CN118234851A - 重组武装溶瘤病毒组合物及其在til过继治疗中的用途 - Google Patents
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Abstract
一种用于将肿瘤细胞转化为APC的重组武装溶瘤病毒组合物，尤其是单纯疱疹溶瘤病毒组合物，其中所述溶瘤病毒组合物感染肿瘤细胞并表达三聚化OX40L和IL‑12和任选地PD1阻断剂。还提供所述溶瘤病毒组合物在癌症治疗中用于增强肿瘤细胞的抗原呈递、以及用于增强肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的抗肿瘤作用的用途。也提供用于所述方法和用途的药物组合物、药盒和联合产品。
Description
本发明涉及癌症治疗领域。更具体地，本发明提供了可以用于将肿瘤细胞转化为APC的重组武装溶瘤病毒组合物，尤其是单纯疱疹溶瘤病毒组合物，其中所述溶瘤病毒组合物感染肿瘤细胞并表达三聚化OX40L和IL-12和任选地PD1阻断剂。本发明还提供所述溶瘤病毒组合物在癌症治疗中用于增强肿瘤细胞的抗原呈递、以及用于增强肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的抗肿瘤作用的用途。本发明也提供用于所述方法和用途的药物组合物、药盒和联合产品。
免疫系统根除肿瘤的抗肿瘤反应一般涉及2个阶段：i)启动阶段，其中引发从头的抗肿瘤T细胞产生；和ii)效应子阶段，其中引发的抗肿瘤T细胞破坏和清除肿瘤。在抗肿瘤反应的启动阶段，表达MHC-I和II分子以及共刺激分子(例如CD80和CD86)的专业APC向幼稚T细胞(
T cell)呈递抗原。激活抗肿瘤T细胞通常需要至少2个信号：i)第一信号，由MCH/抗原复合物与T细胞受体(TCR)相互作用引起，并向T细胞传递激活信号；和ii)第二信号，由共刺激分子CD80/CD86与T细胞上表达的CD28刺激性受体的相互作用引起。这2个信号导致CD4T细胞激活(通过MHC-II)和CD8T细胞激活(通过MHC-I)。在有第一信号而无第二信号的情况下，会发生T细胞失能(anergy)。
抗原呈递的下调是肿瘤的一种主要免疫逃逸机制。该机制使得肿瘤细胞可以躲开抗肿瘤T细胞的免疫攻击。肿瘤细胞可以通过以下几种方式来减少抗原呈递：第一，丢失肿瘤抗原；第二，下调或突变MHC基因导致MHC分子低水平表达或无表达；第三，改变MHC上的抗原荷载；第四，下调共刺激分子CD80和CD86以阻碍MHC向T细胞的信号传导。
目前用于增强肿瘤抗原呈递的策略大致包括：通过基于树突细胞(DC)的干预措施(即，在体内或体外使DC细胞负载肿瘤抗原)，或通过肽疫苗或DNA疫苗、或通过TLR激动剂来增强抗肿瘤反应的启动阶段。大多数这些方法都要求存在功能性DC。但是，DC在癌症患者中普遍较少，甚至具有耐受原性，因此限制了此类方法的潜在功效。
研究提出，促使肿瘤细胞本身恢复抗原呈递或强制肿瘤细胞进行抗原呈递，可能是基于DC的免疫疗法的一种替代方案。
Ostrand-Rosenberg S.等在临床前小鼠模型中，通过基因转染MHC-I和-II以及共刺激分子CD80和CD86，证实表达这些分子而具有APC性质的癌细胞可以有效呈递其自身抗原，激活免疫反应，促进肿瘤浸润淋巴细胞对肿瘤的清除。(Ostrand-Rosenberg S.Tumor immunotherapy:the tumor cell as an antigen-presenting cell.Curr Opin Immunol 1994；6:722e7.)
Tanaka等人(Reversal of oncogenesis by the expression of a major histocompatibility complex class I gene.Science 1985:228.)的研究显示，转染了MHC-I的肿瘤细胞的荷瘤小鼠比亲代MHC-I阴性细胞荷瘤小鼠存活时间更长。这说明，恢复MHC-I表达有助于细胞毒性CD8T细胞识别肿瘤细胞。
Ostrand-Rosenberg S等人的再一项研究显示(Ostrand-Rosenberg S,Takur A,Clements V.Rejection of mouse sarcoma cells after transfection of MHC class II genes.J Immunol 1990:4068e71.)，高度恶性肉瘤细胞转染MHC-II后，荷瘤小鼠的肿瘤生长停滞；而相反，在免疫受损的小鼠中接种MHC-II转染的肉瘤细胞会导致肿瘤生长。这说明，MHC-II转染后的肿瘤具有免疫原性并被免疫系统排斥。因此，已经提出，恢复/诱导MHC-II在癌细胞中表达，能够激活CD4辅助T细胞并提高CD8细胞毒性T细胞的杀伤能力，并允许具有细胞毒性的CD4T细胞清除肿瘤细胞。
在T细胞免疫过程中，共刺激分子CD80/CD86在癌细胞上的表达，是将第二信号(通过CD28)传递至T细胞，从而引发抗肿瘤反应和避免T细胞失能所必需的。多项研究表明，通过例如转染CD80/CD86基因的方式，在表达MHC-I和II的肿瘤细胞中强制表达CD80/CD86，可以导致肿瘤排斥和长期免疫。见例如，Chen L等人.Costimulation of antitumor immunity by the B7 counterreceptor for the T lymphocyte molecules CD28 and CTLA-4.Cell 1992；71:1093e102；和Townsend SE,Allison JP.Tumor rejection after direct co-stimulation of
T cells by B7-transfected melanoma cells.Science 1993；259:368e70。
然而，对于使用病毒载体转染以表达MHCI和II分子和/或共刺激分子来恢复肿瘤细胞的抗原呈递和加强抗原特异性TIL细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤的这些方法，其应用仍受到诸如不同瘤组织以及其中负责抗原呈递下调的损伤性质等因素的限制。
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是天然存在于肿瘤中的特异性免疫细胞，在机体的免疫反应中，由免疫系统募集并浸润到肿瘤组织中，对肿瘤细胞具有特异性的杀伤作用。TIL细胞疗法利用此天然TIL来抑制或杀伤肿瘤。在TIL治疗中，一般涉及，自肿瘤患者的肿瘤组织分离其中的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，在体外扩增达到足够数量后，回输到患者体内。鉴于TIL对实体瘤存在天然的杀伤能力，已经提出在多种实体瘤中应用过继TIL治疗。然而，由于大多数实体肿瘤的免疫浸润程度较低且肿瘤内抗原呈递细胞较少，目前TIL治疗的适应症和疗效仍十分有限，大多数患者并无法获益于TIL治疗。此外，目前临床中TIL过继疗法一般需要至少500亿个细胞才能产生疗效，这也导致在向患者回输TIL细胞前需要较长的TIL体外扩增时间，从而往往使得患者错过最佳的治疗时间窗口。再一方面，在TIL回输至患者体内后，为维持TIL在体内的扩增和激活，大多数情况下，患者需要接受较高剂量的IL-2施用，但高浓度的IL-2会对肾脏和肝脏功能造成损害。因此，在本领域中仍存在进一步改善TIL治疗的需求。
溶瘤病毒是难治性癌症的另一种有希望的替代疗法。在理论上，病毒介导的溶瘤应扩散到肿瘤中的所有癌细胞上，并且病毒对肿瘤细胞的选择性感染和裂解，可以协作破坏肿瘤微环境中的免疫抑制，重新激活抗肿瘤免疫。然而临床经验显示，在施用溶瘤病毒中出现的抗病毒免疫反应会限制单独施用病毒的功效。此外，肿瘤微环境的基质细胞可以减少病毒在肿瘤细胞的传递，限制病毒引发的抗肿瘤反应。而且，初始感染的肿瘤细胞凋亡速度过快也会影响病毒的瘤内复制速度。因此，尽管一些溶瘤病毒已经进入临床研究，但是其治疗效力仍有待提升。
在癌症的治疗中，为了提高疗效，已经提出了多种联合疗法。例如，Sonia Guedan等人(CAR-T Cells and Oncolytic Viruses:Joining Forces to Overcome the Solid Tumor Challenge,Front.Immunol.9:2460.,doi:10.3389/fimmu.2018.02460)提出了，采用溶瘤病毒来克服T细胞过继疗法在实体瘤上面临的多重阻碍的几种可能机制，包括，例如，通过溶瘤病毒感染提供的危险信号来逆转肿瘤免疫抑制性环境，从而有利于CAR-T细胞向肿瘤微环境的募集(trafficking)、增殖和维持；通过溶瘤病毒对癌细胞的直接裂解和肿瘤相关抗原的释放，来促进抗肿瘤过继反应；以及通过使用具有转基因的武装溶瘤病毒，来进一步增强T细胞的效应子功能。
WO2020/056228公开了一种溶瘤病毒与CAR T细胞的联合癌症疗法，其中通过溶瘤病毒表达1型干扰素并通过CAR T细胞转基因表达干扰素α/β受体，来改变CAR-T细胞的功能和/或增强其扩增。
WO2018081789公开了一种利用工程化抗原呈递细胞(aAPC)来增强肿瘤浸润淋巴细胞扩增并将扩增的TIL用于癌症治疗的方法。在该方法中，为构建aAPC，选择了内源性表达HLA-A/B/C、ICOS-L和CD58分子的骨髓瘤细胞，所述细胞通过转导病毒表达外源CD86和4-1BBL和/或OX40L分子。
Victor Cervera-Carrascon等人(Comparison of Clinically Relevant Oncolytic Virus Platforms for Enhancing T Cell Therapy of Solid Tumors,Molecular Therapy:Oncolytics Vol.17 June 2020,
https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.03.003.)比较了四种不同溶瘤病毒(腺病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒和呼肠弧病毒)对TIL过继疗法在实体瘤中功效的影响。在该研究中，在接受TIL细胞治疗的肿瘤动物模型中，进行了肿瘤生长控制和存活分析。结果显示，相比于过继T细胞疗法的单独施用(TIL+PBS)，腺病毒是唯一在联用中导致了肿瘤体积显著降低的病毒。相对于PBS对照，其他病毒无一能够提供显著肿瘤生长控制。与之相关，在完全反应率上，TIL+PBS的反应率为17.5％，TIL+腺病毒为62.5％；而其他病毒与TIL的联用的反应率均分别低于PBS对照，分别为：单纯疱疹病毒(0％),痘苗病毒(12.5％)，呼肠弧病毒(12.5％)。然而，这些不同溶瘤病毒在过继TIL疗法中展示出显著差异性的原因未明。
鉴于肿瘤治疗的复杂性和目前肿瘤治疗方案的局限性，本领域持续存在着开发新的肿瘤治疗方案的需求。
发明概述
本发明人通过深入研究，令人惊奇地发现并首次公开了，一种应用重组武装溶瘤病毒来显著提升肿瘤组织中的肿瘤细胞的抗原呈递性能，以增强基于免疫细胞(尤其是肿瘤浸润淋巴细胞，即TIL细胞)的抗肿瘤免疫治疗的方法。更具体地，本发明人发现，通过施用联合表达三聚化OX40L和IL-12两者或是联合表达三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂三者的一种或多种武装溶瘤病毒，可以促使癌症患者的肿瘤细胞有效地转化为抗原呈递细胞(APC)，表达高水平的MHC-I和MHC-II以及共刺激分子如CD80/CD86，由此恢复和/或增强抗肿瘤的特异性淋巴细胞(诸如TIL)在肿瘤组织中的浸润、扩增和/或激活，改善肿瘤治疗效果。基于此发现，本发明人创造性地提出了能够在感染肿瘤细胞后提供三聚化OX40L和IL-12二因子的重组溶瘤病毒组合物和提供三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂三因子的重组溶瘤病毒组合物，及其在癌症治疗和改善过继TIL细胞治疗中的应用。在进一步的研究中，本发明还发现，在应用重组溶瘤病毒组合物提供PD-1阻断剂的方案中，作为一种替代方式，可以向受试者组合施用根据本发明的两因子重组溶瘤病毒和PD-1阻断剂。如本申请实施例所证实，当通过采用本发明的组合物和方法向受试者提供本发明的两因子(三聚化OX40L和IL-12)或本发明的三因子(三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂)时，在诱导肿瘤细胞的APC转化以及增强基于TIL的抗肿瘤细胞免疫方面，导致了协同效应。
因此，在一个方面，本发明提供了，包含编码三聚化OX40L和IL12两者的核酸的至少一种重组溶瘤病毒(在本文中，也称作武装溶瘤病毒)，尤其是单纯疱疹病毒，在癌症治疗中，用于将肿瘤细胞转化为APC和/或用于增强肿瘤细胞的抗原呈递的用途。在该应用中，所述至少一种重组溶瘤病毒可以进一步与PD-1阻断剂联合。用于联合的PD-1阻断剂可以为单独的PD-1阻断剂或包含PD-1阻断剂的组合物，或可以由所述的至少一种溶瘤病毒通过在基因组中包含和表达编码该PD-1阻断剂的核酸而产生。在该应用中，所述至少一种重组溶瘤病毒(或其与PD-1阻断剂的组合)可以进一步联合过继细胞治疗组合物，尤其是过继TIL细胞治疗组合物。不受任何理论的束缚，转化为APC的肿瘤细胞将促进患者体内的肿瘤浸润淋巴细胞，包括但不限于，治疗之前患者已有的和通过治疗诱导的和/或过继转移的肿瘤浸润淋巴细胞，向肿瘤组织的募集和浸润、和/或扩增和/或激活。
在再一方面中，本发明提供用于在受试者中将肿瘤细胞转化为抗原递呈细胞(APC)的方法、用于治疗癌症的方法、和用于改善过继细胞治疗癌症患者的方法，其中所述方法包括向受试者施用包含编码三聚化OX40L和IL12的核酸的至少一种重组溶瘤病毒。在一个优选实施方案中，所述方法还包括向受试者施用PD-1阻断剂或施用包含PD-1阻断剂编码核酸的重组溶瘤病毒。在再一优选的实施方案中，所述方法还包括向受试者施用过继细胞治疗组合物，尤其是过继TIL细胞治疗组合物。
因此，在一些实施方案中，本发明提供一种用于在受试者中将肿瘤细胞转化为抗原递呈细胞(APC)的方法、用于治疗癌症患者的方法、或用于改善过继细胞治疗癌症患者的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：
a)重组溶瘤病毒组合物，或者
b)重组溶瘤病毒组合物与PD-1阻断剂，或者
c)(a)或(b)与过继细胞治疗组合物，
其中，所述重组溶瘤病毒组合物包含至少一种(例如一种或两种或三种，优选地两种)重组溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒感染受试者的肿瘤细胞并表达外源三聚化OX40L和IL12和任选地PD-1阻断剂，
其中，所述过继细胞治疗组合物包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中优选地所述TIL细胞与肿瘤细胞来自相同的肿瘤受试者。优选地，所述重组溶瘤病毒组合物为提供三聚化OX40L和IL-12二因子的本发明重组溶瘤病毒组合物。
在再一些实施方案中，本发明提供用于在受试者中增强过继TIL疗法的功效的方法，包括向有需要的受试者施用
a)重组溶瘤病毒组合物，或者
b)重组溶瘤病毒组合物与PD-1阻断剂，
其中，所述重组溶瘤病毒组合物包含至少一种(例如一种或两种或三种，优选地两种)重组溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒感染受试者的肿瘤细胞并表达外源三聚化OX40L和IL12和任选地PD-1阻断剂，
其中，所述过继TIL治疗包括向受试者施用包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继细胞治疗组合物，其中优选地所述TIL细胞与肿瘤细胞来自相同的肿瘤受试者。优选地，所述重组溶瘤病毒组合物为提供三聚化OX40L和IL-12二因子的本发明重组溶瘤病毒组合物。
在上述本发明方法的一些实施方案中，本发明的方法包括：向受试者组合施用
(a)包含编码三聚化OX40L和IL12两者的核酸或包含编码三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂三者的核酸作为外源武装基因的一种或多种(优选地一种或两种)武装溶瘤病毒，与
(b)过继TIL细胞。
所述武装病毒与过继TIL细胞的组合施用提供更有效的抗肿瘤效果。所述组合施用可以是武装病毒与过继TIL细胞的并行施用、分开施用、或以任何顺序的相继施用。相比于仅施用所述武装病毒或仅施用过继T细胞，所述组合施用导致协同效果。
在上述本发明方法的再一些实施方案中，本发明的方法包括：向受试者组合施用
(a)包含编码三聚化OX40L和IL12两者的核酸(但优选地不包含编码PD-1阻断剂的核酸)作为外源武装基因的一种或两种武装溶瘤病毒，
(b)PD-1阻断剂，和
(c)过继TIL细胞。所述武装病毒、PD-1阻断剂与过继TIL细胞的组合施用提供更有效的抗肿瘤效果。相比于仅施用所述武装病毒或PD-1阻断剂或仅施用过继T细胞，所述组合导致协同效果。所述组合施用可以是武装病毒、PD-1阻断剂与过继TIL细胞的并行施用、分开施用、或以任何顺序的相继施用。
在上述本发明方法的任何实施方案中，所述癌症为实体瘤，例如，头颈癌或口腔癌，例如，牙龈癌，颊癌，和舌癌，或消化系统癌症例如结直肠癌，胰腺癌，或脑胶质瘤或黑色瘤，及其转移灶；优选地所述肿瘤为鳞状上皮细胞癌或腺癌。在一些实施方案中，所述癌症具有低肿瘤浸润程度。
在再一些方面，本发明也提供重组溶瘤病毒组合物，所述组合物包含至少一种重组溶瘤病毒，例如一种或两种或三种，优选地两种重组HSV-1溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒在感染细胞(优选地肿瘤细胞)后表达至少2种(例如1-4种)外源武装基因，所述外源武装基因包括三聚化OX40L和IL12和任选地PD-1阻断剂。优选地，所述组合物包含编码三聚化OX40L与PD-1阻断剂的第一溶瘤病毒与编码IL-12与PD-1阻断剂的第二溶瘤病毒，或所述组合物包含同时编码三聚化OX40L和IL12的一种重组溶瘤病毒。
在再一些方面，本发明提供本发明的重组溶瘤病毒组合物与
(a)PD-1阻断剂，或
(b)用于过继细胞治疗的过继细胞治疗组合物，或
(c)(a)和(b)的组合。
在再一些方面，本发明提供包含所述组合的药物、药盒或联合产品，优选地，其中所述过继细胞治疗组合物、所述PD-1阻断剂、和所述至少一种重组溶瘤病毒分别配制在不同的制剂中。优选地，所述至少一种重组溶瘤病毒中的不同重组溶瘤病毒配制在一种或优选地多种分开的不同制剂中，例如配制在第二制剂中、或配制在第二制剂和第三制剂中。
本发明也提供本发明的重组溶瘤病毒组合物或本发明的组合，在制备用于上述本发明的方法和/或用途之任一的药物或药盒或药物联合产品中的用途。
在上述任何的方面和实施方案中，包含在本发明重组溶瘤病毒组合物中的根据本发明的至少一种重组溶瘤病毒具有如下优选技术特征之一或其任何组合。
在一些优选实施方案中，所述至少一种重组溶瘤病毒(例如，一种或两种)在基因组中包含编码三聚化OX40L和IL-12的异源多核苷酸。在一些优选方面，所述至少一种重组溶瘤病毒在基因组中还包含编码 PD-1阻断剂的异源多核苷酸。在另一些优选方面，所述至少一种重组溶瘤病毒在基因组中不包含编码PD-1阻断剂的异源多核苷酸。在再一些优选方面，所述至少一种重组溶瘤病毒仅包含编码三聚化OX40L和IL-12的异源多核苷酸作为外源武装基因。在更优选的一些方面，所述至少一种重组溶瘤病毒仅包含编码三聚化OX40L和IL-12以及PD-1阻断剂的异源多核苷酸作为外源武装基因。
优选地，所述至少一种重组溶瘤病毒为在基因组中包含三聚化OX40L和IL-12编码核酸的一种重组溶瘤病毒。优选地，所述OX40L和IL-12编码核酸分别位于病毒的不同基因组位置。
更优选地，所述至少一种重组溶瘤病毒由第一和第二重组溶瘤病毒组成，其中第一重组溶瘤病毒在基因组中包含三聚化OX40L编码核酸；第二重组溶瘤病毒在基因组中包含IL-12编码核酸。再优选地，所述至少一种重组溶瘤病毒也提供PD-1阻断剂，例如在第一重组溶瘤病毒或第二重组溶瘤病毒或两者中提供。由此，在一些更优选的实施方案中，第一重组溶瘤病毒和/或第二重组溶瘤病毒(优选两者)还在基因组中包含编码PD-1阻断剂的核酸，优选地，所述PD-1阻断剂编码核酸与所述OX40L编码核酸或所述IL-12编码核酸分别位于病毒的不同基因组位置。
在上述的任一实施方案中，优选地，所述重组溶瘤病毒为单纯疱疹病毒1型病毒(HSV1)。更优选地，在上述的任一实施方案中，包含在重组溶瘤病毒基因组中的所述OX40L编码核酸、IL12编码核酸和任选地PD-1编码核酸分别插在HSV1病毒的如下位点：
当OX40L编码核酸和IL-12编码核酸由不同溶瘤病毒(优选地分别由第一和第二溶瘤病毒)提供时，
-OX40编码核酸插在HSV1病毒的ICP34.5位点中，优选地以双拷贝插在病毒的两个ICP34.5位点中；
-IL12编码核酸插在HSV1病毒的ICP34.5位点中，优选地以双拷贝插在病毒的两个ICP34.5位点中；
以及任选地，编码PD-1阻断剂的核酸插在HSV1病毒的UL26和UL27之间的基因间区；
当OX40L编码核酸和IL-12编码核酸由相同溶瘤病毒提供时，两者分别插在不同的HSV1基因组位置，例如，
-OX40编码核酸插在HSV1病毒的ICP34.5位点中，优选地以双拷贝插在病毒的两个ICP34.5位点中；
