ES2905757T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento del melanoma - Google Patents

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Abstract

Una composición para su uso en terapia celular adoptiva para el tratamiento de un melanoma, en donde la composición comprende: (a) un péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas, opcionalmente una secuencia de dominio de transducción de proteínas TAT; (ii) una secuencia de polipéptido MYC; y (b) una o más células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto donante que tiene un tumor de melanoma, en donde la una o más células inmunitarias primarias son reactivas contra un antígeno específico de melanoma.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para el tratamiento del melanoma
Antecedentes de la invención
La transferencia celular adoptiva (ACT, por sus siglas en inglés) es una forma de inmunoterapia que implica la transferencia de células inmunitarias con actividad antitumoral a los pacientes. La ACT generalmente implica el aislamiento de linfocitos con actividad antitumoral de un paciente, el cultivo de linfocitos in vitro para expandir la población y después la infusión de los linfocitos en el hospedador portador de cáncer. Los linfocitos utilizados para la transferencia adoptiva pueden proceder del estroma de tumores resecados (por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores), de los vasos o ganglios linfáticos o de la sangre. En algunos casos, los linfocitos aislados se modifican por ingeniería genética para expresar receptores de linfocitos T (TCR) o receptores de antígenos quiméricos (CAR) antitumorales. Los linfocitos utilizados para la infusión se pueden aislar de un donante (ACT alogénica) o del hospedador portador del cáncer (ACT autóloga). El documento US2014/109246 divulga métodos para la generación de animales xenoquiméricos, que comprenden células progenitoras de médula ósea y tumores de un animal heterólogo. El documento US2014/255369 se refiere a la producción de glóbulos rojos a partir de células madre hematopoyéticas, mediante la diferenciación de tales células en presencia de una proteína que induce la supervivencia y proliferación celular El documento US2014/356392 divulga métodos de modulación de la viabilidad de una célula, métodos para modular una respuesta inmunitaria y métodos para identificar agentes capaces de modular la viabilidad de una célula o una respuesta inmunitaria. El documento WO2011/100477 divulga procesos para la producción mejorada de organismos productores de anticuerpos, tejidos productores de anticuerpos, células productoras de anticuerpos y anticuerpos.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, se proporciona una composición para su uso en terapia celular adoptiva para tratar un melanoma, en donde la composición comprende:
(a) un péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas, opcionalmente una secuencia de dominio de transducción de proteínas TAT; (ii) una secuencia de polipéptido MYC; y
(b) una o más células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto donante que tiene un tumor de melanoma, en donde la una o más células inmunitarias primarias son reactivas contra un antígeno específico de melanoma.
En la composición para el uso del primer aspecto de la invención, el péptido de fusión de MYC puede comprender la SEQ ID NO: 1. En la composición para el uso del primer aspecto de la invención, la una o más células inmunitarias pueden comprender uno o más linfocitos, opcionalmente, un linfocito T, un linfocito B, una célula NK o cualquier combinación de los mismos. En la composición para el uso del primer aspecto de la invención, el uno o más linfocitos pueden comprender un linfocito infiltrante de tumores o pueden modificarse de manera recombinante para expresar un receptor modificado o un receptor de antígenos quimérico.
En un segundo aspecto de la invención, se proporciona una célula inmunitaria modificada para su uso en terapia celular adoptiva para tratar un melanoma en un sujeto en donde la célula inmunitaria modificada comprende un péptido de fusión de m Yc que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas, opcionalmente una secuencia de dominio de transducción de proteínas TAT; y (ii) una secuencia de polipéptido MYC y es reactiva contra un antígeno específico de tumor. La célula inmunitaria modificada para el uso del segundo aspecto de la invención puede tener el péptido de fusión de MYC que comprende la SEQ ID NO: 1; y/o la una o más células inmunitarias pueden comprender uno o más linfocitos, opcionalmente, un linfocito T, un linfocito B, una célula NK, o cualquier combinación de los mismos, y opcionalmente el uno o más linfocitos pueden comprender un linfocito infiltrante de tumores o pueden modificarse de forma recombinante para expresar un receptor modificado o un receptor de antígenos quimérico.
La célula inmunitaria modificada para el uso del segundo aspecto de la invención puede proceder de células inmunitarias primarias aisladas del sujeto receptor o aisladas de un sujeto donante distinto que tenga el mismo tipo de melanoma. La célula inmunitaria modificada para el uso del segundo aspecto de la invención puede prepararse poniendo en contacto las células inmunitarias primarias in vitro con el péptido de fusión de MYC tras el aislamiento del sujeto donante. La célula inmunitaria modificada para el uso del segundo aspecto de la invención, puede comprender además la expansión de las células inmunitarias primarias in vitro antes o después del contacto con el péptido de fusión de m Yc , en donde las células se expanden opcionalmente, usando un anticuerpo anti-CD3, células alimentadoras alogénicas irradiadas o una citocina exógena, en donde la citocina es opcionalmente, interleucina-2. La célula inmunitaria modificada para el uso del segundo aspecto de la invención, puede ser para su uso en donde el sujeto receptor:
(i) tiene linfocitos agotados antes de la administración de la una o más células inmunitarias modificadas;
(ii) se le ha administrado una citocina antes de, durante o después de la administración de la una o más células inmunitarias modificadas, en donde la citocina se selecciona opcionalmente de un grupo que consiste en interferón a, interferón p, interferón y, complemento C5a, IL-2, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2; y/o
(iii) es un ser humano o un animal no humano.
La célula inmunitaria modificada para el uso del segundo aspecto de la invención puede ser para el uso en donde el melanoma es metastásico. La célula inmunitaria modificada para el uso del segundo aspecto de la invención puede ser para el uso en donde al sujeto receptor se le ha administrado una terapia adicional contra el cáncer, opcionalmente seleccionada entre quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, anticuerpos monoclonales, ácidos nucleicos o proteínas contra el cáncer, virus o microorganismos contra el cáncer y cualquier combinación de los mismos.
En el tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar células inmunitarias modificadas para terapia celular adoptiva para melanoma, que comprende poner en contacto una o más células inmunitarias in vitro con un polipéptido de fusión de MYC, en donde las células inmunitarias son de un donante que se ha expuesto a uno o más antígenos tumorales y en donde el péptido de fusión de MYC comprende (i) un dominio de transducción de proteínas, opcionalmente, una secuencia de dominio de transducción de proteínas TAT; (ii) una secuencia de polipéptido MYC y son reactivas a un antígeno específico de tumores. La una o más células inmunitarias modificadas pueden proceder de células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto que tiene melanoma. El método puede comprender expandir las células inmunitarias primarias in vitro antes o después del contacto con el péptido de fusión de MYC; y/o en donde el péptido de fusión de MYC comprende la SEQ ID NO: 1
En el presente documento se proporcionan métodos para la transferencia celular adoptiva para el tratamiento del melanoma. En el presente documento se proporcionan métodos para el tratamiento del melanoma en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de células inmunitarias que tienen actividad antitumoral, en donde las células inmunitarias se ponen en contacto con un polipéptido de fusión dominio de transducción de proteínas (PTD, por sus siglas en inglés)-MYC antes de la administración al sujeto. Las células inmunitarias pueden comprender uno o más linfocitos. El uno o más linfocitos pueden comprender linfocitos T y/o linfocitos B. El uno o más linfocitos pueden comprender linfocitos infiltrantes de tumores. El melanoma puede ser un melanoma metastásico. El melanoma puede ser un melanoma de extensión superficial, un melanoma nodular, un melanoma lentigo maligno o un melanoma acral. Las células inmunitarias pueden obtenerse de un sujeto donante que tiene melanoma. El sujeto donante y el sujeto que recibe las células inmunitarias pueden ser el mismo (es decir, ACT autóloga). El sujeto donante y el sujeto que recibe las células inmunitarias pueden ser diferentes (es decir, ACT alogénica).
El polipéptido de fusión PTD-MYC puede comprender: (i) un dominio de transducción de proteínas TAT de HIV; y (ii) una secuencia de polipéptido MYC. El polipéptido de fusión PTD-MYC puede trasladarse al núcleo de la célula inmunitaria. El polipéptido de fusión PTD-MYC puede presentar una actividad biológica de MYC, tal como la activación de los genes MYC diana. El péptido de fusión puede comprender la SEQ ID NO: 1.
En el presente documento se describen composiciones que comprenden (a) un péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC; y (b) una o más células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto donante que tiene un tumor de melanoma, en donde la una o más células inmunitarias primarias son reactivas contra un antígeno específico de melanoma. El péptido de fusión de MYC puede translocarse al núcleo de la una o más células inmunitarias primarias. El péptido de fusión de MYC puede presentar una actividad biológica de MYC. El péptido de fusión de MYC puede comprender además una o más moléculas que unen el dominio de transducción de proteínas y el polipéptido MYC. El péptido de fusión de MYC puede comprender un péptido de fusión de MYC con la siguiente estructura general:
dominio de transducción de proteínas-X-secuencia MYC,
en donde -X- es una molécula que une el dominio de transducción de proteínas y la secuencia MYC. La secuencia del dominio de transducción de proteínas puede ser una secuencia del dominio de transducción de proteínas TAT. La secuencia del dominio de transducción de proteínas TAT se puede seleccionar del grupo que consiste en TAT[48-57] y TAT[57-48]. El péptido de fusión de MYC puede comprender la SEQ ID NO: 1. El péptido de fusión de MYC puede estar acetilado. La una o más células inmunitarias pueden tener actividad antitumoral contra células de melanoma. La una o más células inmunitarias pueden comprender uno o más linfocitos. El uno o más linfocitos pueden comprender un linfocito T, un linfocito B, una célula NK o cualquier combinación de los mismos. El linfocito T se puede seleccionar del grupo que consiste en linfocitos T indiferenciados, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T de memoria, linfocitos T activados, linfocitos T anérgicos, linfocitos T tolerantes, linfocitos T quiméricos y linfocitos T específicos de antígeno. Los linfocitos B pueden seleccionarse del grupo que consiste en linfocitos B indiferenciados, linfocitos B plasmáticos, linfocitos B activados, linfocitos B de memoria, linfocitos B anérgicos, linfocitos B tolerantes, linfocitos B quiméricos y linfocitos B específicos de antígeno. El uno o más linfocitos pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores, linfocito modificado con receptor de linfocitos T o linfocito modificado con receptor de antígenos quimérico. El linfocito infiltrante de tumores puede tener una firma CD8+CD25+. El linfocito infiltrante de tumores puede tener una firma CD4+CD25+. La una o más células inmunitarias pueden comprender un resto detectable.
En el presente documento se describen métodos para tratar un melanoma en un sujeto, que comprenden administrar una o más células inmunitarias modificadas al sujeto que las necesita, en donde la una o más células inmunitarias modificadas comprenden un péptido de fusión de MYC que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC y son reactivos a un antígeno específico de tumores. La una o más células inmunitarias modificadas pueden proceder de células inmunitarias primarias aisladas del sujeto. La una o más células inmunitarias modificadas pueden proceder de células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto donante distinto que tiene el mismo tipo de melanoma. La una o más células inmunitarias modificadas pueden prepararse poniendo en contacto las células inmunitarias primarias in vitro con el péptido de fusión de MYC después del aislamiento. Los métodos pueden comprender además la expansión de las células inmunitarias primarias in vitro antes del contacto con el péptido de fusión de MYC. Los métodos pueden comprender además la expansión de las células inmunitarias primarias después del contacto con el péptido de fusión de MYC. Las células se pueden expandir utilizando un anticuerpo anti-CD3. Las células pueden expandirse usando células alimentadoras alogénicas irradiadas. Las células pueden expandirse en presencia de una citocina exógena. La citocina puede ser interleucina-2. El péptido de fusión de MYC se trasloca al núcleo de la célula inmunitaria. El péptido de fusión de MYC puede presentar una actividad biológica de MYC. El péptido de fusión de MYC puede comprender además una o más moléculas que unen el dominio de transducción de proteínas y el polipéptido MYC. El péptido de fusión de MYC puede comprender un péptido de fusión de MYC con la siguiente estructura general:
dominio de transducción de proteínas-X-secuencia MYC,
en donde -X- es una molécula que une el dominio de transducción de proteínas y la secuencia MYC. La secuencia del dominio de transducción de proteínas puede ser una secuencia del dominio de transducción de proteínas TAT. La secuencia del dominio de transducción de proteínas TAT se puede seleccionar del grupo que consiste en TAT[48-57] y TAT[57-48]. El péptido de fusión de MYC puede comprender la SEQ ID NO: 1. El péptido de fusión de MYC puede estar acetilado. La una o más células inmunitarias modificadas pueden tener actividad antitumoral contra las células de melanoma en el sujeto. La una o más células inmunitarias modificadas pueden tener actividad antitumoral contra las células de melanoma en el sujeto. La una o más células inmunitarias modificadas pueden comprender una o más células inmunitarias anérgicas. La una o más células inmunitarias pueden comprender uno o más linfocitos. El uno o más linfocitos pueden comprender un linfocito T, un linfocito B, una NK o cualquier combinación de los mismos. El linfocito T se puede seleccionar del grupo que consiste en linfocitos T indiferenciados, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T de memoria, linfocitos T activados, linfocitos T anérgicos, linfocitos T tolerantes, linfocitos T quiméricos y linfocitos T específicos de antígeno. Los linfocitos B pueden seleccionarse del grupo que consiste en linfocitos B indiferenciados, linfocitos B plasmáticos, linfocitos B activados, linfocitos B de memoria, linfocitos B anérgicos, linfocitos B tolerantes, linfocitos B quiméricos y linfocitos B específicos de antígeno. El uno o más linfocitos pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores, linfocito modificado con receptor de linfocitos T o linfocito modificado con receptor de antígenos quimérico. El linfocito puede tener una firma CD8+CD28-CD152-. El linfocito puede tener una firma CD8+CD25+. El linfocito puede tener una firma CD4+CD25+. Los métodos pueden comprender además aislar las células inmunitarias primarias del sujeto donante. El sujeto donante puede tener melanoma. La una o más células inmunitarias modificadas pueden administrarse por vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular o intratumoral. Los métodos pueden comprender además agotar los linfocitos del sujeto antes de la administración de la una o más células inmunitarias modificadas. Los métodos pueden comprender además administrar una citocina al sujeto. La citocina puede administrarse antes, durante o después de la administración de la una o más células inmunitarias modificadas. La citocina se puede seleccionar de un grupo que consiste en interferón a, interferón p, interferón y, complemento C5a, IL-2, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2. El melanoma puede ser metastásico. El sujeto puede ser un ser humano o animal no humano. Los métodos pueden comprender además administrar una terapia adicional contra el cáncer. La terapia adicional contra el cáncer puede seleccionarse entre quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, anticuerpos monoclonales, ácidos nucleicos o proteínas contra el cáncer, virus o microorganismos contra el cáncer y cualquier combinación de los mismos. La una o más células inmunitarias modificadas pueden comprender un resto detectable.
