CN109641032A - 用于治疗黑素瘤的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供使用经PTD‑MYC融合蛋白(例如HIV TAT‑MYC融合蛋白)处理的抗肿瘤免疫细胞治疗黑素瘤的方法和组合物。

Description

用于治疗黑素瘤的方法和组合物
背景技术
过继细胞转移(ACT)为一种涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到患者中的免疫疗法的形式。ACT通常涉及从患者分离具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，体外培养淋巴细胞以扩增细胞群，并随后将淋巴细胞输注到患有癌症的宿主中。用于过继转移的淋巴细胞可来源于所切除的肿瘤的基质(例如肿瘤浸润性淋巴细胞)、淋巴管或淋巴结或血液。在一些情况下，所分离的淋巴细胞经基因工程改造以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。用于输注的淋巴细胞可从供体分离(同种异体ACT)或从患有癌症的宿主分离(自体ACT)。
发明内容
在某些实施例中，本文提供用于过继细胞转移以治疗黑素瘤的方法。在一些实施例中，提供治疗受试者中的黑素瘤的方法，其包含向受试者施用治疗有效量的具有抗肿瘤活性的免疫细胞，其中所述免疫细胞在向受试者施用之前与蛋白质转导结构域(PTD)-MYC融合多肽接触。在一些实施例中，免疫细胞包含一或多种淋巴细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞包含T细胞和/或B细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞包含肿瘤浸润性淋巴细胞。在一些实施例中，黑素瘤为转移性黑素瘤。在一些实施例中，黑素瘤为浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、雀斑样痣性黑素瘤或肢端黑素瘤。在一些实施例中，免疫细胞由患有黑素瘤的供体受试者获得。在一些实施例中，供体受试者和接受免疫细胞的受试者为相同的(即自体ACT)。在一些实施例中，供体受试者和接受免疫细胞的受试者为不同的(即同种异体ACT)。
在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽包含：(i)HIV TAT蛋白质转导结构域；和(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽易位到免疫细胞的细胞核中。在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽展现MYC的生物活性，诸如MYC靶基因的活化。在一些实施例中，融合肽包含SEQ ID NO:1。
在某些实施例中，本文描述包含以下的组合物：(a)MYC融合肽，其包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；和(b)从患有黑素瘤肿瘤的供体受试者分离的一或多种原代免疫细胞，其中所述一或多种原代免疫细胞对黑素瘤特异性抗原有反应性。在一些实施例中，MYC融合肽易位到一或多种原代免疫细胞的细胞核中。在一些实施例中，MYC融合肽展现MYC的生物活性。在一些实施例中，MYC融合肽进一步包含一或多种连接蛋白质转导结构域和MYC多肽的分子。在一些实施例中，MYC融合肽包含具有以下一般结构的MYC融合肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC序列，
其中-X-为连接蛋白质转导结构域和MYC序列的分子。在一些实施例中，蛋白质转导结构域序列为TAT蛋白质转导结构域序列。在一些实施例中，TAT蛋白质转导结构域序列选自由TAT[48-57]和TAT[57-48]组成的群组。在一些实施例中，MYC融合肽包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，MYC融合肽被乙酰化。在一些实施例中，一或多种免疫细胞具有针对黑素瘤细胞的抗肿瘤活性。在一些实施例中，一或多种免疫细胞包含一或多种淋巴细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞或其任何组合。在一些实施例中，T细胞选自由以下组成的群组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无反应性T细胞、耐受性T细胞、嵌合T细胞和抗原特异性T细胞。在一些实施例中，B细胞选自由以下组成的群组：原初B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受性B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、经T细胞受体修饰的淋巴细胞或经嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，肿瘤浸润性淋巴细胞具有CD8+CD25+标签。在一些实施例中，肿瘤浸润性淋巴细胞具有CD4+CD25+标签。在一些实施例中，一或多种免疫细胞包含可检测部分。
在某些实施例中，本文描述治疗受试者中的黑素瘤的方法，其包含向有需要的受试者施用一或多种经修饰的免疫细胞，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞包含MYC融合肽并且对肿瘤特异性抗原有反应性，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞来源于从受试者分离的原代免疫细胞。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞来源于从患有相同类型的黑素瘤的单独供体受试者分离的原代免疫细胞。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞是通过在分离之后使原代免疫细胞与MYC融合肽体外接触来制备。在一些实施例中，所述方法进一步包含在与MYC融合肽接触之前，体外扩增原代免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包含在与MYC融合肽接触之后，扩增原代免疫细胞。在一些实施例中，使用抗CD3抗体扩增所述细胞。在一些实施例中，使用经照射的同种异体饲养细胞扩增所述细胞。在一些实施例中，在外源性细胞因子存在下扩增所述细胞。在一些实施例中，细胞因子为白细胞介素-2。在一些实施例中，MYC融合肽易位到免疫细胞的细胞核中。在一些实施例中，MYC融合肽展现MYC的生物活性。在一些实施例中，MYC融合肽进一步包含一或多种连接蛋白质转导结构域和MYC多肽的分子。在一些实施例中，MYC融合肽包含具有以下一般结构的MYC融合肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC序列，
其中-X-为连接蛋白质转导结构域和MYC序列的分子。在一些实施例中，蛋白质转导结构域序列为TAT蛋白质转导结构域序列。在一些实施例中，TAT蛋白质转导结构域序列选自由TAT[48-57]和TAT[57-48]组成的群组。在一些实施例中，MYC融合肽包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，MYC融合肽被乙酰化。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞具有针对受试者中的黑素瘤细胞的抗肿瘤活性。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞具有针对受试者中的黑素瘤细胞的抗肿瘤活性。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞包含一或多种无反应性免疫细胞。在一些实施例中，一或多种免疫细胞包含一或多种淋巴细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞包含T细胞、B细胞、NK或其任何组合。在一些实施例中，T细胞选自由以下组成的群组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无反应性T细胞、耐受性T细胞、嵌合T细胞和抗原特异性T细胞。在一些实施例中，B细胞选自由以下组成的群组：原初B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受性B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、经T细胞受体修饰的淋巴细胞或经嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-标签。在一些实施例中，淋巴细胞具有CD8+CD25+标签。在一些实施例中，淋巴细胞具有CD4+CD25+标签。在一些实施例中，所述方法进一步包含从供体受试者分离原代免疫细胞。在一些实施例中，供体受试者患有黑素瘤。在一些实施例中，静脉内、腹膜内、皮下、肌内或瘤内施用一或多种经修饰的免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包含在施用一或多种经修饰的免疫细胞之前对受试者进行淋巴细胞清除。在一些实施例中，所述方法进一步包含向受试者施用细胞因子。在一些实施例中，在施用一或多种经修饰的免疫细胞之前、期间或之后施用所述细胞因子。在一些实施例中，细胞因子选自由以下组成的群组：干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、IL-2、TNFα、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7和XCL2。在一些实施例中，黑素瘤为转移性的。在一些实施例中，受试者为人或动物。在一些实施例中，所述方法进一步包含施用其它癌症疗法。在一些实施例中，所述其它癌症疗法选自化疗、放疗、免疫疗法、单克隆抗体、抗癌核酸或蛋白质、抗癌病毒或微生物及其任何组合。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞包含可检测部分。
在某些实施例中，本文还描述制备用于黑素瘤疗法的经修饰的免疫细胞的方法，其包含使一或多种免疫细胞与MYC融合多肽体外接触，其中所述免疫细胞来自已暴露于一或多种肿瘤抗原的供体并且对肿瘤特异性抗原有反应性，并且其中所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞来源于从患有黑素瘤的受试者分离的原代免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包含在与MYC融合肽接触之前，体外扩增原代免疫细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包含在与MYC融合肽接触之后，扩增原代免疫细胞。在一些实施例中，使用抗CD3抗体扩增所述细胞。在一些实施例中，使用经照射的同种异体饲养细胞扩增所述细胞。在一些实施例中，在外源性细胞因子存在下扩增所述细胞。在一些实施例中，细胞因子为白细胞介素-2。在一些实施例中，MYC融合肽易位到免疫细胞的细胞核中。在一些实施例中，MYC融合肽展现MYC的生物活性。在一些实施例中，MYC融合肽进一步包含一或多种连接蛋白质转导结构域和MYC多肽的分子。在一些实施例中，MYC融合肽包含具有以下一般结构的MYC融合肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC序列，
其中-X-为连接蛋白质转导结构域和MYC序列的分子。在一些实施例中，蛋白质转导结构域序列为TAT蛋白质转导结构域序列。在一些实施例中，TAT蛋白质转导结构域序列选自由TAT[48-57]和TAT[57-48]组成的群组。在一些实施例中，MYC融合肽包含SEQ ID NO:1。在一些实施例中，MYC融合肽被乙酰化。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞具有抗肿瘤活性。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞具有针对受试者中的黑素瘤细胞的抗肿瘤活性。在一些实施例中，一或多种经修饰的免疫细胞包含一或多种无反应性免疫细胞。在一些实施例中，一或多种免疫细胞包含一或多种淋巴细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞包含T细胞、B细胞、NK或其任何组合。在一些实施例中，T细胞选自由以下组成的群组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无反应性T细胞、耐受性T细胞、嵌合T细胞和抗原特异性T细胞。在一些实施例中，B细胞选自由以下组成的群组：原初B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受性B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。在一些实施例中，一或多种淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、经T细胞受体修饰的淋巴细胞或经嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。在一些实施例中，淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-标签。在一些实施例中，淋巴细胞具有CD8+CD25+标签。在一些实施例中，淋巴细胞具有CD4+CD25+标签。
在某些实施例中，本文还描述包含以下的组合物：(a)一或多种经分离的原代免疫细胞，其已暴露于黑素瘤细胞系；和(b)MYC融合肽，其包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；其中所述一或多种原代免疫细胞对黑素瘤特异性抗原有反应性。
在某些实施例中，本文还描述用于治疗黑素瘤的上述组合物中的任一种。在某些实施例中，本文还描述用于制造供治疗黑素瘤的药剂的上述组合物中的任一种。
在某些实施例中，本文还描述增加过继细胞疗法或T细胞疗法在受试者中的功效的方法，其包含施用上述组合物中的任一种。
