CN111556756A - 重组免疫细胞、制备方法和使用方法 - Google Patents

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Abstract

重组免疫细胞表达异源IgG Fc受体。在一些实施方式中，异源IgG Fc受体可以是嵌合IgG Fc受体。通常，嵌合IgG Fc受体包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。细胞外结构域通常包括足以与IgG Fc区域结合的CD64的部分。嵌合IgG Fc受体的细胞内结构域包括足以在IgG Fc区域与细胞外结构域结合时允许免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)启动细胞信号传导的Fc受体的部分。

Description

重组免疫细胞、制备方法和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年10月26日提交的美国临时专利申请No.62/577,425的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
政府资助
本发明是在国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA203348的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
序列表
本申请包含序列表，该序列表通过EFS-Web电子提交给美国专利商标局，该序列表是ASCII文本文件，名称为“Sequence-Listing-0589_ST25.txt”，大小为97千字节，且创建于2018年10月26日。由于序列表是通过电子方式提交的，因此电子提交的序列表既可以用作37CFR§1.821(c)要求的纸质副本，也可以用作§1.821(e)要求的CRF。序列表中包含的信息通过引用并入本文。
发明内容
本公开描述，在一个方面，本公开描述了表达异源IgG Fc受体的免疫细胞。
在一些实施方式中，异源IgG Fc受体可以是嵌合IgG Fc受体。通常，嵌合IgG Fc受体包括细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。细胞外结构域通常包括足以与IgG Fc区域结合的CD64的部分。嵌合IgG Fc受体的细胞内结构域包括足以在IgG Fc区域与细胞外结构域结合时启动细胞信号传导的Fc受体免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的部分。
在这些实施方式的一些中，细胞内结构域包括CD16A的细胞内区域的至少一部分。在其它实施方式中，细胞内结构域可以包括CD27、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、FcRγ或CD3ζ的细胞内区域的至少一部分。
在一些实施方式中，嵌合IgG Fc受体可以包括CD16A细胞外切割位点。在一些实施方式中，嵌合IgG Fc受体的细胞外结构域可以缺少CD16A细胞外切割位点。
在一些实施方式中，异源IgG Fc受体可以包括不被免疫细胞天然表达的IgG Fc受体。在这些实施方式的一些中，免疫细胞可以是经遗传修饰以表达CD64的天然杀伤(NK)细胞。
在另一方面，本公开描述了编码上文概述的异源IgG Fc受体的任何实施方式的多核苷酸。
在另一方面，本公开描述了经遗传修饰以包括编码上文概述的异源IgG Fc受体的任何实施方式的多核苷酸的免疫细胞。
在另一方面，本公开描述了杀伤肿瘤细胞的方法。通常，该方法包括使肿瘤细胞与特异性结合该肿瘤细胞的抗体接触，并使该肿瘤细胞与上文概述的重组免疫细胞的任何实施方式在重组免疫细胞有效杀伤肿瘤细胞的条件下接触。
在另一方面，本公开描述了治疗患有肿瘤的受试者的方法。通常，该方法包括向受试者给药特异性结合肿瘤的细胞的抗体，以及在重组免疫细胞有效杀伤肿瘤的细胞的条件下向受试者给药包括上文概述的重组免疫细胞的任何实施方式的组合物。
在另一方面，本公开描述了包括治疗性抗体与上文概述的重组免疫细胞的任何实施方式之间形成的复合物的组合物，其中异源IgG Fc受体结合治疗性抗体的Fc部分。
在另一方面，本公开描述了治疗患有肿瘤的受试者的方法。总体上，该方法包括向受试者给药刚刚概述的组合物的任何实施方式，其中治疗性抗体特异性结合肿瘤的细胞。
上述发明内容并非意图描述每个公开的实施方式或本发明的每种实施方案。下文的描述更具体地举例说明了示例性实施方式。在整个申请中的多个地方，通过一系列实例提供了指导，这些实例可以以各种组合使用。在每种情况下，所列举的系列仅用作代表组，而不应解释为排他性系列。
附图说明
专利或申请文件中包含至少一张彩色附图。在提出要求并支付必要费用后，专利局将提供带有彩色附图(一张或多张)的本专利或专利申请公开的副本。
图1.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
图2.野生型CD16A、野生型CD64和CD64/16A嵌合构建体。对于CD16A所示的剪刀和虚线代表胞外域脱落的细胞外蛋白水解位点。
图3.表达野生型CD16A或CD64/16A的NK92细胞。(A)用抗CD16、抗CD64或对照抗体将NK92-CD64/16A细胞染色。(B)用抗CD16、抗CD64或对照抗体将NK92-CD16A细胞染色。(C)将NK92-CD64/16A、NK92-CD16A或NK92亲本细胞与曲妥珠单抗(trastuzumab)一起温育然后与抗人IgG-APC第二级抗体一起温育，或与单独的抗人IgG-APC第二级抗体(对照)一起温育。通过流式细胞术确定所有抗体染色水平。
图4.表达CD64/CD16A的NK92细胞与野生型CD16A相比诱导更高水平的ADCC。(A)进行标准ADCC测定，其中曲妥珠单抗(赫赛汀(herceptin))包括在测定中。(B)进行标准ADCC测定，其中将NK92-CD64/CD16A和NK92-CD16A细胞与曲妥珠单抗一起预温育，然后将mAb洗去，然后将效应细胞与SKOV-3靶细胞一起温育。
图5.比较了由iNK-CD64/CD16A和iNK-pKT2细胞表达的表型标志物的流式细胞仪数据。
图6.显示使用SKOV-3靶细胞，iNK-CD64/CD16A细胞与iNK-CD16A细胞相比诱导更高水平的ADCC的条形图与数据。
图7.显示iNK-CD64/CD16A，但不是iNK-CD16A细胞，可以预装载有治疗性mAb并介导ADCC的条形图与数据。
图8.显示使用MA148靶细胞，iNK-CD64/CD16A细胞与iNK-CD16A细胞相比诱导更高水平的ADCC的条形图与数据。
图9.示例性的CD64/CD16A嵌合IgG Fc受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图10.CD64 IgG Fc受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图11.示例性的CD16A-CD28-BB-ζ链嵌合IgG Fc受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
图12.示例性的CD16A-BB-ζ链嵌合IgG Fc受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图13.NK92细胞表达CD64/16A。(A)CD16A、CD64和CD64/16A的细胞膜形式的示意图。如图所示，CD16A在膜近侧位置经历通过ADAM17的胞外域脱落，这在CD64和CD64/16A中不存在。(B)将NK92亲本细胞、NK92-CD16A细胞和NK92-CD64/16A细胞用抗CD16、抗CD64或同种型匹配的阴性对照mAb染色，并通过流式细胞术检查。(C)将NK92-CD16A和NK92-CD64/16A细胞与SKOV-3细胞，在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下，在37℃(E:T＝1:1)下温育2小时。然后将NK92-CD16A和NK92-CD64/16A细胞用抗CD16 mAb或抗CD64 mAb分别染色，并通过流式细胞术检查。使用适当的同种型阴性对照mAb确定非特异性抗体标记。数据代表至少三个独立的实验。
图14.CD64/16A促进靶细胞缀合、ADCC和IFNγ产生。(A)表达eGFP的NK92-CD64/16A细胞和CellTrace Violet标记的SKOV-3细胞以E:T比率1:2在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下混合，在37℃下温育60分钟，固定，并然后通过流式细胞术分析。显示了至少三个独立实验的代表性数据。(B)将NK92-CD64/16A细胞与SKOV-3细胞(E:T＝20:1)和曲妥珠单抗(tras.)在所指示的浓度下温育(左图)，或与SKOV-3细胞以所示的E:T比率在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下温育(右图)，在37℃下进行2小时。数据表示为％特异性释放，并且显示三个独立实验的平均值±SD。统计学显著性表示为*p<0.05，**p<0.01。(C)在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)和抗CD64 mAb 10.1(10μg/ml)的情况下，如所示的，将NK92-CD64/16A细胞与SKOV-3细胞(E:T＝20:1)一起温育，在37℃下进行2小时。数据表示为％特异性释放，并且显示三个独立实验的平均值±SD。统计显著性表示为**p<0.01。(D)将NK92-CD64/16A细胞与SKOV-3细胞(E:T＝1:1)在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下在37℃下温育2小时。通过ELISA定量分泌的IFNγ水平。数据显示为两次独立实验的平均值。
图15.CD64/16A与可溶性靶向肿瘤的mAb和IgG融合蛋白附连。(A)NK92细胞上CD16A和CD64/16A的相对表达水平分别通过用抗CD16和抗CD64 mAb(黑条)，或同种型匹配的阴性对照抗体(灰条)进行细胞染色来确定。条形图显示了三个独立实验的平均荧光强度(MFI)±SD。代表性的流式细胞术数据以直方图叠加显示。虚线直方图显示NK92-CD64/16A细胞的CD64染色，橙色填充的直方图显示NK92-CD16A细胞的CD16A染色，以及绿色填充的直方图显示NK92-CD16A细胞的同种型对照抗体染色。(B)NK92-CD16A和NK92-CD64/16A细胞在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下在37℃下温育2小时，洗涤，用荧光团缀合的抗人二抗染色，并通过流式细胞仪进行分析。数据代表至少三个独立的实验。(C)将NK92-CD64/16A细胞与西妥昔单抗(cetuximab)或利妥昔单抗(rituximab)(每种5μg/ml)一起温育，洗涤，并然后用荧光团缀合的抗人二抗染色。对照代表仅用抗人二抗染色的细胞。NK92-CD64/16A细胞也与L-选择素/Fc(5μg/ml)一起温育，洗涤，并然后用荧光团缀合的抗L-选择素mAb染色。NK92细胞缺乏内源性L-选择素的表达(数据未显示)。通过流式细胞术分析所有染色。显示的数据代表三个独立的实验。(D)在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下温育NK92-CD16A和NK92-CD64/16A细胞，洗涤，并在指示的E:T细胞比率下在37℃下暴露于SKOV-3细胞2小时。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。统计显著性表示为**p<0.01，***p<0.001。bd＝低于检测限(即，<阴性对照细胞的自发释放)。(E)NK92-CD16A和NK92-CD64/16A细胞与SKOV-3细胞(E:T＝10:1)在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下，如所指示的，在37℃下温育2小时。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。统计显著性表示为**p<0.01。
图16.表达CD64/CD16A的iNK细胞的生成。iPSC进行转导以稳定表达CD64/16A，分化为NK细胞，并然后使用K562-mbIL21-41BBL饲养层细胞进行扩增。iNK-CD64/16A细胞和从成人外周血富集的新分离的外周血(PB)NK细胞进行针对CD56、CD3和各种抑制性和活化受体的染色，如所指示的。通过用抗CD64 mAb染色细胞来确定CD64/16A表达。显示了至少三个独立实验的代表性数据。
图17.与iNK-pKT2对照细胞相比，iNK-CD64/16A细胞显示出增强的ADCC。(A)对源自空载体(iNK-pKT2)或CD64/16A(iNK-CD64/16A)转导的iPSC的NK细胞进行针对CD56、CD64和CD16A的染色，如所指示的。(B)将iNK-pKT2和iNK-CD64/16A细胞与SKOV-3细胞(E:T＝10:1)在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)、功能阻断性抗CD16 mAb 3G8(5μg/ml)和功能阻断性抗CD64 mAb 10.1(5μg/ml)的情况下，如所指示的，在37℃下温育2小时。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。统计显著性表示为***p<0.001；****p<0.0001。(C)将iNK-pKT2和iNK-CD64/16A细胞在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下温育，洗涤，并在37℃下暴露于SKOV-3细胞(E:T＝10:1)2小时。数据显示为三个独立实验的平均值±SD。统计显著性表示为***p<0.001。
图18.犬CD16A(SEQ ID NO：5)、犬CD64sp(SEQ ID NO：25)和人CD16A(SEQ ID NO：6)的序列比对。
图19.犬CD64(SEQ ID NO：7)和人CD64(SEQ ID NO：8)的序列比对。
