CN117157391A - 由用于导入T细胞受体基因的iPS细胞构成的细胞库 - Google Patents

Abstract

提供一种细胞库，其包含从iPS细胞分化诱导的造血干细胞、未成熟T细胞和/或成熟T细胞作为制造中间体，用于快速制造导入患者个体抗原特异性T细胞受体的再生T细胞。构建包含选自iPS细胞和从iPS细胞分化的造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞中的一种或多种细胞的细胞库。所述iPS细胞是通过对已去除B细胞和T细胞的外周血单核细胞进行重编程或对T细胞进行重编程而获得的。使用病毒载体、转座子载体或基因组编辑技术将T细胞受体基因导入所述造血干细胞或所述未成熟T细胞中。使用基因组编辑技术将T细胞受体基因导入所述成熟T细胞中。

Description

由用于导入T细胞受体基因的iPS细胞构成的细胞库

技术领域

本发明涉及一种细胞库，其包含来自作为用于制造导入了识别来自肿瘤或病原体的抗原的T细胞受体(T cell receptor:TCR)基因的人工多能干细胞(iPS细胞)来源的T细胞(再生T细胞)的中间体的iPS细胞的造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞。此外，本发明涉及包含造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞的细胞库用于制造用于癌症的预防和/或治疗的再生T细胞制剂的用途。

背景技术

T细胞在对细菌或病毒等外来病原体或癌细胞等异常细胞的免疫应答中发挥着核心作用。因此，认为T细胞的功能降低会导致癌症和病原体感染的发生。对患有因T细胞功能降低而引起的疾病的患者，T细胞的补充疗法或再生疗法可成为改善患者病情和治疗疾病的极为有效的手段。

在使用人和小鼠的研究中，已知在对癌症或感染症进行T细胞补充疗法时，通过使用特异性地识别癌细胞或被细菌或病毒等外来病原体感染的异常细胞所具有的抗原的T细胞，可以得到较高的治疗效果。另一方面，难以确保足够量的T细胞、制造T细胞需要很长时间、以及当使用源自患者的细胞作为材料时，T细胞的增殖能力降低以及对靶细胞等抗原的免疫应答降低等T细胞耗竭已成为T细胞补充疗法中的障碍。

为了克服T细胞补充疗法中的上述障碍，已经提出了使用从抗原特异性的T细胞建立iPS细胞，使该iPS细胞增殖后分化为T细胞的再生T细胞的T细胞的补充疗法、或者使用从导入了用于识别靶抗原的TCR的iPS细胞分化为T细胞的再生T细胞的T细胞补充疗法。作为制造iPS细胞的原料，通过使用对靶抗原具有特异性的T细胞或识别靶抗原的TCR，可以制造表现出与原T细胞相同抗原特异性的再生T细胞(专利文献1和非专利文献1)。

由iPS细胞制造再生T细胞时，需要长时间的分化培养(专利文献2)。在将已得到的TCR导入同种iPS细胞中时，由于可以保存所制造的再生T细胞，所以再生T细胞的制造期间长不会特别成为问题。另一方面，当把得到的TCR用于与TCR来源个体不同的患者时，存在由于同种异体反应而产生副作用的风险。因此，为了避免风险，使用患者个别抗原特异性TCR的方法备受关注。在癌症中，每个人都有不同的基因突变，这些突变成为作为T细胞治疗的理想靶点的新抗原。迄今为止，针对新抗原的疫苗接种也显示出很高的药效，并且通过使用患者个别抗原特异性TCR的方法制造的治疗剂在癌症治疗中具有巨大的益处。

现有技术文献：

专利文献

专利文献1：WO2011/096482号文本

专利文献2：WO2013/176197号文本

非专利文献

1.Nishimura T,et al.Generation of rejuvenated antigen-specific Tcellsby reprogramming to pluripotency and redifferentiation.Cell Stem Cell.2013；12:114-126.