在某些实施例中，本文还描述包含MYC融合肽的经修饰的肿瘤浸润性淋巴细胞，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，肿瘤浸润性淋巴细胞来源于从患有癌症(例如黑素瘤)的受试者分离的原代肿瘤浸润性淋巴细胞。
在某些实施例中，本文还描述包含嵌合抗原受体和MYC融合肽的淋巴细胞，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。在一些实施例中，淋巴细胞来源于从患有癌症(例如黑素瘤)的受试者分离的原代淋巴细胞。
在某些实施例中，本文还描述制备用于过继细胞疗法的组合物的方法，其包含使一或多种原代免疫细胞与MYC融合肽接触，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列，其中一或多种原代免疫细胞是从患有黑素瘤的患者分离，并且其中一或多种原代免疫细胞对黑素瘤特异性抗原有反应性。
还提供用于治疗黑素瘤的试剂盒，其包含本文中提供的MYC融合多肽和/或经MYC融合多肽修饰的免疫细胞。在一些实施例中，所述试剂盒包含一或多种用于检测所施用的MYC融合多肽和/或经MYC融合多肽经修饰的免疫细胞的试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含与本文中提供的MYC融合多肽一起用于治疗的细胞，例如造血干细胞、供体白细胞、T细胞或NK细胞。在一些实施例中，所述试剂盒包含关于使用MYC融合多肽和/或经MYC融合多肽修饰的免疫细胞的相关说明书。
附图说明
图1说明了在输注来自用TAT-MYC处理的携带肿瘤的供体小鼠的淋巴细胞长达1小时之后，携带黑素瘤肿瘤的小鼠的存活结果。用TAT-MYC淋巴细胞处理小鼠，用经过对照蛋白处理的淋巴细胞处理小鼠或不处理小鼠。在处理当天记录死亡日为第0天。
图2说明了在输注来自用TAT-MYC处理的携带肿瘤的供体小鼠的淋巴细胞之后，携带黑素瘤肿瘤的小鼠的存活结果(图1所示的实验的重复)。用TAT-MYC淋巴细胞处理小鼠，用经过对照蛋白处理的淋巴细胞处理小鼠或不处理小鼠。在处理当天记录死亡日为第0天。
图3说明了在输注不同量的来自用TAT-MYC处理的携带肿瘤的供体小鼠的淋巴细胞之后，携带黑素瘤肿瘤的小鼠的存活结果。用TAT-MYC淋巴细胞处理小鼠，用经过对照蛋白处理的淋巴细胞处理小鼠或不处理小鼠。在处理当天记录死亡日为第0天。
图4说明了在输注不同量的来自用TAT-MYC处理的携带肿瘤的供体小鼠的淋巴细胞之后，携带黑素瘤肿瘤的小鼠的存活结果。用TAT-MYC淋巴细胞处理小鼠，用经过对照蛋白处理的淋巴细胞处理小鼠或不处理小鼠。在处理当天记录死亡日为第0天。
具体实施方式
本公开不限于本申请中描述的特定实施例，其旨在作为本公开的各个方面的单个说明。本文将不描述本公开的所有各种实施例。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本公开的范围内的功能等同的方法和装置对于本领域技术人员而言从前面的描述中是显而易见的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。
应理解，本公开不限于特定用途、方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，其当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不是限制性的。
另外，在根据马库什群组描述本公开的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此以马库什群组的任何单个成员或成员子群的形式描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围可以容易地被认为充分描述相同的范围并且使得相同的范围被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例，这里讨论的每个范围可以容易地分解。如本领域技术人员还将理解的，所有措辞，例如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等等包括所引用的数字并且是指如上所述可以随后分解成子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
I.定义
本文使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本公开。如本文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”旨在包括复数形式。
如本文所用，术语“约”是指值可以变化+/-20％、+/-15％、+/-10％或+/-5％并且仍然在本公开的范围内。例如，约200IU/mL的浓度涵盖160IU/mL和240IU/mL之间的浓度。
如本文所用，术语向受试者“施用”药剂包括将药剂引入或递送至受试者以执行其预期功能的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下。施用包括自我施用和通过另一个人施用。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)和热解赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的试剂，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。在一些实施例中，形成多肽的氨基酸为D形式。在一些实施例中，形成多肽的氨基酸为L形式。在一些实施例中，形成多肽的第一多个氨基酸为D形式，第二多个氨基酸为L形式。
氨基酸在本文中通过它们通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸通过它们普遍接受的单字母代码来指代。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及氨基酸聚合物，其中一或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸，例如氨基酸类似物。所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所用，“对照”是用于比较目的的实验中使用的替代样品。对照可以是“阳性的”或“阴性的”。例如，在实验的目的是确定治疗剂对特定类型疾病的治疗功效的相关性的情况下，通常使用阳性对照(已知具有所需治疗效果的组合物)和阴性对照(通常使用不接受治疗或接受安慰剂的受试者或样品)。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现所需治疗效果的药剂的量。在治疗应用的背景下，施用于受试者的治疗性肽的量可取决于感染的类型和严重程度以及个体的特征，例如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受性。它还可以取决于疾病的程度、严重程度和类型。技术人员将能够根据这些及其它因素确定合适的剂量。
如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可包括在真核细胞中剪接mRNA。可以通过测量细胞或组织样品中mRNA或蛋白质的量来确定基因的表达水平。在一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与来自对照或参照样品的所述基因的表达水平直接比较。在另一个方面，可以将来自一个样品的基因的表达水平与施用本文公开的组合物之后来自相同样品的所述基因的表达水平直接比较。术语“表达”还指一或多个以下事件：(1)从细胞内的DNA序列(例如，通过转录)产生RNA模板；(2)在细胞内加工RNA转录物(例如通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)将RNA序列翻译成细胞内的多肽或蛋白质；(4)细胞内多肽或蛋白质的翻译后修饰；(5)在细胞表面上呈递多肽或蛋白质；和(6)从细胞中分泌或呈递或释放多肽或蛋白质。
术语“连接子”是指联接或连接两个序列(例如连接两个多肽结构域)的合成序列(例如，氨基酸序列)。在一些实施例中，连接子含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸序列。
如本文所用的术语“冻干”、“冻干法”等是指首先将欲要干燥的材料(例如，纳米颗粒)冷冻然后通过在真空环境中升华去除冰或冷冻溶剂的过程。赋形剂可以包括在预冻干调配物中以增强冻干产品在储存时的稳定性。冻干样品可进一步含有另外的赋形剂。
如本文所用，术语免疫细胞是指在免疫应答中起作用的任何细胞。免疫细胞是造血起源的，并且包括淋巴细胞，如B细胞和T细胞；自然杀伤细胞；骨髓细胞，如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
术语“淋巴细胞”是指所有未成熟、成熟、未分化和分化的白色淋巴细胞群，其包括组织特异性和特化变种。作为非限制性实例，其涵盖B细胞、T细胞、NKT细胞和NK细胞。在一些实施例中，淋巴细胞包括所有B细胞谱系，包括前B细胞(pre-B cells)、祖细胞B细胞(progenitor B cells)、早期原B细胞(early pro-B cells)、晚期原B细胞、大型前B细胞、小型前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞和无反应性AN1/T3细胞群。
如本文所用，术语T细胞包括原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无反应性T细胞、耐受性T细胞、嵌合T细胞和抗原特异性T细胞。
作为非限制性实例，术语“B细胞(B cell)”或“B细胞(B cells)”是指前B细胞、祖细胞B细胞、早期原B细胞、晚期原B细胞、大型前B细胞、小型前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、原初B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、无反应性B细胞、耐受性B细胞、嵌合B细胞、抗原特异性B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞和无反应性AN1/T3细胞群。在一些实施例中，术语B细胞包括在其细胞表面上表达免疫球蛋白重链和/或轻链的B细胞。在一些实施例中，术语B细胞包括表达和分泌免疫球蛋白重链和/或轻链的B细胞。在一些实施例中，术语B细胞包括在其细胞表面上结合抗原的细胞。在本文公开的一些实施例中，B细胞或AN1/T3细胞用于所述过程中。在某些实施例中，此类细胞任选地被任何适于表达，能够表达(例如，可诱导表达)或能够分化成适于表达抗体的细胞的动物细胞取代，包括例如造血干细胞、原初B细胞、B细胞、前B细胞、祖细胞B细胞、早期原B细胞、晚期原B细胞、大型前B细胞、小型前B细胞、未成熟B细胞、成熟B细胞、血浆B细胞、记忆B细胞、B-1细胞、B-2细胞、无反应性B细胞或无反应性AN1/T3细胞。
如本文所用，“过继细胞治疗组合物”是指包含适于过继细胞转移的细胞的任何组合物。在示例性实施例中，过继细胞治疗组合物包含选自由肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR(即异源T细胞受体)修饰的淋巴细胞和CAR(即嵌合抗原受体)修饰的淋巴细胞组成的群组的细胞类型。在另一个实施例中，过继细胞治疗组合物包含选自由T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、Δ-γT-细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞组成的群组的细胞类型。在另一个实施例中，TIL、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、Δ-γT-细胞、调节性T细胞或外周血单核细胞形成过继细胞治疗组合物。在一个实施例中，过继细胞治疗组合物包含T细胞。
如本文所用，“肿瘤浸润淋巴细胞”或TIL是指已经离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。
术语“MYC”和“MYC基因”是同义词。它们是指编码MYC多肽的核酸序列。MYC基因包含至少120个核苷酸的核苷酸序列，其与NCBI登录号NM-002467的序列是至少60％至100％相同或同源的，例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或从约70％至约100％的任何其它百分比是相同的。在一些实施例中，MYC基因是原癌基因。在某些情况下，在染色体8上在8q24.21处发现MYC基因。在某些情况下，MYC基因开始于和pter相距128,816,862bp处，并且终止于和pter相距128,822,856bp处。在某些情况下，MYC基因约为6kb。在某些情况下，MYC基因编码至少8个单独的mRNA序列-5个交替剪接变体和3个未剪接变体。
术语“MYC蛋白”、“MYC多肽“和“MYC序列”是同义词，并且是指NCBI登录号UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1(MYC同种型1)或NP_002458.2(UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.2；MYC同种型2)中公开的氨基酸残基聚合物，及其功能同源物、类似物或片段。UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1的序列是：
MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQ IDNO:2)
NP_002458.2(UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.2)的序列是：
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA(SEQ ID NO:11)