图20.表达野生型人CD64的NK92细胞介导ADCC。(A)用同种型匹配的阴性对照mAb或抗CD64 mAb(克隆10.1)将NK92-CD64细胞染色，并通过流式细胞术检查。(B)将NK92-CD64细胞与SKOV-3细胞(以所指示的E:T比率)在存在或不存在曲妥珠单抗(tras.)(5μg/ml)的情况下在37℃下温育2小时。显示了至少三个独立实验的代表性数据。
具体实施方式
本公开描述了重组免疫细胞，制备重组免疫细胞的方法，以及使用重组免疫细胞的方法。通常，重组免疫细胞经遗传修饰以包括异源IgG Fc受体。在一些情况下，异源IgGFc受体可以是经工程化以包括来自两种或更多种受体的结构域的嵌合受体。在其他实施方式中，异源可以是不被免疫细胞天然表达的IgG Fc受体。通常，重组免疫细胞提供针对靶标(例如肿瘤细胞)的持续的细胞毒性免疫应答，该靶标被免疫细胞靶向杀伤，因为该靶标结合了被IgG Fc受体识别的治疗性抗体。
细胞介导的免疫防御机制涉及由白细胞表达的Fc受体与靶细胞附连的抗体的接合，从而杀伤靶细胞。此过程称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。已经针对多种肿瘤抗原产生了治疗性单克隆抗体(mAb)，并已在临床试验中进行了测试，以治疗传染性疾病、慢性疾病和癌症，包括例如AML、乳腺癌、卵巢癌、胃癌、神经母细胞瘤和淋巴瘤。许多临床上成功的mAb将ADCC用作作用机制。然而，抗体疗法的局限性在于患者耐药性的发展以及某些恶性肿瘤的无反应性。
本公开描述了用于增强Fc受体与治疗性抗体的相互作用的方法。该方法涉及包括CD16A结构域和CD64结构域的嵌合受体。
CD16A(FcγRIIIA)是由人天然杀伤(NK)细胞(一种细胞毒性淋巴细胞的群体)表达的IgG Fc受体，并且是其识别与肿瘤细胞或病毒感染的细胞结合的IgG的唯一手段。CD16A是通过NK细胞诱导ADCC的有效活化受体(图1)。CD16A跨膜区域负责与包含免疫受体酪氨酸基活化基序的CD3ζ和/或FcRγ链(FcRγ)连接(图2；图13A)，并且CD16A细胞质结构域与对受体功能至关重要的细胞内分子相互作用。CD16A是具有与治疗性mAb包被的靶细胞结合的有限能力的低亲和性FcγR。CD16A还在细胞活化后经历表达的迅速下调，从而显著降低其细胞表面密度和对IgG的亲和力。CD16A下调是通过蛋白水解事件在质膜近侧的细胞外位点发生的，并且被称为胞外域脱落。该切割位点的位置已被报道(Jing等人，2015年.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10:e0121788)，并在图2和图13A中示意性示出。
CD64(FcγRI)是另一种IgG Fc受体，并且由单核细胞、巨噬细胞和活化的嗜中性粒细胞表达。CD64是高亲和性IgG受体。该受体在细胞活化后不经历胞外域脱落，也不天然地转导NK细胞中ADCC的信号。
本公开描述了包括CD16A结构域和CD64结构域的嵌合FcγR。嵌合受体包括人CD64的细胞外区域和人CD16A的细胞质区域，其示例性实施方式在图2和图13A中示意性地示出为CD64/16A。在各种实施方式中，嵌合CD64/CD16A受体可包括CD64跨膜区域或CD16A跨膜区域。已对CD64/16A构建体进行了工程化，使其缺少CD16A细胞外切割位点，并因此不易发生胞外域脱落(图2；图13A)，但包括涉及细胞内信号传导的CD16A细胞内区域的至少一部分。
此外，虽然本文在其中CD64结构域和CD16A分别包含人CD64和人CD16A的氨基酸序列的示例性实施方式的上下文中进行了描述，但本文所述的嵌合FcγR可以包括是或衍生自由任何物种天然表达的任何合适的CD64或CD16A的氨基酸序列。图18和图19提供了CD16A(图18)和CD64(图19)的人和犬氨基酸序列的氨基酸序列比对。
如本文所用，如果结构域的氨基酸序列与参考多肽的氨基酸序列相比具有指定量的序列相似性和/或序列同一性，则该结构域的氨基酸序列“衍生自”参考多肽的氨基酸序列。可以通过比对两个多肽的残基(例如，结构域氨基酸序列和参考CD16A或CD64多肽的氨基酸序列)以优化沿其序列长度的相同氨基酸的数量来确定序列相似性。为了优化相同氨基酸的数目，允许在进行比对中在任一序列或两个序列中存在空位，尽管每个序列中的氨基酸必须仍然保持其正确顺序。
可以使用GCG软件包(版本10.2，Madison WI)中的BESTFIT算法对氨基酸序列进行成对比较分析。替代地，可使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序对多肽进行比较，如Tatiana等人所述(FEMS Microbiol Lett,174,247-250(1999))，并可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information(NCBI))网站获得。可以使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括矩阵(matrix)＝BLOSUM62；开放空位罚分(open gappenalty)＝11，扩展空位罚分(extension gap penalty)＝1，空位x_丢掉(gap x_dropoff)＝50，期望(expect)＝10，字号(wordsize)＝3，并且过滤开启(filter on)。
如果结构域的氨基酸序列具有指定程度的氨基酸序列“同一性”或氨基酸序列“相似性”，则该结构域的氨基酸序列“衍生自”参考多肽的氨基酸序列。氨基酸序列同一性是指存在相同氨基酸。氨基酸序列相似性是指不仅存在相同氨基酸，而且还存在保守性替换。氨基酸的保守性替换可以选自取代的氨基酸所属类别的其他成员。例如，在蛋白质生物化学领域中众所周知，可以将属于具有特定大小或特点(诸如电荷、疏水性和亲水性)的一组氨基酸的氨基酸替换为另一种氨基酸，而不会改变蛋白质的活性，特别是在与生物活性不直接相关的蛋白质区域中。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守性替换包括，例如，Lys替换为Arg，反之亦然，以保持正电荷；Glu替换为Asp，反之亦然，以保持负电荷；Ser替换为Thr，以保持游离的-OH；以及Gln替换为Asn，以保持游离的-NH2。同样，还考虑了包含不消除多肽的功能活性的一个或多个连续或不连续氨基酸的缺失或添加的多肽的生物活性类似物。
如果结构域氨基酸序列具有与参考氨基酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列相似性，则CD16A结构域或CD64结构域的氨基酸序列“衍生自”参考氨基酸序列。
如果结构域氨基酸序列具有与参考氨基酸序列至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性，则CD16A结构域或CD64结构域的氨基酸序列“衍生自”参考氨基酸序列。
为了确定结构域氨基酸序列是否“衍生自”特定参考氨基酸序列，示例性的合适参考多肽包括人CD16A(SEQ ID NO：6)、犬CD16A(SEQ ID NO：5)、人CD64(SEQ ID NO：8)、犬CD64(SEQ ID NO：7)、犬CD64sp(SEQ ID NO：25)或表1中所列任何构建体的对应的结构域。
此外，尽管本文在图2和图13A所示的示例性实施方式的上下文中进行了描述，但嵌合受体可以被设计为包括图2和图13A所示的CD64和CD16A之间的不同的融合点，以包括CD16A切割区域、CD64或CD16A区域中经修饰的功能基序，和/或添加其他信号传导结构域，诸如例如CD27、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、FcRγ或CD3ζ的信号传导结构域。因此，可以将嵌合受体设计为增加NK细胞或其他效应细胞的增殖，增加NK细胞或其他效应细胞的存活率，增加NK细胞或其他效应细胞的效力，和/或减少体内NK细胞的消耗。
在某些实施方式中，嵌合FcγR可被修饰成包括赋予嵌合受体附加功能的细胞质结构域或信号传导结构域。例如，嵌合FcγR可包括CD28的功能性部分，其转导参与T细胞增殖、存活和细胞因子产生的信号。作为另一实例，嵌合FcγR可包括4-1BB的功能性部分，其有助于造血细胞的克隆扩增、存活和发育。作为另一实例，嵌合FcγR可以包括
Figure BDA0002558291200000111
胞质结构域的功能性部分，其包含触发ADCC、细胞因子产生和细胞增殖和生存的细胞内信号转导途径的三个免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。作为另一实例，嵌合FcγR可包括FcRγ细胞质结构域的功能性部分，其包含优先募集Syk激酶来介导ADCC、细胞因子产生和细胞增殖和存活的细胞内信号的ITAM。作为另一实例，嵌合FcγR可包括DAP10细胞质结构域的功能性部分，其包含YxxM基序，其特异性活化NK和T细胞的细胞毒性、细胞存活以及增殖的磷脂酰肌醇3-激酶依赖性信号传导途径。作为另一实例，嵌合FcγR可以包括DAP12细胞质结构域的功能性部分，其包含触发针对NK细胞和T细胞的细胞毒性、存活和增殖的信号的ITAM。作为另一实例，嵌合FcγR可以包括NKG2D(或CD314)跨膜结构域的功能性部分，其特异性连接DAP10以介导NK和T细胞的细胞毒性、细胞存活以及增殖的信号传导途径。作为另一实例，嵌合FcγR可以包括2B4(NKR2B4或CD244)细胞质结构域的功能性部分，其转导涉及增强的NK细胞的细胞毒性的细胞溶解颗粒极化的信号。作为另一实例，嵌合FcγR可包括高亲和性IgE受体FcεR跨膜和细胞质结构域的功能性部分，其组成性地与它的β亚单位和FcRγ链(FcRγ)连接以介导引发过敏反应的在髓样细胞中的最有效的脱颗粒信号，其可以被开发用于使用重组高亲和性IgG Fc受体的癌症疗法。
表1列出了包括示例性细胞质结构域和/或信号传导结构域修饰的示例性构建体。
表1
Figure BDA0002558291200000121
*EC：细胞外结构域；TM：跨膜结构域；CY：细胞质结构域；SD：信号传导结构域。
64：CD64，高亲和性IgG Fc受体FcγRI；mutCD64：具有导致更高水平的细胞因子产生和脱颗粒的细胞质突变的高亲和性IgG Fc受体FcγR1；16A：C16A，低亲和性IgG Fc受体FcγRIIIA；--：无信号传导结构域；28：CD28，用于细胞增殖和活化的共刺激受体；BB：4.1BB或CD137；
Figure BDA0002558291200000122
链或CD247；FcRγ：FcRγ链；D10：DAP10信号传导接头；D12：DAP12信号传导接头；FceR：高亲和性IgE Fc受体；16PKC-：具有在PKC磷酸化位点上的突变以破坏由CD16A介导的细胞因子产生的CD16A细胞质结构域；G2D：NKG2D或CD314；2B4：NKR2B4或CD244。
CD64/16A嵌合受体可由cDNA编码，该cDNA可从导入宿主细胞以产生重组细胞的表达载体转录和翻译。宿主细胞可包括合适的白细胞样细胞或原代白细胞。合适的白细胞样细胞包括但不限于造血细胞系或诱导的多能干细胞。合适的原代白细胞包括但不限于NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或T淋巴细胞。与未经修饰的宿主细胞相比，在天然和治疗性抗体的存在下，由基因工程化的白细胞表达CD64/16A可以增强重组细胞杀伤靶细胞(例如肿瘤细胞和病毒感染的细胞)的效应子功能。因为CD64/16A嵌合受体以高亲和性与IgG结合，所以在将其给药于患者之前，也可以将治疗性mAb附连到表达该构建体的效应细胞上。因此，附连有治疗性mAb的CD64/16A将为效应细胞提供靶向元件，以将其引导至癌症位置。
NK92细胞是缺乏内源性CD16A表达的人NK细胞系。产生以稳定方式表达野生型CD16A、野生型CD64或示例性嵌合受体CD64/16A的NK细胞。表达CD64/16A的NK92细胞可以用抗CD64 mAb染色，但不能用抗CD16 mAb染色(图3A)。NK92-CD16A细胞可以用抗CD16 mAb染色，但不能用抗CD64 mAb染色(图3B)。表达CD64的NK92细胞可以用抗CD64 mAb染色，但不能用同种型匹配的阴性对照mAb染色(图20A)。
图3C示出了表达CD64/16A或CD16A的NK92细胞结合曲妥珠单抗的能力，曲妥珠单抗是对由某些恶性肿瘤过度表达的HER2/EGFR2特异的治疗性mAb。将未转导的NK92细胞、NK92-CD64/16A细胞和NK92-CD16A细胞与曲妥珠单抗(5μg/ml)在室温下温育2小时，洗涤以去除未结合的抗体，同与荧光团缀合的抗人IgG第二级抗体温育，并然后通过流式细胞仪检查。与NK92-CD16A细胞和NK92细胞相比，NK92-hCD64/16A细胞结合曲妥珠单抗的水平高得多。
图4展示了示出示例性嵌合受体CD64/16A赋予了NK92细胞ADCC效应子功能的数据。在存在或不存在不同浓度的曲妥珠单抗(0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml或5μg/ml)的情况下，将表达CD64/16A或野生型CD16A的NK92细胞与人卵巢癌细胞系SKOV-3(20:1比率)一起温育。在曲妥珠单抗的存在下，表达CD64/16A或野生型CD16A的NK92细胞表现出SKOV-3细胞毒性。在所有所检查的曲妥珠单抗浓度下，表达CD64/16A的NK92细胞具有比NK92-CD16A细胞更高的靶细胞杀伤水平(图4A)。在曲妥珠单抗的存在下，表达任一种CD64的NK92细胞也显示出SKOV-3细胞毒性(图20B)。另外，用曲妥珠单抗以5μg/ml或10μg/ml预处理NK92-CD64/16A和NK92-CD16A细胞2小时，洗涤以除去未结合的抗体，并然后与SKOV-3细胞一起温育。在该测定中，与NK92-CD16A细胞相比，NK92-CD64/16A细胞表现出显著增强的靶细胞杀伤力(图4B)。
CD64/16A也在iPSC中表达，并然后这些细胞分化为NK细胞(本文称为iNK细胞)。如图5所示，比较了用CD64/16A或空载体(pKT2)作为对照转导的iNK细胞的几种NK细胞标志物的表达。iNK-CD64/16A和iNK-pKT2细胞是CD56+和CD3-，表明它们确实是NK细胞。它们还表达了相似水平的各种NK细胞标志物。发现iNK-CD64/16A和iNK-pKT2细胞表达相似水平的CD16A，而仅iNK-CD64/16A被抗CD64 mAb染色(图5)。
