CN116970065A - Tigit信号转换受体及其用途 - Google Patents

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CN116970065A CN202310478908.2A CN202310478908A CN116970065A CN 116970065 A CN116970065 A CN 116970065A CN 202310478908 A CN202310478908 A CN 202310478908A CN 116970065 A CN116970065 A CN 116970065A
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Abstract

本发明涉及TIGIT信号转换受体及其用途，具体提供一种分离的融合蛋白，包含：胞外区，跨膜区，和共刺激信号分子的胞内结构域，所述胞外区包括TIGIT胞外结构域。本发明的信号转换受体能够高效地将免疫检查点抑制性的信号通路转换为免疫激活信号，有效减少肿瘤微环境对免疫细胞的抑制，激活免疫细胞杀伤肿瘤。

Description

TIGIT信号转换受体及其用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种信号转换受体及其用途。
背景技术
肿瘤通过多种免疫逃逸机制逃脱免疫介导的识别。当长期暴露于肿瘤抗原时，T细胞会出现功能异常(dysfunction)，并进入耗竭(exhausted)状态。同时T细胞会上调表达多种免疫检查点抑制受体(inhibitory receptor,IR)来抑制T细胞的存活与功能。同时，在肿瘤细胞和肿瘤微环境中的抗原呈递细胞的表面表达抑制受体的配体，通过与抑制受体的结合激活IR胞内区ITIM相关的免疫抑制信号通路的下游事件，从而达到抑制T细胞活化、增殖与生存的效果。抑制受体包括例如PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3和TIGIT。其中，TIGIT(T cellimmunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain)是近年来被发现并受到广泛关注的免疫检查点，已经成为极具前景的癌症免疫治疗的新兴靶点。TIGIT在激活的T细胞、NK细胞和调节性T细胞表面表达上调，结合肿瘤细胞和肿瘤微环境抗原呈递细胞上表达的配体CD155(PVR)和CD112(PVRL2，nectin-2)。已经多项研究表明TIGIT在限制抗肿瘤的天然免疫和获得免疫中发挥了重要作用，是抗肿瘤应答的关键抑制因素，能够阻碍癌症免疫周期中的多个步骤。
针对免疫效应细胞负调控的抑制性信号通路，在近年已经有多项报道将其相应受体的胞外区与正向共刺激信号分子的跨膜区与胞内区连接，构建得到新的融合受体，这类融合受体在免疫效应细胞中表达后起到信号转换器的功能，可将肿瘤微环境内免疫抑制信号转换为免疫激活信号，即该信号转换分子胞外多肽接收肿瘤细胞表面、肿瘤基质细胞表面或肿瘤微环境中的免疫抑制分子信号并传递到胞内，通过共刺激信号分子胞内段激活免疫细胞的第二信号，进而增强免疫效应细胞的增殖与细胞因子分泌功能，延长活化免疫效应细胞的存活时间。CN103965361B公开了一种T细胞信号的嵌合分子转换器，该嵌合分子转换器包括PD1分子的胞外区(或PD1分子胞外区与HERIN的融合蛋白)、CD28跨膜区和CD28(或4-1BB)胞内共刺激结构域。表达该T细胞信号嵌合分子转换器的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在增殖与对肿瘤靶细胞的杀伤效果上均有显著提升。CN105452287A公开了一种免疫抑制性TGF-β信号转换器，其为包括TGF-β受体胞外结构域与来自另一种分子的胞内结构域的嵌合体，使得TGF-β与该胞外结构域的结合导致胞内结构域刺激T细胞活性。但目前仍未见基于将TIGIT的抑制性信号转换为激活信号的信号转换受体。
为刺激免疫效应细胞的增殖和提升其肿瘤免疫的效果，目前仍然需要更多的包括信号转换器分子在内的手段对免疫效应细胞进行改造和激活。
发明内容
本发明提供一种分离的融合蛋白，其是信号转换受体，包含：胞外区，跨膜区或其突变体，和共刺激信号分子的胞内结构域或其保留了共刺激信号分子传递共刺激信号、活化免疫细胞的生物学功能的功能片段或突变体，所述胞外区包括TIGIT胞外结构域或其保留了特异性结合免疫抑制细胞因子的功能片段或突变体。
在一个或多个实施方案中，TIGIT胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。TIGIT胞外结构域的编码序列如SEQ ID NO:3所示。
在一个或多个实施方案中，所述胞外区还包括膜表面结构域。优选地，所述胞外区还包括位于膜表面结构域和TIGIT胞外结构域或其功能片段或突变体之间的接头。
在一个或多个实施方案中，所述膜表面结构域位于所述TIGIT胞外结构域的N端或C端。
在一个或多个实施方案中，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示；所述接头的编码序列如SEQ ID NO:27所示。
在一个或多个实施方案中，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述接头的编码序列如SEQ ID NO:29所示。
在一个或多个实施方案中，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示；所述接头的编码序列如SEQ ID NO:31所示。
在一个或多个实施方案中，所述接头的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示；所述接头的编码序列如SEQ ID NO:33所示。
在一个或多个实施方案中，所述膜表面结构域包括B细胞表面抗原的胞外结构域或其保留了特异性结合抗原配体的功能片段或突变体。
在一个或多个实施方案中，B细胞表面抗原是BCMA，所述膜表面结构域包括BCMA胞外结构域或其保留了或提高了特异性结合BCMA配体的功能片段或突变体。优选地，BCMA配体包括增殖诱导配体(APRIL)和/或B细胞激活因子(BAFF)。
在一个或多个实施方案中，所述膜表面结构域包括BCMA胞外结构域，所述BCMA胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；所述BCMA胞外结构域的编码序列如SEQ IDNO:21所示。
在一个或多个实施方案中，所述膜表面结构域包括BCMA胞外结构域突变体，所述BCMA胞外结构域突变体提高了特异性结合BCMA配体BAFF的功能。在一个或多个实施方案中，所述BCMA胞外结构域突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；所述BCMA胞外结构域突变体的编码序列如SEQ ID NO:23所示。
在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子是免疫激活受体。
在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子包括但不限于选自CD226、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7Ralpha、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40中的任一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域包括CD226的胞内结构域或其突变体。
在一个或多个实施方案中，所述共刺激信号分子的胞内结构域包括CD226的胞内结构域或其突变体及OX40胞内结构域。
在一个或多个实施方案中，所述CD226的胞内结构域或其突变体在所述OX40胞内结构域的N端或C端。
在一个或多个实施方案中，所述CD226胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。所述CD226胞内结构域的编码序列如SEQ ID NO:7所示。
在一个或多个实施方案中，所述CD226胞内结构域的突变体的氨基酸序列如SEQID NO:10所示。所述CD226胞内结构域的突变体的编码序列如SEQ ID NO:9所示。
在一个或多个实施方案中，所述OX40胞内结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。所述OX40胞内结构域的编码序列如SEQ ID NO:25所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区包括来自CD226、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7Ralpha、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40的跨膜区中的任一种或多种。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区来自CD226跨膜区或其突变体，或IL-7Ralpha跨膜区或其突变体。
在一个或多个实施方案中，所述CD226跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。所述CD226跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:5所示。
在一个或多个实施方案中，所述IL-7Ralpha跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。所述IL-7Ralpha跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:11所示。
在一个或多个实施方案中，所述IL-7Ralpha跨膜区的突变体的氨基酸序列如SEQID NO:14、16、18、20中任一所示。
在一个或多个实施方案中，所述IL-7Ralpha跨膜区的突变体的编码序列如SEQ IDNO:13、15、17、19中任一所示。
在一个或多个实施方案中，所述跨膜区和所述共刺激信号分子的胞内结构域来自相同或不同分子。
在一个或多个实施方案中，所述融合蛋白还包括信号肽。优选地，所述信号肽位于所述信号转换受体的N端。所述信号肽包括来自TIGIT、CD8、CD4、CD28、CD137、EGFR、TGFBRI、TGFBRII、TGFBRIII的信号肽和轻链信号肽中的任一种或多种。
在一个或多个实施方案中，TIGIT的信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。TIGIT的信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1所示。
在一个或多个实施方案中，所述分离的融合蛋白为SEQ ID NO:35-58中任一项所编码的蛋白。
本发明还提供一种核酸分子，选自：编码本发明任一实施方案所述的融合蛋白的核酸分子或其互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸分子选自SEQ ID NO:35-58中任一所示，或者为任一所示多核酸分子的互补序列。