在一些实施例中，MYC多肽是完整的MYC多肽序列。在一些实施例中，MYC多肽是部分MYC多肽序列。在一些实施例中，MYC多肽包含SEQ ID NO:2或11的至少400个连续氨基酸。在一些实施例中，MYC多肽包含SEQ ID NO:2或11的至少400个连续氨基酸并保留至少一种MYC活动。在一些实施例中，MYC多肽包含SEQ ID NO:2或11的至少400个、至少410个、至少420个、至少430个或至少450个连续氨基酸。在一些实施例中，MYC多肽包含SEQ ID NO:2或11的至少400个、至少410个、至少420个、至少430个或至少450个连续氨基酸并保留至少一种MYC活动。在一些实施例中，MYC多肽是c-MYC。在一些实施例中，MYC多肽序列包含如下所示的序列：
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，MYC多肽序列包含如下所示的序列：
PLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:4)。
在一些实施例中，MYC多肽包含与NCBI登录号NP002458.2或UniProtKB/Swiss-Prot登录号P01106.1的序列至少40％至100％相同的氨基酸序列，例如，至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或从约40％至约100％相同的任何其它百分比。在一些实施例中，MYC多肽是指439个氨基酸的聚合物，这是未经历任何翻译后修饰的MYC多肽。在一些实施例中，MYC多肽是指经历翻译后修饰的439个氨基酸的聚合物。在一些实施例中，MYC多肽是48,804kDa。在一些实施例中，MYC多肽含有基础螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH/LZ)结构域。在一些实施例中，bHLH/LZ结构域包含以下序列：ELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR(SEQ ID NO:5)。在一些实施例中，MYC多肽是转录因子(例如，转录因子64)。在一些实施例中，MYC多肽含有E-盒(E-box)DNA结合结构域。在一些实施例中，MYC多肽结合包含CACGTG的序列。在一些实施例中，MYC多肽促进细胞存活和/或增殖中的一或多种。在一些实施例中，MYC多肽包括上述那些中的一或多种，并且包括一或多种翻译后修饰(例如，乙酰化)。在一些实施例中，MYC多肽在多肽的N-末端或C-末端包含一或多个另外的氨基酸残基。在一些实施例中，MYC多肽是融合蛋白。在一些实施例中，MYC多肽在多肽的N-末端或C-末端与一或多个另外的肽连接。
适用于本文所述方法的蛋白质还包括功能变体，其包括与本文描述的任何蛋白质的氨基酸序列相比具有1至15个氨基酸变化的蛋白质，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代、缺失或添加。在其它实施例中，改变的氨基酸序列与本文所述的任何蛋白质抑制剂的氨基酸序列至少75％相同，例如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。此类序列变体蛋白适用于本文所述的方法，只要改变的氨基酸序列保留足以在本文所述的组合物和方法中起作用的生物活性即可。在进行氨基酸取代的情况下，取代可以是保守氨基酸取代。在常见的天然存在的氨基酸中，例如，“保守氨基酸取代”通过以下各组中的氨基酸之间的取代来说明：(1)甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)丝氨酸和苏氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(6)赖氨酸、精氨酸和组氨酸。BLOSUM62表是衍生自蛋白质序列区段的约2,000个局部多重比对的氨基酸取代矩阵，代表超过500组相关蛋白质的高度保守区域(亨尼可夫(Henikoff)等人(1992)，美国科学院院报(Proc.Natl Acad.Sci.)USA，89:10915-10919)。因此，BLOSUM62取代频率用于定义保守氨基酸取代，其在一些实施例中被引入到本文描述或公开的氨基酸序列中。尽管可以仅基于化学性质(如上所述)设计氨基酸取代，但措辞“保守氨基酸取代”优选是指由大于-1的BLOSUM62值表示的取代。例如，如果取代的特征在于BLOSUM62值为0、1、2或3，则氨基酸取代是保守的。根据此系统，优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值至少为1(例如，1、2或3)，而更优选的保守氨基酸取代的特征在于BLOSUM62值至少为2(例如，2或3)。
短语“E-盒序列”和“增强子盒序列”在本文中可互换使用，并且表示核苷酸序列CANNTG，其中N是任何核苷酸。在某些情况下，E-盒序列包含CACGTG。在某些情况下，由MYC编码的转录因子的基础螺旋-环-螺旋结构域与E-盒序列结合。在某些情况下，E-盒序列位于基因(例如，p21、Bc1-2或鸟氨酸脱羧酶)的上游。在某些情况下，MYC多肽含有E-盒DNA结合结构域。在某些情况下，E-盒DNA结合结构域包含KRRTHNVLERQRRN的序列(SEQ ID NO:6)。在某些情况下，MYC编码的转录因子与E-盒序列的结合允许RNA聚合酶转录E-盒序列下游的基因。
术语“MYC活性”或“MYC生物活性”或“生物活性MYC”包括增强或诱导细胞存活、细胞增殖和/或抗体产生中的一或多种。作为实例而非限制，MYC活性包括增强抗CD3和抗CD28活化的T细胞的扩增和/或增加长期自我更新的造血干细胞的增殖。MYC活性还包括进入细胞核，结合核酸序列(例如，结合E-盒序列)，和/或诱导MYC靶基因的表达。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且是指动物，通常是哺乳动物。在一个实施例中，患者、受试者或个体是哺乳动物。在一个实施例中，患者、受试者或个体是人。在一些实施例中，患者、受试者或个体是动物，例如但不限于家养动物，例如马、牛、鼠、绵羊、犬和猫。
术语“蛋白质转导结构域(PTD)”或“转运蛋白肽序列”(也称为细胞渗透性蛋白质(CPP)或膜转位序列(MTS))在本文中可互换使用，是指能够不依赖于经典内吞作用而将更大分子转运到细胞中的小肽。在一些实施例中，可以在蛋白质转导结构域内发现核定位信号，其介导分子进一步转运到细胞核中。
本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”涵盖治疗受试者(例如人)的疾病，并且包括：(i)抑制疾病，即阻止其发展；(ii)缓解疾病，即导致疾病消退；(iii)减缓疾病的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病的一或多种症状的进展。关于黑素瘤，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”还涵盖肿瘤消退、减缓肿瘤生长、抑制黑素瘤肿瘤转移、抑制复发或复发性黑素瘤和/或维持缓解。
还应理解，所描述的各种治疗或预防医学疾病和病症的模式旨在表示“实质性的”，其包括全部治疗或预防但也少于全部治疗或预防，并且其中实现一些生物学或医学相关的结果。治疗可以是对慢性疾病的持续延长治疗，或者是用于治疗急性病症的单次或几次给药。
如本文所用的术语“治疗性”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态获得治疗效果。
II.综述
本公开部分涉及通过施用包含一或多种具有抗肿瘤活性的免疫细胞(例如，调节针对肿瘤的应答的免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))的组合物来治疗受试者中的黑素瘤，其中一或多种免疫细胞在施用于受试者之前与PTD-MYC融合多肽体外接触。在一些实施例中，免疫细胞获自患有黑素瘤肿瘤的供体受试者。在一些实施例中，细胞对接受治疗的受试者是自体的。在一些实施例中，黑素瘤是浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、雀斑样痣性黑素瘤或肢端黑素瘤。
本公开至少部分基于以下发现：用含有MYC多肽和蛋白质转导结构域(PTD)(例如HIV TAT蛋白质转导结构域)的MYC融合多肽处理从患有黑素瘤肿瘤的供体受试者分离的淋巴细胞并将被处理的淋巴细胞施用于携带有黑素瘤肿瘤的受试者显著增加了携带肿瘤的受试者的存活率。本文提供的实例证明，在施用于第二只携带黑素瘤的小鼠之前，在体外用TAT-MYC融合蛋白处理细胞时，从黑素瘤小鼠的淋巴结中提取的免疫细胞具有显著增加的治疗功效。这些数据支持使用用PTD-MYC融合多肽处理的抗肿瘤免疫细胞的过继细胞转移可用于治疗肿瘤，例如黑素瘤肿瘤。
在一些实施例中，用于治疗受试者中的黑素瘤的方法包括施用已经体外与PTD-MYC融合多肽接触的免疫细胞。在一些实施例中，用于本发明方法的免疫细胞用黑素瘤肿瘤抗原体内引发。在一些实施例中，免疫细胞来自患有黑素瘤的供体。在一些实施例中，免疫细胞来自具有实体瘤例如黑素瘤的供体。在一些实施例中，免疫细胞与黑素瘤肿瘤抗原体内接触。在一些实施例中，免疫细胞来自已暴露于一或多种黑素瘤肿瘤抗原的供体。在一些实施例中，免疫细胞来自已经暴露于抗肿瘤疫苗的供体。在一些实施例中，免疫细胞是B细胞、T细胞、NK细胞或其任何组合。在一些实施例中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在一些实施例中，免疫细胞是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。
在一些实施例中，用于治疗受试者中的黑素瘤的方法包括向有此需要的受试者施用一或多种经修饰的免疫细胞，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞包含MYC融合肽并且对黑素瘤肿瘤特异性抗原具有反应性，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。
在一些实施例中，用于治疗受试者中的黑素瘤的方法包含以下步骤：
a)使免疫细胞与MYC融合多肽体外接触，其中免疫细胞来自已经暴露于一或多种黑素瘤肿瘤抗原的供体并且MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；和
b)将接触的免疫细胞施用于携带有黑素瘤肿瘤的受试者，由此治疗黑素瘤。
在一些实施例中，通过在MYC融合多肽存在下培养免疫细胞来使免疫细胞与PTD-MYC融合多肽体外接触。在一些实施例中，在一或多种细胞因子和/或生长因子(例如白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15)的存在下培养免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞在施用前没有扩增。在一些实施例中，免疫细胞在施用前扩增。在一些实施例中，供体和用于治疗的受试者是相同的。
在一些实施例中，免疫细胞是肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施例中，肿瘤浸润淋巴细胞是自体肿瘤浸润淋巴细胞。因此，在一些实施例中，治疗受试者中黑素瘤的方法包括施用已经与PTD-MYC融合多肽体外接触的淋巴细胞，其中来自淋巴细胞的免疫细胞是来自受试者的自体肿瘤浸润淋巴细胞。
在一些实施例中，用于治疗受试者中的黑素瘤的方法包含以下步骤：
a)将淋巴细胞与PTD-MYC融合多肽体外接触，其中淋巴细胞是来自受试者的自体肿瘤浸润淋巴细胞，和
b)将接触的自体肿瘤浸润淋巴细胞施用于受试者，由此治疗黑素瘤。
获得和制备用于转移的免疫细胞的方法
可以使用本领域已知的任何合适方法获得用于本文提供的方法的免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是原代免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞是淋巴细胞，例如T细胞和B细胞。在一些实施例中，免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施例中，免疫细胞是淋巴细胞和NK细胞的混合物。在一些实施例中，免疫细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，免疫细胞是已经渗入肿瘤的T细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞)。在一些实施例中，在受试者的黑素瘤肿瘤或转移性肿瘤的手术期间去除T细胞。例如，在一些实施例中，在通过活组织检查去除肿瘤组织后分离T细胞。在一些实施例中，免疫细胞在从供体分离后被修饰。在一些实施例中，免疫细胞是嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。
在一些实施例中，从含有细胞群的样品(例如血液、淋巴或组织活检样品)中分离T细胞。可以通过本领域已知的任何方法从细胞群中分离T细胞。在一个实施例中，所述方法包含通过本领域已知的任何合适的方法从肿瘤样品中获得大量T细胞。例如，通过将肿瘤样品解离成可以从中选择特定细胞群的细胞悬液，可以从肿瘤样品中获得大量T细胞。获得大量T细胞的合适方法可包括但不限于机械解离(例如，切碎)肿瘤、酶促解离(例如，消化)肿瘤和抽吸(例如，用针)中的任何一或多种。
从肿瘤样品获得的大量T细胞可包含任何合适类型的T细胞。优选地，从肿瘤样品获得的大量T细胞包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
肿瘤样品可以从任何哺乳动物中获得。除非另有说明，否则如本文所用，术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于以下目的哺乳动物：兔形目(Logomorpha)，例如兔；食肉目(Carnivora)，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)；偶蹄目(Artiodactyla)，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目(Perssodactyla)，包括马科动物(马)。哺乳动物可以是非人灵长类动物，例如灵长目、卷尾猴科(Ceboids)或猴科(Simoids)(猴子)或类人猿目(Anthropoids)(人和猿)。在一些实施例中，哺乳动物可以是啮齿目(Rodentia)的哺乳动物，例如小鼠和仓鼠。优选地，哺乳动物是非人灵长类动物或人。示例性哺乳动物是人。在一些实施例中，接受免疫细胞的受试者也是肿瘤样品的供体(即，自体ACT)。