如上文针对NK92细胞所述，评价了iNK-CD64/16A和iNK-pKT2细胞的ADCC。在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下，将iNK-CD64/16A和iNK-pKT2细胞与SKOV-3细胞以10:1的比率一起温育。与iNK-pKT2细胞相比，在存在曲妥珠单抗的情况下，iNK-CD64/16A细胞表现出增加的SKOV-3细胞毒性和较高水平的ADCC(图6)。
尽管iNK-CD64/16A和iNK-pKT2细胞表达相似水平的CD16A(图5)，但功能阻断性抗CD16A mAb 3G8仅阻断iNK-pKT2细胞的ADCC(图6)。相反，功能阻断性抗CD64 mAb 10.1仅阻断iNK-CD64/16A细胞的ADCC(图6)。还用曲妥珠单抗以10μg/ml预处理iNK-CD64/16A和iNK-pKT2细胞2小时，洗涤以除去未结合的抗体，并然后与SKOV-3细胞一起温育。在该测定中，与iNK-pKT2细胞相比，iNK-CD64/16A细胞表现出明显增强的靶细胞杀伤力(图7)。MA148是人卵巢癌细胞系，与SKOV-3细胞相比，其表达的HER2水平低得多。在存在或不存在曲妥珠单抗(5μg/ml)的情况下以各种比率暴露于MA148细胞时，评价iNK-CD64/16A和iNK-pKT2细胞的ADCC。再一次，在存在曲妥珠单抗的情况下，在所有效应子与靶细胞比率下，iNK-CD64/16A细胞表现出比iNK-pKT2细胞显著更高的肿瘤细胞杀伤水平(图8)。
嵌合受体CD64/16A(图2；图13A)在人NK细胞系NK92中稳定表达。这些细胞缺乏内源性FcγR，但表达外源性CD16A的转导的细胞可以介导ADCC。如图13B所示，抗CD64 mAb染色表达CD64/16A的NK92细胞，但不染色亲本NK92细胞或表达CD16A的NK92细胞。抗CD16 mAb染色表达CD16A的NK92细胞，但不染色表达CD64/16A的NK92细胞或亲本NK92细胞(图13B)。在NK细胞活化后，CD16A经历通过ADAM17的胞外域脱落，导致其表达迅速下调。中性粒细胞上的CD16A及其同种型CD16B被ADAM17切割，并且这发生在细胞膜近侧的细胞外区域。CD64或CD64/16A中不存在CD16A的ADAM17切割区域(图13A)。在通过ADCC的NK92刺激后，CD16A经历>50％的表达减少，而CD64/16A显示出很小到无的下调(图13C)。
为了评价CD64/16A的功能，检查了CD64/16A在NK细胞接合抗体结合的肿瘤细胞后引发E:T缀合、诱导ADCC以及刺激细胞因子生产的能力。在释放其颗粒内容物之前，NK细胞与靶细胞形成稳定的缀合物。使用双色流式细胞仪检查NK92-CD64/16A细胞和SKOV-3细胞的缀合。SKOV-3细胞是表达HER2的卵巢癌细胞系，并在不存在或存在抗HER2治疗性mAb曲妥珠单抗的情况下进行该测定。包含CD64/16A的双顺反子载体也表达eGFP，且其荧光用于鉴定NK92细胞。SKOV-3细胞用荧光染料CellTrace Violet标记。E:T缀合导致双色事件，其通过流式细胞术评价。NK92-CD64/16A细胞与SKOV-3细胞温育得到了在初始暴露后非常低水平的缀合，其在暴露60分钟后升高(图14A)。然而，在曲妥珠单抗的存在下，NK92-CD64/16A细胞和SKOV-3的缀合大幅增强(图14A)。这种缀合的增强对应于更高水平的靶细胞杀伤。如图14B所示，NK92-CD64/16A细胞导致的SKOV-3细胞的细胞毒性根据曲妥珠单抗浓度和E:T比率而变化。为了确认CD64/16A在诱导靶细胞杀伤中的作用，在存在和不存在抗CD64mAb10.1(其阻断IgG结合)的情况下进行ADCC测定(图14C)。在ADCC期间还诱导了细胞因子产生，而NK细胞是IFNγ的主要产生者。与仅暴露于SKOV-3细胞相比，暴露于SKOV-3细胞和曲妥珠单抗的NK92-CD64/16A细胞产生显著更高水平的IFNγ(图14D)。综上所述，以上发现证明重组受体的CD64组分与肿瘤结合的抗体接合，并且CD16A组分促进导致脱颗粒和细胞因子产生的细胞内信号传导。
CD64通过其独特的第三细胞外结构域与其他FcγR成员区分开，该第三细胞外结构域有助于其高亲和性和稳定结合可溶性单体IgG。比较表达CD64/16A或CD16A-176V更高的亲和性变体的NK92细胞的捕获可溶性治疗性mAb的能力。检查的NK92细胞转导子表达类似水平的CD64/16A和CD16A(图15A)。将NK92细胞转导子与曲妥珠单抗一起温育2小时，洗涤掉多余的抗体，用荧光团缀合的抗人IgG抗体染色，并然后通过流式细胞术进行评价。如图15B所示，与NK92-CD16A细胞相比，NK92-CD64/16A细胞捕获显著更高水平的曲妥珠单抗(8.1倍增加±1.3，三个独立实验的平均值±SD)。此外，NK92-CD64/16A细胞有效地捕获肿瘤靶向mAb西妥昔单抗和利妥昔单抗，以及融合蛋白L-选择素/Fc(图15C)。
测试具有捕获的肿瘤靶向mAb的NK92-CD64/16A细胞，以确定该细胞是否介导ADCC。对于该测定，将相同数量的NK92-CD64/16A和NK92-CD16A细胞与相同浓度的可溶性曲妥珠单抗一起温育，洗涤并暴露于SKOV-3细胞。具有捕获的曲妥珠单抗的NK92-CD64/16A细胞的靶细胞杀伤力显著高于仅NK92-CD64/16A细胞的情况，并且在所检查的所有E:T比率下均优于用或不用曲妥珠单抗处理的NK92-CD16A细胞(图15D)。与之形成对比，在曲妥珠单抗存在并且未被洗涤掉的情况下，NK92-CD16A和NK92-CD64/16A细胞导致的SKOV-3细胞毒性没有显著不同(图15E)，从而表明了两个转导子的等效的细胞毒性。综上所述，这些发现表明表达CD64/16A的NK92细胞可以稳定地结合可溶性抗肿瘤mAb和IgG融合蛋白，并且它们可以作为靶向元件以杀伤肿瘤细胞。
CD64/16A在iPSC衍生的NK细胞中的表达和功能
使用用于非随机基因插入和稳定表达的Sleeping Beauty转座子质粒转导未分化的iPSC以表达CD64/16A。如实施例2中所述，将iPSC分化为造血细胞，并然后分化为iNK细胞。产生CD34+CD43+CD45+细胞，进一步分化成iNK细胞，并使用重组IL-2和aAPC扩增这些细胞用于分析。CD56+CD3-是人NK细胞的标志表型，并且这些细胞组成我们的分化细胞群体的大多数(图16)。活化性和抑制性受体在iNK细胞上的表达也进行了评估，并与由外周血NK细胞的表达进行了比较。某些受体，诸如CD16A，被两个NK细胞群体的相似比例表达。然而，扩增的iNK细胞缺乏抑制性KIR受体KIR2DL2/3、KIR2DL1和KIR3DL1以及某些活化性受体(NKp46和NKG2D)的表达(图16)。相比外周血NK细胞的另一个区别是，iNK细胞被抗CD64 mAb染色(图16)，证明了CD64/16A的表达。
为了评估CD64/16A在iNK细胞中的功能，对衍生自用PKT2空载体或pKT2-CD64/16A转导的iPSC的iNK细胞进行比较。两种iNK细胞群体以相似的水平和比例表达了上文提到的NK细胞标志物(数据未示出)，包括CD16A(图17A)，但只有iNK-CD64/16A细胞被抗CD64 mAb染色(图17A)。证明了两种iNK转导子在存在曲妥珠单抗时的SKOV-3细胞杀伤力均增加，但与iNK-pKT2对照细胞相比，iNK-CD64/16A细胞介导的ADCC水平显著更高(图17B)。抗CD16功能阻断性mAb 3G8有效地抑制了由iNK-pKT2细胞介导的ADCC(图17B)，但抗CD64 mAb 10.1没有。相反地，10.1阻断了由iNK-CD64/16A细胞介导的ADCC，但3G8不能(图17B)。这些发现表明，iNK细胞是响应于CD16A和CD64/16A与抗体结合的肿瘤细胞接合的细胞溶解效应物。
此外，用可溶性曲妥珠单抗处理iNK-CD64/16A和iNK-PKT2细胞，洗涤掉过量的抗体，并将细胞暴露于SKOV-3细胞。在这些条件下，与iNK-pKT2细胞相比，由iNK-CD64/16A细胞介导的ADCC惊人地更高(图17C)，还确立了CD64/16A可以捕获作为用于肿瘤细胞杀伤的靶向元件的可溶性抗肿瘤mAb。
综合来看，数据显示CD64/16A以比CD16A更高的亲和性结合治疗性mAb。而且，与分别表达野生型或内源性CD16A的NK92细胞和iNK细胞相比，在NK92细胞和iNK细胞中表达的CD64/16A赋予细胞介导更高水平的ADCC的能力。表达CD64/16A的NK细胞促进细胞与抗体结合的肿瘤细胞缀合、细胞毒性和IFNγ产生，证明了重组FcγR的两个组分的功能。表达CD64/16A的NK92细胞和iNK细胞可在其暴露于靶细胞之前预装载治疗性mAb。表达嵌合受体并预装载有治疗性抗体的细胞可以允许用靶向多种类型癌症的元件的不同治疗性mAb修饰工程化NK细胞。最后，CD64/16A缺乏存在于CD16A中的ADAM17切割区域，并且在ADCC期间其不经历相同水平的表达下调。
显示CD64/16A在两个NK细胞平台——NK92细胞系和衍生自iPSC的原代NK细胞——中起作用。与源自患者的其他NK细胞系相比，NK92细胞缺乏抑制性KIR受体，并表现出高水平的天然细胞毒性。NK92细胞已被广泛用于表达修饰的基因以指导其细胞溶解效应子功能，已经在临床前研究中进行了评价，并正在癌症患者中进行临床测试。iPSC也非常适合基因工程，并可以分化为表达各种受体的NK细胞，以指导其效应子功能。在这项研究中产生的iNK细胞缺乏几个作为不成熟状态的指标的抑制性和活化性受体。在一些应用中，缺乏抑制性受体和某些活化性受体的治疗性iNK细胞可通过工程化的受体允许更直接和/或更有效的肿瘤细胞杀伤。
iNK细胞表达内源性CD16A并介导ADCC，因此它们是细胞毒性效应细胞。单个NK细胞可以以不同方式杀伤多种肿瘤细胞。这包括通过称为连续杀伤的顺序的接触和脱粒过程，以及通过称为旁观者杀伤的杀伤周围肿瘤细胞的其颗粒内容物的局部化分散。已经报道抑制性CD16A脱落延缓了NK细胞与靶细胞的脱附并降低了体外NK细胞的连续杀伤。由于CD64组件及其缺乏胞外域脱落，表达CD64/16A的NK细胞可能在连续杀伤上效率较低，并且在旁观者杀伤上效率较高。
作为治疗剂与治疗性抗体组合的表达CD64/16A的NK细胞具有多个潜在优势。用抗体修饰表达CD64/16A的NK细胞可以减少向患者给药的治疗性抗体的剂量。包含人IgG Fc区域的融合蛋白，诸如L-选择素/FC，也可以被CD64/16A捕获并且这可以提供用于指导工程化的NK细胞的组织和肿瘤抗原靶向的其他选择。用于过继细胞疗法的NK92和iNK细胞平台也可以在克隆水平上容易地进行遗传修饰，并扩增到临床规模的细胞数量，以产生作为现成的癌症免疫疗法的治疗剂的具有改善的效应子活性的工程化NK细胞。
在一些实施方式中，表达CD64/16A的iPSC衍生的NK细胞可以在治疗性mAb的存在下表现出增加的体内抗癌活性。例如，可以将经稳定工程化以表达萤火虫荧光素酶的NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠和人癌细胞系用于生物发光成像，以测试iNK细胞针对癌细胞的活性。SKOV-3和MA148卵巢癌细胞系可作为模型体内靶标。可以对NSG雌性小鼠进行亚致死性照射，然后向其腹膜内注射肿瘤细胞以进行生物发光成像以量化肿瘤生长或消退。每隔一天向小鼠给予IL-2和/或IL-15，持续4周以促进NK细胞的体内存活。可以给药治疗性抗体(例如曲妥珠单抗)，例如每周一次，持续4周。可以通过例如生物发光成像和称重小鼠来监测肿瘤生长/消退。还可以将小鼠放血(例如每周一次)以定量人NK细胞存活性，并且可以通过FACS进一步评价各种效应子功能标志物的表达/细胞表面水平。转移的证据可以通过例如收获内部器官并检查内部器官的转移来确定。
在一些实施方式中，治疗组合物中的细胞数为每剂量至少0.1x105个细胞、至少1x105个细胞、至少5x105个细胞、至少1x106个细胞、至少5x106个细胞、至少1x107个细胞、至少5x107个细胞、至少1x 108个细胞、至少5x108个细胞、至少1x109个细胞或至少5x109个细胞。在一些实施方式中，治疗组合物中的细胞数为每剂量约0.1×105个细胞至约1×106个细胞；每剂量约0.5x106个细胞至约1x107个细胞；每剂量约0.5×107个细胞至约1×108个细胞；每剂量约0.5×108个细胞至约1×109个细胞；每剂量约1x109个细胞至约5x109个细胞；每剂量约0.5×109个细胞至约8×109个细胞；每剂量约3x109个细胞至约3x1010个细胞，或之间的任何范围。通常，对于60kg的患者，1x108个细胞/剂量可转换为1.67x106个细胞/kg。
在一种实施方式中，治疗组合物中的细胞数是部分或单脐带血液中的免疫细胞数，或者是至少0.1x105个细胞/kg体重、至少0.5x105个细胞/kg体重、至少1x105个细胞/kg体重、至少5x105个细胞/kg体重、至少10x105个细胞/kg体重、至少0.75x106个细胞/kg体重、至少1.25x106个细胞/kg体重、至少1.5x106个细胞/kg体重、至少1.75x106个细胞/kg体重、至少2x106个细胞/kg体重、至少2.5x106个细胞/kg体重、至少3x106个细胞/kg体重、至少4x106个细胞/kg体重、至少5x106个细胞/kg体重、至少10x106个细胞/kg体重、至少15x106个细胞/kg体重、至少20x106个细胞/kg体重、至少25x106个细胞/kg体重、至少30x106个细胞/kg体重、1x108个细胞/kg体重、5x108个细胞/kg体重或1x109个细胞/kg体重。
在一种实施方式中，将一剂量的细胞递送至受试者。在一种说明性实施方式中，提供给受试者的细胞的有效量为至少2×106个细胞/kg、至少3×106个细胞/kg、至少4×106个细胞/kg、至少5×106个细胞/kg、至少6x106个细胞/kg、至少7x106个细胞/kg、至少8x106个细胞/kg、至少9x106个细胞/kg或至少10x106个细胞/kg或更多细胞/kg，包括所有介于中间的剂量的细胞。
在另一种说明性实施方式中，提供给受试者的细胞的有效量为约2×106个细胞/kg、约3×106个细胞/kg、约4×106个细胞/kg、约5×106个细胞/kg、约6x106个细胞/kg、约7x106个细胞/kg、约8x106个细胞/kg、约9x106个细胞/kg或约10x106个细胞/kg或更多细胞/kg，包括所有介于中间的剂量的细胞。
