotentes essencialmente livres dos polinucleotídeos dos plasmídeos são produzidas sem a necessidade de seleção ou passagem extensiva da célula pluripotente. Em uma modalidade, o método gera células pluripotentes tendo pelo menos uma das propriedades: alta clonalidade, estabilidade genética e pluripotência no estado fundamental. Em algumas modalidades, o método gera células pluripotentes compreendendo genes reativados associados a células extraembrionárias.

[00014] Em algumas modalidades, o método envolve o uso do segundo plasmídeo que tem uma alta taxa de perda; e assim a expressão de EBNA pelo segundo plasmídeo é de curta duração, transitória e temporal, no sentido de que o EBNA é perdido rapidamente e é expresso no citoplasma, e antes do aparecimento da morfologia da iPSC ou expressão do gene da pluripotência endógena. Em algumas modalidades do método, a origem da replicação e/ou EBNA compreendidos no primeiro e no segundo plasmídeo, respectivamente, são baseados em EBV. Em algumas modalidades do método, o processo de reprogramação é conduzido sob uma condição livre de alimentador, isto é, em meio que é livre de alimentador. Em algumas outras modalidades do método, o inibidor de ROCK compreendido no meio é tiazovivina.

[00015] Outro aspecto do presente pedido fornece uma célula de reprogramação ou uma população obtida após a transfecção de uma célula não pluripotente com um ou mais primeiros plasmídeos, em que o primeiro plasmídeo compreende uma origem de replicação e um polinucleotídeo que codifica um ou mais fatores de reprogramação, mas não codificar um EBNA ou um derivado do mesmo; em que pelo menos um dos um ou mais primeiros plasmídeos — compreende um polinucleotídeco que codifica OCT4; e opcionalmente um de: um segundo plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica fator (ou fatores) de reprogramação, um mRNA de EBNA e uma proteína de EBNA; em que a célula de reprogramação compreende uma alteração morfológica da célula não pluripotente antes da introdução da combinação de plasmídeos e é essencialmente livre de EBNA ou derivado do mesmo; em que a célula de reprogramação não compreende: (i) morfologia celular pluripotente; e (ii) expressão endógena de OCTA4; e em que a célula de reprogramação é capaz de estabelecer pluripotência estável fornecida uma quantidade de tempo suficiente para gerar uma célula pluripotente. Em uma modalidade, um segundo plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA é usado para gerar células de reprogramação e iPSCs, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica o fator (ou fatores) de reprogramação. Em uma modalidade, em vez de um segundo plasmídeo, um mRNA de EBNA é usado com o um ou mais primeiros plasmídeos para induzir a reprogramação e gerar células de reprogramação e iPSCs com as propriedades descritas. Em outra modalidade, uma proteína ou polipeptídeo EBNA é usada com o um ou mais primeiros plasmídeos para induzir a reprogramação e gerar células de reprogramação e iPSCs com as propriedades divulgadas.

[00016] Em algumas modalidades da célula de reprogramação ou de uma população da mesma, a célula foi induzida por cerca de 4 a 10, a 12, a 14, a 21, a 25 dias ou a quaisquer dias intermediários. Em algumas modalidades, a célula de reprogramação ou uma população da mesma é cultivada na presença de um inibidor de TGFB, um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK. Em algumas outras modalidades, a célula de reprogramação ou uma população da mesma é induzida a partir de um fibroblasto, como tal, a alteração morfológica da reprogramação compreende a de MET (transição mesenquimal para epitelial). Em algumas modalidades, a célula de reprogramação ou uma população da mesma está essencialmente livre do primeiro e do segundo plasmídeos. Em algumas modalidades, a célula de reprogramação dá origem a uma célula pluripotente que está essencialmente livre dos polinucleotídeos dos plasmídeos sem a necessidade de seleção ou passagem extensiva da célula pluripotente. Em algumas outras modalidades, a célula de reprogramação ou uma população da mesma dá origem a uma célula pluripotente que tem reversão de pluripotência reduzida ou diferenciação espontânea, por exemplo, em comparação com células introduzidas com um plasmídeo adicional que compreende oriP e EBNA. Em ainda algumas outras modalidades, a célula de reprogramação ou uma população da mesma dá origem a uma célula pluripotente que tem pelo menos uma das propriedades: alta clonalidade; estabilidade genética e pluripotência no estado fundamental. Ainda em outra modalidade, a célula de reprogramação ou uma população da mesma dá origem a uma célula pluripotente que compreende genes reativados associados a células extraembrionárias.

[00017] Outro aspecto do presente pedido fornece, assim, uma composição compreendendo a célula de reprogramação ou uma população da mesma como descrito acima. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um meio que compreende um inibidor de TGFRB, um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK. Em uma modalidade, o inibidor de ROCK compreendido no meio da composição é tiazovivina. Em outras modalidades, o meio está livre de alimentador. Um outro aspecto do presente pedido fornece uma célula pluripotente isolada ou uma linha celular pluripotente produzida pelo dito método divulgado neste documento. Em algumas modalidades, a célula pluripotente isolada ou uma linha celular pluripotente assim produzida pode ser adicionalmente geneticamente modificada e/ou rediferenciada a uma célula derivada não natural. Em algumas modalidades, a célula derivada não natural rediferenciada da célula pluripotente isolada ou de uma linha celular pluripotente é uma célula imune, incluindo, porém sem limitação, uma célula CD34, uma célula de endotélio hemogênica, uma célula-tronco ou progenitora hematopoiética, uma célula progenitora hematopoiética multipotente, uma célula T progenitora, uma célula NK, uma célula T, uma célula NKT, uma célula NK, uma célula B e uma célula reguladora imune. Em algumas modalidades, as células não naturais derivadas da célula pluripotente ou de uma linha celular pluripotente são células rejuvenescidas que compreendem pelo menos uma das propriedades: aumento global da heterocromatina; função mitocondrial melhorada; aumento das respostas a danos no DNA; alongamento dos telômeros e diminuição da fração de telômeros curtos; diminuição da fração de células senescentes; e maior potencial para proliferação, sobrevivência, persistência ou funções do tipo memória, em comparação com o seu homólogo celular natural.

[00018] Um aspecto adicional do presente pedido fornece uma composição para uso terapêutico compreendendo uma célula pluripotente obtida pelo método como descrito neste documento e, opcionalmente, um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Também é fornecida uma composição para uso terapêutico compreendendo uma célula pluripotente geneticamente modificada ou uma célula não natural derivada de reivindicações obtidas pelos métodos como descritos neste documento e, opcionalmente, um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, essas composições para uso terapêutico são para uso no tratamento de um sujeito que necessita das mesmas. O presente pedido também fornece uma composição para uso na fabricação de uma célula pluripotente para aplicação em terapias baseadas em células. Em algumas modalidades, a célula pluripotente é alogênica, isto é, reprogramada a partir de uma célula de um sujeito diferente daquele que deve receber as terapias baseadas em células; ou autólogo, isto é, reprogramado a partir de células do mesmo sujeito que deve receber as terapias baseadas em células.

[00019] É fornecido um kit compreendendo uma célula pluripotente obtida pelo dito método, conforme descrito. Em algumas modalidades, a célula pluripotente compreendida no kit é geneticamente modificada. Também é fornecido um kit que compreende células não naturais derivadas da célula pluripotente obtida pelo dito método, conforme descrito.

[00020] Ainda outro aspecto do presente pedido fornece um sistema in vitro para iniciar a reprogramação em uma célula não pluripotente, em que o sistema compreende: (1) um ou mais primeiros plasmídeos, em que o primeiro plasmídeo compreende uma origem de replicação e um polinucleotídeo que codifica um ou mais fatores de reprogramação, mas não codifica um EBNA ou um derivado do mesmo; em que pelo menos um dos um ou mais primeiros plasmídeos compreende um polinucleotídeo que codifica OCTA4; e opcionalmente (2) um de (i) um segundo plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codificam o fator (ou fatores) de reprogramação, (ii) um mRNA de EBNA e (iii) uma proteína EBNA. Em algumas modalidades, o segundo plasmídeo do sistema tem uma alta taxa de perda; e em que a expressão de EBNA pelo segundo plasmídeo tem vida curta, transitória e temporal. Em algumas outras modalidades, o sistema não fornece replicação de EBNA e/ou expressão contínua no núcleo. Em uma modalidade, o sistema pode permitir uma expressão transitória/citoplasmática de EBNA por um curto período de tempo e antes do aparecimento da morfologia das células de pluripotência e da expressão induzida de genes de pluripotência endógenos. Em algumas modalidades, a curta duração para a expressão de EBNA é de cerca de 4, 5, 6, 7 ou 8 dias após a transfecção, mas não mais do que 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 22, 23, 24 ou 25 dias após a transfecção. Em algumas outras modalidades, o sistema também permite uma expressão transitória/citoplasmática de um ou mais fatores de reprogramação compreendidos no primeiro plasmídeo (ou plasmídeos) por um curto período e antes do aparecimento da morfologia das células de pluripotência e da expressão induzida de genes de pluripotência endógenos.

[00021] Em uma modalidade do sistema, a origem de replicação do primeiro plasmídeo (ou plasmídeos) é uma selecionada a partir do grupo que consiste em um vírus Polyomavirinae, um vírus Papillomavirinae e um vírus Gammaherpesvirinae. Em algumas modalidades, a origem da replicação é uma selecionada a partir do grupo que consiste em SV40, vírus BK (BKV), vírus do papiloma bovino (BPV) ou vírus Epstein-Barr (EBV). Em uma modalidade particular, a origem de replicação corresponde ou é derivada da origem de replicação do tipo selvagem do EBV. Em algumas outras modalidades, o EBNA do segundo plasmídeo no sistema é baseado em EBV. Em algumas modalidades, o sistema fornece um ou mais primeiros plasmídeos coletivamente compreendidos polinucleotídeos que codificam fator (ou fatores) de reprogramação que compreendem um ou mais de OCT4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPAA4, DNMT3B, ZIC3 e LITD1. Em algumas modalidades, os polinucleotídeos que codificam os fatores de reprogramação estão compreendidos em uma construção policistrônica ou construção não policistrônica em um primeiro plasmídeo. Em uma modalidade de uma construção policistrônica, ele compreende um único quadro de leitura aberto ou vários quadros de leitura abertos. Na modalidade em que o sistema compreende dois ou mais primeiros plasmídeos, cada primeiro plasmídeo pode compreender os mesmos ou diferentes fatores de reprogramação codificados por pelo menos uma cópia do polinucleotídeo. Nessas modalidades, em que o sistema compreende dois ou mais primeiros plasmídeos, o sistema oferece um controle da estequiometria do fator de reprogramação.

[00022] Em algumas modalidades do sistema, o primeiro plasmídeo compreende mais de um polinucleotídeo que codifica fatores de reprogramação, em que os polinucleotíideos adjacentes são operacionalmente conectados por uma sequência ligante que codifica um peptídeo autoclivante ou um IRES. Em uma modalidade, o peptídeo de autoclivagem é um peptídeo 2A e é selecionado a partir do grupo que compreende F2A, E2A, P2A e T2A. Em outra modalidade, os peptídeos 2A compreendidos em uma primeira construção plasmídica podem ser os mesmos ou diferentes. Em ainda outra modalidade em que o plasmídeo do sistema compreende 2As múltiplos, os dois peptídeos 2A em posições vizinhas são diferentes. Em algumas outras modalidades do sistema, o primeiro e o segundo plasmídeo compreendem um ou mais promotores para expressão de fatores de reprogramação e EBNA, e os um ou mais promotores compreendem pelo menos um dentre CMV, EF1a, PGK, CAG, UBC e outros promotores adequados que sejam constitutivos, indutíveis, regulados endogenamente ou específicos do tipo temporal, tecidular ou celular. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo plasmídeo compreendem, cada um, um promotor CAG.

[00023] Também é fornecido um kit que compreende o sistema in vitro, como descrito neste documento.

[00024] Vários objetivos e vantagens do uso dos presentes métodos e composições serão evidentes a partir da descrição a seguir, tomada em conjunto com os desenhos anexos, em que são apresentados, a título de ilustração e exemplo, certas modalidades da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00025] O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta patente ou pedido de publicação de patente com desenho (ou desenhos) a cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[00026] A Figura 1 mostra um diagrama das construções de DNA do vetor 1 e do vetor 2 usado em um sistema STTR (reprogramação transitória e temporal de curta duração) e um vetor adicional 3 a ser usado com os vetores 1 e 2 para um sistema EmTTR (transiente mediado por EBNA e Reprogramação Temporal).

[00027] A Figura 2 mostra a análise por citometria de fluxo para a expressão do marcador de pluripotência SSEA4+/TRA181+, 15 dias após a transfecção de fibroblastos usando um sistema EmTTR.

[00028] A Figura 3 mostra marcadores de pluripotência OCTA4, NANOG, TRA181 e SSEAA colorindo 30 dias após a transfecção para confirmar o surgimento de colônias que expressam marcadores iPSC usando um sistema EmTTR.

[00029] A Figura 4 mostra a análise por citometria de fluxo para a expressão do marcador de pluripotência SSEA4+/TRA181+, 15 dias após a transfecção de fibroblastos usando um sistema STTR.

[00030] A Figura 5 mostra marcadores de pluripotência OCTA4, NANOG, TRA181 e SSEAA colorindo 30 dias após a transfecção para confirmar o surgimento de colônias que expressam marcadores iPSC usando um sistema STTR.

[00031] A Figura 6 mostra que a maioria da população derivada de STTR manteve a expressão de todos os três marcadores de pluripotência, enquanto a população induzida por EMTTR parece estar perdendo pluripotência, conforme indicado pela grande queda na expressão de CD30, 25 dias após a transfecção.

[00032] As Figuras 7A a 7B mostram que a estabilidade da pluripotência é diferente nas colônias de iPSC obtidas de EMTTR e STTR após passagem em série em D28. A: Morfologia das colônias iPSC e aglomerados diferenciados na cultura em ambas as populações. B: A população STTR manteve colônias de iPSC com diferenciação espontânea mínima, enquanto a população de EMTTR mostrou um alto nível de diferenciação espontânea com a presença de apenas poucas colônias de iPSC.

[00033] A Figura 8 mostra aanálise de expressão de gene de EBNA realizada em vetor 2 e expressão endógena de OCT4 na população celular durante a reprogramação celular de fibroblastos, utilizando um sistema STTR.

[00034] As Figuras 9A a 9D mostram a caracterização de iPSCs obtida usando STTR para expressão de pluripotência e demonstração da formação de teratoma em camundongos. A. Uma imagem de fase dos clones iPSC. B. Análise de fluxo da expressão do marcador de pluripotência SSEA4+/TRA181+. C. Coloração imunofluorescente do clone para marcadores de pluripotência OCT4, NANOG, TRA181 e SSEAA4. D. A capacidade do clone iPSC de se diferenciar nas três camadas germinativas: endoderma, mesoderma e ectoderma.

[00035] A Figura 10 mostra a análise por citometria de fluxo para a expressão do marcador de pluripotência SSEA4+/TRA181+, 15 dias após a transfecção de fibroblastos usando um sistema STTR com fatores de reprogramação adicionais.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[00036] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que é comumente entendido pelos versados na técnica a quem a invenção pertence. Para os fins da presente invenção, os seguintes termos são definidos abaixo. Os artigos “um(ns)”, “o(s)' e “a(s)” e são usados neste documento para se referir a um ou mais de um (isto é, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais de um elemento.

[00037] O uso da alternativa (por exemplo, “ou”) deve ser entendido como significando uma, ambas ou qualquer combinação das alternativas. O termo "e/ou" deve ser entendido como significando uma ou ambas as alternativas.

[00038] Conforme usado neste documento, o termo “cerca de" ou "aproximadamente" refere-se a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento que varia em até 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% em comparação com uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento de referência. Em uma modalidade, o termo “cerca de" ou "aproximadamente" refere-se a um intervalo de quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento + 15%, + 10%, + 9%, + 8%, + 7%, + 6%, + 5%, + 4%, + 3%, + 2% ou + 1% sobre uma quantidade, nível, valor,

número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento de referência.

[00039] Conforme usado neste documento, o termo "substancialmente" ou "essencialmente" refere-se a uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento que é de cerca de 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou superior em comparação com uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento de referência. Em uma modalidade, os termos “essencialmente iguais” ou “substancialmente iguais” referem-se a uma faixa de quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento que é aproximadamente o mesmo que uma quantidade, nível, valor, número, frequência, porcentagem, dimensão, tamanho, quantia, peso ou comprimento de referência.

[00040] Conforme usado neste documento, os termos "substancialmente livre de" e "essencialmente livre de" são usados de forma intercambiável e, quando usados para descrever uma composição, tal como uma população celular ou meio de cultura, referem-se a uma composição que é livre de isenta de uma substância especificada ou fonte da mesma, tal como 95% livre, 96% livre, 97% livre, 98% livre, 99% livre da substância especificada ou da fonte da mesma, ou é indetectável conforme medido por meios convencionais. O termo "livre de" ou "essencialmente livre de" um determinado ingrediente ou substância em uma composição também significa que esse ingrediente ou substância não é (1) incluído na composição em qualquer concentração ou (2) incluído na composição funcionalmente inerte, mas em uma baixa concentração. Significado semelhante pode ser aplicado ao termo "ausência de", quando se refere à ausência de uma substância específica de uma composição ou da fonte da mesma.

[00041] Como usado neste documento, o termo "isolado" ou semelhante refere-se a uma célula, ou uma população de células,

que foi separada de seu ambiente original, isto é, o ambiente das células isoladas é substancialmente livre de pelo menos um componente, conforme encontrado no ambiente em que as células de referência "não isoladas" existem. O termo inclui uma célula que é removida de alguns ou de todos os componentes, como é encontrada em seu ambiente natural, por exemplo, tecido, biópsia. O termo também inclui uma célula que é removida de pelo menos um, alguns ou todos os componentes, como a célula é encontrada em ambientes de ocorrência não natural, por exemplo, cultura, suspensão de células. Portanto, uma célula isolada é parcial ou completamente separada de pelo menos um componente, incluindo outras substâncias, células ou populações de células, como é encontrada na natureza ou quando é cultivada, armazenada ou subsistida em ambientes de ocorrência não natural. Exemplos específicos de células isoladas incluem células parcialmente puras, células substancialmente puras e células cultivadas em um meio de ocorrência não natural. As células isoladas podem ser obtidas separando as células desejadas, ou populações das mesmas, de outras substâncias ou células no ambiente, ou removendo uma ou mais populações ou subpopulações de células do ambiente.

[00042] Conforme usado neste documento, o termo "purificar" ou semelhante refere-se ao aumento da pureza. Por exemplo, a pureza pode ser aumentada para pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%.

[00043] Em toda este relatório descritivo, a menos que o contexto exija de outra forma, as palavras “compreendem", "compreende" e "compreender" serão entendidas para implicar na inclusão de uma etapa ou elemento declarado ou grupo de etapas ou elementos, mas não a exclusão de qualquer outra etapa ou elemento ou grupo de etapas ou elementos. Em modalidades particulares, os termos "incluí", "possuí", "contém" e "compreende" são usados como sinônimos.

[00044] Por "consistindo em" significa incluir, e limitado a, o que segue a frase "consistindo em". Assim, a frase “consistindo em” indica que os elementos listados são requeridos ou obrigatórios e que nenhum outro elemento pode estar presente.

[00045] Por “consistindo essencialmente em” significa incluir quaisquer elementos listados após a frase e limitados a outros elementos que não interferem ou contribuem para a atividade ou ação especificada na divulgação para os elementos listados. Assim, a frase "consistindo essencialmente em" indica que os elementos listados são requeridos ou obrigatórios, mas que nenhum outro elemento é opcional e pode ou não estar presente, dependendo de afetar ou não a atividade ou a ação dos elementos listados.

[00046] Areferência ao longo deste relatório descritivo a “uma única modalidade", "uma modalidade", "uma modalidade específica", "uma modalidade relacionada", "uma certa modalidade", "uma modalidade adicional" ou "outra modalidade" ou combinações dos mesmos significa que uma característica, estrutura ou característica específica descrita em conexão com a modalidade é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, as aparências das frases anteriores em vários lugares ao longo deste relatório descritivo não estão necessariamente todas se referindo à mesma modalidade. Além disso, os recursos, estruturas ou características particulares podem ser combinadas em qualquer maneira adequada em uma ou mais modalidades.

[00047] O termo "ex vivo" refere-se em geral a atividades que ocorrem fora de um organismo, como experimentação ou medições feitas em ou sobre tecido vivo em um ambiente artificial fora do organismo, preferencialmente com alteração mínima das condições naturais. Em modalidades particulares, os procedimentos "ex vivo" envolvem células ou tecidos vivos retirados de um organismo e cultivados em um aparelho de laboratório, em geral em condições estéreis, e normalmente por algumas horas ou até 24 horas, mas incluindo até 48 ou 72 horas ou mais, dependendo das circunstâncias. Em certas modalidades, esses tecidos ou células podem ser coletados e congelados e posteriormente descongelados para tratamento ex vivo. Experiências ou procedimentos de cultura de tecidos que duram mais de alguns dias usando células ou tecidos vivos são tipicamente considerados "in vitro", embora em certas modalidades, esse termo possa ser usado de forma intercambiável com ex vivo.

[00048] O termo "in vivo" refere-se em geral a atividades que ocorrem dentro de um organismo.