-IL12编码核酸插在HSV1病毒基因组的不同位置，例如，UL26和UL27之间的基因间区或UL3和UL4之间的基因间区，优选UL26和UL27之间的基因间区，
在此情况下，所述溶瘤病毒可以包含，但更优选地不包含编码PD-1阻断剂的核酸。
在上述的任一实施方案中，优选地，所述的至少一种重组溶瘤病毒，在每种重组溶瘤病毒上，包含1-4种(例如，1,2,3或4种)，优选地不超过3种(例如1,2或3种)，更优选地不超过2种(例如1种或2种)外源武装基因。在再优选的实施方案中，所述的至少一种重组溶瘤病毒包含总共2-10种(例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,或10种)，例如2-6种，优选2-4种，例如，3种或2种的外源武装基因。
因此，在一些最优选的实施方案中，本发明提供了两因子重组溶瘤病毒，其中所述重组溶瘤病毒包含两种外源武装基因，其选自：
(a)编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码PD-1阻断剂(优选抗PD-1单链抗体)的多核苷酸；
(b)编码IL12的多核苷酸和编码PD-1阻断剂(优选抗PD-1单链抗体)的多核苷酸；和
(c)编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL12的多核苷酸。
优选地，根据本发明的重组溶瘤病毒组合物包含本发明的一种或多种两因子重组溶瘤病毒。在一些实施方案中，根据本发明的重组溶瘤病毒组合物包含上述(c)中定义的两因子重组溶瘤病毒或由其组成，在一些优选方面，所述的重组溶瘤病毒组合物与PD-1阻断剂(例如包含PD-1阻断剂的组合物)组合。在另一些实施方案中，根据本发明的重组溶瘤病毒组合物包含上述(a)和(b)中定义的两因子重组溶瘤病毒，或由其组成。
可以编码外源三聚化OX40L的任何核酸均可以用于本发明。优选地，所述核酸编码这样的三聚化OX40L多肽，所述多肽从N端至C端包含三聚化结构域(例如，来自人TRAF家族成员，如TRAF2的三聚化结构域，例如人TRAF2的310至349位氨基酸)、OX40L的胞外域(例如，人OX40L的51-183位氨基酸)和跨膜结构域(例如PDGFR跨膜结构域。优选地，所述多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与其具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列。
可以编码IL-12的任何核酸均可以用于本发明。优选地，所述核酸编码包含或由IL-12α多肽和IL-12β多肽组成的IL-12异源二聚体蛋白。优选地，所述IL-12α多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与其具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列；且IL-12β多肽包含SEQ ID NO:16氨基酸序列或与其具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列。
可以编码PD-1阻断剂的任何核酸均可以用于本发明。优选地，所述核酸编码抗PD1抗体，优选地抗PD-1单链scFv抗体，更优选地所述抗PD-1scFv抗体包含SEQ ID NO：20的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:21的VL氨基酸序列。
优选地，编码所述三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂的核酸与CMV启动子功能性连接。
在根据本发明的一个优选的实施方案中，根据本发明的重组溶瘤病毒组合物提供本发明的所有三种治疗性因子，IL-12、OX40L和PD-1阻断剂，并优选地包含编码IL12和PD-1阻断剂的第一两因子重组溶瘤病毒和编码三聚化OX40L和PD-1阻断剂的第二两因子重组溶瘤病毒，或由其组成。在再一更优选的实施方案中，根据本发明的重组溶瘤病毒组合物提供所述三种因子中的IL-12和OX40L，并例如取决于肿瘤细胞类型或待治疗患者的具体情况下，在一些实施方案中优选地与包含PD-1阻断剂的组合物组合，其中优选地，根据本发明的该重组溶瘤病毒组合物包含编码三聚化OX40L的单因子重组溶瘤病毒和编码IL-12的第二重组溶瘤病毒或由其组成，或包含同时编码三聚化OX40L和IL-12的一种重组溶瘤病毒或由其组成。优选地，在所述这些实施方案中，根据本发明的三聚化OX40L多肽具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列；根据本发明的IL12包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的IL12α和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的IL12β；且根据本发明的PD1阻断剂为抗PD1单链scFv抗体，包含SEQ ID NO:22-24的HCDR1-HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:25-27的LCDR1-LCDR3氨基酸序列，优选地，包含SEQ ID NO：20和21的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列，更优选地所述scFv抗体包含或由SEQ ID No:19的氨基酸序列组成。
附图简述
图1A-1B显示，利用肿瘤细胞杀伤实验和ELISA证明激活的OC1-TIL具有特异性杀伤肿瘤的能力。其中，***表示，相对于TIL组，P<0.001。
图2显示，编码OX40L的溶瘤病毒(OV-OX40L)和编码IL12的溶瘤病毒(OV-IL12)、以及编码OX40L和IL12的两因子溶瘤病毒(OV-OX40L/IL12)的改造示意图。
图3A-3E显示，利用PCR、Western blot、流式和ELISA鉴定溶瘤病毒OV-OX40L，OV-IL12和OV-OX40L/IL12。
图4A-4D显示，溶瘤病毒对口腔癌原代细胞和原代组织的杀伤作用。其中，图4A比较了不同溶瘤病毒(包括表达GFP的溶瘤病毒OV-GFP、表达三聚化OX40L的溶瘤病毒OV-OX40L、表达IL-12的溶瘤病毒OV-IL-12和同时表达三聚化OX40L和IL12的溶瘤病毒OV-OX40L/IL12)在不同滴度下对来自多个口腔癌患者的原代肿瘤细胞(OC1，OC2，OC3和OC4)的杀伤效果。图4B-4D显示，溶瘤病毒对来自口腔癌OC1原代组织的样本的杀伤效果，其中，**表示P<0.01,***表示P<0.001，相对于组织块1(block-1)而言；##表示P<0.01,###表示P<0.001，相对于组织块-3(block-3)而言。图4E显示，溶瘤病毒能够感染多种肿瘤细胞系，包括脑胶质瘤，纤维肉瘤，结肠癌，乳腺癌。
图5显示，利用共培养实验检测溶瘤病毒OV-OX40L/IL12、OV-OX40L/αPD-1、OV-IL12/αPD-1和OV-OX40L/IL12/αPD-1联合TIL对原代口腔癌细胞的杀伤作用。
图6A-6C显示，利用ELISA和ELISPOT检测预感染OV-OX40L/IL12、OV-OX40L/αPD-1、OV-IL12/αPD-1和OV-OX40L/IL12/αPD-1的口腔癌原代细胞对TIL的激活作用。图6A中，***表示P< 0.001，相对于OC+OV-GFP+TIL而言。图6B中，***表示P<0.001，相对于OC1+OV-GFP+TIL而言。
图7显示，利用MTT检测OV-OX40L/IL12、OV-OX40L/αPD-1、OV-IL12/αPD-1和OV-OX40L/IL12/αPD-1联合TIL对原代口腔癌细胞的杀伤作用。其中，***表示P<0.001，相对于OC+OV-GFP+TIL而言。
图8显示，在预感染OV-OX40L/IL12、OV-OX40L/αPD-1、OV-IL12/αPD-1和OV-OX40L/IL12/αPD-1的原代口腔癌细胞的刺激下，利用MTT测定各组T细胞扩增情况。其中，***表示P<0.001，相对于TIL+OC-GFP而言。
图9显示，利用流式检测预感染OV-OX40L/IL12、OV-OX40L/αPD-1、OV-IL12/αPD-1和OV-OX40L/IL12/αPD-1的OC1原代口腔癌细胞对TIL的激活作用。其中，***表示P<0.001，相对于TIL+OC1-OV而言。
图10显示，利用流式检测武装溶瘤病毒OV-OX40L/IL12、OV-OX40L/αPD-1、OV-IL12/αPD-1和OV-OX40L/IL12/αPD-1对原代口腔癌细胞表面抗原表达的影响。其中，***表示P<0.001，相对于OC1+OV+TIL而言。
图11显示，利用QPCR检测OV-OX40L/IL12、OV-OX40L/αPD-1、OV-IL12/αPD-1和OV-OX40L/IL12/αPD-1对原代口腔癌细胞表面抗原表达的影响。
图12A-12D显示，在免疫缺陷小鼠中，评估OV-OX40L/IL12联合TIL对OC1和OC4-PDX肿瘤生长的抑制效果。图12A和12B显示，在不同给药方式下，在OC1-PDX荷瘤小鼠中的肿瘤生长情况，其中，***表示P<0.001，相对于OC1+TIL而言。图12C和12D显示，在不同给药方式下，在OC4-PDX荷瘤小鼠中的肿瘤生长情况，其中，***表示P<0.001，相对于OC4+TIL而言。
图13显示，ELISA检测各组肿瘤组织中的IFNγ的含量。其中，**表示P<0.01,***表示P<0.001，均相对于OC1+TIL而言；##表示P<0.01，相对于OC1+OV-GFP+TIL而言。
图14A-B显示，在不同给药方式下，在免疫完整小鼠中MC38移植瘤的生长曲线和小鼠存活曲线。
图15A-B显示，在不同给药方式下，在免疫完整小鼠中Pan02-HVEM移植瘤的生长曲线和小鼠存活曲线。
图16A-D显示，OV-OX40L/IL12+αPD-1联合TIL治疗3d和7d时肿瘤组织中免疫细胞和肿瘤细胞表面标志物的表达。
发明详述
除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外，本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书及附图并且从后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5％的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值。该术语也旨在涵盖在指定数字±1％,±0.5％，或±0.1％范围内的数值。
在本文中，术语“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整数或步骤，但是不排除任意其他要素、整数或步骤。
在本文中，表述“第一”、“第二”或“第三”等用于在所述及的要素之间进行区分，并且除非另有说明，这些表述并不指示要求所述要素具有特定的数量或以任何特定顺序或位置存在。
在本文中，表述“和/或”用于表示所列相关项目中的任何一个、或所列相关项目中的多个的任何和所有可能的组合。
术语“共施用”、“联合施用”、“组合施用”，在本文中涵盖向受试者个体施用两种或两种以上的药物活性成分，以便这些药物活性成分和/或其代谢物可以同时存在于受试者机体中。在根据本发明的方法和/或用途中，例如，可以向受试者组合施用第一和第二药物活性成分，其中第一药物活性成分包含过继TIL 细胞，且第二药物活性成分包含提供本发明的两因子(三聚化OX40和IL-12)或提供本发明的三因子(三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂)的一种或多种重组溶瘤病毒。在一些情况下，当所述一种或多种重组溶瘤病毒仅提供本发明的两因子(三聚化OX40和IL-12)时，还可以酌情向受试者施用第三药物活性成分，PD-1阻断剂或包含PD-1阻断剂的组合物。
在本文中，共施用/联合施用包括在分开的组合物中的同时施用，在分开的组合物中于不同时间施用，或施用包含两种或两种以上药物活性成分的组合物。优选地，在本发明中，过继T细胞与(一种或多种)重组溶瘤病毒，以及任选地PD-1阻断剂，分开在不同的组合物中施用，且优选地，(一种或多种)重组溶瘤病毒在过继T细胞回输受试者前施用，以感染受试者的肿瘤细胞并表达所携带的本发明因子(三聚化OX40和IL-12和任选地PD-1阻断剂)。
在本文中，“有效量”或“治疗有效量”是指，在以一个或多个剂量施用一段时间后，足以提供期望的生物学效应的药物活性成分量。所述期望生物学效应可以是缓解、治愈、或减轻疾病或疾病的相关一个或多个症状、或改善受试者的生存期。在癌症治疗中，期望的生物学效应可以包括，癌性数量的减少、肿瘤体积的减小、或肿瘤的根除；或抑制(例如减慢或停止)癌细胞向外周器官的浸润；或抑制转移瘤生长；抑制(稳定或停止)肿瘤生长；和/或诱导和促进针抗肿瘤免疫反应。适宜的有效量可以由本领域技术人员基于本说明书的整体教导，根据常规实验和分析，加以确定。治疗有效量可以由于如下因素而变动，所述因素包括但不限于，具体所用的药物活性成分(例如重组溶瘤病毒和过继TIL细胞以及任选地PD-1阻断剂)，待治疗的个体的年龄和状况、肿瘤形成程度、有无其他治疗形式等。类似地，组合物，包括重组溶瘤病毒组合物、过继细胞治疗组合物和包含PD-1阻断剂的组合物，的施用剂量将取决于多种因素，诸如活性成分、施用途径、个体的年龄和状况、医师的判断等。
术语“个体”或“受试者”或者“患者”在本文中可互换地使用，是指哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化动物(例如，奶牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)、兔和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。特别地，个体是人。
术语“治疗”指意欲改变正在接受治疗的个体中疾病之天然过程的临床介入。想要的治疗效果包括但不限于防止疾病出现或复发、减轻症状、减小疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低病情进展速率、改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。在根据本发明的一些实施方案中，施用根据本发明的重组溶瘤病毒组合物，或组合施用根据本发明的重组溶瘤病毒组合物与过继TIL治疗组合物，以及任选地PD-1阻断剂，用来延缓癌症发展或用来减慢癌症的进展。
术语“抗肿瘤作用”或“抑瘤作用”指，可以体现为以下之一或多项的生物学效果，包括但不限于例如，肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、肿瘤细胞增殖减少、或肿瘤患者的生存期延长。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。
在本文中，术语“重组”，当涉及例如病毒或细胞或核酸或蛋白或载体时，指所述病毒、细胞、核酸、蛋白或载体已经通过引入异源核酸或蛋白、或通过改变自身已有的天然核酸或蛋白而被修饰、或指来自于由此修饰的病毒或细胞的物质。
在本文中，“重组HSV-1溶瘤病毒”是指，经工程改造而携带异源多核苷酸，例如编码三聚化OX40L、IL-12和/或PD-1阻断剂的异源多核苷酸的1型单纯疱疹病毒，所述病毒能够选择性感染肿瘤细胞并具有溶瘤性质。野生型的HSV-1作为一种嗜神经性病毒，在人群中感染非常普遍，临床表现轻微。作为双链DNA病毒，HSV-1的基因组长152kb，由独特长片段(UL)和短片段(US)组成，两端为末端反向重复序列TR
L和TR
s，两片段连接处为内部反向重复序列(IR)。IR包括IR
L和IR
s,分别是TR
L和TR
s的反向重复序列。重组HSV-1溶瘤病毒可以利用基因工程手段，通过缺失单个或多个HSV-1基因，任选地插入免疫激活和/或肿瘤治疗相关基因，改造临床分离株获得。HSV-1的ICP34.5(也称γ34.5)为神经毒基因，编码HSV-1在神经细胞中增殖所必需的蛋白质。临床研究已经证实，缺失γ34.5的重组HSV-1可以选择性地在肿瘤细胞中复制和实现溶瘤效应。此外，在缺失γ34.5的基础上，敲除ICP47基因，获得的重组病毒在感染细胞中可以增强细胞MHC-1表达，促进肿瘤细胞抗原的递呈。因此，在一些优选的实施方案中，本发明的重组溶瘤病毒优选在基因组中具有单拷贝或双拷贝ICP34.5基因敲除以及ICP47基因敲 除。更优选地，本发明的重组溶瘤病毒是ICP47和ICP34.5双拷贝缺失的HSV-1病毒，即具有双拷贝ICP34.5基因敲除以及ICP47基因敲除的HSV-1病毒。
“敲除”或“基因敲除”或“基因缺失”在本文中是指，基因通过遗传工程方式被破坏从而丧失其功能。例如，可以通过遗传工程改造，在基因中引入无效突变或插入异源核酸，造成基因不再表达或以极低水平表达从而无法发挥其原有的生物学活性，或导致基因产物无功能性。
术语“宿主细胞”指已经向其中引入外源多核苷酸的细胞，包括这类细胞的子代。宿主细胞包括体外培养的细胞，也包括转基因动物个体或组织内部的细胞。例如，在一些情况下，宿主细胞可以是通过重组病毒引入了外源编码多核苷酸的肿瘤细胞，例如分离自受试者的肿瘤细胞；或位于受试者机体内部的肿瘤细胞。
描述核酸或蛋白质时所用的术语“外源的”或“异源的”可互换使用，是指相对于包含或待包含所述核酸或蛋白质的宿主细胞而言，该核酸或蛋白质是外来的，即其在所述宿主细胞中的存在位置并不是其在自然情况下的天然存在位置。异源核酸序列也指衍生自并引入(例如通过病毒感染而引入)相同宿主细胞或受试者而由此以非天然状态存在的序列，例如，所述序列位于不同的位置、以不同的拷贝数存在，或处于不同调控元件的控制下。
术语“调控序列”或“表达控制序列”是指这样的核酸序列，其诱导、抑制或以其它方式控制与之有效连接的编码核酸序列的蛋白质转录。调控序列可以是例如起始序列、增强子序列、内含子序列和启动子序列等。
术语“表达盒”是指，编码并能够表达一个或多个目的基因(例如本发明因子，三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂)的DNA序列。在表达盒中，通常，编码目的基因的异源多核苷酸序列与表达控制序列功能性连接。取决于插入位点和预期功能，在一些实施方案中，表达盒的插入导致插入位点处的基因破坏；在另一些实施方案中，表达盒的插入不影响插入位点两侧的基因的转录和/或表达。
术语“功能性连接”也称作“有效连接”，意指指定的各组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系中。
术语序列“同一性”用于描述两个氨基酸序列或多核苷酸序列之间的序列结构相似性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分数，可以将所述序列出于最佳比较目的进行比对(例如，可以为了最佳比对而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以为比较目的而选择合适的比较窗)。在一个优选实施方案中，为比较目的，参与比对的参考序列长度是参考序列全长的至少30％、优选地至少40％、更优选地至少50％、60％和甚至更优选地至少70％、80％、90％、或最优选100％。在所述比对后，可以比较两序列在对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置由第二序列中对应位置处的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在这个位置处是相同的。
两个序列间的序列比较和同一性百分数的计算可以利用数学算法实现。在一个优选实施方案中，使用已经集成至GCG软件包的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在http://www.gcg.com可获得)，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵和空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。在又一个优选的实施方案中，使用GCG软件包中的GAP程序(在http://www.gcg.com可获得)，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80和长度权重1、2、3、4、5或6，确定两个核苷酸序列之间的同一性百分数。还可以使用PAM120加权余数表、空位长度罚分12，空位罚分4，利用已经并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法((1989)CABIOS,4:11-17),确定两个氨基酸序列或核苷酸序列之间的同一性百分数。
如本文中所用，术语“保守性”氨基酸或核苷酸改变是指，导致包含所述氨基酸或核苷酸改变的蛋白质或核酸分子实质性地保持原有功能的中性或近中性氨基酸或核苷酸改变。例如，保守性氨基酸置换是将氨基酸置换或取代成侧链具有相似生物化学性质(例如电荷、疏水性和大小)的不同氨基酸。这类保守性修饰的变体可以附加在多态性变体、物种间同源物或等位基因上。以下8组含有互为保守替换的氨基 酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。本领域技术人员可以通过常规技术手段，例如功能性测定试验，容易地检测一个特定多肽序列或核苷酸序列中的氨基酸或核苷酸改变的保守性。