发明内容

发明要解决的课题

在使用通过iPS细胞制造再生T细胞(iPS-T细胞)治疗癌症及感染症时，使用特异性地识别肿瘤细胞或肿瘤组织、以及感染细胞及感染部位中存在的靶抗原的患者个别的TCR对于确保再生T细胞补充疗法在治疗中的安全性和有效性是重要的。而且，在检测出癌症发病或癌症复发的情况下，迅速开始iPS-T细胞补充疗法，对于提高治疗成绩是很重要的。然而，需要为每个患者单独制造使用患者单独的抗原特异性TCR的细胞制剂，制造所需的劳力和制造周期长的问题妨碍了细胞制剂的开发。特别是在同种再生T细胞制剂中，其制造期间长一直是个问题。

本发明的目的在于构建一种细胞库，该细胞库能够提供一种作为制造中间体的细胞群，所述细胞群包含作为用于快速生产导入了患者个别抗原特异性TCR的iPS-T细胞的、从iPS细胞分化而来的细胞的造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞。此外，本发明包括所述细胞库用于从所述制造中间体制备用于预防和/或治疗癌症或感染症的再生T细胞制剂的用途。

最近的研究表明，对于一个抗原表位，多个T细胞克隆(5～10克隆)分别使用不同的TCR来识别抗原。此外，已明确知晓每个患者对于一个抗原表位都有不同的TCR库。另外，癌细胞在各个患者中具有彼此不同的基因突变，这些突变成为作为T细胞治疗的理想靶点的新抗原。使用从各个患者获得的TCR制造的再生T细胞很可能是具有最合适攻击相应患者体内T细胞治疗的靶点的TCR的T细胞。很明显，使用从各个患者获得的TCR制造的再生T细胞不会产生攻击受体细胞的同种异体反应。因此，在癌症或感染症的预防和/或治疗中，在安全性和药效方面，使用从各个患者获得的TCR制造再生T细胞的益处非常高。

目前，当使用来自患者的细胞的IPS细胞克隆来制造再生T细胞时，其制造所需的时间较长。为了及时向有需要的患者提供再生T细胞补充疗法，缩短制造周期已成为一大课题。

解决课题的方法

本发明人发现通过从对各个患者的肿瘤相关抗原或病原体特异性抗原反应的T细胞群中获得了各种具有抗原特异性的TCR，将该TCR导入从iPS细胞分化诱导而入预先保存的造血干细胞、未成熟T细胞或成熟T细胞，或将其用内源性TCR替代，可以制造再生T细胞；通过由预先从iPS细胞分化诱导的造血干细胞，未成熟T细胞和成熟T细胞构建细胞库，可以大幅缩短再生T细胞的制造周期；并且发现通过将细胞库中所含的细胞作为制备再生T细胞制剂的中间体使用，可以使再生T细胞制剂的均质化和标准化变得容易，并完成了本发明。本发明还可以应用于导入了已得的TCR的再生T细胞和导入了嵌合抗原受体(chimericantigen receptor：CAR)的再生T细胞的制造。

即，本发明的目的通过以下的发明来实现。

[1]一种细胞库，其由用于导入T细胞受体基因的细胞构成，其中，所述细胞是选自iPS细胞和从所述iPS细胞分化的造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞的一种以上的细胞。

[2]根据[1]所述的细胞库，其中，所述细胞是用于进一步导入嵌合抗原受体基因的细胞。

[3]根据[1]或[2]所述的细胞库，其中，所述iPS细胞是受试者的外周血单核细胞，是通过重编程去除了B细胞和T细胞的外周血单核细胞而得到的iPS细胞。

[4]根据[3]所述的细胞库，其中，使用病毒载体、转座子载体或基因组编辑技术将T细胞受体基因导入所述iPS细胞克隆或由所述iPS细胞克隆分化的所述造血干细胞或所述未成熟T细胞中。