在另一种说明性实施方式中，提供给受试者的细胞的有效量为约2x106个细胞/kg至约10x106个细胞/kg、约3x106个细胞/kg至约10x106个细胞/kg、约4x106个细胞/kg至约10x106个细胞/kg、约5x106个细胞/kg至约10x106个细胞/kg、2x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg、2x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg、2x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg、3x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg、4x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg、4x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg、4x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg、5x106个细胞/kg至约6x106个细胞/kg、5x106个细胞/kg至约7x106个细胞/kg、5x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg或6x106个细胞/kg至约8x106个细胞/kg，包括所有介于中间的剂量的细胞。
根据待治疗的受试者的病症，必然会发生剂量的某些变化。在任何情况下，负责给药的人员将确定适用于个体受试者的适当剂量。
在一些实施方式中，细胞的治疗性用途是单剂量治疗。在一些实施方式中，衍生的造血谱系细胞的治疗性用途是多剂量治疗。在一些实施方式中，多剂量治疗是每天一个剂量、每3天一个剂量、每7天一个剂量、每10天一个剂量、每15天一个剂量、每20天一个剂量、每25天一个剂量、每30天一个剂量、每35天一个剂量、每40天一个剂量、每45天一个剂量或每50天一个剂量或介于之间的任何天数一个剂量。
包括本文所述的细胞群体的组合物可以是无菌的，并且可以适合并准备好向人类患者给药(即，可以不进行任何进一步处理而给药)。准备好给药的基于细胞的组合物是指该组合物在移植或给药至受试者之前不需要任何进一步的处理或操作。在一些实施方式中，这样的细胞群体可以包括分离的细胞群体，其在给药之前用一种或多种试剂扩增和/或调节。
在某些实施方式中，可以通过不同的方案提供治疗性细胞的初级刺激信号和共刺激信号。例如，提供每个信号的试剂可以是在溶液中或偶联至表面。当偶联至表面时，试剂可以偶联至相同的表面(即，以“顺式”形式)或偶联至分开的表面(即，以“反式”形式)。替代地，可以将一种试剂偶联至表面，而另一种试剂在溶液中。在一种实施方式中，提供共刺激信号的试剂可以结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂是在溶液中或偶联至表面。在某些实施方式中，两种试剂都可以在溶液中。在另一种实施方式中，试剂可以是可溶的形式，并然后交联至表面，诸如表达Fc受体的细胞或将与试剂结合的抗体或其他结合剂，诸如美国专利申请公开No.20040101519和20060034810中所公开的人工抗原呈递细胞(aAPC)，其被设计用于活化和扩增T淋巴细胞。
适用于向患者给药的治疗组合物可以包括一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂(例如药学上可接受的培养基，例如细胞培养基)或其他药学上可接受的组分。药学上可接受的载体和/或稀释剂部分地取决于被给药的特定组合物以及用于给药治疗组合物的特定方法。因此，治疗组合物有多种合适的制剂(参见，例如《雷明登氏药学全书(Remington's Pharmaceutical Sciences)》，第17版1985年，其公开内容通过引用整体并入本文)被本领域技术人员众所周知。
在特定的实施方式中，具有如本文所述分离的细胞群体的治疗性细胞组合物还具有药学上可接受的细胞培养基，或药学上可接受的载体和/或稀释剂。可以通过静脉内、腹膜内、肠内或气管内给药方法分别给药包含本文公开的细胞群体的治疗组合物，或者与其他合适的化合物组合给药以达到期望的治疗目的。
这些药学上可接受的载体和/或稀释剂可以以足以将治疗组合物的pH维持在约3至约10之间的量存在。这样，缓冲剂可以占总组合物的按重量计约5％那么多。电解质(诸如但不限于氯化钠和氯化钾)也可以包括在治疗组合物中。一方面，治疗组合物的pH在约4至约10的范围内。替代地，治疗组合物的pH在约5至约9、约6至约9或约6.5至约8的范围内。在另一种实施方式中，治疗组合物包括具有的pH在所述pH范围之一中的缓冲液。在另一种实施方式中，治疗组合物的pH为约7。替代地，治疗组合物的pH在约6.8至约7.4的范围内。在又一种实施方式中，治疗组合物的pH为约7.4。
本公开还提供了药学上可接受的细胞培养基在本文所述的细胞的特定组合物和/或培养物中的用途。这样的组合物适合于向人类受试者给药。一般而言，支持iPSC衍生的免疫细胞的维持、生长和/或健康的任何培养基都适合用作药物细胞培养基。在特定的实施方式中，药学上可接受的细胞培养基是无血清和/或无饲养层的培养基。在各种实施方式中，无血清培养基是无动物成分的，并且可以任选地是无蛋白质的。任选地，培养基可以包含生物药学上可接受的重组蛋白。无动物成分的培养基是指其中成分源自非动物来源的培养基。重组蛋白代替了无动物成分培养基中的天然动物蛋白，并且营养成分获得自合成、植物或微生物来源。与之形成对比，无蛋白质培养基被定义为基本上不含蛋白质。本领域普通技术人员将理解，上述培养基的实例是说明性的且绝不限制合适培养基的制剂，并且存在本领域技术人员已知和可获得的许多替代的合适培养基。
在前面的描述和所附的权利要求书中，术语“和/或”是指所列要素中的一个或全部，或所列要素中任何两个或多个的组合；术语“包括”、“包含”及其变体应被解释为开放式的，即，另外的要素或步骤是可选的，且可能存在也可能不存在；除非另有说明，否则“一个”、“一种”，“该”和“至少一个”可互换使用，且表示一个或多于一个；并且通过端点对数值范围的引用包括该范围内的所有数字(例如，1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
在前面的描述中，为了清楚起见，可以独立地描述特定实施方式。除非另外明确指出特定实施方式的特征与另一实施方式的特征不兼容，否则某些实施方式可以包括与一个或多个实施方式有关的本文所述的兼容特征的组合。
对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进行。并且，适当地，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
通过以下实施例说明本发明。应该理解的是，具体的实例、材料、数量和程序将根据本文所述的本发明的范围和精神来广义地解释。
实施例
实施例1
人CD64/16A表达构建体的产生
使用TRIzol总RNA分离试剂(Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA)从外周血白细胞(PBL)中分离总RNA。人PBL cDNA用SuperScript预扩增系统(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Carlsbad,CA)合成。CD64/16A包括人CD64细胞外结构域(CD64-EC)和CD16A跨膜和细胞质结构域(CD16A-TM-CY)。通过重叠PCR产生嵌合构建体以生成嵌合cDNA的EcoR I侧翼的RT-PCR产物。使用正向引物5’-CGG GAA TTC GGA GACAAC ATG TGG TTC TTG ACA A-3’(SEQ ID NO：28)和反向引物5’-TTG GTA CCC AGG TGGAAA GAA GCC AAG CAC TTG AAG CTC CAA-3’；SEQ ID NO：29)从人PBL cDNA扩增CD64-ECcDNA片段(885bps)。使用正向引物5’-TTG GAG CTT CAA GTG CTT GGC TTC TTT CCA CCTGGG TAC CAA-3’(SEQ ID NO：30)和反向引物5’-CCG GAA TTC TCA TTT GTC TTG AGG GTCCTT TCT-3’(SEQ ID NO：31)从人PBL cDNA扩增CD16A-TM-CY cDNA片段(195bps)。用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化CD64-EC cDNA和CD16A-TM-CY cDNA的PCR片段，并与正向引物5’-CGG GAA TTC GGA GAC AAC ATG TGG TTC TTG ACA A-3’(SEQID NO：32)和反向引物5’-CCG GAA TTC TCA TTT GTC TTG AGG GTC CTT TCT-3’(SEQ IDNO：33)一起混合。对于上面列出的所有引物，带下划线的核苷酸是EcoR I切割位点，以产生嵌合受体的RT-PCR产物。用Pfx50 DNA聚合酶(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Carlsbad,CA)进行RT-PCR。将所得的CD64/CD16a cDNA插入逆转录病毒表达载体pBMN-IRES-EGFP(Addgene,Cambridge,MA)和pKT2Sleeping Beauty转座子载体(Jing等人，2015年.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10:e0121788；Hermanson等人，2016.《干细胞(Stem Cells)》34：93-101)。通过使用ABI BigDye终止子循环测序试剂盒(AppliedBiosystems,Thermo Fisher Scientific,Foster City,CA)在ABI 377测序仪上从两个方向进行直接测序来确认所有克隆的构建体的序列。
CD64/16A在NK细胞中的稳定表达
使用先前描述的逆转录病毒感染程序，用包含CD64/16A或野生型CD16AcDNA的pBMN-IRES-EGFP逆转录病毒表达构建体稳定地转导NK92细胞(一种缺乏内源性CD16A表达的人NK细胞系)(Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10：e0121788)。如前所述，使用Sleeping Beauty转座子系统用CD64/16A-pKT2表达构建体稳定地转导人iPSC(UCBiPS7，源自脐带血CD34细胞)(Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10：e0121788)。如前所述，转导的iPSC细胞分化为造血细胞，然后为成熟NK细胞(Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10：e0121788)。使用流式细胞术分析确定eGFP荧光和CD64、CD16和各种NK细胞表型标志物的表面表达。
实施例2
抗体
表2中描述了针对人类造血和白细胞表型标志物的所有mAb。所有同种型匹配的阴性对照mAb均购自BioLegend(San Diego,CA)。APC缀合的F(ab')2驴抗人或山羊抗小鼠IgG(H+L)购自Jackson免疫研究实验室(West Grove,PA)。通过明尼苏达Boynton Pharmacy大学购买了由Genentech(South San Francisco,CA)生产的人IgG1 mAb曲妥珠单抗/赫赛汀和利妥昔单抗/美罗华(Rituxan)，以及由Bristol-Myers Squibb(Lawrence,NJ)生产的西妥昔单抗/爱必妥(Erbitux)。重组人L-选择素/IgG1 Fc嵌合体购自R&D Systems(Minneapolis,MN)。
表2.抗体
<u>抗原</u> <u>克隆</u> <u>荧光团</u> <u>公司</u>
CD56 HCD56 PE-CY7 BioLegend,San Diego,CA
CD3 HIT3a PE BioLegend
CD16 3G8 APC BioLegend
CD16 3G8 无 Ancell,Bayport,MN
CD7 CD7-6B7 PE/CY5 BioLegend
CD336/NKp44 P44-8 APC BioLegend
CD335/NKp46 9E2 APC BioLegend
CD159a/NKG2A Z199 APC Beckman Coulter,Brea,CA
CD314/NKG2D 1D11 PerCP/Cy5.5 BioLegend
CD158a/KIR2DL1 HP-MA4 PE BioLegend
CD158b1/KIR2DL2/L3 DX27 PE BioLegend
CD158e1/KIR3DL1 DX9 PE BioLegend
CD94 DX22 PE BioLegend
CD64 10.1 APC BioLegend
CD64 10.1 无 Ancell
CD34 561 PE BioLegend
CD45 2D1 APC BioLegend
CD43 CD43-10G7 APC BioLegend
CD62L/L-选择素 LAM1-116 APC Ancell
人CD64/16A的产生
使用TRIzol总RNA分离试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)从人外周血白细胞分离总RNA，并用SuperScript预扩增系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)合成cDNA。重组CD64/16A由人CD64细胞外结构域和CD16A跨膜及细胞质结构域组成。从产生的cDNA中扩增CD64(885bps)和CD16A(195bps)的PCR片段。将PCR片段纯化，并与正向引物5’-CGG GAA TTC GGAGAC AAC ATG TGG TTC TTG ACA A-3’(SEQ ID NO：28)、反向引物5’-CCG GAA TTC TCA TTTGTC TTG AGG GTC CTT TCT-3’(SEQ ID NO：31)和Pfx50 DNA聚合酶(Invitrogen)一起混合，以产生重组CD64/16A受体。对于两种引物，带下划线的核苷酸是EcoR I位点。将CD64/CD16A和CD16A cDNA(CD16A-176V变体)插入逆转录病毒表达载体PBMN-IRES-EGFP，并且产生病毒用于NK92细胞转导，如先前所述(Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoSOne)》10(3)：e0121788)。此外，将CD64/CD16A cDNA插入pKT2 sleeping beauty转座子载体，并与SB100X转座酶一起用于iPSC转导，如先前所述(Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10(3)：e0121788)。通过使用ABI BigDye终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)在ABI 377测序仪上从两个方向进行直接测序来确认所有构建体的核苷酸序列。