También se describen en el presente documento, en determinadas realizaciones, métodos para preparar células inmunitarias modificadas para el tratamiento de melanoma, que comprenden poner en contacto una o más células inmunitarias in vitro con un polipéptido de fusión de MYC, en donde las células inmunitarias son de un donante que se ha expuesto a uno o más antígenos tumorales y en donde el péptido de fusión de MYC comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido m Yc y son reactivas a un antígeno específico de tumores. En algunas realizaciones, la una o más células inmunitarias modificadas proceden de células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto que tiene melanoma. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la expansión de las células inmunitarias primarias in vitro antes del contacto con el péptido de fusión de MYC. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además la expansión de las células inmunitarias primarias después del contacto con el péptido de fusión de MYC. Las células se pueden expandir utilizando un anticuerpo anti-CD3. Las células pueden expandirse usando células alimentadoras alogénicas irradiadas. Las células pueden expandirse en presencia de una citocina exógena. En algunas realizaciones, la citocina es interleucina-2. El péptido de fusión de MYC puede traslocarse al núcleo de la célula inmunitaria. El péptido de fusión de MYC puede presentar una actividad biológica de MYC. El péptido de fusión de MYC puede comprender además una o más moléculas que unen el dominio de transducción de proteínas y el polipéptido MYC. El péptido de fusión de MYC puede comprender un péptido de fusión de MYC con la siguiente estructura general:
dominio de transducción de proteínas-X-secuencia MYC,
en donde -X- es una molécula que une el dominio de transducción de proteínas y la secuencia MYC. La secuencia del dominio de transducción de proteínas puede ser una secuencia del dominio de transducción de proteínas TAT. La secuencia del dominio de transducción de proteínas TAT se puede seleccionar del grupo que consiste en TAT[48-57] y TAT[57-48]. En algunas realizaciones, el péptido de fusión de MYC comprende la s Eq ID NO: 1. El péptido de fusión de m Yc puede estar acetilado. La una o más células inmunitarias modificadas pueden tener actividad antitumoral. La una o más células inmunitarias modificadas pueden tener actividad antitumoral contra las células de melanoma en el sujeto. La una o más células inmunitarias modificadas pueden comprender una o más células inmunitarias anérgicas. La una o más células inmunitarias pueden comprender uno o más linfocitos. El uno o más linfocitos pueden comprender un linfocito T, un linfocito B, una NK o cualquier combinación de los mismos. El linfocito T puede seleccionarse del grupo que consiste en linfocitos T indiferenciados, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T de memoria, linfocitos T activados, linfocitos T anérgicos, linfocitos T tolerantes, linfocitos T quiméricos y linfocitos T específicos de antígeno. Los linfocitos B pueden seleccionarse del grupo que consiste en linfocitos B indiferenciados, linfocitos B plasmáticos, linfocitos B activados, linfocitos B de memoria, linfocitos B anérgicos, linfocitos B tolerantes, linfocitos B quiméricos y linfocitos B específicos de antígeno. El uno o más linfocitos pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores, linfocito modificado con receptor de linfocitos T o linfocito modificado con receptor de antígenos quimérico. El linfocito puede tener una firma CD8+CD28-CD152-. El linfocito puede tener una firma CD8+CD25+. El linfocito puede tener una firma CD4+CD25+.
En el presente documento también se describen composiciones que comprenden: (a) una o más células inmunitarias primarias aisladas que se han expuesto a una línea celular de melanoma; y (b) un péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC; en donde la una o más células inmunitarias primarias son reactivas contra un antígeno específico de melanoma.
En el presente documento también se describen, en determinadas realizaciones, cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas para su uso en el tratamiento de un melanoma. En el presente documento también se describen cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas para su uso en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un melanoma.
En el presente documento también se describen métodos para aumentar la eficacia de la terapia celular adoptiva o la terapia con linfocitos T en un sujeto que comprenden administrar cualquiera de las composiciones anteriormente mencionadas.
En el presente documento también se describen linfocitos infiltrantes de tumores modificados que comprenden un péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC. Los linfocitos infiltrantes de tumores pueden proceder de linfocitos infiltrantes de tumores primarios aislados de un sujeto que tiene cáncer (por ejemplo, melanoma).
En el presente documento también se describen linfocitos que comprenden un receptor de antígenos quimérico y un péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC. Los linfocitos proceden de linfocitos primarios aislados de un sujeto que tiene cáncer (por ejemplo, melanoma).
En el presente documento también se describen métodos para preparar una composición para terapia celular adoptiva que comprenden poner en contacto una o más células inmunitarias primarias con el péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC, en donde se aíslan una o más células inmunitarias primarias de un paciente que tiene melanoma, y en donde una o más células inmunitarias primarias son reactivas frente a un antígeno específico de melanoma.
También se proporcionan kits que comprenden los polipéptidos de fusión de MYC y/o células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC proporcionadas en el presente documento para su uso en el tratamiento de un melanoma. El kit puede comprender uno o más reactivos para la detección de los polipéptidos de fusión de MYC y/o las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC administrados. El kit puede comprender células para el tratamiento con un polipéptido de fusión de MYC proporcionado en el presente documento, por ejemplo, células madre hematopoyéticas, leucocitos de donante, linfocitos T o células NK. El kit puede comprender instrucciones asociadas para usar los polipéptidos de fusión de MYC y/o las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra los resultados de supervivencia de ratones portadores de tumores de melanoma después de la infusión de linfocitos de ratones donantes portadores de tumores tratados con TAT-MYC durante 1 hora. Los ratones se trataron con linfocitos TAT-MYC, células linfáticas tratadas con una proteína de control o se dejaron sin tratar. Día de la muerte registrado con el día de tratamiento como Día 0.
La figura 2 ilustra los resultados de supervivencia de ratones portadores de tumores de melanoma después de la infusión de linfocitos de ratones donantes portadores de tumores tratados con TAT-MYC (repetición del experimento mostrado en la figura 1). Los ratones se trataron con linfocitos TAT-MYC, células linfáticas tratadas con una proteína de control o se dejaron sin tratar. Día de la muerte registrado con el día de tratamiento como Día 0.
La figura 3 ilustra los resultados de supervivencia de ratones portadores de tumores de melanoma después de la infusión de diferentes cantidades de linfocitos de ratones donantes portadores de tumores tratados con TAT-MYC. Los ratones se trataron con linfocitos TAT-MYC, células linfáticas tratadas con una proteína de control o se dejaron sin tratar. Día de la muerte registrado con el día de tratamiento como Día 0.
La figura 4 ilustra los resultados de supervivencia de ratones portadores de tumores de melanoma después de la infusión de diferentes cantidades de linfocitos de ratones donantes portadores de tumores tratados con TAT-MYC. Los ratones se trataron con linfocitos TAT-MYC, células linfáticas tratadas con una proteína de control o se dejaron sin tratar. Día de la muerte registrado con el día de tratamiento como Día 0.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación no está limitada en términos de las realizaciones particulares descritas en la presente solicitud, que pretenden ser ilustraciones individuales de aspectos individuales de la divulgación. No se describirán en el presente documento todas las diversas realizaciones de la presente divulgación. Se pueden realizar muchas modificaciones y variaciones de la presente divulgación sin apartarse de su alcance, como resultará evidente para aquellos expertos en la materia. Los métodos y aparatos funcionalmente equivalentes comprendidos en el alcance de la presente divulgación, además de los citados en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de las descripciones anteriores. Dichas modificaciones y variaciones están destinadas a encontrarse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación está limitada solamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que tienen derecho dichas reivindicaciones.
Debe entenderse que la presente divulgación no se limita a usos, métodos, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos particulares, que pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene únicamente la finalidad de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea una limitación.
Además, cuando las características o aspectos de la divulgación se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia reconocerán que la divulgación también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.
Tal como entenderá el experto en la materia, para todos y cada uno de los fines, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos divulgados en el presente documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos. Cualquier intervalo enumerado puede reconocerse fácilmente como lo suficientemente descriptivo y permite que el mismo intervalo se divida en al menos mitades, tercios, cuartos, quintos, décimos iguales, etc. Como ejemplo no limitante, cada intervalo analizado en el presente documento puede dividirse fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, etc. También comprenderá un experto en la materia que todos los términos lingüísticos tales como "hasta", "al menos", "más grande que", "menos que", y similares, incluyen el número citado y se refieren a los intervalos que posteriormente pueden desglosarse en subintervalos como se ha analizado anteriormente. Finalmente, tal como entenderá el experto en la materia, un intervalo incluye cada número individual. Por tanto, por ejemplo, un grupo que tiene 1-3 células se refiere a grupos que tienen 1, 2 o 3 células. De forma similar, un grupo que tiene 1-5 células se refiere a grupos que tienen 1, 2, 3, 4 o 5 células y así sucesivamente.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación.
I. Definiciones
La terminología utilizada en el presente documento tiene como finalidad describir solamente realizaciones concretas y no pretende ser limitante de la divulgación. Como se usa en el presente documento, las formas en singular "un", "uno/una" y "el/la" pretenden incluir las formas en plural también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa que un valor puede variar /- 20 %, /- 15%, /- 10% o /- 5% y permanecen dentro del alcance de la presente divulgación. Por ejemplo, "una concentración de aproximadamente 200 UI/ml" abarca una concentración entre 160 UI/ml y 240 UI/ml.
Como se usa en el presente documento, el término "administración" de un agente a un sujeto incluye cualquier vía de introducción o suministro del agente a un sujeto para realizar su función prevista. La administración se puede realizar mediante cualquier vía adecuada, incluyendo vía intravenosa, vía intramuscular, vía intraperitoneal o vía subcutánea. La administración incluye la autoadministración y la administración por un tercero.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y no naturales, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que actúan de manera similar a la de los aminoácidos naturales. Los aminoácidos codificados de forma natural son los 20 aminoácidos comunes (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina) y pirolisina y selenocisteína. Los análogos de aminoácidos se refieren a agentes que tienen la misma estructura química básica que la de un aminoácido natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, tales como, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (tal como, norleucina) o cadenas principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido natural. Los aminoácidos que forman un polipéptido pueden estar en la forma D. Los aminoácidos que forman un polipéptido pueden estar en la forma L. Una primera pluralidad de aminoácidos que forman un polipéptido pueden estar en la forma D y una segunda pluralidad están en la forma L.
Los aminoácidos se denominan en el presente documento bien por sus símbolos de tres letras habitualmente conocidos o bien mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Los nucleótidos, igualmente, se denominan por sus códigos de una letra habitualmente aceptados.
Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos naturales, así como a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un aminoácido no natural, por ejemplo, un análogo de aminoácido. Los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa, en donde los restos de aminoácidos se unen mediante enlaces peptídicos covalentes.
Como se usa en el presente documento, un "control" es una muestra alternativa usada en un experimento a efectos de comparación. Un control puede ser "positivo" o "negativo". Por ejemplo, cuando la finalidad del experimento es determinar una correlación de la eficacia de un agente terapéutico para el tratamiento de un tipo concreto de enfermedad, se emplean normalmente un control positivo (una composición conocida por presentar el efecto terapéutico deseado) y un control negativo (un sujeto o una muestra que no recibe la terapia o recibe un placebo).
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente suficiente para conseguir un efecto terapéutico deseado. En el contexto de las aplicaciones terapéuticas, la cantidad de un péptido terapéutico administrada al sujeto dependerá del tipo y la gravedad de la infección y de las características del individuo, tales como la salud general, la edad, el sexo, el peso corporal y la tolerancia a los fármacos. Puede depender también del grado, gravedad y tipo de enfermedad. El experto en la materia será capaz de determinar las dosis adecuadas dependiendo de estos y otros factores.
Como se usa en el presente documento, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual los polinucleótidos se transcriben en ARNm y/o al proceso mediante el cual el ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido procede de ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota. Se puede determinar el nivel de expresión de un gen midiendo la cantidad de ARNm o proteína en una célula o muestra de tejido. El nivel de expresión de un gen procedente de una muestra puede compararse directamente con el nivel de expresión de ese gen procedente de una muestra de control o de referencia. El nivel de expresión de un gen procedente de una muestra puede compararse directamente con el nivel de expresión de dicho gen procedente de la misma muestra tras la administración de las composiciones divulgadas en el presente documento. El término "expresión", se refiere también a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción) dentro de una célula; (2) procesamiento de un transcrito de ARN (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, protección terminal con caperuza en 5' y/o formación en el extremo 3') dentro de una célula; (3) traducción de una secuencia de ARN en un polipéptido o proteína dentro de una célula; (4) modificación posterior a la traducción de un polipéptido o proteína dentro de una célula; (5) presentación de un polipéptido o proteína sobre la superficie celular; y (6) secreción o presentación o liberación de un polipéptido o proteína a partir de una célula.
El término "enlazador" se refiere a secuencias sintéticas (por ejemplo, secuencias de aminoácidos) que conectan o unen dos secuencias, por ejemplo, que unen dos dominios polipeptídicos. El enlazador contiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias de aminoácidos.