[00049] Como usado neste documento, os termos "reprogramação" ou "desdiferenciação" ou "aumento da potência celular" ou "aumento da potência de desenvolvimento" referem-se a um método ou processo de aumentar a pluripotência de uma célula ou desdiferenciar a célula para um estado menos diferenciado. Por exemplo, uma célula que tem uma pluripotência celular aumentada tem mais plasticidade no desenvolvimento (isto é, pode se diferenciar em mais tipos de células) em comparação com a mesma célula no estado não reprogramado. Em outras palavras, uma célula reprogramada é aquela que está em um estado menos diferenciado do que a mesma célula em um estado não reprogramado. Uma “célula de reprogramação”, em oposição a uma célula reprogramada, refere-se a uma célula não pluripotente submetida a reprogramação/desdiferenciação a um estado pluripotente, apresentando uma morfologia de transição (isto é, uma mudança na morfologia), mas sem as características de uma célula pluripotente, incluindo morfologia de células-tronco pluripotentes ou expressão estável de genes de pluripotência endógena, como OCT4, NANOG, SOX2, SSEAA4, TRA181, CD30 e/ou CD50. A morfologia transicional de uma célula de reprogramação distingue a célula da célula não pluripotente inicial antes da reprogramação da indução, bem como de uma célula reprogramada que possui a morfologia característica da célula-tronco embrionária. Por exemplo, ao reprogramar um fibroblasto, a alteração morfológica da célula de reprogramação compreende MET (transição mesenquimal para epitelial). Um versado na técnica compreende e identifica prontamente essa morfologia transicional para vários tipos de células somáticas induzidas a reprogramar. Em algumas modalidades, as células de reprogramação são células intermediárias que foram induzidas a reprogramar por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 ou mais dias, mas não mais que 21,22,24,26,28, 30, 32, 35, 40 dias ou qualquer número de dias intermediários, em que as células não entraram em um estado pluripotente de automanutenção ou autossustentável. Uma célula não pluripotente é induzida a reprogramar quando a célula é introduzida com um ou mais fatores de reprogramação. Uma célula de reprogramação que foi induzida a reprogramar por 1, 2, 3 ou 4 dias é uma célula de 1, 2, 3 ou 4 dias após a transdução dos fatores de reprogramação (o dia da transdução é o dia 0). Ao contrário da célula somática anterior à exposição à expressão exógena de fatores de reprogramação, uma célula de reprogramação pode progredir o processo de reprogramação para atingir um estado pluripotente estável e se tornar uma célula reprogramada mesmo sem a presença dos fatores de reprogramação da expressão exógena, desde que seja dado um período de tempo suficiente.

[00050] Conforme usado neste documento, o termo "células-tronco pluripotentes induzidas" ou "iPSCs" significa que as células- tronco são produzidas a partir de células adultas, neonatais ou fetais diferenciadas que foram induzidas ou alteradas (isto é, reprogramadas) em células capazes de se diferenciar em tecidos das três camadas germinativas ou dérmicas: mesoderma, endoderme e ectoderma.

[00051] Como utilizado neste documento, o termo "célula-tronco embrionária" refere-se a células-tronco pluripotentes de ocorrência natural da massa celular interna do blastocisto embrionário. As células-tronco embrionárias são pluripotentes e dão origem, durante o desenvolvimento, a todos os derivados das três camadas germinativas primárias: ectoderma, endoderme e mesoderma. Elas não contribuem para as membranas extra-embrionárias ou para a placenta e não são totipotentes.

[00052] Como usado neste documento, o termo "célula-tronco multipotente" refere-se a uma célula que tem o potencial de desenvolvimento para se diferenciar em células de uma ou mais camadas germinativas (ectoderma, mesoderma e endoderme), mas não as três. Assim, uma célula multipotente também pode ser denominada "célula parcialmente diferenciada". As células multipotentes são bem conhecidas na técnica e exemplos de células multipotentes incluem células-tronco adultas, tal como por exemplo, células-tronco hematopoiéticas e células-tronco neurais. "Multipotente" indica que uma célula pode formar muitos tipos de células em uma determinada linhagem, mas não células de outras linhagens. Por exemplo, uma célula hematopoiética multipotente pode formar muitos tipos diferentes de células sanguíneas (vermelha, branca, plaquetas, etc.), mas não pode formar neurônios. Por conseguinte, o termo "multipotência" refere-se a um estado de uma célula com um grau de potencial de desenvolvimento que é menor que totipotente e pluripotente.

[00053] Como utilizado neste documento, o termo "pluripotente" refere-se à capacidade de uma célula de formar todas as linhagens do corpo ou soma (isto é, o próprio embrião). Por exemplo, as células-tronco embrionárias são um tipo de células-tronco pluripotentes capazes de formar células de cada uma das três camadas germinativas, o ectoderma, o mesoderma e o endoderme. A pluripotência é um continuum de potências de desenvolvimento que variam desde a célula incompletamente ou parcialmente pluripotente (por exemplo, uma célula-tronco epiblasta ou EpiSC), que é incapaz de dar origem a um organismo completo à célula mais primitiva e mais pluripotente, capaz de ascender um organismo completo (por exemplo, uma célula-tronco embrionária).

[00054] A pluripotência pode ser determinada, em parte, pela avaliação das características de pluripotência das células. As características da pluripotência incluem, porém sem limitação: (i) morfologia de células-tronco pluripotentes; (ii) o potencial de autorrenovação ilimitado; (iii) expressão de marcadores de células-tronco pluripotentes, incluindo, porém sem limitação, SSEA1 (somente camundongo), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60, TRA1-

81, TRA1I-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/proeminina, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 e/ou CD50; (iv) capacidade de diferenciar as três linhagens somáticas (ectoderma, mesoderma e endoderme); (v) formação de teratoma consistindo em três linhagens somáticas; e (vi) formação de corpos embrióides consistindo em células das três linhagens somáticas.

[00055] Dois tipos de pluripotência foram descritos anteriormente: o estado de pluripotência “preparado” ou “metaestável”, semelhante às células-tronco epiblásticas (EpiSC) do blastocisto tardio, e o estado “Ingênuo” ou “Fundamental” da pluripotência, semelhante à massa celular interior do blastocisto precoce/de pré-implantação. Enquanto ambos os estados pluripotentes exibem as características descritas acima, o estado ingênuo ou fundamental exibe ainda: (i) pré-inativação ou reativação do cromossomo X nas células femininas; (ii) melhor clonalidade e sobrevivência durante a cultura de células únicas; (ili) redução global na metilação do DNA; (iv) redução da deposição de marca de cromatina repressiva H3K27me3 em promotores de genes reguladores do desenvolvimento; e (v) expressão reduzida de marcadores de diferenciação em relação às células pluripotentes no estado inicial. Metodologias padrão de reprogramação celular nas quais os genes de pluripotência exógenos são introduzidos em uma célula somática, expressos e, em seguida, silenciados ou removidos das células pluripotentes resultantes, em geral são vistos como tendo características do estado inicial da pluripotência. Sob condições de cultura de células pluripotentes padrão, essas células permanecem no estado inicial, a menos que a expressão exógena do transgene seja mantida, em que as características do estado fundamental são observadas.

[00056] Como usado neste documento, o termo "morfologia de células-tronco pluripotentes" refere-se às características morfológicas clássicas de uma célula-tronco embrionária. A morfologia normal das células-tronco embrionárias é caracterizada por sua forma redonda e compacta, com uma alta razão núcleo-para-citoplasma, a presença notável de nucléolos e espaçamento intercelular típico.

[00057] Um "fator de pluripotência" ou "fator de reprogramação" refere-se a um agente ou a uma combinação de agentes usados para induzir ou aumentar a potência de desenvolvimento de uma célula. Os fatores de pluripotência incluem, sem limitação, polinucleotídeos, polipeptídeos e pequenas moléculas capazes de aumentar a potência de desenvolvimento de uma célula. Fatores de pluripotência exemplares incluem, por exemplo, fatores de transcrição OCT4 e SOX2 e agentes de reprogramação de pequenas moléculas, por exemplo, inibidor de TGFB, inibidor de GSK3, inibidor de MEK e inibidor de ROCK.

[00058] Como utilizado neste documento, o termo "diferenciação" é o processo pelo qual uma célula não especializada ("não comprometida") ou menos especializada adquire os recursos de uma célula especializada, tal como, por exemplo, uma célula sanguínea ou uma célula muscular. Uma célula diferenciada ou induzida pela diferenciação é aquela que assumiu uma posição mais especializada ("comprometida") dentro da linhagem de uma célula. O termo “comprometido", quando aplicado ao processo de diferenciação, refere-se a uma célula que prosseguiu a via da diferenciação até um ponto em que, em circunstâncias normais, continuará a se diferenciar em um tipo de célula específico ou subconjunto de tipos de células, e não pode, em circunstâncias normais, diferenciar-se em um tipo de célula diferente ou reverter para um tipo de célula menos diferenciado.

[00059] A diferenciação de células-tronco pluripotentes requer uma mudança no sistema de cultura, como a alteração dos agentes de estímulo no meio de cultura ou no estado físico das células. À estratégia mais convencional utiliza a formação de corpos embrionários (EBs) como um intermediário comum e crítico para iniciar a diferenciação específica da linhagem. Os "corpos embrionários" são aglomerados tridimensionais que demonstraram imitar o desenvolvimento embrionário, pois dão origem a numerosas linhagens na área tridimensional dos mesmos. Por meio do processo de diferenciação, em geral de poucas horas a dias, EBs simples (por exemplo, células-tronco pluripotentes agregadas induzidas a diferenciar) continuam a maturação e se desenvolvem em um EB cístico, quando, tipicamente dias a algumas semanas, são processados para continuar a diferenciação. A formação de EB é iniciada aproximando células-tronco pluripotentes em aglomerados tridimensionais de células multicamadas, normalmente isso é alcançado por um de vários métodos, incluindo permitir que células pluripotentes sedimentem em gotículas líquidas, sedimentando células para placas de cavidade com fundo em “U” ou por agitação mecânica. Para promover o desenvolvimento do EB, os agregados de células-tronco pluripotentes requerem sinais adicionais de diferenciação, pois os agregados mantidos no meio de manutenção da cultura de pluripotentes não formam EBs adequados. Como tal, os agregados pluripotentes de células-tronco precisam ser transferidos para um meio de diferenciação que forneça sinais para a linhagem de escolha. A cultura baseada em EB de células-tronco pluripotentes normalmente resulta na geração de populações celulares diferenciadas (camadas de ectoderma, mesoderma e endoderme) com proliferação modesta no aglomerado de células EB. Embora tenham sido comprovados como facilitadores da diferenciação celular, os EBs, no entanto, dão origem a células heterogêneas no estado de diferenciação variável, devido à exposição inconsistente das células na estrutura tridimensional a sinais de diferenciação do ambiente. Além disso, os EBs são trabalhosos para criar e manter. Além disso, a diferenciação celular através do EB é acompanhada de expansão celular modesta, o que também contribui para a baixa eficiência de diferenciação.

[00060] Em comparação, a "formação de agregados", distinta da "formação de EB", pode ser usada para expandir as populações de células derivadas de células-tronco pluripotentes. Por exemplo, durante a expansão de células-tronco pluripotentes baseadas em agregados, os meios de cultura são selecionados para manter a proliferação e a pluripotência. À proliferação celular em geral aumenta o tamanho dos agregados formando agregados maiores, esses agregados podem ser rotineiramente mecanicamente ou enzimaticamente dissociados em agregados menores para manter a proliferação celular dentro da cultura e aumentar o número de células. Diferentemente da cultura EB, as células cultivadas em agregados na cultura de manutenção mantêm marcadores de pluripotência. Os agregados de células- tronco pluripotentes requerem sinais adicionais de diferenciação para induzir diferenciação.

[00061] Conforme usado neste documento, "diferenciação de monocamada" é um termo que se refere a um método de diferenciação distinto da diferenciação através de aglomerados tridimensionais de células multicamadas, isto é, "formação de EB". A diferenciação de monocamada, entre outras vantagens divulgadas neste documento, evita a necessidade de formação de EB para o início da diferenciação. Como a cultura em monocamada não imita o desenvolvimento embrionário, como a formação de EB, a diferenciação em relação a linhagens específicas é considerada mínima, em comparação com todas as três diferenciações da camada germinativa em EB.

[00062] Como utilizado neste documento, uma célula "dissociada" refere-se a uma célula que foi substancialmente separada ou purificada para longe de outras células ou de uma superfície (por exemplo, uma superfície da placa de cultura). Por exemplo, as células podem ser dissociadas de um animal ou tecido por métodos mecânicos ou enzimáticos. Alternativamente, as células que se agregam in vitro podem ser dissociadas umas das outras, tal como por dissociação em uma suspensão de aglomerados, células únicas ou uma mistura de células e aglomerados únicos, enzimaticamente ou mecanicamente. Em ainda outra modalidade alternativa, as células aderentes são dissociadas de uma placa de cultura ou outra superfície. Assim, a dissociação pode envolver a quebra das interações celulares com a matriz extracelular (ECM) e substratos (por exemplo, superfícies de cultura) ou a quebra da ECM entre as células.

[00063] Como usado neste documento, "células alimentadoras" ou "alimentadores" são termos que descrevem células de um tipo que são cocultivadas com células de um segundo tipo para fornecer um ambiente no qual as células do segundo tipo podem crescer, conforme as células alimentadoras fornecem fatores de crescimento e nutrientes para o suporte do segundo tipo de célula. As células alimentadoras são opcionalmente de uma espécie diferente das células que estão suportando. Por exemplo, certos tipos de células humanas, incluindo células-tronco, podem ser suportadas por culturas primárias de fibroblastos embrionários de camundongo ou fibroblastos embrionários de camundongo imortalizados. As células alimentadoras podem tipicamente ser inativadas quando cocultivadas com outras células por irradiação ou tratamento com um agente antimitótico, tal como a mitomicina, para impedir que elas superem as células que estão suportando. As células alimentadoras podem incluir células endoteliais, células estromais (por exemplo, células epiteliais ou fibroblastos) e células leucêmicas. Sem limitar o precedente, um tipo específico de célula alimentadora pode ser um alimentador humano, tal como um fibroblasto de pele humana. Outro tipo de célula alimentadora pode ser fibroblastos embrionários de camundongo (MEF). Em geral, várias células alimentadoras podem ser usadas em parte para manter a pluripotência, direcionar a diferenciação em relação a uma determinada linhagem e promover a maturação de tipos de células especializados, tal como uma célula efetora.

[00064] Como usado neste documento, um ambiente "livre de alimentador" (FF) refere-se a um ambiente tal como uma condição de cultura, cultura de células ou meio de cultura que é essencialmente livre de células alimentadoras e/ou que não foi pré-condicionado pelo cultivo de células alimentadoras. Meio "pré-condicionado" refere-se a um meio colhido após as células alimentadoras terem sido cultivadas no meio por um período de tempo, tal como por pelo menos um dia. O meio pré-condicionado contém muitas substâncias mediadoras, incluindo fatores de crescimento e citocinas secretadas pelas células alimentadoras. Em algumas modalidades, um ambiente livre de alimentador está livre de ambas as células alimentadoras e também não é pré- condicionado pelo cultivo de células alimentadoras. As células alimentadoras incluem, porém sem limitação, células estromais, fibroblastos embrionários de camundongo, fibroblastos humanos, queratinócitis e células-tronco embrionárias.

[00065] "Cultura" ou "cultura de células" refere-se à manutenção, crescimento e/ou diferenciação de células em um ambiente in vitro. "Meio de cultura celular", "meio de cultura" ("meio" singular em cada caso), "suplemento" e "suplemento ao meio" referem-se a composições nutritivas que cultivam culturas celulares.

[00066] "Cultivar" ou "manter" refere-se à sustentação, propagação (crescimento) e/ou diferenciação de células fora do tecido ou do corpo, por exemplo, em um prato ou frasco de plástico estéril (ou plástico revestido) de cultura celular. O "cultivo" ou "manutenção" pode utilizar um meio de cultura como fonte de nutrientes, hormônios e/ou outros fatores úteis para propagar e/ou sustentar as células.

[00067] Como usado neste documento, “passar” ou "passagem" refere-se ao ato de dividir as células cultivadas subdividindo e plaqueando células em múltiplas superfícies ou vasos de cultura de células quando as células proliferarem até a extensão desejada. Em algumas modalidades “passar" ou "passagem!" refere-se a subdividir, diluir e plaquear as células. Como as células são passadas da superfície ou vaso da cultura primária para um conjunto subsequente de superfícies ou vasos, as culturas subsequentes podem ser referidas neste documento como "cultura secundária" ou "primeira passagem", etc. Cada ato de subdividir e plaquear em um novo vaso de cultura é considerado uma passagem. Em algumas modalidades, as células cultivadas são passadas a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias. Em algumas modalidades, os iPSCs selecionados inicialmente após a reprogramação são passados uma vez a cada 3 a 7 dias.

[00068] "Funcional", conforme usado no contexto da edição ou modificação genômica de iPSC e células não pluripotentes derivadas diferenciadas a partir das mesmas, ou edição ou modificação genômica de células não pluripotentes e iPSCs derivadas reprogramadas a partir das mesmas, refere-se a (1) no nível do gene - realizou knock-in/knock-out/knock- down da expressão gênica com sucesso, expressão gênica transgênica ou controlada, tal como expressão induzível ou temporal, em um estágio desejado de desenvolvimento celular, que é alcançado através da edição ou modificação direta do genoma, ou através de “passagem em" através da diferenciação ou reprogramação de uma célula inicial que é inicialmente geneticamente modificada; ou (2) no nível da célula - remoção, adição ou alteração bem- sucedida de uma funçãáo/características da célula por meio de (i) modificação da expressão gênica obtida na dita célula por meio de edição genômica direta, (ii) modificação da expressão gênica mantida na dita célula por “passagem em” através da diferenciação ou reprogramação de uma célula inicial que é inicialmente geneticamente modificada; (ili) regulação gênica posterior na dita célula como resultado de modificação da expressão gênica que só aparece em um estágio de desenvolvimento anterior da dita célula, ou aparece apenas na célula inicial que dá origem à dita célula por diferenciação ou reprogramação; ou (iv) função ou atributo celular aprimorado ou recém-atingido exibido no produto celular maduro, inicialmente derivado da edição ou modificação genômica realizada na iPSC, origem celular progenitora ou desdiferenciada.

[00069] Conforme usado neste documento, o termo "impressão genética" refere-se a informações genéticas ou epigenéticas que contribuem para atributos terapêuticos preferenciais em uma célula de origem ou em um iPSC e podem ser retidas nos iPSCs derivados da célula de origem e/ou nos não naturais derivados do iPSC células de linhagem hematopoiética. Como usado neste documento, "uma célula de origem" é uma célula não pluripotente que pode ser usada para gerar iPSCs por meio de reprogramação, e os iPSCs derivados da célula de origem podem ser ainda mais diferenciados para tipos de células específicos, incluindo quaisquer células de linhagem hematopoiética.

As iPSCs derivadas das células de origem e as células diferenciadas são às vezes chamadas coletivamente de “células derivadas”, dependendo do contexto.

Conforme usado neste documento, as impressões genéticas que conferem um atributo terapêutico preferencial são incorporadas nos iPSCs através da reprogramação de uma célula fonte selecionada que é específica para doadores, doenças ou respostas ao tratamento ou através da introdução de modalidades geneticamente modificadas no iPSC usando edição genômica.

No aspecto de uma célula fonte obtida a partir de um contexto especificamente selecionado de doador, doença ou tratamento, a impressão genética que contribui para atributos terapêuticos preferenciais pode incluir qualquer modificação genética ou epigenética específica do contexto que manifeste um fenótipo retido, isto é, um atributo terapêutico preferencial, que é transmitida para células derivadas da célula fonte selecionada, independentemente dos eventos moleculares subjacentes serem identificados ou não.

As células-fonte específicas de resposta do doador, da doença ou do tratamento podem compreender impressões genéticas que são retidas em iPSCs e células de linhagem hematopoiética derivadas, cujas impressões genéticas incluem, porém sem limitação, TOR monoespeciífico pré-arranjado, por exemplo, de uma célula T específica viral ou uma célula T exterminadora natural invariável (iNKT); polimorfismos genéticos rastreáveis e desejáveis, por exemplo, homozigotos para uma mutação pontual que codifica para o receptor CD16 de alta afinidade em doadores selecionados; e requisitos predeterminados de HLA, isto é, células doadoras selecionadas compatíveis com HLA exibindo um haplótipo com população aumentada.

Como utilizado neste documento, os atributos — terapêuticos — preferenciais incluem enxerto, diapedese, autodirecionamento, viabilidade, autorrenovação, persistência, regulação e modulação da resposta imune, sobrevivência e citotoxicidade melhorados de uma célula derivada. Um atributo terapêutico preferencial também pode estar relacionado à expressão do receptor de direcionamento de antígeno; apresentação de HLA ou falta do mesmo; resistência ao microambiente tumoral; indução de células imunes e modulações imunes; especificidade no alvo aprimorada com efeito não tumoral reduzido; resistência ao tratamento, tal como quimioterapia.

[00070] Conforme usado neste documento, "modificação genética" refere-se à edição genética incluindo aqueles (1) naturalmente derivados de rearranjos, mutações, impressão genética e/ou modificação epigenética, ou (2) obtidos por modificação genética por inserção, exclusão ou substituição no genoma de uma célula. A modificação genética, como utilizada neste documento, também inclui um ou mais atributos terapêuticos retidos de uma célula imune específica da fonte que é específica para doadores, doenças ou respostas ao tratamento.

[00071] Oo termo "propriedade terapêutica aprimorada", conforme usado neste documento, refere-se a uma propriedade terapêutica de uma célula que é aprimorada em comparação com uma célula típica do mesmo tipo geral de célula. No contexto das células imunes, por exemplo, uma célula NK com uma "propriedade terapêutica aprimorada" possuirá uma propriedade terapêutica aprimorada, aperfeiçoada e/ou aumentada em comparação com uma célula NK típica, não modificada e/ou de ocorrência natural. Propriedades terapêuticas de uma célula imunitária pode incluir, porém sem limitação, enxerto, diapedese, autodirecionamento, viabilidade, autorrenovação, persistência, regulação da resposta imunitária e modulação, sobrevivência, e citotoxicidade de células. As propriedades terapêuticas de uma célula imune também são manifestadas pela expressão do receptor alvo do antígeno; apresentação de HLA ou falta do mesmo; resistência ao microambiente tumoral; indução de células imunes e modulações imunes; especificidade no alvo aprimorada com efeito não tumoral reduzido; resistência ao tratamento, tal como quimioterapia.

[00072] Por “integração” pretende-se dizer que um ou mais nucleótidos de uma construção é inserida de forma estável no genoma celular, isto é, ligado de forma covalente à sequência de ácido nucleico no ADN cromossómico da célula. Por "integração alvejada", entende-se que o nucleotídeo (ou nucleotídeos) de uma construção é inserido no DNA cromossômico ou mitocondrial da célula em um sítio pré-selecionado ou em um “sítio de integração". O termo "integração", conforme usado neste documento, refere-se ainda a um processo que envolve a inserção de uma ou mais sequências ou nucleotídeos exógenos da construção, com ou sem deleção de uma sequência ou nucleotídeo endógeno no sítio de integração. No caso, onde há uma deleção no sítio de inserção, a "integração" pode ainda compreender a substituição da sequência endógena ou de um nucleotídeo que é excluído pelos um ou mais nucleotídeos inseridos.