本发明还提供一种核酸构建体，含有本发明任一实施方案所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体为载体。
在一个或多个实施方案中，所述载体为表达载体；优选为病毒载体或非病毒载体。
在一个或多个实施方案中所述非病毒载体为基于转座子系统的非病毒整合载体。
本发明还提供一种基因工程化的细胞，其表达本发明任一实施方案所述的融合蛋白，和/或携带所述融合蛋白的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述细胞为免疫效应细胞。
在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达CAR，或携带CAR的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述细胞还表达TCR，或携带TCR的编码序列。
在一个或多个实施方案中，所述免疫效应细胞包括：T细胞、NK细胞、CAR-T、CAR-NK、TCR-T、CIK和TIL种的任一种或多种。
本发明还提供包含本发明任一实施方案所述的融合蛋白、核酸分子、核酸构建体和细胞中的任一种或多种的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。
本发明还提供本发明任一实施方案所述的融合蛋白、核酸分子、核酸构建体或细胞在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
附图说明
图1：TIL-CTRL、TIL-TG226-22、TIL-TG226-23和TIL-TG226-24细胞对同源配对的黑色素瘤原代肿瘤细胞的RTCA杀伤效果；
图2：TIL-CTRL和TIL-TG226-21-TIL-TG226-24细胞对同源配对的黑色素瘤原代肿瘤细胞的杀伤率；
图3：TIL-CTRL、TIL-TG226-22、TIL-TG226-23和TIL-TG226-24细胞对同源配对的黑色素瘤PDX肿瘤组织的体内杀伤效果。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明的信号转换受体将免疫检查点受体TIGIT的胞外区与免疫激活相关受体的胞内区相连，形成一种全新的信号转换受体分子，能够高效地将免疫检查点抑制性的信号通路转换为免疫激活信号，有效减少肿瘤微环境对免疫细胞的抑制，激活免疫细胞杀伤肿瘤。本发明的信号转换受体刺激免疫效应细胞的水平与现有技术相比进一步提升。本发明提供含有上述信号转换受体的免疫细胞，其可将抑制免疫细胞增殖的抑制性信号转化为增强免疫细胞增殖的刺激性信号。
本发明中，免疫细胞具有本领域周知含义，指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。淋巴细胞包括T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、B淋巴细胞、K淋巴细胞和NK淋巴细胞。适用于本发明的免疫细胞尤其包括那些通常用于肿瘤过继细胞治疗的免疫细胞。
本发明的免疫细胞表达本发明所述的信号转换受体，和/或含有所述信号转换受体的编码序列。本发明的信号转换受体设计为结合抑制性分子但传送正信号而非抑制性信号。即，这些细胞将“刹车”信号转化为“加速”信号以改善各免疫细胞的抗肿瘤作用。
定义
本发明使用到以下术语。对于本文未具体定义的术语，其具有本领域公知含义。
术语“表达框”是指表达一个基因所需的完整元件，包括启动子、基因编码序列、PolyA加尾信号序列。
术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如信号转换受体、CAR)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
术语“共刺激信号分子”是指存在于细胞表面，能与共刺激信号分子受体结合，产生协同刺激信号的分子。其能激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。淋巴细胞的增殖不仅需要抗原的结合，还需要接受共刺激分子的信号。共刺激信号传递给T细胞主要是通过表达在抗原呈递细胞表面的共刺激分子CD80，CD86与T细胞表面的CD28分子结合。B细胞接受共刺激信号可以通过一般的病原体成分例如LPS，或者通过补体成分，或者通过激活了的抗原特异性的Th细胞表面的CD40L。
术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，以及例如Furin 2A肽。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalSciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
术语“有效量”是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的剂量。
术语“疾病和/或病症”是指所述受试者的一种身体状态，该身体状态与本发明所述疾病和/或病症有关。
术语“受试者”或“对象”可以指患者或者其它接受本发明药物组合物以治疗、预防、减轻和/或缓解本发明所述疾病或病症的动物，特别是哺乳动物，例如人、狗、猴、牛、马等。
术语“肿瘤基质细胞”指肿瘤微环境内一些支撑肿瘤细胞的恶性增殖、抗凋亡、侵袭、转移，逃脱免疫监控等生命活动的细胞，主要包括成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)、调节性T细胞(Treg)、未分化的骨髓细胞、内皮细胞、周细胞和血小板、内皮细胞等。
术语“胞外区”指膜蛋白位于细胞外的区段。
术语“结构域”是指蛋白质中具有特异结构和独立功能的区域，常见结构域的氨基酸残基数在100～400个之间，最小的结构域只有40～50个氨基酸残基，大的结构域可超过400个氨基酸残基。
术语“膜表面标签”或“膜表面结构域”是指通常位于细胞(特别是免疫细胞)表面的蛋白片段。
信号转换受体
本发明的信号转换受体为一种多肽，其为一种融合蛋白，包含与免疫刺激分子(也称为“共刺激信号分子”)的胞内结构域(也称为“胞内区”)融合的胞外区，所述胞外区包含TIGIT的胞外结构域。更具体而言，本发明的信号转换受体包括TIGIT的胞外结构域、跨膜区和共刺激信号分子的胞内结构域。本发明的信号转换受体结合由TIGIT特异性识别的免疫抑制细胞因子但诱导免疫刺激信号而非免疫抑制。本发明涉及使用TIGIT的胞外结构域或其功能片段或保留了结合对应免疫抑制细胞因子的能力的突变体来构建本发明的信号转换受体。在优选实施方案中，TIGIT胞外结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；其编码序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明的胞外区可以仅包含TIGIT的胞外结构域，或者可进一步含有膜表面结构域。膜表面结构域包括B细胞表面抗原(例如BCMA)的胞外结构域或其保留和/或增强了特异性结合抗原配体的功能片段或突变体。示例性地，所述膜表面结构域包括BCMA胞外结构域或其保留和/或增强了特异性结合BCMA配体(例如增殖诱导配体(APRIL)和/或B细胞激活因子(BAFF))的功能片段或突变体。在一些实施方案中，BCMA胞外结构域的氨基酸序列如SEQID NO:22所示，其编码序列如SEQ ID NO:21所示。在一些实施方案中，BCMA胞外结构域突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示，其编码序列如SEQ ID NO:23所示。
膜表面结构域可以位于TIGIT胞外结构域的N端或C端。膜表面结构域和TIGIT胞外结构域可直接连接或通过接头连接。在示例性实施方案中，所述接头的氨基酸序列如SEQID NO:28、30、32和34中任一项所示，其编码序列分别如SEQ ID NO:27、29、31和33所示。
本发明中，共刺激信号分子是免疫激活受体，包括但不限于CD226、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7Ralpha、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40。可使用一种或多种这些共刺激信号分子的胞内结构域(胞内区)或其功能片段或保留了共刺激信号分子传递共刺激信号、活化免疫细胞的生物学功能的突变体来构建本发明的信号转换受体。示例性的共刺激信号分子可以是CD226的，其胞内结构域的氨基酸序列和相应的编码序列可分别如SEQ ID NO:8和7所示。本发明还包括上述共刺激信号分子的胞内结构域的保留了共刺激信号分子传递共刺激信号、活化免疫细胞的生物学功能的功能片段或突变体。CD226胞内结构域突变体的氨基酸序列和相应的编码序列可分别如SEQ ID NO:10和9所示。在一些实施方案中，共刺激信号分子可以包括CD226胞内结构域或其突变体及OX40胞内结构域。在一些实施方案中，所述OX40胞内结构域在所述CD226胞内结构域的N端或C端与其共价连接。在一些实施方案中，所述OX40胞内结构域在所述CD226胞内结构域突变体的N端或C端与其共价连接。所述OX40胞内结构域的氨基酸序列和相应的编码序列可分别如SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:25。
本发明中，免疫抑制细胞因子的受体的胞外结构域通过跨膜区(跨膜结构域)与共刺激信号分子的胞内结构域连接。跨膜区可以是任意来源。适用于本发明的跨膜区包括但不限于CD226、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7Ralpha、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40的跨膜区或其保留了跨膜功能的突变体中的任一种或多种。跨膜区可与胞内结构域来自相同的分子，也可来自不同的分子。本发明中，优选的跨膜区来自CD226跨膜区及其突变体或IL-7Ralpha跨膜区及其突变体。CD226跨膜区的示例性氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO:6和5所示。IL-7Ralpha跨膜区的示例性氨基酸序列及其编码序列分别如SEQ ID NO:12和11所示。IL-7Ralpha跨膜区的突变体1-4的示例性氨基酸序列可选自SEQID NO:14、16、18、20中的任一条；优选地，其编码核酸序列选自SEQ ID NO:13、15、17、19中任一条。
应理解的是，本文所述的“功能片段”指保留了所需生物学功能的片段。例如，本文所述的胞外结构域的功能片段指保留了结合对应免疫抑制细胞因子的能力；胞内结构域的功能片段指保留了该共刺激信号分子传递共刺激信号、活化免疫细胞的生物学功能的片段。举例而言，TIGIT胞外结构域的功能片段为来自该胞外结构域的能结合TIGIT配体(例如CD155)的功能片段。适用于本发明的各胞外结构域的功能片段以及各胞内结构域的功能片段可由本领域技术人员结合本领域现有技术手段容易确定。