Los términos "liofilizado/a", "liofilización" y similares, tal como se usa en el presente documento, se refieren a un proceso mediante el cual el material (por ejemplo, nanopartículas) a secar se congela primero y después el hielo o el disolvente congelado se elimina por sublimación en un ambiente de vacío. Puede incluirse un excipiente en las formulaciones liofilizadas previamente para potenciar la estabilidad del producto liofilizado durante el almacenamiento. La muestra liofilizada puede contener además excipientes adicionales.
Como se usa en el presente documento, el término célula inmunitaria se refiere a cualquier célula que desempeña un papel en la respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias son de origen hematopoyético e incluyen linfocitos, tales como linfocitos B y linfocitos T; linfocitos citolíticos naturales; células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos, basófilos y granulocitos.
El término "linfocito" se refiere a todas las poblaciones de linfocitos blancos inmaduros, maduros, sin diferenciar y diferenciados que incluyen variedades especializadas y específicas de tejido. Abarca, a modo de ejemplo no limitante, linfocitos B, linfocitos T, células NKT y células NK. Los linfocitos pueden incluir todos los linajes de linfocitos B, incluidos los linfocitos pre-B, linfocitos B progenitores, linfocitos pro-B tempranos, linfocitos pro-B tardíos, linfocitos pre-B grandes, linfocitos pre-B pequeños, linfocitos B inmaduros, linfocitos B maduros, linfocitos B plasmáticos, linfocitos B de memoria, linfocitos B-1, linfocitos B-2 y poblaciones de células AN1/T3 anérgicas.
Como se usa en el presente documento, la expresión linfocito T incluye linfocitos T indiferenciados, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos T de memoria, linfocitos T activados, linfocitos T anérgicos, linfocitos T tolerantes, linfocitos T quiméricos y linfocitos T específicos de antígeno.
La expresión "linfocito B" o "linfocitos B" se refiere a, a modo de ejemplo no limitante, un linfocito pre-B, linfocito B progenitor, linfocito pro-B temprano, linfocito pro-B tardío, linfocito pre-B grande, linfocito pre-B pequeño, linfocito B inmaduro, linfocito B maduro, linfocitos B indiferenciados, linfocitos B plasmáticos, linfocitos B activados, linfocitos B anérgicos, linfocitos B tolerantes, linfocitos B quiméricos, linfocitos B específicos de antígeno, linfocito B de memoria, linfocito B-1, linfocitos B-2 y poblaciones de células AN1/T3 anérgicas. La expresión linfocito B puede incluir un linfocito B que expresa una cadena pesada y/o una cadena ligera de inmunoglobulina en su superficie celular. La expresión linfocito B puede incluir un linfocito B que expresa y secreta una cadena pesada y/o una cadena ligera de inmunoglobulina. La expresión linfocito B puede incluir una célula que se une a un antígeno en su superficie celular. Pueden utilizarse linfocitos B o células AN1/T3 en los procesos descritos. Dichas células pueden sustituirse opcionalmente con cualquier célula animal adecuada para expresar, capaz de expresar (por ejemplo, expresión inducible), o capaz de diferenciarse en una célula adecuada para expresar un anticuerpo que incluye, por ejemplo, una célula madre hematopoyética, un linfocito B indiferenciado, un linfocito B, un linfocito pre-B, un linfocito B progenitor, un linfocito pro-B temprano, un linfocito pro-B tardío, un linfocito pre-B grande, un linfocito pre-B pequeño, un linfocito B inmaduro, un linfocito B maduro, un linfocito B plasmático, un linfocito B de memoria, un linfocito B-1, un linfocito B-2, un linfocito B anérgico o una célula AN1/T3 anérgica.
Como se usa en el presente documento, "composición terapéutica celular adoptiva" se refiere a cualquier composición que comprenda células adecuadas para la transferencia celular adoptiva. La composición terapéutica celular adoptiva puede comprender un tipo celular seleccionado de un grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumores (TIL, por su siglas en inglés), linfocitos modificados con TCR (es decir, receptor de linfocitos T heterólogo) y linfocitos modificados con CAR (es decir, receptor de antígenos quimérico). La composición terapéutica celular adoptiva puede comprender un tipo celular seleccionado de un grupo que consiste en linfocitos T, células CD8+, células c D4+, células NK, linfocitos T delta-gamma, linfocitos T reguladores y células mononucleares de sangre periférica. Los TIL, linfocitos T, células CD8+, células CD4+, células NK, linfocitos T delta-gamma, linfocitos T reguladores o células mononucleares de sangre periférica pueden formar la composición terapéutica celular adoptiva. La composición terapéutica celular adoptiva puede comprender linfocitos T.
Como se usa en el presente documento, "linfocitos infiltrantes de tumores" o TIL se refieren a glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo y migrado a un tumor.
Los términos "MYC" y "gen MYC" son sinónimos. Hacen referencia a una secuencia de un ácido nucleico que codifica un polipéptido MYC. Un gen MYC comprende una secuencia de nucleótidos de al menos 120 nucleótidos que es al menos un 60 % a 100 % idéntica u homóloga, por ejemplo, al menos un 60, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o cualquier otro porcentaje de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 100 % idéntica a las secuencias del número de registro del NCBI NM-002467. El gen MYC puede ser un protooncogén. En determinados casos, un gen MYC se encuentra en el cromosoma 8, en 8q24.21. En determinados casos, un gen MYC comienza en 128.816.862 pb de pter y termina en 128.822.856 pb de pter. En determinados casos, un gen MYC tiene aproximadamente 6 kb. En determinados casos, un gen MYC codifica al menos ocho secuencias de ARNm distintas, 5 variantes con corte y empalme alternativo y 3 variantes sin corte y empalme.
Las expresiones "proteína MYC", "polipéptido MYC", y "secuencia MYC" son sinónimos y se refieren al polímero de restos de aminoácidos divulgado en el número de registro de NCBI UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1 (isoterma 1 de MYC) o NP_002458.2 (UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.2; isoterma 2 de MYC) y homólogos, análogos o fragmentos funcionales del mismo. La secuencia de o UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.1 es:
MPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSY VAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLA SYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLS
STESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKR
CHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRS FFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSV QAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 2)
La secuencia de NP_002458.2 (UniProtKB/Swiss-Prot:P01106.2) es:
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTP
PLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCM
WSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCA SQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSA GGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRT HNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAP KVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRNSCA (SEQ ID NO: 11)
El polipéptido MYC puede ser una secuencia de polipéptido MYC completa. El polipéptido MYC puede ser una secuencia de polipéptido MYC parcial. El polipéptido MYC puede comprender al menos 400 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2 u 11. El polipéptido MYC puede comprender al menos 400 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2 u 11 y conserva al menos una actividad de MYC. El polipéptido MYC puede comprender al menos 400, al menos 410, al menos 420, al menos 430 o al menos 450 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2 u 11. El polipéptido MYC puede comprender al menos 400, al menos 410, al menos 420, al menos 430, o al menos 450 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2 u 11 y conserva al menos una actividad de MYC. El polipéptido MYC puede ser c-MYC. La secuencia de polipéptido MYC puede comprender la secuencia que se muestra a continuación:
MDFFRVVENQQPPATMPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTP
PLSPSRRSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCM
WSGFSAAAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCA SQDSSAFSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSA GGHSKPPHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRT HNVLERQRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAP KVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR
(SEQ ID NO: 3).
La secuencia de polipéptido MYC comprende la secuencia que se muestra a continuación:
PLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSRRSGLCSPSYV
AVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSAAAKLVSEKLAS YQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSAFSPSSDSLLSS
TESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKPPHSPLVLKRC
HVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLERQRRNELKRSF
FALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLR (SEQ ID NO: 4).
Un polipéptido MYC puede comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos de un 40% a un 100% idéntica, por ejemplo, al menos un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o cualquier otro porcentaje de aproximadamente 40% a aproximadamente 100% idéntica a la secuencia del número de registro del NCBI NP002458.2 o el número de registro UniProtKB/Swiss-Prot P01106.1. El polipéptido MYC puede referirse a un polímero de 439 aminoácidos, un polipéptido MYC que no ha experimentado ninguna modificación postraduccional. El polipéptido MYC puede referirse a un polímero de 439 aminoácidos que ha experimentado modificaciones postraduccionales. El polipéptido MYC puede tener 48.804 kDa. El polipéptido MYC puede contener un dominio básico hélice-bucle-hélice de cremallera de leucina (bHLH/LZ, por sus siglas en inglés). El dominio bHLH/LZ puede comprender la secuencia de: ELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQL KHKLEQLR (SEQ ID NO: 5). El polipéptido MYC puede ser un factor de transcripción (por ejemplo, factor de transcripción 64). El polipéptido MYC puede contener un dominio de unión a ADN caja E. El polipéptido MYC puede unirse a una secuencia que comprende CACGTG. El polipéptido MYC puede promover uno o más de supervivencia y/o proliferación celular. Un polipéptido MYC puede incluir uno o más de los descritos anteriormente e incluir una o más modificaciones postraduccionales (por ejemplo, acetilación). Los polipéptidos MYC pueden comprender uno o más restos de aminoácidos adicionales en el extremo N o en el extremo C del polipéptido. Los polipéptidos MYC pueden ser proteínas de fusión. Los polipéptidos MYC pueden unirse a uno o más péptidos adicionales en el extremo N o extremo C del polipéptido.
Las proteínas adecuadas para su uso en los métodos descritos en el presente documento también incluyen variantes funcionales, incluyendo proteínas que tienen entre 1 y 15 cambios de aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína descrita en el presente documento. La secuencia de aminoácidos alterada puede ser idéntica en al menos un 75 %, por ejemplo, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquier inhibidor de proteínas descrito en el presente documento. Dichas proteínas de secuencia variante son adecuadas para los métodos descritos en el presente documento siempre que la secuencia de aminoácidos alterada conserve suficiente actividad biológica para ser funcional en las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Cuando se realizan sustituciones de aminoácidos, las sustituciones pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas. Entre los aminoácidos naturales comunes, por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservativa" se ilustra por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparagina, y (6) lisina, arginina e histidina. La tabla BLOSUM62 es una matriz de sustitución de aminoácidos procedente de unos 2000 alineamientos múltiples locales de segmentos de secuencias de proteínas, que representan regiones altamente conservadas de más de 500 grupos de proteínas relacionadas (Henikoff et al., (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:10915- 10919). Por consiguiente, las frecuencias de sustitución de BLOSUM62 se utilizan para definir sustituciones de aminoácidos conservativas que, pueden introducirse en las secuencias de aminoácidos descritas o divulgadas en el presente documento. Aunque es posible diseñar sustituciones de aminoácidos basadas únicamente en las propiedades químicas (como se analiza anteriormente), la expresión "sustitución conservativa de aminoácidos" se refiere preferentemente a una sustitución representada por un valor de BLOSUM62 superior a -1. Por ejemplo, una sustitución de aminoácido es conservativa si la sustitución se caracteriza por un valor BLOSUM62 de 0, 1, 2 o 3. Según este sistema, las sustituciones de aminoácidos conservativas preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 1 (por ejemplo, 1,2 o 3), mientras que las sustituciones de aminoácidos conservativas más preferidas se caracterizan por un valor BLOSUM62 de al menos 2 (por ejemplo, 2 o 3).
Las expresiones "secuencia de caja E" y "secuencia de caja potenciadora" se usan indistintamente en el presente documento y significan la secuencia de nucleótidos CANNTG, en donde N es cualquier nucleótido. En determinados casos, la secuencia de caja E comprende CACGTG. En determinados casos, el dominio básico hélice-bucle-hélice de un factor de transcripción codificado por MYC se une a la secuencia de caja E. En determinados casos, la secuencia de caja E se encuentra cadena arriba de un gen (por ejemplo, p21, Bc1-2, u ornitina descarboxilasa). En determinados casos, el polipéptido MYC contiene un dominio de unión a ADN caja E. En determinados casos, el dominio de unión a ADN de caja E comprende la secuencia de KRRTHNVLERQRRN (SEQ ID NO: 6). En determinados casos, la unión del factor de transcripción codificado por MYC a la secuencia de caja E, permite que la ARN polimerasa transcriba el gen cadena abajo de la secuencia de caja E.
La expresión "actividad de MYC" o "actividad biológica de MYC" o "MYC biológicamente activo" incluye uno o más de potenciar o inducir la supervivencia celular, proliferación celular y/o producción de anticuerpos. A modo de ejemplo y no a modo de limitación, la actividad de MYC incluye la potenciación de la expansión de los linfocitos T activados con anti-CD3 y anti-CD28 y/o el aumento de la proliferación de células madre hematopoyéticas de autorrenovación a largo plazo. La actividad de MYC también incluye la entrada en el núcleo de una célula, la unión a una secuencia de un ácido nucleico (por ejemplo, uniéndose a una secuencia de caja E), y/o la inducción de la expresión de genes diana de MYC.
Los términos "paciente", "sujeto", "individuo", y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un animal, generalmente un mamífero. El paciente, sujeto o individuo puede ser un mamífero. El paciente, sujeto o individuo puede ser un ser humano. El paciente, sujeto o individuo puede ser un animal, tal como, pero sin limitación, animales domésticos, tal como equinos, bovinos, murinos, ovinos, caninos y felinos.
Las expresiones "dominio de transducción de proteínas (PTD)" o "secuencia peptídica transportadora" (también conocidas como proteínas permeables a las células (CPP, por sus siglas en inglés) o secuencias de traslocación de membrana (MTS, por sus siglas en inglés)) se usan indistintamente en el presente documento para referirse a péptidos pequeños que son capaces de transportar moléculas mucho más grandes en células independientes de la endocitosis clásica. Se puede encontrar una señal de localización nuclear dentro del dominio de transducción de proteínas, que media una translocación adicional de las moléculas en el núcleo celular.
Los términos "tratar" o "tratamiento" tal como se usan en el presente documento abarcan el tratamiento de una enfermedad en un sujeto, tal como un ser humano, e incluye: (i) inhibir una enfermedad, es decir, detener su desarrollo; (ii) aliviar una enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad; (iii) ralentizar la progresión de la enfermedad; y/o (iv) inhibir, aliviar o ralentizar la progresión de uno o más síntomas de la enfermedad. Con respecto a un melanoma, "tratar" o "tratamiento" también abarca la regresión de un tumor, ralentizar el crecimiento del tumor, inhibir la metástasis de un tumor de melanoma, inhibir la recaída o el melanoma recurrente y/o mantener la remisión.