在本文中，术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用。例如编码三聚化OX40L的多核苷酸也可以称作三聚化OX40编码核酸；类似地，编码IL-12的多核苷酸也可以称作IL-12编码核酸；编码PD-1阻断剂的核酸也可以称作PD-1阻断剂编码核酸。
术语“OX40L”或OX40配体，也称作TNFSF4，在本文中，是指能够与肿瘤坏死因子受体OX40相互作用并向表面表达OX40的T细胞传递存活和激活信号的OX40配体。OX40L多肽的一个例子是登录号UniProt P23510下的人OX40L蛋白。本发明也涵盖天然全长OX40L的功能性片段、变体、或包含OX40L胞外域的融合蛋白。例如，在一个优选的实施方案中，根据本发明的OX40L多肽是包含OX40L的胞外域的膜结合性融合蛋白，其中在该胞外域氨基酸序列的N端连接了三聚化结构域并在C端连接了跨膜结构域。三聚化结构域是具有介导包含其的多肽发生三聚化的功能的肽序列，这样的肽序列是本领域已知的。此类具有三聚化结构域的OX40L多肽在本文中称作“三聚化OX40L”，是本发明优选方案。在一个优选实施方案中，与OX40L胞外域融合的三聚化结构域是TRAF家族蛋白的三聚化结构域，例如，人TRAF2(例如，UniProt Q12933下氨基酸序列)的310至349位氨基酸。在再一优选实施方案中，融合蛋白中包含的OX40L胞外域具有例如UniProt P23510下的OX40L氨基酸序列的Gln51-Leu183氨基酸，或具有与其至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列变体，尤其是保守性氨基酸替代变体。在再一优选实施方案中，与OX40L胞外域连接的跨膜结构域可以来自哺乳动物跨膜蛋白，例如，PDGFR的跨膜结构域。
在一个优选实施方案中，本发明溶瘤病毒包含编码三聚化OX40L的核酸，其中所述核酸编码并表达从N端至C端包含TRAF2三聚化结构域(例如，人TRAF2的310至349位氨基酸)、OX40L的胞外域(例如，人OX40L的51-183位氨基酸)和跨膜结构域(例如PDGFR跨膜结构域)的融合多肽。优选地，该融合多肽在表达后可以形成展示在细胞表面的三聚化OX40L，并可以通过OX40L胞外区结合OX40分子，激活相关信号事件。
在一个实施方案中，OX40L多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列、或由其组成；或包含与所述氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个优选实施方案中，OX40L多肽是SEQ ID NO：18的保守性氨基酸替代变体，优选地，氨基酸残基改变的数目不超过10个，例如0-5个。
在本发明中，三聚体OX40L编码基因或编码核酸或多核苷酸是指能够编码三聚化OX40L多肽，并能够在递送到肿瘤细胞中(例如通过溶瘤病毒递送到肿瘤细胞中)后实现功能性三聚体OX40L蛋白在肿瘤细胞表面表达的核酸。在一个实施方案中，OX40L编码核酸编码本发明的三聚化OX40多肽。在一个实施方案中，OX40L编码核酸编码包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的多肽、或与其具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列的变体，尤其是保守性氨基酸替代变体。在再一些实施方案中，OX40L编码核酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
术语“IL-12”是指，由IL-12α(p35)和IL-12β(p40)两个亚基组成的异源二聚体蛋白。IL-12α亚基的一个例子是登录号UniProt P29459下的人IL-12α蛋白。IL-12β亚基的一个例子是登录号UniProt P29460下的人IL-12β蛋白。本发明涵盖天然全长IL-12α和IL-12β、其功能性片段、变体、或包含其的蛋白。
在一个实施方案中，IL-12α多肽包含SEQ ID NO:17氨基酸序列或由其组成；或包含与所述氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个优选实施方案中，IL-12α多肽是SEQ ID NO：17的保守性氨基酸替代变体，优选地，氨基酸残基改变的数目不超过10个，例如0-5个。在另一实施方案中，IL-12α多肽包含UniProt P29459下的氨基酸序列、或由其组成；或包含与所述氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％, 99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个优选实施方案中，IL-12α多肽是UniProt P29459下的氨基酸序列的保守性氨基酸替代变体，优选地，氨基酸残基改变的数目不超过10个，例如0-5个。
在一个实施方案中，IL-12β多肽包含SEQ ID NO:16氨基酸序列或由其组成；或包含与所述氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个优选实施方案中，IL-12β多肽是SEQ ID NO：16的保守性氨基酸替代变体，优选地，氨基酸残基改变的数目不超过10个，例如0-5个。在另一实施方案中，IL-12β多肽包含UniProt P29460下的氨基酸序列、或由其组成；或包含与所述氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。在一个优选实施方案中，IL-12β多肽是UniProt P29460下的氨基酸序列的保守性氨基酸替代变体，优选地，氨基酸残基改变的数目不超过10个，例如0-5个。
在一个优选的实施方案中，IL-12异源二聚体蛋白包含或由IL-12α多肽和IL-12β多肽组成，其中IL-12α多肽包含SEQ ID NO:17氨基酸序列或由其组成；且IL-12β多肽包含SEQ ID NO:16氨基酸序列或由其组成。
在本发明中，IL-12编码基因或编码核酸或多核苷酸是指能够编码功能性IL-12，并能够在递送到肿瘤细胞中(例如通过溶瘤病毒递送到肿瘤细胞中)后实现所述功能性IL-12自肿瘤细胞的分泌表达或展示在肿瘤细胞表面的核酸。在一个实施方案中，IL-12编码核酸编码并表达分泌型IL-2α和IL12β。在另一个实施方案中，IL-12编码核酸编码并表达通过融合跨膜结构域如PDGFR跨膜结构域展示在细胞表面的IL-2α或IL12β。在一个实施方案中，IL-12α和IL12β作为串联的多顺反子表达。在再一实施方案中，IL-12α编码核酸和IL12β编码核酸之间由IRES序列连接，所述IRES序列能招募核糖体对mRNA进行翻译。
在一个实施方案中，IL-12编码核酸编码UniProt P29459下的人IL-2α多肽和UniProt P29460下的人IL-12β多肽、或与其各自具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列的变体，尤其是保守性氨基酸替代变体。在再一实施方案中，IL-12编码核酸编码包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的IL-12α多肽、或与其具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列的变体，尤其是保守性氨基酸替代变体；且编码包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的IL-12β多肽、或与其具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列的变体，尤其是保守性氨基酸替代变体。在再一些实施方案中，IL-12编码核酸包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
术语“PD-1阻断剂”指能够阻断PD-1和PD-L1结合并传递信号的物质。例如，PD-1阻断剂可以是抗PD-1(程序死亡1蛋白)抑制性抗体或抗PD-L1(程序死亡配体1)抑制性抗体。抗PD-1抗体的例子包括，例如，纳武单抗,pembrolizumab、匹地利珠单抗。抗PD-L1抗体的例子包括，例如MPDL3280A,MSB00107180。用于本发明的抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段，例如scFv。
在一个实施方案中，PD-1阻断剂是抗PD-1scFv抗体。在一个实施方案中，所述抗PD-1scFv抗体包含：从N端到C端，重链可变区(VH)-接头-轻链可变区(VL)；或轻链可变区(VL)-接头-重链可变区(VH)。任何可以用于形成scFv抗体并保持其与目的抗原结合之能力的接头均可以用于本发明的抗PD-1scFv抗体中。在一个实施方案中，所述接头为长10-20个氨基酸，例如15个氨基酸的柔性接头。在一个优选实施方案中，接头为(GnS)m，其中n和m分别为1-5的整数，例如n＝4,m＝2,3或4。优选地，接头为(G4S)3。为了利于抗PD-1scFv抗体在肿瘤细胞中的分泌表达，所述抗体还可以在N端包含信号肽，例如SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在本文中，术语“外源武装基因”是指，插入重组溶瘤病毒中并可以在重组溶瘤病毒感染细胞(优选肿瘤细胞)后表达产生具有治疗性功效的分子(例如RNA和蛋白质，优选蛋白质)的核酸/多核苷酸，所述核酸/多核苷酸相对于所述重组溶瘤病毒以及所述病毒转入或待转入的宿主细胞(例如体外或体内肿瘤细胞)是外源的。可以用于武装重组溶瘤病毒的此类治疗性外源武装基因包括但不限于，用于改善重组溶瘤病毒的感染复制能力和/或溶瘤效果，和/或克服免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的作用的任何核酸/多核苷酸，例 如编码治疗性蛋白(例如细胞因子)、肿瘤相关抗原(TAA)、T细胞共刺激分子、免疫检查点抑制剂(ICIs)和细胞自杀基因等的核酸/多核苷酸。外源武装基因的一些具体例子包括，但不限于，可以直接诱导肿瘤细胞死亡的细胞死亡相关分子，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，抑癌基因P53等；抗血管生成的分子，如内皮抑素、血管内皮细胞生长抑制因子(VEGI)；免疫调节因子，如免疫相关细胞因子(GM-CSF、IL-2、干扰素)，趋化因子(CCL5、CCL20、CCL21)，其他可诱导抗肿瘤免疫反应的因子(病毒膜蛋白、HSP70)等；抑制肿瘤相关基因的小RNA分子，如miRNA、siRNA、shRNA和lncRNA等。在本发明的一些实施方案中，包含在本发明的重组溶瘤病毒组合物的至少一种重组溶瘤病毒中的外源武装基因可以不限于(但在一些优选方案中，可以仅限于)本发明的二因子，即，编码三聚化OX40L的外源多核苷酸和编码IL-12的外源多核苷酸。在本发明的再一些实施方案中，包含在本发明的重组溶瘤病毒组合物的至少一种重组溶瘤病毒中的外源武装基因可以不限于(但在一些优选方案中，可以仅限于)本发明的三因子，即，编码三聚化OX40L的外源多核苷酸、编码IL-12的外源多核苷酸、以及编码PD-1阻断剂的外源多核苷酸。
尽管可以将多数种外源武装基因引入一个重组溶瘤病毒中，但在一些情况下，这对于保持重组溶瘤病毒的稳定性是不利的。因此，在本发明的重组溶瘤病毒组合物的至少一种重组溶瘤病毒中，插入单一一个重组溶瘤病毒中的外源武装基因的数量优选不超过4种，更优选不超过3种，最优选不超过2种。例如，在一些优选实施方案中，编码三聚化OX40L的外源核酸、编码IL-12的外源核酸和编码PD-1阻断剂的外源核酸，分别单独地或以任意两者组合的方式，包含在同一重组溶瘤病毒中，作为该重组溶瘤病毒上仅有的外源武装基因。
在本文中，在感染肿瘤细胞后可以提供(即表达产生)本发明三因子(即，OX40L、IL-12和PD-1阻断剂)之任一的重组溶瘤病毒被称作“单因子”重组溶瘤病毒；可以提供本发明三因子中的两者的重组溶瘤病毒被称作“两因子重组溶瘤病毒”；可以同时提供本发明三因子中的三者的重组溶瘤病毒被称作“三因子重组溶瘤病毒”。
类似地，在本文中，在施用于肿瘤细胞后可以提供(即表达产生)本发明三因子(即，OX40L、IL-12和PD-1阻断剂)中的OX40L和IL-12的重组溶瘤病毒组合物被称作“两因子”重组溶瘤病毒组合物；可以提供本发明所有三种因子(即，OX40L、IL-12和PD-1阻断剂)中的重组溶瘤病毒被称作“三因子”重组溶瘤病毒组合物。
II.本发明
如实施例中所证实，令人惊奇的，本发明人发现，通过编码三聚化OX40L和IL-12或编码三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂的武装溶瘤病毒，或通过编码三聚化OX40L和IL-12的武装溶瘤病毒与PD-1阻断剂的组合，可以显著地促使癌症患者的肿瘤细胞表达MHC-I和-II分子以及共刺激分子例如CD80/CD86，从而将肿瘤细胞转化为具有APC性质的抗原呈递细胞。
不受任何理论的束缚，在抗肿瘤免疫反应的启动阶段，通过本发明武装溶瘤病毒感染而具有APC性质的肿瘤细胞，将通过MHC-I或-II呈递其自身肿瘤抗原，并通过共刺激分子CD80/CD86传递共刺激信号，由此促进T细胞向肿瘤组织中的浸润、以及瘤组织中肿瘤浸润淋巴细胞TIL的扩增和激活。由于瘤组织中肿瘤细胞比专业APC树突细胞(DC)数量多得多，通过恢复或增强肿瘤细胞直接呈递自身抗原的能力，也增强了在缺乏APC的肿瘤组织内抗肿瘤TIL细胞对肿瘤细胞的识别，由此改善TIL对肿瘤的清除。
基于此，本发明提供了一种新的重组溶瘤病毒组合物及其用于癌症治疗中增强基于免疫细胞(尤其是肿瘤浸润淋巴细胞)的抗肿瘤免疫的用途和方法。本发明的重组溶瘤病毒组合物(作为三因子组合物单独地，或作为两因子组合物，优选地与PD-1阻断剂组合)与过继TIL治疗组合物的组合导致协同治疗效果，即，超出任何组合物之一单独施用时的治疗效果。
以下就本发明的各方面详细描述如下。
过继细胞治疗组合物
在本文中，过继细胞治疗组合物优选为过继TIL细胞治疗组合物，即包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的组合物。
过继TIL细胞在癌症治疗中的应用，一般涉及将离体生长的TIL细胞转移到宿主体内，以增强抗癌免疫。过继转移的细胞可以是自体的，或同种异体的。在一些情况下，可以根据待治疗的癌症类型，对过继转移的TIL细胞在体外进行或不进行特定T细胞亚群的分选和富集。过继转移的TIL细胞也可以是未经遗传修饰的，或经遗传修饰而转基因表达异源蛋白例如嵌合抗原受体(CAR)。在回输前，癌症受试者可以接受清髓性(myeloablating)或非清髓性(myeloablating)的预处理性化疗和/或放疗。
在一些优选实施方案中，在根据本发明的过继TIL细胞治疗中，使用自体细胞。在一些实施方案中，优选地，过继转移的TIL淋巴细胞是未经细胞亚群分选的。在另一些实施方案中，过继转移的TIL细胞是经分选的细胞亚群，例如，CD8+T细胞富集的，或CD4+T细胞富集的。在再一些实施方案中，过继转移的TIL细胞是未经遗传修饰的。
在一些实施方案中，过继转移的TIL细胞为分离自受试者的肿瘤浸润淋巴细胞，所述细胞能够特异性识别并破坏癌症的肿瘤细胞。
在本文中，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是指能够浸润肿瘤的淋巴细胞。一般可以通过以下生物标志物之一或多个来分类TIL：CD4，CD8,TCRab,CD27,CD28,CD56,CCR7,CD45Ra,CD95,PD-1和CD25。在本发明中，优选地，TIL是能够浸润实体肿瘤并实现抗肿瘤作用的淋巴细胞。
在一些实施方案中，分离的肿瘤浸润淋巴细胞在体外培养至大数量，并回输给患者，优选地腹膜内施用或瘤内施用，更优选地瘤内施用。在再一实施方案中，在TIL细胞回输前，向受试者施用编码三聚化OX40L，IL12和任选地PD1阻断剂的一种或多种武装溶瘤病毒，尤其是HSV-1病毒，优选地，施用本发明的两因子或三因子重组溶瘤病毒组合物。在施用本发明两因子重组溶瘤病毒组合物时，可以酌情在治疗过程中施用单剂或多剂PD-1阻断剂。
用于本发明过继治疗的TIL的分离和体外扩增，可以按照本领域已知的任何方式进行。例如，TIL的体外扩增可以通过如下方式进行：在包含IL-2/IL-7/IL-15细胞因子和抗CD3抗体的细胞培养基中培养分离的TIL细胞；之后进行快速扩增。该扩增方法因其速度和效率，是TIL扩增的优选方案。在第一阶段的TIL扩增中，IL-2/IL-7/IL-15细胞因子在细胞培养基中的初始浓度可以分别为大约5ng/ml,抗CD3抗体(例如OKT-3抗体)可以为大约30ng/ml。
在TIL的体外扩增中，可以使用饲养细胞，但也可以直接进行分离的TIL的直接传代扩增。例如，可以将取自受试者的肿瘤样品消化成单细胞后，铺在24孔板中，在一段时间例如24小时的培养后，收集上清中的细胞进行后续的分离扩增。相比于使用饲养细胞，该直接扩增操作更简便，并可以保证细胞在每孔中大致均匀分布，避免细胞由于无法接触到培养基而发生死亡。
在根据本发明的任何方法和/或用途的一个实施方案中，包括离体扩增分离自受试者的TIL的步骤，包括：
(a)从患者切除的肿瘤组织中获得第一TIL群体；
(b)在包含IL-2、IL-7和IL-15以及OKT-3抗体的细胞培养基中扩增第一TIL群体，以获得第二TIL群体，
(c)将第二TIL群体在包含高浓度IL-2的细胞培养基中进行快速扩增，获得第三TIL群体。
步骤(a)的TIL分离可以包括：将来自肿瘤受试者的肿瘤组织消化并分散为单细胞，优选地，使用包含IV胶原酶、II型透明质酸酶、和IV型DNaseI的消化缓冲液进行肿瘤组织消化；使用非连续密度梯度(例如标准等渗Percoll溶液(SIP)的非连续密度梯度)离心以分离TIL细胞。
步骤(b)的第一阶段TIL扩增优选地使用低浓度IL-2进行，例如所述扩增可以包括：用包含IL-2(大约5ng/ml或大约100IU/ml),IL-7(大约5ng/ml),IL-15(大约5ng/ml)与抗CD3抗体(大约30ng/ml)的培养基，培养分离的TIL细胞。
步骤(c)的快速扩增优选采用大约3000IU/ml的IL-2进行。
任选地，在步骤(c)后，还包括将TIL细胞与癌细胞，尤其是经含有地西他滨、TNFα和IFN-γ的DEC混合液刺激的癌细胞，共培养，以激活TIL；以及任选地，对分离和扩增的TIL细胞进行或不进行亚型富集，优选地，在扩增后TIL细胞不经亚型富集直接回输受试者。
扩增后的TIL细胞可以直接施用于受试者。或者，TIL细胞冷冻储存在大约-150到60摄氏度。用于冷冻保存TIL细胞的一般方法是本领域已知的。
在一些实施方案中，过继转移的TIL细胞包含在过继细胞治疗组合物中。所述组合物可以包含药物可接受载体、缓冲剂、赋形剂、助剂、添加剂、抑菌剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂、和/或通常可以在相应的过继细胞治疗产品中存在的任何其他成分。适宜过继细胞治疗产品的试剂和配制方法是本领域已知的。可以将过继转移的TIL细胞配制为任何适宜施用的组合物形式，例如固体、半固体或液体形式。制剂可以选自，例如，但不限于，溶液、乳液、悬浮液、片剂、和囊剂。在一个优选的实施方案中，制剂为适于过继TIL细胞腹膜内施用的制剂形式；更优选地适于瘤内注射施用的制剂形式。
重组溶瘤病毒及其组合物
用于本发明的重组溶瘤病毒可以是任何适于人或动物的溶瘤病毒，包括但不限于，单纯疱疹病毒、呼肠弧病毒、痘苗病毒，尤其是1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。例如，可以工程化改造HSV-1的临床分离株，以产生本发明的重组溶瘤病毒。所述工程化改造包括在HSV-1的基因组中插入编码选自三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂之一、之二或之三的多核苷酸。在本发明中，工程化改造的溶瘤病毒也称作重组溶瘤病毒。
在一个实施方案中，因此，本发明提供至少一种重组溶瘤病毒及包含所述至少一种重组溶瘤病毒的重组溶瘤病毒组合物，所述至少一种重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40、IL-12和任选地PD-1阻断剂的多核苷酸。
在一个实施方案中，所述至少一种重组溶瘤病毒为一种重组溶瘤病毒，其在基因组中编码包含编码三聚化OX40、IL-12和任选地PD-1阻断剂的多核苷酸，优选地，所述重组溶瘤病毒为编码三聚化OX40L和IL-12的两因子重组溶瘤病毒。在再一实施方案中，所述至少一种重组溶瘤病毒为一种以上重组溶瘤病毒，例如，两种或三种重组溶瘤病毒，由此在将该一种以上的不同重组溶瘤病毒施用于受试者后可以在受试者的肿瘤细胞中重组表达三聚化OX40L和IL-12两者或优选地重组表达三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂三者。在两种重组溶瘤病毒的情况下，优选地，第一重组溶瘤病毒在基因组包含编码三聚化OX40L和PD-1阻断剂的多核苷酸；第二重组溶瘤病毒在基因组中包含编码IL-12和PD-1阻断剂的多核苷酸。在三种重组溶瘤病毒的情况下，优选地，第一重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40L的多核苷酸；第二重组溶瘤病毒在基因组中包含编码IL-12的多核苷酸；第三重组溶瘤病毒在基因组中包含编码PD-1阻断剂的多核苷酸。在一个备选方案中，在本发明的任何方法和用途中，在涉及本发明重组溶瘤病毒提供PD-1阻断剂的任何实施方案中，均可以考虑将其替代为单独施用的PD-1阻断剂；并且这样的替代方案涵盖在本发明的保护范围中。