[00073] Uma "construção" referese a uma macromolécula ou complexo de moléculas compreendendo um polinucleotídeo a ser entregue a uma célula hospedeira, in vitro ou in vivo. Um "vetor", como utilizado neste documento, refere-se a qualquer construção de ácido nucleico capaz de direcionar a entrega ou transferência de um material genético estranho para as células alvo, onde pode ser replicado e/ou expresso. O termo "vetor", conforme utilizado neste documento, compreende a construção a ser entregue. Um vetor pode ser uma molécula linear ou circular. Um vetor pode ser integrador ou não integrador. Os principais tipos de vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetor epissomal, vetores virais, cosmídeos e cromossomos artificiais. Os vetores virais incluem, mas não estão limitados a, vetor de adenovírus, vetor de vírus adenoassociado, vetor de retrovírus, vetor de lentivírus, vetor de vírus Sendai e similares.

[00074] Como usado neste documento, o termo "codificação" refere-se à propriedade inerente de sequências específicas de nucleotídeos em um polinucleotídeo, como um gene, um cDNA ou um mRNA, para servir como modelos para a síntese de outros polímeros e macromoléculas em processos biológicos tendo uma sequência definida de nucleotídeos (isto é, rRNA, tRNA e mMRNA) ou uma sequência definida de aminoácidos e as propriedades biológicas resultantes das mesmas. Assim, um gene codifica uma proteína se a transcrição e translação do mMRNA correspondente a esse gene produzem a proteína em uma célula ou outro sistema biológico. Tanto a cadeia de codificação, cuja sequência nucleotídica é idêntica à sequência de MRNA e em geral é fornecida nas listagens de sequências, quanto a cadeia não codificante, usada como modelo para a transcrição de um gene ou cDNA, podem ser denominadas codificação de proteína ou outro produto desse gene ou cDNA.

[00075] Como usado neste documento, o termo "exógeno" pretende significar que a molécula referenciada ou a atividade referenciada é introduzida na célula hospedeira. A molécula pode ser introduzida, por exemplo, através da introdução de um ácido nucleico codificador no material genético do hospedeiro, como por integração em um cromossomo hospedeiro ou como material genético não cromossômico, tal como um plasmídeo. Por conseguinte, o termo tal como é utilizado em referência à expressão de um ácido nucleico codificante refere-se à introdução do ácido nucleico codificante em uma forma expressável na célula. O termo "endógeno" refere-se a uma molécula ou atividade referenciada que está presente na célula hospedeira. Do mesmo modo, o termo quando utilizado em referência à expressão de um ácido nucleico codificante refere-se à expressão de um ácido nucleico codificante contido na célula e não introduzido exogenamente.

[00076] Como usado neste documento, um "gene de interesse" ou "uma sequência polinucleotídica de interesse" é uma sequência de DNA que é transcrita em RNA e, em alguns casos, traduzida em um polipeptídeo in vivo quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Um gene ou polinucleotídeo de interesse pode incluir, porém sem limitação, sequências procarióticas, CcDNA de mRNA eucariótico, sequências de DNA genômico de DNA eucariótico (por exemplo, mamífero) e sequências de DNA sintéticas. Por exemplo, um gene de interesse pode codificar um miRNA, um

ShRNA, um polipeptídeo nativo (isto é, um polipeptídeo encontrado na natureza) ou um fragmento do mesmo; um polipeptídeo variante (isto é, um mutante do polipeptídeo nativo com menos de 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo nativo) ou um fragmento do mesmo; um polipeptídeo ou fragmento de peptídeo manipulado, um peptídeo ou polipeptídeo terapêutico, um marcador de imagem, um marcador selecionável e similares.

[00077] Como utilizado neste documento, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, seja desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. A sequência de um polinucleotídeo é composta de quatro bases nucleotídicas: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); e uracila (U) para timina quando o polinucleotídeo é RNA. Um polinucleotídeo pode incluir um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, EST ou etiqueta SAGE), éxons, íntrons, RNA mensageiro (mMRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramiíificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácidos nucleicos e iniciadores. Polinucleotídeo também se refere a moléculas de cordão dupla e único.

[00078] Como usado neste documento, o termo "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usados de forma intercambiável e referem-se a uma molécula com resíduos de aminoácidos covalentemente ligados por ligações peptídicas. Um polipeptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos, e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos de um polipeptídeo. Como utilizado neste documento, os termos se referem a ambas as cadeias curtas, que também são comumente referidas na técnica como peptídeos, oligopeptídeos e oligômeros, por exemplo, e as cadeias mais longas, que em geral são referidas na técnica como polipeptídeos ou proteínas. "Polipeptídeos" incluem, por exemplo, fragmentos biologicamente ativos, — polipeptídeos — substancialmente — homólogos, — oligopeptídeos, homodímeros, heterodímeros, variantes de polipeptídeos, polipeptídeos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusão, entre outros. Os polipeptídeos incluem polipeptídeos naturais, polipeptídeos recombinantes, polipeptídeos sintéticos ou uma combinação dos mesmos.

[00079] "Ligado —operacionalmente" refere-se à associação de sequências de ácidos nucleicos em um único fragmento de ácido nucleico, de modo que a função de um seja afetado pela outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação ou RNA funcional quando é capaz de afetar a expressão dessa sequência de codificação ou RNA funcional (isto é, a sequência de codificação ou RNA funcional está sob o controle transcricional do promotor). As sequências de codificação podem ser operacionalmente ligadas a sequências reguladoras na orientação de sentido ou antisentido.

[00080] Como usado neste documento, o termo "engajador" refere-se a uma molécula, por exemplo, um polipeptídeo de fusão, que é capaz de formar uma ligação entre uma célula imune, por exemplo, uma célula T, uma célula NK, uma célula NKT, uma célula B, um macrófago, um neutrófiio e uma célula tumoral; e ativar a célula imune. Exemplos de engajadores incluem, porém sem limitação, engajadores de células T biespecíficos (BiTEs), engajadores de células exterminadoras biespecíficos (BiKEs), engajadores de células exterminadoras triespecíficos ou engajadores de células exterminadoras multiespecíficos ou engajadores universais compatíveis com vários tipos de células imunes.

[00081] Conforme usado neste documento, o termo "receptor desencadeador de superfície" refere-se a um receptor capaz de desencadear ou iniciar uma resposta imune, por exemplo uma resposta citotóxica. Os receptores de desencadeamento de superfície podem ser projetados e podem ser expressos em células efetoras, por exemplo uma célula T, uma célula NK, uma célula NKT, uma célula B, um macrófago, um neutrófilo. Em algumas modalidades, o receptor de desencadeamento de superfície facilita o engajamento de anticorpos bi ou multiespecíficos entre as células efetoras e a célula alvo específica, por exemplo, uma célula tumoral, independente dos receptores naturais e tipos de células da célula efetora. Utilizando esta abordagem, pode-se gerar iPSCs compreendendo um receptor universal desencadeador de superfície e depois diferenciar tais IPSCs em populações de vários tipos de células efetoras que expressam o receptor universal desencadeador de superfície.Por "universal", entende-se que o receptor desencadeador de superfície pode ser expresso e ativar quaisquer células efetoras, independentemente do tipo de célula, e todas as células efetoras que expressam o receptor universal podem ser acopladas ou ligadas aos engajadores que têm o mesmo epítopo reconhecível pelo receptor de ativação da superfície, independentemente das especificidades de aglutinação do tumor do engajador. Em algumas modalidades, os engajadores com a mesma especificidade de direcionamento de tumor são usados para acoplar-se ao receptor universal desencadeador de superfície. Em algumas modalidades, os engajadores com especificidade de direcionamento de tumor diferente são usados para acoplar-se com o receptor universal desencadeador de superfície. Como tal, um ou vários tipos de células efetoras podem ser acoplados para exterminar um tipo específico de células tumorais em alguns casos e para exterminar dois ou mais tipos de tumores em alguns outros casos. Um receptor de desencadeamento de superfície em geral compreende um domínio coestimulador para a ativação de células efetoras e um antiepítopo que é específico ao epítopo de um engajador. Um agente biespecífico é específico para o antiepítopo de um receptor desencadeador de superfície em uma extremidade e é específico para um antígeno tumoral na outra extremidade.

[00082] Conforme utilizado neste documento, o termo “proteína chave de segurança” refere-se a uma proteína modificada projetada para prevenir toxicidade potencial ou efeitos de outra forma adversos de uma terapia celular. Em alguns casos, a expressão da proteína chave de segurança é controlada condicionalmente para enderçar preocupações de segurança para células modificadas transplantadas que tenham incorporado permanentemente o gene que codifica a proteína chave de segurança no seu genoma. Essa regulação condicional pode ser variável e incluir controle por meio de uma ativação pós-traslacional mediada por moléculas pequenas e regulação transcricional específica de tecido e/ou temporal. A chave de segurança pode mediar a indução de apoptose, inibição da síntese de proteínas, replicação de DNA, detenção do crescimento, regulação genética transcricional e pós- transcricional e/ou depleção mediada por anticorpos.Em alguns casos, a proteína chave de segurança é ativada por uma molécula exógena, por exemplo, um profármaco, que quando ativada desencadeia apoptose e/ou morte celular de uma célula terapêutica. Exemplos de proteínas chave de segurança, incluem, mas não estão limitados a genes suicidas, tais como caspase 9 (ou caspase 3 ou 7), timidina quinase, citosina desaminase, de células-B CD20, EGFR modificado, e qualquer combinação dos mesmos. Nesta estratégia, um profármaco que é administrado no evento de um evento adverso é ativado pelo produto do gene suicida e extermina a célula transduzida.

[00083] Como usado neste documento, o termo "proteínas ou peptídeos farmaceuticamente ativos" refere-se a proteínas ou peptídeos que são capazes de alcançar um efeito biológico e/ou farmacêutico em um organismo. Uma proteína farmaceuticamente ativa tem propriedades curativas ou paliativas de cura contra uma doença e pode ser administrada para melhorar a mitigação, aliviar, reverter ou diminuir a severidade de uma doença. Uma proteína farmaceuticamente ativa também tem propriedades profiláticas e é usada para prevenir o aparecimento de uma doença ou diminuir a severidade de tal doença ou condição patológica quando ela surge. As proteínas farmaceuticamente ativas incluem uma proteína ou peptídeo inteiro ou fragmentos farmaceuticamente ativos dos mesmos. Também inclui análogos farmaceuticamente ativos da proteína ou peptídeo ou análogos de fragmentos da proteína ou peptídeo. O termo proteína farmaceuticamente ativa também se refere a uma pluralidade de proteínas ou peptídeos que agem de forma cooperativa ou sinérgica para fornecer um benefício terapêutico. Exemplos de proteínas ou peptídeos farmaceuticamente ativos incluem, mas sem limitação a, receptores, proteínas de aglutinação, fatores de transcrição e translação, proteínas supressoras de crescimento de tumores, anticorpos ou fragmentos dos mesmos, fatores de crescimento e/ou citocinas.

[00084] Como usado neste documento, o termo "molécula de sinalização" refere-se a qualquer molécula que modula, participa, inibe, ativa, reduz ou aumenta a transdução de sinal celular. A transdução de sinal refere-se à transmissão de um sinal molecular na forma de modificação química pelo recrutamento de complexos de proteínas ao longo de uma via que finalmente desencadeia um evento bioquímico na célula. As vias de transdução de sinal são bem conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitação, sinalização de receptor acoplado à proteína G, sinalização de receptor de tirosina quinase, sinalização de integrina, sinalização de pedágio, sinalização de canal iônico fechado por ligante, via de sinalização ERK/MAPK, via de sinalização Wnt, via dependente de cAMP e via de sinalização IP3/DAG.

[00085] Como usado neste documento, o termo "modalidade de alvejamento" refere-se a uma molécula, por exemplo, um polipeptídeo, que é geneticamente incorporado em uma célula para promover a especificidade do antígeno e/ou epítopo que inclui, porém sem limitação: i) especificidade do antígeno relacionada a um receptor único de antígeno quimérico (CAR) ou receptor de célula T (TCR), ii) especificidade do engajador relacionado a anticorpos monoclonais ou engajador biespecífico, iii) alvejamento da célula transformada; iv) alvejamento da célula-tronco cancerígena; v) outras estratégias de alvejamento na ausência de um antígeno específico ou molécula de superfície.

[00086] Conforme usado neste documento, o termo "específico" ou "especificidade" pode ser usado para se referir à capacidade de uma molécula, por exemplo, um receptor ou um engajador, de se aglutinar seletivamente a uma molécula alvo, em contraste com aglutinação não específicas ou não seletiva.

[00087] "Deficiente em HLA", incluindo deficiente em HLA classe | ou deficiente em HLA classe Il, ou ambos, refere-se a células que carecem ou não mantêm mais ou têm nível reduzido de expressão superficial de um complexo de MHC completo que compreende um heterodímero de proteína HLA classe | e/ou um heterodímero de HLA classe Il, de modo que o nível diminuído ou reduzido seja menor que o nível naturalmente detectável por outras células ou por métodos sintéticos. A deficiência de HLA classe | pode ser alcançada pela deleção funcional de qualquer região do local da HLA classe | (cromossomo 6p21) ou deleção ou redução do nível de expressão dos genes associados ao HLA classe |, incluindo, sem limitação, a microglobulina beta-2 (B2M), gene TAP 1, gene TAP 2 e Tapasina. A deficiência de HLA classe |l pode ser alcançada pela deleção funcional ou redução de genes associados a HLA-II, incluindo, sem limitação, REXANK, CIITA, RFX5 e RFXAP. Não era claro, antes desta invenção, se as iPSCs deficientes ou alteradas no complexo HLA têm a capacidade de entrar em desenvolvimento, amadurecer e gerar células funcionais diferenciadas enquanto mantêm a atividade modulada. Além disso, não estava claro, antes desta invenção, se as células diferenciadas deficientes no complexo HLA podem ser reprogramadas para iPSCs e mantidas como células-tronco pluripotentes enquanto têm a deficiência do complexo HLA. Falhas imprevistas durante a reprogramação celular, manutenção da pluripotência e diferenciação podem estar relacionadas a aspectos que incluem, porém sem limitação, expressão gênica específica do estágio de desenvolvimento ou a falta da mesma, requisitos para apresentação complexa de HLA, derramamento de proteínas das modalidades de expressão de superfície introduzidas, necessidade de reprogramação clonal própria e eficiente e necessidade de reconfiguração de protocolos de diferenciação.

[00088] “PSC deficiente em HLA modificado", como usado neste documento, refere-se a iPSC deficiente em HLA que é posteriormente modificado pela introdução de genes que expressam proteínas relacionadas, mas não limitadas a um potencial de diferenciação aprimorado,

alvejamento de antígeno, apresentação de antígeno, reconhecimento de anticorpos, persistência, evasão imunológica, resistência à supressão, proliferação, coestimulação, estimulação de citocinas, produção de citocinas (autócrinas ou parácrinas), quimiotaxia e citotoxicidade celular, tal como proteínas HLA classe | não clássicas (por exemplo, HLA-E e HLA-G), receptor de antígeno quimérico (CAR), receptor de células T (TCR), receptor de CD16 Fc, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 41BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3z, 41BBL, CD47, CD113 e PDL1. As células que são "deficientes em HLA modificado" também incluem células que não são iPSCs.

[00089] "Receptores Fc", FcR abreviado, são classificados com base no tipo de anticorpo que eles reconhecem. Por exemplo, aqueles que se aglutinam à classe mais comum de anticorpos, IgG, são chamados receptores Fc-gama (FcyR), aqueles que se aglutinam a IgA são chamados receptores Fc-alfa (FcaR) e aqueles que se aglutinam a IgE são chamados receptores Fc-epsilon (FceR). As classes de FcR também são distinguidas pelas células que as expressam (macrófagos, granulócitos, células exterminadoras naturais, células T e B) e pelas propriedades de sinalização de cada receptor. Os receptores Fc-gama (FcyR) incluem vários membros, FeyRI (CD64), FCcyRIIA (CD32), FeyRIIB (CD32), FeyRIINA (CD16a), FeyRIIIB (CD16b), que diferem em suas afinidades de anticorpos devido à estrutura molecular diferente dos mesmos.

[00090] CD16 foi identificado como duas isoformas, receptores Fc FceyRilla (CD16a) e FeyRIllb (CD16b). CD16a é uma proteína transmembranar expressa por células NK, que aglutina a IgG monomérica fixada às células alvo para ativar as células NK e facilitar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC). "CD16 de alta afinidade", "CD16 não clivável" ou "CD16 não clivável de alta afinidade", como utilizado neste documento, refere-se a uma variante de CD16. O CD16 do tipo selvagem tem baixa afinidade e está sujeito ao derramamento de extoma, um processo de clivagem proteolítica que regula a densidade superficial das células de várias moléculas da superfície celular nos leucócitos após a ativação das células NK. F176V e F158V são variantes exemplificativas de CD16 com alta afinidade; enquanto a variante S197P é um exemplo de versão não clivável de CD16.

[00091] O termo "terapia celular adotiva", conforme usado neste documento, refere-se a uma imunoterapia baseada em células que, conforme usada neste documento, se refere à transfusão de linfócitos autólogos ou alogênicos, tal como células CD34, células endoteliais hemogênicas, células- tronco hematopoiéticas ou progenitoras, células progenitoras multipotentes hematopoiéticas, progenitoras de células T, progenitoras de células NK, células T, células NKT, células NK, células B ou células reguladoras imunes, geneticamente modificadas ou não, que foram expandidas ex vivo antes da dita transfusão.

[00092] Uma "quantidade terapeuticamente suficiente", como utilizada neste documento, inclui dentro do seu significado uma quantidade não tóxica, mas suficiente e/ou eficaz da composição terapêutica e/ou farmacêutica específica à qual ela se refere para proporcionar um efeito terapêutico desejado. A quantidade exata necessária varia de sujeito para sujeito, dependendo de fatores como a saúde geral do paciente, a idade do paciente, o estágio e a severidade da condição. Em modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente suficiente é suficiente e/ou eficaz para melhorar, reduzir e/ou melhorar pelo menos um sintoma associado a uma doença ou condição do sujeito a ser tratado.

[00093] Como utilizado neste documento, o termo “sujeito" refere-se a qualquer animal, de preferência um paciente humano, gado ou outro animal domesticado.

[00094] Conforme usado neste documento, os termos "tratar", "tratamento" e similares, quando usados em referência a um sujeito que necessita de um tratamento terapêutico, referem-se à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado, incluindo, sem limitação, alcançar uma melhoria ou eliminação dos sintomas de uma doença. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença ou sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de alcançar uma melhoria ou eliminação de sintomas ou de fornecer uma cura parcial ou completa para uma doença e/ou efeito adverso atribuível para a doença. O termo "tratamento" inclui qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um humano, e inclui: (a) prevenir que a doença ocorra em um sujeito que pode ser predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado como tendo a mesma; (b) inibir a doença ou interromper seu desenvolvimento; (c) aliviar a doença ou causar regressão da doença ou eliminar completamente ou parcialmente os sintomas da doença; e (d) restaurar o indivíduo a um estado pré-doença, tal como reconstituir o sistema hematopoiético.

1 UM SISTEMADEREPROGRAMAÇÃO NOVO E AS

CELULAS GERADAS DO MESMO

[00095] Em geral, a presente divulgação fornece um processo de reprogramação iniciado colocando células não pluripotentes em contato com pelo menos um fator de reprogramação e, opcionalmente, na presença de uma combinação de um receptor de TGFB/inibidor de ALK, um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e um inibidor de ROCK (FRM; Tabela 1).

Convencional (Conv.) do Destino Meio (FMM) Meio (FRM)

E E

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[00096] Um aspecto da presente invenção fornece um método para obter iPSCs livres de pegadas, usando um sistema plasmídeo que medeia a expressão transgênica transitória e temporal. O sistema plasmídeo compreende um ou mais primeiros plasmídeos (V1) carregando uma origem de replicação e polinucleotídecos que codificam o fator (ou fatores) de reprogramação, mas sem EBNA, e um segundo plasmídeo (V2) compreendendo EBNA que codifica polinucleotídeos, mas sem uma origem de replicação ou fator de reprogramação que codifica as sequências.

[00097] A combinação dos plasmídeos permite a expressão citoplasmática de transgenes (EBNA e fatores de reprogramação exógenos) temporalmente na célula após a transdução e gera uma população de células intermediárias livres de EBNA que apresentam uma morfologia de transição ou uma alteração morfológica (por exemplo, mesenquimal a epitelial (MET)), mas carece de qualquer morfologia celular pluripotente ou expressão gênica de pluripotência endógena, tal como OCTA4, mas são capazes de entrar em um estado pluripotente autossustentável estável. Essa população celular distinta é assim denominada como "células de reprogramação". Uma célula de reprogramação, conforme descrita neste documento, também difere da célula somática antes da introdução dos fatores de reprogramação, não apenas morfologicamente, mas também funcionalmente, na medida em que é capaz de reprogramar para um estado pluripotente, dado um período de tempo suficiente sob uma condição de cultura que suporta o processo de reprogramação (por exemplo, FMM). Como tal, um aspecto da presente divulgação fornece uma célula de reprogramação livre de EBNA com uma morfologia de transição e capaz de continuar o processo de reprogramação para estabelecer um estado pluripotente estável. Em algumas modalidades, as células de reprogramação livres de EBNA são livres de transgene. A população de iPSC resultante e os iPSCs são, portanto, livres de pegadas sem a necessidade de seleção contra EBNA ou passagem contínua para eliminar EBNA e transgenes, conforme necessário na reprogramação epissomal. Além disso, as iPSCs geradas usando esse sistema plasmídeo transitório e temporal de vida curta têm pelo menos uma das propriedades, incluindo clonalidade e estabilidade genética melhoradas, alta homogeneidade, alta taxa de cariótipo normal, reversão mínima ou diferenciação espontânea; e são capazes de sobrevivência e classificação de células únicas, expansão e autorrenovação a longo prazo e diferenciação de monocamada, com ou sem condições de alimentação.