[5]根据[1]或[2]所述的细胞库，其中，所述iPS细胞是通过重编程受试者的T细胞而得到的iPS细胞。

[6]根据[5]所述的细胞库，其中，使用基因组编辑技术将T细胞受体基因导入所述成熟T细胞。

[7]根据[1]～[6]任一项中所述的细胞库，其中，所述iPS细胞是向成熟T细胞分化效率良好的iPS细胞克隆。

[8]根据[1]～[7]任一项中所述的细胞库，其中，所述细胞被冷冻保存。

[9]根据[5]所述的细胞库，其中，所述细胞是经过基因修饰以能够控制内源性T细胞受体的表达的细胞。

[10]根据[1]～[9]任一项中所述的细胞库，其中，所述造血干细胞和所述未成熟T细胞是不表达T细胞受体的细胞。

[11]根据[5]所述的细胞库，其中，所述成熟T细胞表达T细胞受体，所述T细胞受体不识别来自与成熟T细胞来源的受试者不同的受试者的非肿瘤细胞。

[12]根据[11]所述的细胞库，其中，所述成熟T细胞识别单一抗原。

[13]根据[12]所述的细胞库，其中，所述单一抗原是流感病毒抗原、EB病毒抗原、HPV抗原、HBV抗原、HCV抗原、HIV抗原、冠状病毒抗原或HTLV抗原。

[14]根据[1]～[13]任一项中所述的细胞库，其中，所述造血干细胞为CD34/CD43双阳性。

[15]根据[1]～[14]任一项中所述的细胞库，其中，所述未成熟T细胞是CD8α链/β链双阳性。

[16]根据[1]～[15]任一项中所述的细胞库，其中，所述成熟T细胞是CD8α链/β链双阳性和TCRα链/β链双阳性。

[17]根据[1]～[16]任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞受体基因是由从受试者获得的T细胞而对肿瘤相关抗原具有反应性的T细胞群中的每单个细胞制备的。

[18]根据[1]～[16]任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞受体基因是由通过将从受试者获得的T细胞与肿瘤相关抗原接触而对所述肿瘤相关抗原具有反应性的T细胞群中的每单个细胞制备的。

[19]根据[1]～[16]任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞受体基因是由将从施用了肿瘤相关抗原的受试者获得的T细胞与所述肿瘤相关抗原接触而对肿瘤相关抗原具有反应性的T细胞群中的每单个细胞制备的。

[20]根据[17]～[19]任一项中所述的细胞库，其中，肿瘤相关抗原选自GPC3、WT1、XAGE1、LMP2、NY-ESO-1、EB病毒抗原和新抗原以及它们的肽片段。

[21]根据[17]～[19]任一项中所述的细胞库，其中，所述肿瘤相关抗原是HLA-A24限制性GPC3肽EYILSLEEL(序列号1)、HLA-A2限制性GPC3肽FVGEFFTDV(序列号2)或它们的混合物。

[22]根据[17]～[19]任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞群是CD3/CD137双阳性。

[23]根据[17]～[19]任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞群和与所述肿瘤相关抗原肽形成复合体的MHC四聚体(Tetramer)或结合。

[24]根据[1]～[23]任一项中所述的细胞库，其中，提供用于获得所述iPS细胞的细胞的受试者和提供用于制备所述T细胞受体基因的细胞的受试者是同一个体。

[25]根据[1]～[23]任一项中所述的细胞库，其中，提供用于获得所述iPS细胞的细胞的受试者和提供用于制备所述T细胞受体基因的细胞的受试者是彼此不同的个体。

[26]根据[1]～[25]任一项中所述的细胞库，其中，用于导入T细胞受体基因或T细胞受体基因和嵌合抗原受体的所述细胞是用于制造癌症预防和/或治疗用的T细胞制剂的中间体。