细胞
这项研究是依照明尼苏达大学的机构审查委员会(Institutional ReviewBoard)并经其批准进行的。根据《赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)》，所有受试者均签署了知情同意书。来自血小板分离的新鲜人外周血白细胞获得自Innovative BloodResources(St.Paul，MN)。使用Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，瑞典)进一步富集外周血单核细胞，并使用EasySep人NK细胞试剂盒(StemCellTechnologies，Cambridge，MA)通过阴性消耗纯化NK细胞，根据制造商的说明，CD56+CD3-淋巴细胞生存力>95％以及富集90-95％。使用Countess II自动细胞计数器(LifeTechnologies Corporation,Bothell,WA)进行活细胞计数。人NK细胞系NK92和卵巢癌细胞系SKOV-3获得自ATCC(Manassas,VA)，并按照制造商的说明进行培养。NK92细胞需要IL-2用于生长(500IU/ml)，其是从R&D Systems(Minneapolis,MN)获得的。对于以下所述的所有测定，使用在对数生长期时的细胞。
衍生自脐带血CD34细胞的iPSC UCBiPS7先前已经过表征，并且培养和分化为造血祖细胞，如所述进行了一些修改(Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10：e0121788；Ni等人，2013.《分子生物学方法(Methods in molecular biology)》1029:33-41；Knorr等人，2013年.《干细胞转化医学(Stem Cells Transl Med)》2(4):274-283；Ni等人，2014.《干细胞(Stem Cells)》32(4)：1021-1031；Hermanson等人，2016年.《干细胞(StemCells)》34(1)：93-101)。使用TeSR-E8培养基和STEMdiff造血试剂盒(StemCellTechnologies，Cambridge，MA)进行iPSC培养和造血分化，其不需要使用小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞、TrypLE适应、自旋胚状体形成或CD34+细胞富集。将传代过程中的iPSC细胞用Gentle Cell Dissociation试剂(StemCell Technologies，Cambridge，MA)解离，并用血细胞计数器对直径≥50μm的iPSC聚集体进行计数，并用TeSR-E8培养基稀释至20-40个聚集体/ml。在12孔板的每个孔中预涂覆Matrigel基质(Corning Inc.,Tewksbury,MA)，并在2ml的TeSR-E8培养基中接种40-80个聚集体。根据制造商的说明，在用STEMdiff造血试剂盒(StemCell Technologies，Cambridge，MA)分化之前，将细胞聚集体培养24小时。在造血祖细胞分化的第12天，使用流式细胞术分析用抗CD34、抗CD45和抗CD43 mAb来确定造血祖细胞的百分比。进行NK细胞分化，如先前所述(Woll等人，2009.《血液(blood)》113(24)：6094-6101)。将衍生自iPSC的NK细胞(这里称为iNK细胞)使用γ照射的K562-mbIL21-41BBL饲养层细胞(1:2比率)在细胞扩增培养基[60％DMEM、30％Ham’s F12、10％人AB血清(ValleyBiomedical,Winchester,VA)、20μM 2-巯基乙醇、50μM乙醇胺、20μg/ml抗坏血酸、5ng/ml亚硒酸钠、10mM HEPES和100-250IU/ml IL-2(R&D Systems)]中扩增以用于检查，如前所述(Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10：e0121788；Knorr等人，2013年.《干细胞转化医学(Stem Cells Transl Med)》2(4):274-283；Ni等人，2014.《干细胞(StemCells)》32(4)：1021-1031；Hermanson等人，2016年.《干细胞(Stem Cells)》34(1):93-101)。
细胞染色、流式细胞术和ELISA
对于细胞染色，将非特异性抗体结合位点封闭，并将细胞用所示抗体染色并通过流式细胞术检查，如前所述(Romee等人，2013年.《血液(Blood)》121(18)：3599-3608；Jing等人，2015.《公共科学图书馆·综合(PLoS One)》10：e0121788；Mishra等人，2018.《癌症免疫学与免疫疗法(Cancer Immunol.Immunother)》67(9)：1407-1416)。对于对照，由于目的细胞表达FcR，因此使用荧光减一以及合适的同种型匹配抗体。FSC-A/SSC-A图用于在白细胞群体上设置电子门，而FSC-A/FSC-H图用于在单细胞上设置电子门。根据制造商的说明(BioLegend,San Diego,CA)，使用僵尸生存力试剂盒(Zombie viability kit)评估活细胞与死细胞。
为了评估可溶性曲妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗或L-选择素/Fc嵌合体的捕获，将转导的NK细胞与5μg/ml抗体在37℃下在补充有IL-2(200IU/ml)、HEPES(10mM)和2-巯基乙醇(0.1mM)的MEM-α基础培养基(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)中一起温育2小时，用MEM-α基础培养基洗涤，然后在冰上用1:200稀释的APC缀合F(ab')2驴抗人IgG(H+L)染色30分钟。为了检测重组人L-选择素/Fc结合，用抗L-选择素mAb APC缀合的Lam1-116染色细胞。
为了比较CD16A、CD64和CD64/16A在NK92细胞上的染色水平，将相应转导子用饱和浓度的未缀合的抗CD16(3G8)或抗CD64(10.1)mAb(5μg/ml)染色，用包含2％山羊血清和2mM叠氮化钠的dPBS(USB Corporation，Cleveland，OH)充分洗涤，并然后用APC缀合的F(ab')2山羊抗小鼠IgG(H+L)染色。之所以使用这种方法，是因为直接缀合的抗CD16和抗CD64 mAb的荧光团标记水平可能有所不同。根据制造商的说明，通过针对人IFNγ的基于细胞计数珠的Flex Set测定法进行ELISA(BD Biosciences,San Jose,CA)。所有流式细胞术分析均在FACSCelesta仪器(BD Biosciences)上进行。使用FACSDIVAv8(BD Biosciences)和FlowJov10(Ashland，OR)分析数据。
细胞-细胞缀合测定和ADCC
NK92细胞中用于表达CD64/16A的pBMN-IRES-EGFP载体也表达eGFP。将这些细胞在补充有IL-2(200IU/ml)、HEPES(10mM)和2-巯基乙醇(0.1mM)的MEM-α基础培养基(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA)中在37℃下温育2小时。按照制造商的说明，将SKOV-3细胞用CellTrace Violet(Molecular Probes，Eugene，OR)标记，与5μg/ml曲妥珠单抗一起温育30分钟，并用MEM-α基础培养基洗涤。然后将NK92细胞和SKOV-3细胞分别以1×106和2×106/ml重悬于补充的MEM-α基础培养基中。对于1:2E:T比率，将100μl的每种细胞类型混合在一起，以20×g离心1分钟，并在37℃下温育指定的时间点。在每个时间点之后，将细胞轻轻涡旋三秒钟，然后立即用4℃的dPBS中的1％多聚甲醛固定。立即通过流式细胞术分析样品。通过在eGFP和CellTrace Violet双阳性事件上进行门控来计算缀合的NK细胞的百分比。
为了评价ADCC，根据制造商的说明(PerkinElmer，Waltham，MA)使用基于DELFIAEuTDA的细胞毒性测定法。简而言之，将靶细胞在其培养基中用双(乙酰氧基甲基)-2-2:6,2三联吡啶6,6二羧酸酯(BATDA)标记30分钟，在培养基中洗涤，然后以8×104个细胞/孔的密度移液到96孔非组织培养物处理过的U型底板中。以指定的5μg/mL浓度添加肿瘤靶向mAb，并以指定的效应子:靶标(E:T)比率添加NK细胞。将板以400×g离心1分钟，并然后在37℃下在湿润的5％CO2气氛中温育2小时。温育结束时，将板以500xg离心5分钟，然后将上清液转移至96孔DELFIA黄色板(PerkinElmer,Waltham,MA)中，并与铕组合。使用BMGLabtech CLARIOstar读板仪(Cary，NC)通过时间分辨荧光法测量荧光。在有或没有治疗性抗体的情况下培养单独的BATDA标记的靶细胞以评估自发裂解，并在2％Triton-X的存在下测量最大裂解。使用以下公式计算每个样品的ADCC水平：特定释放百分比＝(实验释放计数－自发释放计数)/(最大释放－自发释放计数)×100％。对于每个实验，使用三个重复孔一式三份进行测量。
统计分析
使用GraphPad Prism(GraphPad软件，La Jolla，CA，美国)进行统计分析。在评估近似正态分布后，将所有变量汇总为平均值±SD。两组之间的比较采用Student's t检验进行，将p<0.05视为有统计学意义。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物以及可通过电子方式获得的材料的完整公开(包括，举例来说，例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，以及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB以及来自GenBank和RefSeq中带注释的编码区的翻译中的氨基酸序列提交)均通过引用整体并入本文。在本申请的公开与通过引用并入本文的任何文件的公开之间存在任何不一致的情况下，以本申请的公开为准。仅出于清楚理解的目的给出了以上具体实施方式和实施例。由此没有不必要的限制。本发明不限于所示出和描述的确切细节，对于本领域技术人员显而易见的变体将包括在由权利要求书限定的本发明之内。
除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示组分的量、分子量等的所有数字均应理解为在所有情况下均被术语“约”修饰。因此，除非另有相反指示，否则说明书和权利要求书中列出的数字参数是近似值，其可以根据本发明试图获得的所需特性而变化。至少，且并非试图将等同原则限制在权利要求的范围之内，每个数字参数至少应根据所报告的有效数字的数目并通过应用普通的舍入技术来解释。
尽管阐述本发明的广泛范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值被尽可能精确地报道。但是，所有数值固有地都包含由它们各自的测试测量值中存在的标准偏差必然导致的范围。
所有标题都是为了方便读者阅读，且除非另有说明，否则不应将其用于限制标题下的文字的含义。
序列表独立文本
rCD64#1(pCDH-CD64)肽序列(SEQ ID NO：9)
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rCD64#2(pCDH-mutCD64)肽序列(SEQ ID NO：10)
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rCD64#9(pCDH-CD64-FceR)肽序列(SEQ ID NO：17)
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rCD64#10(pCDH-CD64/16-PKC-)肽序列(SEQ ID NO：18)
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rCD64#11(pCDH-CD64-G2D-2B4-Z)肽序列(SEQ ID NO：19)
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rCD64#12(pCDH-CD64/16-2B4-Z)肽序列(SEQ ID NO：20)
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rCD64#13(pCDH-CD64/16-2B4-G)肽序列(SEQ ID NO：21)
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rCD64#14(pCDH-CD64/16-2B4-D10)肽序列(SEQ ID NO：22)
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rCD64#15(pCDH-CD64/16-2B4-D12)肽序列(SEQ ID NO：23)
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rCD64#16(pCDH-CD64-64-2B4-Z)肽序列(SEQ ID NO：24)
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犬CD16#17(pCDH-caCD16)肽序列(SEQ ID NO：25)
MWQLVSSTAL LLLVSAGTQA DVPKAVVVLE PKWNRVLTMD SVTLKCQGDHLLRDNYTWLHNGRPISNQIS TYIIKNASIK NSGEYRCQTD QSKLSDPVQL EVHTGWLLLQVPRLVFQEGELIQLKCHSWK NTPVRNVQYF QNGRGKKFFY NNSEYHIPAA TSEHNGSYFCRGIIGKKNESSEAVNIIIQG SSLPSTSLLL SHWPQIPFSL VMALLFAVDT GLYFAVQRDLRSSMGNLKNSKVIWSQGS