También se debe apreciar que los diversos modos de tratamiento o prevención de enfermedades y afecciones médicas que se describen tienen la intención de significar "sustancial", que incluye el tratamiento total pero también menos del tratamiento o prevención total, y en donde se consigue algún resultado biológica o médicamente relevante. El tratamiento puede ser un tratamiento prolongado continuado para una enfermedad crónica o una única administración, o unas pocas administraciones para el tratamiento de una afección aguda.
El término "terapéutico", como se usa en el presente documento, significa un tratamiento y/o profilaxis. Se obtiene un efecto terapéutico por supresión, remisión o erradicación de una patología.
II. Visión general
La presente divulgación se refiere, en parte, al tratamiento de melanoma en un sujeto mediante la administración de una composición que comprende una o más células inmunitarias que tienen actividad antitumoral (por ejemplo, células inmunitarias que modulan una respuesta contra un tumor, tal como linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)), en donde una o más células inmunitarias se ponen en contacto con un polipéptido de fusión PTD-MYC in vitro antes de la administración al sujeto. Las células inmunitarias pueden obtenerse de un sujeto donante que tenga un tumor de melanoma. Las células pueden ser autólogas del sujeto que recibe el tratamiento. El melanoma puede ser un melanoma de extensión superficial, un melanoma nodular, un melanoma lentigo maligno o un melanoma acral.
La presente divulgación se basa, al menos en parte, en el descubrimiento, de que tratar linfocitos aislados de un sujeto donante que tiene un tumor de melanoma con un polipéptido de fusión de MYC que contiene un polipéptido MYC y un dominio de transducción de proteínas (PTD), tales como el dominio de transducción de proteínas TAT de1HIV, y administrar los linfocitos tratados a un sujeto portador de un tumor de melanoma aumenta significativamente la supervivencia del sujeto portador del tumor. Los ejemplos proporcionados en el presente documento demuestran que las células inmunitarias extraídas de los ganglios linfáticos de un ratón portador de melanoma aumentaron significativamente la eficacia terapéutica cuando las células se trataron con una proteína de fusión TAT-MYC in vitro antes de la administración a un segundo ratón portador de melanoma. Estos datos respaldan que la transferencia celular adoptiva utilizando células inmunitarias antitumorales tratadas con un polipéptido de fusión PTD-MYC puede emplearse en el tratamiento de tumores, tal como tumores de melanoma.
El método para el tratamiento del melanoma en un sujeto puede comprender la administración de células inmunitarias que se han puesto en contacto in vitro con un polipéptido de fusión PTD-MYC. Las células inmunitarias para su uso en los presentes métodos pueden cebarse in vivo con antígeno tumoral de melanoma. Las células inmunitarias pueden ser de un donante que tenga melanoma. Las células inmunitarias pueden ser de un donante que tenga un tumor sólido, tal como un tumor de melanoma. Las células inmunitarias pueden ponerse en contacto in vivo con un antígeno tumoral de melanoma. Las células inmunitarias pueden ser de un donante que ha estado expuesto a uno o más antígenos tumorales de melanoma. Las células inmunitarias pueden ser de un donante que ha estado expuesto a una vacuna antitumoral. Las células inmunitarias pueden ser linfocitos B, linfocitos T, células NK o cualquier combinación de las mismas. Las células inmunitarias pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). Las células inmunitarias pueden ser linfocitos T con receptor de antígenos quimérico (CAR).
El método para el tratamiento del melanoma en un sujeto puede comprender administrar una o más células inmunitarias modificadas al sujeto que lo necesite, en donde la una o más células inmunitarias modificadas comprenden un péptido de fusión de MYC que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC y son reactivas a un antígeno específico de tumores de melanoma.
El método para el tratamiento del melanoma en un sujeto puede comprender las etapas de:
a) poner en contacto las células inmunitarias in vitro con un polipéptido de fusión de MYC, en donde las células inmunitarias son de un donante que se ha expuesto a uno o más antígenos tumorales de melanoma y al péptido de fusión de MYC que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas; (ii) una secuencia de polipéptido MYC; y
b) administrar las células inmunitarias que se han puesto en contacto al sujeto portador de un tumor de melanoma, mediante las que se trata el melanoma.
Poner en contacto las células inmunitarias in vitro con un polipéptido de fusión PTD-MYC puede realizarse cultivando las células inmunitarias en presencia del polipéptido de fusión de MYC. Las células inmunitarias pueden cultivarse en presencia de una o más citocinas y/o factores de crecimiento (por ejemplo, interleucina-2 (IL-2), IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15). Las células inmunitarias pueden no expandirse antes de la administración. Las células inmunitarias pueden expandirse antes de la administración. El donante y el sujeto de tratamiento pueden ser el mismo.
Las células inmunitarias pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores. Los linfocitos infiltrantes de tumores pueden ser linfocitos infiltrantes de tumores autólogos. El método para el tratamiento del melanoma en un sujeto puede comprender la administración de linfocitos que se han puesto en contacto in vitro con un polipéptido de fusión PTD-MYC, en donde las células inmunitarias proceden de linfocitos que son linfocitos infiltrantes de tumores autólogos del sujeto.
El método para el tratamiento del melanoma en un sujeto puede comprender las etapas de:
a) poner en contacto linfocitos in vitro con un polipéptido de fusión PTD-MYC, en donde los linfocitos son linfocitos infiltrantes de tumores autólogos del sujeto, y
b) administrar los linfocitos infiltrantes de tumores autólogos que se han puesto en contacto al sujeto, mediante los que se trata el melanoma.
Métodos de obtención y preparación de células inmunitarias para transferencia
Las células inmunitarias para su uso en los métodos proporcionados en el presente documento se pueden obtener usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. En algunas realizaciones, las células inmunitarias son células inmunitarias primarias. En algunas realizaciones, las células inmunitarias son linfocitos, tales como linfocitos T y linfocitos B. En algunas realizaciones, las células inmunitarias son linfocitos citolíticos naturales (NK). En algunas realizaciones, las células inmunitarias son una mezcla de linfocitos y células NK. Las células inmunitarias pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés). En algunas realizaciones, las células inmunitarias son linfocitos T que se han infiltrado en un tumor (por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores). Los linfocitos T pueden eliminarse durante la cirugía de un tumor de melanoma o de un tumor metastásico en un sujeto. Por ejemplo, los linfocitos T pueden aislarse después de la extracción del tejido tumoral mediante biopsia. Las células inmunitarias pueden modificarse tras el aislamiento a partir de un donante. Las células inmunitarias pueden ser linfocitos T con receptor de antígenos quimérico (CAR).
Los linfocitos T pueden aislarse de una muestra que contiene una población de células, tal como una muestra de sangre, de linfa o de biopsia de tejido. Los linfocitos T pueden aislarse de una población de células por cualquier medio conocido en la técnica. El método puede comprender obtener una población en masa de linfocitos T a partir de una muestra de tumor mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, se puede obtener una población en masa de linfocitos T a partir de una muestra de tumor al disociar la muestra de tumor en una suspensión celular a partir de la cual se pueden seleccionar poblaciones de células específicas. Los métodos adecuados para obtener una población en masa de linfocitos T pueden incluir, pero sin limitación, uno cualquiera o más de disociar mecánicamente (por ejemplo, triturar) el tumor, disociar enzimáticamente (por ejemplo, digerir) el tumor, y aspiración (por ejemplo, como con una aguja).
La población en masa de linfocitos T obtenida de una muestra de tumor puede comprender cualquier tipo adecuado de linfocito T. Preferentemente, la población en masa de linfocitos T obtenida de una muestra de tumor comprende linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
La muestra de tumor se puede obtener de cualquier mamífero. A menos que se indique lo contrario, como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero incluyendo, pero sin limitación, mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos; del orden Carnivora, incluyendo felinos (gatos) y caninos (perros); del orden Artiodactyla, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos); o del orden Perissodactyla, incluyendo equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser primates no humanos, por ejemplo, del orden primates, ceboides o simioides (monos) o del orden antropoides (seres humanos y simios). El mamífero puede ser un mamífero del orden Rodentia, tal como ratones y hámsteres. Preferentemente, el mamífero es un primate no humano o un ser humano. Un mamífero ilustrativo es un ser humano. El sujeto que recibirá las células inmunitarias también puede ser el donante de la muestra tumoral (es decir, ACT autóloga)
Los linfocitos T se pueden obtener de varias fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de ganglios linfáticos, tejido del bazo y tumores. Los linfocitos T se pueden obtener a partir de una unidad de sangre extraída de un sujeto usando cualquier número de técnicas conocidas por el experto en la materia, tal como la separación con Ficoll. Las células de la sangre circulante de un individuo pueden obtenerse mediante aféresis o leucoféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluyendo linfocitos T, monocitos, granulocitos, linfocitos B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y plaquetas. Las células recogidas por aféresis se pueden lavar para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para etapas de procesamiento posteriores. Las células se pueden lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La solución de lavado puede carecer de calcio y puede carecer de magnesio o puede carecer de muchos, si no de todos, los cationes divalentes. Las etapas iniciales de activación en ausencia de calcio dan lugar a una activación magnificada. Como pueden apreciar fácilmente los expertos en la materia, una etapa de lavado se puede lograr mediante métodos conocidos por los expertos en la materia, tal como mediante el uso de una centrífuga de "flujo continuo" semiautomática (por ejemplo, el procesador de células Cobe 2991) según las instrucciones del fabricante. Después del lavado, las células se pueden resuspender en una variedad de tampones biocompatibles, tales como, por ejemplo, PBS sin calcio, sin magnesio. Como alternativa, los componentes no deseables de la muestra de aféresis se pueden eliminar y las células se resuspenden directamente en el medio de cultivo.
Los linfocitos T se pueden aislar de los linfocitos de sangre periférica mediante la lisis de los glóbulos rojos y el agotamiento de los monocitos, por ejemplo, por centrifugación a través de un gradiente PERCOLL™. Una subpoblación específica de linfocitos T, tal como linfocitos T CD28+, CD4+, CDC, CD45RA+ and CD45RO+, puede aislarse adicionalmente mediante técnicas de selección positiva o negativa. Los linfocitos T pueden aislarse mediante incubación con perlas conjugadas anti-CD3/anti-CD28 (es decir, 3x28), tal como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T o XCYTE DYNABEADS™ durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de los linfocitos T deseados. El período de tiempo puede ser de aproximadamente 30 minutos. El período de tiempo puede oscilar entre 30 minutos y 36 horas o más y todos los valores enteros intermedios. El período de tiempo puede ser de al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 horas. El período de tiempo puede ser de 10 a 24 horas. El período de tiempo de incubación puede ser de 24 horas. Para el aislamiento de linfocitos T de pacientes con leucemia, un uso de tiempos de incubación más largos, tal como 24 horas, puede aumentar el rendimiento celular. Se pueden utilizar tiempos de incubación más largos para aislar linfocitos T en cualquier situación en la que haya pocos linfocitos T en comparación con otros tipos celulares, tales como el aislamiento de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a partir de tejido tumoral o de individuos inmunocomprometidos. Asimismo, el uso de tiempos de incubación más largos puede aumentar la eficacia de la captura de linfocitos T CD8+.
El enriquecimiento de una población de linfocitos T por selección negativa se puede lograr con una combinación de anticuerpos dirigidos a marcadores de superficie exclusivos de las células seleccionadas negativamente. El método puede ser la clasificación y/o selección de células a través de inmunoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza un cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas negativamente. Por ejemplo, para el enriquecimiento en células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales normalmente incluye anticuerpos contra CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y CD8.
Asimismo, las poblaciones de monocitos (es decir, células CD14+) se pueden agotar de las preparaciones de sangre mediante una variedad de metodologías, incluyendo perlas o columnas recubiertas de anti-CD14, o la utilización de la actividad fagocitósica de estas células para facilitar la eliminación. Pueden usarse partículas paramagnéticas de un tamaño suficiente para ser engullidas por monocitos fagocitósicos. Las partículas paramagnéticas pueden ser perlas comercialmente disponibles, por ejemplo, las producidas por Life Technologies con el nombre comercial Dynabeads™. Otras células no específicas pueden eliminarse revistiendo las partículas paramagnéticas con proteínas "ajenas" (por ejemplo, proteínas séricas o anticuerpos). Las proteínas y anticuerpos ajenos incluyen aquellas proteínas y anticuerpos o fragmentos de los mismos que no se dirigen específicamente a los linfocitos T que se van a aislar. Las perlas ajenas pueden incluir perlas recubiertas con anticuerpos de oveja antirratón, anticuerpos de cabra antirratón y albúmina de suero humano.
En resumen, tal agotamiento de monocitos se realiza incubando previamente linfocitos T aislados de sangre completa, sangre periférica obtenida por aféresis, o tumores con una o más variedades de partículas paramagnéticas acopladas sin anticuerpos o ajenas en cualquier cantidad que permita la eliminación de monocitos (aproximadamente una relación perla:célula de 20:1) durante aproximadamente 30 minutos a 2 horas de 22 a 37 grados centígrados, seguida de la eliminación magnética de las células que se han fijado a o engullido las partículas paramagnéticas. Dicha separación se puede realizar utilizando métodos convencionales disponibles en la técnica. Por ejemplo, se puede usar cualquier metodología de separación magnética, incluida una variedad de las que están disponibles comercialmente, (por ejemplo, concentrador de partículas magnéticas DYNAL® (DYNAL MPC®)). La garantía del agotamiento requerido se puede monitorizar mediante una variedad de metodologías conocidas por los expertos en la materia, incluyendo análisis por citometría de flujo de células CD14 positivas, antes y después del agotamiento.