[27]根据[1]-[26]任一项中所述的细胞库用于制造癌症预防和/或治疗用的T细胞制剂的用途。

[28]一种由根据[1]～[26]任一项中所述的细胞库制造的再生T细胞。

[29]一种含有[28]所述的再生T细胞的药物组合物。

[30]一种使用根据[29]所述的药物组合物的癌症的预防或治疗方法。

发明的效果

由于本发明细胞库含有从iPS细胞分化诱导并预先保存的造血干细胞、未成熟T细胞和/或成熟T细胞，因此，将从作为癌症治疗或感染症治疗对象的受试者采集的TCR或已得的TCR或CAR向这些细胞进行基因导入可以在短时间内制造再生T细胞。因此，可以显著缩短从导入了抗原特异性TCR的再生T细胞的制造到将该再生T细胞用于治疗所需要的时间，并且能够稳定地确保治疗所需要的量的再生T细胞。此外，本发明的细胞库可以使用从非T非B细胞或单核细胞诱导的iPS细胞克隆或者从T细胞诱导的iPS细胞克隆的任一种来构建。如果将TCR导入从非T非B细胞或单核细胞诱导的iPS细胞克隆分化的造血干细胞、未熟T细胞及成熟T细胞，使这些细胞分化为再生T细胞，然后进行扩增培养时，难以发生TCR基因的重构，因此保持了导入的TCR的抗原特异性，结果提高了再生T细胞制剂的安全性。另外，通过使用构成本发明的细胞库的细胞，能够制造源于扩增培养的耗竭较少的再生T细胞。此外，在使用构成本发明的细胞库的iPS细胞制造再生T细胞时，预先筛选向T细胞的分化效率良好的iPS细胞克隆并用作构成细胞库的细胞，可以最小化再生T细胞的生产批次之间的细胞产量和细胞分化程度的变动以及采集细胞的受试者的个体差异对所获得的再生T细胞的质量等的影响。此外，通过使用本发明的细胞库，可以高效且迅速地制造具有识别抗原并高效杀伤靶标的TCR的T细胞。

将编码TCR的cDNA向细胞中导入是对在预先从iPS细胞分化诱导的、构成本发明的细胞库的源自iPS细胞的分化细胞，即从iPS细胞分化的造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞进行的。由于构成细胞库的细胞是由克隆的iPS细胞分化诱导的，因此该细胞的质量更均质且稳定。对于源自iPS细胞的分化细胞，即从iPS细胞分化的造血干细胞、未成熟T细胞或成熟T细胞，用于一次TCR导入的细胞数为10⁷～10⁹个或更多，本发明的细胞库可以以等份形式含有1000次或更多次TCR导入所需的细胞数。因此，预计实施一次TCR导入的成本将会降低。所以，在应用再生T细胞补充疗法的癌症治疗中，对于作为治疗对象的癌症患者的肿瘤的抗原变化或治疗耐性的表达或癌症的复发，也能够迅速且容易地进行对所表达的抗原具有特异性的再生T细胞的准备。

关于导入本发明细胞库中所包括的细胞中的TCR，采集用于制备编码TCR的cDNA的T细胞的受试者可以是与作为再生T细胞补充疗法的治疗对象的癌症患者受试者相同的个体，也可以是彼此不同的个体。因此，可以为每个癌症患者选择安全有效且具有最佳抗原特异性的TCR。

附图说明

图1是由从iPS细胞分化诱导、构成细胞库的成熟T细胞制造肿瘤特异性再生T细胞的图。向成熟T细胞导入肿瘤特异性TCR是使用CRISPR/Cas9等基因组修饰技术进行基因替换进行的。从向细胞导入TCR到向患者施用TCR导入细胞所需的期间约为2周。成熟T细胞中表达的TCR优选是不诱导同种异体反应的TCR。导入细胞中的TCR是从计划施用再生T细胞制剂的癌症患者获得的TCR、已经获得的癌症特异性TCR或癌症特异性CAR。