犬CD64#18(pCDH-caCD64)肽序列(SEQ ID NO：26)
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犬CD64sp#19(pCDH-caCD64sp)肽序列(SEQ ID NO：27)
MWLLTVLLLW VPAGAQTDWL ILQVSGRVFT EGEPLTLRCH GWNNKLVYNVLFYQNGTVLKFSPQNSEFTI LKTTLHHNGI YHCSAMGKHR YESAGVSITI KELFPAPVLKASLSSPILEGHVVNLSCETK LLLQRPGLQL YFSFYMGSKT LLSRNTSSEY QILTAKKEDSGLYWCEATTEDGNVVKRSPE LELQVVGPQT LTPVWFHVLF YVAMGMIFLV DTIFCMIIHKELQRKKKWNLEISLYSGLEK RVDSYLQKER DLEEPKYQEL EQLQEKTPQK PPEGEQQ。
序列表
<110> 明尼苏达大学董事会（REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTA）
<120> 重组免疫细胞、制备方法和使用方法
<130> PPI20009936US
<150> 62/577,425
<151> 2017-10-26
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 1
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Ser Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Phe Phe Pro Pro Gly Tyr
275 280 285
Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr
290 295 300
Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
305 310 315 320
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
325 330 335
<210> 2
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 2
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Ser Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290 295 300
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305 310 315 320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
325 330 335
Val Thr Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340 345 350
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355 360 365
Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
<210> 3
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 3
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
85 90 95
Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln
100 105 110
Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys
115 120 125
His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn
130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Arg Ser
245 250 255
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
260 265 270
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
275 280 285
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
290 295 300
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
325 330 335
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
340 345 350
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
355 360 365
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
370 375 380
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
385 390 395 400
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
420 425 430
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
435 440 445
Arg
<210> 4
<211> 408
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 4
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln
35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe
165 170 175
Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
180 185 190
Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Lys Arg
245 250 255
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
260 265 270
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
275 280 285
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
290 295 300
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
305 310 315 320
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
325 330 335
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
340 345 350
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
355 360 365
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
370 375 380
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
385 390 395 400
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
405
<210> 5
<211> 248
<212> PRT
<213> 犬（Canis lupus familiaris）
<400> 5
Met Trp Gln Leu Val Ser Ser Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Thr Gln Ala Asp Val Pro Lys Ala Val Val Val Leu Glu Pro Lys
20 25 30
Trp Asn Arg Val Leu Thr Met Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly
35 40 45
Asp His Leu Leu Arg Asp Asn Tyr Thr Trp Leu His Asn Gly Arg Pro
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Ile Ser Asn Gln Ile Ser Thr Tyr Ile Ile Lys Asn Ala Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asn Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asp Gln Ser Lys Leu Ser Asp
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Arg Leu Val Phe Gln Glu Gly Glu Leu Ile Gln Leu Lys Cys His Ser
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Trp Lys Asn Thr Pro Val Arg Asn Val Gln Tyr Phe Gln Asn Gly Arg
130 135 140
Gly Lys Lys Phe Phe Tyr Asn Asn Ser Glu Tyr His Ile Pro Ala Ala
145 150 155 160
Thr Ser Glu His Asn Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Ile Ile Gly Lys
165 170 175
Lys Asn Glu Ser Ser Glu Ala Val Asn Ile Ile Ile Gln Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Pro Ser Thr Ser Leu Leu Leu Ser His Trp Pro Gln Ile Pro Phe
195 200 205
Ser Leu Val Met Ala Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe
210 215 220
Ala Val Gln Arg Asp Leu Arg Ser Ser Met Gly Asn Leu Lys Asn Ser
225 230 235 240
Lys Val Ile Trp Ser Gln Gly Ser
245
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<211> 254
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro
20 25 30
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35 40 45
Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu
50 55 60
Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr
65 70 75 80
Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu
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115 120 125
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Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln
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Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln
195 200 205
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210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp
225 230 235 240
Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
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<212> PRT
<213> 犬（Canis lupus familiaris）
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100 105 110
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Asn Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Phe Tyr Gln Asn Gly Thr Val Leu
130 135 140
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Glu Ser Ala Gly Val Ser Ile Thr Ile Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