本文所述的“突变体”包括各胞外结构域、跨膜区和胞内结构域的突变体，只要该突变体保留了所述胞外结构域、跨膜区和胞内结构域各自相应的生物学功能即可。例如，适用于本发明的胞外结构域的突变体包括与作为对比的胞外结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的跨膜区的突变体包括与作为对比的跨膜区具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体；适用于本发明的胞内结构域的突变体包括与作为对比的胞内结构域具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体。或者，与作为对比的序列相比，本发明所述的突变体具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失。
本发明也包括前文所述信号转换受体的突变体，如与所述信号转换受体具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％序列同一性的突变体。更具体而言，本发明包括与前文所述信号转换受体相比具有一个或多个(如20个以内、15个以内、10个以内、8个以内、5个以内或3个以内，如1-20、1-10等)氨基酸残基插入、取代或缺失的突变体。这类突变体保留了本发明所述信号转换受体的生物学功能，包括但不限于将抑制免疫细胞增殖的抑制性信号转化为增强免疫细胞增殖的刺激性信号。突变可发生在本文所述胞外结构域、跨膜区和胞内结构域中的任一个、任两个或全部三个。
本发明的信号转换受体可以是上述任意具体胞外区或其突变体、跨膜区或其突变体、胞内区或其突变体的任意组合。
在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体从N端至C端包含SEQ ID NO:4所示的TIGIT胞外结构域、SEQ ID NO:6所示的CD226跨膜区、和SEQ ID NO:8所示的CD226胞内结构域或SEQ ID NO:10的CD226胞内结构域突变体。
在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体从N端至C端包含SEQ ID NO:4所示的TIGIT胞外结构域、SEQ ID NO:12所示的IL7Ralpha跨膜区或如SEQ ID NO:14、16、18、20中任一所示的IL7Ralpha跨膜区突变体、和SEQ ID NO:8所示的CD226胞内结构域或SEQ IDNO:10的CD226胞内结构域突变体。
在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体从N端至C端包含SEQ ID NO:4所示的TIGIT胞外结构域、SEQ ID NO:28、30、32、34中任一项所示的接头、SEQ ID NO:22所示的BCMA胞外结构域、SEQ ID NO:6所示的CD226跨膜区或SEQ ID NO:20所示的IL7Ralpha跨膜区突变体、和SEQ ID NO:8所示的CD226胞内结构域或SEQ ID NO:10的CD226胞内结构域突变体。
在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体从N端至C端包含SEQ ID NO:22所示的BCMA胞外结构域、SEQ ID NO:28、30、32、34中任一项所示的接头、SEQ ID NO:4所示的TIGIT胞外结构域、SEQ ID NO:6所示的CD226跨膜区或SEQ ID NO:20所示的IL7Ralpha跨膜区突变体、和SEQ ID NO:8所示的CD226胞内结构域或SEQ ID NO:10的CD226胞内结构域突变体。
在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体从N端至C端包含SEQ ID NO:4所示的TIGIT胞外结构域、如SEQ ID NO:28、30、32、34中任一项所示的接头、SEQ ID NO:22所示的BCMA胞外结构域或SEQ ID NO:24所示的BCMA胞外结构域突变体、SEQ ID NO:6所示的CD226跨膜区、SEQ ID NO:10所示的CD226胞内结构域突变体和SEQ ID NO:26所示的OX40胞内结构域。
在一个或多个实施方案中，所述信号转换受体从N端至C端包含SEQ ID NO:22所示的BCMA胞外结构域、SEQ ID NO:28中任一项所示的接头、SEQ ID NO:4所示的TIGIT胞外结构域、SEQ ID NO:20所示的IL7Ralpha跨膜区突变体、SEQ ID NO:10所示的CD226胞内结构域突变体和SEQ ID NO:26所示的OX40胞内结构域。
本发明示例性的信号转换受体包括但不限于含有下表1每一行所示的胞外结构域、跨膜区和胞内结构域或由下表1每一行所示的胞外结构域、跨膜区和胞内结构域组成的信号转换受体：
表1
在一些实施方案中，本发明的信号转换受体还可包括信号肽序列。通常，信号肽序列与胞外结构域连接，位于所述信号转换受体的N端。所述信号肽可以为本领域常规的任何能够引导多肽出核的信号肽，包括但不限于TIGIT、CD8、CD4、CD28、CD137、EGFR、TGFBRI、TGFBRII、TGFBRIII和轻链信号肽。示例性的信号肽序列包括TIGIT的信号肽。在一些实施方案中，TIGIT的信号肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其编码序列如SEQ ID NO:1所示。
应理解，视需要，可在本文所述的信号肽与胞外结构域、胞外结构域与跨膜区、和/或跨膜区与胞内结构域之间可通过接头序列连接。可使用本领域周知的接头序列，如含有G和S的接头序列，如(GSSS)n或(GSSSS)n，其中，n为1-8的整数。
嵌合抗原受体(CAR)
本发明的免疫细胞可进一步表达CAR，或含有CAR的编码序列。本发明所述的CAR可以是本领域周知的各种CAR。
CAR可依次包含结合肿瘤细胞膜抗原的多肽(如scFv)、铰链区、跨膜区和胞内信号区。可采用本领域周知的用于构建CAR的铰链区、跨膜区和胞内信号区来构建本发明的CAR。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原，该多肽通常插入有抗原表位，插入的位置选自如下3个位置中的任意1个、2个或3个：所述结合肿瘤细胞膜抗原的多肽为天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。
本发明的嵌合抗原受体可针对如下抗原中的一种或多种：CD19、CD20、CEA、GD2(又称B4GALNT1)、FR(Flavin还原酶)、PSMA(前列腺特异性膜抗原)、PMEL前黑素小体蛋白)、CA9(碳酸酐酶IX)、CD171/L1-CAM、IL-13RL1、MART-1(又称粘蛋白-A)、ERBB2、NY-ESO-1(又称CTAG1B，癌/睾丸抗原1B)、MAGE(黑素瘤相关抗原E1)家族蛋白、BAGE(B黑素瘤抗原家族)家族蛋白、GAGE(生长激素释放因子)家族蛋白、AFP(alpha胎蛋白)、MUC1(mucin 1，细胞表面相关)、CD22、CD23、CD30、CD33、CD44v7/8、CD70、VEGFR1、VEGFR2、IL-11R/、EGP-2、EGP-40、FBP、GD3、PSCA(前列腺干细胞抗原)、FSA(又称KIAA1109)、PSA(又称KLK3，激肽释放酶相关的肽酶3)、HMGA2、胎儿型乙酰胆碱受体、LeY(又称FUT3)、EpCAM、MSLN(间皮素)、IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称MUC16，mucin 16，细胞表面相关)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC(又称SERPINB3)、AFU(又称FUCA1)、EBV-VCA、POA(又称VDR，维生素D(1,25-二氢维生素D3)受体)、beta体)、G(beta)、微球蛋白)和PROGRP(GRP胃泌素释放肽)。
单个细胞可表达多个CAR，包括靶向不同肿瘤抗原的CAR。
核酸分子
本发明提供核酸分子，其编码本发明所述的信号转换受体。本发明也提供该信号转换受体的编码序列的互补序列。该核酸分子可以是重组核酸分子，也可以是合成的；其可包含DNA、RNA以及PNA(肽核酸)并且可以是其杂合体。
还提供是本发明信号转换受体的表达框，其为一种核酸构建体即含有启动子、信号转换受体编码序列和PolyA加尾信号序列。核酸构建体中还可含有其它表达所需的原件，包括但不限于增强子等。
还提供一种载体，其含有本文所述的核酸分子、表达框或核酸构建体。载体可以是质粒、粘粒、病毒和噬菌体。载体可以是克隆载体，也可以是表达载体。表达载体可以是转座子载体。在某些实施方案中，表达载体为选自如下转座子载体中的一种或多种：piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5和Ty。除本发明所述的核酸分子外，表达载体中通常还含有载体通常所含的其它元件，例如多克隆位点、抗性基因、复制起始位点等。在某些实施方案中，所述重组表达载体采用pUC18、pUC19、pMD18-T、pMD19-T、pGM-T载体、pUC57、pMAX或pDC315系列载体作为骨架。在其它实施方案中，所述重组表达载体采用pCDNA3系列载体、pCDNA4系列载体、pCDNA5系列载体、pCDNA6系列载体、pRL系列载体、pUC57载体、pMAX载体或pDC315系列载体作为骨架。在某些实施方案中，本发明使用CN201510638974.7构建的pNB载体。在某些实施方案中，本发明使用WO2022078310A1构建的pKB20载体。这些专利申请通过引用全文纳入本文。
本发明的CAR也可通过常规的载体在本发明所述的免疫细胞中表达。载体可以是常规的表达CAR的载体，包括但不限于前文所述的各类转座子载体和重组表达载体。
在一些实施方案中，同一载体同时编码本发明的信号转换受体和CAR。该载体可以是双顺反子。CAR的编码序列可设置在信号转换受体编码序列5’或3’端。CAR和信号转换受体的表达可处于相同或不同调控序列的指导下。
在多核苷酸序列已知的情况下，可采用本领域常规的方法制备得到各核酸分子，并构建相应的载体。可使用本领域技术人员熟知的方法来构建重组载体，参见例如Sambrook等、Ausubel(1989)或其他标准教科书中描述的技术。替代地，可将所述核酸分子和载体重建成用于递送到靶细胞的脂质体。含有本发明的核酸分子的载体可通过熟知的方法转移至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电转可用于其它细胞宿主，可参见Sambrook。
宿主细胞
本文中，在表达异源核酸序列时，“宿主细胞”是指真核细胞，其能够复制载体和/或表达由载体编码的异源基因。宿主细胞可用作载体的受主。宿主细胞可以是“转染的”或“转化的”，其指外源性核酸转染或转导到宿主细胞中的过程。转化的细胞包括原代对象细胞及其后代。本文所用的术语“工程改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞往往指其中已经导入外源性核酸序列，例如载体的细胞。因此，重组细胞可与不含导入的重组核酸的天然存在的细胞相区分。
本文中，宿主细胞包括携带本文所述核酸分子和/或多肽的细胞。具体而言，本发明提供携带本发明所述信号转换受体和/或其编码序列的细胞。本发明的细胞优选为免疫细胞，可用于肿瘤过继细胞治疗。本发明这类细胞也称为本发明信号转换受体修饰的细胞。