T细胞可以从许多来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的任何技术(例如Ficoll分离)从采集自受试者的血液单位获得。在一个实施例中，来自个体的循环血液的细胞通过单采血液成分术或白细胞去除术获得。单采血液成分产物通常含有淋巴细胞，其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施例中，可以洗涤通过单采血液成分术收集的细胞以去除血浆部分并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理步骤。在本发明的一个实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个替代实施例中，洗涤溶液缺乏钙并且可能缺乏镁或者可能缺乏许多(如果不是全部)二价阳离子。在没有钙的情况下的初始活化步骤导致活化放大。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过根据制造商说明使用半自动流通式离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器)。洗涤后，可将细胞重悬于各种生物相容性缓冲液中，例如无Ca无Mg的PBS。或者，可以去除单采血液成分样品中不需要的成分，并将细胞直接重悬于培养基中。
在另一个实施例中，通过裂解红细胞和耗尽单核细胞(例如，通过经由PERCOLLTM梯度进行离心)从外周血淋巴细胞中分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD28+、CD4+、CDC、CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，在一个实施例中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)缀合珠粒(例如M-450CD3/CD28T或XCYTEDYNABEADSTM)孵育足以阳性选择所需T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施例中，所述时间段是约30分钟。在另一个实施例中，所述时间段的范围为30分钟至36小时或更长，以及其间的所有整数值。在另一个实施例中，所述时间段为至少1、2、3、4、5或6小时。在又一个实施例中，所述时间段为10至24小时。在一个实施例中，孵育时间段为24小时。为了从患有白血病的患者中分离T细胞，使用更长的孵育时间(例如24小时)可以增加细胞产量。与其它细胞类型(例如从肿瘤组织或免疫受损个体中分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))相比，在较少T细胞的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高CD8+T细胞的捕获效率。
通过阴性选择富集T细胞群可以通过针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来实现。在一个实施例中，所述方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。
此外，可通过多种方法从血液制剂中去除单核细胞群(即CD14+细胞)，所述方法包括抗CD14包被的珠或柱，或利用这些细胞的吞噬活性以促进去除。因此，在一个实施例中，本发明使用大小足以被吞噬单核细胞吞噬的顺磁性颗粒。在某些实施例中，顺磁性颗粒是可商购的珠粒，例如由Life Technologies以商品名DynabeadsTM生产的那些。在一个实施例中，通过用“无关”蛋白质(例如，血清蛋白质或抗体)包被顺磁性颗粒来去除其它非特异性细胞。无关蛋白质和抗体包括那些不特异性靶向待分离的T细胞的蛋白质和抗体或其片段。在某些实施例中，无关珠粒包括用绵羊抗小鼠抗体、山羊抗小鼠抗体和人血清白蛋白包被的珠粒。
简而言之，通过将从全血、单采血液成分的外周血或肿瘤中分离的T细胞与无关的顺磁性颗粒或非抗体偶联的顺磁性颗粒中的一或多种种类以允许去除单核细胞的任何量(大约20:1珠:细胞比)在22至37℃下预孵育约30分钟至2小时，然后磁性去除已经附着或吞噬顺磁性颗粒的细胞，从而进行单核细胞的这种消耗。可以使用本领域可获得的标准方法进行这种分离。例如，可以使用任何磁分离方法，其包括各种商业上可获得的方法(例如，磁性颗粒浓缩器(DYNAL))。可以通过本领域普通技术人员已知的各种方法监测必需耗尽的保证，包括在耗尽之前和之后的CD14阳性细胞的流式细胞术分析。
为了通过阳性或阴性选择分离所需的细胞群，可以改变细胞和表面(例如珠粒等颗粒)的浓度。在某些实施例中，可能需要显著降低珠粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。例如，在一个实施例中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施例中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施例中，使用大于100百万个细胞/ml。在另一个实施例中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施例中，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施例中，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可以更有效地捕获可以弱表达目的靶抗原的细胞，例如CD28阴性T细胞，或者存在许多肿瘤细胞的样品(即白血病血液、肿瘤组织等)。此类细胞群可具有治疗价值并且需要获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关的实施例中，可能需要使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，诸如珠粒等颗粒)的混合物，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。这选择表达大量所需抗原的细胞以与颗粒结合。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且比稀释浓度的CD8+T细胞被更有效地捕获。在一个实施例中，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其它实施例中，使用的浓度可以是约1×105/ml至1×106/ml，以及其间的任何整数值。
T细胞也可以冷冻。冷冻和随后的解冻步骤可以通过去除细胞群中的粒细胞和在一定程度上去除单核细胞来提供更均匀的产物。在用于去除血浆和血小板的洗涤步骤后，可将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下是有用的，但一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或其它合适的细胞冷冻介质，然后将细胞以每分钟1°的速度冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其它控制冷冻方法以及在-20℃或液氮中不受控制的立即冷冻。
用于本发明的T细胞也可以是抗原特异性T细胞。例如，可以使用肿瘤特异性T细胞。在某些实施例中，抗原特异性T细胞可以从目的患者中分离，例如患有黑素瘤的患者，例如患有黑素瘤肿瘤的患者。在一些实施例中，患者患有黑素瘤。
在一个实施例中，确定受试者的新表位，并分离对这些抗原具有特异性的T细胞。用于扩增中的抗原特异性细胞也可以使用本领域已知的多种方法体外产生，例如，如在题为抗原特异性T细胞的产生和分离(Generation And Isolation of Antigen-SpecificTCells)的美国专利公开第US 20040224402号中或在美国专利第6,040,177号中所描述。用于本发明的抗原特异性细胞也可以使用本领域已知的许多方法产生，例如，如在两者皆由Wiley&Sons公司，Boston，Mass出版的免疫学当前实验方案(Current ProtocolsinImmunology)或细胞生物学当前实验方案(Current Protocols in Cell Biology)中所描述。
在一个相关的实施例中，可能需要在一轮或两轮扩增之前或之后对抗原特异性细胞进行分选或以其它方式阳性选择(例如通过磁选择)。可以使用肽-MHC四聚体进行分选或阳性选择抗原特异性细胞(艾特曼(Altman)等人，科学(Science.)1996年10月4日；274(5284):94-6)。在另一个实施例中，使用适应性四聚体技术方法(安德森(Andersen)等人，2012自然实验方案(Nat Protoc.)7:891-902)。四聚体受限于需要基于先前假设利用预测的结合肽，以及对特定HLA的限制。肽-MHC四聚体可以使用本领域已知的技术产生，并且可以用任何目的MHC分子和如本文所述的任何目的抗原制备。可以使用本领域已知的许多测定法鉴定在此情况中使用的特异性表位。例如，多肽结合MHC I类的能力可以通过监测促进125I标记的β2-微球蛋白(β2m)掺入MHC I类/β2m/肽异源三聚体复合物的能力来间接评估(参见帕克(Parker)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)152:163，1994)。
在一些实施例中，重组修饰T细胞以表达修饰的或嵌合的受体(例如，嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞)。
在一个实施例中，用表位特异性试剂直接标记细胞，用于通过流式细胞术分离，然后表征表型和TCR。在一个实施例中，通过接触T细胞特异性抗体分离T细胞。抗原特异性T细胞或通常任何本发明细胞的分选可以使用多种市售细胞分选仪中的任何一种进行，其包括但不限于MoFlo分选仪(DakoCytomation，Fort Collins，Colo.)、FACSAriaTM、FACSArrayTM、FACSVantageTM、BDTMLSR II和FACSCaliburTM(BD Biosciences，San Jose，Calif.)。
在一个实施例中，所述方法包含选择也表达CD3的细胞。所述方法可以包含以任何合适的方式特异性地选择细胞。优选地，使用流式细胞术进行选择。流式细胞术可以使用本领域已知的任何合适的方法进行。流式细胞术可以使用任何合适的抗体和染色剂。优选地，选择抗体使得其特异性识别并结合所选择的特定生物标志物。例如，CD3、CD8、TIM-3、LAG-3、4-1BB或PD-1的特异性选择可以分别使用抗CD3、抗CD8、抗TIM-3、抗LAG-3、抗4-lBB或抗PD-1抗体进行。一或多种抗体可以与珠粒(例如磁珠)或荧光染料缀合。优选地，流式细胞术是荧光活化细胞分选术(FACS)。可以基于对自体肿瘤的反应性来选择在T细胞上表达的TCR。另外，可以使用专利公开第WO2014133567和WO2014133568号中描述的方法基于标志物选择对肿瘤具有反应性的T细胞，所述专利公开以全文引用的方式并入本文。另外，可以基于CD107a的表面表达选择活化的T细胞。
在一个实施例中，所述方法还包含扩增富集细胞群中T细胞的数量。这些方法描述于美国专利第8,637,307号中，其以全文引用的方式并入本文。可以在用PTD-MYC多肽处理细胞之前或之后扩增T细胞。T细胞的数量可以增加至少约3倍(或4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍)，更优选至少约10倍(或20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍或90倍)，更优选至少约100倍，更优选至少约1,000倍，或最优选至少约100,000倍。可以使用本领域已知的任何合适方法扩增T细胞的数量。在专利公开第WO 2003057171号、美国专利第8,034,334号和美国专利申请公开第2012/0244133号中描述了扩增细胞数量的示例性方法，其中的每一个以引用的方式并入本文。
在一个实施例中，离体T细胞扩增可以通过分离T细胞并随后刺激或活化然后进一步扩增来进行。在本发明的一个实施例中，T细胞可以被单一药剂刺激或活化。在另一个实施例中，用两种试剂刺激或活化T细胞，一种诱导主要信号，另一种诱导共刺激信号。用于刺激单一信号或刺激主要信号的配体和刺激第二信号的辅助分子可以以可溶形式使用。配体可以附着在细胞表面，附着在工程多价信号平台(Engineered Multivalent SignalingPlatform，EMSP)上，或固定在表面上。在一个实施例中，将一级和二级试剂共同固定在表面上，例如珠粒或细胞上。在一个实施例中，提供主要活化信号的分子可以是CD3配体，并且共刺激分子可以是CD28配体或4-1BB配体。在一些实施例中，通过用一或多种抗原(例如黑素瘤肿瘤抗原或源自患者肿瘤的抗原)刺激来扩增细胞。
在一些实施例中，分离后立即用PTD-MYC融合多肽处理分离的免疫细胞。在其它实施例中，在用PTD-MYC融合多肽处理之前，将分离的免疫细胞储存在合适的缓冲液中并冷冻。在一些实施例中，分离后立即用PTD-MYC融合多肽处理分离的免疫细胞，并将处理的细胞储存在合适的缓冲液中并冷冻直至需要施用于患者。
在某些实施例中，使分离的免疫细胞(例如，混合群免疫细胞或分离的类型，例如肿瘤浸润淋巴细胞)与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触足以被细胞吸收的时间段。在一些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触少于约24小时，少于约23小时，少于约22小时，少于约21小时，少于约20小时，少于约19小时，少于约18小时，少于约17小时，少于约16小时，少于约15小时，少于约14小时，少于约13小时，少于约12小时，少于约11小时，少于约10小时，少于约9小时，少于约8小时，少于约7小时，少于约6小时，少于约5小时，少于约4小时，少于约3小时，少于约2小时，或少于约1小时。