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Val Leu Lys Ala Ser Leu Ser Ser Pro Ile Leu Glu Gly His Val Val
195 200 205
Asn Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Leu Ser Arg Asn
225 230 235 240
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290 295 300
Val Asp Thr Ile Phe Cys Met Ile Ile His Lys Glu Leu Gln Arg Lys
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Val Asp Ser Tyr Leu Gln Lys Glu Arg Asp Leu Glu Glu Pro Lys Tyr
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Gln Glu Leu Glu Gln Leu Gln Glu Lys Thr Pro Gln Lys Pro Pro Glu
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Gly Glu Gln Gln
370
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<211> 374
<212> PRT
<213> 智人
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20 25 30
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100 105 110
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Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
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225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
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Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
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<211> 374
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
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275 280 285
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Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
<210> 10
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 10
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
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Glu Pro Gln Gly Ala Thr
370
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 11
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
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Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
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275 280 285
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<213> 人工
<220>
<223> 多肽
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 13
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 14
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
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290 295 300
Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
305 310 315 320
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Trp
325 330 335
Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe
340 345 350
Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His
355 360 365
Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met
370 375 380
Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg
405 410 415
Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys
420 425 430
Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu
435 440 445
Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala
450 455 460
Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn
465 470 475 480
Met Pro Gly Arg Gly
485
<210> 23
<211> 512
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 23
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Phe Phe Pro Pro Gly Tyr
275 280 285
Gln Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr
290 295 300
Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
305 310 315 320
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Trp
325 330 335
Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe
340 345 350
Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His
355 360 365
Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met
370 375 380
Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg
405 410 415
Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys
420 425 430
Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu
435 440 445
Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
450 455 460
Arg Leu Val Pro Arg Gly Arg Gly Ala Ala Glu Ala Ala Thr Arg Lys
465 470 475 480
Gln Arg Ile Thr Glu Thr Glu Ser Pro Tyr Gln Glu Leu Gln Gly Gln
485 490 495
Arg Ser Asp Val Tyr Ser Asp Leu Asn Thr Gln Arg Pro Tyr Tyr Lys
500 505 510
<210> 24
<211> 615
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 多肽
<400> 24
Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys
115 120 125
Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe
130 135 140
Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile
145 150 155 160
Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val
195 200 205
Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu
290 295 300
Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys
305 310 315 320
Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys
325 330 335
Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys
340 345 350
Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys
355 360 365
Glu Pro Gln Gly Ala Thr Gly Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln
370 375 380
Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys
385 390 395 400
Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly
405 410 415
Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro
420 425 430
Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser
435 440 445
Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser
450 455 460
Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro
465 470 475 480
Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Gly
485 490 495
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
500 505 510
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
515 520 525
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
530 535 540
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
545 550 555 560
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
565 570 575
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
580 585 590
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
595 600 605
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
610 615
<210> 25
<211> 248
<212> PRT
<213> 犬（Canis lupus familiaris）
<400> 25
Met Trp Gln Leu Val Ser Ser Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala
1 5 10 15
Gly Thr Gln Ala Asp Val Pro Lys Ala Val Val Val Leu Glu Pro Lys
20 25 30
Trp Asn Arg Val Leu Thr Met Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln Gly
35 40 45
Asp His Leu Leu Arg Asp Asn Tyr Thr Trp Leu His Asn Gly Arg Pro
50 55 60
Ile Ser Asn Gln Ile Ser Thr Tyr Ile Ile Lys Asn Ala Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asn Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asp Gln Ser Lys Leu Ser Asp