更具体而言，本发明的细胞优选为免疫效应细胞，包括T细胞，如细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)；NK细胞；NKT细胞；CIK细胞；TIL细胞；和能引发效应功能的其他免疫细胞。本领域技术人员知晓这些细胞的制备方法。例如，制备TIL的方法通常包括收集肿瘤样本，对样本处理和培养，从中分离获得TIL。参见例如WO2022111571A1中记载的TIL制备方法，该专利申请通过引用全文纳入本申请。
本文中，相对于接受它们的个体，细胞可以是自体细胞、同系细胞、同种异体细胞，并且甚至在一些情况中可以是异种移植细胞。
可将本发明的核酸构建物/重组表达载体转入感兴趣的细胞中。转入的方法为本领域常规的方法，包括但不限于：病毒转导、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电转等。在某些实施方案中，采用电转将所述核酸构建物或重组表达载体。
除携带本发明所述信号转换受体和/或其编码序列外，本发明的细胞还可具有可用于细胞免疫治疗(如肿瘤过继细胞治疗)的一种或多种其他特性。这类其他特性可以是对细胞而言固有的或可以是人进行遗传操作后细胞的一部分。例如，本发明的细胞可携带嵌合抗原受体、αβT细胞受体，和/或抗原特异性受体，例如肿瘤特异性受体，或其编码序列。
药物组合物
本文所述信号转换受体、核酸分子、核酸构建体和含有所述信号转换受体的免疫细胞可以用于科学研究或用于制备相应癌症的治疗药物。本文中，“药物组合物”指用于给予个体的组合物且涵盖用于免疫治疗的细胞的组合物。本发明的药物组合物还可包含药学上可接受的运载体。合适的药物运载体的示例是本领域已知的且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液，如油/水乳液、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。可通过熟知的常规方法配制包含这类运载体的组合物。这些药物组合物可以合适剂量给予对象。
可由主治医师和临床因素确定剂量方案。如医学领域所熟知，用于任何一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药时间和给药途径、总体健康状况和同时给予的其他药物。
本发明的组合物可局部或全身性给予。在某些实施方式中，本发明提供的组合物(例如表达本发明所述的信号转换受体的细胞)可通过胃肠道外给予，例如静脉内、动脉内、鞘内、真皮下或肌内给予。在某些其他实施方式中，可直接将编码本发明提供的构建体的DNA给予至靶位点，例如通过基因枪递送到内部或外部靶位点或通过导管递送到动脉内位点。在优选的实施方式中，皮下给予药物组合物，且在更优选的实施方式中，静脉内给予。胃肠道外给药制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。胃肠道外载剂包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格右旋糖的那些物质)等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可包含蛋白性运载体，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，优选人源的。除蛋白性嵌合细胞因子受体构建体或编码其的核酸分子或载体外，设想本发明的药物组合物还可包含生物活性试剂，这取决于该药物组合物的预定用途。
用于肠胃外(例如静脉内)施用本文所述细胞的组合物还可以冻干形式或在溶液中(例如冻存制剂)储存。冻存制剂可储存成即用形式或在施用前进一步配制的形式。冻存制剂可以耐受远距离运输而不损伤细胞。除了细胞本身外，冻存制剂通常还包括细胞冻存液、人血清白蛋白(HSA)等组分。在施用前(例如静脉输注)，冻存的药物组合物需低温保存(例如置于液氮中)。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。本领域技术人员知晓常规冻存液的组分和浓度。例如，冻存液或输注组合物还可包含二甲亚砜、氯化钠、葡萄糖、醋酸钠、氯化钾或氯化镁等，其浓度可由本领域技术人员(例如有经验的医师)根据细胞、疾病、患者等状况确定。
方法和应用
本发明所述的信号转换受体、核酸分子、载体、宿主细胞以及包含这些物质的药物组合物可用于预防、治疗或缓解癌症，尤其是癌细胞表面表达有相应肿瘤抗原(例如TIGIT配体)的癌症，或用于制备用于预防、治疗或缓解癌症的药物。
本文所用“治疗”或“处理”包括对疾病或病理状况的症状或病变的任何有益或需要的效果，并且可包括治疗中的疾病或病症(例如，癌症)的一种或多种可测量标记物的甚至很小的减少。治疗可任选地包括疾病或病症的症状的减少或缓解，或者疾病或病症进展的延迟。“治疗”不一定表示疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。
本文所用的“预防”表示用于预防、抑制或降低疾病或病症(例如，癌症)出现或复发的可能性的方法。其也指延迟疾病或病症的发生或复发或者延迟疾病或病症的症状的出现或复发。本文所用“预防”也包括在疾病或病症发生或复发之前降低疾病或病症的强度、影响、症状和/或负担。
本发明包括使用标准载体和/或基因递送系统将细胞、核酸分子和载体单独或以任意组合的方式给予，任选地与药学上可接受的运载体或赋形剂一同使用。在某些实施方式中，给药后，所述核酸分子或载体可稳定地整合至对象的基因组中。
在具体的实施方式中，可使用特异性针对某些细胞或组织且在所述细胞中持续存在的病毒载体。合适的药物运载体和赋形剂在本领域是众所周知的。还可以使用基于转座子系统的非病毒载体，通过诸如电穿孔等方式将外源基因递送至细胞内，利用转座子系统的整合功能整合到目的细胞基因组中。根据本发明制备的组合物可而用于预防或治疗或延缓上述鉴定的疾病。
此外，本发明提供一种预防、治疗或缓解癌症的方法，包括以下步骤：向有此需要的对象给予有效量的细胞，所述细胞携带本发明所述和/或由本发明所述方法生成的信号转换受体、核酸分子和/或载体。
本文中，癌症包括但不限于乳腺、前列腺、肺和结肠癌或上皮癌，如乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、头颈癌、皮肤癌；生殖-泌尿道癌症，例如卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌；肾癌、肺癌、胃癌、小肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、食道癌、唾液腺癌和甲状腺癌等。给予本发明的组合物可用于癌症的所有阶段和类型，包括用于例如微小残留病、早期癌症、晚期癌症和/或转移性癌症和/或难以治疗的癌症。
通过示例的方式，如下治疗癌症患者或易患癌症的患者或疑似患有癌症的患者。如本文所述修饰的细胞可给予个体并且停留延长的时间段。该个体可接受细胞的一次或多次给药，且给药的间隔时间可以是数天、数周、数月或数年。在具体实施方式中，多次给药可在数周或数月内发生，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周或月。在一些实施方式中，遗传修饰的细胞经包封以抑制免疫识别并位于肿瘤位点。在使用本发明的细胞进行初始治疗后肿瘤复发后向个体提供细胞的情况中，可改变这些细胞使其识别不同的靶肿瘤抗原。例如，当初始轮次包括携带本发明的信号转换受体和特异性针对特定抗原的另一受体的细胞时，后续轮次后(包括肿瘤复发后)可使用针对不同特定抗原的受体。
在一些实施方案中，向需要的个体提供有效量的治疗性细胞，所述治疗性细胞携带或表达本发明任一实施方案所述的信号转换受体和任选的CAR。在一些实施方案中，向需要的个体提供有效量的治疗性细胞为表达或携带本发明任一实施方案所述的信号转换受体的TIL细胞。可与一种或多种其他癌症治疗同时或不同时递送这些细胞。可在同一或单独的制剂中递送这些细胞和其他癌症治疗剂。可以单独的递送途径向个体提供细胞和其他癌症治疗剂。可通过例如在肿瘤位点处注射或静脉内或口服来递送细胞和/或其他癌症治疗剂。这类组合物的常规递送途径是本领域已知的。
所采用的细胞数量将取决于多种情况，例如导入的目的、细胞的寿命、待使用的方案、给药的次数、细胞繁殖的能力、重组构建体的稳定性等。
可根据需要给予细胞。在某些实施方式中，可使用多种方案来调节方案参数。在具体实施方式中，给药的途径或次数或时机、细胞的寿命和/或存在的细胞数目可以发生变化。给药的次数可例如至少部分取决于上述因素。
试剂盒
本文所述的任意组合物可包含于试剂盒中。在一个非限制性实施例中，可在试剂盒中包含用于细胞疗法的表达本发明任一实施方案所述的信号转换受体的细胞和/或生成用于细胞疗法的一种或多种细胞的试剂，该疗法含有重组表达载体。以合适的容器方式提供试剂盒组分。
这些试剂盒的一些组分可包装在水性基质中或包装成冻干形式。这些试剂盒的容器用具通常包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器用具，其中该组分可放置，并优选适当分装于其中。在试剂盒中存在超过一种组分的情况中，该试剂盒通常还含有第二、第三或其他容器，其中可分开放置其他组分。然而，可在小瓶中包含组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还包含用于市售的封闭约束形式含有该组分的器具。此类容器可包括注塑或吹塑的塑料容器，其中保留所需小瓶。
当在一种和/或多种液体溶液中提供试剂盒的组分时，液体溶液是水性溶液，特别优选无菌水性溶液。在一些情况中，容器用具本身可以是注射器、移液器和/或其他这类设备。
试剂盒的组分也可以干粉形式提供。当以干粉提供试剂和/或组分时，可通过加入合适的溶剂来重建粉末。因此，试剂盒还可包含含有无菌的、药学上可接受的缓冲剂和/或其他稀释剂的第二容器用具。
试剂盒的组分也可以冻存制剂(例如冻存液)的形式提供。冻存制剂解冻后可直接或者配制为输注组合物向患者输注。因此，试剂盒还可包含细胞冻存袋、细胞冻存管、温度保持装置(例如含液氮的容器)、解冻装置等。
在本发明的具体实施方式中，在试剂盒中提供待用于本文所述细胞疗法的细胞。在一些实施方案中，细胞基本上是试剂盒的唯一组分。该试剂盒可包含制备所需细胞的试剂和材料。在具体实施方式中，该试剂和材料包含用于扩增所需序列的引物、核苷酸、合适的缓冲剂或缓冲试剂、盐等，并且在一些情况中，该试剂包括编码本文任一实施方案所述的信号转换受体和/或其调控元件的DNA和/或载体。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
本发明实施例中所涉及的信号转换受体如表2所示：
表2，信号转换受体结构与序列
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实施例1：信号转换受体表达载体的构建
按照PCT申请WO2022078310A1说明书第21页实施例1记载的方法，构建pKB20载体。按照该实施例记载的构建pKB20-EGFP的方法，构建含有外源基因表达框的pKB20载体。具体地，委托公司合成获得SEQ ID NO:35-58所示序列，分别将SEQ ID NO:35-58所示的序列的2端用连接酶加上含有相应的酶切位点的接头后按照WO2022078310A1说明书第21页实施例1记载的方法克隆到制备好的pKB20载体中，分别命名为pKB20-TG226-1至pKB20-TG226-24。将上述获得的重组质粒转化到E.coli(DH5c)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。
实施例2：黑色素瘤组织来源TIL细胞的分离培养