图2是由从iPS细胞分化诱导、构成细胞库的未成熟T细胞制造肿瘤特异性再生T细胞的图。向未成熟T细胞导入肿瘤特异性TCR是使用CRISPR/Cas9等基因组修饰技术进行基因替换或使用慢病毒或转座子载体等进行的。从向细胞导入TCR到向患者施用TCR导入细胞所需的期间约为4周。导入细胞中的TCR是从计划施用再生T细胞制剂的癌症患者获得的TCR、已经获得的癌症特异性TCR或癌症特异性CAR。

图3示出了使用转座子将TCR基因导入造血干细胞、未成熟T细胞或成熟T细胞的步骤。

图4示出了由iPS细胞诱导的成熟T细胞(CD8阳性细胞毒性T细胞)的表型。构成细胞库的成熟T细胞采用图4所示的表型。

图5示出了作为由iPS细胞诱导的成熟T细胞中的细胞老化标记，对端粒进行分析的结果。

图6示出了作为由iPS细胞诱导的成熟T细胞中的细胞耗竭标记，对PD-1和TIGHT分子的表达进行分析的结果。

图7示出了由iPS细胞诱导的未成熟T细胞(CD8阳性未成熟T细胞)的表型。构成细胞库的未成熟T细胞采用图7所示的表型。

图8示出了在成熟T细胞阶段导入了GPC3抗原特异性TCR基因的源自iPS细胞的成熟T细胞的表型。CD19基因是与所述TCR基因串联到同一转座子载体中的基因，用作向宿主染色体的基因插入和基因表达的标记。

图9说明了在从外周血T细胞已重编程的iPS细胞制造再生T细胞的步骤中，筛选向T细胞分化效率高的iPS细胞克隆的方法。

图10说明了在从外周血T细胞已重编程的iPS细胞制造再生T细胞的步骤中，通过对被筛选为向T细胞分化效率高的细胞的iPS细胞克隆进行基因组编辑来制造再生T细胞的方法。将该再生T细胞作为宿主T细胞的主细胞库。

图11说明了由宿主T细胞制造识别癌抗原的再生T细胞的方法。

图12示出了从外周血T细胞已重编程的同种iPS细胞制造再生T细胞的步骤的概略。将分化的T细胞作为宿主T细胞的主细胞库。

具体实施方式

在本发明中，“细胞库”是由用于导入T细胞受体基因的细胞构成的多种细胞的集合体。还可以将CAR导入到构成细胞库的细胞中。本发明的细胞库由选自iPS细胞和从所述iPS细胞分化的造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞的一种以上的细胞构成。使用本发明的细胞库中包含的细胞，可以制造用于预防和/或治疗癌症或感染症的再生T细胞。“细胞集合体”是指根据细胞的来源、细胞分化的阶段等对细胞进行划分，将它们分别分装到独立的细胞容器中并进行蓄积的细胞集合体。本发明的细胞库可以储存在能够冷冻保存细胞的任何设施或储存库中。

〔细胞〕

在本发明中，构成细胞库的“成熟T细胞”是从iPS细胞分化诱导的分化细胞，是作为细胞表面抗原表达CD3和CD4或CD8，并且在细胞表面表达功能性TCR的细胞，所述功能性TCR能够响应在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex)上呈递的抗原而诱导细胞增殖、细胞因子产生和细胞毒性。TCR包括由α链和β链组成的异二聚体、以及由γ链和δ链组成的异二聚体。具有由α链和β链组成的TCR的T细胞称为αβ型T细胞，具有由γ链和δ链组成的TCR的T细胞称为γδ型T细胞。在本发明的一个实施方案中，本发明的成熟T细胞优选是CD3/αβ型T细胞，但也可以是CD3/γδ型T细胞。成熟T细胞可以是表达已完成TCR基因重构的内源性TCR的细胞，也可以是表达外源性导入的TCR的细胞。