[00098] Em geral, é aceito no campo que os fatores de reprogramação introduzidos exogenamente precisam ser expressos por pelo menos 10 a 12 dias a fim de gerar iPSCs (Okita et a/., Science (2008); 322: 949 a 953; Brambrink et a/., Cell Stem Cell (2008); 2(2):151 a 159; Stadtfeld et al., Cell Stem Cell (2008); 2(3):230 a 240). A transdução adenoviral dos fatores de transcrição exógena às vezes requer transfecção repetida devido à natureza transitória da expressão do gene mediada pelo vetor viral não integrador. Além disso, a eficiência de reprogramação usando o método adenoviral é de apenas 0,001 a 0,0001% em camundongos (Stadtfeld et a/., Science (2008); 322:945 a 946) e 0,0002% em células humanas (Zhou et a/., Stem Células (2009); 27:2667 a 2674). No caso da reprogramação mediada pelo vetor viral de Sendai, a transdução múltipla não é necessária porque esse vetor viral pode produzir continuamente grandes quantidades de proteína exógena por um longo período de tempo, criando uma certa dependência da expressão do transgene para manter a pluripotência. O vírus Sendai pode reprogramar fibroblastos neonatais e adultos, assim como células sanguíneas em cerca de 25 dias, com uma eficiência mais alta de 0,1% a 1%. No entanto, são necessárias cerca de 10 passagens para que o vírus se perca completamente das iPSCs reprogramadas recentemente, o que é considerado uma desvantagem da reprogramação baseada em Sendai, incluindo maior chance de integração do DNA ou seleção de clones do tipo iPSC que são suportados pela expressão transgênica e não o circuito endógeno dos genes pluripotentes (Fusaki et a/., Proc Jon Acad Ser B Phys Biol Sci. (2009); 85:348 a 362; Seki et a/., Cell Stem Cell (2010); 7:11 a 14; Ban et a/., PNAS (2011); 108:14234 a 14239).

[00099] Os plasmídeos, contendo um promotor e transgene (ou transgenes), apresentam baixa captação nuclear, não são replicáveis e são perdidos rapidamente das células transfectadas. Quando usados para gerar células iPS, os vetores de plasmídeo, incluindo vetores de DNA de minicírculo (plasmídeo mínimo, livre de DNA bacteriano), demonstraram resultar em células reprogramadas em condições de alimentação com eficiência inaceitavelmente baixa e somente através de transfecções diárias repetidas a reprogramação eficiente é vista, mas muitas vezes resulta na integração do genoma hospedeiro dos transgenes transfectados (Okita et a/., Science (2008); 322:949 a 953: utilizado plasmídeo padrão com transfecção diária repetida, e integração do genoma observado; com obtenção de 1 a 4 clones livres de integração de 10E6 células; Narsinh et a/., Nat Protoc. (2011); 6 (1): 78 a 88: eficiência em torno de 0,005%).

[000100] Comparado ao plasmídeo, o epissoma pode sustentar e replicar autonomamente no citoplasma ou junto com o cromossomo de uma célula hospedeira em divisão. A reprogramação celular mediada por vetor epissomal foi demonstrada principalmente com a aplicação de vetores epissomais baseados no vírus Epstein-Barr (EBV). Além do gene (ou genes) exógeno de interesse, os vetores epissomais baseados em EBV compreendem polinucleotídeos que codificam a proteína do antígeno-1 nuclear Epstein-Barr (EBNA1) e carregam a origem da replicação (oriP) derivada do EBV. O EBNA se aglutina aos cromossomos celulares, permitindo a localização do núcleo do vetor e a ligação do oriP às cromátides irmãs. Portanto, um EBNA expresso de maneira estável atua em conjunto com o oriP para replicar e reter o vetor epissomal no núcleo das células em divisão, o que fornece uma expressão estável e de longo prazo dos genes exógenos, incluindo o EBNA na célula, aumentando a probabilidade de integração de transgene já que os vetores epissomais persistem tipicamente por aproximadamente 4 a 8 semanas (Yates et al., 1984, 1985; Reisman et a/., 1985; Sugden et a/., 1985). Embora os vetores epissomais de oriP/EBNA melhorem a eficiência da reprogramação em comparação com a reprogramação de plasmídeos, ele ainda está em torno de uma faixa insatisfatória de 0,006% a 0,1% (Malik et al., Methods Mol Biol. (2013); 997:23 a 33).

[000101] Além de expressar continuamente EBNA no mesmo vetor que oriP, onde o EBNA é replicado e também transcrito, um EBNA estavelmente expresso também pode ser fornecido integrando a sequência de codificação de EBNA no genoma da célula hospedeira para melhorar a taxa de transfecção do vetor que contém oriP e transgenes (Mazda et al., 1997, J. Immunol. Methods; 204:143 a 151). No entanto, esse projeto, sem manipulação adicional das células, acaba por falhar no propósito de obter uma célula pluripotente livre de pegada.

[000102] O presente sistema de reprogramação, em algumas modalidades, compreende pelo menos um primeiro plasmídeo e pelo menos um segundo plasmídeo, em que o primeiro plasmídeo tem uma construção que fornece uma oriP e um ou mais fatores de reprogramação, mas não EBNA; em que o segundo plasmídeo tem uma construção que fornece EBNA, mas não oriP ou fatores de reprogramação.

Em algumas modalidades, o sistema de reprogramação compreende mais de um primeiro plasmídeo, em que cada primeiro plasmídeo fornece o mesmo ou diferente fator de reprogramação ou uma combinação dos mesmos.

A reprogramação usando este sistema plasmídico é diferente do método convencional de reprogramação plasmídica conhecido no campo, pois não há necessidade de múltiplas transfecções das células, não há integração genômica de transgenes, mas com uma eficiência de reprogramação muito maior.

Em comparação à reprogramação epissomal, em que o EBNA e o fator (ou fatores) de reprogramação são colocados na mesma cassete de expressão e com um oriP presente no mesmo vetor, o sistema plasmídeo de algumas modalidades não fornece replicação de EBNA e/ou expressão contínua de EBNA e transgenes no núcleo, mas apenas permite uma expressão transitória/citoplasmática por um curto período e antes do aparecimento da morfologia das células de pluripotência e da expressão induzida de genes de pluripotência endógenos, tal como OCTA4. Portanto, a presente divulgação fornece iPSCs livres de pegada geradas a partir de células de reprogramação que estão livres da expressão de EBNA em um estágio inicial (por exemplo, por volta do dia 4 a 6 após a transfecção de um processo típico de reprogramação de 21 a 32 dias), eliminando o caso contrário que é necessária seleção positiva ou passagem contínua dos iPSCs para obter iPSCs livres de pegada na reprogramação epissomal.

Em algumas modalidades, a curta duração para a expressão de EBNA é de cerca de 4, 5, 6, 7 ou 8 dias após a transfecção, mas não mais do que 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 22, 23, 24 ou dias após a transfecção.

[000103] A origem da replicação (oriP) é o sítio em ou próximo ao qual a replicação do DNA inicia e é composta por duas sequências de ação cis: FR (família de repetições) serve como sítio de aglutinação ao EBNA (antígeno nuclear de Epstein-Barr) e também um potenciador transcricional para promotores em cis; e DS (elemento de simetria da díade) é para o início da síntese de DNA após a aglutinação de FR da EBNA e é regulado pelo sistema de replicação da célula hospedeira.

A aglutinação de EBNA aos sítios FR afeta a partição eficiente dos plasmídeos oriP após o ciclo de replicação uma vez por célula, que localiza os plasmídeos oriP no núcleo e mantém a retenção do plasmídeo nas duas células filhas após a divisão celular parental.

Em uma modalidade, a oriP pode ser uma origem de replicação de um vírus Papovaviridae ou um vírus Herpesviridae.

Em algumas modalidades, o oriP pode ser uma origem de replicação de um vírus Polyomavirinae, um vírus Papillomavirinae ou um vírus Gammaherpesvirinae.

Em algumas outras modalidades, a oriP pode ser uma origem de replicação de SV40, vírus BK (BKV), vírus do papiloma bovino (BPV) ou vírus Epstein-Barr (EBV). Em uma modalidade, a oriP corresponde ou é derivada da origem de replicação do tipo selvagem do EBV.

Em uma modalidade, o EBNA é um polipeptídeo que corresponde a, ou um derivado de, uma proteína do tipo selvagem correspondente ao EBNA-1 de EBV (UniProtKB/Swiss-Prot Adesão No: P03211; SEQ ID NO: 1). Um derivado de EBNA-1 é um polipeptídeo que, em relação a um polipeptídeo de tipo selvagem correspondente, possui uma sequência de aminoácidos modificada incluindo exclusão, inserção ou substituição de um ou mais aminoácidos de EBNA-1. Em uma modalidade, o derivado de EBNA compreende um truncamento em comparação com o EBNA de tipo selvagem.

Em uma modalidade, a proteína EBNA truncada tem um polipeptídeo de SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades, o derivado de EBNA-1 codifica uma proteína com pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos para resíduos de cerca de 1 a cerca de 90, resíduos de 1 a cerca de 40, resíduos de 41 a cerca de 90, resíduos de 91 a cerca de cerca de 324 (região de repetição rica em GA),

resíduos de cerca de 325 a cerca de 377, resíduos de cerca de 378 a cerca de 386, resíduos de cerca de 451 a cerca de 608 e/ou resíduos de cerca de 609 a cerca de 641 no EBNA-1.

[000104] Os fatoresdereprogramação conhecidos pela reprogramação de células-tronco no campo podem ser todos usados com o presente sistema e método de reprogramação. Em uma modalidade, os fatores de reprogramação incluem, porém sem limitação, OCT4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPAA4, DNMT3B, ZIC3 e LITD1. Os polinucleotídeos que codificam esses fatores de reprogramação podem estar compreendidos na mesma construção plasmídica contendo oriP, mas não EBNA (isto é, o mesmo primeiro plasmídeo). Os polinucleotídeos que codificam esses fatores de reprogramação podem estar compreendidos em pelo menos duas construções de plasmídeo, cada uma contendo oriP, mas não EBNA (isto é, múltiplos primeiros plasmídeos). Os polinucleotídeos que codificam esses fatores de reprogramação podem ser compreendidos em uma construção policistrônica (isto é, múltiplas sequências de codificação controladas por um promotor) ou construção não policistrônica (várias sequências de codificação com algumas controladas por um promotor e outras por um promotor diferente). O promotor pode ser, por exemplo, CMV, EF1a, PGK, CAG, UBC e outros promotores adequados que sejam constitutivos, indutíveis, regulados endogenamente ou específicos temporal, tecidular ou tipo celular. Em uma modalidade, o promotor é CAG. Em outra modalidade, o promotor é EF1a. Em algumas modalidades, a construção policistrônica pode fornecer um único quadro de leitura aberto (por exemplo, várias sequências de codificação são operacionalmente ligadas por uma sequência de codificação de peptídeo autoclivável, tal como 2A) ou vários quadros de leitura abertos (por exemplo, várias sequências de codificação ligadas por um Sítio Interno de Entrada do Ribossomo ou IRES).

[000105] Em algumas modalidades do sistema plasmídeo da aplicação, uma ou mais construções plasmídicas (primeiros plasmídeos) compreendem coletivamente polinucleotídeos que codificam um ou mais fatores de reprogramação selecionados do grupo que consiste em OCTA4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 e LITD1. Em algumas modalidades, apenas uma primeira construção de plasmídeo está no sistema e fornece todos os fatores de reprogramação selecionados. Em algumas outras modalidades, existem duas ou mais primeiras construções de plasmídeo no sistema que fornecem um ou mais fatores de reprogramação, com cada construção compreendendo os mesmos ou diferentes fatores de reprogramação codificados por pelo menos uma cópia do polinucleotídeo. Em uma modalidade, a uma ou mais primeiras construções de plasmídeo no sistema compreendem pelo menos polinucleotídeos que codificam OCT4. Em uma modalidade, a uma ou mais primeiras construções de plasmídeo compreendem coletivamente pelo menos dois polinucleotídeos que codificam OCT4. Em outra modalidade, a uma ou mais primeiras — construções = de plasmídeo compreendem coletivamente polinucleotídeos que codificam OCT4 e SOX2. Em uma modalidade, a uma ou mais primeiras construções de plasmídeo compreendem coletivamente pelo menos um polinucleotídeo que codifica OCT4, mas não c-MYC. Em algumas modalidades, a uma ou mais primeiras construções de plasmídeo compreendem coletivamente pelo menos dois polinucleotídeos que codificam OCT4 e um ou mais polinucleotídeos que codificam pelo menos um dentre ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 e LITD1.

[000106] Quando uma primeira construção plasmídica compreende mais de um polinucleotídeo que codifica fatores de reprogramação, os polinucleotídeos adjacentes são operacionalmente conectados por uma sequência ligante que codifica um peptídeo de autoclivagem ou um IRES. O peptídeo de autoclivagem pode ser um peptídeo 2A. Os péptidos 2A podem ser derivados a partir de FMDV (vírus da doença da febre aftosa), ERAV (vírus da rinite equina A), PTV-1 (vírus tescho porcino-1), ou TaV (vírus thosea asigna), que são referidos como F2A, E2A, P2A e T2A, respectivamente. Os múltiplos peptídeos 2A em uma primeira construção plasmídica podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, dois peptídeos 2A vizinhos mais próximos são diferentes, por exemplo: RF-2A1-RF-2A2-RF-2A1, em que 2A1 e 2A2 são diferentes.

[000107] Uma biblioteca da primeira construção plasmídica pode ser pré-construída, com cada construção contendo um ou mais polinucleotídeos que codificam vários números, tipos e/ou combinações de fatores de reprogramação. A reprogramação é conhecida por ser um processo ineficiente e estocástico, com latência longa. O tempo e os níveis de expressão e a estequiometria dos fatores de reprogramação conduzem à cinética de reprogramação em diferentes fases da reprogramação e estados intermediários das células submetidas à reprogramação e determinam a conclusão da reprogramação. A estequiometria do fator de reprogramação também afeta a eficiência da reprogramação e produz iPSCs com qualidade variada, tal como pluripotência iniciada versus estado fundamental e propriedades biológicas relacionadas, incluindo manutenção de clonalidade, autorrenovação, homogeneidade e pluripotência (em oposição à diferenciação espontânea) das iPSCs. A estequiometria mede as relações quantitativas entre os reagentes em um processo de reação e é usada para determinar a quantidade de reagentes necessários em uma determinada reação e, às vezes, a quantidade de produtos produzidos. A estequiometria considera a quantidade estequiométrica de um reagente ou a razão estequiométrica dos reagentes, que é a quantidade ou razão ideal de reagente (ou reagentes) para concluir a reação. Um aspecto do pedido fornece um sistema e método para avaliar ou utilizar a estequiometria do fator de reprogramação, permitindo que um ou mais primeiros plasmídeos sejam convenientemente selecionados a partir da biblioteca, misturados e combinados, ajustados à dosagem e cotransfectados.

[000108] O segundo plasmídeo do presente sistema de reprogramação fornece um cassete de expressão compreendendo um promotor e um polinucleotídeo codificador de EBNA, em que nem a fita de expressão nem o segundo plasmídeo compreendem polinucleotídeos que codificam fatores de reprogramação. O promotor compreendido no segundo plasmídeo pode ser, por exemplo, CMV, EF1a, PGK, CAG, UBC e outros promotores adequados que são constitutivos, indutíveis, regulados endogenamente ou específicos temporal, tecidular ou do tipo celular. Em uma modalidade, o promotor é CAG. Em outra modalidade, o promotor é EF1a. Cotransfectando uma célula não pluripotente com a combinação descrita acima de pelo menos um primeiro plasmídeo e um segundo plasmídeo, o EBNA e oriP independentes, juntamente com pelo menos um fator de reprogramação, são introduzidos nas células não pluripotentes para iniciar a reprogramação.

[000109] Em determinada modalidade, a reprogramação é iniciada na presença de uma combinação de compostos de moléculas pequenas compreendendo um receptor de TGFB/inibidor de ALK, um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e um inibidor de ROCK, e iPSCs são gerados após um período de tempo suficiente. Em algumas modalidades, a reprogramação está sob uma condição livre de alimentador. Em modalidades particulares, o ambiente livre de alimentador é essencialmente livre de células alimentadoras humanas e não é pré-condicionado por células alimentadoras, incluindo, sem limitação, fibroblastos embrionários de camundongo, fibroblastos humanos, queratinócitos e células-tronco embrionárias.

[000110] Em determinada modalidade, as células após serem induzidas por cerca de 7 a 35, 10 a 32, 15 a 31 dias, cerca de 17 a 29 dias, cerca de 19 a 27 dias ou cerca de 21 a cerca de 25 dias estão opcionalmente sujeitas a desassociação, de tal forma que as células são dissociadas em uma única suspensão celular, por meios enzimáticos ou mecânicos. As células dissociadas podem ser ressuspensas em qualquer solução ou meio adequado para manter as células ou realizar a classificação celular. Em algumas modalidades, a suspensão única de células dissociadas compreende um inibidor de ROCK. Em algumas outras modalidades, a suspensão única de células dissociadas compreende um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK. Em modalidades particulares, a suspensão de célula única contém um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de Rock e não tem um inibidor de TFGB. Em certas modalidades, o inibidor de GSK3 é CHIR99021, o inibidor de MEK é PDO325901 e/ou o inibidor de Rock é tiazovivina.

[000111] Em algumas modalidades, a suspensão de célula dissociada única pode ser ainda classificada. Em uma modalidade, o enriquecimento fornece um método para derivar colônias clonais de iPSC em um tempo relativamente curto, melhorando assim a eficiência da geração de iPSC. O enriquecimento pode compreender a classificação de uma população de células através da identificação e obtenção de células que expressam marcadores de pluripotência, obtendo assim uma população de células pluripotentes enriquecidas. Uma metodologia de enriquecimento adicional compreende a depleção de células que expressam marcadores de diferenciação, células não reprogramadas ou não pluripotentes. Em algumas modalidades, as células para classificação são células pluripotentes. Em algumas “modalidades, as células para classificação são células de reprogramação. Em algumas modalidades, as células para classificação foram induzidas a reprogramar por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais dias, mas não mais que 25, 26, 28, 30, 32, 35, 40 dias ou qualquer número de dias nos intervalos. Em determinada modalidade, as células para classificação foram induzidas a reprogramar por cerca de 21 a 25 dias, cerca de 19 a 23 dias, cerca de 17 a 21 dias, cerca de 15 a cerca de 19 ou cerca de 16 a cerca de 18 dias.

[000112] As células podem ser classificadas por qualquer método adequado de classificação de células, como por classificação de esferas magnéticas ou citometria de fluxo (FACS). As células podem ser classificadas com base em um ou mais marcadores de pluripotência, incluindo, sem limitação, expressão de SSEA3/4, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM- 2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/prominina, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCTA4, NANOG, SOX2, KLF4, SSEA1 (camundongo), CD30, SSEA5, CD90 e/ou

CD50. Em várias modalidades, as células são classificadas com base em pelo menos dois, pelo menos três ou pelo menos quatro marcadores de pluripotência. Em certas modalidades, as células são classificadas com base na expressão de SSEA4 e em certas modalidades particulares com base na expressão de SSEA4 em combinação com TRA1-81 e/ou TRA1-60. Em certas modalidades, as células são classificadas com base na expressão de SSEA4, TRA1-81 ou TRA1-60 e/ou CD30. Em uma modalidade, as células são classificadas com base em SSEAA4, TRA1-81 e CD30. Em outra modalidade, as células são classificadas com base em SSEA4, TRA1I-60 e CD30. Em certas modalidades, as células são inicialmente esgotadas para células não reprogramadas usando um ou mais marcadores de superfície de células diferenciadoras, incluindo, porém sem limitação, CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 e CD7, e depois enriquecidas para marcadores pluripotentes, tais como SSEA4, TRA1-81 e/ou CD30.

[000113] Após a reprogramação, os iPSCs são mantidos, passados e expandidos. Em algumas modalidades, as iPSCs são cultivadas, isto é, mantidas, passadas e expandidas, como células únicas por um período prolongado no meio de manutenção, por exemplo, o FMM, como mostrado na Tabela 1. Demonstrou-se que os iPSCs cultivados no FMM continuam mantendo o perfil indiferenciado, fundamentado ou ingênuo do mesmo; a estabilidade genômica sem a necessidade de limpeza ou seleção de cultura; e devem dar facilmente origem às três linhagens somáticas, diferenciação in vitro via corpos embrionários ou monocamada (sem formação de corpos embrionários); e diferenciação in vivo por formação de teratoma. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente No. US 61/947.979 e a Publicação de Pedido de Patente dos No. US 20170073643, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência. As células adequadas para reprogramação utilizando o presente sistema e método de reprogramação incluem em geral quaisquer células não pluripotentes. As células não pluripotentes incluem, porém sem limitação, células terminalmente diferenciadas; ou células multipotentes ou progenitoras, que não são capazes de dar origem aos três tipos de células da linhagem da camada germinativa. Em algumas modalidades, a célula não pluripotente para reprogramação é uma célula primária, isto é, uma célula isolada diretamente do tecido humano ou animal. Em algumas modalidades, a célula não pluripotente para reprogramação é uma célula específica da fonte, por exemplo, específica para resposta a doadores, doenças ou tratamentos. Em algumas modalidades, a célula não pluripotente para reprogramação é uma célula imune primária. Em algumas modalidades, a célula não pluripotente para reprogramação é ela própria derivada de uma célula pluripotente, incluindo célula-tronco embrionária e célula-tronco pluripotente induzida. Em algumas modalidades, a célula não pluripotente para reprogramação é uma célula imune derivada, por exemplo, uma célula do tipo T ou NK não natural derivada de iPSC.

[000114] Em algumas outras modalidades, a célula não pluripotente para reprogramação é uma célula primária ou derivada geneticamente modificada. A modificação genética compreendida na célula não pluripotente inclui inserção, deleção ou substituição no genoma, o que leva a knock-in, knock-out ou knock-down de uma expressão de gene. A expressão modificada na célula não pluripotente para reprogramação pode ser constitutiva ou induzível (por exemplo, específica para o estágio de desenvolvimento, tecido, célula ou indutor). Em algumas modalidades, a inserção ou substituição é uma integração alvejada específica do local. Em algumas modalidades, o local selecionado para integração é um local de porto seguro ou um local de gene endógeno de interesse. Os locais de porto seguro podem incluir AAVS1, CCR5, ROSA26, colágeno, HTRP, H11, microglobulina beta-2, GAPDH, TCR ou RUNX1 e outros locais que atendam aos critérios de um porto seguro do genoma. Para que um sítio de integração seja um potencial local de porto seguro, o ideal é atender a critérios que incluem, porém sem limitação: ausência de interrupção de elementos ou genes reguladores, conforme julgado pela anotação de sequência; seja uma região intergênica em uma área densa de genes ou um local na convergência entre dois genes transcritos em direções opostas; mantenha distância para minimizar a possibilidade de interações de longo alcance entre ativadores da transcrição codificados por vetor e os promotores de genes adjacentes, particularmente genes relacionados ao câncer e microRNA; e possui atividade transcricional aparentemente onipresente, como refletido pelos amplos padrões de expressão de marca de sequência expressa espacial e temporal (EST), indicando atividade transcricional onipresente. Esta última característica é especialmente importante no que diz respeito às células pluripotentes, nas quais, durante a diferenciação, a remodelação da cromatina normalmente leva ao silenciamento de alguns locais e à ativação potencial de outros. Dentro da região adequada para inserção exógena, um local preciso escolhido para inserção deve ser desprovido de elementos repetitivos e sequências conservadas e para os quais os iniciadores para amplificação dos braços de homologia possam ser facilmente projetados. Em um exemplo, a célula não pluripotente para reprogramação usando o presente sistema e método é uma célula T que compreende um CAR no local endógeno do TCR, e a expressão do TCR é interrompida como resultado da integração do CAR.