本领域熟知在HSV-1的基因组中插入外源多核苷酸而不影响病毒的复制和感染功能的基因组区域位置。可以根据需要，选择在HSV-1基因组中插入外源多核苷酸的适宜插入位点。在本发明中，当将两种或两种以上的外源武装基因插入同一病毒基因组中时，优选地所述外源武装基因分别插在病毒基因组的不同位置。在本文中，就插入病毒基因组中的外源武装基因而言，位于或插入“不同基因组位置”是指，两个基因之间至少间隔一个或数个病毒基因。因此，在涉及应用一种重组溶瘤病毒来提供OX40L、IL-12和PD-1阻断剂三者的实施方案中，优选地，在不同的基因组位置插入OX40L、IL-12和PD-1阻断剂。在涉及应用包含第一重组溶瘤病毒和第二重组溶瘤病毒的实施方案中，优选地，第一重组溶瘤病毒包含插在不同的基因组位置的编码OX40L和PD-1阻断剂的多核苷酸；第二重组溶瘤病毒包含插在不同的基因组位置的编码IL-12和PD-1阻断剂的多核苷酸。
本领域技术人员明了，对HSV-1进行工程化改造，应优选减少除期望改变之外对病毒基因组的改变，外源基因插入的位点应优选不影响病毒的生长和病理学。可以插入外源基因的HSV-1基因组位置包 括，但不限于，ICP34.5基因位点、以及UL3UL4，UL50UL51,US1US2、UL26UL27之间的基因间区。对于在基因间区中的插入，外源基因的插入应优选不破坏插入位点两侧的基因各自的转录。
为实现外源基因在HSV-1基因组中的插入，可以在哺乳动物细胞中通过病毒基因组与包含外源基因的质粒之间的同源重组来进行。一种可用的方式是，向哺乳动物细胞共转染质粒和分离的病毒基因组DNA。另一种可选的替代方式是转染-感染法，其中通过感染的方法提供病毒基因组，即，用HSV-1感染已经转染了质粒的细胞来提供HSV基因组。在该方法中，感染后可以进行几轮，例如3-4轮，病毒噬斑纯化，筛选正确插入了外源基因的重组病毒。可以用于构建重组溶瘤病毒的哺乳动物细胞包括，但不限于，Vero细胞和293细胞。
用于重组HSV-1溶瘤病毒构建的转染-感染方法，还可以和CRISPR/Cas9基因组编辑方法/TALEN基因组编辑方法或ZFN基因组编辑方法组合。
本发明的至少一种重组溶瘤病毒在感染肿瘤细胞后将表达三聚化OX40L和IL-12两者或优选地表达三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂三者。因此，在一些优选的实施方案中，编码OX40L、IL-12和任选地PD-1阻断剂的异源多核苷酸，分别以表达盒的形式，插入HSV-1基因组中。优选地，所述表达盒包含与所述异源多核苷酸功能性连接的启动子和终止子。任何可以在肿瘤细胞中启动异源多核苷酸表达的启动子均可以使用，例如来自哺乳动物细胞或其病毒的启动子，例如CMV启动子。任何可以在肿瘤细胞中实现异源多核苷酸表达终止的终止子序列均可以使用，例如，来自哺乳动物细胞或其病毒的终止子序列，例如polyA信号序列，优选地选自SV40晚期polyA序列、兔β-珠蛋白polyA序列、牛生长激素polyA序列，更优选SV40 polyA序列。在一个优选的实施方案中，包含编码OX40L的异源多核苷酸的表达盒、包含编码IL-12的异源多核苷酸的表达盒、和包含编码PD-1阻断剂的异源多核苷酸的表达盒，分别具有与编码多核苷酸功能性连接的CMV启动子，且更优选地以及功能性连接的SV40 polyA序列。
为了有利于重组溶瘤病毒在肿瘤细胞中选择性复制的能力，和/或增加感染溶瘤病毒的肿瘤细胞的抗原呈递，除了插入OX40L、IL-12和/或PD-1阻断剂之外，本发明的重组溶瘤病毒在基因组中还可以包含其他修饰。在一个实施方案中，本发明的重组HSV-1溶瘤病毒的基因组中的(单拷贝或双拷贝)ICP34.5和ICP47被敲除，优选地，所述病毒为ICP47和ICP34.5双拷贝缺失的HSV-1病毒。
在一些实施方案中，本发明的因子OX40L、IL-12和/或PD-1阻断剂优选通过两因子重组溶瘤病毒来提供。因此，本发明在一个方面也提供了一种两因子重组溶瘤病毒，其中所述重组溶瘤病毒为HSV-1，且在基因组中包含(且优选地仅包含)选自以下的两种外源武装基因：
(a)编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸，优选地，所述OX40L编码核酸以双拷贝插入病毒基因组的两个ICP34.5位点且PD-1阻断剂编码核酸插入病毒基因组的UL26UL27基因间区；
(b)编码IL12的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸，优选地，所述IL12编码核酸以双拷贝插入病毒基因组的两个ICP34.5位点且PD-1阻断剂编码核酸插入病毒基因组的UL26UL27基因间区；和
(c)编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL12的多核苷酸，优选地，所述OX40L编码核酸以双拷贝插入病毒基因组的两个ICP34.5位点且IL12编码核酸插入病毒基因组的UL26UL27基因间区。
在一些实施方案中，本发明也提供了包含本发明至少一种重组溶瘤病毒的重组溶瘤病毒组合物。在本文中，当本发明的重组溶瘤病毒组合物包含两种或两种以上的重组溶瘤病毒时，“重组溶瘤病毒组合物”与“重组溶瘤病毒组合”可以互换使用，用于指包含所述的至少一种重组溶瘤病毒的组合物或组合产品。在本发明的重组溶瘤病毒组合物中，所述至少一种重组溶瘤病毒可以配制在同一制剂中。或者，当重组溶瘤病毒组合物包含两种或两种以上的重组溶瘤病毒时，所述至少一种重组溶瘤病毒中的每一种重组溶瘤病毒或其任何两种或多种的组合，可以分别配制在相同的制剂中或不同的制剂中。
在所述组合物的一个实施方案中，本发明的重组溶瘤病毒为ICP47和ICP34.5双拷贝敲除的HSV-1病毒。在再一实施方案中，所述重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂之任一、之任意两者、或所有三者的异源多核苷酸。在一个优选的实施方案中，编码OX40L的异源多核苷酸插在病毒基因组的两个ICP34.5位点之一或优选地两者中，其中所述插入导致插入位点处的ICP34.5 基因的敲除。在又一优选的实施方案中，编码IL-12的异源多核苷酸插在病毒基因组的两个ICP34.5位点之一或优选地两者中，并导致插入位点处的ICP34.5基因的敲除。在再一优选实施方案中，编码PD-1阻断剂的异源多核苷酸插在病毒基因组的UL26和UL27之间的基因间区。优选地，编码OX40L、IL-12和PD1阻断剂的异源核酸与CMV启动子功能性连接。再优选地，编码OX40L、IL-12和PD1阻断剂的异源多核苷酸还与转录终止子，例如SV40 polyA序列，功能性连接。
在一个实施方案中，重组溶瘤病毒组合物包含仅一种重组溶瘤病毒，所述重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40L和IL-12两者的异源多核苷酸。在一个实施方案中，异源多核苷酸的插入位点选自：ICP34.5，UL3和UL4之间或UL26和UL27之间。在一个优选实施方案中，三聚化OX40L编码核酸插在两个ICP34.5位点之一或优选地两者中；IL-12编码核酸优选地插在UL26和UL27之间。
在一个实施方案中，重组溶瘤病毒组合物包含第一和第二溶瘤病毒。在一个实施方案中，所述第一和第二溶瘤病毒为ICP47和ICP34.5双拷贝敲除的HSV-1病毒。在又一实施方案中，第一病毒包含插在病毒基因组的双拷贝ICP34.5位点之一或优选地两者中的OX40L编码多核苷酸；且第二病毒包含插在病毒基因组的双拷贝ICP34.5位点之一或优选地两者中的IL12编码多核苷酸。在再一实施方案中，第一病毒和第二病毒各自还包含编码PD1阻断剂的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸酸插在重组溶瘤病毒基因组的U26和U27之间的基因间区。优选地，编码OX40L、IL-12和PD1阻断剂的异源多核苷酸与CMV启动子功能性连接。再优选地，编码OX40L、IL-12和PD1阻断剂的异源多核苷酸还与转录终止子，例如SV40 polyA序列，功能性连接。
可以根据本发明应用的OX40L编码核酸可以是任何通过病毒感染而能够在肿瘤细胞表面表达功能性三聚体OX40L多肽的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述OX40编码核酸编码包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的蛋白、或与其具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列的变体，尤其是保守性氨基酸替代变体。在再一些实施方案中，OX40L编码核酸包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
可以根据本发明应用的IL-12编码核酸可以是任何通过病毒感染而能够自肿瘤细胞分泌表达功能性IL-12蛋白的多核苷酸。在一个优选的实施方案中，IL-12编码核酸编码包含或由IL-12α多肽和IL-12β多肽组成的异源二聚体蛋白，其中所述IL-12α多肽IL-12α多肽包含SEQ ID NO:17氨基酸序列或由其组成；或包含与所述氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列，或由其组成；且所述IL-12β多肽包含SEQ ID NO:16氨基酸序列或由其组成；或包含与所述氨基酸序列具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列，或由其组成。更优选地，所述IL-12由IL-12α多肽和IL-12β多肽组成，其中IL-12α多肽包含SEQ ID NO:17氨基酸序列或由其组成；且IL-12β多肽包含SEQ ID NO:18氨基酸序列或由其组成。在再一些优选实施方案中，IL-12编码核酸包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的核苷酸序列。
可以根据本发明应用的PD-1阻断剂编码核酸可以是任何通过病毒感染而能够自肿瘤细胞分泌表达功能性PD-1阻断剂多肽的多核苷酸。本领域已知的多种PD-1阻断剂之任一种均可以在本发明中使用。优选地，PD-1阻断剂是抗PD-1抗体，更优选的抗PD-1 scFv抗体。在一些优选实施方案中，所述抗PD-1 scFv抗体包含VH和VL，其中所述VH包含SEQ ID NO:22的HCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:23的HCDR2氨基酸序列、以及SEQ ID NO:24的HCDR3氨基酸序列；且所述VL包含SEQ ID NO:25的LCDR1氨基酸序列、SEQ ID NO:26的LCDR2氨基酸序列、以及SEQ ID NO:27的LCDR3氨基酸序列。优选地，所述抗PD-1scFv抗体包含SEQ ID NO：20的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:21的VL氨基酸序列。更优选地，所述scFv抗体包含或由SEQ ID No:19的氨基酸序列组成。
在本发明的重组溶瘤病毒组合物中，优选地，其包含的所述至少一种重组溶瘤病毒，在每种重组溶瘤病毒上，包含1-4种外源武装基因，优选地不超过3种，更优选地不超过2种外源武装基因。更优选地，所述的至少一种重组溶瘤病毒包含总共不超过10种，优选地2,3,4,5或6种，更优选地4种或3种或2种的外源武装基因。因此，在一些实施方案中，提供三聚化OX40L和IL-12的本发明两因子重组溶瘤病毒组合物，或提供三聚化OX40L和IL-12和PD-1阻断剂的本发明三因子重组溶瘤病毒组合物，还 可以提供一种或多种非本发明因子(即，除三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断剂)的外源武装基因；但优选地，所述组合物不再提供其它外源武装基因。
再一方面，本发明也提供药物组合物或药物制剂，其包含至少一种本发明的重组溶瘤病毒，例如包含一种、两种或三种重组溶瘤病毒，以在感染肿瘤细胞后表达三聚化OX40L、IL-12和任选地PD-1阻断剂。除了重组溶瘤病毒外，药物组合或药物组合物也可以包含其他治疗活性剂，尤其是本发明的过继TIL细胞，和/或可药用载体。适宜的可药用载体的例子包括但不限于，缓冲液、赋形剂、助剂、添加剂、防腐剂、填充剂、稳定剂。适宜的其它治疗活性剂还可以包括，但不限于，免疫调节剂、抗癌药物、放疗药物、化疗药物等。
施用
本发明的重组溶瘤病毒组合物或包含本发明重组溶瘤病毒的药物组合物或药物制剂可以向任何受试者施用，优选地，所述受试者是人癌症患者。
任何适宜将本发明的重组溶瘤病毒或其组合物，和/或本发明的过继TIL细胞或过继细胞治疗组合物，引入或递送给受试者，以发挥其预期功能的施用方式和施用途径，均涵盖在本发明的范围中。施用可以包括，但不限于，通过任何以下一种或多种途径进行，口服、鼻内、肠胃外(静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内或皮下)、直肠、鞘内、肿瘤内、或局部给药。
例如，可以采用溶瘤HSV-1病毒的常规施用方法，向受试者施用本发明的重组溶瘤病毒或组合物；也可以采用过继细胞治疗中常规的TIL施用方法，向受试者施用本发明的过继TIL细胞或包含其的过继细胞治疗组合物。施用途径将取决于待施用的活性成分、药物组合物的剂型或形式、癌症类型、肿瘤位置、患者情况、共病及其它因素。
在本发明的一个实施方案中，组合施用过继T细胞治疗组合物和重组溶瘤病毒组合物。所述施用可以是并行、同时、或相继以任何顺序，施用本发明的过继T细胞和本发明的一种或多种重组溶瘤病毒。优选地，过继T细胞与重组溶瘤病毒(一种或多种)分开在不同的产品或组合物中。施用可以为一次。也可以是多次施用，每次施用之间可以相隔任何时间，例如，取决于患者和癌症类型等，相隔1分钟至4周，例如1-10天，或可以为连续多天施用。
过继T细胞组合物的施用次数和重组溶瘤病毒组合物的施用次数可以相同或不同。优选地，重组溶瘤病毒组合物在过继T细胞组合物施用前一段时间施用，以允许在TIL转移前肿瘤细胞感染重组溶瘤病毒并表达三聚化OX40L和IL12两者或优选地表达三聚化OX40L、IL-12和PD-1阻断三者。
溶瘤病毒的施用可以通过瘤内、动脉内、静脉内、腹膜内、胸膜内、腔内给药，或口服给药。也可以是任何施用方式的组合。优选地，溶瘤病毒瘤内施用。过继T细胞治疗组合物可以静脉内、腹膜内或瘤内施用。在一个实施方案中，过继TIL细胞通过静脉内给药，且重组溶瘤病毒通过瘤内和/或静脉内给药。在另一实施方案中，过继TIL细胞和重组溶瘤病毒两者都通过瘤内施用。
方法和用途
本发明涉及应用本发明的重组溶瘤病毒组合物，任选地组合本发明的过继细胞治疗组合物，在受试者中治疗癌症、改善肿瘤细胞的抗原递呈、和/或改善过继TIL细胞治疗功效的方法。在本文中，受试者包括但不限于人或哺乳动物，尤其是人类患者。
本发明方法可以用于任何癌症或肿瘤受试者，尤其是实体肿瘤，例如恶性实体肿瘤、原发性实体肿瘤、和转移性实体肿瘤。在一个实施方案中，癌症的瘤组织中包含肿瘤浸润淋巴细胞。在另一些实施方案中，癌症的瘤组织具有低的肿瘤淋巴细胞浸润程度。
可用本发明方法治疗的实体瘤例子包括，但不限于：头颈癌，例如口腔癌；鳞状上皮细胞癌；直肠腺癌、胶质瘤、黑素瘤、胰腺癌、子宫/卵巢癌症、宫颈癌、前列腺癌、肺癌，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳癌、膀胱癌、肾细胞癌、和肝细胞癌、食道癌、眼癌、胃肠道癌症，及其转移灶。
在一些实施方案中，用于治疗的实体瘤选自头颈癌、喉癌、咽下癌、口腔癌(例如，唇癌、牙龈癌、 颊癌、舌癌)。优选地，所述实体瘤是鳞状上皮细胞癌。在一些实施方案中，用于治疗的实体瘤选择结直肠癌以及转移灶。在一些情况下，所述实体瘤具有低的肿瘤浸润程度。
不受任何理论的束缚，本发明的重组溶瘤病毒组合物可以：通过瘤内注射将肿瘤细胞转化为抗原呈递细胞，诱导和/或增强肿瘤细胞的抗原呈递；并任选地可以实现以下之一或多项：i)引导/募集肿瘤特异性T细胞到肿瘤部位；ii)通过增加危险信号，减少肿瘤耐受；iii)通过改善肿瘤组织的免疫抑制性环境，诱导肿瘤组织中TIL细胞增殖。由此，本发明的重组溶瘤病毒组合物有利于促进肿瘤浸润淋巴细胞(包括体内已有的TIL细胞以及在过继细胞治疗时过继转移到受试者体内的TIL细胞)向肿瘤部位的募集、以及在肿瘤组织中的维持、扩增、和/或激活，以及抗肿瘤功效。
因此，在一个方面中，本发明提供了一种用于治疗癌症患者的方法，或用于改善肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)过继治疗癌症患者的方法，所述方法包括向受试者组合施用：
(a)重组溶瘤病毒组合物，所述组合物包含至少一种重组溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒感染患者的肿瘤细胞并表达外源三聚化OX40L和IL12或优选地表达外源三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂，
优选地，所述方法还包括施用
(b)过继细胞治疗组合物，所述组合物包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中所述TIL细胞与肿瘤细胞来自相同的肿瘤受试者，
其中，所述至少一种重组溶瘤病毒是单纯疱疹病毒HSV-1。
在再一方面中，本发明提供了一种用于在受试者中将肿瘤细胞转化为抗原递呈细胞(APC)的方法，所述方法包括施用：
(a)本发明的重组溶瘤病毒组合物，所述组合物包含至少一种重组溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒感染患者的肿瘤细胞并表达外源三聚化OX40L和IL12或优选地表达三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂，
优选地，所述方法还包括施用
(b)本发明的过继细胞治疗组合物，所述组合物包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中所述TIL细胞与肿瘤细胞来自相同的肿瘤受试者，
其中，所述至少一种重组溶瘤病毒是单纯疱疹病毒HSV-1。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗癌症患者的方法、或用于改善过继细胞治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用
a)重组溶瘤病毒组合物，或者
b)重组溶瘤病毒组合物与PD-1阻断剂，或者
c)(a)或(b)与过继细胞治疗组合物，
其中，所述重组溶瘤病毒组合物包含至少一种(例如一种或两种或三种，优选地两种)重组溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒感染受试者的肿瘤细胞并表达外源三聚化OX40L和IL12和任选地PD-1阻断剂，
其中，所述过继细胞治疗组合物包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中优选地所述TIL细胞与肿瘤细胞来自相同的肿瘤受试者。
在一些优选的实施方案中，所述方法包括单独施用本发明两因子重组溶瘤病毒组合物。
在再一优选实施方案中，所述方法包括单独施用本发明的三因子重组溶瘤病毒组合物。
在另一些优选实施方案中，所述方法包括组合施用本发明两因子重组溶瘤病毒组合物与
(i)PD-1阻断剂；或
(ii)过继细胞治疗组合物；或
(iii)(i)和(ii)。
在再一优选实施方案中，所述方法包括组合施用本发明的三因子重组溶瘤病毒组合物与过继细胞治疗组合物。
在根据这些实施方案的方法中，优选地，本发明的两因子重组溶瘤病毒组合物包含在基因组中同时具有三聚化OX40L编码核酸和IL-12编码核酸的一种重组溶瘤病毒，或由其组成；或包含分别在基因组中具有三聚化OX40L编码核酸的第一重组溶瘤病毒和在基因组中具有IL-12核酸的第二重组溶瘤病毒，或由其组成。
在根据这些实施方案的方法中，优选地，本发明三因子重组溶瘤病毒组合物包含在基因组中具有三聚化OX40L编码核酸和PD-1阻断剂编码核酸的第一重组溶瘤病毒和在基因组中具有IL-12编码核酸和PD-1阻断剂的第二重组溶瘤病毒，或由其组成。
在上述任何方法的一些优选实施方案中，所述病毒为HSV-1，且病毒基因组中ICP34.5和ICP47被敲除，优选地，所述病毒为ICP47和ICP34.5双拷贝缺失的HSV-1病毒。
在上述方法的一个实施方案中，所述施用至少一种重组溶瘤病毒包括：施用在基因组中同时包含编码三聚化OX40L和IL12的多核苷酸的一种重组溶瘤病毒。优选的，在所述溶瘤病毒的基因组中，编码三聚化OX40L的核酸插在两个ICP34.5位点，编码IL12的IL12A和IL12B核酸通过IRES2序列链接插在UL26和UL27之间。