收集新切除的黑色素瘤标本，立即在无菌条件下进行处理。根据WO2022111571A1实施1中记载的培养基和实施例2记载的肿瘤样本处理方法与TIL培养方法对本实施例黑色素瘤组织进行处理并培养获得TIL。WO2022111571A1通过引用全文纳入本申请。
具体如下：
1)配制含有终浓度100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和50μg/mL庆大霉素的生理盐水待用；
2)在二级生物安全柜中无菌环境下将获得的新鲜分离的肿瘤患者的肿瘤组织样本置于已加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm培养皿中洗涤，再转移至新的加入30mL步骤1)配制的生理盐水的10cm皿中洗涤，共重复洗3次；
3)用无菌手术刀片剔除脂肪组织与坏死组织，将肿瘤组织切割成为直径3×3×3mm3的小块，取2个G-REX100培养罐(购自Wilsonwolf)，每个G-REX100培养罐中放置42块随机选取的肿瘤组织块，培养罐中加入种子细胞培养基，种子培养基的组分包括：3000IU/mLIL-2、20ng/mL IL-7、20ng/mL IL-15、500U/mL GM-CSF、1000IU/mL IFN-γ、3μg/mL抗CD137mAb、3μg/mL抗CD28 mAb、3μg/mL抗PD-1mAb、10ng/mL TNF-α、5％v/v人AB血清、1×PS双抗和补至终体积的X-VIVO 15基础培养基；多余的肿瘤组织块用CryoStor10(购自BioLifeSolutions)冻存液通过程序降温仪液氮冻存；
4)3)中含有肿瘤组织块的G-REX100培养罐中加入1L上述种子细胞培养基后，对肿瘤组织块37℃5％CO2进行培养，每隔4天移除一半体积的旧种子细胞培养基，补加一半体积的新鲜种子细胞培养基，第12天离心收获TIL种子细胞后统计细胞总数与活率；
5)取4)中收获的种子细胞，用含有500IU/mL IL-2、7ng/mL IL-7、30ng/mL IL-15、5％v/v人AB血清、1×PS双抗和补齐至终体积的X-VIVO 15基础培养基的扩大培养基重悬至5.0×105/mL，加入到经过抗CD3 mAb、抗CD28 mAb和抗CD137 mAb包被预处理的细胞培养器皿中，37℃5％CO2激活2天，然后将激活后的细胞离心收集，接种至加入有已事先预热的扩大培养基的G-REX500M培养罐中，G-REX500M培养罐中的扩大培养基与上述扩大培养基相同。每个G-REX500M中扩大培养基体积为5L。激活后的种子细胞按照2.5×105/cm2的接种密度接种，37℃5％CO2进行培养，每隔4天进行细胞计数后，移除一半体积的旧扩大培养基，补加一半体积的新鲜扩大培养基，待每个G-REX500M罐中的细胞总数达到1.0×1010后，按1﹕2比例进行分瓶，每瓶补加新鲜扩大培养基至5L后继续培养。在G-REX500M培养罐的扩大培养基中前后总共培养12天后收获细胞，获得TIL。
实施例3：TIL的遗传修饰与增殖
1)预先将AIM-V培养基加入三个12孔板内，总计25个孔，每孔2mL，随后转入细胞培养箱内37℃5％ CO2预热1小时；
2)按下表进行每孔单次用量的电转液配比：
按照需要测试的质粒pKB20-TG226-1至pKB20-TG226-24以及对照空载质粒pKB20，准备实验组电转体系24组和对照组1组；
3)取实施例2获得的TIL至25个EP管内，每个EP管内加入5×106个细胞，1200rpm离心5min，弃上清，随后用500μL生理盐水重悬细胞，重复离心步骤洗涤细胞沉淀；
4)向2)中配置好的每个不同实验组和对照组的电转液分别加入质粒pKB20-TG226-1至pKB20-TG226-24及对照空载质粒pKB20 6μg，随后室温静置30min以内；
5)用4)中配置好的含质粒的电转液重悬所有试管，每管100μL，小心吸取细胞重悬液转入LONZA 100μL电转杯内，将电转杯放入LONZA NucleofectorTM2b电转槽内，启动电转程序，电转程序选择X001；
6)电转完成后小心取出电转杯，吸取细胞悬液转移至EP管中，每管加入预热的AIM-V培养基200μL，随后转入1)中12孔板内含预热AIM-V培养基的孔中，37℃、5％CO2培养；培养5天后，获得过表达TG226-1-TG226-24的TIL细胞与对照组TIL细胞，分别命名为TIL-TG226-1至TIL-TG226-24和TIL-CTRL。
实施例4：电转TG226信号转换受体TIL的表型检测
1、电转TG226信号转换受体TIL的细胞存活率与阳性率
通过台盼蓝染色和细胞计数仪计数检测各组细胞存活率。结果显示，实施例3制备的TIL-TG226-1-TIL-TG226-24和TIL-CTRL的细胞存活率均在95％以上。
通过间接标记法荧光标记上述各电转TG226信号转换受体TIL，流式细胞仪检测TG226信号转换受体基因表达阳性的细胞占比，方法如下：
1)收集TIL-TG226-1-TIL-TG226-24和TIL-CTRL各组细胞，每组细胞数量收集1×106个，800g，离心3min；
2)弃上清，各细胞样品加入生理盐水重悬细胞，800g，离心3min；
3)弃上清，各细胞样品加入100μL生理盐水重悬细胞，每管各加2μL偶联生物素的TIGIT的配体CD155的胞外结构域分子(购自acrobiosystems；货号：CD5-H82E3)，室温孵育30分钟；800g，离心3min，洗涤两遍；
4)弃上清，每管沉淀加入100μL生理盐水，重悬细胞，每管加入2μL PE-链霉亲和素(PE Streptavidin，购自BDbiosciences；货号：554061)，室温孵育30分钟，800g，离心3min，洗涤两遍，弃上清；
5)用400μL生理盐水重悬，上流式细胞仪检测。
同时，针对表达含有BCMA胞外结构域的TG226信号转换受体的TIL(TIL-TG226-13-TIL-TG226-24)，将BCMA胞外结构域(或其突变体)作为标签，通过直接标记法流式细胞仪检测BCMA阳性细胞的占比，方法如下：
1)收集TIL-TG226-13-TIL-TG226-24各组细胞，每组细胞数量收集1×106个，800g，离心3min；
2)弃上清，各加入生理盐水重悬细胞，800g，离心3min；
3)弃上清，各加入100μL生理盐水重悬细胞，每管各加2μL BCMA流式抗体(购自Biolegend货号：357504)，室温孵育30分钟；
4)各加入适量生理盐水，800g，离心3min，洗涤两遍，弃上清；
5)用400μL生理盐水重悬，上流式细胞仪检测。
结果显示，各组细胞阳性率如下表3所示：
表3间接标记法与直接标记法检测TIGIT信号转换受表达阳性细胞占比
结果如表3所示，在对照组细胞TIL-CTRL中，BCMA阳性细胞占比接近0，TIGIT胞外结构域阳性细胞占比约5％，表明在制备的天然TIL中，基本不存在BCMA表达阳性的细胞，有约5％细胞表达免疫耗竭相关的受体TIGIT(野生型TIGIT)。在TIL-TG226-13-TIL-TG226-24中，间接标记法检测获得的阳性比例均高于直接标记法检测获得的比例，高出的部分可能为TIL自身标的野生型TIGIT产生(可认为是TIGIT信号转换受体表达阳性细胞比例中的假阳性)，而通过BCMA胞外结构域作为标签的直接标记法获得的阳性细胞比例范围在约34％-60％，相对准确地反映了TIGIT信号转换受体表达阳性TIL的占比。
由于TIL-TG226-1-TIL-TG226-12各组细胞中未包含BCMA胞外结构域或其突变体，因而无法获得基于直接标记法的阳性细胞占比数值，以下实施例中对所有组别细胞均仍采用间接标记法检测的结果作为TIGIT信号转换受体表达阳性的细胞占比。
2、电转TG226信号转换受体TIL的淋巴细胞表型及细胞因子分泌水平
(1)电转TG226信号转换受体TIL的淋巴细胞表型
各组细胞的相关淋巴细胞表型如表4所示
表4TIL-TG226-1-TIL-TG226-24细胞表型
(2)电转TG226信号转换受体TIL的细胞因子IFN-γ的分泌
a.未经靶细胞刺激IFN-γ的分泌水平
直接取实施例3制备的TIL-TG226-1-TIL-TG226-24及TIL-CTRL的细胞上清，用CBA检测试剂盒(Human IFN-γFlex Set，BDbiosciences，货号：558269)根据说明书记载的方法检测各组细胞的上清中的IFN-γ浓度；
b.经靶细胞刺激后IFN-γ的分泌水平
复苏并培养黑色素瘤细胞系A375(购自ATCC，货号：CRL-1619TM)，与CD155流式荧光抗体(PE anti-human CD155(PVR)Antibody,Biolegend,货号：337610)共孵育后，PBS洗涤3次，上流式细胞仪检测。结果表明，A375细胞表面CD155表达阳性。
取上述A375细胞，铺12孔板的25个孔，待细胞贴壁稳定且汇合度超过90％时，向每孔中分别加入实施例3制备的含有5×105个/mL TIL-TG226-1-TIL-TG226-24和TIL-CTRL的细胞悬液1mL，37℃，5％ CO2培养箱中共孵育过夜，离心，取各样本的上清，用CBA检测试剂盒(Human IFN-γFlex Set，BDbiosciences，货号：558269)根据说明书记载的方法检测上清中的IFN-γ浓度。
结果如下表5所示：
表5 TIL-TG226-1-TIL-TG226-24 IFN-γ分泌水平
未经CD155表达阳性的黑色素瘤细胞A375刺激的TIL-TG226-1-TIL-TG226-24的IFN-γ分泌水平与对照细胞TIL-CTRL的IFN-γ分泌水平相比未见明显差异；经过刺激后，TIL-TG226-1-TIL-TG226-24的IFN-γ分泌水平较TIL-CTRL的IFN-γ分泌水平有了明显提高，而TIL-CTRL的IFN-γ分泌水平在未刺激与刺激后相比没有明显差异。
以上结果显示，电转了TG226信号转换受体的TIL在经过CD155表达阳性靶细胞刺激后，其活化水平有了明显提升。考虑到A375细胞与上述TIL之间不存在同源性，进而基本不存在肿瘤抗原对TCR的特异性激活作用。同时，对照细胞TIL-CTRL刺激与否对其IFN-γ分泌水平没有产生明显的影响，表明A375细胞对上述TIL的非特异性刺激效果可以基本忽略。因而可以认为，这种提升来源于靶细胞A375表面的CD155与TIL表面TG226信号转换受体相结合激活受体后产生的作用。
实施例5：表达TG226信号转换受体的TIL细胞对同源肿瘤细胞的杀伤效果
将实施例2的新鲜的黑色素瘤组织切割成为3×3×3mm大小的碎块，碎块尽量均匀混合后按照Robert Suriano et al.Ex Vivo Derived Primary Melanoma Cells:Implications for Immunotherapeutic Vaccines J Cancer 2013；4(5):371-382.Materials and Methods部分记载的方法培养获得原代黑色素瘤细胞。用靶向CD155的带有荧光基团标记的抗体(PE anti-human CD155(PVR)Antibody,Biolegend,货号：337610)与获得的原代黑色素瘤细胞共孵育后上流式细胞仪进行检测。结果显示，超过90％的原代黑色素瘤细胞为阳性细胞。
应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例3获得的TIL-TG226-1至TIL-TG226-24和TIL-CTRL细胞对其同源的黑色素瘤原代细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：