[000115] Em uma modalidade, a reprogramação de uma célula não pluripotente geneticamente modificada é obter um iPSC modificado por genoma, compreendendo a mesma modificação (ou modificações) genética. Como tal, em algumas outras modalidades, uma ou mais dessas edições genômicas podem ser introduzidas no iPSC após reprogramação para obter um iPSC geneticamente modificado. Em uma modalidade, o iPSC para edição genômica é uma linha clonal ou uma população de células iPS clonais.

[000116] Em algumas modalidades, os iPSCs geneticamente modificados que compreendem uma ou mais edição genética alvejadas são mantidas, passadas e expandidas em um meio que compreende MEKi, GSKi, e ROCKi, e livres de, ou essencialmente livres de, receptor de TGFRB/inibidores de ALK5, em que os iPSCs retêm a edição direcionada intacta e funcional nos sítios selecionados. Em algumas modalidades, a edição genética introduz uma ou mais de uma proteína de chave de segurança, uma modalidade de direcionamento, um receptor, uma molécula de sinalização, um fator de transcrição, uma proteína ou peptídeo farmaceuticamente ativo, um candidato a um fármaco alvo e um enxerto promotor de proteína, diapedese, autodirecionamento, infilttação tumoral, viabilidade, autorrenovação, persistência e/ou sobrevivência da célula pluripotente e/ou células derivadas da mesma. Em uma modalidade, o iPSC geneticamente modificado compreende uma ou mais chaves de segurança mediadas por gene suicida incluindo, sem limitação, caspase 9 (ou caspase 3 ou 7), timidina quinase, citosina desaminase, B-célula CD20, EGFR modificado e qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os iPSCs geneticamente modificados têm pelo menos uma modificação genômica compreendendo a expressão introduzida ou aumentada de um receptor quimérico, um receptor de autodirecionamento, uma molécula anti-inflamatória, uma proteína de ponto de verificação imune, um receptor de chamariz de citocinas/quimiocinas, um fator de crescimento, um receptor de citocina pró-inflamatória alterado, um CAR ou um receptor de ativação de superfície para acoplamento com acopladores bi ou multiespecíficos ou universais; ou expressão reduzida ou silenciada de um gene coestimulador. Em algumas modalidades, os iPSCs geneticamente modificados compreendem uma alta afinidade e/ou CD16 não clivável como uma modalidade de alvejamento. Em algumas outras modalidades, a modalidade de alvejamento compreendida nos iPSCs geneticamente modificados é um receptor de antígeno quimérico (CAR) que é específico da célula T, ou específico da célula NK, ou compatível com ambas as células T e NK.

[000117] Em algumas modalidades, o iPSC geneticamente modificado compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos ou in/dels em um ou mais genes endógenos. Em algumas modalidades, o in/del compreendido em um gene endógeno resulta na interrupção da expressão do gene. Em algumas modalidades, o in/del compreendido em um gene endógeno resulta em knock-out do gene editado. Em determinada modalidade, o in/del compreendido em um gene endógeno resulta em knock-down do gene editado.

Em algumas modalidades, o iPSC geneticamente modificado compreendendo um ou mais polinucleotídeos exógenos no sítio (ou sítios) selecionado pode compreender ainda uma ou mais edições alvejadas incluindo in/dels no sítio (ou sítios) selecionado. Em algumas modalidades, o in/del é compreendido em um ou mais genes endógenos associados à regulação e mediação da resposta imune. Em algumas modalidades, o in/del é compreendido em um ou mais genes endógenos de ponto de verificação. Em algumas modalidades, o in/del é compreendido em um ou mais genes endógenos receptores de células T. Em algumas modalidades, o in/del é compreendido em um ou mais genes supressores endógenos de MHC classe |. Em algumas modalidades, o in/del é compreendido em um ou mais genes endógenos associados ao complexo principal de histocompatibilidade. Em uma modalidade, as células iPS modificadas compreendem uma exclusão ou expressão reduzida em pelo menos um dos B2M, TAP1, TAP2, Tapasin, NLRC5, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP e qualquer um dos genes HLA na região do cromossomo 6p21. Em outra modalidade, as células iPS modificadas compreendem uma expressão introduzida ou aumentada de HLA-E ou HLA-G.Em ainda algumas outras modalidades, as células iPS geneticamente modificadas compreendem um local de TCR interrompido.

[000118] Os vários métodos de edição genética alvejada de iPSCs, especialmente para projetar efetivamente iPSC em um único nível de célula com estratégias de alvejamento multigênico em multilocais, incluem aqueles descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido Internacional WO 2017/079673, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência.

[000119] Apresente invenção também fornece métodos para identificar um agente que reprograma as células somáticas para um estado menos diferenciado, bem como os agentes assim identificados. Em uma modalidade, os métodos compreendem a reprogramação de células somáticas usando as composições e métodos de reprogramação divulgados neste documento, em que pelo menos um vetor compreende um agente candidato; selecionando para células que têm aparência da morfologia celular de pluripotência e a expressão induzida de pelo menos um gene de pluripotência endógena tal como OCTA4. A presença de células que expressam o marcador selecionável apropriado indica que o agente reprograma as células somáticas.

Esse agente é considerado um agente de reprogramação para os fins deste pedido.

Em uma modalidade adicional, os métodos compreendem o colocar as células somáticas em contato com um agente candidato usando as composições e métodos de reprogramação divulgados neste documento, selecionando células que expressam o marcador selecionável apropriado e avaliando as células assim selecionadas por características de pluripotência.

A presença de um conjunto completo de características de pluripotência indica que o agente reprograma as células somáticas para se tornarem pluripotentes.

Os agentes candidatos utilizados na invenção abrangem inúmeras classes químicas, embora tipicamente sejam moléculas orgânicas, incluindo pequenos compostos orgânicos.

Os agentes candidatos também são encontrados entre biomoléculas, incluindo peptídeos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas, pirimidinas, ácidos nucleicos e derivados, análogos estruturais ou combinações dos mesmos.

Os agentes candidatos podem surgir naturalmente, recombinantes ou projetados em laboratório.

Os agentes candidatos podem ser isolados de microrganismos, animais ou plantas, ou podem ser produzidos de forma recombinante ou sintetizados por métodos químicos conhecidos na técnica.

Em algumas modalidades, os agentes candidatos são isolados de bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais usando os métodos da presente invenção.

Por exemplo, estão disponíveis numerosos meios para a síntese randômica e dirigida de uma grande variedade de compostos orgânicos e biomoléculas, incluindo a expressão de oligonucleotídeos e oligopeptídeos randomizados.

Alternativamente, bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis ou são prontamente produzidas.

Adicionalmente, as bibliotecas e compostos naturais ou produzidos sinteticamente são facilmente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais e podem ser utilizados para produzir bibliotecas combinatórias. Os agentes farmacológicos conhecidos podem ser submetidos a modificações químicas direcionadas ou randômicas, incluindo acilação, alquilação, esterificação, amidificação, para produzir análogos estruturais. Existem inúmeras bibliotecas de compostos disponíveis comercialmente, incluindo, por exemplo, o ChemBridge DIVERSetrtvm.

[000120] Os métodos de triagem mencionados acima são baseados em ensaios realizados nas células. Estes ensaios baseados em células podem ser realizados em um formato de triagem de alto rendimento (HTS), que foi descrito na técnica. Por exemplo, Stockwell et al. descreveram uma triagem de alto rendimento de pequenas moléculas em ensaios baseados em células de mamíferos miniaturizados envolvendo modificações pós- translacionais (Stockwell et a/., 1999). Da mesma forma, Qian et al. descreveram um ensaio baseado em células de leucemia para triagem de alto rendimento para agentes anticâncer (Qian et al., 2001). Ambas as referências são incorporadas neste documento na totalidade das mesmas.

Il. — CÉLULAS DERIVADAS IPSC OBTIDAS /N VITRO

[000121] A presente invenção fornece ainda, em algumas modalidades, células não pluripotentes derivadas dos iPSCs obtidas utilizando o sistema e métodos como divulgados neste documento. Em algumas modalidades, os iPSCs para gerar células não pluripotentes derivadas são geneticamente modificados, seja por edição alvejada de iPSCs ou por reprogramação de células não pluripotentes geneticamente modificadas com integração de sítio específico ou in/dels. Em algumas modalidades, as células não pluripotentes derivadas de iPSC são células progenitoras ou células totalmente diferenciadas. Em algumas modalidades, as células derivadas de iPSC que mantêm a mesma edição alvejada compreendida no iPSC geneticamente modificado são células mesodérmicas não naturais, células CD34, células endoteliais hemogênicas, células-tronco ou progenitoras hematopoiéticas, células progenitoras multipotentes hematopoiéticas, progenitor de células T, progenitor de células NK, células T, células NKT, células NK, células B, células reguladoras imunes ou qualquer célula desejada de qualquer linhagem da camada germinativa. Em algumas modalidades, as células reguladoras imunes não naturais derivadas de iPSC compreendem células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs), macrófagos reguladores, células dendríticas reguladoras ou células estromais mesenquimais, que são reguladores imunes potentes de células NK, Be T.

[000122] Além de produzir um número ilimitado de células de um determinado tipo ou subtipo que são difíceis de obter através do isolamento de fontes doadoras, foi demonstrado que linhagens derivadas de iPSC humanas exibem as propriedades das células do estágio fetal, de modo que o processo de reprogramação redefine não apenas o destino celular (de especificado/diferenciado para pluripotente), mas também a característica de idade cronológica da população de células doadoras independente da idade do doador inicial de células somáticas. Além das propriedades do tipo fetal observadas nas linhagens derivadas da iPSC, incluindo células neurais, cardíacas ou pancreáticas, as características celulares do envelhecimento mostraram mudanças mensuráveis indicativas de rejuvenescimento das células rediferenciadas do iPSC após o processo de reprogramação. Os parâmetros relacionados à idade expressos na população de fibroblastos de doadores idosos foram redefinidos após a indução e diferenciação de iPSC em células semelhantes a fibroblastos derivados de iPSC (Miller et a/., 2013). As células T específicas para o antígeno derivadas de iPSC diferenciadas das iPSC reprogramadas a partir de um clone de células T demonstram rejuvenescimento através de telômeros alongados do que aqueles no clone de células T original. Alterações adicionais em células totalmente diferenciadas indicativas de um processo de rejuvenescimento incluem, porém não se limitam a, aumento global da heterocromatina, função mitocondrial aprimorada (redução de ROS, mutação reduzida do mtDNA, presença de ultraestrutura), aumento das respostas a danos no DNA, alongamento dos telômeros e diminuição de porcentagem de telômeros curtos e diminuição da fração de células senescentes. (Nishimura et a/l., 2013). A reposição positiva nesses vários aspectos relacionados à idade leva a uma célula não natural com maior potencial de proliferação, sobrevivência, persistência e funções do tipo memória. Portanto, o rejuvenescimento mediado pela reprogramação e rediferenciação confere muitas propriedades moleculares, fenotípicas e funcionais em uma célula totalmente diferenciada derivada de iPSC, cujas propriedades não naturais a diferenciam de sua contraparte da célula primária, apesar da semelhança na linhagem celular.

[000123] Os métodos e composições de diferenciação aplicáveis para a obtenção de linhagens de células hematopoiéticas derivadas de iPSC incluem aqueles representados, por exemplo, no Pedido Internacional No. PCT/US2016/044122, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência. Conforme fornecido, os métodos e composições para gerar linhagens de células hematopoiéticas são através do endotélio hemogênico (HE) definitivo derivado de células-tronco pluripotentes, incluindo IPSCs sob condições livre de soro, livre de alimentador e/ou livre de estroma e em uma plataforma de cultura escalável e monocamada sem a necessidade de formação de EB. As células que podem ser diferenciadas de acordo com os métodos fornecidos variam de células-tronco pluripotentes a células progenitoras comprometidas com uma célula particular terminalmente diferenciada e células transdiferenciadas, células de várias linhagens que passam diretamente para o destino hematopoiético sem passar por um intermediário pluripotente. Da mesma forma, as células produzidas pela diferenciação de células-tronco variam de células-tronco multipotentes ou progenitoras a células-tronco terminais diferenciadas e todas as linhagens de células hematopoiéticas intervenientes.

[000124] Os métodos para diferenciar e expandir as células da linhagem hematopoiética das células-tronco pluripotentes na cultura em monocamada compreendem colocar as células-tronco pluripotentes em contato com um ativador da via BMP e, opcionalmente, bFGF. Conforme fornecido, as células mesodérmicas derivadas de células-tronco pluripotentes são obtidas e expandidas sem formar corpos embrionários a partir de células- tronco pluripotentes. As células mesodérmicas são então sujeitas a contato com um ativador da via BMP, bFGF e um ativador da via WNT para obter células mesodérmicas expandidas com potencial definitivo de endotélio hemogênico (HE) sem formar corpos embrionários a partir das células-tronco pluripotentes. Por contato subsequente com bFGF e, opcionalmente, um inibidor de ROCK e/ou um ativador da via WNT, as células mesodérmicas com potencial HE definitivo são diferenciadas em células HE definitivas, que também são expandidas durante a diferenciação.

[000125] Os métodos fornecidos neste documento para obter células da linhagem hematopoiética são superiores à diferenciação de células-tronco pluripotentes mediada por EB, porque a formação de EB leva a uma expansão celular de modesta a mínima, não permite a cultura de monocamada, importante para muitas aplicações que requerem expansão homogênea e homogênea, e a diferenciação das células em uma população, e é trabalhoso e de baixa eficiência.

[000126] A plataforma de diferenciação de monocamada fornecida facilita a diferenciação em relação ao endotélio hemogênico — definitivo, resultando na derivação de células-tronco hematopoiéticas e progênie diferenciada, como células T, B, NKT, NK e células reguladoras. A estratégia de diferenciação de monocamada combina eficiência de diferenciação aprimorada com expansão em larga escala, permitindo a entrega de um número terapeuticamente relevante de células hematopoiéticas derivadas de células-tronco pluripotentes para várias aplicações terapêuticas. Além disso, a cultura de monocamada usando os métodos fornecidos neste documento leva a células funcionais de linhagem hematopoiética que permitem uma faixa completa de diferenciação in vitro, modulação ex vivo e autorrenovação, reconstituição e enxerto hematopoiético a longo prazo in vivo. Conforme fornecido, as células da linhagem hematopoiética derivadas do iPSC incluem, porém sem limitação, endotélio hemogênico definitivo, células progenitoras multipotentes hematopoiéticas, células-tronco e progenitoras hematopoiéticas, progenitoras de células T, progenitoras de células NK, células T, células NK, células NKT, células B, macrófagos, neutrófilos, células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs), macrófagos reguladores, células dendríticas reguladoras e células estromais mesenquimais.

[000127] O método para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células de uma linhagem hematopoiética definitiva, em que o método compreende: (i) colocar células-tronco pluripotentes em contato com uma composição que compreende um ativador de BMP e, opcionalmente, bFGF, para iniciar a diferenciação e expansão de células mesodérmicas das células estaminais pluripotentes; (ii) colocar as células mesodérmicas em contato com uma composição que compreende um ativador de BMP, bFGF e um inibidor de GSK3, em que a composição é opcionalmente livre de receptor de TGFEB/inibidor de ALK, para iniciar a diferenciação e expansão de células mesodérmicas com potencial HE definitivo das células mesodérmicas; (iii) colocar as células mesodérmicas em contato com potencial HE definitivo com uma composição que compreende um inibidor de ROCK; um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6 e IL11; e opcionalmente, um ativador da via Wnt, em que a composição é opcionalmente livre de receptor de TGFRB/inibidor de ALK, para iniciar a diferenciação e expansão do endotélio hemogênico definitivo das células mesodérmicas derivadas de células-tronco pluripotentes com potencial endotélio hemogênico definitivo.

[000128] Em algumas modalidades, o método compreende ainda colocar células-tronco pluripotentes em contato com uma composição que compreende um inibidor de MEK, um inibidor de GSK3 e um inibidor de ROCK, em que a composição está livre de receptor de TGFB/inibidor de ALK, para semear e expandir as células-tronco pluripotentes. Em algumas modalidades, as células-tronco pluripotentes são iPSCs ou iPSCs ingênuas ou iPSCs que compreendem uma ou mais impressões genéticas; e as uma ou mais impressões genéticas compreendidas no iPSC são retidas nas células hematopoiéticas diferenciadas das mesmas. Em algumas modalidades do método para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células de uma linhagem hematopoiética, a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células de linhagem hematopoiética é nula de geração de corpos embrionários e está em uma forma de cultura de monocamada.

[000129] Em algumas modalidades do método acima, as células endoteliais hemogênicas definitivas derivadas de células-tronco pluripotentes obtidas são CD34+. Em algumas modalidades, as células endoteliais hemogênicas definitivas obtidas são CD34+CD43-. Em algumas modalidades, as células endoteliais hemogênicas definitivas são CD34+CD43- CXCRA4-CD73-. Em algumas modalidades, as células endoteliais hemogênicas definitivas são CD34+ CXCR4-CD73-. Em algumas modalidades, as células endoteliais hemogênicas definitivas são CD34+CD43-CD93-. Em algumas modalidades, as células endoteliais hemogênicas definitivas são CD34+ CD93-. Em algumas modalidades, as células endoteliais hemogênicas definitivas são CD34+CD93-CD73-.

[000130] Em algumas modalidades do método acima, o método compreende ainda (i) colocar o endotélio hemogênico definitivo derivado de células-tronco pluripotentes em contato com uma composição que compreende um inibidor de ROCK; um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em VEGF, bFGF, SCF, FItàL, TPO e I|L7; e opcionalmente um ativador de BMP; para iniciar a diferenciação do endotélio hemogênico definitivo em progenitores de pré-células T; e opcionalmente, (ii) colocar os progenitores de células pré-T em contato com uma composição que compreende um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, FIt3L e IL7, mas livre de um ou mais ativadores de VEGF, bFGF, TPO, BMP e inibidores de ROCK, para iniciar a diferenciação dos progenitores de para progenitores de células T ou células T.

Em algumas modalidades do método, os progenitores de células T derivadas de células-tronco pluripotentes são CD34+CD45+CD7+. Em algumas modalidades do método, os progenitores de células T derivadas de células-tronco pluripotentes são CD45+CD7+. Em algumas modalidades, a célula T derivada de célula-tronco pluripotente compreende uma fração de células yóT muito mais alta que a de células T primárias isoladas de fontes doadoras.

[000131] Ainda, em algumas modalidades do método acima para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes em células de uma linhagem hematopoiética, o método compreende ainda: (i) colocar o endotélio hemogênico definitivo derivado de células-tronco pluripotentes em contato com uma composição que compreende um inibidor de ROCK; um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados a partir do grupo que consiste em VEGF, bFGF, SCF, FIt3L, TPO, IL3, IL7 e IL1I5; e, opcionalmente, um ativador de BMP, para iniciar a diferenciação do endotélio hemogênico definitivo em progenitor de células pré-NK; e, opcionalmente, (ii) colocar progenitores de células pré-NK derivadas de células-tronco pluripotentes em contato com uma composição que compreende um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em SCF, FIt3L, IL3, IL7, IL15, em que o meio está livre de um ou mais dos ativadores de VEGF, bFGF, TPO, BMP e inibidores de ROCK, para iniciar a diferenciação dos progenitores de células pré-NK para progenitores de células NK ou células NK. Em algumas modalidades, os progenitores NK derivados de células-tronco pluripotentes são CD3-CD45+CD56+CD7+. Em algumas modalidades, as células NK derivadas de células-tronco pluripotentes são CD3-CD45+CD56+. Em algumas modalidades, as células NK derivadas de células-tronco pluripotentes são opcionalmente definidas ainda por um ou mais de NKp46 (CD335), NKp30 (CD337), DNAM-1 (CD226), 2B4 (CD244), CD57 e CD16.

[000132] Em outra modalidade do método, o método permite a produção de células reguladoras imunes ao colocar HE definitivo derivado de células-tronco pluripotentes contato com um meio que compreende um inibidor de ROCK, MCSF, GMCSF e um ou mais fatores de crescimento e citocinas selecionados do grupo que consiste em IL1b, IL3, IL6, IL4, IL10, IL13, TGFRB, bFGF, VEGF, SCF e FLT3L e, opcionalmente, um ou ambos de um antagonista de AnR e um agonista da via da prostaglandina.

[000133] Em algumas modalidades, as células reguladoras imunes derivadas compreendem células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs). Em uma modalidade, a população de células reguladoras imunes derivadas compreende células CD45+CD33+. Em algumas modalidades, a população de células reguladoras imunológicas derivadas compreende monócitos. Em algumas modalidades, os monócitos compreendem células CD45+CD33+CD14+. Em ainda algumas outras modalidades, a população de células reguladoras imunes derivadas compreende células CD45+CD33+PDL1+. Um aspecto desta invenção fornece uma população ou subpopulação celular enriquecida de células reguladoras imunes derivadas de iPSC que compreendem células CD45+CD33+, CD45+CD33+CD14+ ou CD45+CD33+PDL1+. Em algumas outras modalidades, a população de células reguladoras imunes derivadas compreende células CD33+CD15+CD14-CD11b- . Em algumas modalidades, a população de células reguladoras imunes derivadas compreendendo iMDSCs compreende menos de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0,1% de eritrócitos, linfóides, granulócitos, células CD45-CD235+, células CD45+CD7+ ou células CD45+CD33+CD66b+. Em algumas modalidades, a população de células reguladoras imunes derivadas é essencialmente livre de eritrócitos, linfóides, granulócitos, células CD45- CD235+, células CD45+CD7+ ou células CD45+CD33+CD66br+.

ll. USO TERAPÉUTICO DE |IPSCS E CELULAS IMUNES

DERIVADAS DO MESMO

[000134] A presente invenção fornece, em algumas modalidades, uma composição compreendendo uma população ou subpopulação isolada de iPSCs e/ou células imunes que foram derivadas da dita iPSC usando os métodos e composições como divulgados. Em algumas modalidades, os iPSCs compreendem uma ou mais edições genéticas alvejadas que são retidas nas células imunes derivadas de iPSC, em que os iPSCs geneticamente modificados e células derivadas do mesmo são adequados para terapias adotivas baseadas em células.

Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células HSC derivadas de iPSC.

Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células proT ou T derivadas de iPSC.

Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células proNK ou NK derivadas de iPSC.

Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente compreende células reguladoras imunes derivadas de iPSC ou células supressoras derivadas de mieloides (MDSCs). Em algumas modalidades, as células imunes geneticamente modificadas derivadas do iPSC são ainda moduladas ex vivo para melhorar o potencial terapêutico.

Em uma modalidade, uma população ou subpopulação isolada de células imunes modificadas geneticamente que foram derivadas de iPSC compreende um número ou razão aumentada de células T ingênuas, células T de memória de células-tronco e/ou células T de memória central.

Em uma modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes geneticamente modificadas que foram derivadas de iPSC compreende um número ou razão aumentada de células NKT tipo |. Em outra modalidade, a população ou subpopulação isolada de células imunes geneticamente modificadas que foram derivadas de iPSC compreende um número ou razão aumentada de células NK adaptativas.

Em algumas modalidades, a população ou subpopulação isolada de células CD34 geneticamente modificadas, células HSC, células T, células NK ou células supressoras derivadas de mieloides derivadas de iPSC são alogênicas.

Em algumas outras modalidades, a população ou subpopulação isolada de células CD34 geneticamente modificadas, células HSC, células T, células NK ou MDSC derivadas de iPSC são autogênicas.

[000135] Em algumas modalidades, o iPSC para diferenciação compreende impressões genéticas que transmitem atributos terapêuticos desejáveis nas células efetoras, cujas impressões genéticas são retidas e funcionais nas células hematopoiéticas diferenciadas derivadas do dito iPSC.

[000136] Em algumas modalidades, as impressões genéticas das células-tronco pluripotentes compreendem (i) uma ou mais modalidades geneticamente modificadas obtidas por inserção, exclusão ou substituição genômica no genoma das células pluripotentes durante ou após a reprogramação de uma célula não pluripotente para o iPSC; ou (ii) um ou mais atributos terapêuticos retidos de uma célula imune específica da fonte que é específica para resposta a doador, doença ou tratamento e em que as células pluripotentes são reprogramadas a partir da célula imune específica da fonte, em que o iPSC retém os atributos terapêuticos da fonte, que também estão compreendidos nas células da linhagem hematopoiética derivadas do iPSC.

[000137] Em algumas modalidades, as modalidades geneticamente modificadas compreendem uma ou mais dentre: proteínas de chaves de segurança, modalidades de alvejamento, receptores, moléculas de sinalização, fatores de transcrição, proteínas e peptídeos farmaceuticamente ativos, candidatos a alvos de fármacos; ou proteínas que promovam enxerto, diapedese, autodirecionamento, viabilidade, autorrenovação, persistência, regulação e modulação da resposta imune e/ou sobrevivência dos iPSCs ou células derivadas dos mesmos. Em algumas outras modalidades, as modalidades geneticamente modificadas compreendem uma ou mais dentre (i) exclusão ou expressão reduzida de B2M, TAP1, TAP2, Tapasin, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, REXANK, CIITA, RFX5 ou RFXAP e qualquer gene na região do cromossomo 6p21; (ii) expressão introduzida ou aumentada de HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD8O, PDL1,

AZAR, CAR, TCR, receptor Fc ou receptores de desencadeamento de superfície para acoplamento com acopladores bi ou multiespecíficos ou universais.

[000138] Em ainda algumas outras modalidades, as células da linhagem hematopoiética compreendem os atributos terapêuticos da célula imune específica da fonte em relação a um ou mais dentre (i) expressão do receptor alvo do antígeno; (ii) apresentação do HLA ou falta do mesmo; (iii) resistência ao microambiente tumoral; (iv) indução de células imunes e modulações imunes; (iv) especificidade melhorada no alvo com efeito não tumoral reduzido; (v) resistência ao tratamento, tal como quimioterapia; e (vi) melhoria de autodirecionamento, persistência e citotoxicidade.

[000139] Em algumas modalidades, o iPSC e células hematopoiéticas derivadas do mesmo compreendem um ou mais de B2M nulo ou baixo, HLA-E/G, PDL1, A2AR, CD47, LAG3 nulo ou baixo, TIM3 nulo ou baixo, TAP1 nulo ou baixo, TAP2 nulo ou baixo, Tapasin nulo ou baixo, NLRC5 nulo ou baixo, PD1 nulo ou baixo, RFEKANK nulo ou baixo, CIITA nulo ou baixo, RFEX5 nulo ou baixo e RFXAP nulo ou baixo. Essas células com HLA modificado classe | e/ou Il têm resistência aumentada à detecção imune e, portanto, apresentam melhor persistência in vivo. Além disso, essas células podem evitar a necessidade de correspondência do HLA na terapia celular adotiva e, assim, fornecer uma fonte de regime terapêutico universal e pronto para uso.

[000140] Em algumas modalidades, o iPSC e suas células hematopoiéticas derivadas compreendem um ou mais de hnCD16 (CD16 não clivável de alta afinidade), HLA-E, HLA-G, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, AzAR, CAR ou TCR. Tais células melhoraram a capacidade efetiva imunológica.

[000141] Em algumas modalidades, o iPSC e células derivadas hematopoiéticas do mesmo são específicas do antígeno.

[000142] Uma variedade de doenças pode ser melhorada através da introdução das células imunes da invenção a um sujeito adequado para terapia celular adotiva. Exemplos de doenças, incluindo vários distúrbios autoimunes, incluindo, porém sem limitação, alopecia areata, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, dermatomiosite, diabetes (tipo 1), algumas formas de artrite idiopática juvenil, glomerulonefrite, doença de Graves, síndrome de Guillain-Barré, púrpura trombocitopênica idiopática, miastenia gravis, algumas formas de miocardite, esclerose múltipla, pênfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, polimiosite, cirrose biliar primária, psoríase, artrite reumatóide, esclerodermia/esclerose sistêmica, síndrome de Sjógren, lupus sistêmico, eritemitosa, formas de tireoidite, algumas formas de uveite, vitiligo, granulomatose com poliangiite (de Wegener); neoplasias hematológicas, incluindo, porém sem limitação, leucemias agudas e crônicas, linfomas, mieloma múltiplo e síndromes mielodisplásicas; tumores sólidos, incluindo, porém sem limitação, tumor do cérebro, próstata, mama, pulmão, cólon, útero, pele, fígado, osso, pâncreas, ovário, testículos, bexiga, rim, cabeça, pescoço, estômago, colo do útero, reto, laringe ou esôfago; e infecções, incluindo, porém sem limitação, distúrbios associados ao HIV (vírus da imunodeficiência humana), RSV (vírus sincicial respiratório), EBV (vírus de Epstein-Barr), CMV (citomegalovírus), adenovírus e poliomavírus BK.

[000143] De acordo com algumas modalidades, a presente invenção fornece ainda composições para uso terapêutico compreendendo as células da linhagem hematopoiética derivadas de células pluripotentes feitas pelos métodos e composição divulgados neste documento, em que as composições farmacêuticas compreendem ainda um meio farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição para uso terapêutico compreende as células T derivadas de célula pluripotente feitas pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição para uso terapêutico compreende as células NK derivadas de célula pluripotente feitas pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição para uso terapêutico compreende as células HE CD34+ derivadas de célula pluripotente feitas pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição para uso terapêutico compreende os HSCs derivados de célula pluripotente feitos pelos métodos e composição divulgados neste documento. Em uma modalidade, a composição para uso terapêutico compreende a MDSC derivada de célula pluripotente feito pelos métodos e composição divulgados neste documento.

[000144] Além disso, a presente invenção fornece, em algumas modalidades, uso terapêutico das composições terapêuticas acima, introduzindo a composição em um sujeito adequado para terapia celular adotiva, em que o sujeito tem um distúrbio autoimune; uma malignidade hematológica; um tumor sólido; ou uma infecção associada ao HIV, RSV, EBV, CMV, adenovírus ou poliomavírus BK.

[000145] As células da linhagem hematopoiética derivadas de célula-tronco pluripotente isolada podem ter pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou 99% de células T, células NK, células NKT, células proT, células proNK, células HE CD34+, HSCs, células B, células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs), macrófagos reguladores, células dendríticas reguladoras ou células estromais mesenquimais. Em algumas modalidades, as células de linhagem hematopoiética derivadas de célula-tronco pluripotente isolada têm cerca de 95% a cerca de 100% de células T, células NK, células NKT, células proT, células proNK, células HE CD34+, HSCs, células B, células supressoras derivada de mieloide (MDSCs), macrófagos reguladores, células dendríticas reguladoras ou células estromais mesenquimais. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece composições terapêuticas com células T purificadas, células NK, células NKT, células HE CD34+, células proT, células proNK, HSCs, células B, células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs), macrófagos reguladores, dendríticos reguladores células ou células estromais mesenquimais, como uma composição com uma população isolada de cerca de 95% de células T, células NK, células NKT, células proT, células proNK, células HE CD34+, HSCs, células B, células supressoras derivadas de mieloide (MDSCs), macrófagos reguladores, células dendríticas reguladoras ou células estromais mesenquimais para tratar um sujeito em necessidade da terapia celular.

[000146] Otratamento utilizando as células de linhagem hematopoiética derivadas das modalidades divulgadas neste documento pode ser realizado mediante sintoma ou para prevenção de recidivas. Os termos “tratar", "tratamento" e similares são usados neste documento para, em geral, significar a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou completa de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", conforme usado neste documento, abrange qualquer tratamento de uma doença em um mamífero e inclui: prevenir que a doença ocorra em um sujeito que pode estar predisposto à doença, mas que ainda não foi diagnosticado com ela; inibir a doença, isto é, interrompendo seu desenvolvimento; ou aliviar a doença, isto é, causar regressão da doença. O agente ou composição terapêutica pode ser administrado antes, durante ou após o início de uma doença ou lesão. O tratamento da doença em andamento, em que o tratamento estabiliza ou reduz os sintomas clínicos indesejáveis do paciente, também é de particular interesse. Em modalidades particulares, o sujeito que precisa de um tratamento tem uma doença, uma condição e/ou uma lesão que pode ser tratada, melhorada e/ou aprimorada em pelo menos um sintoma associado por uma terapia celular. Certas modalidades contemplam que um sujeito que precisa de terapia celular inclui, porém sem limitação, um candidato para transplante de medula óssea ou de células-tronco, um sujeito que recebeu quimioterapia ou terapia de irradiação, um sujeito que tem ou corre o risco de ter um distúrbio hiperproliferativo ou um câncer, por exemplo, um distúrbio hiperproliferativo ou um câncer do sistema hematopoiético, um sujeito com ou em risco de desenvolver um tumor, por exemplo, um tumor sólido, um sujeito que tem ou corre o risco de ter uma infecção viral ou um doença associada a uma infecção viral.

[000147] A composição terapêutica compreendendo células de linhagem hematopoiética derivadas, conforme divulgado, pode ser administrada em um sujeito antes, durante e/ou após outros tratamentos. Como tal, o método de uma terapia combinatória pode envolver a administração ou preparação de células imunes derivadas de iPSC antes, durante e/ou após o uso de um agente terapêutico adicional. Como fornecido acima, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais compreendem um peptídeo, uma citocina, um mitogênio, um fator de crescimento, um RNA pequeno, um dsRNA (RNA de fita dupla), células sanguíneas mononucleares, células alimentadoras, componentes de células alimentadoras ou fatores de substituição dos mesmos, um vetor que compreende um ou mais ácidos polinucleicos de interesse, um anticorpo, um agente quimioterapêutico ou uma porção radioativa ou um fármaco imunomodulador (IMiD). A administração das células imunes derivadas de iPSC pode ser separada no tempo da administração de um agente terapêutico adicional por horas, dias ou até semanas. Adicional ou alternativamente, a administração pode ser combinada com outros agentes ou modalidades biologicamente ativos, tais como, porém sem limitação, um agente antineoplásico, uma terapia não farmacológica, tal como cirurgia.

[000148] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo humanizado, um anticorpo monoclonal humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, aglutina-se especificamente a um antígeno viral. Em outras modalidades, o anticorpo, ou fragmento de anticorpo, aglutina-se especificamente a um antígeno tumoral. Em algumas modalidades, o antígeno tumoral ou viral específico ativa as células da linhagem hematopoiética derivadas de iPSC administradas para aumentar sua capacidade de exterminar. Em algumas modalidades, os anticorpos adequados para o tratamento combinacional como um agente terapêutico adicional às células de linhagem hematopoiéticas derivadas de iPSC administradas incluem, porém sem limitação, anti-CD20 (retuximabe, veltuzumabe, ofatumumabe, ublituximabe, ocaratuzumabe, —obinutuzumabe), anti-Her2 (trastuizumabe), anti-CD52 (alemtuzumabe), anti-EGFR (certuximabe) e anti-CD38 (daratumumabe, isatuximabe, MOR202) e variantes dos mesmos humanizadas e modificadas por Fc.

[000149] Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional compreende um ou mais agentes quimioterapêuticos ou uma porção radioativa. Agente quimioterapêutico refere-se a agentes antineoplásicos citotóxicos, ou seja, agentes químicos que exterminam preferencialmente células neoplásicas ou interrompem o ciclo celular de células em rápida proliferação ou que são considerados por erradicar células-tronco cancerígenas e que são utilizadas terapeuticamente para prevenir ou reduzir o crescimento de células neoplásicas. Os agentes quimioterapêuticos também são algumas vezes referidos como fármacos ou agentes antineoplásicos ou citotóxicos e são bem conhecidos na técnica.

[000150] Em algumas modalidades, o agente quimioterapêutico compreende uma antraciclina, um agente alquilante, um sulfonato de alquila, uma aziridina, uma etilenimina, uma metilmelamina, uma mostarda de nitrogênio, uma nitrosoureia, um antibiótico, um antimetabolito, um análogo do ácido fólico, um análogo da purina, um análogo da pirimidina, uma enzima, uma podofilotoxina, um agente contendo platina, um interferon e uma interleucina. Agentes quimioterapêuticos exemplificativos incluem, porém sem limitação, agentes alquilantes (ciclofosfamida, mecloretamina, metfalina, clorambucil, heamemelamina, tiotepa, bussulfano, carmustina, lomustina, semustina), animetabólitos (metotrexato, fluorouracil, mercúrio, floxuridina, citarabina, 6-mercatopurina, tioguanina, pentostatina), alcalóides de vinca (vincristina, vinblastina, vindesina), epipodofilotoxinas (etoposídeo, etoposídeo ortoquinona e teniposídeo), antibióticos (daunorrubicina, doxorrubicina, mitoxantrona, bisantreno, actinomicina D, plicamicina, puromicina e gramicidina

D), paclitaxel, colchicina, citochalasina B, emetina, maitansina e amsacrina. Agentes adicionais incluem aminglutetimida, cisplatina, carboplatina, mitomicina, altretamina, ciclofosfamida, lomustina (CCNU), carmustina (BCNU), irinotecano (CPT-11), alemtuzamabe, altretamina, anastrozol, L-asparaginase, azacitidina, bevacizumabe, bexarateno, bleomicina, bortezomibe, busulfano, calusterona, capecitabina, celecoxibe, cetuximabe, cladribina, clofurabina, citarabina, dacarbazina, denileucina diftitox, dietilestilbestrol, docetaxel, dromostanolona, epirubicina, erlotinibe, estramustina, etoposida, etinil estradiol, exemestano, floxuridina, S5-flouroracila, fludarabina, flutamida, fulvestrante, gefitinibe, gencitabina, goserelina, hidroxiureia, ibritumomabe, idarubicina, ifosfamida, imatinibe, interferon alfa (2a, 2b), irinotecano, letrozol, leucovorina, leuprolida, levamisol, mecloretamina, megestrol, melfalina, mercaptopurina, metotrexato, metoxsaleno, mitomicina C, mitotano, mitoxantrona, nandrolona, nofetumomabe, oxaliplatina, paclitaxel, pamidronato, pemetrexedo, pegademase, pegasparagase, pentostatina, pipobroman, plicamicina, polifeprosan, porfímero, procarbazina, quinacrina, rituximabe, sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, teniposídeo, testolactona, tioguanina, tiotepa, topetecano, toremifeno, tositumomabe, trastuzamabe, tretinoína, mustarda de uracila, valrubicina, vinorelbina e zoledronato. Outros agentes adequados são aqueles que são aprovados para uso humano, incluindo aqueles que serão aprovados, como quimioterapêuticos ou radioterapêuticos, e conhecidos na técnica. Tais agentes podem ser referenciados através de várias referências médicas padrão de médicos e oncologistas (por exemplo, The Pharmacological Basis of Therapeutics, de Goodman & Gilman, Nona Edição, McGraw-Hill, N.1., 1995) ou através do sítio do National Cancer Institute (fda.gov/cder/cancer/druglisttrarne.htm), ambos atualizados de tempos em tempos.

[000151] Fármacos imunomoduladores (IMIDs), tais como a talidomida, a lenalidomida e a pomalidomida, estimulam ambas as células NK e as células T. Como fornecido neste documento, os IMIiDs podem ser usados com as células imunológicas terapêuticas derivadas de iPSC para tratamentos de câncer.

[000152] Como um especialista na técnica entenderia, ambas as células de linhagem hematopoiética autólogas e alogênicas derivadas de iPSC com base nos métodos e composição deste documento podem ser usadas em terapias celulares como descrito acima. Para o transplante autólogo, a população isolada de células de linhagem hematopoiética derivadas é compatível com HLA completa ou parcial com o paciente. Em outra modalidade, as células derivadas de linhagem hematopoiética não são compatíveis com HLA para o sujeito.

[000153] Em algumas modalidade, o número de células de linhagem hematopoiética derivadas na composição terapêutica é de pelo menos 0,1 x 105 células, pelo menos 1 x 105 células, pelo menos 5 x 105 células, pelo menos 1 x 106 células, pelo menos 5 x 106 células, pelo menos 1 x 107 células, pelo menos 5 x 107 células, pelo menos 1 x 108 células, pelo menos 5 x 108 células, pelo menos 1 x 109 células ou pelo menos 5 x 109 células, por dose. Em algumas modalidades, o número de células hematopoiéticas de linhagem derivadas na composição terapêutica é de cerca de 0,1 x 105 células a cerca de 1 x 106 células, por dose; cerca de 0,5 x 106 células a cerca de 1x 107 células, por dose; cerca de 0,5 x 107 células a cerca de 1 x 108 células, por dose; cerca de 0,5 x 108 células a cerca de 1 x 109 células, por dose; cerca de 1 x 109 células a cerca de 5 x 109 células, por dose; cerca de 0,5 x 109 células a cerca de 8 x 109 células, por dose; cerca de 3 x 109 células a cerca de 3 x 1010 células, por dose ou qualquer faixa intermediária. Em geral, 1 x 108 células/dose traduz a 1,67 x 106 células/kg para um paciente de 60 kg.

[000154] Em uma modalidade, o número de células de linhagem hematopoiética derivadas na composição terapêutica é o número de células imunes em um cordão parcial ou única de sangue, ou é, pelo menos, 0,1 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 0,5 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 1 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 5 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 10 x 105 células/kg de peso corporal, pelo menos 0,75 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 1,25 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 1,5 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 1,75 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 2 x 106 células/Kkg de peso corporal, pelo menos 2,5 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 3 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 4 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 5 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 10 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 15 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 20 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 25 x 106 células/kg de peso corporal, pelo menos 30 x 106 células/kg de peso corporal, 1 x 108 células/kg de peso corporal, 5 x 108 células/kg de peso corporal ou 1 x 109 células/kg de peso corporal.

[000155] Em uma modalidade, uma dose de células da linhagem hematopoiética derivada é entregue a um sujeito. Em uma modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células fornecida a um sujeito é de pelo menos 2x 106 células/Kkg, pelo menos 3 x 106 células/Kkg, pelo menos 4 x 106 células/Kg, pelo menos 5 x 106 células/kg, pelo menos 6 x 106 células/kg, pelo menos 7 x 106 células/kg, pelo menos 8 x 106 células/kg, pelo menos 9 x 106 células/kg ou pelo menos 10 x 106 células/Kkg, ou mais células/kg, incluindo todas as doses intermediárias de células.

[000156] Em outramodalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células fornecidas a um sujeito é de cerca de 2 x 106 células/kg, cerca de 3 x 106 células/kg, cerca de 4 x 106 células/Kkg, cerca de 5 x 106 células/kg, cerca de 6 x 106 células/kg, cerca de 7 x 106 células/kg, cerca de 8 x 106 células/kg, cerca de 9 x 106 células/kg ou cerca de 10 x 106 células/kg, ou mais células/kg, incluindo todas as doses intermediárias de células.

[000157] Em outra modalidade ilustrativa, a quantidade eficaz de células fornecida a um sujeito é de cerca de 2 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 3 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 4 x 106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, cerca de 5 x

106 células/kg a cerca de 10 x 106 células/kg, 2 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/Kkg, 2 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/Kkg, 2 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 3 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/Kkg, 3 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/Kkg, 4 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/Kkg, 4 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/Kkg, 4 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 6 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 7 x 106 células/kg, 5 x 106 células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg ou 6 x 106células/kg a cerca de 8 x 106 células/kg, incluindo todas as doses intermediárias de células.

[000158] Alguma variação na dosagem necessariamente ocorrerá, dependendo da condição do sujeito a ser tratado. À pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o sujeito.

[000159] Em algumas modalidades, o uso terapêutico de células de linhagem hematopoiética derivadas é um tratamento de dose única. Em algumas modalidades, o uso terapêutico de células da linhagem hematopoiética derivadas é um tratamento de doses múltiplas. Em algumas modalidades, o tratamento com múltiplas doses é uma dose todos os dias, a cada 3 dias, a cada 7 dias, a cada 10 dias, a cada 15 dias, a cada 20 dias, a cada 25 dias, a cada 30 dias, a cada 35 dias, a cada 40 dias, a cada 45 dias ou a cada 50 dias ou a qualquer número de dias intermediários.

[000160] As composições compreendendo uma população de células de linhagem hematopoiética derivadas da invenção podem ser estéreis e podem ser adequadas e prontas para administração (isto é, podem ser administradas sem qualquer processamento adicional) a pacientes humanos. Uma composição baseada em células que está pronta para administração significa que a composição não requer nenhum tratamento ou manipulação adicional antes do transplante ou administração a um sujeito. Em outras modalidades, a invenção fornece uma população isolada de células de linhagem hematopoiética derivadas que são expandidas e/ou moduladas antes da administração com um ou mais agentes. Para células de linhagem hematopoiética derivadas que foram geneticamente modificadas para expressar TCR ou CAR recombinante, as células podem ser ativadas e expandidas usando métodos como descrito, por exemplo, nas Patentes US 6.352.694.