85 90 95
Pro Val Gln Leu Glu Val His Thr Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Pro
100 105 110
Arg Leu Val Phe Gln Glu Gly Glu Leu Ile Gln Leu Lys Cys His Ser
115 120 125
Trp Lys Asn Thr Pro Val Arg Asn Val Gln Tyr Phe Gln Asn Gly Arg
130 135 140
Gly Lys Lys Phe Phe Tyr Asn Asn Ser Glu Tyr His Ile Pro Ala Ala
145 150 155 160
Thr Ser Glu His Asn Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Ile Ile Gly Lys
165 170 175
Lys Asn Glu Ser Ser Glu Ala Val Asn Ile Ile Ile Gln Gly Ser Ser
180 185 190
Leu Pro Ser Thr Ser Leu Leu Leu Ser His Trp Pro Gln Ile Pro Phe
195 200 205
Ser Leu Val Met Ala Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe
210 215 220
Ala Val Gln Arg Asp Leu Arg Ser Ser Met Gly Asn Leu Lys Asn Ser
225 230 235 240
Lys Val Ile Trp Ser Gln Gly Ser
245
<210> 26
<211> 372
<212> PRT
<213> 犬（Canis lupus familiaris）
<400> 26
Met Trp Leu Leu Thr Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala Gly Ala Gln
1 5 10 15
Thr Asp Pro Val Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser
20 25 30
Val Phe Gln Glu Glu Ser Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu
35 40 45
Pro Gly Asp Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln
50 55 60
Thr Leu Thr Pro Arg Tyr Arg Ile Ala Ala Ala Ser Val Asn Asp Asn
65 70 75 80
Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Gly Leu Ser Val Leu Ser Asp Pro Ile
85 90 95
Gln Leu Gly Ile His Arg Asp Trp Leu Ile Leu Gln Val Ser Gly Arg
100 105 110
Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Thr Leu Arg Cys His Gly Trp Asn
115 120 125
Asn Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Phe Tyr Gln Asn Gly Thr Val Leu
130 135 140
Lys Phe Ser Pro Gln Asn Ser Glu Phe Thr Ile Leu Lys Thr Thr Leu
145 150 155 160
His His Asn Gly Ile Tyr His Cys Ser Ala Met Gly Lys His Arg Tyr
165 170 175
Glu Ser Ala Gly Val Ser Ile Thr Ile Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro
180 185 190
Val Leu Lys Ala Ser Leu Ser Ser Pro Ile Leu Glu Gly His Val Val
195 200 205
Asn Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln
210 215 220
Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Leu Ser Arg Asn
225 230 235 240
Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Lys Lys Glu Asp Ser Gly
245 250 255
Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Thr Thr Glu Asp Gly Asn Val Val Lys Arg
260 265 270
Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Val Gly Pro Gln Thr Leu Thr Pro
275 280 285
Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Val Ala Met Gly Met Ile Phe Leu
290 295 300
Val Asp Thr Ile Phe Cys Met Ile Ile His Lys Glu Leu Gln Arg Lys
305 310 315 320
Lys Lys Trp Asn Leu Glu Ile Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Glu Lys Arg
325 330 335
Val Asp Ser Tyr Leu Gln Lys Glu Arg Asp Leu Glu Glu Pro Lys Tyr
340 345 350
Gln Glu Leu Glu Gln Leu Gln Glu Lys Thr Pro Gln Lys Pro Pro Glu
355 360 365
Gly Glu Gln Gln
370
<210> 27
<211> 287
<212> PRT
<213> 犬（Canis lupus familiaris）
<400> 27
Met Trp Leu Leu Thr Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala Gly Ala Gln
1 5 10 15
Thr Asp Trp Leu Ile Leu Gln Val Ser Gly Arg Val Phe Thr Glu Gly
20 25 30
Glu Pro Leu Thr Leu Arg Cys His Gly Trp Asn Asn Lys Leu Val Tyr
35 40 45
Asn Val Leu Phe Tyr Gln Asn Gly Thr Val Leu Lys Phe Ser Pro Gln
50 55 60
Asn Ser Glu Phe Thr Ile Leu Lys Thr Thr Leu His His Asn Gly Ile
65 70 75 80
Tyr His Cys Ser Ala Met Gly Lys His Arg Tyr Glu Ser Ala Gly Val
85 90 95
Ser Ile Thr Ile Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro Val Leu Lys Ala Ser
100 105 110
Leu Ser Ser Pro Ile Leu Glu Gly His Val Val Asn Leu Ser Cys Glu
115 120 125
Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu Tyr Phe Ser Phe
130 135 140
Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Leu Ser Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr
145 150 155 160
Gln Ile Leu Thr Ala Lys Lys Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Trp Cys Glu
165 170 175
Ala Thr Thr Glu Asp Gly Asn Val Val Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu
180 185 190
Leu Gln Val Val Gly Pro Gln Thr Leu Thr Pro Val Trp Phe His Val
195 200 205
Leu Phe Tyr Val Ala Met Gly Met Ile Phe Leu Val Asp Thr Ile Phe
210 215 220
Cys Met Ile Ile His Lys Glu Leu Gln Arg Lys Lys Lys Trp Asn Leu
225 230 235 240
Glu Ile Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Glu Lys Arg Val Asp Ser Tyr Leu
245 250 255
Gln Lys Glu Arg Asp Leu Glu Glu Pro Lys Tyr Gln Glu Leu Glu Gln
260 265 270
Leu Gln Glu Lys Thr Pro Gln Lys Pro Pro Glu Gly Glu Gln Gln
275 280 285
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 28
cgggaattcg gagacaacat gtggttcttg acaa 34
<210> 29
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 29
ttggtaccca ggtggaaaga agccaagcac ttgaagctcc aa 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 30
ttggagcttc aagtgcttgg cttctttcca cctgggtacc aa 42
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 31
ccggaattct catttgtctt gagggtcctt tct 33
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 32
cgggaattcg gagacaacat gtggttcttg acaa 34
<210> 33
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引物
<400> 33
ccggaattct catttgtctt gagggtcctt tct 33

Claims (15)

1.嵌合IgG Fc受体，包括：
细胞外结构域，包括足以与IgG Fc区域结合的CD64的部分；
跨膜结构域；以及
细胞内结构域，包括足以在IgG Fc区域与所述细胞外结构域结合时启动细胞信号传导的Fc受体免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)的部分。
2.根据权利要求1所述的嵌合IgG Fc受体，其中，所述细胞内结构域包括CD16A的细胞内区域的至少一部分。
3.根据权利要求1所述的嵌合IgG Fc受体，其中，所述细胞内结构域包括CD27、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、FcεR1、NKG2D、CD244(2B4)、FcRγ、DAP10、DAP12或CD3ζ的细胞内区域的至少一部分。
4.根据任一前述权利要求所述的嵌合IgG Fc受体，其中，所述细胞外结构域包括CD16A切割位点。
5.根据任一前述权利要求所述的嵌合IgG Fc受体，其中，所述细胞内结构域包括信号传导结构域。
6.编码任一前述权利要求所述的嵌合受体的多核苷酸。
7.包括权利要求6所述的多核苷酸的重组细胞。
8.表达权利要求1-5中任一项所述的IgG Fc嵌合受体的重组细胞。
9.根据权利要求8所述的重组细胞，其中，所述重组细胞是天然杀伤(NK)细胞。
10.包括编码CD64的多核苷酸的重组天然杀伤(NK)细胞。
11.重组细胞，包括经遗传修饰以表达CD64的天然杀伤(NK)细胞。
12.一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：
使所述肿瘤细胞与特异性结合所述肿瘤细胞的抗体接触；以及
使所述肿瘤细胞与权利要求7-11中任一项所述的重组细胞在所述重组细胞有效杀伤所述肿瘤细胞的条件下接触。
13.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者给药特异性结合所述肿瘤的细胞的抗体；以及
将包括权利要求7-11中任一项所述的重组细胞的组合物在所述重组细胞有效杀伤所述肿瘤的细胞的条件下给药于所述受试者。
14.一种组合物，包括：
权利要求7-11中任一项所述的重组细胞；以及
与所述嵌合受体结合的抗体。
15.一种治疗患有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者给药权利要求14所述的组合物，其中，所述抗体特异性结合所述肿瘤的细胞。
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