(1)调零：每孔加入50μL DMEM培养液，放入仪器中，选择步骤1，调零；
(2)靶细胞铺板：将培养获得的黑色素瘤原代细胞按每孔104个细胞/50μL铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定后，再放入仪器中，开始步骤2，培养细胞；
(3)加入效应细胞：靶细胞培养18h-24h后，观察细胞指数，当细胞指数为～1-2时，分别加入效应细胞TIL-TG226-1至TIL-TG226-24和TIL-CTRL，每孔50μL，效靶比设为4:1，开始步骤3，共培养超过48后，观察细胞增殖曲线和杀伤水平，计算靶细胞杀伤率。靶细胞杀伤率计算公式如下：
其中A为未加入任何效应细胞仅存在靶细胞(即肿瘤细胞)组的细胞指数，B为加入效应细胞各组的细胞指数。
结果如图1和图2所示。图1表明，TIL-TG226-22、TIL-TG226-23与TIL-TG226-24对同源的黑色素瘤原代肿瘤细胞相较TIL-CTRL显示出明显更强的杀伤效果。图2显示，与TIL-CTRL相比，TIL-TG226-1至TIL-TG226-24对同源的黑色素瘤原代肿瘤细胞具有更高的杀伤率。
实施例6：表达TG226信号转换受体的TIL细胞对同源配对的肿瘤移植物(Patient-derived xenograft，PDX)肿瘤组织的杀伤
实验动物
选用免疫缺陷B-NDG小鼠(购自百奥赛图)作为PDX模型构建实验动物。
实验设计和分组：如下表6所示
表6小鼠给药方案及分组
组2-组5中所用TIL为实施例3中制备的TIL中的TIL-CTRL、TIL-TG226-22、TIL-TG226-23和TIL-TG226-24。尾静脉注射给药前将细胞离心重悬于PBS，制成细胞密度为1×108/mL PBS细胞悬液。
动物饲养
采购所需用量的B-NDG小鼠后，饲养于SPF级实验动物房，适应期7-10天。
环境：小鼠将被安置于动物房的透明树脂塑料笼中。鼠笼垫料为经高压灭菌的木屑和玉米芯垫料，定期更换。动物房间配备高效空气过滤器，温度将保持在20-26℃(68-79°F)之间，相对湿度为40-70％。持续观测并记录温度和湿度。照明条件为每天12小时日光灯照射和12小时无照明。
食物和饮水：实验用小鼠可无限量获取专用鼠粮(经辐照消毒，上海斯莱克实验动物责任有限公司，中国)，可无障碍在任何时间接近灭菌的洁净饮水。
PDX模型的构建
1)患者肿瘤组织样本处理：取实施例2中的黑色素瘤组织一部分，无菌条件下剔除坏死部分组织、脂肪组织、结缔组织等，冲洗干净后用手术刀分割成若干5×5×5mm3组织块，置于含肿瘤样本运输保存液UW中，准备用瘤块接种B-NDG小鼠；
2)肿瘤组织样本接种：取若干B-NDG小鼠，小鼠肩胛部备皮后用小鼠皮下肿瘤接种固定器固定小鼠，碘伏消毒，利多卡因局麻后用PDX模型瘤块接种套管针将1)中瘤块接种至右侧腹股沟部。接种当天记为P0，每周量瘤2次，肿瘤体积计算公式为:V＝0.5×a×b2，其中a和b分别为肿瘤的长径和短径；
3)PDX组织传代：观察各接种小鼠肿瘤组织生长情况，等到有肿瘤组织体积长到超过300mm3后，麻醉小鼠，取出瘤块，无菌条件下手术刀切割成5×5×5mm3组织块后重复步骤2)，接种到新的小鼠右侧腹股沟部，等待PDX肿瘤的下一代生长；
4)重复步骤3)，继续传代2-3代后，取部分小鼠体内PDX组织进行组织切片病理分析，确定PDX组织仍然为人源组织(而非鼠源组织)后，按表6的实验设计中使用的小鼠数量的1.5倍继续用PDX组织接种小鼠(即PDX组织块接种60只鼠)，观察小鼠成瘤情况，每周量瘤2次，等待成瘤。
动物分组及给药
等PDX接种小鼠的肿瘤体积达到～50mm3左右时，从60只动物中选取40只肿瘤体积合适的动物，按肿瘤体积进行随机分组，n＝8，确保所有组在基线上具有可比性。分组当天记为D0，按表6方案进行给药。实验期间每周3次测定动物体重和肿瘤体积，每日进行观察动物的临床症状。肿瘤体积用mm3表示，肿瘤测量公式同上述。
结果
实验结果如图3所示。不同组别间肿瘤体积大小差异进行单向方差分析(one-wayANOVA analysis)，随后采用Bonferroni法进行事后检验(Bonferroni post hoc test)，观察不同组别两两间是否有显著差异。*：p<0.05；**:p<0.01。图3显示，截止到给药后第40天，与注射PBS的对照组荷瘤小鼠相比，TIL-CTRL给药组的小鼠肿瘤体积增长受到了非常显著的抑制。而与TIL-CTRL给药组相比，TIL-TG226-22、TIL-TG226-23与TIL-TG226-24给药组的荷瘤小鼠的肿瘤体积又进一步地有了显著或非常显著的缩小。以上结果表明，未经修饰TIL-CTRL对其同源配对的PDX肿瘤组织有显著的抑制效果，而经过TG226-22、TG226-23或TG226-24信号转换受体的转基因修饰后，TIL对同源的PDX肿瘤组织的抑制效果在此基础上又有了更显著的提升，证明TG226信号转换受体能显著激活免疫效应细胞，提升免疫效应细胞的肿瘤杀伤能力。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
本文序列
TIGIT信号肽：
SEQ ID NO:1
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcagga
SEQ ID NO:2
MRWCLLLIWAQGLRQAPLASG
TIGIT胞外结构域：
SEQ ID NO:3
atgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatcttacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctagaaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattcca
SEQ ID NO:4
MMTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIP
CD226跨膜区：
SEQ ID NO:5
ggagggacagttttattgttgttgtttgttatctcaattaccaccatcattgtcattttcctt
SEQ ID NO:6
GGTVLLLLFVISITTIIVIFL
CD226胞内结构域：
SEQ ID NO:7
aacagaaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacagaaggcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccaaagactagagtt
SEQ ID NO:8
NRRRRRERRDLFTESWDTQKAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPKTRV
CD226胞内结构域突变体：
SEQ ID NO:9
aacagaaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacaggccgcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagtt
SEQ ID NO:10
NRRRRRERRDLFTESWDTQAAPNNYRSPISTSQPTNQSMDDTREDIYVNYPTFSRRPATRV
IL7Rα跨膜区：
SEQ ID NO:11
cctatcttactaaccatcagcattttgagttttttctctgtcgctctgttggtcatcttggcctgtgtgttatgg
SEQ ID NO:12
PILLTISILSFFSVALLVILACVLW
IL7Rα跨膜区突变体1：
SEQ ID NO:13
gaccccatcctgctgcccccctgcctgaccatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgtgg
SEQ ID NO:14
DPILLPPCLTISILSFFSVALLVILACVLW
IL7Rα跨膜区突变体2：
SEQ ID NO:15
gaccctatcttactgagatgcaccatcagcattttgagttttttctctgtcgctctgttggtcatcttggcctgtgtgttatgg
SEQ ID NO:16
DPILLRCTISILSFFSVALLVILACVLW
IL7Rα跨膜区突变体3：
SEQ ID NO:17
gaccccatcctgccctgccccctgatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgtgg
SEQ ID NO:18
DPILPCPLTISILSFFSVALLVILACVLW
IL7Rα跨膜区突变体4：
SEQ ID NO:19
gaccccatcctgctgggctgcaccatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgtgg
SEQ ID NO:20
DPILLGCTISILSFFSVALLVILACVLW
BCMA胞外结构域：
SEQ ID NO:21
atgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgacagcctgctgcacgcctgcatcccctgccagctgagatgcagcagcaacacccccccactgacctgtcagagatactgtaacgcc
SEQ ID NO:22
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNA
BCMA胞外结构域突变体：
SEQ ID NO:23
atgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgactccctgctgcacgcctgcatcccttgcgacctgagatgtagctccaatacacctcctctgacatgccagagatactgcaacgccagcgtgaccaattccgtgaagggcaccaatgcc
SEQ ID NO:24
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCDLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA
OX40胞内结构域
SEQ ID NO:25
gccctgtacctgctgagaagggaccagagactgcctcctgatgcccacaagcctcccggaggaggatcttttagaacacccatccaggaggagcaggccgacgcccatagcaccctggctaagatc
SEQ ID NO:26
ALYLLRRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
接头1：
SEQ ID NO:27
gccgaggccgccgccaaggaggccgccgccaaggcc
SEQ ID NO:28
AEAAAKEAAAKA
接头2：
SEQ ID NO:29
agagctgatgccgctcctaccgtgagc
SEQ ID NO:30
RADAAPTVS
接头3：
SEQ ID NO:31