[000161] Em certas modalidades, o sinal estimulador primário e o sinal coestimulador para as células de linhagem hematopoiética derivadas podem ser fornecidos por diferentes protocolos. Por exemplo, os agentes que fornecem cada sinal podem estar em solução ou acoplados a uma superfície. Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem ser acoplados à mesma superfície (isto é, na formação "cis") ou a superfícies separadas (isto é, na formação "trans"). Alternativamente, um agente pode ser acoplado a uma superfície e o outro agente em solução. Em uma modalidade, o agente que fornece o sinal coestimulador pode ser ligado a uma superfície celular e o agente que fornece o sinal de ativação primário está em solução ou acoplado a uma superfície. Em certas modalidades, ambos os agentes podem estar em solução. Em outra modalidade, os agentes podem estar na forma solúvel e, em seguida, reticulados a uma superfície, como uma célula que expressa receptores Fc ou um anticorpo ou outro agente de aglutinação que se aglutinará aos agentes, como divulgado nas Publicações de Pedido de Patente Nos US 20040101519 e 20060034810 para células apresentadoras de antígeno artificial (aAPCs) que são contempladas para uso na ativação e expansão de linfócitos T em modalidades da presente invenção.

[000162] As composições terapêuticas adequadas para administração a um paciente podem incluir um ou mais veículos (aditivos) e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, meio farmaceuticamente aceitável, por exemplo, meio de cultura celular) ou outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Os carreadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular utilizado para administrar a composição terapêutica. Desse modo, existe uma ampla variedade de formulações adequadas de composições terapêuticas da presente invenção (ver, por exemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17º ed. 1985, cuja divulgação é incorporada neste documento a título de referência na totalidade da mesma).

[000163] Em modalidades particulares, as composições de células terapêuticas com uma população isolada de células de linhagem hematopoiética derivadas de iPSC também têm um meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável, ou carreadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Una composição terapêutica compreendendo uma população de células de linhagem hematopoiética derivadas de iPSC, como divulgado neste documento, pode ser administrada separadamente por métodos de administração intravenosa, intraperitoneal, entérica ou traqueal ou em combinação com outros compostos adequados para afetar os objetivos de tratamento desejados.

[000164] Esses transportadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis podem estar presentes em quantidades suficientes para manter um PH da composição terapêutica entre cerca de 3 e cerca de 10. Como tal, o agente tamponante pode ser de até cerca de 5% em peso do peso da composição total. Eletrólitos tais como, porém sem limitação, cloreto de sódio e cloreto de potássio também podem ser incluídos na composição terapêutica. Em um aspecto, o pH da composição terapêutica está na faixa de cerca de 4 a cerca de 10. Alternativamente, o pH da composição terapêutica está na faixa de cerca de 5 a cerca de 9, de cerca de 6 a cerca de 9 ou de cerca de 6,5 a cerca de 8. Em outra modalidade, a composição terapêutica inclui um tampão com um pH em uma das ditas faixas de pH. Em outra modalidade, a composição terapêutica tem um pH de cerca de 7. Alternativamente, a composição terapêutica tem um pH na faixa de cerca de 6,8 a cerca de 7,4. Ainda em outra modalidade, a composição terapêutica tem um pH de cerca de 7,4.

[000165] Ainvenção também fornece, em parte, o uso de um meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável em composições particulares e/ou culturas da presente invenção. Tais composições são adequadas para administração a sujeitos humanos. De um modo geral, qualquer meio que suporte a manutenção, crescimento e/ou saúde das células imunes derivadas de iPSC, de acordo com modalidades da invenção, é adequado para uso como meio de cultura de células farmacêuticas. Em modalidades particulares, o meio de cultura de células farmaceuticamente aceitável é um meio isento de soro e/ou isento de alimentador. Em várias modalidades, o meio isento de soro é isento de animais e pode opcionalmente ser isento de proteínas. Opcionalmente, o meio pode conter proteinas recombinantes biofarmaceuticamente aceitáveis. Meio isento de animais refere-se ao meio em que os componentes são derivados de fontes não animais. As proteínas recombinantes substituem as proteínas animais nativas em meio isento de animais e os nutrientes são obtidos de fontes sintéticas, vegetais ou microbianas. O meio isento de proteínas, em contraste, é definido como substancialmente isento de proteínas. Um versado na técnica apreciaria que os exemplos acima de meios são ilustrativos e de forma alguma limitam a formulação de meios adequados para uso na presente invenção.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[000166] SEQIDNO:1

[000167] Comprimento: 641

[000168] Tipo: PRT

[000169] — Organismo: Herpesvírus humano 4

[000170] MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGG

SGPQORRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPOKR PSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAG AGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAG GGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAG AGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAG GAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAG GGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSCGGRRGRGRERA RGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSOQOSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGE ADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKK GGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGG SKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFL QTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAE GDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE

[000171] SEQIDNO:2

[000172] Comprimento: 422

[000173] Tipo: PRT

[000174] — Organismo: Herpesvírus humano 4

[000175] MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGG

SGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQOKR PSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSG GRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSG SPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPG EGPSTGPRGAGDGGRRKKGGWFGKHRGQAGGSNPKFENIAEGLRALLARSH VERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPG PGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFD DGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE EXEMPLOS

[000176] Os exemplos a seguir são oferecidos como ilustração e não como limitação.

EXEMPLO 1 - MATERIAL E MÉTODOS

[000177] Dissociação de Célula Única Todas as culturas de reprogramação foram mudadas para FMM no dia 14 após a transfecção. Uma vez no FMM, todas as culturas de reprogramação foram mantidas e dissociadas usando Accutase. As células únicas foram então passadas na superfície revestida com Matrigel ou Vitronectina. As células dissociadas de célula única foram então expandidas em FMM e mantidas até a classificação por citometria de fluxo.

[000178] Análise e classificação por citometria de fluxo Os conjuntos de reprogramação dissociados por célula única foram ressuspensos em tampão de coloração resfriado. Anticorpos primários conjugados, incluindo SSEA4-FITC, TRA181-Alexa Fluor-647 e CD30-PE (BD Biosciences), foram adicionados à solução celular e incubados em gelo por 15 minutos. Todos os anticorpos foram utilizados em 7 a 10 ul em 100 ul de tampão de coloração por milhão de células. As células únicas dissociadas ressuspensas em tampão de coloração foram centrifugadas e ressuspensas em tampão de coloração agora contendo um inibidor de ROCK e mantidas em gelo para classificação por citometria de fluxo. A classificação por citometria de fluxo foi realizada no FACS Aria 1l (BD Biosciences) usando a estratégia de restrição descrita na seção Resultados. As células classificadas foram ejetadas diretamente em placas de 96 poços com concentrações de 3 e 9 eventos por poço. Cada poço foi pré-preenchido com FMM. Após a conclusão da classificação, placas de 96 poços foram incubadas para formação e expansão de colônias. Sete a dez dias após a classificação, as células foram passadas. Passagens subsequentes no FMM foram feitas rotineiramente em 75 a 90% de confluência. A análise por citometria de fluxo foi realizada em Guava EasyCyte 8 HT (Millipore) e analisada usando FCS Express 4 (De Novo Software).

[000179] Teste da presença de transgenes O DNA genômico foi isolado usando o QIAampO DNA Mini Kit e digestão com Proteinase K (Qiagen). 100 ng do DNA genômico foram amplificados usando conjuntos de iniciadores específicos para transgenes, incluindo os fatores de reprogramação e EBNA1 usando o Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen). As reações de PCR foram realizadas por 35 ciclos da seguinte maneira: 94 ºC por 30 segundps (desnaturação), 60 a 64 ºC por 30 segundos (recozimento) e 72 ºC por 1 minuto (extensão). O DNA genômico de fibroblastos e hiPSCs gerados usando métodos lentivirais foram usados como controles negativos. O DNA das construções epissomais foi usado como controle positivo.

[000180] Coloração de fosfatase alcalina Células foram fixadas em paraformaldeído a 4% v/v (Alfa Aesar), lavadas três vezes com PBS e coradas com Kit de coloração de fosfatase alcalina (Millipore). Resumidamente, duas partes de Violeta Vermelho Rápido, uma parte de Fosfato de Naftol AS-BI e uma parte de água foram misturadas, adicionadas às células fixadas e incubadas a 25 ºC por 15 minutos, seguida por uma lavagem com PBS.

[000181] Análise de cariótipo A análise citogenética foi realizada em células metafásicas de banda G pelo WiCell Research Institute (Madison, WI). Cada análise de cariótipo inclui uma contagem mínima de 20 propagações, com análises expandidas para 40 contagens de propagação quando aberrações não clonais são identificadas nas primeiras 20.

[000182] Formação de teratoma Os hiPSCs dissociados de célula única, nas concentrações de 0,5 e 3 milhões de células por solução de 200 ul (100 ul de FMM e 100 ul de Matrigel) foram injetados por via subcutânea em camundongos NOD/SCID/ynull. Após 5 a 6 semanas (injeção de 3 milhões de células) e 7 a 8 semanas (injeção de 0,5 milhão de células), os teratomas foram colhidos, fixados e mantidos para processamento. As amostras foram submetidas ao Centro de Histologia da UCSD para corte, coloração e exame.

[000183] Análise estatística Pelo menos três experimentos independentes foram realizados. Os valores são relatados como média + SEM. A análise estatística foi realizada com ANOVA, com p <0,05 considerado significativo.

[000184] Meios de cultura A cultura convencional de hESC contém meio de cultura DMEM/F12 suplementado com 20% de reposição sérica de KnockOut, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM (ou 1% v/v), L- glutamina a 1 a 2 MM, &-mercaptoetanol a 0,1 mM e 10 a 100 ng/ml de bFGF. Em comparação, o meio de cultura de vários estágios compreende adicionalmente um inibidor de ROCK e um ou mais inibidores de GSK3, inibidores de MEK e inibidores de TGFB. Essa plataforma de cultura específica do estágio também suporta reprogramação e manutenção sem alimentador.

[000185] Em certas aplicações, além dos ingredientes para a cultura convencional, o meio de reprogramação (FRM) contém SMC4: uma combinação de inibidor de ROCK, inibidor de GSK3, inibidor de MEK e inibidor de TGFB; e o meio de manutenção (FMM) contém SMC3: uma combinação de inibidor de ROCK, inibidor de GSK3 e inibidor de MEK.

EXEMPLO 2 - REPROGRAMAÇÃO USANDO O SISTEMA

DE REPROGRAMAÇÃO TRANSITOÓRIA E TEMPORAL

[000186] Os vetores plasmídicos e epissomais são DNAs extracromossômicos não integrantes. Um plasmídeo padrão contém apenas um promotor e polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) a serem expressos e não é capaz de se replicar autonomamente ou com o cromossomo da célula hospedeira. Portanto, a expressão do transgene mediada por um plasmídeo não é contínua nem estável, mas transitória (citoplasmática) e temporária (curto prazo), e é ditada pelo DNA do vetor de entrada sobrevivente que pode estar sujeito à eficiência da transfecção, número de cópias e taxa de perda de plasmídeo. Foi demonstrado que apenas através de transfecções diárias repetidas do vetor plasmídico a reprogramação foi alcançada ainda com uma eficiência inaceitavelmente baixa (Okita et a/., Science (2008); 322:949 a 953).

[000187] Em comparação com um vetor plasmídico, o vetor epissomal pode existir e replicar-se autonomamente no citoplasma ou como parte de um cromossomo. Portanto, a expressão do transgene mediada por um vetor epissomal é contínua e estável devido à replicação dos vetores. Por exemplo, além do transgene (ou transgenes) de interesse, o vetor epissomal baseado em EBV codifica a proteína do antígeno-1 nuclear Epstein-Barr (EBNA1) e a origem da replicação (oriP) derivada do EBV, que atua em conjunto com o replicar e reter o vetor epissomal no núcleo das células em divisão. O EBNA expresso no vetor epissomal aglutina-se ao oriP e recruta o componente complexo de replicação de DNA celular para permitir que o oriP inicie a replicação do DNA do vetor junto com a replicação cromossômica da célula hospedeira. O EBNA-1 amarra os epissomas de filha gerados durante a fase S para hospedar os cromossomos de filha por meio de oriP, mantendo a retenção nuclear do epissoma e, portanto, do transgene (ou transgenes) contínuo e expressão de EBNA (Gil et al., Gene Ther 2010 17 (10):1288 a 1293). A ligação do epissoma mediada por EBNA confere a segregação dos epissomas a cada célula filha durante a mitose, garantindo um número constante de epissoma por célula (Gil et a/., 2010). Um plasmídeo epissomal contendo tanto oriP e uma cassete de expressão de EBNA-1 pode persistir na replicação de células humanas de cultura com — 95% de retenção de epissoma por ciclo celular sem seleção (Gil et a/., 2010). Os vetores epissomais baseados em EBV fornecem uma expressão contínua de fatores de reprogramação exógenos por pelo menos 12 dias (um período de tempo necessário para estabelecer um estado pluripotente autosustentável, ver Okita et al/., Science (2008); 322:949 a 953; ou pelo menos 8 dias a pelo menos 30 dias declarados na Patente No. US

8.5546.140).

[000188] Para realizar a reprogramação usando o sistema de reprogramação transitória e temporal do presente pedido, vários vetores foram construídos como mostrado na Tabela 1 e Figura 1. O vetor 1 (V1) é um vetor plasmídico que contém uma expressão de promotor de fator (ou fatores) de reprogramação selecionado (RF) e um oriP. O vetor 1 não tem sequência de codificação EBNA e, como resultado, reduziu o tempo de retenção em uma célula hospedeira. O vetor 1 também é denominado como plasmídeo oriP/RF. Nos casos em que o Vetor 1 codifica mais de um fator de reprogramação, os fatores podem ser separados por um peptídeo 2A autoclivável, ou IRES. Vis múltiplos podem ser usados para cotransfecção, em que diferentes combinações de múltiplos fatores de reprogramação são desejadas, e a estequiometria dos fatores de reprogramação pode ser predeterminada controlando o número de cópias relativo de cada fator de reprogramação em uma combinação de Vis.

O vetor 2 (V2) é um plasmídeo contendo um promotor e uma sequência de codificação de EBNA, cuja expressão é direcionada pelo promotor.

Mais importante, a V2 não tem oriP, o que leva a um tempo de retenção do V2 significativamente reduzido na população de células hospedeiras transfectadas.

O vetor 2 também é chamado plasmídeo EBNA.

V2 também pode ser substituído por EBNA mMRNA ou proteína/peptídeo.

O método e o material para reprogramação mediada por MRNA são descritos, por exemplo, em Warren et al. (Cell Stem Cell (2010):7, 618 a 630); enquanto que para a reprogramação mediada por proteína recombinante, é descrito, por exemplo, em Zhou et a/. (Cell Stem Cell (2009):4, 381 a 384), os quais são incorporados neste documento a título de referência.

O vetor 3 (V3) é um vetor que expressa oriP e EBNA, mas não possui nenhuma sequência de codificação de fator de reprogramação.

Para examinar se esses vetores suportam a reprogramação, V1, V2 e V3 foram transduzidos sozinhos ou em combinações diferentes para fibroblastos humanos (consulte a Tabela 2). TABELA 1 - CONSTRUÇÃO VETORIAL [Vetor| ———Descriçãodovetor —— | Notas “| | 1º | poeEP4-OCT4-P2A-OCT4-0riP pCEP4-NANOG-P2A-SOX2-T2A- Não contém EBNA; encurtou o SV40 LT-oriP tempo de retenção na célula 1C | pcEP4-CDH1-P2A-ZIC3-T2A-ESRG- | hospedeira como um oriP plasmídeo; | 1D | pcEP4-ECAT1-P2A-UTF1-oriP pCEP4-L1TD1-P2A-DPPA4-T2A- TDGF1-oriP Não contém oriP; encurtou o pCDNA-EBNA-1 tempo de retenção na célula hospedeira Contém ambos oriP e EBNA, pCEP4-oriP-EBNA-1 prolonga significativamente o tempo de retenção na célula hospedeira; mas não expressa transgene (ou transgenes) de fator de reprogramação

[000189] O primeiro testado foi a combinação de V1, V2 e V3 (sistema de reprogramação transitória e temporal mediada por EmTTR, EBNA) para induzir a expressão a longo prazo de EBNA, retenção persistente de transgene e reprogramação eficaz. Os fatores de reprogramação usados nessa combinação incluíram OCT4, NANOG e SOX2 (V1A e V1B). Quinze dias após a transfecção (D15), o conjunto de reprogramação foi classificado por citometria de fluxo para células que expressam SSEA4 e TRA181, indicativas de um estado de pluripotência. Notáveis 21,4% das células são duplamente positivas nesses marcadores de pluripotência (Figura 2). Trinta dias após a transfecção (D30), o conjunto de reprogramação foi colorido para os marcadores de pluripotência iPSC TRAI81, SSEA4 e CD30 (marcador substituto para NANOG) (Figura 3). A coloração imunofluorescente para OCT4 e NANOG confirma o surgimento de colônias que expressam marcadores de pluripotência iPSC indicando reprogramação bem-sucedida.

[000190] Para eliminar a possibilidade de V3 criar em trans uma quantidade superfisiológica de expressão de transgene no sistema EmTTR, criando células que são excessivamente dependentes da expressão de transgene em vez de fazer a transição oportuna para fatores de pluripotência endógenos na condução da reprogramação, foi removido V3 da combinação e foi transfectado fibroblasto com apenas V1 (VIA + V1B) e V2, um sistema denominado STTR (reprogramação transitória e temporal de curta duração). Surpreendentemente, a combinação de V1 e V2 não apenas resultou na reprogramação, mas também com uma eficiência modesta sem a necessidade de transfecção repetida de V1 e V2. Havia 2,35% de células SSEA/TRA181 duplamente positivas na D15 após a transfecção (Figura 4). Vinte e sete dias após a transfecção, o conjunto de reprogramação foi colorido para os marcadores de pluripotência iPSC TRA1I81, SSEA4 e CD30. A coloração imunofluorescente confirma o surgimento de colônias que expressam marcadores de pluripotência iPSC indicando reprogramação bem-sucedida usando o sistema STTR (somente V1 e V2) (Figura 5).

[000191] Este foi um resultado totalmente inesperado. Antecipou-se que o sistema STTR não suportaria a reprogramação, uma vez que se supunha que a expressão de curta duração do transgene não fosse suficiente em duração ou tempo. TABELA 2 - COMBINAÇÕES DE VETORES PARA

REPROGRAMAÇÃO Vetor (ou vetores) Células D12-D15 | Células SSEA4+/TRA181 | reprogramada + s V1A+V1B (somente V1 N/D Não VIA+V1B+V2+V3 (EmTTR) 214% Sim (pluripotência revertida) V1IA+V1IB+V2 (STTR) 2,35% Sim (pluripotência mantida Vetor epissomal 0,0003 a 0,0006% | Sim (oriP/EBNA/OCT4.SOX2.NANOG.LIN2 | de coloração AP2

8. c-Myc.KLF4.SV40LT)1 1: Yu et al, Science (2009); 324(5928): 797 a 801 (cotransfecção de 3 vetores epissomais para transferir 7 fatores de reprogramação e reprogramado usando meio hESC convencional condicionado com alimentador para obter 3 a 6 colônias/106 células de entrada). 2: A coloração AP é menos rigorosa do que o dobro do positivo na estimativa da eficiência da reprogramação.

[000192] Além disso, embora a reprogramação inicial pelo sistema EmTTR pareça muito mais eficiente em comparação à reprogramação STTR com base na porcentagem de células positivas duplas, a STTR, no entanto, suporta melhor a reprogramação celular para gerar iPSCs com pluripotência autosustentável e capaz de ser mantida por longo prazo. As células de fibroblastos induzidas para reprogramar usando os sistemas EmTTR e STTR foram respectivamente mantidas por 25 dias e avaliadas quanto à expressão de marcadores pluripotentes SSEA4, TRAI81 e CD30. Como mostrado na Figura 6, enquanto a maioria da população derivada de STTR em D25 manteve a expressão de todos os três marcadores de pluripotência, a população induzida por EMTTR em D25 parece estar perdendo pluripotência, conforme indicado pela principal queda na expressão de CD30, indicando reversão associada a um estado pluripotente não sustentável ou instável. Ambas as populações foram passadas e a morfologia das colônias de iPSC e aglomerados diferenciados na cultura foram subsequentemente observados e comparados em D28 (Figura 7A). Como observado inicialmente com a coexpressão mantida de SSEA4, TRAI81 e CD30, a população STTR se manteve principalmente como colônias de iPSC com diferenciação espontânea mínima, enquanto a população EMTTR mostrou um alto nível de diferenciação espontânea (Figura 7B).

[000193] Para analisara natureza transitória e temporal do sistema STTR, analisou-se a expressão de EBNA na população de células após a transfecção usando RT-PCR quantitativo. Também foi monitorada a expressão endógena de OCTA4 indicativa do surgimento do estado de pluripotência na população celular. Como mostrado na Figura 8, a expressão de EBNA apareceu após a transfecção, atingiu o ponto mais alto em D2 e começou a cair acentuadamente para menos de 1% por DA, refletindo uma taxa de perda do plasmídeo V2 em mais de 90% por divisão celular (em comparação com cerca de 5% de perda de vetores epissomais baseados em EBV). Os ensaios convencionais eliminam a seleção de plasmídeos no início do experimento e triam a aparência de células livres de plasmídeo ao longo do crescimento populacional a longo prazo. Por D6, a expressão de EBNA na população é essencialmente não detectável, caracterizando um sistema de expressão transitório. Uma perda tão rápida da expressão de EBNA determinou sua natureza de extrema curta duração e temporal, indicando muito provavelmente uma retenção transitória do plasmídeo V2 no citoplasma, sem o benefício da incorporação do núcleo e da integração cromossômica ou do genoma. Mais importante, o EBNA foi perdido antes que qualquer morfologia do iPSC aparecesse na cultura e certamente antes que o estado pluripotente autosustentável fosse formado. O método fornecido neste documento reduziu o tempo de retenção de plasmídeo mediado por EBNA e contrasta claramente com a necessidade de expressão estável de EBNA na reprogramação mediada por epissoma (consultar o documento US 8.546.140, exigindo expressão estável de EBNA por pelo menos 8 dias a pelo menos 30 dias, ou expressão constitutiva na célula hospedeira em Mazda et a/., 1997).