Para el aislamiento de una población de células deseada mediante selección positiva o negativa, se puede variar la concentración de células y superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas). Puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el que las perlas y las células se mezclan (es decir, aumentar la concentración de células), para asegurar el máximo contacto de células y perlas. Se puede utilizar una concentración de 2 mil millones de células/ml. Se puede utilizar una concentración de 1 mil millones de células/ml. Se pueden utilizar más de 100 millones de células/ml. Se puede utilizar una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml. Se puede utilizar una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml. Se pueden utilizar concentraciones de 125 o 150 millones de células/ml. El uso de altas concentraciones puede dar como resultado un mayor rendimiento celular, activación celular y expansión celular. Asimismo, el uso de altas concentraciones de células permite una captura más eficaz de células que pueden expresar débilmente los antígenos diana de interés, tal como linfocitos T CD28 negativos, o de muestras donde hay muchas células tumorales presentes (es decir, sangre leucémica, tejido tumoral, etc.). Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y sería deseable obtenerlas. Por ejemplo, el uso de una alta concentración de células permite una selección más eficaz de los linfocitos T CD8+ que normalmente tienen una expresión de CD28 más débil.
Puede ser deseable usar concentraciones más bajas de células. Al diluir significativamente la mezcla de linfocitos T y la superficie (por ejemplo, partículas tales como perlas), se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona células que expresan grandes cantidades de antígenos deseados para unirse a las partículas. Por ejemplo, los linfocitos T CD4+ expresan niveles más altos de CD28 y se capturan de manera más eficaz que los linfocitos T CD8+ en concentraciones diluidas. La concentración de células utilizadas puede ser 5x106/ml. La concentración utilizada puede ser de aproximadamente 1x105/ml a 1x106/ml y cualquier valor entero intermedio.
Los linfocitos T también se pueden congelar. La etapa de congelación y posterior descongelación puede proporcionar un producto más uniforme eliminando los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. Después de una etapa de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas, las células se pueden suspender en una solución de congelación. Si bien muchas soluciones y parámetros de congelación se conocen en la técnica y serán útiles en este contexto, un método implica el uso de PBS que contiene DMSO al 20 % y albúmina de suero humano al 8 % u otros medios de congelación de células adecuados, las células se congelan a -80 °C a una tasa de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Se pueden utilizar otros métodos de congelación controlada, así como la congelación no controlada inmediatamente a -20 °C o en nitrógeno líquido.
Los linfocitos T para su uso en la presente invención también pueden ser linfocitos T específicos de antígeno. Por ejemplo, se pueden usar linfocitos T específicos de tumor. Los linfocitos T específicos de antígeno se pueden aislar de un paciente de interés, tal como un paciente afectado por un melanoma, tal como un paciente con un tumor de melanoma. El paciente puede tener melanoma.
Se pueden determinar los neoepítopos para un sujeto y se aíslan los linfocitos T específicos para estos antígenos. También se pueden generar células específicas de antígeno para su uso en la expansión in vitro utilizando cualquier número de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la publicación de patente de los Estados Unidos n.° US 20040224402 titulada, Generation And Isolation of Antigen-Specific T Cells, o en la patente de los Estados Unidos n° 6.040.177. Las células específicas de antígeno para su uso en la presente invención también se pueden generar utilizando cualquier número de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Immunology, o Current Protocols in Cell Biology, publicados ambos por John Wiley & Sons, Inc., Boston, Mass.
Puede ser deseable clasificar o seleccionar de manera positiva de otro modo (por ejemplo, mediante selección magnética) las células específicas de antígeno antes o después de una o dos rondas de expansión. La clasificación o selección positiva de células específicas de antígeno se puede realizar utilizando tetrámeros de péptido-MHC (Altman, et al., Science. 4 de octubre de 1996; 274(5284):94-6). Se puede utilizar el enfoque de tecnología de tetrámero adaptable (Andersen et al., 2012 Nat Protoc. 7:891-902). Los tetrámeros están limitados por la necesidad de utilizar péptidos de unión predichos basándose en hipótesis previas y la restricción a HLA específicos. Los tetrámeros de péptido-MHC pueden generarse usando técnicas conocidas en la técnica y pueden prepararse con cualquier molécula MHC de interés y cualquier antígeno de interés como se describe en el presente documento. Los epítopos específicos para usar en este contexto pueden identificarse usando numerosos ensayos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido para unirse con el MHC de clase I puede evaluarse indirectamente mediante la monitorización de la capacidad de promover la incorporación de p2-microglobulina (p2m) marcada con 125I en complejos heterotriméricos de MHC de clase I/p2m/péptido (véase Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994).
Los linfocitos T pueden modificarse de forma recombinante para expresar un receptor modificado o quimérico (por ejemplo, linfocitos T modificados con receptor de antígenos quimérico (CAR)).
Las células se pueden marcar directamente con un reactivo específico de epítopo para el aislamiento mediante citometría de flujo seguido de la caracterización del fenotipo y los TCR. Los linfocitos T pueden aislarse poniendo en contacto los anticuerpos específicos de linfocitos T. La clasificación de linfocitos T específicos de antígeno, o en general de cualquier célula de la presente invención, se puede realizar utilizando cualquiera de una variedad de clasificadores de células disponibles comercialmente, incluyendo, pero sin limitación, clasificador MoFlo (DakoCytomation, Fort Collins, Colo.), FACSAria™, FACSArray™, FACSVantage™, BD™ LSR II y FACSCalibur™ (BD Biosciences, San José, Calif.).
El método puede comprender seleccionar células que también expresan CD3. El método puede comprender seleccionar específicamente las células de cualquier manera adecuada. Preferentemente, la selección se realiza mediante citometría de flujo. La citometría de flujo se puede realizar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. La citometría de flujo puede emplear cualquier anticuerpo y tinción adecuados. Preferentemente, el anticuerpo se elige de manera que reconozca y se una de manera específica al biomarcador particular que se está seleccionando. Por ejemplo, la selección específica de CD3, CD8, TIM-3, LAG-3, 4-1BB o p D-1 se puede realizar utilizando anticuerpos anti-CD3, anti-CD8, anti-TIM-3, anti-LAG-3, anti-4-1BB o anti-PD-1, respectivamente. El anticuerpo o anticuerpos pueden conjugarse con una perla (por ejemplo, una perla magnética) o con un fluorocromo. Preferentemente, la citometría de flujo es clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los TCR expresados en linfocitos T se pueden seleccionar en función de la reactividad a los tumores autólogos. Adicionalmente, los linfocitos T que son reactivos a los tumores se pueden seleccionar basándose en marcadores usando los métodos descritos en las publicaciones de patentes números WO2014133567 y WO2014133568. Adicionalmente, los linfocitos T activados pueden seleccionarse en función de la expresión superficial de CD107a.
El método puede comprender además expandir el número de linfocitos T en la población celular enriquecida. Dichos métodos se describen en la patente de los Estados Unidos n.° 8.637.307. Los linfocitos T pueden expandirse antes o después del tratamiento de las células con el polipéptido PTD-MYC. El número de linfocitos T se puede aumentar al menos aproximadamente 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces), más preferentemente al menos aproximadamente 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 veces), más preferentemente al menos aproximadamente 100 veces, más preferentemente al menos aproximadamente 1.000 veces y lo más preferentemente al menos aproximadamente 100.000 veces. El número de linfocitos T puede expandirse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Se describen métodos ilustrativos para expandir el número de células en la publicación de patente n.° WO 2003057171, en la patente de los Estados Unidos n.° 8.034.334 y en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos n.° 2012/0244133.
La expansión de linfocitos T ex vivo se puede realizar mediante el aislamiento de los linfocitos T y la posterior estimulación o activación seguida de una expansión adicional. Los linfocitos T pueden estimularse o activarse mediante un solo agente. Los linfocitos T pueden estimularse o activarse con dos agentes, uno que induce una señal primaria y un segundo que es una señal coestimuladora. Los ligandos útiles para estimular una única señal o estimular una señal primaria y una molécula accesoria que estimula una segunda señal pueden usarse en forma soluble. Los ligandos se pueden fijar a la superficie de una célula, a una plataforma de señalización multivalente modificada por ingeniería (EMSP, por sus siglas en inglés), o inmovilizar en una superficie. Tanto los agentes primarios como los secundarios se pueden inmovilizar conjuntamente en una superficie, por ejemplo, una perla o una célula. La molécula que proporciona la señal de activación primaria puede ser un ligando de CD3 y la molécula coestimuladora puede ser un ligando de CD28 o un ligando de 4-1BB. Las células pueden expandirse por estimulación con uno o más antígenos, tal como un antígeno tumoral de melanoma o antígenos derivados de tumor del paciente.
Las células inmunitarias aisladas pueden tratarse inmediatamente con el polipéptido de fusión PTD-MYC después del aislamiento. Las células inmunitarias aisladas se almacenan en un tampón adecuado y se congelan antes del tratamiento con el polipéptido de fusión PTD-MYC. Las células inmunitarias aisladas pueden tratarse inmediatamente con el polipéptido de fusión PTD-MYC después del aislamiento y las células tratadas se almacenan en un tampón adecuado y se congelan hasta que se necesitan para la administración al paciente.
Las células inmunitarias aisladas (por ejemplo, una población mixta de células inmunitarias o tipos aislados, tales como linfocitos infiltrantes de tumores) pueden ponerse en contacto con una composición que contiene un polipéptido de fusión PTD-MYC durante un período de tiempo suficiente para que las células lo absorban. Las células inmunitarias pueden ponerse en contacto con una composición que contiene un polipéptido de fusión PTD-MYC durante menos de aproximadamente 24 horas, menos de aproximadamente 23 horas, menos de aproximadamente 22 horas, menos de aproximadamente 21 horas, menos de aproximadamente 20 horas, menos de aproximadamente 19 horas, menos de aproximadamente 18 horas, menos de aproximadamente 17 horas, menos de aproximadamente 16 horas, menos de aproximadamente 15 horas, menos de aproximadamente 14 horas, menos de aproximadamente 13 horas, menos de aproximadamente 12 horas, menos de aproximadamente 11 horas, menos de aproximadamente 10 horas, menos de aproximadamente 9 horas, menos de aproximadamente 8 horas, menos de aproximadamente 7 horas, menos de aproximadamente 6 horas, menos de aproximadamente 5 horas, menos de aproximadamente 4 horas, menos de aproximadamente 3 horas, menos de aproximadamente 2 horas o menos de aproximadamente 1 hora.
Las células inmunitarias pueden ponerse en contacto con una composición que contiene un polipéptido de fusión PTD-MYC durante menos de aproximadamente 55 minutos, menos de aproximadamente 50 minutos, menos de aproximadamente 45 minutos, menos de aproximadamente 40 minutos, menos de aproximadamente 35 minutos, menos de aproximadamente 30 minutos, menos de aproximadamente 29 minutos, menos de aproximadamente 28 minutos, menos de aproximadamente 27 minutos, menos de aproximadamente 26 minutos, menos de aproximadamente 25 minutos, menos de aproximadamente 24 minutos, menos de aproximadamente 23 minutos, menos de aproximadamente 22 minutos, menos de aproximadamente 21 minutos, menos de aproximadamente 20 minutos, menos de aproximadamente 19 minutos, menos de aproximadamente 18 minutos, menos de aproximadamente 17 minutos, menos de aproximadamente 16 minutos, menos de aproximadamente 15 minutos, menos de aproximadamente 14 minutos, menos de aproximadamente 13 minutos, menos de aproximadamente 12 minutos, menos de aproximadamente 11 minutos o menos de aproximadamente 10 minutos. Las células inmunitarias pueden ponerse en contacto con una composición que contiene un polipéptido de fusión PTD-MYC durante aproximadamente 1 hora.
Las células inmunitarias pueden ponerse en contacto con una composición que contiene un polipéptido de fusión PTD-MYC durante 24 horas o más. Las células inmunitarias pueden ponerse en contacto con una composición que contiene un polipéptido de fusión PTD-MYC durante menos de aproximadamente 12 días, menos de aproximadamente 11 días, menos de aproximadamente 10 días, menos de aproximadamente 9 días, menos de aproximadamente 8 días, menos de aproximadamente 7 días, menos de aproximadamente 6 días, menos de aproximadamente 5 días, menos de aproximadamente 4 días, menos de aproximadamente 2 días o menos de aproximadamente 1 día.
Las células pueden ponerse en contacto con un polipéptido de fusión de MYC a una concentración de 0,5 pg/ml a 500 |jg/ml, 0,5 pg/ml, al menos 0,6 pg/ml, al menos 0,7 pg/ml, al menos 0,8 pg/ml, al menos 0,9 pg/ml, al menos 1 pg/ml, al menos 2 pg/ml, al menos 3 pg/ml, al menos 4 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 6 pg/ml, al menos 7 pg/ml, al menos 8 pg/ml, al menos 9 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 15 pg/ml, al menos 20 pg/ml, al menos 25 pg/ml, al menos 30 pg/ml, al menos 35 pg/ml, al menos 40 pg/ml, al menos 45 pg/ml, al menos 50 pg/ml, al menos 55 pg/ml, al menos 60 pg/ml, al menos 65 pg/ml, al menos 70 pg/ml, al menos 75 pg/ml, al menos 80 pg/ml, al menos 85 pg/ml, al menos 90 |jg/ml, al menos 95 |jg/ml o al menos 100 |jg/ml.
Proteínas de fusión de MYC
El polipéptido de fusión PTD-MYC puede comprender un dominio de transducción de proteínas (PTD), un polipéptido MYC que promueve una o más de supervivencia o proliferación celular y, opcionalmente, un dominio etiqueta de proteína, por ejemplo, una o más secuencias de aminoácidos que facilitan la purificación de la proteína de fusión. Una célula que se pone en contacto con el polipéptido MYC puede presentar un mayor tiempo de supervivencia (por ejemplo, en comparación con una célula idéntica o similar del mismo tipo que no se puso en contacto con MYC), y/o un aumento de la proliferación (por ejemplo, en comparación con una célula idéntica o similar del mismo tipo que no se puso en contacto con MYC).
La proteína de fusión puede comprender (a) un dominio de transducción de proteínas; y (b) una secuencia de polipéptido MYC. El péptido de fusión puede ser un péptido de Fórmula (I):
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC.
Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) un dominio de transducción de proteínas; (b) una secuencia de polipéptido MYC; y (c) una o más moléculas que unen el dominio de transducción de proteínas y la secuencia de polipéptido MYC. El péptido de fusión puede ser un péptido de fórmula (II):
dominio de transducción de proteínas-X-secuencia de polipéptido MYC,
en donde -X- es una molécula que une el dominio de transducción de proteínas y la secuencia de polipéptido MYC. -X- puede ser al menos un aminoácido.
Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) un dominio de transducción de proteínas; (b) una secuencia de polipéptido MYC; (c) al menos dos etiquetas de proteínas; y (d) opcionalmente uno o más enlazadores. El péptido de fusión puede ser un péptido de Fórmula (III-VI):
dominio de transducción de proteínas-X-secuencia de polipéptido MYC-X-etiqueta de proteína 1-X-etiqueta de proteína 2 (Fórmula (III)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-X-etiqueta de proteína 1-X-etiqueta de proteína 2 (Fórmula (IV)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-etiqueta de proteína 1-X-etiqueta de proteína 2 (Fórmula (V)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-etiqueta de proteína 1-etiqueta de proteína 2 (Fórmula (VI)),
en donde -X- es un enlazador. -X- puede ser uno o más aminoácidos.
Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) un dominio de transducción de proteínas; (b) una secuencia de polipéptido MYC; (c) una etiqueta de 6-histidina; (d) una etiqueta de epítopo V5: y (e) opcionalmente uno o más enlazadores. El péptido de fusión puede ser un péptido de Fórmula (VII-XIV):
dominio de transducción de proteínas-X-secuencia de polipéptido MYC-X-etiqueta de 6-histidina-X-etiqueta de epítopo V5 (Fórmula (VII)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-X-etiqueta de 6-histidina-X-etiqueta de epítopo V5 (Fórmula (VIII)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-etiqueta de 6-histidina-X-etiqueta de epítopo V5 (Fórmula (IX)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-etiqueta de 6-histidina-etiqueta de epítopo V5 (Fórmula (X)),
dominio de transducción de proteínas-X-secuencia de polipéptido MYC-X-etiqueta de epítopo V5-X-etiqueta de 6-histidina (Fórmula (XI)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-X-etiqueta de epítopo V5-X-etiqueta de 6-histidina (Fórmula (XII)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-etiqueta de epítopo V5-X-etiqueta de 6-histidina (Fórmula (XIII)), o
dominio de transducción de proteínas-secuencia de polipéptido MYC-etiqueta de epítopo V5-etiqueta de 6-histidina (Fórmula (XIV)),
en donde -X- es un enlazador. -X- puede ser uno o más aminoácidos.
Como se ha indicado anteriormente, la proteína de fusión de MYC puede comprender una o más secuencias enlazadoras. Las secuencias enlazadoras se pueden emplear para unir el dominio de transducción de proteínas, secuencia de polipéptido MYC, etiqueta de epítopo V5 y/o etiqueta de 6-histidina de la proteína de fusión. El enlazador puede comprender uno o más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del enlazador puede comprender KGELNSKLE. El enlazador puede comprender la secuencia de aminoácidos de RTG.
Dominio de transducción de proteínas (PTD)
La proteína de fusión de MYC puede incluir un dominio de transducción de proteínas. El transporte de péptidos proporciona una alternativa para el suministro de moléculas pequeñas, proteínas o ácidos nucleicos a través de la membrana celular a un compartimento intracelular de una célula. Un ejemplo no limitante y un dominio de transducción de proteínas (PTD) bien caracterizado es un péptido derivado de TAT. Frankel et al., (véanse, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 5.804.604, la patente de los Estados Unidos n.° 5.747.641, la patente de los Estados Unidos n.° 5.674.980, la patente de los Estados Unidos n.° 5.670.617 y la patente de los Estados Unidos n.° 5.652.122) demostró el transporte de una proteína de carga (p-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante) en una célula mediante la conjugación de un péptido que contenía los aminoácidos 48-57 de TAT a la proteína de carga. TAT puede comprender una secuencia de aminoácidos de MRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 7).
Otro ejemplo no limitante de un PTD es la penetratina. La penetratina puede transportar macromoléculas hidrófilas a través de la membrana celular (Derossi et al., Trends Cell Biol., 8:84-87 (1998)). La penetratina es un péptido de 16 aminoácidos que corresponde a los aminoácidos 43-58 del homeodominio de Antennapedia, un factor de transcripción de Drosophila que es internalizado por las células en cultivo.
Otro ejemplo no limitante más de un PTD es VP22. VP22, una proteína del tegumento del virus del herpes simple de tipo 1 (HSV-1), tiene la capacidad de transportar proteínas y ácidos nucleicos a través de una membrana celular (Elliot et al., Cell 88:223-233, 1997). Los restos 267-300 de VP22 son necesarios, pero no suficientes para el transporte. Debido a que no se ha identificado la región responsable de la función de transporte, se utiliza comúnmente toda la proteína VP22 para transportar proteínas de carga y ácidos nucleicos a través de la membrana celular (Schwarze et al., Trends Pharmacol Sci, 21:45-48, 2000).
El polipéptido de fusión PTD-MYC puede incluir un dominio de transducción de proteínas. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, el dominio de transducción de proteínas puede comprender el dominio de transducción de proteínas de uno o más de TAT, penetratina, VP22, vpr, EPTD, R9, R15, VP16 y Antennapedia. El dominio de transducción de proteínas puede comprender el dominio de transducción de proteínas de uno o más de TAT, penetratina, VP22, vpr y EPTd . El dominio de transducción de proteínas puede comprender el dominio de transducción de proteínas de al menos uno de TAT, penetratina, VP22, vpr, EPTD, R9, R15, VP16 y Antennapedia. El dominio de transducción de proteínas puede comprender un dominio de transducción de proteínas sintético (por ejemplo, poliarginina o PTD-5). El dominio de transducción de proteínas puede comprender un dominio de transducción de proteínas TAT. El dominio de transducción de proteínas puede estar unido covalentemente al polipéptido MYC. El dominio de transducción de proteínas puede unirse al polipéptido MYC a través de un enlace peptídico. El dominio de transducción de proteínas se puede unir al polipéptido My C a través de una secuencia enlazadora. El enlazador puede comprender una secuencia de aminoácidos corta. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, las secuencias enlazadoras pueden tener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de longitud.
La proteína de fusión de MYC de la presente tecnología se puede disponer en cualquier orden deseado. La proteína de fusión de MYC se puede disponer en el orden de a) el dominio de transducción de proteínas enlazado en marco con el polipéptido MYC, b) el polipéptido MYC enlazado en marco con el dominio V5, y c) el dominio V5 enlazado en marco con la etiqueta de epítopo de 6-histidina. La proteína de fusión de MYC puede tener un orden de componentes de a) el polipéptido MYC enlazado en marco al dominio de transducción de proteínas, b) el dominio de transducción de proteínas enlazado en marco al dominio V5, y c) el dominio V5 enlazado en marco al dominio de epítopo de etiqueta 6-histidina. Se pueden incluir secuencias de aminoácidos adicionales entre cada una de las secuencias. Se pueden incluir aminoácidos adicionales al comienzo y/o al final de las secuencias polipeptídicas.
El dominio de transducción de proteínas puede ser un dominio de transducción de proteínas TAT. El dominio de transducción de proteínas puede ser TAT[48-57]. El dominio de transducción de proteínas puede ser TAT[57-48].
Dominios de etiquetas de proteínas
La proteína de fusión de MYC puede comprender un dominio de etiqueta de proteína que comprende una o más secuencias de aminoácidos que facilitan la purificación de la proteína de fusión. El dominio de etiqueta de proteína puede comprender uno o más de una etiqueta de polihistidina y una etiqueta de epítopo. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, las etiquetas ilustrativas incluyen una o más de una etiqueta de V5, una de histidina (por ejemplo, una etiqueta de 6-histidina), etiquetas de HA (hemaglutinina), etiqueta FLAG, CBP (péptido de unión a calmodulina), CYD (péptido NorpD covalente pero disociable), Strepll, o HPC (cadena pesada de proteína C). El dominio de etiqueta de proteína puede tener una longitud de aproximadamente 10 a 20 aminoácidos. El dominio de etiqueta de proteína puede comprender de 2 a 40 aminoácidos de longitud, por ejemplo 6-20 aminoácidos de longitud. Dos de las etiquetas enumeradas anteriormente (por ejemplo, V5 y la etiqueta HIS) pueden usarse juntas para formar el dominio de etiqueta de proteína.
La etiqueta de histidina puede ser una etiqueta de 6-histidina. La etiqueta de histidina puede comprender la secuencia HHHHHH (SEQ ID NO: 8). El péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender una etiqueta de epítopo V5. La etiqueta de v 5 puede comprender la secuencia de aminoácidos de: GKPIPNPLLGLDST (SEQ ID NO: 9). La etiqueta de V5 puede comprender la secuencia de aminoácidos de IPNPLLGLD (SEQ ID NO: 10).
Las etiquetas de proteínas se pueden añadir a la proteína de fusión divulgada en el presente documento mediante cualquier método adecuado. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, una secuencia de TAT-polipéptido MYC puede clonarse en un vector de expresión que codifica una o más etiquetas de proteína, por ejemplo, una etiqueta de poliHis y/o una etiqueta de V5. Se puede agregar una etiqueta de polihistidina y/o una etiqueta de V5 mediante PCR (es decir, los cebadores de PCR comprenden una secuencia de polihistidina y/o una secuencia de V5).
Construcción de polipéptidos de fusión PTD-MYC
Los polipéptidos de fusión PTD-MYC (por ejemplo, el polipéptido de fusión TAT-MYC) divulgados en el presente documento pueden construirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de fusión TAT-MYC puede generarse mediante PCR. Un cebador directo para una secuencia MYC humana puede comprender una secuencia de 9 aminoácidos aminoterminal en fase del dominio de transducción de proteínas TAT (por ejemplo, RKKRRQRRR). Puede diseñarse un cebador inverso para una secuencia MYC humana para eliminar el codón de terminación. El producto de PCR se puede clonar en cualquier vector de expresión adecuado. El vector de expresión puede comprender una etiqueta de polihistidina y una etiqueta de V5.
Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) TAT y (b) c-MYC. Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) TAT[48-57] y (b) c-MYC. Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) TAT[57-48] y (b) c-MYC.
Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) TAT, (b) c-MYC, (c) uno o más enlazadores, (d) etiqueta de V5 y (e) etiqueta de 6-histidina. Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) TAT[48-57], (b) c-MYC, (c) uno o más enlazadores, (d) etiqueta de V5 y (e) etiqueta de 6-histidina. Un péptido de fusión divulgado en el presente documento puede comprender (a) TAT[57-48], (b) c-MYC, (c) uno o más enlazadores, (d) etiqueta de V5 y (e) etiqueta de 6-histidina.
El polipéptido de fusión PTD-MYC puede comprender la SEQ ID NO: 1; el polipéptido de fusión PTD-MYC puede ser la SEQ ID NO: 1.
MRKKRRQRRRPLNVSFTNRNYDLDYDSVQPYFYCDEEENFYQQQQQSELQPPAPSEDIWKKFELLPTPPLSPSR RSGLCSPSYVAVTPFSLRGDNDGGGGSFSTADQLEMVTELLGGDMVNQSFICDPDDETFIKNIIIQDCMWSGFSA AAKLVSEKLASYQAARKDSGSPNPARGHSVCSTSSLYLQDLSAAASECIDPSVVFPYPLNDSSSPKSCASQDSSA FSPSSDSLLSSTESSPQGSPEPLVLHEETPPTTSSDSEEEQEDEEEIDVVSVEKRQAPGKRSESGSPSAGGHSKP
PHSPLVLKRCHVSTHQHNYAAPPSTRKDYPAAKRVKLDSVRVLRQISNNRKCTSPRSSDTEENVKRRTHNVLER
QRRNELKRSFFALRDQIPELENNEKAPKVVILKKATAYILSVQAEEQKLISEEDLLRKRREQLKHKLEQLRKGELNS
KLEGKPIPNPLLG LDSTRTGHHHHHH (SEQ ID NO: 1).
La proteína de fusión se puede modificar durante o después de la síntesis para incluir uno o más grupos funcionales. A modo de ejemplo, pero no a modo de limitación, la proteína se puede modificar para incluir uno o más de un grupo acetilo, fosfato, acetato, amida, alquilo y/o metilo. Esta lista no pretende ser exhaustiva y es únicamente un ejemplo. La proteína puede incluir al menos un grupo acetilo.
Un polipéptido de fusión PTD-MYC puede generarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mediante expresión de proteínas recombinantes en una célula, tal como una célula bacteriana, una célula de insecto o célula de mamífero. Un polipéptido de fusión PTD-MYC puede producirse de forma recombinante mediante fermentación microbiana. La fermentación microbiana se puede realizar en un volumen de fermentación de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 litros, por ejemplo, un volumen de fermentación de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 litros. La fermentación puede utilizar cualquier célula microbiana hospedadora y medio de cultivo adecuados. E. coli puede utilizarse como célula hospedadora microbiana. Se pueden utilizar otros microorganismos, por ejemplo, S. cerevisiae, P. pastoris, Lactobacilli, Bacilli y Aspergilli. La célula hospedadora microbiana puede ser la cepa BL-21 Star™ de E. coli (Invitrogen). La célula hospedadora microbiana puede ser la cepa BLR DE3 de E. coli.
Las células hospedadoras pueden modificarse para proporcionar ARNt para codones raros, que se emplean para superar el sesgo de codón de la célula microbiana hospedadora para mejorar la traducción de las proteínas expresadas. Las células hospedadoras (por ejemplo, E. coli) pueden transformarse con un plásmido, como pRARE (CamR), que expresa ARNt para los codones AGG, AGA, AUA, CUA, CCC, GGA. Otros plásmidos o construcciones adecuados para proporcionar ARNt para codones particulares se conocen en la técnica y se pueden emplear en los métodos proporcionados.