在上述任何方法的一个实施方案中，所述施用至少一种重组溶瘤病毒包括：施用第一重组溶瘤病毒和第二重组溶瘤病毒，其中：第一重组溶瘤病毒在基因组中编码三聚化OX40L和PD1阻断剂；第二重组溶瘤病毒在基因组中编码IL12和PD1阻断剂。优选地，第一病毒包含插在病毒基因组的双拷贝ICP34.5位点之一或优选地两者中的OX40L编码核酸；第二病毒包含插在病毒基因组的双拷贝ICP34.5位点之一或优选地两者中的IL12编码核酸。更优选地，所述第一病毒和第二病毒各自还包含编码PD1阻断剂的核酸，优选地，所述PD-1阻断剂编码核酸插入重组溶瘤病毒基因组的UL26和UL27之间的基因间区，优选地PD1阻断剂为抗PD1单链scFv抗体。
在上述任何方法中，优选地，所述受试者是人癌症患者。
在上述任何方法的一个实施方案中，向受试者瘤内相继施用包含本发明TIL细胞的过继细胞治疗组合物和包含本发明的至少一种重组溶瘤病毒的重组溶瘤病毒组合物，例如两因子重组溶瘤病毒组合物或三因子重组溶瘤病毒组合物。在再一实施方案中，重组溶瘤病毒组合物和过继细胞治疗组合物同时或相继以任何顺序施用，优选地，溶瘤病毒组合物在过继细胞治疗组合物施用之前施用，更优选地，溶瘤病毒组合物施用与过继细胞治疗组合物施用之间间隔10小时至72小时，例如，24小时-48小时，例如大约36小时或48小时。在施用两因子重组溶瘤病毒组合物的实施方案中，优选地，也组合施用单独的PD-1阻断剂，例如，在溶瘤病毒组合物和过继细胞治疗组合物之前、同时或之后开始PD-1阻断剂的施用。PD-1阻断剂可以在治疗过程中施用一剂或多剂，优选多剂，例如，根据疾病病情，间隔施用并持续一定时间，例如，数天、数周、数月，或更长时间。
在上述任何方法的一个实施方案中，向受试者瘤内施用本发明的重组溶瘤病毒组合物，其中所述组合物包含第一和第二溶瘤病毒。优选地，向受试者瘤内施用表达OX40L和PD1阻断剂的第一溶瘤病毒和表达IL2和PD1阻断剂的第二溶瘤病毒，优选地，所述第一溶瘤病毒和第二溶瘤病毒的施用比例为1：1至3:1，例如大约1.5:1,大约2:1,大约2.5:1，其中所述第一和第二溶瘤病毒例如配制在分开的或相同的药物组合物中。
在上述任何方法的一个实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用IL-2蛋白，例如super-IL-2蛋白，优选地腹腔注射施用，优选地，在溶瘤病毒和/或TIL施用后施用所述IL-2蛋白。关于super-IL-2，参见例如，Aron M Levin等，Exploiting a natural conformational switch to engineer an interleukin-2'superkine'，Nature,2012 Mar 25；484(7395):529-33.doi:10.1038/nature10975。
在上述任何方法的一个实施方案中，本发明方法导致以下一项或多项：
-增加肿瘤细胞表面的抗原递呈分子表达，优选地，所述抗原递呈分子选自以下之一或多种：HLA-A/B/C,HLA-DR/DP/DQ,CD80,CD83和CD86；更优选地选自以下之一或多种或所有：HLA-A,HLA-C,HLA-DRB1,CD80,CD83和CD86；更优选地，CD86；
和/或
-增强受试者肿瘤组织中TIL的激活和/或扩增，和/或
-上调受试者肿瘤组织中的IFN-gamma含量；
-抑制肿瘤细胞生长或减小肿瘤体积；
-改善受试者的生存期。
本发明的重组溶瘤病毒组合物(任选地与PD-1阻断剂组合)与过继TIL治疗组合物的组合具有增强癌症治疗效果和降低副作用的优势。采用本发明的方法可以减少用于TIL过继治疗的T细胞数量，缩短TIL的体外扩增时间以符合患者的最适用药窗口；和/或减少用于在TIL过继转移后维持、扩增和/或激活体内TIL细胞的IL-2量，由此避免在现有技术中由于高剂量IL2引起的患者副反应，例如毒性或对健康组织的损伤。
因此，在上述任何方法的一个实施方案中，相对于TIL单独施用，所述方法包括施用降低剂量的TIL，优选地所述方法还包括施用降低剂量的IL-2以用于维持过继TIL的体内扩增和激活。
在再一方面，本发明也提供在癌症受试者中应用本发明的重组溶瘤病毒及其组合物的用途或方法，优选地，其中所述重组溶瘤病毒及其组合物与本发明的过继细胞治疗组合物联合向所述受试者施用。在所述用途或方法的一些实施方案中，也组合施用PD-1阻断剂，尤其是当所述重组溶瘤病毒组合物为两因子重组溶瘤病毒组合物时。
在一些实施方案中，本发明也提供了一种用于将肿瘤细胞转化为抗原递呈细胞(APC)或用于增强肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)活化的方法，其中所述方法包括：用根据本发明的溶瘤病毒组合物感染肿瘤细胞，和使感染了所述溶瘤病毒的所述肿瘤细胞接触肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中所述TIL与所述肿瘤细胞来自相同癌症受试者。
在一些实施方案中，所述方法为体外方法，其中所述感染和接触在体外进行，优选地，第一和第二溶瘤病毒以感染复数MOI至少0.01感染肿瘤细胞；再优选地，所述TIL与所述感染了溶瘤病毒的肿瘤细胞以至少1:1，例如，1:2,1:5的比例共培养。
优选地，在一些实施方案中，所述感染和接触在体内发生。在这些实施方案中，优选地，所述方法还包括步骤：在用所述溶瘤病毒感染包含所述肿瘤细胞的受试者之前或之后，自所述受试者的肿瘤组织中分离肿瘤浸润淋巴细胞，和将分离的TIL回输给受试者的步骤。
在一些优选实施方案中，所述方法包括：在施用所述溶瘤病毒之前自受试者分离TIL，将分离的TIL联合所述溶瘤病毒施用于受试者。
在再一优选实施方案中，所述方法包括：自施用了所述溶瘤病毒的受试者的肿瘤组织，分离肿瘤浸润淋巴细胞，并将所述分离的TIL细胞回输施用于所述肿瘤受试者。
在再一些实施方案中，所述方法包括：将所述溶瘤病毒组合物联合分离自受试者的TIL施用于受试者，优选地瘤内施用。
优选地，根据本发明的方法增强肿瘤细胞在其细胞表面的抗原呈递分子表达，和/或增加肿瘤细胞向TIL递呈其自身肿瘤抗原的能力。在一些实施方案中，通过本发明的方法，所述感染溶瘤病毒的肿瘤细胞刺激与之接触的肿瘤浸润淋巴细胞并引起所述TIL扩增。更优选地，所述方法提高所述TIL细胞的激活比例，提高激活的TIL的肿瘤杀伤能力，和/或增强TIL细胞的扩增。再优选地，所述TIL在接触感染溶瘤病毒的肿瘤细胞后表达增加的IFN-gamma。
在一些实施方案中，本发明也提供根据本发明的重组溶瘤病毒或其组合物，任选地连同包含肿瘤淋巴浸润细胞的过继细胞治疗组合物和PD-1阻断剂之一或两者，在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的用途或在制备用于改善肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)过继治疗肿瘤患者的药物中的用途，或在制备用于上述本发明任何方法的药物、药物组合物、药盒或药物联合产品中的用途。
联合产品
在再一方面，本发明提供一种联合产品，其包含：
(a)根据本发明的重组溶瘤病毒组合物；和
(b)根据本发明的包含肿瘤淋巴浸润细胞的过继细胞治疗组合物和PD-1阻断剂之一或两者。
联合产品中还可以包含有利于实施上述本发明的任何方法的试剂、组合物、和/或物质。例如，还可以包括用于自肿瘤组织分离TIL的试剂、在体外扩增TIL的培养基和试剂、和/或于TIL回输的装置；或还可以包括用于重组溶瘤病毒组合物的制备、存储和/或施用相关的物质和/或装置。
在一个优选的实施方案中，本发明提供联合产品，其包含：本发明的两因子重组溶瘤病毒或本发明的重组溶瘤病毒组合物(优选两因子或三因子重组溶瘤病毒组合物)与
(a)PD-1阻断剂；或
(b)过继细胞治疗组合物，或
(c)(a)和(b)的组合。
优选地，所述药物组合或联合产品包含PD-1阻断剂时，所述重组溶瘤病毒组合物为两因子重组溶瘤病毒组合物。
在根据本发明的上述任一实施方案中，如本领域技术人员理解，所述过继TIL细胞可以替代为包含选自T细胞受体修饰的淋巴细胞和嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的过继细胞治疗组合物。
在根据本发明的上述任一实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物，尤其是人。
在根据本发明的上述任一实施方案中，所述治疗还包括施用其他的治疗剂和/或疗法，例如，细胞因子，例如选自干扰素、TNFa,IL15、IL2，或其他抗癌药物；放疗；化疗；单克隆抗体。
材料和方法
1.1实施例中所用的试剂和培养基
1.2实施例中所用培养基和溶液
CCM培养基：
50ml CCM培养基配制如下：RPMI1640：42.5ml；青链霉素溶液：500μL；丙酮酸钠(100mM)：500μL；MEM-NEAA非必需氨基酸溶液(100X)：500μL；β-巯基乙醇(55mM)：13μL；L-谷氨酰胺(200mM)：500μL；Gibco胎牛血清：5ml；HEPES：500μL；庆大霉素：10μL；两性霉素：50μL。
REP Media I培养基：
20ml REP Media I培养基配制：CCM：20ml；rIL-2(10μg/ml)：10μL；rIL-7(10μg/ml)：20μL；rIL-15(10μg/ml)：20μL；OKT3(500μg/ml)：2μL。
REP Media II培养基：
REP Media I和AIM V培养基以1：1等体积混合组成REP Media II培养基。
199V培养基：
在Medium 199培养基中加入1％的胎牛血清(BI)配制199V培养基。
标准等渗Percoll溶液(SIP)：
将Percoll与酸性PBS以19：1的比例混合新鲜制备SIP。用以下试剂制备20×酸性PBS(pH 4.6，1.051g/ml)：①6.75g氯化钠；②0.0625g二水磷酸氢二钠；③1.05g磷酸二氢钾；④50mL蒸馏水。配制10ml SIP需要500μL酸性PBS和9.5ml Percoll。通过用CCM稀释SIP，制备60％，45％和34％的SIP溶液用于分离步骤。
1.3实施例中使用的仪器和设备
1.4实施例中使用的核酸和氨基酸序列在序列表中提供
实施例1：肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的分离、扩增与鉴定
实施例1.1：TIL的分离与扩增
将自4例口腔癌患者获得的口腔癌原代组织(第一例(OC1)：牙龈癌，第二例(OC2)：颊癌，第三例(OC3)：舌癌，第四例(OC4)：牙龈癌，四例均属于鳞状上皮细胞癌)收集到培养皿中，用手术刀切成碎末<0.5mm。将组织碎块转移至15mL离心管中，并加入4mL消化缓冲液覆盖组织块，于37℃振荡孵育30分钟。消化缓冲液含有：①溶于Hank's平衡盐溶液(HBSS)中的2mg/ml IV型胶原酶；②溶于含有0.02M磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)、0.77M NaCl和0.1％人血清白蛋白的溶液中的10mg/ml II型透明质酸酶；③溶于0.15M NaCl溶液中的5mg/ml IV型DNase I；和④2.4ml CCM培养基。
将消化后的肿瘤块置于70μm滤网中捣碎，PBS连续洗涤至终体积为20mL。400g室温离心3-5分钟，弃去上清液并将细胞重悬于1mL ACK红细胞裂解缓冲液中。再添加3mL ACK裂解缓冲液并颠倒试管进 行混合，在室温下孵育4分钟。加入30mL PBS，在室温下以400g离心3分钟；重悬于20mL PBS中并通过70μm滤网。
将细胞均匀铺在24孔板中，每孔25万/500μL。过夜后小心收集上清，在室温下以400g离心5分钟，将细胞重悬于3mL 60％SIP中并转移至15mL离心管中。在60％SIP层的上层缓慢加入3mL 45％SIP；在45％SIP层的顶部缓慢添加3mL 34％SIP。在室温下，将试管以2400g的速度离心30分钟。将底部界面(60％与45％之间的界面)(2-3mL)收集到15mL离心管中，并加入适量PBS。在室温下以600g离心10分钟；在含有低浓度(100IU/ml)IL-2且含有IL-7和IL-15的500μL REP Media I中重悬细胞沉淀；在37℃和5％CO2下孵育并传代以保持1×10
6细胞/ml的密度。在传代后第5天，用REP Media II培养基替换70％的REP Media I培养基。在24孔板中培养10-22天，直到细胞数达到5*10
7左右时进行快速扩增。
快速扩增以及回输步骤：第1天，将由上述分离和培养步骤获得的4*10
5个TIL细胞重悬在50mL REP Media I培养基中，将细胞悬液置于垂直放置的T75培养瓶中。第5天，将65％的培养基替换为含3000IU/mL IL-2的REP Media II培养基。从第5天开始，每隔一天测定总活细胞数。当细胞扩增至1.4*10
7时，将TIL细胞重悬在100μL 0.9％生理盐水中，并在30分钟内原位(瘤内)注射给动物模型。
实施例1.2TIL细胞的抑瘤性质表征利用肿瘤细胞杀伤实验和ELISA证明激活的OC1-TIL具有特异性杀伤肿瘤的能力
肿瘤细胞杀伤实验
多项研究表明，含有地西他滨(一种DNA甲基化抑制剂)、TNFα和IFN-γ的DEC混合液可以恢复肿瘤细胞表面多种抗原的表达。为了证明TIL能够靶向杀伤自体口腔癌细胞，采用经DEC混合液处理的原代口腔癌细胞(OC1-TC)与自体TIL(OC1-TIL)共培养，检测OC1-TIL对原代口腔癌细胞的杀伤效果。
简言之，在96孔板中，每孔铺5000个口腔癌原代细胞(OC1-TC)，24h后将上清替换成DEC混合液(10μM DEC，100U/mL IFNγ和10ng/mL TNF-α)培养基，继续培养48h。48h后将上清吸弃，按照不同E:T比例(仅OC1-TC，TIL与OC1-TC比例1:1,5:1或10:1)加入TIL，用100μl REP media I重悬，共培养24h后收集上清。96孔板用PBS小心洗涤3次，利用显微镜观察并拍照。
如图1A所示，与OC1-TIL共培养导致原代口腔癌细胞数量显著减少，且减少比例与E:T比例成正比。
IFN-gamma ELISA检测
以往的研究表明，TIL的活化程度与IFN-γ的释放成正比。为了进一步证明经DEC混合液处理的OC1-TC可以激活TIL，按上述方式在96孔板中培养OC1-TC细胞48小时，然后以各种E:T比例加入TIL再培养24小时，采用ELISA检测各组(仅OC1-TC、仅TIL、TIL和OC1-TC的1:1,5:1或10:1共培养物)上清液中IFN-γ的含量，并对OC1-TC存活细胞进行计数。
使用Human IFN-gamma Valukine ELISA Kit(1KT)(R&D Systems，VAL104)，按照厂商说明书，实施上清液中IFN-γ的含量测定。取出微孔板，分别将不同浓度标准品或实验样本加入相应孔中，每孔100μl。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时。每孔加400μl洗涤液洗板，重复操作4次。在每个微孔内加入200μl酶标检测抗体，室温孵育2小时；洗板后在每个微孔内加入200μl显色底物，室温避光孵育30分钟；在每个微孔内加入50μl终止液1，孔内溶液颜色会从蓝色变为黄色。加入终止液1后30分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，设定540nm或570nm作为校正波长。
实验结果(图1B)显示，经DEC混合液处理的OC1-TC可以激活TIL，且激活程度与E:T比例相关，当E:T比值达到10时，80％以上的OC1-TC被清除，OC1-TILs释放出约600pg/ml的IFN-γ。
上述结果充分证明当TIL与OC1-TC的比值达到在一定程度上，激活的TIL能够特异性识别并杀伤自体肿瘤，具有肿瘤特异性。
实施例2：溶瘤病毒的改造和溶瘤性质表征
实施例2.1改造溶瘤病毒
Wild type OV(HSV-1)分离自口腔疱疹感染患者。本研究中所构建的病毒如下：通过将HSV-1基因组中的ICP34.5基因替换成GFP表达盒，并删除基因组中的ICP47基因得到OV-GFP。在OV-GFP基础上，将GFP表达盒分别用细胞膜展示的三聚化OX40L(OX40L胞外域与TRAF2三聚化结构域融合，并通过柔性连接序列与跨膜区结构域融合表达；SEQ ID NOs:3和18)和IL12基因(SEQ ID NOs:1-2和16-17)替换，命名为OV-OX40L和OV-IL12。在OV-OX40L和OV-IL12的基础上，于UL26UL27基因间插入PD-1scFv基因(SEQ ID NOs:4-5和19)，得到OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1。在OV-OX40L的基础上，于UL26UL27基因间插入PD-1scFv基因，于UL3和UL4基因间插入IL12序列，得到OV-OX40L/IL12/αPD-1；在OV-OX40L的基础上，于UL26UL27基因间插入IL12a-IRES2-IL12b-T2A-PD-1scFv基因,得到OV-OX40L/IL12/αPD-1。溶瘤病毒改造示意图如图2所示。删除HSV-1的ICP34.5能够提高肿瘤选择性复制能力，删除ICP47能够增加抗原呈递并改善溶瘤特性。
OV-GFP病毒构建
为了构建pICP34.5-HA2L-HA2R质粒，分别通过PCR从HSV-1DNA扩增了位于ICP34.5编码区两侧的同源臂HomologyArm2L(HA2L)和HomologyArm2R(HA2R)(序列见附表)。HA2L和HA2R依次克隆到CMV-GFP-SV40polyA的两侧作为供体DNA。将供体DNA转染293FT细胞24h，用HSV-1感染细胞48h后挑取三轮病毒蚀斑得到OV-GFP前体病毒。
然后利用相同的方法构建pICP47-HA3L-HA3R质粒，其中将ICP47编码区两侧的同源臂HA3L和HA3R(序列见附表)克隆到CMV-RFP-SV40polyA的两侧作为供体DNA。将该供体DNA转染293FT细胞24h，再用OV-GFP前体病毒感染细胞48h后挑取三轮病毒蚀斑得到OV-GFP。
构建UL26-UL27基因间区域插入GFP表达盒的OV-OX40L/GFP病毒
为了在病毒的UL26-UL27基因间区域插入PD-1scFv基因，通过病毒基因组与供体质粒的同源重组，将GFP表达盒CMV-GFP-SV40polyA重组进入OV-OX40L的UL26-UL27基因间区域。用于此过程的供体质粒包括1471bp的左侧同源臂、GFP表达盒和1339bp的右侧同源臂(左侧和右侧同源臂HA1L和HA1R的具体序列信息见附表)。
构建UL3-UL4基因间区域插入GFP表达盒的OV-OX40L/αPD-1/GFP病毒
为了在病毒的UL3-UL4基因间区域插入IL12基因，通过病毒基因组与供体质粒的同源重组，将GFP表达盒CMV-GFP-SV40polyA重组进入OV-OX40L/αPD-1的UL3-UL4基因间区域。用于此过程的供体质粒包括1113bp的左侧同源臂、GFP表达盒和1031bp的右侧同源臂(左侧和右侧同源臂HA4L和HA4R的具体序列信息见附表)
目的片段质粒的构建
于北京义翘神州生物技术有限公司订购目的基因片段(IL-12 p35/IL12A cDNA ORF Clone in Cloning Vector,Human：HG10021-M和IL12B cDNA ORF Clone in Cloning Vector,Human：HG10052-M；OX40L：HG13127)，于Drugbank数据库得到PD-1 scFv序列，利用PCR在其两端添加合适的酶切位点，将含有目的基因片段的质粒与含有同源重组臂(CMV promoter和SV40 polyA signal作为同源臂)的pCMV-eGFP质粒(优宝生物)进行双酶切，连接转化涂板，挑取单克隆进行测序验证，验证正确即得到插入了目的片段的质粒，pCMV-OX40L，pCMV-IL12和pCMV-PD-1_scFv。
武装溶瘤病毒生产
将6×10
5个293FT-A5细胞接种至六孔板，培养12-18h，至汇合度约70％-80％。通过PEI转染试剂(10μL)转染4μg pCMV-OX40L或pCMV-IL12质粒，37℃转染6h后，更换新鲜培养基，转染24h后，接种1×10
5PFU的OV-GFP，2h后更换为不含病毒的199V培养基。继续培养48h后，将孔中的细胞 和培养基吸出，放入无菌离心管，4℃，3000rpm离心10min后，弃上清。向沉淀中加入100μL的9％无菌脱脂牛奶，并于-80℃和室温之间反复冻融3次后，分装到500μL管中。通过在Vero细胞中进行梯度浓度筛选，挑取病毒蚀斑后进行第二轮筛选。三次筛选后利用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，利用PCR检测CMV启动子-OX40L或IL12-SV40 polyA signal的表达盒(expression cassette)是否插入病毒基因组中。得到溶瘤病毒OV-OX40L和OV-IL12。