[000194] Howden et a/., 2006 (Human Gene Therapy; 17: 833 a 844) mostraram que a cotransfecção de mMRNA de EBNA com vetor epissomal baseado em EBV aumenta a captação nuclear e, portanto, a amarração cromossômica do vetor epissomal baseado em EBV e aumentando, assim, a eficiência de transfecção em 10 vezes. No presente pedido, o pico transitório da expressão de EBNA por transfecção do plasmídeo V2 no sistema STTR pode ser semelhante à forma do MRNA de EBNA, no entanto, o plasmídeo V1 neste documento, contendo oriP sozinho e sem expressar EBNA, carece do mecanismo de amarração de um Episomal baseado em EBV, que depende de uma expressão contínua de EBNA para reter e replicar o DNA do vetor a longo prazo para impactar significativamente a taxa de transfecção. Mesmo que o transporte de um plasmídeo que contenha oriP, como V1, do citoplasma para o núcleo seja aumentado pelo plasmídeo EBNA transitoriamente expresso V2, na ocorrência de cotransfecção dos dois plasmídeos, V1 ainda não suporta uma expressão a longo prazo do fator de reprogramação transgenes, conforme indicado por uma taxa de perda semelhante entre V1 e V2.

[000195] Portanto, a reprogramação do STTR usando V1 e V2 é através de um mecanismo de plasmídeos que é caracterizado como verdadeiramente transitório (extracromossômico e citoplasmático) e temporal (duração extremamente curta), diferente de uma reprogramação epissomal localizada no núcleo e a longo prazo, em comparação. Sem a necessidade de transfecção múltipla, a reprogramação de plasmídeo mediada por V1 e V2 é surpreendentemente eficiente. Além disso, a reprogramação do plasmídeo pareceu perder todo o plasmídeo EBNA por D6, momento em que nenhum iPSC, ou um estado de pluripotência, foi formado. Através da detecção de EBNA, o sistema STTR demonstrou que a perda de transgene é rápida e é significativamente antes de estabelecer um estado de pluripotência que, em geral, fica em torno de D21 a D32, com o nível de expressão endógena elevado de OCT4 como um dos marcadores.

[000196] Curiosamente, embora a eficiência de reprogramação usando o sistema STTR tenha sido menor que o sistema EMTTR (aproximadamente 2% versus 21%), diferentemente do sistema EmTTR, não foi detectada reversão de pluripotência e/ou diferenciação espontânea de iPSCs no sistema STTR, como a maioria das iPSCs geradas no sistema STTR mantinham o status de iPSC e conseguiam se diferenciar em todas as três camadas germinativas: endoderme, mesoderma e ectoderma (Figura 9). Isso em parte pode ser atribuído à curta duração da exposição ao transgene para a população de células, de modo que a reprogramação é mais inclinada a utilizar o sistema e a cinética do desenvolvimento endógeno induzido, em vez de ser amplamente impulsionada por fatores de reprogramação exógenos cuja presença pode ser sustentada por expressão de longo tempo de EBNA, como visto em EmTTR.

[000197] Para fornecer mais evidências da ausência de DNA V1 nas iPSCs recém-formadas, foi realizo um teste funcional em várias linhas de iPSC (D25 a D30) quanto à sobrevivência na presença de higromicina.

Todas as linhas hiPSC testadas demonstraram não ter nenhum componente genético do STTR e mostraram resistência à higromicina, mais uma evidência da perda completa do DNA V1 no sistema STTR. Os clones selecionados foram passados continuamente como células únicas em um ambiente livre de alimentador e demonstraram manter uma população homogênea de células indiferenciadas, enquanto exibiam a capacidade de se diferenciar eficientemente nas três linhagens somáticas. A análise de variação de cariótipo e número de cópias divulgou linhas hiPSC genomicamente estáveis durante a cultura de longo prazo mantida no FMM. Além disso, os clones selecionados demonstraram a capacidade de dar origem a células das três camadas germinativas e, quando direcionadas, diferenciadas de maneira homogênea em relação às células hematopoiéticas, incluindo células CD34+, células NK e células T.

[000198] O sistema STTR também mostrou ser eficaz no início da reprogramação, independentemente das várias combinações de fatores de reprogramação realizadas por vetores V1 distintos (Figura 10 e Tabela 3).

TABELA 3 - NOVAS COMBINAÇÕES DE FATORES DE

SISTEMA STTR SSEA4+/TRA181+ | reprogramadas

[000199] —Areprogramação usando o presente sistema STTR e a reprogramação usando o vetor epissomal baseado em EBV geram iPSCs diferentes em termos de conteúdo de DNA exógeno. A reprogramação epissomal baseada em EBV foi elogiada por gerar iPSCs livres de pegadas, mas é amplamente dependente de uma taxa lenta de perda de DNA epissomal em cerca de 3 a 5% por divisão celular (Leight et a/., Mol Cell Biol (2001); 21:4149 a

4161). Portanto, quando um vetor epissomal é usado para reprogramação, uma população de iPSC livre de pegadas é possível somente após várias rodadas de passagem de células iPS. Foi demonstrado que leva pelo menos 12 a 15 passagens (cada cultura dividida a cada 4 a 7 dias conta como uma passagem) das iPSCs obtidas inicialmente para obter uma população de células-tronco pluripotentes que é essencialmente livre de pegadas (Cheng et a/., Cell Stem Cell (2012); 10:337 a 344) sem seleção. Até então, a população de iPSC assim gerada é altamente heterogênea em termos de seu conteúdo de DNA exógeno. Um estudo mostrou que cerca de dois terços das iPSCs da população contêm o vetor epissomal oriP/EBNA cerca de 20 dias após a transfecção (Leight et al., Mol Cell Biol (2001); 21: 4149 a 4161; Yu et al., Science (2009); 324(5928): 797 a 801). Para células reprogramadas com taxa de diferenciação espontânea perceptível ou alta, obter iPSCs livres de pegadas por meio de um processo prolongado de passagem natural é ainda mais inadequado.

[000200] — Coletivamente, os dados mostram que os hiPSCs livres de pegadas podem ser facilmente gerados pela expressão transitória e temporária de genes de reprogramação usando as combinações de vetores plasmídicos de curta duração fornecidas neste documento e a plataforma suporta a geração eficiente e rápida de uma população iPSC livre de pegadas substancialmente homogênea. Em algumas modalidades, a população de iPSC livre de pegadas é gerada sem a necessidade de passagem extensiva e, opcionalmente, em um ambiente completamente livre de alimentador.

EXEMPLO 3 - SISTEMA DE REPROGRAMAÇÃO

CELULA UNICA COMO FONTE DE CELULAS DERIVADAS PARA USOS TERAPÉUTICOS

[000201] —Ascomposições e métodos de reprogramação STTR foram utilizados para gerar linhas iPSC clonais principais para uso como fontes celulares renováveis e confiáveis para imunoterapias prontas para uso. Os fibroblastos consentidos pelos doadores foram transfectados com a combinação de plasmídeo como divulgado. As células de reprogramação foram classificadas em densidade clonal em placas de 96 poços e os clones de iPSC derivados de células únicas foram expandidos e rastreados quanto aos atributos desejados, incluindo pluripotência, perda de plasmídeos de reprogramação, estabilidade genômica e potencial de diferenciação. A linha iPSC clonal selecionada foi fabricada e criopreservada sob rigorosos controles de qualidade de fabricação e processo, e a linha foi ainda sujeita a extensas caracterizações e testes para se qualificar como “banco de células principais”, conforme exigido pela regulamentação relevante. Os bancos iPSC fabricados foram diferenciados seguindo as boas práticas atuais de fabricação em células exterminadoras naturais (NK) em uma escala clinicamente relevante. As células derivadas foram sujeitas a extensas caracterizações e testes para se qualificarem como “substância de fármaco e produto de fármaco”, conforme exigido pela regulamentação relevante. As células NK-iPSC derivadas foram criopreservadas para gerar um grande número de doses em cerca de 1x108 células/dose para utilização em terapia celular adoptiva para o sangue e cânceres sólidos como monoterapia ou em combinação com inibidores de via de sinalização imunes. Em geral, 1 x 1083 células/dose traduz a 1,67 x 106 células/kg para um paciente de 60 kg. A forma de dosagem, rota de administração e regime de dosagem para cada indicação foram projetados e determinados de acordo com dados pré- clínicos de estudos GLP (Boas Práticas de Laboratório) e não GLP in vitro e in vivo.

[000202] Além de apoiar células imunes derivadas de iPSC para tratar câncer e doenças imunológicas, as linhas iPSC principais livres de pegadas e de células alimentadoras geradas pela plataforma de reprogramação STTR têm o potencial de permitir terapias celulares prontas para distúrbios degenerativos, que variam de degeneração, diabetes, doença de Parkinson, distúrbios no sangue a doenças cardiovasculares.

[000203] Um versado na técnica apreciaria prontamente que os métodos, composições e produtos descritos neste documento são representativos de modalidades exemplares, e não pretendem ser limitações do escopo da invenção. Será facilmente aparente para um versado na técnica que várias substituições e modificações podem ser feitas na presente divulgação divulgada neste documento sem se afastar do escopo e espírito da invenção.

[000204] “Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas dos níveis dos versados na técnica aos quais a presente divulgação se refere. Todas as patentes e publicações são incorporadas neste documento a título de referência na mesma extensão como se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada como incorporada a título de referência.

[000205] A presente divulgação ilustrativamente e adequadamente descrita neste documento pode ser praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não sejam especificamente divulgados neste documento. Assim, por exemplo, em cada caso neste documento, qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente em" e "consistindo em" pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos. Os termos e expressões que foram utilizados são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há intenção de que, no uso de tais termos e expressões, exclua quaisquer equivalentes dos recursos mostrados e descritos ou porções dos mesmos, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis dentro do escopo da presente divulgação reivindicada. Assim, deve ser entendido que, embora a presente divulgação tenha sido especificamente divulgada por modalidades preferenciais e recursos opcionais, a modificação e a variação dos conceitos divulgados neste documento podem ser recorridas pelos versados na técnica, e que essas modificações e variações são consideradas como estando dentro do escopo desta invenção, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para reprogramar uma célula não pluripotente para gerar uma célula pluripotente, uma linha celular ou uma população da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) introduzir a uma primeira célula, em que a primeira célula é uma célula não pluripotente: um ou mais primeiros plasmídeos, em que o primeiro plasmídeo compreende uma origem de replicação e um polinucleotídeo que codifica um ou mais fatores de reprogramação, mas não codifica um EBNA ou um derivado do mesmo; em que pelo menos um dos um ou mais primeiros plasmídeos compreende um polinucleotídeo que codifica OCT4; em que a introdução de um ou mais primeiros plasmídeos induz processo de reprogramação; e, opcionalmente, um de: (1) um segundo plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codificam fator (ou fatores) de reprogramação; (2) um mRNA de EBNA; e (3) uma proteína EBNA; (b) cultivaras células da etapa (a) para gerar uma segunda célula, em que a segunda célula é uma célula de reprogramação, em que a célula de reprogramação compreende uma alteração morfológica da primeira célula e é essencialmente livre de EBNA; em que a célula de reprogramação não compreende: (1) morfologia celular pluripotente; e (2) expressão endógena de OCTA4; e (c) cultivar adicionalmente a segunda célula obtida na etapa (b) por um período de tempo suficiente para gerar uma célula pluripotente.

2. — Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) compreende introduzir na primeira célula um segundo plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica (ou codificam) fator (ou fatores) de reprogramação;

3. — Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: dissociar as células pluripotentes para obter células pluripotentes dissociadas de célula única.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: suspender as células pluripotentes dissociadas de célula única.

5. “Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: classificar as células pluripotentes dissociadas por célula única selecionando e isolando as células que expressam um ou mais marcadores de pluripotência para enriquecer para células pluripotentes que expressam o marcador (ou marcadores).

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: cultivar a célula pluripotente na presença de um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK para manter a pluripotência, em que a célula pluripotente mantém a pluripotência por pelo menos 5, 10, 15 ou 20 passagens.

7. — Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cultivar na etapa (b) compreende cultivar na presença de pelo menos um dentre um inibidor de TGFB, um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira célula é uma célula somática, um célula progenitora ou uma célula multipotente.

9. — Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira célula é um fibroblasto e em que a alteração morfológica da segunda célula compreende MET (transição mesenquimal para epitelial).

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda célula está essencialmente livre de plasmídeos da etapa (a).

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a segunda célula compreende a reprogramação de células de cerca de 4 a 10, 12, 14, 21, 25 dias ou a qualquer número de dias intermediários após a introdução de um ou mais primeiros plasmídeos na etapa (a).

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente tem reversão de pluripotência reduzida ou diferenciação espontânea.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente está essencialmente livre dos polinucleotídeos dos plasmídeos da etapa (a) sem a necessidade de seleção ou passagem extensiva da célula pluripotente.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente tem pelo menos uma das propriedades: (1) altaclonalidade;

(2) estabilidade genética; e (3) pluripotência no estado fundamental.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula pluripotente compreende genes reativados associados a células extraembrionárias.

16. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o segundo plasmídeo tem uma alta taxa de perda; e/ou em que a expressão de EBNA é transitória e temporal.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a origem da replicação e/ou EBNA é baseada em EBV.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que as células estão sob uma condição livre de alimentador.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ROCK é tiazovivina.

20. Célula de reprogramação ou uma população da mesma obtida após a introdução em uma célula não pluripotente com um ou mais primeiros plasmídeos, caracterizada pelo fato de que o primeiro plasmídeo compreende uma origem de replicação e um polinucleotídeo que codifica um ou mais fatores de reprogramação, mas não codifica um EBNA ou um derivado do mesmo; em que pelo menos um dos um ou mais primeiros plasmídeos compreende um polinucleotídeo que codifica OCT4; e opcionalmente com um de: (1) um segundo plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica (ou codificam) fator (ou fatores) de reprogramação; (2) um mRNA de EBNA; e (3) uma proteína EBNA; em que a célula de reprogramação compreende uma alteração morfológica da célula não pluripotente antes da introdução da combinação de plasmídeos e é essencialmente livre de EBNA ou derivado do mesmo; em que a célula de reprogramação não compreende: (1) morfologia celular pluripotente; e (2) expressão endógena de OCT4; e em que a célula de reprogramação é capaz de estabelecer pluripotência estável ou autossustentável, fornecida uma quantidade de tempo suficiente para gerar uma célula pluripotente.

21. Célulade reprogramação ou uma população da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a célula de reprogramação é de cerca de 4 a 10, 12, 14, 21, 25 dias ou a qualquer número de dias intermediários, após a introdução de um ou mais primeiros plasmídeos.

22. Céluladereprogramação ou uma população da mesma, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que a célula de reprogramação é cultivada na presença de pelo menos um dentre um inibidor de TGFB, um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK.

23. Céluladereprogramação ou uma população da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizada pelo fato de que a célula não pluripotente é um fibroblasto e em que a alteração morfológica da célula de reprogramação compreende MET (transição mesenquimal para epitelial).

24. Céluladereprogramação ou uma população da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que a célula de reprogramação está essencialmente livre de primeiro e/ou segundo plasmídeo.

25. Céluladereprogramação ou uma população da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizada pelo fato de que a célula pluripotente está essencialmente livre dos polinucleotídeos dos plasmídeos sem a necessidade de seleção ou passagem extensiva da célula pluripotente.

26. Célulade reprogramação ou uma população da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizada pelo fato de que a célula pluripotente tem reversão de pluripotência reduzida ou diferenciação espontânea.

27. Céluladereprogramação ou uma população da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizada pelo fato de que a célula pluripotente tem pelo menos uma das propriedades: (1) altaclonalidade; (2) estabilidade genética; e (3) pluripotência no estado fundamental.

28. Céluladereprogramação ou uma população da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, caracterizada pelo fato de que a célula pluripotente compreende genes reativados associados a células extraembrionárias.

29. Composição caracterizada pelo fato de que compreende a célula de reprogramação ou uma população da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um meio que compreende um inibidor de TGFB, um inibidor de GSK3, um inibidor de MEK e um inibidor de ROCK.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o inibidor de ROCK é tiazovivina.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizada pelo fato de que o meio é livre de alimentador.

33. Célula pluripotente isolada ou linha celular pluripotente caracterizada pelo fato de que é produzida por um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

34, Célula pluripotente geneticamente modificada ou uma linha celular da mesma caracterizada pelo fato de que utiliza a célula ou linha celular pluripotente isolada produzida por um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

35. Célula não natural derivada caracterizada pelo fato de que é rediferenciada da célula ou linha celular pluripotente isolada, de acordo com a reivindicação 33, ou da célula ou linha celular pluripotente geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 34.

36. Célula não natural derivada, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a célula é do tipo célula imune, em que a célula compreende uma célula CD34, uma célula endotélio hemogênica, uma célula-tronco ou progenitora hematopoiética, uma célula progenitora multipotente hematopoiética, um progenitor de célula T, um progenitor de célula NK, uma célula T, uma célula NKT, uma célula NK, uma célula B ou uma célula reguladora imune.

37. Célula não natural derivada, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula rejuvenescida que compreende pelo menos uma das seguintes propriedades: aumento global da heterocromatina; função mitocondrial melhorada; aumento das respostas a danos no DNA; alongamento de telômero e diminuição da porcentagem de telômero curto; diminuição da fração de células senescentes; e maior potencial de proliferação, sobrevivência, persistência ou funções do tipo memória, em comparação em comparação com o seu homólogo celular natural.

38. Composição para uso terapêutico caracterizada pelo fato de que compreende uma célula pluripotente obtida por um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 e, opcionalmente, um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

39. Composição para uso terapêutico caracterizada pelo fato de que compreende uma célula pluripotente geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 34, ou uma célula não natural derivada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, e, opcionalmente, um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de um indivíduo com necessidade da mesma.

41. Composição para uso na fabricação de uma célula pluripotente para aplicação em terapias baseadas em células, sendo que a composição é caracterizada pelo fato de que compreende uma célula pluripotente produzida por um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que a célula pluripotente é alogênica ou autóloga.

43. Kit para uso medicativo caracterizado pelo fato de que compreende uma célula pluripotente obtida por um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19.

44, Kit para uso medicativo caracterizado pelo fato de que compreende uma célula pluripotente geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 34, ou uma célula não natural derivada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37.

45. Sistema in vitro para iniciar a reprogramação em uma célula não pluripotente, sendo que o sistema é caracterizado pelo fato de que compreende: um ou mais primeiros plasmídeos, em que o primeiro plasmídeo compreende uma origem de replicação e um polinucleotídeo que codifica um ou mais fatores de reprogramação, mas não codifica um EBNA ou um derivado do mesmo; em que pelo menos um dos um ou mais primeiros plasmídeos compreende um polinucleotídeo que codifica OCTA4; e opcionalmente um de: (1) um segundo plasmídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um EBNA, em que o segundo plasmídeo não compreende uma origem de replicação ou polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica (ou codificam) fator (ou fatores) de reprogramação; (2) um mRNA de EBNA; e (3) uma proteína EBNA.

46. Sistema, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o segundo plasmídeo tem uma alta taxa de perda; e em que a expressão de EBNA é transitória e temporal.

47. Sistema, de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que o sistema não fornece replicação de EBNA e/ou expressão contínua no núcleo.

48. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que o sistema permite uma expressão transitória/citoplasmática de EBNA por um curto período de tempo e antes do aparecimento da morfologia das células de pluripotência e da expressão induzida de genes de pluripotência endógenos.

49. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 48, caracterizado pelo fato de que o sistema permite uma expressão transitória/citoplasmática de um ou mais fatores de reprogramação compreendidos no primeiro plasmídeo (ou plasmídeos) por uma curta duração e antes do aparecimento da morfologia das células de pluripotência e expressão induzida de genes de pluripotência endógena.

50. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, caracterizado pelo fato de que a origem da replicação é selecionada a partir do grupo que consiste em um vírus Polyomavirinae, um vírus Papillomavirinae e um vírus Gammaherpesvirinae.

51. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 50, caracterizado pelo fato de que a origem da replicação é aquela selecionada a partir do grupo que consiste em SV40, vírus BK (BKV), vírus do papiloma bovino (BPV) ou vírus Epstein-Barr (EBV).

52. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51, caracterizado pelo fato de que a origem da replicação corresponde à, ou é derivada da, origem de replicação do tipo selvagem do EBV.

53. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 52, caracterizado pelo fato de que o EBNA é baseado em EBV.

54. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 53, caracterizado pelo fato de que o um ou mais primeiros plasmídeos compreendem coletivamente polinucleotídeos que codificam fator (ou fatores) de reprogramação compreendendo um ou mais de OCT4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPAA4, DNMT3B, ZIC3 e LITD1.

55. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 54, caracterizado pelo fato de que os polinucleotídeos que codificam os fatores de reprogramação estão compreendidos em uma construção policistrônica ou construção não policistrônica.

56. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 55, caracterizado pelo fato de que o construto policistrônico compreende um único quadro de leitura aberto ou vários quadros de leitura abertos.

57. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 56, caracterizado pelo fato de que o sistema compreende dois ou mais primeiros plasmídeos, com cada primeiro plasmídeo compreendendo o mesmo ou diferentes fatores de reprogramação codificados por pelo menos uma cópia do polinucleotídeo.

58. Sistema, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o sistema que compreende dois ou mais primeiros plasmídeos fornece um controle da estequiometria do fator de reprogramação.

59. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 58, caracterizado pelo fato de que o primeiro plasmídeo compreende mais de um polinucleotídeo que codifica fatores de reprogramação, em que os polinucleotídeos adjacentes são operacionalmente conectados por uma sequência ligante que codifica um peptídeo autoclivante ou um IRES.

60. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 59, caracterizado pelo fato de que o peptídeo de autoclivagem é um peptídeo 2A e é selecionado a partir do grupo que compreende F2A, E2A, P2A e T2A.

61. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 60, caracterizado pelo fato de que os peptídeos 2A compreendidos em um primeiro construto plasmídico podem ser iguais ou diferentes.

62. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 61, caracterizado pelo fato de que dois peptídeos 2A em posições vizinhas são diferentes.

63. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 62, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo plasmídeo compreendem, cada um, um ou mais promotores para expressão de fatores de reprogramação e EBNA, e em que um ou mais promotores compreendem pelo menos um dentre CMV, EFia, PGK, CAG, UBC e outros promotores adequados que sejam constitutivos, indutíveis, regulados endogenamente ou específicos do tipo temporal, tecidular ou celular.

64. Sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 63, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo plasmídeo compreendem um promotor CAG.

65. Kit caracterizado pelo fato de que compreende o sistema, de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 64.