ccttcccctctgttccctggaccatccaagccc
SEQ ID NO:32
PSPLFPGPSKP
接头4：
SEQ ID NO:33
aggaccgtggctgctcccagcgtgttc
SEQ ID NO:34
RTVAAPSVF
TG226-1
SEQ ID NO:35
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatcttacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctagaaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaggagggacagttttattgttgttgtttgttatctcaattaccaccatcattgtcattttccttaacagaaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacagaaggcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccaaagactagagtttga
TG226-2
SEQ ID NO:36
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatcttacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctagaaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaggagggacagttttattgttgttgtttgttatctcaattaccaccatcattgtcattttccttaacagaaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacaggccgcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaagagaggatatttatgtcaactatcc
aaccttctctcgcagaccagccactagagtttga
TG226-3
SEQ ID NO:37
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
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tgttgttgtttgttatctcaattaccaccatcattgtcattttcctttga
TG226-4
SEQ ID NO:38
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
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aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccagaccccatcctgctgcccccctgcctgaccatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgt
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acaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagtttga
TG226-5
SEQ ID NO:39
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
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ggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagtttga
TG226-6
SEQ ID NO:40
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
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aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccagaccccatcctgccctgccccctgatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgtggaaca
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gaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagtttga
TG226-7
SEQ ID NO:41
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccagaccccatcctgctgggctgcaccatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgtggaac
agaaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacaggccgcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaag
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TG226-8
SEQ ID NO:42
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccacctatcttactaaccatcagcattttgagttttttctctgtcgctctgttggtcatcttggcctgtgtgttatggaacagaaggagaag
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tgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagtttga
TG226-9
SEQ ID NO:43
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccagaccccatcctgctgcccccctgcctgaccatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgt
ggaacagaaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacaggccgcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgat
acaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagtttga
TG226-10
SEQ ID NO:44
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccagaccctatcttactgagatgcaccatcagcattttgagttttttctctgtcgctctgttggtcatcttggcctgtgtgttatggaacaga
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TG226-11
SEQ ID NO:45
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
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TG226-12
SEQ ID NO:46
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccagaccccatcctgctgggctgcaccatcagcatcctgagcttcttcagcgtggccctgctggtgatcctggcctgcgtgctgtggaac
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TG226-13
SEQ ID NO:47
atgcgctggtgtctcctcctgatctgggcccaggggctgaggcaggctcccctcgcctcaggaatgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgacagcctgctgcacgcctgca
tcccctgccagctgagatgcagcagcaacacccccccactgacctgtcagagatactgtaacgccgccgaggccgccgccaaggaggccgccgccaaggccatgatgacaggcacaatagaaac
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TG226-14
SEQ ID NO:48
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tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
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TG226-15
SEQ ID NO:49
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tcccctgccagctgagatgcagcagcaacacccccccactgacctgtcagagatactgtaacgccgccgaggccgccgccaaggaggccgccgccaaggccatgatgacaggcacaatagaaac
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gacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccc
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TG226-16
SEQ ID NO:50
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tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
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TG226-17
SEQ ID NO:51
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TG226-18
SEQ ID NO:52
atgcggtggtgcctgctgctgatctgggctcagggcctgaggcaggctcctctggcttccggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
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TG226-19