按照上述相同的转染-感染方法，随后在OV-OX40L和OV-IL12的UL26UL27位点，使用质粒pCMV-PD-1_scFv，通过同源重组插入含CMV启动子-PD-1 scFv基因-SV40 polyA signal的表达盒，得到溶瘤病毒OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1。在OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1中，由于OX40L或IL12和PD-1 scFv基因插入的位点不同，并且都有独立的表达系统，因此表达不会受到相互的干扰。
在OV-OX40L的基础上，在UL26和UL27之间插入含CMV启动子-hIL-12-polyA signal序列的表达盒，得到双因子武装溶瘤病毒OV-OX40L/IL12。
武装溶瘤病毒鉴定
首先在基因水平验证目的基因插入的准确性：利用试剂盒对OV-OX40L、OV-IL12、OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1的病毒基因组进行提取，然后利用相应的引物对基因组进行扩增，得到结果如图3A所示。
其次在蛋白水平验证病毒感染口腔癌原代细胞后OX40L和IL12的表达量和活性。简言之，
为检测IL12的表达量，在图3B的western blot实验中，利用OV-IL12(MOI＝0.01)感染口腔癌细胞48h，48h后收集培养上清，蛋白变性后进行电泳，显影后利用凝胶成像仪进行扫描和拍照，并与IL-12蛋白阳性对照进行比较。此外，在图3C的ELISA实验中，利用OV-GFP(MOI＝0.01)，OV-IL12(MOI＝0.01)和OV-OX40L/IL12(MOI＝0.01)感染口腔癌细胞48h，48h后收集培养上清，利用Human IL12/IL23p40 Valukine ELISA kit，根据厂商说明书，检测上清中IL12的含量。如图3B和3C所示，利用Western Blot和ELISA证明了感染OV-IL12和OV-OX40L/IL12的口腔癌细胞能够表达IL12。
为检测OX40L的表达量和活性，在图3D的流式染色实验中，利用wild type OV(MOI＝0.01)、OV-OX40L(MOI＝0.01)和OV-OX40L/IL12(MOI＝0.01)感染口腔癌细胞48h，48h后收集各组细胞进行染色。具体的染色步骤与实施例1.2中相同。此外，在图3E的报告细胞系实验中，利用OV-OX40L(MOI＝0.01)和OV-OX40L/IL12(MOI＝0.01)感染口腔癌细胞48h，48h后与Jurkat-OX40-GFP细胞共培养24h，24h后收集孔中悬浮细胞，利用流式检测GFP阳性细胞的比例。如图3D和3E所示，利用流式染色和报告细胞系实验证明了口腔癌细胞表面表达的三聚化OX40L能够与OX40结合并激活OX40。
实施例2.2改造的武装溶瘤病毒的溶瘤性质表征
利用MTT检测不同滴度的武装溶瘤病毒对多例口腔癌原代细胞的杀伤作用
为了评估溶瘤病毒感染口腔癌的能力，我们用OV-GFP以及改造的武装溶瘤病毒以不同的感染复数(MOI)感染口腔癌原代细胞和患者原代口腔癌组织。具体而言：
分别用溶瘤病毒OV-GFP、OV-OX40L、OV-IL12和OV-OX40L/IL12感染口腔癌原代细胞OC1、OC2、OC3和OC4，由此产生如下分组：
OC1/2/3/4+OV-GFP(MOI：0、0.01、0.1、1、10、100)
OC1/2/3/4+OV-OX40L(MOI：0、0.01、0.1、1、10、100)
OC1/2/3/4+OV-IL12(MOI：0、0.01、0.1、1、10、100)
OC1/2/3/4+OV-OV-OX40L/IL12(MOI：0、0.01、0.1、1、10、100)
在原代口腔癌细胞与溶瘤病毒孵育一段时间后，采用MTT检测溶瘤病毒对口腔癌原代细胞的杀伤作用。简言之：在96孔板中，每孔铺5000个口腔癌原代细胞，24h后将上清弃掉。加入100μl配制好的病毒稀释液(病毒梯度稀释于CCM培养基中)，2000rpm离心10分钟后置于培养箱中继续培养2h。2h之后用100μl新鲜的CCM培养基替换各孔上清，继续培养48h。48h后3000rpm离心5分钟，小心吸弃上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，避光培养4h。4小时后3000rpm离心5分钟，然后吸弃上清，每孔加入150μl二甲基亚砜，左右摇晃2分钟后置于 培养箱中孵育30分钟，使结晶物充分溶解。设置调零孔，即空白孔(即，PBS组(MOI＝0))，加入MTT孵育后吸出加入DMSO。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。相对于空白孔的吸光值，确定相对细胞存活率。
如图4A所示，溶瘤病毒可以有效感染和裂解口腔癌细胞，且改造后的溶瘤病毒和亲本溶瘤病毒对口腔癌细胞的杀伤能力没有显著差异。
检测溶瘤病毒对患者原代口腔癌组织的杀伤作用
在以下实验中，使用亲本溶瘤病毒OV-GFP或未加入GFP的相应野生型溶瘤病毒OV，检测溶瘤病毒单独对于原代癌组织的杀伤作用。
荧光显微镜观察：
①准备一个96孔板，在A1-A4孔中加入100μl CCM培养基；
②将第一例口腔癌(OC1)原代组织置于无菌培养皿中，用2mm的肿瘤取样器对肿瘤进行穿刺，然后利用手术刀将穿刺后的样本切成四份，用分析天平测量肿瘤质量；
③用吸管尖端将组织块分别置于96孔板的A1-A4孔中；
④A1-A3孔加入1*10
5PFU的OV-GFP，A4孔为空白对照，37℃培养48h后利用荧光显微镜观察。
观察结果显示在图4B中。图中，block 1-3分别对应A1-A3孔。
病毒滴度测定
为检测OV-GFP感染肿瘤组织样品的上清中的病毒滴度，收集上述步骤④培养48h后的上清，梯度稀释该上清。将梯度稀释好的病毒液，按800μl/孔加入预先接种了5*10
5个Vero细胞的6孔板中。在培养箱中培养2小时后，更换新鲜199v培养基，再培养36小时。之后，显微镜下计数每孔中的病毒噬斑数，计算病毒扩增倍数(virus amplification multiple)。结果显示在图4C中。
相对抑制率测定
在本测定中，为了避免GFP荧光干扰Alamar blue实验，使用OV-GFP的对应野生型wild type OV，以检查OV对口腔癌原代组织的杀伤作用。简言之，
①准备一个24孔板，在A1-A4孔中加入2ml培养基；
②将第一列口腔癌原代组织置于无菌培养皿中，用2mm的肿瘤取样器对肿瘤进行穿刺，然后利用手术刀将穿刺后的样本切成均匀的四份，用分析天平测量肿瘤质量；
③用吸管尖端将肿瘤组织分别置于A1-A4孔中；
④每孔加入25μl Alamar blue细胞活力检测剂(碧云天)，37℃培养箱中孵育1h；
⑤孵育后，每孔吸出300μl到96孔板的三个平行孔中；
⑥用荧光酶标仪检测(激发光：530；发射光：590)，记录数据；
⑦读取数据后，将组织块从A排转移至B排，加入新的培养基；
⑧B1-B3孔分别对应block-1、block-2和block-3，每孔加25μl wild type OV(1*10
6PFU/ml)；B4孔不加wild type OV。72h后，添加25μl Alamar blue，并重复步骤④至⑥。计算相对抑制率。结果显示在图4D中。
结果描述：
如图4B所示，OV-GFP能够感染并侵袭第一例口腔癌原代组织；图4C检测了三个孔(block 1-3)上清中的病毒滴度，结果显示36小时内OV-GFP能够在口腔癌组织中扩增2-8倍，证明了病毒能够在口腔癌原代组织中扩增；图4D利用alamar blue检测了OV对口腔癌组织细胞活力的影响，结果显示OV在72h时对block-2号样品的抑制率达到了60％，证明OV-GFP对口腔癌组织具有一定的杀伤能力。图4说明，OV-GFP在原代癌组织的不同区域均能够感染、扩增并杀伤癌细胞，但表现出组织区域异质性。
溶瘤病毒OV-OX40L/IL12在多种肿瘤细胞系中的杀伤效果
为了证明OV-OX40L/IL12能够感染多种肿瘤类型的细胞系，我们利用溶瘤病毒感染SCC-15(人口腔鳞状细胞癌细胞系，ATCC，CRL-1623)，SHG-44(人脑胶质瘤细胞系)，MCF-7(人乳腺癌上皮细胞系，ATCC，HTB-22)，HT-29(人结肠癌细胞系，ATCC，HTB-38)，HT-1080(人纤维肉瘤细胞系，ATCC，CCL-121)这5种细胞系，进行了如下分组实验：PBS，OV-GFP(MOI＝0.1)和OV-OX40L/IL12(MOI＝0.1)；在溶瘤病毒感染后第6h，12h，24h和48h时，利用显微镜对各组对应孔中的细胞进行观察和拍照，结果显示在图4E中。
结果描述：溶瘤病毒OV-OX40L/IL12能够有效感染人口腔鳞状细胞癌、人脑胶质瘤、人乳腺癌、人结肠癌和人纤维肉瘤等多种肿瘤细胞系。
综上所述，这些数据表明OV-OX40L、OV-IL12、OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1可以感染和杀死原发口腔癌细胞和组织，并能够表达OX40L、IL12和PD-1scFv。
实施例3：溶瘤病毒与TIL联用在口腔癌中的效果
实施例3.1溶瘤病毒与TIL的体外联用
利用共培养实验检测OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1联合TIL对原代口腔癌细胞的杀伤作用
以MOI＝0.01，使用武装溶瘤病毒预先感染原代口腔癌细胞(OC1-TC)48小时，之后加入或不加入TIL再孵育24小时，利用显微镜观察并拍照。作为对照，检查未加入溶瘤病毒和TIL的OC1原代细胞，以及仅加入TIL的OC1原代细胞。简言之：
在实验中设置如下分组：
-仅OC1细胞，
-OC1+OV-GFP(感染溶瘤病毒OV-GFP的OC1细胞)，
-OC1+OV-OX40L(感染溶瘤病毒OV-OX40L的OC1细胞)，
-OC1+OV-IL12(感染溶瘤病毒OV-IL12的OC1细胞)，
-OC1+OV-OX40L/IL12(感染溶瘤病毒OV-OX40L/IL12的OC1细胞)，
-OC1+OV-OX40L/αPD-1(感染溶瘤病毒OV-OX40L/αPD-1的OC1细胞)，
-OC1+OV-IL12/αPD-1(感染溶瘤病毒OV-IL12/αPD-1的OC1细胞)，
-OC1+OV-OX40L/IL12/αPD-1(感染溶瘤病毒OV-OX40L/αPD-1+OV-IL12/αPD-1(1:1等比例加入)的OC1细胞)，
-OC1+TIL(OC1细胞与TIL共培养)，
-OC1+OV-GFP+TIL(感染溶瘤病毒OV-GFP的OC1细胞与TIL共培养)，
-OC1+OV-OX40L+TIL(感染溶瘤病毒OV-OX40L的OC1细胞与TIL共培养)，
-OC1+OV-IL12+TIL(感染溶瘤病毒OV-IL12的OC1细胞与TIL共培养)，
-OC1+OV-OX40L/IL12+TIL(感染溶瘤病毒OV-OX40L/IL12的OC1细胞与TIL共培养)，
-OC1+OV-OX40L/αPD-1+TIL(感染溶瘤病毒OV-OX40L/αPD-1的OC1细胞与TIL共培养)，
-OC1+OV-IL12/αPD-1+TIL(感染溶瘤病毒OV-IL12/αPD-1的OC1细胞与TIL共培养)，
-OC1+OV-OX40L/IL12/αPD-1+TIL(感染溶瘤病毒OV-OX40L/αPD-1+OV-IL12/αPD-1(1:1等比例加入)的OC1细胞与TIL共培养)。
在96孔板中，每组两个复孔，每孔铺5000个口腔癌原代细胞，24h后感染武装溶瘤病毒(MOI＝0.01)，继续培养48h。在不同溶瘤病毒组合感染的情况下，感染比例为1:1。48h后将上清吸弃，按照1:1的E/T比例加入TIL，用100μl REP media I重悬，共培养24h后收集上清。96孔板用PBS小心洗涤3次，利用显微镜观察并拍照。结果显示在图5中。
利用ELISA检测预感染OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1的口腔癌原代细胞对TIL的激活作用
设置如下分组，利用ELISA检测各组细胞培养上清液中IFNγ的浓度以反映预感染溶瘤病毒的口腔癌细胞对TIL的激活作用：
-仅TIL细胞，
-口腔癌原代细胞与TIL的共培养物：OC1/2/3/4+TIL，
-预感染不同溶瘤病毒(OV-GFP,OV-OX40L,OV-IL12,OV-OX40L/IL12,OV-OX40L/αPD-1,OV-IL12/αPD-1或OV-OX40L/αPD-1+OV-IL12/αPD-1(即OV-OX40L/IL12/αPD-1))的口腔癌原代细胞与TIL的共培养物：OC1/2/3/4+OV-GFP+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L+TIL,OC1/2/3/4+OV-IL12+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L/αPD-1+TIL,OC1/2/3/4+OV-IL12/αPD-1+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12/αPD-1+TIL。
实验步骤：
1、准备4个96孔板，每孔铺5000个口腔癌原代细胞，24h后将上清弃掉，加入100μl配制好的病毒稀释液(MOI＝0.01)，对于两种溶瘤病毒组合感染的情况，感染比例为：1:1。2000rpm离心10分钟后置于培养箱中继续培养2h。2h之后用100μl新鲜的CCM培养基替换各孔上清，继续培养48h；
2、以1:1的E:T比例加入肿瘤特异性TIL，即，在对肿瘤细胞计数后，将TIL稀释至2*10
5个细胞/ml，每孔加入100μl细胞悬液(用CCM重悬)，继续培养24h；
3、24h后收集上清，2000rpm离心5min，将上清液收集到干净EP管中待测；
4、将待测液稀释5倍后用Human IFN-gamma Valukine ELISA试剂盒(R&D Systems)检测。结果显示在图6A中。
利用ELISPOT检测预感染OV-OX40L，OV-IL12和OV-OX40L/IL12的口腔癌细胞对肿瘤特异性TIL的
激活作用
在本实验中，病毒感染复数为0.01，设置如下分组：
-单纯TIL
-未感染溶瘤病毒的口腔癌原代细胞与TIL共培养：OC1+TIL
-感染OV-GFP的口腔癌原代细胞与TIL共培养：OC1+OV-GFP+TIL
-感染OV-OX40L的口腔癌原代细胞与TIL共培养：OC1+OV-OX40L+TIL
-感染OV-IL12的口腔癌原代细胞与TIL共培养：OC1+OV-IL12+TIL
-感染OV-OX40L/IL12的口腔癌原代细胞与TIL共培养：OC1+OV-OX40L/IL12+TIL
-阳性对照：2.5μg/ml的PHA处理TIL。
实验步骤：
1、用2*10
5个OC1细胞铺24孔板的一个孔，24h后加入DEC混合液处理48h后将上清弃掉，再向孔中加入2*10
6个TIL(用1ml REP media I培养基重悬)，共培养一周，随后在无细胞因子的培养基中培养过夜；之后再用DEC混合液处理的OC1刺激TIL 6h；
2、用OC1铺一个96孔板，共7组，其中5组提前铺OC1；
3、每组设置2个复孔，共15个孔；将10万OC1重悬于2ml CCM培养基中，每孔加入100微升；
4、24h后在对应孔中加入改造后的溶瘤病毒(MOI＝0.01)，继续培养48h；
5、48h后加入刺激后的TIL，每孔5万，用REP media I重悬；
6、共培养24h后将各组上清中的TIL吸出，用PBS洗三次后重悬于100微升CCM培养基中，加入到ELISPOT(货号：2110005)预包被板中；
7、具体的染色步骤见厂商说明书。
结果显示在图6B和6C中。
利用MTT检测OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1联合TIL对原代口腔癌细胞的杀伤作用
在本实验中，病毒滴度选择为MOI＝0.01。
设置如下分组：
-未感染溶瘤病毒且未加TIL的口腔癌原代细胞：OC1/2/3/4+PBS,
-预感染不同溶瘤病毒(OV-GFP,OV-OX40L,OV-IL12,OV-OX40L/IL12,OV-OX40L/αPD-1,OV-IL12/αPD-1或OV-OX40L/αPD-1+OV-IL12/αPD-1(即OV-OX40L/IL12/αPD-1))的口腔癌原代细胞：OC1/2/3/4+OV-GFP,OC1/2/3/4+OV-OX40L,OC1/2/3/4+OV-IL12,OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12,OC1/2/3/4+OV-OX40L/αPD-1,OC1/2/3/4+OV-IL12/αPD-1,OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12/αPD-1；
-口腔癌原代细胞与TIL的共培养物：OC1/2/3/4+TIL,
-预感染不同溶瘤病毒(OV-GFP,OV-OX40L,OV-IL12,OV-OX40L/IL12,OV-OX40L/αPD-1,OV-IL12/αPD-1或OV-OX40L/IL12/αPD-1)的口腔癌原代细胞与TIL的共培养物：OC1/2/3/4+OV-GFP+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L+TIL,OC1/2/3/4+OV-IL12+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L/αPD-1+TIL,OC1/2/3/4+OV-IL12/αPD-1+TIL,OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12/αPD-1+TIL。
实验步骤：
1、准备4个96孔板，每孔铺5000个口腔癌原代细胞，24h后将上清弃掉，加入100μl配制好的病毒稀释液(MOI＝0.01)，2000rpm离心10分钟后置于培养箱中继续培养2h。2h之后用100μl新鲜的CCM培养基替换各孔上清，继续培养48h；
2、以1:1的E:T比例加入肿瘤特异性TIL，即，在对肿瘤细胞计数后，将TIL稀释至2*10
5个细胞/ml，每孔加入100μl细胞悬液(用CCM重悬)，继续培养24h；
3、MTT检测步骤与实施例2.2相同。本实验所用到的口腔癌细胞为贴壁细胞，而TIL为悬浮细胞，检测口腔癌细胞的增殖实验时将培养上清收集到离心管中，然后用PBS冲洗贴壁肿瘤细胞3次，然后对底部存活的贴壁肿瘤细胞进行MTT检测。结果显示在图7中。
在预感染病毒的原代口腔癌细胞的刺激下利用MTT测定T细胞扩增情况
选择MOI＝0.01；
设置如下分组：CCM,TIL+CCM,TIL+OC1/2/3/4,TIL+OV-GFP,TIL+OV-OX40L,TIL+OV-IL12,TIL+OV-OX40L/IL12,TIL+OC1/2/3/4+OV-GFP,TIL+OC1/2/3/4+OV-OX40L,TIL+OC1/2/3/4+OV-IL12,TIL+OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12,TIL+OC1/2/3/4+OV-OX40L/αPD-1,TIL+OC1/2/3/4+OV-IL12/αPD-1,TIL+OC1/2/3/4+OV-OX40L/IL12/αPD-1(OV-OX40L/αPD-1+OV-IL12/αPD-1)；
实验步骤：
1、准备1个96孔板，每孔铺5000个口腔癌原代细胞，24h后将上清弃掉，加入100μl配制好的病毒稀释液(MOI＝0.01)，2000rpm离心10分钟后置于培养箱中继续培养2h。2h之后用100μl新鲜的CCM培养基替换各孔上清，继续培养48h；
2、48h后将上清弃掉，用PBS洗三遍，以1:1的E:T比例加入肿瘤特异性TIL，即，在肿瘤细胞计数后将TIL稀释至2*10
5个细胞/ml，每孔加入100μl细胞悬液(用CCM重悬)，继续培养24h；
3、MTT检测步骤与实施例2.2相同。检测培养上清中TIL的增殖时，收集培养上清和三次PBS冲洗后收集的冲洗液，进行MTT检测。结果显示在图8中。
结果：
当TIL与预感染OV-OX40L/IL12的口腔癌细胞共培养24h时，与单纯TIL处理组相比，第一例口腔癌细胞的活力显著降低(图5)。利用MTT实验进一步在4例口腔癌原代细胞中进行了验证，结果显示TIL能够显著抑制OV-OX40L/IL12/αPD-1处理后的口腔癌细胞的活力(图7)。随后利用ELISA检测了预感染 武装溶瘤病毒的口腔癌原代细胞对TIL激活的影响。结果表明，与OV-GFP+TIL组相比，预感染OV-OX40L/IL12/αPD-1的原代口腔癌细胞可以显著上调TIL中IFNγ的产生，证明表达的OX40L和IL12蛋白能够显著激活TIL(图6A)。ELISPOT结果显示，预感染OV-OX40L/IL12/αPD-1的口腔癌细胞处理TIL能够显著提高TIL中IFNγ的产量以及单个TIL中IFNγ的表达量，证明预感染OV-OX40L/IL12/αPD-1的口腔癌细胞不仅能够提高TIL的激活比例，还能够显著提高激活TIL的肿瘤杀伤能力(图6B和C)。最后利用MTT测定了各组TIL的扩增情况，结果表明TIL在OV-OX40L/IL12/αPD-1+TIL组中的增殖能力最强(图8)。以上实验表明，预感染OV-OX40L/IL12/αPD-1的口腔癌原代细胞能够显著促进TIL的活化和扩增，使其产生强效的抗肿瘤效果。
实施例3.2溶瘤病毒将口腔癌细胞转化为APC
利用流式证明武装溶瘤病毒能够将肿瘤细胞转化为APC