在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触少于约55分钟，少于约50分钟，少于约45分钟，少于约40分钟，少于约35分钟，少于约30分钟，少于约29分钟，少于约28分钟，少于约27分钟，少于约26分钟，少于约25分钟，少于约24分钟，少于约23分钟，少于约22分钟，少于约21分钟，少于约20分钟，少于约19分钟，少于约18分钟，少于约17分钟，少于约16分钟，少于约15分钟，少于约14分钟，少于约13分钟，少于约12分钟，少于约11分钟，或少于约10分钟。在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触约1小时。
在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触24小时或更长时间。在某些实施例中，使免疫细胞与含有PTD-MYC融合多肽的组合物接触少于约12天，少于约11天，少于约10天，少于约9天，少于约8天，少于约7天，少于约6天，少于约5天，少于约4天，少于约2天，或少于约1天。
在可以与任何前述实施例组合的某些实施例中，使细胞与MYC-融合多肽以0.5μg/ml至500μg/ml、0.5μg/ml、至少0.6μg/ml、至少0.7μg/ml、至少0.8μg/ml、至少0.9μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少3μg/ml、至少4μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少7μg/ml、至少8μg/ml、至少9μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少30μg/ml、至少35μg/ml、至少40μg/ml、至少45μg/ml、至少50μg/ml、至少55μg/ml、至少60μg/ml、至少65μg/ml、至少70μg/ml、至少75μg/ml、至少80μg/ml、至少85μg/ml、至少90μg/ml、至少95μg/ml或至少100μg/ml的浓度接触。
MYC融合蛋白
在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽包含蛋白质转导结构域(PTD)、促进细胞存活或增殖中的一或多种的MYC多肽和任选的蛋白质标签结构域，例如有助于纯化融合蛋白的一或多种氨基酸序列。在一些实施例中，与MYC多肽接触的细胞表现出增加的存活时间(例如，与未与MYC接触的相同类型的相同或类似细胞相比)和/或增加的增殖(例如，与未与MYC接触的相同类型的相同或类似细胞相比)。
在一些实施例中，融合蛋白包含(a)蛋白质转导结构域；和(b)MYC多肽序列。在一些实施例中，融合肽是式(I)的肽：
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列。
在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)蛋白质转导结构域；(b)MYC多肽序列；(c)连接蛋白质转导结构域和MYC多肽序列的一或多个分子。在一些实施例中，融合肽是式(II)的肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC多肽序列，
其中-X-是连接蛋白质转导结构域和MYC多肽序列的分子。在一些实施例中，-X-是至少一个氨基酸。
在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)蛋白质转导结构域；(b)MYC多肽序列；(c)至少两个蛋白质标签；和(d)任选的连接子。在一些实施例中，融合肽是式(III-VI)的肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC多肽序列-X-蛋白质标签1-X-蛋白质标签2(式(III))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-X-蛋白质标签1-X-蛋白质标签2(式(IV))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-蛋白质标签1-X-蛋白质标签2(式(V))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-蛋白质标签1-蛋白质标签2(式(VI))，
其中-X-是连接子。在一些实施例中，-X-是一或多个氨基酸。
在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)蛋白质转导结构域；(b)MYC多肽序列；(c)6-组氨酸标签；(d)V5表位标签：和(e)任选的连接子。在一些实施例中，融合肽是式(VII-XIV)的肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC多肽序列-X-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(VII))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-X-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(VIII))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-6-组氨酸标签-X-V5表位标签(式(IX))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-6-组氨酸标签-V5表位标签(式(X))，
蛋白质转导结构域-X-MYC多肽序列-X-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XI))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-X-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XII))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-V5表位标签-X-6-组氨酸标签(式(XIII))，或
蛋白质转导结构域-MYC多肽序列-V5表位标签-6-组氨酸标签(式(XIV))，
其中-X-是连接子。在一些实施例中，-X-是一或多个氨基酸。
如上所述，在一些实施例中，MYC融合蛋白包含一或多个连接子序列。连接子序列可用于连接融合蛋白的蛋白质转导结构域、MYC多肽序列、V5表位标签和/或6-组氨酸标签。在一些实施例中，连接子包含一或多个氨基酸。在一些实施例中，连接子的氨基酸序列包含KGELNSKLE。在一些实施例中，连接子包含RTG的氨基酸序列。
蛋白质转导结构域(PTD)
在一些实施例中，MYC融合蛋白包括蛋白质转导结构域。肽转运提供了将小分子、蛋白质或核酸穿过细胞膜递送至细胞的细胞内区室的替代方案。一个非限制性实例和充分表征的蛋白质转导结构域(PTD)是TAT衍生的肽。弗兰克(Frankel)等人(参见例如美国专利第5,804,604号、美国专利第5,747,641号、美国专利第5,674,980号、美国专利第5,670,617号和美国专利第5,652,122号)证明了通过将含有TAT氨基酸48-57的肽与货物蛋白质结合，将载体蛋白质(β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)转运到细胞中。在一些实施例中，TAT包含MRKKRRQRRR的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
PTD的另一个非限制性实例是穿透素。穿透素可以将亲水性大分子运输穿过细胞膜(德罗斯(Derossi)等人，细胞生物学走向(Trends Cell Biol.)，8:84-87(1998)，其以全文引用的方式并入本文)。穿透素是16个氨基酸的肽，其对应于触角足蛋白(Antennapedia)的同源结构域的氨基酸43-58，触角足蛋白是被培养中的细胞内化的果蝇转录因子。
PTD的另一个非限制性实例是VP22。VP22是来自单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的外皮蛋白，具有将蛋白质和核酸转运穿过细胞膜的能力(艾略特(Elliot)等人，细胞(Cell)88:223-233，1997，其以全文引用的方式并入本文)。VP22的残留物267-300是必需的，但不足以进行运输。由于尚未确定负责运输功能的区域，因此整个VP22蛋白通常用于运输货物蛋白质和核酸通过细胞膜(施瓦策(Schwarze)等人，药理学走向(Trends Pharmacol Sci)，21:45-48，2000)。
在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽包括蛋白质转导结构域。作为实例但不作为限制，在一些实施例中，蛋白质转导结构域包含TAT、穿透素、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16和触角足蛋白中的一或多种的蛋白质转导结构域。在一些实施例中，蛋白质转导结构域包含TAT、穿透素、VP22、vpr和EPTD中的一或多种的蛋白质转导结构域。在一些实施例中，蛋白质转导结构域包含TAT、穿透素、VP22、vpr、EPTD、R9、R15、VP16和触角足蛋白中的至少一种的蛋白质转导结构域。在一些实施例中，蛋白质转导结构域包含合成蛋白质转导结构域(例如，聚精氨酸或PTD-5)。在特定实施例中，蛋白质转导结构域包含TAT蛋白质转导结构域。在一些实施例中，蛋白质转导结构域与MYC多肽共价连接。在一些实施例中，蛋白质转导结构域通过肽键与MYC多肽连接。在一些实施例中，蛋白质转导结构域通过连接子序列与MYC多肽连接。在一些实施例中，连接子包含短氨基酸序列。作为实例，但不作为限制，在一些实施例中，连接子序列的长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。
本技术的MYC融合蛋白可以以任何所需的顺序排列。例如，在一些实施例中，MYC融合蛋白可以按以下顺序排列：a)与MYC多肽框内连接的蛋白质转导结构域，b)与V5结构域框内连接的MYC多肽，和c)与6-组氨酸表位标签框内连接的V5结构域。在一些实施例中，MYC融合蛋白具有以下一系列组分：a)与蛋白质转导结构域框内连接的MYC多肽，b)与V5结构域框内连接的蛋白质转导结构域，和c)与6-组氨酸表位标签框内连接的V5结构域。在一些实施例中，可以在每个序列之间包括另外的氨基酸序列。在一些实施例中，可以在多肽序列的起始和/或末端包括另外的氨基酸。
在一些实施例中，蛋白质转导结构域是TAT蛋白质转导结构域。在一些实施例中，蛋白质转导结构域是TAT[48-57]。在一些实施例中，蛋白质转导结构域是TAT[57-48]。
蛋白质标签结构域
在一些实施例中，MYC融合蛋白包含蛋白质标签结构域，其包含促进融合蛋白纯化的一或多个氨基酸序列。在一些实施例中，蛋白质标签结构域包含多组氨酸标签和表位标签中的一或多种。作为实例，但不作为限制，示例性标签包括V5、组氨酸标签(例如、6-组氨酸标签)、HA(血凝素)标签、FLAG标签、CBP(钙调蛋白结合肽)、CYD(共价但可解离的NorpD肽)、StrepII或HPC(蛋白C的重链)中的一或多种。在一些实施例中，蛋白质标签结构域包含长度为约10至20个的氨基酸。在一些实施例中，蛋白质标签结构域包含长度为2至40个的氨基酸，例如长度为6至20个的氨基酸。在一些实施例中，上述两个标签(例如，V5和HIS-标签)一起使用以形成蛋白质标签结构域。
在一些实施例中，组氨酸标签是6-组氨酸标签。在一些实施例中，组氨酸标签包含序列HHHHHH(SEQ ID NO:8)。在一些实施例中，本文公开的融合肽包含V5表位标签。在一些实施例中，V5标签包含GKPIPNPLLGLDST(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列。在一些实施例中，V5标签包含IPNPLLGLD(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。
可以通过任何合适的方法将蛋白质标签添加到本文公开的融合蛋白中。作为实例，但不作为限制，在一些实施例中，将TAT-MYC多肽序列克隆到编码一或多种蛋白质标签(例如，聚组氨酸-标签和/或V5标签)的表达载体中。在一些实施例中，通过PCR添加多组氨酸标签和/或V5标签(即，PCR引物包含多组氨酸序列和/或V5序列)。
PTD-MYC融合多肽的构建
本文公开的PTD-MYC融合多肽(例如，TAT-MYC融合多肽)可以通过本领域熟知的方法构建。作为实例，但不作为限制，可以通过PCR产生编码TAT-MYC融合多肽的核苷酸序列。在一些实施例中，人MYC序列的正向引物包含TAT蛋白转导结构域的框内N-末端9-氨基酸序列(例如，RKKRRQRRR)。在一些实施例中，设计用于人MYC序列的反向引物以去除终止密码子。在一些实施例中，将PCR产物克隆到任何合适的表达载体中。在一些实施例中，表达载体包含多组氨酸标签和V5标签。
在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)TAT和(b)c-MYC。在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)TAT[48-57]和(b)c-MYC。在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)TAT[57-48]和(b)c-MYC。
在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)TAT，(b)c-MYC，(c)连接子，(d)V5标签和(e)6-组氨酸标签。在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)TAT[48-57]，(b)c-MYC，(c)连接子，(d)V5标签和(e)6-组氨酸标签。在一些实施例中，本文公开的融合肽包含(a)TAT[57-48]，(b)c-MYC，(c)连接子，(d)V5标签和(e)6-组氨酸标签。
在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽包含SEQ ID NO:1；在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽是SEQ ID NO:1。
MRKKRRQRRRPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRKGELNSKLEGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHH(SEQ ID NO:1)。
可以在合成期间或之后修饰融合蛋白以包括一或多个官能团。作为实例但不作为限制，可以将蛋白质修饰为包括乙酰基、磷酸根、乙酸根、酰胺基、烷基和/或甲基中的一或多种。这个列表不是详尽的，仅是示例性的。在一些实施例中，蛋白质包括至少一个乙酰基。
PTD-MYC融合多肽可以通过本领域已知的任何合适的方法产生，例如，通过在例如细菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞的细胞中的重组蛋白质表达。在一些实施例中，通过微生物发酵重组产生PTD-MYC融合多肽。在一些实施例中，微生物发酵在约1至约10,000升的发酵体积中进行，例如，发酵体积为约10至约1000升。发酵可以利用任何合适的微生物宿主细胞和培养基。在示例性实施例中，大肠杆菌用作微生物宿主细胞。在替代实施例中，可以使用其它微生物，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、毕赤酵母(P.pastoris)、乳杆菌(Lactobacilli)、杆菌(Bacilli)和曲霉菌(Aspergilli)。在一个示例性实施例中，微生物宿主细胞是BL-21StarTM大肠杆菌菌株(英杰(Invitrogen))。在一个示例性实施例中，微生物宿主细胞是BLR DE3大肠杆菌菌株。
在一些实施例中，修饰宿主细胞以提供稀有密码子的tRNA，其用于克服宿主微生物细胞密码子偏倚以改善被表达的蛋白质的翻译。在示例性实施例中，用例如pRARE(CamR)的质粒转化宿主细胞(例如大肠杆菌)，其表达AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA密码子的tRNA。另外，用于为特定密码子提供tRNA的合适的质粒或构建体是本领域已知的，并且可以用于所提供的方法中。
整合载体或自我复制载体可用于将PTD-MYC融合多肽表达盒引入所选宿主细胞中。在表达盒中，PTD-MYC融合多肽的编码序列与例如诱导型启动子的启动子可操作地连接。诱导型启动子是响应于培养条件的某些变化(例如，营养物的存在或不存在或温度的变化)在其控制下启动来自DNA的增加的转录水平的启动子。在一些实施例中，编码PTD-MYC融合多肽的核酸经密码子优化用于细菌表达。
被各种潜在宿主细胞识别的示例性启动子是众所周知的。通过限制酶消化从源DNA(如果存在)去除启动子并将分离的启动子序列插入载体中，这些启动子可以与编码PTD-MYC融合多肽的DNA可操作地连接。适用于微生物宿主的启动子包括但不限于β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(张(Chang)等人,(1978)自然(Nature)，275:617-624；古德尔(Goeddel)等人,(1979)自然，281：544)、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(古德尔(1980)核酸研究(Nucleic Acids Res.)8：4057；EP 36,776)和杂合启动子如tac启动子(德波尔(deBoer)等人,(1983)美国科学院院报USA 80：21-25)。可以使用适合所选宿主细胞表达的任何启动子。公开了合适的核苷酸序列，从而使技术人员使用连接子或适配子(adaptor)可操作地将它们与编码PTD-MYC融合多肽的DNA连接(参见例如赛本李斯特(Siebenlist)等人,(1980)细胞(Cell)20：269)以提供任何所需的限制位点。在示例性实施例中，用于细菌系统的启动子可含有与编码序列可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。在一些实施例中，诱导型启动子是lacZ启动子，其用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，如本领域所熟知的。启动子和表达盒也可以使用众所周知的合成目的DNA序列的技术从头合成。在一个示例性实施例中，用于在本文中表达PTD-MYC融合多肽的表达载体是pET101/D-Topo(英杰)。
为了表达PTD-MYC融合多肽，含有编码PTD-MYC融合多肽的表达载体的微生物宿主通常在发酵反应器中生长至高密度。在一些实施例中，反应器具有受控的葡萄糖进料。在一些实施例中，首先在补充有抗生素的培养基中培养发酵罐接种物(例如，过夜培养物)。然后将发酵罐接种物用于接种发酵罐培养物以表达蛋白质。在发酵罐培养物的OD600为至少约15，通常至少约20、至少25、至少约30或更高时，诱导重组蛋白的表达。在其中诱导型启动子是lacZ启动子的示例性实施例中，将IPTG添加到发酵培养基中以诱导PTD-MYC融合多肽的表达。通常，IPTG在代表对数生长期的OD600时添加到发酵罐培养物中。
在所提供的方法的某些实施例中，诱导的蛋白质表达在诱导后维持约2至约5小时，并且可以在诱导后维持约2至约3小时。由于重组蛋白的降解，可能不期望更长的诱导期。诱导期间反应混合物的温度优选为约28℃至约37℃，通常为约30℃至约37℃。在特定实施例中，诱导在约37℃进行。
PTD-MYC融合多肽通常在微生物细胞中表达为胞质包涵体。为了收获包涵体，在诱导后通过离心发酵培养物来收集细胞沉淀，将其在-70℃或更低温度下冷冻，解冻并重悬于破碎缓冲液中。通过例如超声处理、均质化等常规方法裂解细胞。然后将裂解物重悬于增溶缓冲液中，通常在尿素存在下以有效溶解蛋白质的浓度，例如，从约5M、6M、7M、8M、9M或更高。重悬可能需要机械地将沉淀破碎并搅拌以实现均匀性。在一些实施例中，将细胞沉淀直接重悬于尿素缓冲液中并混合至均质。在一些实施例中，重悬/增溶缓冲液是8M尿素、50mM磷酸盐pH 7.5，并使悬浮液通过均化器。
在一些实施例中，均化的悬浮液是磺酰化的。例如，在一些实施例中，调节均化的悬浮液以包括200mM亚硫酸钠和10mM连四硫酸钠。然后将溶液在室温下混合直至均匀。然后将混合的裂解物再混合一段时间以完成磺酰化(例如，在2-8℃下≥12小时)。然后将磺酰化的裂解物离心1小时。然后通过离心收集含有磺酰化的PTD-MYC融合多肽的上清液，并弃去细胞沉淀。然后将上清液通过过滤器，例如0.22μm膜过滤器以澄清裂解物。
然后纯化溶解的蛋白质。纯化方法可包括亲和色谱、反相色谱、凝胶排阻色谱等。在一些实施例中，使用亲和色谱。例如，蛋白质具有表位标签或组氨酸6标签，以便于纯化。在本方法中，示例性PTD-MYC融合多肽包含组氨酸6标签，用于使用Ni-树脂的Ni亲和色谱进行纯化。
在示例性实施例中，Ni-树脂柱在含有尿素的缓冲液中平衡。在一些实施例中，平衡缓冲液是6M尿素、50mM磷酸盐、500mM NaCl和10％甘油溶液。然后将包含PTD-MYC融合多肽的磺酰化和澄清的上清液上样到Ni-树脂柱上。然后用洗涤缓冲液(例如6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油、500mM NaCl，pH7.5)洗涤柱。然后用盐浓度降低的连续洗涤缓冲液洗涤柱。例如，示例性的后续洗涤可包括6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油和2M NaCl、pH 7.5，然后用6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油、50mM NaCl和30mM咪唑、pH 7.5再洗涤。
在顺序施用洗涤缓冲液后，通过添加具有100到300mM咪唑的梯度的洗脱缓冲液(例如6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油和50mM NaCl，pH 7.5)并收集级分，从柱上洗脱PTD-MYC融合多肽。然后将待合并的含蛋白质级分(protein containing fractions)通过0.22μm膜过滤。蛋白质产量的评估可以使用任何合适的方法测量，例如，在UV波长280下的分光光度法。
在一些实施例中，可以使用一或多种另外的纯化方法来进一步纯化分离的PTD-MYC融合多肽。在示例性实施例中，使用Q-Sepharose树脂通过阴离子交换色谱进一步纯化来自Ni-Sepharose色谱步骤的合并级分。在一些实施例中，通过用来自NiSepharose色谱步骤的第二洗涤缓冲液(例如6M尿素、50mM磷酸盐、10％甘油、2M NaCl，pH 7.5)将样品稀释到Q sepharose缓冲液的传导性(17.52+/-1mS/cm)来制备用于加样到Q-Sepharose柱上的池(pool)。然后将稀释的池加样到Q-Sepharose柱上，接着使用追踪缓冲液(例如，6M尿素、50mM磷酸盐、300mM NaCl和10％甘油)进行两个追踪步骤，进一步连续施用追踪缓冲液直至UV痕迹达到基线，表明蛋白质已从柱中洗脱出来。
治疗方法
施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞用于治疗患者的黑素瘤。在一些实施例中，患者具有转移性黑素瘤。在一些实施例中，患者在施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞之前已接受一或多种用于治疗黑素瘤的药剂。在一些实施例中，黑素瘤是复发性或难治性黑素瘤。在一些实施例中，黑素瘤是转移性黑素瘤。在一些实施例中，黑素瘤是浅表扩散性黑素瘤、结节性黑素瘤、雀斑样痣性黑素瘤或肢端黑素瘤。在一些实施例中，黑素瘤对一或多种用于治疗黑素瘤的药剂具有抗性。
在一些实施例中，施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞抑制黑素瘤肿瘤的生长或减小黑素瘤肿瘤的体积。在一些实施例中，向患有黑素瘤的受试者施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞减轻了黑素瘤的一或多种症状。在一些实施例中，将PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞施用于患有黑素瘤的受试者增加了受试者的总体存活。在一些实施例中，将PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞施用于患有黑素瘤的受试者增加了黑素瘤的消退。
根据本文提供的方法施用PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞(例如PTD-MYC融合多肽处理的肿瘤浸润淋巴细胞)可以以任何合适的方式进行以用于向受试者施用细胞，包括但不限于注射、输血、植入或移植。在一些实施例中，将PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞经皮下、皮内、肿瘤内、结内、髓内、肌肉内、鞘内、通过静脉内或淋巴内注射或腹膜内施用于患者。在一些实施例中，将PTD-MYC融合多肽免疫细胞施用到通过切除肿瘤组织形成的腔中(即腔内递送)，或在切除之前直接施用到肿瘤中(即肿瘤内递送)。在一个实施例中，MYC-融合多肽-免疫细胞通过静脉内注射施用。
除了PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞之外，用于施用的组合物可以包含任何其它试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、防腐剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂，和/或通常在相应产品中找到的任何组分。选择合适的成分和适当的制造方法，用于配制用于本领域通常已知的特定施用途径的组合物。
包含PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞的过继细胞治疗组合物可以是适于施用的任何形式，例如固体、半固体或液体形式。调配物可选自由溶液、乳液、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊组成的群组，但不限于它们。组合物不限于某种调配物，而是可以将组合物配制成任何已知的药学上可接受的调配物。药物组合物可通过本领域已知的任何常规方法生产。
在一些实施例中，MYC-融合多肽修饰的免疫细胞的施用包含每千克体重施用104-1010个细胞，包括每千克体重105至106个细胞，包括这些范围内的所有单元数的整数值。在一些实施例中，在有或没有淋巴细胞消除过程，例如使用环磷酰胺的情况下施用细胞。
MYC-融合多肽修饰的免疫细胞可以以一个或多个剂量施用。在一个实施例中，治疗有效量的PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞以单剂量施用。在一些实施例中，施用单剂量的PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞具有治疗效果。在另一个实施例中，有效量的MYC-融合多肽修饰的免疫细胞在一段时间内作为多于一个剂量施用。施用时间在主治医师的判断范围内并且取决于各种因素，包括但不限于患者的年龄、性别或临床状况以及黑素瘤的特征，包括黑素瘤的类型、程度或位置。虽然个体需求有所不同，但用于治疗特定疾病或病症的MYC-融合多肽修饰的免疫细胞的有效量的最佳范围的确定在本领域技术人员的技能范围内。
PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞可以在前2周、3周、4周、每月或在治疗期间施用例如1至10次。在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞施用2、3、4、5、6、7、8、9或10次。在一些实施例中，PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞每周、每2周、每3周或每月施用。
治疗有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量取决于接受者的年龄、健康和体重、同时治疗的种类(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。