SEQ ID NO:53
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TG226-20
SEQ ID NO:54
atgcggtggtgcctgctgctgatctgggctcagggcctgaggcaggctcctctggcttccggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
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aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccagccgaggccgccgccaaggaggccgccgccaaggccatgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgacag
cctgctgcacgcctgcatcccctgccagctgagatgcagcagcaacacccccccactgacctgtcagagatactgtaacgccgaccccatcctgctgggctgcaccatcagcatcctgagcttcttca
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tctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccaaagactagagtttga
TG226-21
SEQ ID NO:55
atgcggtggtgcctgctgctgatctgggctcagggcctgaggcaggctcctctggcttccggaatgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgacagcctgctgcacgcctgca
tcccctgccagctgagatgcagcagcaacacccccccactgacctgtcagagatactgtaacgccgccgaggccgccgccaaggaggccgccgccaaggccatgatgacaggcacaatagaaac
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gacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtggccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccc
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tctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatgatacaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagttgccctgtacctgctgagaagggaccagagact
gcctcctgatgcccacaagcctcccggaggaggatcttttagaacacccatccaggaggagcaggccgacgcccatagcaccctggctaagatctga
TG226-22
SEQ ID NO:56
atgcggtggtgcctgctgctgatctgggctcagggcctgaggcaggctcctctggcttccggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaagagctgatgccgctcctaccgtgagcatgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgacagcctgctgcacg
cctgcatcccctgccagctgagatgcagcagcaacacccccccactgacctgtcagagatactgtaacgccggagggacagttttattgttgttgtttgttatctcaattaccaccatcattgtcattttc
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TG226-23
SEQ ID NO:57
atgcggtggtgcctgctgctgatctgggctcagggcctgaggcaggctcctctggcttccggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaccttcccctctgttccctggaccatccaagcccatgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgactccctgctg
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gttgtttgttatctcaattaccaccatcattgtcattttcctt
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tttagaacacccatccaggaggagcaggccgacgcccatagcaccctggctaagatctga
TG226-24
SEQ ID NO:58
atgcggtggtgcctgctgctgatctgggctcagggcctgaggcaggctcctctggcttccggaatgatgacaggcacaatagaaacaacggggaacatttctgcagagaaaggtggctctatcatct
tacaatgtcacctctcctccaccacggcacaagtgacccaggtcaactgggagcagcaggaccagcttctggccatttgtaatgctgacttggggtggcacatctccccatccttcaaggatcgagtg
gccccaggtcccggcctgggcctcaccctccagtcgctgaccgtgaacgatacaggggagtacttctgcatctatcacacctaccctgatgggacgtacactgggagaatcttcctggaggtcctag
aaagctcagtggctgagcacggtgccaggttccagattccaaggaccgtggctgctcccagcgtgttcatgctgcagatggctggacagtgcagccagaacgagtacttcgacagcctgctgcacg
cctgcatcccctgccagctgagatgcagcagcaacacccccccactgacctgtcagagatactgtaacgccggagggacagttttattgttgttgtttgttatctcaattaccaccatcattgtcattttc
cttaacagaaggagaaggagagagagaagagatctatttacagagtcctgggatacacaggccgcacccaataactatagaagtcccatctctaccagtcaacctaccaatcaatccatggatga
tacaagagaggatatttatgtcaactatccaaccttctctcgcagaccagccactagagttgccctgtacctgctgagaagggaccagagactgcctcctgatgcccacaagcctcccggaggagga
tcttttagaacacccatccaggaggagcaggccgacgcccatagcaccctggctaagatctga

Claims (10)

1.一种分离的融合蛋白，包含：
胞外区，所述胞外区包括TIGIT胞外结构域或其保留了特异性结合免疫抑制细胞因子的功能片段或突变体，
跨膜区或其突变体，和
共刺激信号分子的胞内结构域或其保留了共刺激信号分子传递共刺激信号、活化免疫细胞的生物学功能的功能片段或突变体。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述胞外区还包括膜表面结构域，
优选地，所述膜表面结构域包括B细胞表面抗原的胞外结构域或其保留了特异性结合抗原配体的功能片段或突变体。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述膜表面结构域包括BCMA胞外结构域或其保留了特异性结合BCMA配体的功能片段或突变体。
4.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述共刺激信号分子是免疫激活受体，
优选地，所述共刺激信号分子包括但不限于选自CD226、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7Ralpha、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40中的任一种或多种，
更优选地，所述共刺激信号分子的胞内结构域包括CD226的胞内结构域或其突变体。
5.如权利要求1-3中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述跨膜区包括来自CD226、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、LCK、ICOS、DAP10、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、IL-2R、IL-4R、IL-7Ralpha、IL-10R、IL-12R、IL-15R、IL-21R、CD27和CD40的跨膜区中的任一种或多种，
优选地，所述跨膜区来自CD226跨膜区或其突变体，或IL-7Ralpha跨膜区或其突变体，
更优选地，所述融合蛋白为SEQ ID NO:35-SEQ ID NO:58中的任一条序列所编码的蛋白。
6.一种核酸分子，选自：
(1)编码权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白的核酸分子；和
(2)(1)的互补序列；
优选地，所述核酸分子的序列选自SEQ ID NO:35-SEQ ID NO:58中的任一项。
7.一种核酸构建体，含有权利要求6所述的核酸分子，
优选地，所述核酸构建体为载体，
更优选地，所述载体为表达载体。
8.一种基因工程化的细胞，其表达权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白，和/或携带所述融合蛋白的编码序列，
优选地，所述细胞为免疫效应细胞，
优选地，所述细胞还表达CAR和/或TCR，或携带CAR和/或TCR的编码序列，
优选地，所述免疫效应细胞为TIL。
9.包含权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的核酸构建体和权利要求8所述的细胞中的任一种或多种的药物组合物，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。
10.权利要求1-5中任一项所述的融合蛋白、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的核酸构建体或权利要求8所述的细胞在制备治疗或预防肿瘤的药物中的用途。
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