我们利用流式检测了TIL与预先以不同的武装溶瘤病毒或其组合感染的口腔癌细胞共培养后，原代口腔癌细胞表面APC相关基因的表达情况。我们发现OV-OX40L/αPD-1+OV-IL12/αPD-1(OV-OX40L/IL12/αPD-1)与TIL联用可以上调口腔癌细胞表面抗原递呈分子HLA-A/B/C、HLA-DR/DP/DQ、CD80和CD86的表达。当感染了OV-OX40L/IL12/αPD-1的口腔癌细胞与TIL共培养时，口腔癌细胞上的PD-L1表达也显著增加(图10)。
我们利用流式也检测了共培养后TIL表面的抗原表达情况。流式结果显示OV-OX40L/IL12/αPD-1预感染的口腔癌细胞能够显著上调TIL表面CD137和PD-1的表达，证明表达OX40L、IL12和PD-1scFv的口腔癌细胞能够显著激活TIL(图9)。图9也显示：(1)感染武装溶瘤病毒组合的口腔癌细胞能够显著上调中央记忆T细胞和效应记忆T细胞的数量，从而能够显著抑制肿瘤复发和转移；(2)感染武装溶瘤病毒组合的口腔癌细胞能够显著上调CD8阳性细胞中颗粒酶B、穿孔素和IFNγ的表达，而且CD137和CD28的表达也显著升高，这些结果表明TIL能够被感染溶瘤病毒组合的口腔癌细胞显著激活，且对口腔癌细胞的杀伤效果是由颗粒酶B、穿孔素和IFNγ共同介导的；(3)PD-1和TIM-3的细胞数量在各组中没有显著性差异，证明本发明的联合策略不仅能够提高TIL的激活效率，还能够减缓T细胞的耗竭速度。
上述实验按如下进行。简言之，利用PerCP-Cy5.5-CD45抗体进行细胞表面标记，CD45阳性细胞为TIL，阴性为口腔癌原代细胞。同时，使用荧光标记抗体PE/Dazzle
TM 594 anti-human HLA-A,B,C、FITC anti-human HLA-DR,DP,DQ、PE anti-human CD80、FITC anti-human CD86、PE anti-human CD252(OX40L)、PE/Dazzle
TM 594 anti-human CD274(B7-H1,PD-L1)，以及使用抗体Alexa Fluor 700 anti-human CD137(4-1BB)和PE/Cyanine7 anti-human CD279(PD-1)，按如下方式，以流式细胞术分别检测口腔癌细胞表面和TIL表面的抗原表达。
1、用第一例口腔癌原代细胞(OC1)铺3个六孔板(共16个孔)，每孔铺50万个细胞，每组设置1个复孔；
2、利用改造后的溶瘤病毒(MOI＝0.01)预感染口腔癌细胞48h，48h后将上清吸弃，每孔加入1*10
6TIL，继续培养24h后收集细胞于96孔U底板中，1200rpm离心3min，吸弃上清；
3、每孔加入100μL Viability Dye(Zombie NIR
TM Fixable Viability Kit，Biolegend)(用PBS 1:1000稀释)染死细胞，4℃避光静置10分钟。再直接加100μL PBS混匀洗去残余染料，1400rpm，4℃离心5分钟，弃上清；
4、除空白对照外，其余每孔加入对应的40μL抗体混合液(配制方法与实施例1.2相同)，混匀，4℃避光静置1h；之后进行流式细胞术检测。
利用QPCR检测OV-OX40L/αPD-1和OV-IL12/αPD-1武装溶瘤病毒对原代口腔癌细胞表面抗原表达
的影响
实验分组如下：OC1+TIL，OC1+OV-GFP+TIL，OC1+OV-OX40L+TIL,OC1+OV-IL12+TIL,OC1+OV-OX40L/IL12+TIL,OC1+OV-OX40L/αPD-1+TIL,OC1+OV-IL12/αPD-1+TIL,OC1+OV-OX40L/IL12/αPD-1(OV-OX40L/αPD-1+OV-IL12/αPD-1)+TIL
用第一例TC铺3个六孔板，共16个孔，每孔50万细胞，每组设置2个复孔；24h后用2ml含有溶瘤病毒的CCM培养基替换各组旧培养基；培养48h后加入100万TIL进行共培养，再继续培养24h后收集细胞。
提取RNA，逆转录为cDNA。通过QPCR检测，采用荧光标记的序列特异性引物，检测了各组样品中HLA-A,HLA-C,HLA-DRB1,CD80,CD86,和PD-L1基因的表达。与所有其他组相比，表达所有三种基因(OX40L,IL-12和PD-1scFv)的OV和TIL的组合可以诱导最高水平的抗原呈递细胞相关基因(HLA-A,HLA-C,HLA-DRB1,CD86和PD-L1)的表达；与IL12和PD-1相比，OX40L对增加抗原呈递基因(HLA-A,HLA-C,HLA-DRB1,CD86和PD-L1)的肿瘤表达更为重要(图11)。
具体实验步骤：使用RNA提取试剂盒(天根生化，DP430)，按照厂商说明书，提取RNA。用cDNA合成试剂盒(HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，Vazyme Biotech)，按照厂商说明书，合成cDNA。
制备50μl反应的PCR混合物：
小心混合溶液，将45μl PCR混合物吸到PCR微孔板中。添加5μl模板DNA。根据仪器说明，进行QPCR操作。QPCR扩增条件如下：93℃预变性2分钟，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40个循环，最后72℃延伸7分钟。
实施例3.3体内动物模型试验
上述研究已经证明OV-OX40L/αPD-1+IL12/αPD-1与TIL的组合能够在体外增强对肿瘤的杀伤和T细胞活化，为了进一步在体内水平验证，我们评估了溶瘤病毒、TIL以及联合疗法在口腔癌PDX模型和免疫完整(immunocompetent)小鼠移植瘤中的疗效。
实施例3.3.1免疫缺陷小鼠肿瘤模型试验
口腔癌PDX模型的建立以及传代移植
(1)原代PDX模型的建立：
①用手术剪将自口腔癌患者获得的样本剪成2*2*2mm
3大小的组织块，置于无菌条件下的组织培养基(RPMI 1640)中；
②腹腔注射4％的水合氯醛(Adamas)麻醉小鼠，将小鼠右侧腋下毛发褪去，将小鼠腹部朝上固定在超净台中，用70％酒精擦拭消毒，在距离小鼠腋下2厘米处用剪刀剪开长约3mm的小口，用钝钳分别将3小块口腔癌组织送至皮下(用基底胶(Corning，354234)浸润肿瘤)，用无菌缝合线将伤口缝合，以防肿瘤块脱出，此为原代PDX动物模型建立，为P0代；
③每个肿瘤样本用4只NSG小鼠进行初始传代，植入后，每三天用游标卡尺测量一次异种移植体的尺寸。用该公式计算肿瘤体积：V＝长×(宽)
2/2；
④其余的口腔癌组织块置于冻存管中冻存。
(2)PDX模型的传代移植
①待P0代小鼠皮下瘤长至约1,000mm
3时颈椎脱臼法处死小鼠，铺无菌巾，用70％酒精消毒小鼠腋下皮肤，用无菌手术刀剪开肿瘤周围皮肤，剖出肿瘤放进无菌培养皿中，取部分组织置于4％多聚甲醛溶液(索莱宝)固定，剩余部分用无菌器械分割肿瘤至大小约0.2cm×0.2cm×0.2cm的组织块；
②取5只5周龄NSG小鼠，按照前述方法移植，此代为第1代PDX动物模型，称为P1代。每周定期检测小鼠重量及肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。待P1代小鼠皮下瘤长至大小约1,000mm
3时，按照此方法传代移植，建立第2、3、4代PDX动物模型，称为P2、P3和P4代。
评估OV-OX40L/IL12联合TIL对OC1和OC4-PDX肿瘤生长的抑制效果
使用两例口腔癌组织(OC1和OC4)建立PDX模型。在第4代和第5代PDX模型上评估溶瘤病毒联合TIL对肿瘤的生长抑制。其中，在瘤内注射TIL前，将根据实施例1分离和扩增的TIL与DEC混合物刺激的肿瘤细胞共培养24h来激活TIL。结果显示在图12A-B和12C-D中。
第一例口腔癌PDX模型：
建立OC1-PDX模型，待PDX长至200-300mm3时随机分如下4组，每组5只，给予治疗；OC1+PBS，OC1+TIL，OC1+OV-GFP+TIL，OV-OX40L/IL12+TIL。溶瘤病毒给药：第0天，OC1+OV-GFP+TIL和OC1+OV-OX40L/IL12+TIL两组的小鼠在肿瘤部位接受瘤内注射2*105PFU(50μL)的病毒，仅单次治疗。
TIL给药：第2天，OC1+TIL，OC1+OV-GFP+TIL和OC1+OV-OX40L/IL12+TIL三组的小鼠在肿瘤部位接受瘤内注射2*106TIL，仅单次治疗。
OC1+TIL，OC1+OV-GFP+TIL和OC1+OV-OX40L/IL12+TIL三组的小鼠每只从第2天至第18天每隔 一天腹腔注射一次10μg/100μL Super-IL-2蛋白。每三天用游标卡尺测量一次异种移植体的尺寸。用该公式计算肿瘤体积：V＝长×(宽)
2/2。
第四例口腔癌PDX模型：
建立OC4-PDX模型，待PDX长至200-300mm
3时随机分如下4组，每组5只，给予治疗：OC4+PBS,OC4+TIL,OC4+OV-GFP+TIL,OC4+OV-OX40L/IL12+TIL。治疗方案和肿瘤体积测量和计算方式按上述进行。
利用ELISA检测肿瘤微环境中IFNγ的表达水平
自前述OC1-PDX模型的四个小鼠治疗组中，分别随机选取两到三只小鼠，取肿瘤组织块冻存(第7天)。分组：OC1(两只每只各取两小块)，OC1+TIL(两只每只各取两小块)，OC1+OV-GFP+TIL(两只每只各取两小块)，OC1+OV-OX40L/IL12+TIL(三只各取一小块)。按照下述步骤，检测肿瘤块中IFNγ的表达水平：
1、从液氮中取出冻存组织块，随机选取大小适中的组织块进行称量；
2、用注射器和细胞筛网将各组挑选出的组织块研磨均匀，用PBS冲洗2-3遍，质量体积比为10:1(假设组织块质量为8mg，即将体积定容到0.8ml)；
3、用1.5ml EP管收集滤过液，400g离心5分钟，上清用0.45微米滤膜过滤，将滤液收集到新的EP管中待测。使用Human IFN-gamma Valukine ELISA Kit(1KT)(R&D Systems，VAL104)，按照厂商说明书，实施上清液中IFN-γ的含量测定。结果显示在图13中。
结果：
TIL单独疗法对第一例患者PDX的肿瘤生长仅有一定的延缓作用，并不能在治疗结束时减轻肿瘤负担；OV-GFP与TIL联合疗法相对于TIL单独疗法相比具有一定的肿瘤抑制能力，但治疗结束时PDX模型的肿瘤负担仍较大；OV-OX40L/IL12与TIL联合疗法能够显著减轻第一例PDX模型的肿瘤负担，并且在治疗7周后第一例PDX模型小鼠全部被治愈(图12A-12B)。图12A展示各组动物的肿瘤生长曲线；图12B为图12A的展开图，显示各组中各动物个体的肿瘤生长曲线。
TIL单独疗法对第四例患者PDX几乎没有治疗效果；OV-OX40L/IL12单纯溶瘤病毒能够在一定程度上抑制第四例患者PDX的生长，但抑制效果并不显著；与TIL单独疗法相比，OV-OX40L/IL12联合TIL能够显著抑制第四例PDX的生长(图12C和12D)。图12C展示各组动物的平均肿瘤生长曲线；图12D为图12C的展开图，显示各组中各动物个体的肿瘤生长曲线。
为了证明该联合疗法对口腔癌PDX的抑制效果与过继TIL的激活有关，利用ELISA检测了各组肿瘤匀浆中IFNγ的含量，结果表明OV-OX40L/IL12与TIL联合疗法能够显著上调肿瘤中过继TIL的激活水平(图13)。
实施例3.3.2免疫完整小鼠肿瘤模型试验
在以下实验中，所述溶瘤病毒OV-mOX40L和OV-mIL12根据前述用于武装溶瘤病毒构建的方法，分别采用来自小鼠的OX40L和来自小鼠的IL12予以构建；所述TIL为根据前述TIL制备方法，从相应小鼠移植瘤中提取分离扩增的TIL；并且采用PD-1抗体蛋白(购自BioXcell，货号BE0146)，替代在溶瘤病毒中表达的PD-1抗体，检查不同施用形式的PD-1抗体与表达OX40和IL12的武装溶瘤病毒组合在TIL治疗中的影响。
1、结肠癌细胞系MC38移植瘤模型建立
采用免疫完整的C57BL/6J小鼠(维通利华)，每只单侧注射1*10
6MC38细胞，建立移植瘤。待肿瘤体积长至50mm
3时，随机分为如下8组，每组6只：
分组：MC38+PBS，MC38+OV-GFP，MC38+TIL，MC38+OV-GFP+TIL，MC38+OV-mOX40L/mIL12，MC38+OV-mOX40L/mIL12+TIL，MC38+OV-mOX40L/mIL12+α-PD-1，MC38+OV-mOX40L/mIL12+α-PD-1+TIL。
以随机分组当日为第1天。之后，按照如下施用方案，根据分组，向小鼠施用溶瘤病毒、TIL和/或PD-1抗体蛋白。
溶瘤病毒(OV-mOX40L和OV-mIL12)：第3天和第5天在肿瘤原位注射OV-mOX40L和OV-mIL12，共治疗两次；每只每次共注射2*10
6PFU(100μL，其中OV-mOX40L和OV-mIL12的比例为1:1)；
TIL：第7天开始治疗，每只原位注射在PBS中重悬的1*10
6TIL，注射体积100μL；
PD-1抗体：从第7天开始，最后两组每两周腹腔注射一次10mg/kg的α-PD-1，共注射2次。
每两天记录一次小鼠肿瘤体积和体重,监测小鼠移植瘤的生长并绘制曲线。当肿瘤体积长至1500mm
3时，处死小鼠并取材。结果如图14所示：
(1)与PBS对照组相比，TIL单独疗法仅轻微延缓了MC38移植瘤的生长，并不能减轻小鼠肿瘤负担；
(2)与OV-GFP单药组相比，OV-mOX40L+OV-mIL12治疗组和OV-mOX40L+OV-mIL12+α-PD-1治疗组的小鼠肿瘤生长速度显著降低，α-PD-1能够在一定程度上增强OV-mOX40L+OV-mIL12的抑瘤效果；
(3)TIL的引入能够显著增强OV-mOX40L和OV-mIL12在MC38移植瘤中的治疗效果。在联合治疗后第16天，OV-mOX40L+OV-mIL12+TIL治疗组的7只小鼠肿瘤体积均维持在30-50mm
3左右，OV-mOX40L+OV-mIL12+α-PD-1+TIL治疗组的7只小鼠肿瘤体积均在20-40mm
3左右，肿瘤平均体积减小26％。
2、胰腺癌细胞系pan02-HVEM移植瘤
采用免疫完整的C57BL/6J小鼠，每只单侧注射5*10
5Pan02-HVEM细胞(为了基于HSV-1的溶瘤病毒有效感染小鼠胰腺癌细胞系Pan02，向Pan02细胞中引入病毒受体HVEM，构建Pan02-HVEM细胞)，建立移植瘤。待肿瘤体积长至50mm
3时，随机分为如下6组，每组8只：
分组：Pan02-HVEM+PBS，Pan02-HVEM+OV-GFP，Pan02-HVEM+TIL，Pan02-HVEM+OV-GFP+TIL，Pan02-HVEM+OV-mOX40L/IL12/α-PD-1，Pan02-HVEM+OV-mOX40L/IL12/α-PD-1+TIL。
以动物随机分组当日为第1天。之后，按照如下施用方案，根据分组，向小鼠施用溶瘤病毒、TIL和/或PD-1抗体蛋白：
溶瘤病毒(OV-mOX40L和OV-mIL12)：第3天和第5天在肿瘤原位注射OV-mOX40L和OV-mIL12，共治疗两次；每只每次注射2*10
6PFU(100μL，其中OV-mOX40L和OV-mIL12的比例为1:1)；
TIL：第7天开始治疗，每只肿瘤原位注射在PBS中重悬的1*10
6TIL，注射体积100μL；
PD-1抗体：从第五天开始，最后两组每两周腹腔注射一次10mg/kg的α-PD-1，共注射2次。
每两天记录一次小鼠肿瘤体积和体重,监测小鼠移植瘤的生长并绘制曲线。当肿瘤体积长至1500mm
3时，处死小鼠并取材。结果如图15所示：
(1)与PBS对照组相比，TIL单独疗法对pan02-HVEM移植瘤的生长没有明显抑制效果；
(2)与OV-GFP单药组相比，OV-mOX40L+OV-mIL12+PD-1scFv治疗组的小鼠肿瘤生长速度显著降低。联合治疗后22天，7只小鼠中有4只小鼠的肿瘤完全消失；
(3)TIL的引入对OV-mOX40L+OV-mIL12+PD-1scFv+TIL治疗组有一定增益效果。在胰腺瘤荷瘤小鼠中获得的TIL的该增益效果，相比于在之前的结肠癌荷瘤小鼠中TIL对武装溶瘤病毒(OV- mOX40L/mIL12/α-PD-1)的增益效果，看上去较小，推测这是由于胰腺瘤pan02本身已经含有高丰度的免疫细胞，所以TIL加入效果有限。
3、肿瘤和脾脏中免疫细胞分析
在小鼠C57BL/6J上接种pan02-HVEM细胞建立移植瘤。在TIL治疗后第3天和第7天取材。
脾脏细胞分离：将脾脏剪碎后置于70μm细胞筛中研磨，期间用PBS冲洗3次，将细胞收集至50ml离心管中离心并裂红。
皮下肿瘤中分离细胞的步骤：
(1)处死小鼠，70％酒精浸泡，取肿瘤；
(2)肿瘤用PBS冲洗去除血管及血，称重，拍照；
(3)肿瘤一分为二，取一半肿瘤用4％多聚甲醛固定，进行切片和组织化学染色；
(4)另一半的肿瘤用剪刀剪碎，放入8ml的消化液中(在FACS buffer:PBS+2％FBS中，含collagenase I(1mg/ml)，dispase II(0.05mg/ml)或透明质酸酶(1mg/ml)，以及Dnase(0.5mg/ml))，放入37度培箱，摇床震荡，消化大约一小时；
(5)消化后，过70μm细胞筛(cell strainer)；
(6)1400rpm，4度离心5min，弃上清，涡旋震荡沉淀；加入20ml DMEM洗一遍。
配置40％Percoll和70％Percoll，70％Percoll(6mL)提前放到15ml离心管中，40％Percoll重悬步骤6中的沉淀，缓慢加入到70％Percoll的上层，使两者形成明显分层，离心30min；
100ml 40％Percoll的配制如下:混合4ml 10×PBS，36ml Percoll和60ml DMEM；
90ml 70％Percoll的配制如下：混合7ml 10XPBS，63ml Percoll和30ml DMEM。
(7)小心弃掉上黏稠液体(注意不要损失中间层细胞)，收集中间层的白细胞(肿瘤细胞在底部)，转移至含10ml DMEM的15ml离心管，离心。如果细胞沉淀颜色很红，用ACK裂解缓冲液裂红，根据沉淀体积加裂解缓冲液(通常为3mL)，涡旋,室温静置4min,之后1400rpm,4℃，离心5min。
(8)弃上清，根据沉淀体积加入DMEM重悬，调整DMEM体积，使得每个样品细胞密度大体一致，过网筛，转移至新流式管中。根据最小肿瘤体积估计加入DMEM的量，使得所有样品密度相同。
流式操作步骤采用与实施例3.2中的大致相同的操作步骤，进行样品的流式检测。
如流式检测所证实，OV-mOX40L/IL12将能够显著上调瘤内和脾脏中CD8阳性T细胞的比例，IFNγ和GranzyMEB的表达量也将显著升高。结果显示在图16中。
Figure 16A：该图为治疗后第3d时各组肿瘤组织中肿瘤细胞表面及胞内标志物的表达
结果显示，与单纯TIL或单纯溶瘤病毒治疗组相比，联合治疗组肿瘤细胞中MHCI，MHCII，CD86，OX40L和IL12的表达均显著上调，表明溶瘤病毒联合TIL能够将肿瘤细胞转变为抗原呈递细胞。
图16B：该图为治疗后第3d时各组肿瘤组织中不同免疫细胞比例及标志物的表达
结果显示，与单纯TIL或单纯溶瘤病毒治疗组相比，联合治疗组能够显著上调肿瘤组织中CD3+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞和M1型巨噬细胞的比例，且能够显著下调耗竭的CD8+T细胞、Treg和M2型巨噬细胞的比例；CD45+TIL，CD4+T，巨噬细胞，G-MDSC和M-MDSC细胞的比例没有显著变化。
与单纯TIL或单纯溶瘤病毒治疗组相比，联合治疗组能够显著上调肿瘤组织中CD8+T和NK细胞中IFNγ，TNFα和GranzyMEB的表达，但CD4+T细胞中的IFNγ差异不显著。
上述结果表明溶瘤病毒联合TIL能够显著上调肿瘤组织中CD8+T，NK细胞和M1型巨噬细胞的比例和杀伤能力，并且能够减少免疫抑制性细胞例如耗竭CD8+T细胞、Treg和M2型巨噬细胞的浸润。
图16C：该图为治疗后第7d时各组肿瘤组织中肿瘤细胞表面及胞内标志物的表达
结果显示，与单纯TIL或单纯溶瘤病毒治疗组相比，联合治疗组肿瘤细胞中MHCI，MHCII，CD86，OX40L的表达均显著上调，进一步证实了溶瘤病毒联合TIL能够将肿瘤细胞转变为抗原呈递细胞。
图16D：该图为治疗后第7d时各组肿瘤组织中不同免疫细胞比例及标志物的表达
结果显示，与单纯TIL或单纯溶瘤病毒治疗组相比，联合治疗组能够显著上调肿瘤组织中CD8+T细胞、NK细胞和M1型巨噬细胞的比例，且能够显著下调耗竭的CD8+T细胞、Treg和M2型巨噬细胞的比例；CD45+TIL，CD3+T，CD4+T，巨噬细胞，G-MDSC和M-MDSC细胞的比例没有显著变化。
与单纯TIL或单纯溶瘤病毒治疗组相比，联合治疗组能够显著上调肿瘤组织中CD8+T和NK细胞中IFNγ，TNFα和GranzyMEB的表达。
上述结果表明溶瘤病毒联合TIL能够显著上调肿瘤组织中CD8+T，NK细胞和M1型巨噬细胞的比例和杀伤能力，并且能够减少免疫抑制性细胞例如耗竭CD8+T细胞、Treg和M2型巨噬细胞的浸润。
序列列表：
SEQ ID NO:1:编码IL12 P40的基因序列
SEQ ID NO:2：编码IL12 P35的基因序列
SEQ ID NO:3编码三聚化OX40L的基因序列
SEQ ID NO:4编码PD-1 scFv-VH的核酸序列
SEQ ID NO:5编码PD-1 scFv-VL的核酸序列
SEQ ID NO:6 CMV启动子
SEQ ID NO:7 SV40 polyA
SEQ ID NO:8 Homologyarm-1L
SEQ ID NO:9 Homologyarm-1R