Los vectores integradores o autorreplicativos se pueden usar con la finalidad de introducir el casete de expresión del polipéptido de fusión PTD-MYC en una célula hospedadora de elección. En un casete de expresión, la secuencia codificante para el polipéptido de fusión PTD-MYC está unida operativamente al promotor, tal como un promotor inducible. Los promotores inducibles son promotores que inician mayores niveles de transcripción del ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. El ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión PTD-MYC puede tener codones optimizados para la expresión bacteriana.
Se conocen bien promotores ilustrativos que se reconocen por una variedad de posibles células hospedadoras. Estos promotores se pueden unir operativamente al ADN que codifica el polipéptido de fusión PTD-MYc eliminando el promotor del ADN de origen, si está presente, mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora aislada en el vector. Los promotores adecuados para su uso con hospedadores microbianos incluyen, pero sin limitación, los sistemas promotores de p-lactamasa y lactosa (Chang et al., (1978) Nature, 275:617-624; Goeddel et al., (1979) Nature, 281: 544), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057; documento EP 36.776) y promotores híbridos tal como el promotor tac (deBoer et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Puede usarse cualquier promotor adecuado para la expresión por parte de la célula hospedadora seleccionada. Se publican secuencias de nucleótidos adecuadas, lo que permite a un experto unirlos operativamente al ADN que codifica el polipéptido de fusión PTD-MYC (véase, por ejemplo, Siebenlist et al., (1980) Cell 20: 269) usando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción necesario. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos pueden contener una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) unida operativamente a la secuencia codificante. El promotor inducible puede ser el promotor lacZ, que se induce con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG, por sus siglas en inglés), como se sabe bien en la técnica. También se pueden sintetizar promotores y casetes de expresión de novo usando técnicas bien conocidas para sintetizar secuencias de ADN de interés. El vector de expresión para la expresión de los polipéptidos de fusión PTD-MYC del presente documento puede ser pET101/D-Topo (Invitrogen).
Para la expresión de los polipéptidos de fusión PTD-MYC, el hospedador microbiano que contiene el vector de expresión que codifica el polipéptido de fusión PTD-MYC normalmente se cultiva a alta densidad en un reactor de fermentación. El reactor puede tener alimentaciones controladas para glucosa. Un inóculo de fermentador se puede cultivar primero en un medio complementado con antibióticos (por ejemplo, cultivo nocturno). El inóculo del fermentador se usa después para inocular el cultivo del fermentador para la expresión de la proteína. A una DO600 de al menos aproximadamente 15, por lo general al menos aproximadamente 20, al menos 25, al menos aproximadamente 30 o mayores, del cultivo del fermentador, se induce la expresión de la proteína recombinante. Cuando el promotor inducible es el promotor lacZ, puede añadirse IPTG al medio de fermentación para inducir la expresión del polipéptido de fusión PTD-MYC. Generalmente, el IPTG se añade al cultivo del fermentador a una DO600 que representa la fase de crecimiento logarítmico.
La expresión de proteína inducida puede mantenerse durante alrededor de aproximadamente 2 a alrededor de aproximadamente 5 horas después de la inducción, y puede ser de alrededor de aproximadamente 2 a alrededor de aproximadamente 3 horas después de la inducción. Períodos de inducción más largos pueden no ser deseables debido a la degradación de la proteína recombinante. La temperatura de la mezcla de reacción durante la inducción es preferentemente de aproximadamente 28 °C a aproximadamente 37 °C, normalmente desde aproximadamente 30 °C hasta aproximadamente 37 °C. La inducción puede ser a aproximadamente 37 °C.
El polipéptido de fusión PTD-MYC se expresa normalmente como cuerpos de inclusión citosólicos en células microbianas. Para recoger cuerpos de inclusión, se recoge un sedimento celular por centrifugación del cultivo de fermentación después de la inducción, congelado a -70 °C o menos, descongelado y resuspendido en tampón de interrupción. Las células se lisan por métodos convencionales, por ejemplo, tratamiento por ultrasonidos, homogeneización, etc. Después, el lisado se resuspende en tampón de solubilización, generalmente en presencia de urea a una concentración eficaz para solubilizar proteínas, por ejemplo, de alrededor de aproximadamente 5 M, 6 M, 7 M, 8 M, 9 M o más. La resuspensión puede requerir la separación mecánica del sedimento y la agitación para lograr la homogeneidad. El sedimento celular puede resuspenderse directamente en tampón de urea y mezclarse hasta que sea homogéneo. El tampón de resuspensión/solubilización puede ser Urea 8 M, fosfato 50 mM pH 7,5 y la suspensión se puede pasar a través de un homogeneizador.
La suspensión homogeneizada se puede sulfonilar. La suspensión homogeneizada se puede ajustar para incluir sulfito de sodio 200 mM y tetrationato de sodio 10 mM. Después se mezcla la solución a temperatura ambiente hasta que sea homogénea. Después, el lisado mixto se mezcla durante un período de tiempo adicional para completar la sulfonilación (por ejemplo, a 2-8 °C durante > 12 horas). A continuación, el lisado sulfonilado se centrifugó durante una hora. A continuación, el sobrenadante que contiene los polipéptidos de fusión PTD-MYC sulfonilados se recoge mediante centrifugación y se desecha el sedimento celular. Después se pasa el sobrenadante a través de un filtro, por ejemplo, un filtro de membrana de 0,22 pm para aclarar el lisado.
A continuación, la proteína solubilizada se purifica. Los métodos de purificación pueden incluir cromatografía de afinidad, cromatografía de fase inversa, cromatografía en gel de exclusión y similares. Puede usarse cromatografía de afinidad. Por ejemplo, la proteína se proporciona con una etiqueta de epítopo o una etiqueta de 6 histidinas para una purificación adecuada. En los presentes métodos, el polipéptido de fusión PTD-MYC ilustrativo comprende la etiqueta de 6 histidinas para la purificación usando cromatografía de afinidad de Ni usando resina de Ni.
La columna de resina de Ni se puede equilibrar en un tampón que contenga urea. El tampón de equilibrio puede ser Urea 6 M, fosfato 50 mM, NaCl 500 mM y solución de glicerol al 10 %. El sobrenadante sulfonilado y clarificado que comprende el polipéptido de fusión PTD-MYC se carga después en la columna de resina de Ni. A continuación, la columna se lava con un tampón de lavado, por ejemplo, urea 6 M, fosfato 50 mM, glicerol al 10 %, NaCl 500 mM, pH 7.5. A continuación, la columna se lavó con tampones de lavado secuenciales con una concentración de sal decreciente. Por ejemplo, un lavado posterior ilustrativo puede incluir Urea 6 M, fosfato 50 mM, glicerol al 10 % y NaCl 2 M, pH 7,5, seguido de otro lavado de urea 6 M, fosfato 50 mM, glicerol al 10 %, NaCl 50 mM e imidazol 30 mM, pH 7.5.
Después de la aplicación secuencial de los tampones de lavado, el polipéptido de fusión PTD-MYC se eluye de la columna mediante la adición de tampón de elución, por ejemplo, urea 6 M, fosfato 50 mM, glicerol al 10 % y NaCl 50 mM, pH 7,5 con un gradiente de imidazol de 100 a 300 mM y fracciones de recogida. A continuación, las fracciones que contienen proteínas que van a agruparse se filtran a través de una membrana de 0,22 pm. La evaluación del rendimiento de proteínas se puede medir utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, espectrofotometría a una longitud de onda UV de 280.
Se pueden emplear uno o más métodos de purificación adicionales para purificar adicionalmente los polipéptidos de fusión PTD-MYC aislados. Las fracciones agrupadas de la etapa de cromatografía de Ni-Sepharose se pueden purificar adicionalmente mediante cromatografía de intercambio de aniones utilizando una resina de Q-Sepharose. El grupo se puede preparar para cargarlo en la columna de Q-Sepharose diluyendo las muestras a la conductividad del tampón de Q Sepharose (17,52 /-1 ms/cm) con el segundo tampón de lavado (por ejemplo, urea 6 M, fosfato 50 mM, glicerol al 10 %, NaCl 2 M, pH 7,5) de la etapa de cromatografía con Ni Sepharose. El grupo diluido después se carga en la columna de Q-Sepharose, seguido de dos etapas de seguimiento utilizando un tampón de seguimiento (por ejemplo, urea 6 M, fosfato 50 mM, NaCl 300 mM y glicerol al 10 %), con aplicaciones secuenciales del tampón de seguimiento adicionales hasta que la traza UV alcance el valor inicial, indicando que la proteína ha eluido de la columna.
Métodos de tratamiento
Las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC se administran para el tratamiento de un melanoma en un paciente. El paciente puede tener un melanoma metastásico. El paciente puede haber recibido uno o más agentes para el tratamiento del melanoma antes de la administración de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC. El melanoma puede ser un melanoma recidivante o refractario. El melanoma puede ser un melanoma metastásico. El melanoma puede ser un melanoma de extensión superficial, un melanoma nodular, un melanoma lentigo maligno o un melanoma acral. El melanoma puede ser resistente a uno o más agentes para el tratamiento del melanoma.
La administración de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC puede inhibir el crecimiento de un tumor de melanoma o reducir el volumen de un tumor de melanoma. La administración de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC a un sujeto que tiene un melanoma puede aliviar uno o más síntomas del melanoma. La administración de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC a un sujeto que tiene melanoma puede aumentar la supervivencia global del sujeto. La administración de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC a un sujeto que tiene melanoma puede aumentar la regresión del melanoma.
La administración de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC (por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores tratados con polipéptido de fusión PTD-MYC) según los métodos proporcionados en el presente documento se puede realizar de cualquier manera adecuada para administrar células a un sujeto, incluyendo, pero sin limitación, inyección, transfusión, implante o trasplante. Las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, por vía intradérmica, por vía intratumoral, por vía intraganglionar, por vía intramedular, por vía intramuscular, por vía intratecal, por inyección intravenosa o intralinfática o por vía intraperitoneal. Las células inmunitarias con polipéptido de fusión PTD-MYC pueden administrarse en una cavidad formada por la resección de tejido tumoral (es decir, suministro intracavitario) o directamente en un tumor antes de la resección (es decir, administración intratumoral). Las células inmunitarias con polipéptido de fusión de MYC pueden administrarse mediante inyección intravenosa.
Además de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC, las composiciones para la administración pueden comprender cualquier otro agente, tal como vehículos, tampones, excipientes, adyuvantes, aditivos, antisépticos, rellenos, agentes estabilizantes y/o espesantes, y/o cualquier componente que se encuentre normalmente en los productos correspondientes farmacéuticamente aceptables. La selección de los ingredientes adecuados y los métodos de fabricación apropiados para formular las composiciones para vías de administración particulares generalmente se conocen en la técnica.
La composición terapéutica celular adoptiva que comprende células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC puede estar en cualquier forma, tal como forma sólida, semisólida o líquida, adecuada para la administración. Una formulación se puede seleccionar de un grupo que consiste en, pero sin limitación, soluciones, emulsiones, suspensiones, comprimidos, gránulos y cápsulas. Las composiciones no se limitan a una determinada formulación, en cambio, la composición se puede formular en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable conocida. Las composiciones farmacéuticas se pueden producir mediante cualquier proceso convencional conocido en la técnica.
La administración de células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC puede comprender la administración de 104-1010 de las células por kg de peso corporal, incluyendo 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros de los números de célula dentro de esos intervalos. Las células se pueden administrar con o sin un curso de agotamiento de linfocitos, por ejemplo, con ciclofosfamida.
Las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC se pueden administrar en una o más dosis. La cantidad terapéuticamente eficaz de células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC puede administrarse como una dosis única. La administración de una dosis única de células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC puede tener un efecto terapéutico. La cantidad eficaz de células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC puede administrarse como más de una dosis durante un período de tiempo. El momento de la administración está a criterio del médico tratante y depende de varios factores, incluyendo, pero sin limitación, la edad, sexo, o estado clínico del paciente y características del melanoma, incluido el tipo, grado o ubicación del melanoma. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de una célula inmunitaria modificada con polipéptidos de fusión de MYC para el tratamiento de una enfermedad o afección particular está dentro de la experiencia de un experto en la materia.
Las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC se pueden administrar, por ejemplo, de 1 a 10 veces en las primeras 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, mensualmente o durante el período de tratamiento. Las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC pueden administrarse 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 veces. Las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC pueden administrarse semanalmente, cada 2 semanas, cada 3 semanas o mensualmente.
Una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, tipo de tratamiento concomitante, si lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.
Un paciente que recibe células inmunitarias modificadas con PTD-MYC puede tratarse previamente primero con una o más citocinas y/u otros agentes inmunomoduladores. Un paciente que recibe células inmunitarias modificadas con PTD-MYC puede tener agotamiento de linfocitos antes de la administración de las células inmunitarias modificadas con PTD-MYC. La finalidad del agotamiento de linfocitos es dejar espacio para los linfocitos infundidos, en particular eliminando los linfocitos T reguladores y otros linfocitos T no específicos que compiten por las citocinas homeostáticas.
Las células inmunitarias modificadas con PTD-MYC pueden administrarse con un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional puede administrarse antes de, simultáneamente con, intermitentemente con, o después del tratamiento con las células inmunitarias modificadas con PTD-MYC. El agente terapéutico adicional puede ser un inmunomodulador, tal como una interleucina (por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-12), una citocina, una quimiocina o un fármaco inmunomodulador. La citocina se puede seleccionar entre las citocinas se seleccionan de un grupo que consiste en interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, complemento C5a, IL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, Il 15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2. El agente terapéutico adicional puede ser un agente anticanceroso, tal como quimioterapia o radioterapia.