在一些实施例中，首先用一或多种细胞因子和/或其它免疫调节剂预处理接受PTD-MYC修饰的免疫细胞的患者。在一些实施例中，在施用PTD-MYC修饰的免疫细胞之前，将接受PTD-MYC修饰的免疫细胞的患者清除淋巴细胞。淋巴细胞清除的目的是为输注的淋巴细胞腾出空间，特别是通过消除调节性T细胞和竞争稳态细胞因子的其它非特异性T细胞。
在一些实施例中，PTD-MYC修饰的免疫细胞与另外的治疗剂一起施用。在一些实施例中，在用PTD-MYC修饰的免疫细胞治疗之前、同时、间歇地或之后施用另外的治疗剂。在一些实施例中，另外的治疗剂是免疫调节剂，例如白细胞介素(例如IL-2、IL-7、IL-12)、细胞因子、趋化因子或/和免疫调节药物。在一些实施例中，细胞因子选自选自由干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、IL-2、TNFα、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5(＝RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7和XCL2组成的群组的细胞因子。在一些实施例中，另外的治疗剂是抗癌剂，例如化学疗法或放射疗法。
在一些实施例中，所施用的用于治疗黑素瘤的经修饰的免疫细胞是具有遗传修饰的抗原受体的T细胞，包括嵌合抗原受体(CAR)-T细胞。例如，通过改变T细胞受体(TCR)的特异性，例如通过引入具有所选肽特异性的新TCRα和β链，可以采用各种策略来遗传修饰T细胞(参见例如美国专利第8,697,854号；PCT专利出版物：WO2003020763、WO2004033685、WO2004044004、WO2005114215、WO2006000830、WO2008038002、WO2008039818、WO2004074322、WO2005113595、WO2006125962、WO2013166321、WO2013039889、WO2014018863、WO2014083173；美国专利第8,088,379号)。嵌合抗原受体(CAR)可用于产生对选定靶标(例如恶性细胞)具有特异性的免疫应答细胞，例如T细胞，已经描述了多种受体嵌合体构建体(参见例如美国专利第5,843,728；5,851,828；5,912,170；6,004,811；6,284,240；6,392,013；6,410,014；6,753,162；8,211,422号；和PCT公开WO9215322)。制备CAR T细胞的方法是本领域已知的，并且可以与本文提供的方法组合使用以产生包含如本文所述的MYC融合多肽(例如PTD)的被修饰的CAR T细胞。
通常，CAR由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域构成，其中细胞外结构域包含对预定靶标特异的抗原结合结构域。虽然CAR的抗原结合结构域通常是抗体或抗体片段(例如，单链可变片段scFv)，但结合结构域不受特别限制，只要其导致靶标的特异性识别即可。例如，在一些实施例中，抗原结合结构域可包含受体，使得CAR能够结合受体的配体。或者，抗原结合结构域可包含配体，使得CAR能够结合所述配体的内源受体。
在一些实施例中，通过与γ-照射的活化和增殖细胞(AaPC)共培养来选择表达所需CAR的T细胞，AaPC共表达黑素瘤抗原和共刺激分子。在一些实施例中，扩增工程化的CART细胞，例如通过在可溶性因子如IL-2和IL-21存在下在AaPC上共培养。例如，可以执行此扩增以便提供记忆CAR+T单元。以这种方式，可以提供对携带抗原的肿瘤具有特异性细胞毒活性的CAR T细胞(任选地与产生所需趋化因子如干扰素-γ一起)。
在一些实施例中，使CAR T细胞与本文提供的PTD-MYC融合多肽体外接触，以产生用于治疗黑素瘤的被修饰的CAR T细胞。被修饰的CAR T细胞可以根据任何合适的方法施用，包括施用如上所述的PTD-MYC融合多肽修饰的免疫细胞的方法。
试剂盒
包含本文提供的MYC-融合多肽和/或MYC-融合多肽修饰的免疫细胞的药物组合物可以组装到用于治疗黑素瘤的试剂盒或药物系统中。根据此实施例的试剂盒可包含载体装置，例如盒子、纸盒、管，其中紧密限制一或多个容器，例如小瓶、管，安瓿、瓶子、注射器或袋子。试剂盒还可以包含关于使用MYC-融合多肽和/或MYC-融合多肽修饰的免疫细胞的相关说明书。
在一些实施例中，试剂盒包含有效量的过继细胞疗法，例如MYC-融合多肽修饰的免疫细胞。在一些实施例中，试剂盒包含一或多种用于检测施用的MYC-融合多肽和/或MYC-融合多肽修饰的免疫细胞的试剂。在一些实施例中，试剂盒包含用于用本文提供的MYC-融合多肽治疗的细胞，例如，造血干细胞、供体白细胞、T细胞或NK细胞。在一些实施例中，试剂盒还包含有效量的治疗剂，以与本文提供的MYC-融合多肽和/或MYC-融合多肽修饰的免疫细胞组合施用。在一些实施例中，治疗剂是抗癌剂。
本文提供的试剂盒还可包括用于向受试者施用本文提供的MYC-融合多肽和/或MYC-融合多肽修饰的免疫细胞的装置。本领域已知的用于向受试者施用多肽和细胞的多种装置中的任何一种都可以包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射，但不限于皮下注射针、静脉注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，例如眼药水滴管。通常，用于施用试剂盒的MYC-融合多肽和/或MYC-融合多肽修饰的免疫细胞的装置将与所需的组合物施用方法相容。例如，欲静脉内递送的组合物可以包括在具有皮下注射针和注射器的试剂盒中。
实例
实例1.用TAT-MYC处理的免疫细胞产生TAT-MYC处理的淋巴细胞以用于黑素瘤肿瘤的免疫疗法
在此实例中，检测了包含HIV-1反式活化蛋白(TAT)和MYC的蛋白质转导结构域的PTD-MYC融合多肽在体内调节针对黑素瘤细胞的免疫应答的能力。具体地，研究了来自携带黑素瘤的小鼠并用TAT-MYC处理的淋巴样细胞治疗携带黑素瘤肿瘤的小鼠的能力。这些研究的目的是确定来自携带黑素瘤的小鼠并用TAT-MYC处理以产生TAT-MYC淋巴细胞的免疫细胞在移植到携带黑素瘤的小鼠中时是否是黑素瘤肿瘤的有效治疗。
材料和方法
C57BL/6J是最广泛使用的近交系，并且是第一个对其进行基因组测序的。虽然这种品系对许多肿瘤是难治的，但它是大多数突变的最大表达的允许背景。C57BL/6J小鼠对听源性癫痫发作具有抗性，具有相对低的骨密度，并且发展出与年龄相关的听力损失。它们还容易发生饮食诱导的肥胖、2型糖尿病和动脉粥样硬化。来自此品系的巨噬细胞对炭疽致死毒素的作用具有抗性。
治疗组
产生15只重约25g并且携带黑素瘤肿瘤的C57BL/6小鼠(杰克逊实验室(JacksonLaboratory)物料编号000664)并分成3组，每组5只动物，一组小鼠作为无治疗对照，一组用来自携带肿瘤的小鼠的淋巴样细胞治疗并用对照TAT-融合蛋白治疗，还有一组用TAT-MYC淋巴细胞治疗。
携带肿瘤的供体小鼠的产生和供体细胞的制备
用于植入的B16-F10黑素瘤细胞(ATCC CRL 6475，小鼠皮肤黑素瘤)在D10培养基(DMEM，10％FBS，Pen/Strep(10,000单位/毫升)(Gibco目录号15140)；L-谷氨酰胺(200mM)(Gibco目录号25030)；MEM非必需氨基酸(Gibco目录号11140)中培养。
通过尾静脉注射对C57BL/6j小鼠(杰克逊实验室，编号003548)植入在250μL PBS中的1×104个B16-F10黑素瘤细胞。在注射之前，将每只测试小鼠置于250W加热灯下1-2分钟，然后静脉内注射黑素瘤细胞。在移植后14天，收获来自注射小鼠的淋巴结并用10mL注射器的柱塞研磨。
对于第一项研究，从5只小鼠收获淋巴结。对于第二项研究，从10只小鼠收获淋巴结。用C10洗涤细胞，收集并以260×g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于10mL无菌TAC中，以260×g离心5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于2mL含有5％BSA的无菌过滤的PBS中。
将淋巴结细胞用TAT-MYC处理以产生TAT-MYC淋巴细胞，或用对照TAT-融合蛋白处理。将细胞分到2个15mL锥形管(每个1mL)中，用1mL的25μg/ml对照蛋白(用于实验1的是TAT-CRE，用于实验2的是TAT-GFP)或1mL的25μg/ml TAT-MYC lot C18处理。室温孵育1小时后，将每个管用无菌PBS洗涤三次，转移到5mL无菌管中并置于冰上。
对于每组5只C57BL/6j小鼠，通过将250μL PBS中的1×104个B16-F10黑素瘤细胞注射到尾静脉中来制备测试小鼠。注射后，每天观察一次小鼠。监测体重、食物消耗、活动和死亡率的变化。在移植后第7天，将TAT-MYC淋巴细胞或对照淋巴样细胞移植到注射黑素瘤细胞的小鼠中。
每天监测症状。当出现严重症状并记录死亡时，对小鼠实施安乐死。发现小鼠死亡，或者如果发现有严重症状，如呼吸困难、驼背和不动，则实施安乐死。在处理当天记录死亡日为第0天。
实验1和2的结果分别显示在图1和2中。如图所示，与移植用对照TAT-融合蛋白处理的淋巴样细胞相比，用通过将来自携带黑素瘤的小鼠淋巴样细胞与TAT-MYC接触而产生的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)处理携带黑素瘤的小鼠显著提高了小鼠的总体存活率。这些结果表明，免疫细胞的TAT-MYC处理可用于使用过继细胞转移来治疗黑素瘤。
实例2.TAT-MYC处理的淋巴细胞对黑素瘤肿瘤免疫治疗的剂量应答效应
在这个实例中，检查了施用不同量的TAT-MYC处理的淋巴细胞对黑素瘤肿瘤的免疫治疗的治疗效果。除了注射和比较几种不同剂量的TAT-MYC处理的淋巴细胞外，如上文实例1中所述进行这个实验。进行了两个实验。在第一个实验(实验3)中，根据以下给药组，通过尾静脉注射对携带黑素瘤的小鼠施用TAT-MYC淋巴细胞：3.0×106个细胞/kg、6.0×106个细胞/kg、14.0×106个细胞/kg和70.0×106个细胞/kg。对于对照组，对小鼠施用70.0×106个TAT-Cre处理细胞或无细胞(NT)。在第二个实验(实验4)中，根据以下给药组，通过尾静脉注射对携带黑素瘤的小鼠施用TAT-MYC淋巴细胞：4.0×103个细胞/kg、4.0×104个细胞/kg、4.0×105个细胞/kg、4.0×106个细胞/kg和4.0×107个细胞/kg。对于对照组，对小鼠施用4.0×106个TAT-Cre处理细胞或无细胞(NT)。实验3和4的结果分别显示在图3和4中。如图所示，用增加量的TAT-MYC淋巴细胞(TBX-3400)处理携带黑素瘤的小鼠导致两个实验中总体存活率显著提高。这些实验证明了TAT-MYC淋巴细胞用于治疗携带黑素瘤的受试者的再现性和功效两者。
虽然本文已经显示和描述了本公开的优选实施例，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施例仅以举例的方式提供。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文所述的本公开的实施例的各种替代方案可以用于实践本公开。以下权利要求旨在限定本公开的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物均以全文引用的方式并入本文，包括所有附图和表格，只要它们与本说明书的明确教导不矛盾。
在以下权利要求中阐述了其它实施例。

Claims (86)

1.一种组合物，其包含：
(a)MYC融合肽，其包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；和
(b)从患有黑素瘤肿瘤的供体受试者分离的一或多种原代免疫细胞，其中所述一或多种原代免疫细胞对黑素瘤特异性抗原有反应性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述MYC融合肽易位到所述一或多种原代免疫细胞的细胞核中。
3.根据权利要求1至2中任一权利要求所述的组合物，其中所述MYC融合肽展现MYC的生物活性。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的组合物，其中所述MYC融合肽进一步包含一或多种连接所述蛋白质转导结构域和所述MYC多肽的分子。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的组合物，其中所述MYC融合肽包含具有以下一般结构的MYC融合肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC序列，
其中-X-为连接所述蛋白质转导结构域和所述MYC序列的分子。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的组合物，其中所述蛋白质转导结构域序列为TAT蛋白质转导结构域序列。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述TAT蛋白质转导结构域序列选自由TAT[48-57]和TAT[57-48]组成的群组。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的组合物，其中所述MYC融合肽包含SEQ IDNO:1。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的组合物，其中所述MYC融合肽被乙酰化。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多种免疫细胞具有针对黑素瘤细胞的抗肿瘤活性。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多种免疫细胞包含一或多种淋巴细胞。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述一或多种淋巴细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞或其任何组合。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述T细胞选自由以下组成的群组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无反应性T细胞、耐受性T细胞、嵌合T细胞和抗原特异性T细胞。