SEQ ID NO:10 Homologyarm-2L
SEQ ID NO:11 Homologyarm-2R
SEQ ID NO:12 Homologyarm-3L
SEQ ID NO:13 Homologyarm-3R
SEQ ID NO:14 Homologyarm-4L
SEQ ID NO:15 Homologyarm-4R
SEQ ID NO:16 IL12 P40氨基酸序列
SEQ ID NO:17 IL12 P35氨基酸序列
SEQ ID NO:18 OX40L氨基酸序列
SEQ ID NO:19 PD-1 scFv氨基酸序列
SEQ ID NO:20 PD-1 scFv的VH氨基酸序列
SEQ ID NO:21 PD-1 scFv的VL氨基酸序列
SEQ ID NO:22
PD-1 scFv的VH CDR1：NSGMH
SEQ ID NO:23
PD-1 scFv的VH CDR2：VIWYDGSKRYYADSVKG
SEQ ID NO:24
PD-1 scFv的VH CDR3：NDDY
SEQ ID NO:25
PD-1 scFv的VL CDR1：RASQSVSSYLA
SEQ ID NO:26
PD-1 scFv的VL CDR2：DASNRAT
SEQ ID NO:27
PD-1 scFv的VL CDR3：QQSSNWPRT
SEQ ID NO:28
信号肽：MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO:29
引物HLA-A-F:TGTTCTAAAGTCCGCACGC
SEQ ID NO:30
引物HLA-A-R：TACCTCATGGAGTGGGAGC
SEQ ID NO:31
引物HLA-C-F：CAGTTCGTGCGGTTCGACAG
SEQ ID NO:32
引物HLA-C-R：GCCTGGCGCTTGTACTTCTG
SEQ ID NO:33
引物HLA-DRB1-F：TGGTCCTGTCCTGTTCTCCA
SEQ ID NO:34
引物HLA-DRB1-R：AGAAACGTGGTCTGGTGTCC
SEQ ID NO:35
引物PD-L1-F：TTGCTGAACGCCCCATACAA
SEQ ID NO:36
引物PD-L1-R：TCCAGATGACTTCGGCCTTG
SEQ ID NO:37
引物CD80-F：CTCAGAAGTGGAGTCTTACCCTG
SEQ ID NO:38
引物CD80-R：TGTTCCTGGGTCTCCAAAGG
SEQ ID NO:39
引物CD83-F：CGCCCACTTGTCCCACTATC
SEQ ID NO:40
引物CD83-R：CATTAGCCCATGCAACAGCC
SEQ ID NO:41
引物CD86-F：TAGCACAGACACACGGATGAG
SEQ ID NO:42
引物CD86-R：ACTGAAGTTAGCAGAGAGCAGG
Claims (41)
- 一种用于治疗癌症患者的方法、或用于改善过继细胞治疗癌症患者的方法，所述方法包括施用a)重组溶瘤病毒组合物，或者b)重组溶瘤病毒组合物与PD-1阻断剂，或者c)(a)或(b)与过继细胞治疗组合物，其中，所述重组溶瘤病毒组合物包含至少一种(例如一种或两种或三种，优选地两种)重组溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒感染受试者的肿瘤细胞并表达外源武装基因，三聚化OX40L和IL12和任选地PD-1阻断剂，其中，所述过继细胞治疗组合物包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中优选地所述TIL细胞与肿瘤细胞来自相同的肿瘤受试者,其中，所述至少一种重组溶瘤病毒是单纯疱疹病毒HSV-1。
- 一种用于在受试者中将肿瘤细胞转化为抗原递呈细胞(APC)的方法，所述方法包括施用：a)重组溶瘤病毒组合物，或者b)重组溶瘤病毒组合物与PD-1阻断剂，或者c)(a)或(b)与过继细胞治疗组合物，其中，所述重组溶瘤病毒组合物包含至少一种(例如一种或两种或三种，优选地两种)重组溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒在感染受试者的肿瘤细胞并表达外源武装基因，三聚化OX40L和IL12和任选地PD-1阻断剂，其中，所述过继细胞治疗组合物包含肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，其中优选地所述TIL细胞与肿瘤细胞来自相同的肿瘤受试者,其中，所述至少一种重组溶瘤病毒是单纯疱疹病毒HSV-1。
- 权利要求1-2任一项的方法，其中，所述重组溶瘤病毒组合物为提供三聚化OX40L和IL-12的两因子重组溶瘤病毒组合物，其包含：(i)一种重组溶瘤病毒，其中所述重组溶瘤病毒在基因组中同时包含编码三聚化OX40L和IL12的多核苷酸；或者(ii)两种重组溶瘤病毒，其中第一重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40L的多核苷酸；第二重组溶瘤病毒在基因组中包含编码IL12的多核苷酸，或者，所述重组溶瘤病毒组合物为提供三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂的三因子重组溶瘤病毒组合物，其包含两种重组溶瘤病毒，其中第一重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸；第二重组溶瘤病毒在基因组中包含编码IL12的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸；优选地，其中所述组合物配制为适用于重组溶瘤病毒施用(优选地瘤内施用)的制剂，再优选地，其中所述重组溶瘤病毒组合物包含两种重组溶瘤病毒，且所述第一和第二重组溶瘤病毒配制在相同或不同的制剂中。
- 权利要求1-3任一项的方法，其中，所述重组溶瘤病毒组合物为包含表达外源三聚化OX40L、IL12和PD-1阻断剂的至少一种重组溶瘤病毒的三因子重组溶瘤病毒组合物，且其中所述方法包括施用(i)所述重组溶瘤病毒组合物，或(ii)所述重组溶瘤病毒组合物与所述过继细胞治疗组合物。
- 权利要求1-3任一项的方法，其中，所述重组溶瘤病毒组合物为包含表达外源三聚化OX40L和IL12的至少一种重组溶瘤病毒的两因子重组溶瘤病毒组合物，且其中所述方法包括施用(i)所述重组溶瘤病毒组合物，或(ii)所述重组溶瘤病毒组合物和所述PD-1阻断剂，或(iii)(i)或(ii)与所述过继细胞治疗组合物。
- 权利要求1-5任一项的方法，其中所述重组溶瘤病毒在基因组中具有单拷贝或优选地双拷贝ICP34.5基因敲除以及ICP47基因敲除。
- 权利要求1-6任一项的方法，其中，编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL-12的多核苷酸，以及任选地编码PD-1阻断剂的多核苷酸，插在所述至少一种重组溶瘤病毒的选自以下的基因组位置：ICP34.5位点、UL3UL4基因间区，UL50UL51基因间区,US1US2基因间区、和UL26UL27基因间区。
- 权利要求1-7任一项的方法，其中，所述编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL12的多核苷酸位于同一重组溶瘤病毒上，且其中优选地，编码三聚化OX40L的多核苷酸插在两个ICP34.5位点且编码IL-12的多核苷酸插在UL26和UL27之间的基因间区。
- 权利要求1-7任一项的方法，其中，所述编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL12的多核苷酸分别位于不同的重组溶瘤病毒上，其中优选地，分别插在病毒基因组的双拷贝ICP34.5位点之一或优选地两者中。
- 权利要求1-9任一项的方法，其中所述重组溶瘤病毒组合物提供PD1阻断剂，优选地，所述编码PD-1阻断剂的多核苷酸插在病毒基因组的UL26和UL27之间的基因间区。
- 权利要求1-10任一项的方法，其中-编码三聚化OX40L的多核苷酸编码从N端至C端包含三聚化结构域(例如，人TRAF2的310至349位氨基酸)、OX40L的胞外域(例如，人OX40L的51-183位氨基酸)和跨膜结构域(例如PDGFR跨膜结构域)的融合多肽；优选地，所述融合多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与其具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列；-编码IL-12的多核苷酸编码包含或由IL-12α多肽和IL-12β多肽组成的IL-12二聚体蛋白；优选地，所述IL-12α多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与其具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列；且IL-12β多肽包含SEQ ID NO:16氨基酸序列或与其具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列；-PD-1阻断剂为抗PD1抗体，优选地抗PD-1单链scFv抗体，更优选地所述抗PD-1 scFv抗体包含SEQ ID NO：20的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:21的VL氨基酸序列。
- 权利要求1-11的方法，其中，重组溶瘤病毒组合物和过继细胞治疗组合物同时或相继以任何顺序施用，优选地，重组溶瘤病毒组合物在过继细胞治疗组合物施用之前施用，更优选地，重组溶瘤病毒组合物的施用与过继细胞治疗组合物的施用之间间隔10小时至72小时，例如，24小时-48小时，例如大约36小时或48小时。
- 权利要求1-12的方法，其中，瘤内施用所述重组溶瘤病毒组合物，优选地，向受试者瘤内施用表达三聚化OX40L和IL2的重组溶瘤病毒。
- 权利要求1-13的方法，其中，瘤内施用所述过继细胞治疗组合物。
- 权利要求1-14的方法，其中还包括向所述受试者施用IL-2蛋白，例如super-IL-2蛋白，优选地腹腔注射施用，优选地，在重组溶瘤病毒和/或TIL细胞施用后，施用所述IL-2蛋白。
- 权利要求1-15的方法，其中所述肿瘤为实体瘤，例如，头颈癌或口腔癌，例如，牙龈癌，颊癌，和舌癌，或消化系统癌症例如结直肠癌，胰腺癌，或脑胶质瘤或黑色瘤，及其转移灶；优选地所述肿瘤为鳞状上皮细胞癌或腺癌。
- 权利要求1-16的方法，其中所述方法还包括：从肿瘤受试者分离肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)；离体扩增所述分离的TIL细胞(优选地，在细胞因子IL-2,IL-7，IL-15和抗CD3抗体存在下扩增所述TIL细胞)；和将扩增的TIL细胞回输给受试者，优选地，在将TIL细胞回输前，用肿瘤细胞与TIL细胞共培养，例如，与DEC混合物刺激的肿瘤细胞共培养以激活TIL细胞。
- 权利要求1-17的方法，其中，相对于TIL细胞单独施用，所述方法包括施用降低剂量的TIL细胞，优选地所述方法还包括施用降低剂量的IL-2。
- 权利要求1-17的方法，其中，肿瘤细胞表面的抗原递呈分子的表达被增加，优选地，所述抗原递呈分子选自以下之一或多种：HLA-A/B/C,HLA-DR/DP/DQ,CD80,CD83和CD86；更优选地选自以下之一或多种或所有：HLA-A,HLA-C,HLA-DRB1,CD80,CD83和CD86。
- 一种两因子重组溶瘤病毒，其中所述重组溶瘤病毒为HSV-1，且在基因组中包含(且优选地仅包含)选自以下的两种外源武装基因：(a)编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸，优选地，所述OX40L编码核酸以双拷贝插入病毒基因组的两个ICP34.5位点且PD-1阻断剂编码核酸插入病毒基因组的UL26UL27基因间区；(b)编码IL12的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸，优选地，所述IL12编码核酸以双拷贝插入病毒基因组的两个ICP34.5位点且PD-1阻断剂编码核酸插入病毒基因组的UL26UL27基因间区；和(c)编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL12的多核苷酸，优选地，所述OX40L编码核酸以双拷贝插入病毒基因组的两个ICP34.5位点且IL12编码核酸插入病毒基因组的UL26UL27基因间区。
- 一种重组溶瘤病毒组合物，其包含一种或多种根据权利要求20的两因子重组溶瘤病毒，优选地，所述组合物包含权利要求20(a)的编码OX40L和PD-1阻断剂的两因子重组溶瘤病毒与权利要求20(b)的编码IL-12和PD-1阻断剂的两因子重组溶瘤病毒的组合，或由其组成；或所述组合物包含权利要求20(c)的编码OX40L和IL-12的两因子重组溶瘤病毒，或由其组成。
- 一种重组溶瘤病毒组合物，其包含至少一种(例如一种或两种或三种，优选地两种)重组HSV-1溶瘤病毒，其中所述至少一种重组溶瘤病毒在感染细胞(优选地肿瘤细胞)后表达外源武装基因，三聚化OX40L和IL12和任选地PD-1阻断剂；优选地，所述重组溶瘤病毒组合物为提供三聚化OX40L和IL-12的两因子重组溶瘤病毒组合物，其包含：(i)一种重组溶瘤病毒，其中所述重组溶瘤病毒在基因组中同时包含编码三聚化OX40L和IL12的多核苷酸；或者(ii)两种重组溶瘤病毒，其中第一重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40L的多核苷酸；第二重组溶瘤病毒在基因组中包含编码IL12的多核苷酸，或者，所述重组溶瘤病毒组合物为提供三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂的三因子重组溶瘤病毒组合物，其包含两种重组溶瘤病毒，其中第一重组溶瘤病毒在基因组中包含编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸；第二重组溶瘤病毒在基因组中包含编码IL12的多核苷酸和编码PD-1阻断剂的多核苷酸。
- 权利要求22的重组溶瘤病毒组合物，其中，编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL-12的多核苷酸，以及任选地编码PD-1阻断剂的多核苷酸，插在所述至少一种重组溶瘤病毒的选自以下的基因组位置：ICP34.5位点、UL3UL4基因间区，UL50UL51基因间区,US1US2基因间区、和UL26UL27基因间区。
- 权利要求22-23任一项的重组溶瘤病毒组合物，其中，所述编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL12的多核苷酸位于同一重组溶瘤病毒上，且其中优选地，编码三聚化OX40L的多核苷酸插在两个ICP34.5位点且编码IL-12的多核苷酸插在UL26和UL27之间的基因间区。
- 权利要求22-23任一项的重组溶瘤病毒组合物，其中，所述编码三聚化OX40L的多核苷酸和编码IL12的多核苷酸分别位于不同的重组溶瘤病毒上，其中优选地，分别插在病毒基因组的双拷贝ICP34.5位点之一或优选地两者中。
- 权利要求25的重组溶瘤病毒组合物，其中所述重组溶瘤病毒组合物提供PD1阻断剂，优选地，所述编码PD-1阻断剂的多核苷酸插在病毒基因组的UL26和UL27之间的基因间区。
- 权利要求20-26的两因子重组溶瘤病毒或重组溶瘤病毒组合物，其中所述重组溶瘤病毒在基因组中具有单拷贝或优选地双拷贝ICP34.5基因敲除以及ICP47基因敲除。
- 权利要求20-27的两因子重组溶瘤病毒或重组溶瘤病毒组合物，其中-编码三聚化OX40L的多核苷酸编码从N端至C端包含三聚化结构域(例如，人TRAF2的310至349位氨基酸)、OX40L的胞外域(例如，人OX40L的51-183位氨基酸)和跨膜结构域(例如PDGFR跨膜结构域)的三聚化OX40L多肽；优选地，所述多肽包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列或与其具有至少90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列；和/或-编码IL-12的多核苷酸编码包含或由IL-12α多肽和IL-12β多肽组成的IL-12二聚体蛋白；优选地，所述IL-12α多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列或与其具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列；且IL-12β多肽包含SEQ ID NO:16氨基酸序列或与其具有至少90％,95％,96％,97％,98％,99％同一性的氨基酸序列；和/或-编码PD-1阻断剂的多核苷酸编码抗PD1抗体，优选地抗PD-1单链scFv抗体，更优选地所述抗PD-1 scFv抗体包含SEQ ID NO：20的VH氨基酸序列和SEQ ID NO:21的VL氨基酸序列。
- 权利要求20-28任一项的两因子重组溶瘤病毒或重组溶瘤病毒组合物，其中编码所述三聚化OX40L、IL-12和PD1阻断剂的多核苷酸与CMV启动子功能性连接。
- 权利要求20-29任一项的两因子重组溶瘤病毒或重组溶瘤病毒组合物，其中，所述三聚化OX40L多肽具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列；和/或所述IL12包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的IL12α和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的IL12β；和/或所述PD1阻断剂为抗PD1单链scFv抗体，包含SEQ ID NO:22-24的HCDR1-HCDR3氨基酸序列和SEQ ID NO:25-27的LCDR1-LCDR3氨基酸序列，优选地，包含SEQ ID NO：20和21的VH氨基酸序列和VL氨基酸序列，更优选地所述scFv抗体包含或由SEQ ID No:19的氨基酸序列组成。
- 一种用于在肿瘤原位将肿瘤细胞转化为抗原递呈细胞(APC)或用于增强肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)活化的方法，其中所述方法包括：用权利要求20-30的两因子重组溶瘤病毒或重组溶瘤病毒组合物感染肿瘤细胞，和使感染了所述重组溶瘤病毒的所述肿瘤细胞接触肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
- 权利要求31的方法，其中所述感染包括将所述重组溶瘤病毒组合物施用(优选瘤内施用)于包含所述肿瘤细胞的受试者，由此使所述感染了所述重组溶瘤病毒的肿瘤细胞与受试者体内的TIL细胞接触。
- 权利要求30-32的方法，其中，所述方法包括：将所述溶瘤病毒组合物联合分离自受试者的TIL施用于受试者，优选地瘤内施用；优选地，所述方法还包括：向受试者施用PD-1阻断剂，优选PD-1抗体。
- 权利要求30-33的方法，其中，所述方法增强肿瘤细胞在其细胞表面的抗原呈递分子表达，和/或增加肿瘤细胞向TIL递呈其自身肿瘤抗原的能力。
- (a)权利要求20-30的两因子重组溶瘤病毒或重组溶瘤病毒组合物；或(b)权利要求20-30的两因子重组溶瘤病毒或重组溶瘤病毒组合物和PD-1阻断剂，或(c)(a)或(b)与包含肿瘤淋巴浸润细胞的过继细胞治疗组合物的组合，在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的用途或在制备用于改善肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)过继治疗肿瘤患者的药物或药物联合中的用途，例如在制备用于权利要求1-19的方法的药物、药盒或药物联合产品中的用途，或在制备用于权利要求31-34的方法的药物、药盒或药物联合产品中的用途。
- 一种联合产品，其包含权利要求21-30的重组溶瘤病毒组合物与(a)PD-1阻断剂；或(b)过继细胞治疗组合物，或(c)(a)和(b)的组合，其中，当联合产品包含PD-1阻断剂时，优选地，所述重组溶瘤病毒组合物为提供三聚化OX40L和IL-12的两因子重组溶瘤病毒。
- 前述任一项权利要求，其中所述重组溶瘤病毒在病毒基因组中包含不超过4种外源武装基因，例如1-4种外源武装基因，优选地不超过3种，更优选地不超过2种外源武装基因。
- 前述任一项权利要求，其中所述重组溶瘤病毒组合物提供总共不超过6种，例如2,3,4,5或6种，优选地4种或3种或2种的外源武装基因。
- 前述任一项权利要求，其中所述TIL可以替代为包含选自T细胞受体修饰的淋巴细胞和嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞的过继细胞治疗组合物。
- 前述任一项权利要求，其中所述受试者是哺乳动物，尤其是人。
- 前述任一项权利要求，其中所述治疗还包括施用其他的治疗剂和/或疗法，例如，细胞因子，例如选自干扰素、TNFa,IL15、IL2，或其他抗癌药物；放疗；化疗；单克隆抗体。
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