Las células inmunitarias modificadas administradas para el tratamiento de melanoma pueden ser linfocitos T con receptores de antígeno modificados genéticamente, incluyendo linfocitos T con receptor de antígenos quimérico (CAR)-T. Pueden emplearse varias estrategias, por ejemplo, para modificar genéticamente los linfocitos T alterando la especificidad del receptor de linfocitos T (TCR), por ejemplo, mediante la introducción de nuevas cadenas a y p de TCR con especificidad peptídica seleccionada (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 8.697.854; las publicaciones de patente del PCT n.°: WO2003020763, WO2004033685, WO2004044004, WO2005114215, WO2006000830, WO2008038002, WO2008039818, WO2004074322, WO2005113595, WO2006125962, WO2013166321, WO2013039889, WO2014018863, WO2014083173; la patente de los Estados Unidos n.° 8.088.379). Los receptores de antígenos quiméricos (CAR) se pueden utilizar para generar células inmunosensibles, tales como linfocitos T, específicas para las dianas seleccionadas, tal como células malignas, habiéndose descrito una amplia variedad de construcciones de quimeras de receptores (véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5.843.728; 5.851.828; 5.912.170; 6.004.811; 6.284.240; 6.392.013; 6.410.014; 6.753.162; 8.211.422; y, la publicación del PCT WO9215322). Los métodos para la preparación de linfocitos CAR T se conocen en la técnica y se pueden usar en combinación con los métodos proporcionados en el presente documento para generar linfocitos CAR T modificados que comprenden un polipéptido de fusión de MYC (por ejemplo, PTD) como se describe en el presente documento.
En general, los CAR están compuestos por un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular, en donde el dominio extracelular comprende un dominio de unión a antígeno que es específico para una diana predeterminada. Si bien el dominio de unión a antígeno de un CAR suele ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un fragmento variable de cadena sencilla, scFv), el dominio de unión no está particularmente limitado siempre que dé como resultado el reconocimiento específico de una diana. El dominio de unión al antígeno puede comprender un receptor, de manera que el CAR sea capaz de unirse al ligando del receptor. Como alternativa, el dominio de unión a antígeno puede comprender un ligando, de manera que el CAR sea capaz de unirse al receptor endógeno de ese ligando.
Los linfocitos T que expresan un CAR deseado pueden seleccionarse a través del cultivo conjunto con células de activación y propagación (AaPC, por sus siglas en inglés) irradiadas con radiación y, que coexpresan el antígeno de melanoma y moléculas coestimulantes. Los linfocitos CAR T modificados por ingeniería pueden expandirse, por ejemplo, por cultivo conjunto en AaPC en presencia de factores solubles, tal como IL-2 e IL-21. Esta expansión puede realizarse, por ejemplo, para proporcionar linfocitos CAR+ T de memoria. De esta forma, pueden proporcionarse linfocitos c Ar T que tengan actividad citotóxica específica contra tumores portadores de antígenos (opcionalmente junto con la producción de quimiocinas deseadas tales como interferón-y).
Los linfocitos T CAR pueden entonces ponerse en contacto con un polipéptido de fusión PTD-MYC proporcionado en el presente documento in vitro para generar linfocitos CAR T modificados para el tratamiento de un melanoma. Los linfocitos CAR T modificados se pueden administrar según cualquier método adecuado, incluyendo los métodos para la administración de las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión PTD-MYC como se describe anteriormente.
Kits
Las composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos de fusión de MYC y/o células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC proporcionadas en el presente documento pueden ensamblarse en kits o sistemas farmacéuticos para su uso en el tratamiento de un melanoma. Los kits pueden comprender un medio de transporte, tal como una caja, cartón, tubo, que tiene en confinamiento estrecho en el mismo uno o más recipientes, tales como viales, tubos, ampollas, frascos, jeringas o bolsas. Los kits también pueden comprender instrucciones asociadas para usar polipéptidos de fusión de MYC y/o células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC.
El kit puede comprender una cantidad eficaz de una terapia celular adoptiva, tal como células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC. El kit puede comprender uno o más reactivos para la detección de los polipéptidos de fusión de MYC administrados y/o células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC. El kit puede comprender células para el tratamiento con un polipéptido de fusión de MYC proporcionado en el presente documento, por ejemplo, células madre hematopoyéticas, leucocitos de donante, linfocitos T o células NK. El kit puede comprender además una cantidad eficaz de un agente terapéutico para administrar en combinación con polipéptidos de fusión de MYC y/o células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC proporcionadas en el presente documento. El agente terapéutico puede ser un agente anticanceroso.
Los kits proporcionados en el presente documento también pueden incluir un dispositivo para administrar polipéptidos de fusión de MYC y/o células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC proporcionados en el presente documento a un sujeto. Cualquiera de una variedad de dispositivos conocidos en la técnica para administrar polipéptidos y células a un sujeto puede incluirse en los kits proporcionados en el presente documento. Los dispositivos ilustrativos incluyen una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, una inyección sin aguja, pero sin limitación, una aguja hipodérmica, una aguja intravenosa, un catéter, un dispositivo de inyección sin aguja, un inhalador y un dispensador de líquido tal como un cuentagotas. Normalmente, el dispositivo para administrar los polipéptidos de fusión de MYC y/o las células inmunitarias modificadas con polipéptidos de fusión de MYC del kit será compatible con el método deseado de administración de la composición. Por ejemplo, una composición para suministrar por vía intravenosa se puede incluir en un kit con una aguja hipodérmica y una jeringa.
Ejemplos
Ejemplo 1. Células inmunitarias tratadas con TAT-MYC para generar linfocitos tratados con TAT-MYC para inmunoterapia de tumores de melanoma
En este ejemplo, se probó la capacidad de un polipéptido de fusión PTD-MYC que comprende el dominio de transducción de proteínas de la proteína de transactivación del HIV-1 (TAT) y MYC para modular una respuesta inmunitaria contra las células de melanoma in vivo. De manera específica, la capacidad de las células linfoides, procedentes de ratones portadores de melanoma y tratados con TAT-MYC, para tratar ratones que albergaban tumores de melanoma. El objeto de estos estudios era determinar si las células inmunitarias procedentes de ratones portadores de melanoma y tratadas con TAT-MYC para generar linfocitos TAT-MYC serían un tratamiento eficaz para los tumores de melanoma tras el trasplante en ratones portadores de melanoma.
Materiales y métodos
C57BL/6J es la cepa pura más utilizada y la primera en tener su genoma secuenciado. Aunque esta cepa es refractaria a muchos tumores, es un fondo permisivo para la expresión máxima de la mayoría de las mutaciones. Los ratones C57BL/6J son resistentes a las convulsiones audiogénicas, tienen una densidad ósea relativamente baja y presentan pérdida auditiva relacionada con la edad. También son susceptibles a la obesidad inducida por la dieta, diabetes de tipo 2 y aterosclerosis. Los macrófagos de esta cepa son resistentes a los efectos de la toxina letal del carbunco.
Grupos de tratamiento
Se generaron quince ratones C57BL/6 (Jackson Laboratory número de inventario 000664) que pesaban aproximadamente 25 g y albergaban tumores de melanoma y se dividieron en 3 cohortes de 5 animales, una cohorte de un ratón como control sin tratamiento, una cohorte tratada con células linfoides procedentes de ratones portadores de tumores y tratada con proteína de fusión TAT de control, y una cohorte tratada con linfocitos TAT-MYC.
Generación de ratones donantes portadores de tumores y preparación de células donantes
Se cultivaron células de melanoma B16-F10 (ATCC CRL 6475, melanoma de piel de ratón) para implantación en medio D10 (DMEM, FBS al 10 %, pen/strep (10.000 unidades por/ml) (Gibco, número de catálogo 15140); L-glutamina (200 mM) (Gibco, número de catálogo 25030); aminoácidos no esenciales MEM (Gibco, número de catálogo 11140)).
A los ratones C57BL/6j (Jackson Laboratory número 003548) se les implantaron 1x104 células de melanoma B16-F10 en 250 pl de PBS mediante inyección en la vena de la cola. Antes de la inyección, cada ratón de prueba se colocó bajo una lámpara de calor de 250 W durante 1-2 minutos y después se inyectó por vía intravenosa con las células de melanoma. A los 14 días del trasplante, se recogieron los ganglios linfáticos de los ratones inyectados y se trituraron con el émbolo de una jeringa de 10 ml.
Para el primer estudio, se recogieron los ganglios linfáticos de 5 ratones. Para el segundo, se recogieron ganglios linfáticos de 10 ratones. Las células se lavaron con C10, se recogieron y se centrifugaron a 260 xg durante 5 min. Después de descartar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 10 ml de TAC estéril, se centrifugaron a 260 xg durante 5 minutos. Tras descartar el sobrenadante, las células se resuspendieron en 2 ml de PBS filtrado estéril con BSA al 5 %.
Las células de los ganglios linfáticos se trataron con TAT-MYC para generar linfocitos TAT-MYC o se trataron con una proteína de fusión de TAT de control. Las células se dividieron en 2 tubos cónicos de 15 ml (1 ml cada uno), se trataron con 1 ml de 25 ug/ml de una proteína de control (TAT-CRE para el experimento 1, TAT-GFP para el experimento 2) o 1 ml de 25 ug/ml de TAT-MYC lote C18. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, cada tubo se lavó con PBS estéril tres veces, se transfirieron a tubos estériles de 5 ml y se colocaron en hielo.
Los ratones de prueba se prepararon inyectando 1x104 células de melanoma B16-F10 en 250 ul de PBS en la vena de la cola para cada cohorte de 5 ratones C57BL/6j. Después de la inyección, los ratones se observaron una vez al día. Se controlaron los cambios en el peso corporal, el consumo de comida, la actividad y la mortalidad. A los 7 días del trasplante, a continuación, se trasplantaron linfocitos TAT-MYC o células linfoides de control en ratones inyectados con células de melanoma.
Los síntomas fueron monitorizados a diario. Los ratones se sacrificaron cuando se presentaron síntomas graves y se registraron las muertes. Los ratones se encontraban muertos o se sacrificaron si se observaban con síntomas severos tal como respiración agitada, espalda encorvada e inmovilidad. El día de la muerte se registró con el día de tratamiento como día 0.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para su uso en terapia celular adoptiva para el tratamiento de un melanoma, en donde la composición comprende:
(a) un péptido de fusión de MYC, que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas, opcionalmente una secuencia de dominio de transducción de proteínas TAT; (ii) una secuencia de polipéptido MYC; y
(b) una o más células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto donante que tiene un tumor de melanoma, en donde la una o más células inmunitarias primarias son reactivas contra un antígeno específico de melanoma.
2. La composición para el uso de la reivindicación 1, en donde el péptido de fusión de MYC comprende la SEQ ID NO: 1.
3. La composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde la una o más células inmunitarias comprenden uno o más linfocitos, opcionalmente, un linfocito T, un linfocito B, una célula NK o cualquier combinación de los mismos.
4. La composición para el uso de la reivindicación 3, en donde el uno o más linfocitos comprenden un linfocito infiltrante de tumores o están modificados de forma recombinante para expresar un receptor modificado o un receptor de antígenos quimérico.
5. Una célula inmunitaria modificada para su uso en terapia celular adoptiva para tratar un melanoma en un sujeto en donde la célula inmunitaria modificada comprende un péptido de fusión de MYC que comprende (i) un dominio de transducción de proteínas, opcionalmente una secuencia de dominio de transducción de proteínas TAT; y (ii) una secuencia de polipéptido MYC y es reactiva contra un antígeno específico de tumor.
6. La célula inmunitaria modificada para el uso de la reivindicación 5, en donde el péptido de fusión de MYC comprende la SEQ ID NO: 1; y/o en donde la una o más células inmunitarias comprenden uno o más linfocitos, opcionalmente, un linfocito T, un linfocito B, una célula NK, o cualquier combinación de los mismos, y opcionalmente en donde el uno o más linfocitos comprende un linfocito infiltrante de tumores o están modificados de forma recombinante para expresar un receptor modificado o un receptor de antígenos quimérico.
7. La célula inmunitaria modificada para el uso de la reivindicación 5 o 6, en donde la una o más células inmunitarias modificadas proceden de células inmunitarias primarias aisladas del sujeto receptor o aisladas de un sujeto donante distinto que tiene el mismo tipo de melanoma.
8. La célula inmunitaria modificada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en donde la una o más células inmunitarias modificadas se preparan poniendo en contacto las células inmunitarias primarias in vitro con el péptido de fusión de MYC tras el aislamiento del sujeto donante.
9. La célula inmunitaria modificada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, que comprende además la expansión de las células inmunitarias primarias in vitro antes o después del contacto con el péptido de fusión de MYC, en donde las células se expanden opcionalmente, usando un anticuerpo anti-CD3, células alimentadoras alogénicas irradiadas o una citocina exógena, en donde la citocina es opcionalmente, interleucina-2.
10. La célula inmunitaria modificada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en donde el sujeto receptor: (i) tiene linfocitos agotados antes de la administración de la una o más células inmunitarias modificadas;
(ii) se le ha administrado una citocina antes de, durante, o después de la administración de la una o más células inmunitarias modificadas, en donde la citocina se selecciona opcionalmente de un grupo que consiste en interferón a, interferón p, interferón y, complemento C5a, IL-2, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2; y/o
(iii) es un ser humano o un animal no humano.
11. La célula inmunitaria modificada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-10, en donde el melanoma es metastásico.
12. La célula inmunitaria modificada para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5-11, en donde al sujeto receptor se le ha administrado una terapia contra el cáncer adicional, opcionalmente seleccionada entre quimioterapia, radioterapia, inmunoterapia, anticuerpos monoclonales, ácidos nucleicos o proteínas contra el cáncer, virus o microorganismos contra el cáncer y cualquier combinación de los mismos.
13. Un método para preparar células inmunitarias modificadas para terapia celular adoptiva para melanoma, que comprende poner en contacto una o más células inmunitarias in vitro con un polipéptido de fusión de MYC, en donde las células inmunitarias son de un donante que se ha expuesto a uno o más antígenos tumorales y en donde el péptido de fusión de MYC comprende (i) un dominio de transducción de proteínas, opcionalmente, una secuencia de dominio de transducción de proteínas TAT; (ii) una secuencia de polipéptido MYC y son reactivas a un antígeno específico de tumores.
14. El método de la reivindicación 13, en donde la una o más células inmunitarias modificadas proceden de células inmunitarias primarias aisladas de un sujeto que tiene melanoma.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-14, que comprende además expandir las células inmunitarias primarias in vitro antes o después del contacto con el péptido de fusión de MYC; y/o en donde el péptido de fusión de MYC comprende la SEQ ID NO: 1.
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