14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述B细胞选自由以下组成的群组：原初B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受性B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。
15.根据权利要求11至14中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多种淋巴细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞、经T细胞受体修饰的淋巴细胞或经嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述肿瘤浸润性淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-标签、CD8+CD25+标签或CD4+CD25+标签。
17.根据权利要求1至16中任一权利要求所述的组合物，其中所述一或多种免疫细胞包含可检测部分。
18.一种用于治疗受试者中的黑素瘤的方法，其包含向有需要的所述受试者施用一或多种经修饰的免疫细胞，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞包含MYC融合肽并且对肿瘤特异性抗原有反应性，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞来源于从所述受试者分离的原代免疫细胞。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞来源于从患有相同类型的黑素瘤的单独供体受试者分离的原代免疫细胞。
21.根据权利要求19至20中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞是通过在分离之后使所述原代免疫细胞与所述MYC融合肽体外接触来制备。
22.根据权利要求19至21中任一权利要求所述的方法，其进一步包含在与所述MYC融合肽接触之前，体外扩增所述原代免疫细胞。
23.根据权利要求19至21中任一权利要求所述的方法，其进一步包含在与所述MYC融合肽接触之后，扩增所述原代免疫细胞。
24.根据权利要求22至23中任一权利要求所述的方法，其中使用抗CD3抗体扩增所述细胞。
25.根据权利要求22至24中任一权利要求所述的方法，其中使用经照射的同种异体饲养细胞扩增所述细胞。
26.根据权利要求22至25中任一权利要求所述的方法，其中在外源性细胞因子存在下扩增所述细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述细胞因子为白介素-2。
28.根据权利要求18至27中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽易位到所述免疫细胞的细胞核中。
29.根据权利要求18至28中任一权利要求所述的方法，其中MYC融合肽展现MYC的生物活性。
30.根据权利要求18至29中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽进一步包含一或多种连接所述蛋白质转导结构域和所述MYC多肽的分子。
31.根据权利要求18至30中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽包含具有以下一般结构的MYC融合肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC序列，
其中-X-为连接所述蛋白质转导结构域和所述MYC序列的分子。
32.根据权利要求18至31中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质转导结构域序列为TAT蛋白质转导结构域序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述TAT蛋白质转导结构域序列选自由TAT[48-57]和TAT[57-48]组成的群组。
34.根据权利要求18至33中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽包含SEQ IDNO:1。
35.根据权利要求18至34中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽被乙酰化。
36.根据权利要求18至35中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞具有针对所述受试者中的黑素瘤细胞的抗肿瘤活性。
37.根据权利要求18至36中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞包含一或多种无反应性免疫细胞。
38.根据权利要求18至37中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种免疫细胞包含一或多种淋巴细胞。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述一或多种淋巴细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞或其任何组合。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的群组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无反应性T细胞、耐受性T细胞、嵌合T细胞和抗原特异性T细胞。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述B细胞选自由以下组成的群组：原初B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受性B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述一或多种淋巴细胞包含肿瘤浸润性淋巴细胞、经T细胞受体修饰的淋巴细胞或经嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-标签、CD8+CD25+标签或CD4+CD25+标签。
44.根据权利要求19至43中任一权利要求所述的方法，其中方法进一步包含从所述供体受试者分离所述原代免疫细胞。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述供体受试者患有黑素瘤。
46.根据权利要求18至45中任一权利要求所述的方法，其中静脉内、腹膜内、皮下、肌内或瘤内施用所述一或多种经修饰的免疫细胞。
47.根据权利要求18至46中任一权利要求所述的方法，其进一步包含在施用所述一或多种经修饰的免疫细胞之前对所述受试者进行淋巴细胞清除。
48.根据权利要求18至47中任一权利要求所述的方法，其进一步包含向所述受试者施用细胞因子。
49.根据权利要求48所述的方法，其中在施用所述一或多种经修饰的免疫细胞之前、期间或之后施用所述细胞因子。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中所述细胞因子选自由以下组成的群组：干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、IL-2、TNFα、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7和XCL2。
51.根据权利要求18至50中任一权利要求所述的方法，其中所述黑素瘤为转移性的。
52.根据权利要求18至51中任一权利要求所述的方法，其中所述受试者为人或动物。
53.根据权利要求18至52中任一权利要求所述的方法，其进一步包含施用其它癌症疗法。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述其它癌症疗法选自化疗、放疗、免疫疗法、单克隆抗体、抗癌核酸或蛋白质、抗癌病毒或微生物及其任何组合。
55.根据权利要求18至54中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞包含可检测部分。
56.一种制备用于黑素瘤疗法的经修饰的免疫细胞的方法，其包含使一或多种免疫细胞与MYC融合多肽体外接触，其中所述免疫细胞来自已暴露于一或多种肿瘤抗原的供体并且对肿瘤特异性抗原有反应性，并且其中所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞来源于从患有黑素瘤的受试者分离的原代免疫细胞。
58.根据权利要求55至56中任一权利要求所述的方法，其进一步包含在与所述MYC融合肽接触之前，体外扩增所述原代免疫细胞。
59.根据权利要求55至57中任一权利要求所述的方法，其进一步包含在与所述MYC融合肽接触之后，扩增所述原代免疫细胞。
60.根据权利要求55至59中任一权利要求所述的方法，其中使用抗CD3抗体扩增所述细胞。
61.根据权利要求55至60中任一权利要求所述的方法，其中使用经照射的同种异体饲养细胞扩增所述细胞。
62.根据权利要求55至61中任一权利要求所述的方法，其中在外源性细胞因子存在下扩增所述细胞。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞因子为白介素-2。
64.根据权利要求55至63中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽易位到所述免疫细胞的细胞核中。
65.根据权利要求55至64中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽展现MYC的生物活性。
66.根据权利要求55至65中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽进一步包含一或多种连接所述蛋白质转导结构域和所述MYC多肽的分子。
67.根据权利要求55至66中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽包含具有以下一般结构的MYC融合肽：
蛋白质转导结构域-X-MYC序列，
其中-X-为连接所述蛋白质转导结构域和所述MYC序列的分子。
68.根据权利要求55至67中任一权利要求所述的方法，其中所述蛋白质转导结构域序列为TAT蛋白质转导结构域序列。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述TAT蛋白质转导结构域序列选自由TAT[48-57]和TAT[57-48]组成的群组。
70.根据权利要求55至69中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽包含SEQ IDNO:1。
71.根据权利要求55至70中任一权利要求所述的方法，其中所述MYC融合肽被乙酰化。
72.根据权利要求55至71中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞具有抗肿瘤活性。
73.根据权利要求55至72中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞具有针对所述受试者中的黑素瘤细胞的抗肿瘤活性。
74.根据权利要求55至73中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种经修饰的免疫细胞包含一或多种无反应性免疫细胞。
75.根据权利要求55至74中任一权利要求所述的方法，其中所述一或多种免疫细胞包含一或多种淋巴细胞。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述一或多种淋巴细胞包含T细胞、B细胞、NK或其任何组合。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述T细胞选自由以下组成的群组：原初T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、记忆T细胞、活化T细胞、无反应性T细胞、耐受性T细胞、嵌合T细胞和抗原特异性T细胞。
78.根据权利要求76所述的方法，其中所述B细胞选自由以下组成的群组：原初B细胞、血浆B细胞、活化B细胞、记忆B细胞、无反应性B细胞、耐受性B细胞、嵌合B细胞和抗原特异性B细胞。
79.根据权利要求75所述的方法，其中所述一或多种淋巴细胞包含肿瘤浸润性淋巴细胞、经T细胞受体修饰的淋巴细胞或经嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞。
80.根据权利要求75所述的方法，其中所述淋巴细胞具有CD8+CD28-CD152-标签、CD8+CD25+标签或CD4+CD25+标签。
81.一种增加过继细胞疗法或T细胞疗法在受试者中的功效的方法，其包含施用根据权利要求1至17中任一权利要求所述的组合物。
82.根据权利要求1至17中任一权利要求所述的组合物，其用于治疗黑素瘤。
83.一种肿瘤浸润性淋巴细胞，其包含MYC融合肽，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。
84.一种淋巴细胞，其包含嵌合抗原受体和MYC融合肽，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列。
85.一种制备用于过继细胞疗法的组合物的方法，其包含使一或多种原代免疫细胞与MYC融合肽接触，所述MYC融合肽包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列，其中一或多种原代免疫细胞是从患有黑素瘤的患者分离，并且其中一或多种原代免疫细胞对黑素瘤特异性抗原有反应性。
86.一种组合物，其包含：
(a)一或多种经分离的原代免疫细胞，其已暴露于黑素瘤细胞系；和
(b)MYC融合肽，其包含(i)蛋白质转导结构域；(ii)MYC多肽序列；
其中所述一或多种原代免疫细胞对黑素瘤特异性抗原有反应性。
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