在本发明中，构成细胞库的“未成熟T细胞”是从iPS细胞诱导分化的分化细胞，但是正处于分化为T细胞的过程中并且在细胞表面未表达TCR的细胞。未成熟T细胞包括从CD4/CD8双阴性细胞到CD4/CD8双阳性细胞、进一步到CD8单阳性细胞的各个阶段的T细胞。未成熟T细胞上表达的CD8优选是CD8αβ异二聚体，但也可以是CD8αα同二聚体。

在本发明中，构成细胞库的“造血干细胞”是指能够分化为淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、红细胞、巨核细胞等血细胞系细胞的细胞。注意，造血干细胞和造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPC)互不区分，只要没有特别说明，是指相同的细胞。造血干细胞或造血祖细胞例如通过表面抗原CD34和CD43是双阳性的而被识别。

在本发明中，“经过基因修饰以能够控制内源性TCR表达的细胞”是指，通过使用微RNA等的方法或通过用四环素调控的启动子替换内源性TCR启动子等而经过基因修饰以抑制或控制内源TCR表达的细胞。

在本发明中，由构成细胞库的成熟T细胞表达的TCR识别单一抗原并且不产生或几乎不产生同种异体反应。上述TCR识别的抗原包括流感病毒抗原、EB病毒抗原、HPV抗原、HBV抗原、HCV抗原、HIV抗原、冠状病毒抗原、HTLV抗原和癌症抗原。

在本发明中，被导入到构成细胞库的细胞中的TCR识别的抗原是在肿瘤中特异性或非特异性表达的抗原，包括来源于在肿瘤细胞中过表达的蛋白质的抗原及其变异体、来源于肿瘤病毒的抗原、某些分化抗原以及由于基因突变和剪接异常而产生的新型肿瘤相关抗原(新抗原)等。在本说明书中，肿瘤相关抗原也可以称为肿瘤抗原。如果是蛋白质抗原，它可以是通过将抗原片段化而获得的肽(肽片段)。作为在肿瘤中特异性或非特异性表达的抗原，可以举出WT1、GPC3、XAGE1、MUC1、MUC5AC、MUC6、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、MAGEA1、端粒酶、PRAME、SSX2/4、PSCA、CTLA-4、gp100、GD2、GD3、岩藻糖基GM1、GM3、sLe(a)、糖脂F77、间皮素、PD-L1、trp1、trp2、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33、c-Met、p53、p53变体、NY-ESO-1、PSMA、ETV6-AML、CEA、PSA、AFP、hTERT、EpCAM、ALK、雄激素受体、EphA2、CYP1B1、OY-TES-1、MAD-CT-2、MelanA、/MART1、生存素、Ras、Ras突变体、ERG、bcr-abl、XBP1等，但不限于此。作为病毒抗原，可以举出灭活的HBV和HPV等灭活病毒，以及源自各种病毒的蛋白质，例如EBVLMP1、EBV LMP2、EBNA(EBV核抗原)、HPV E1、HPV E2、HPV E6、HPV E7、HBV HBsHTLV-1Tax及HBZ(HTLV-1bZIP Factor)等，但不限于此。

在本发明的一个实施方案中，被导入到构成细胞库的细胞中的TCR识别的抗原可以选自GPC3、WT1、XAGE1、LMP2、NY-ESO-1、EB病毒抗原和新抗原及它们的肽片段。

在本发明的一个实施方案中，被导入到构成细胞库的细胞中的TCR识别的抗原是作为HLA-A24限制性GPC3肽的EYILSLEEL，作为HLA-A2限制性GPC3肽的FVGEFFTDV，或它们的混合物。另外，在本发明中，氨基酸由常用的单字母缩写表示。

在本发明中，“对特异性抗原具有反应性”是指T细胞具有T细胞通过TCR选择性地结合/缀合在抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex:MHC)I类或II类所呈递的肿瘤相关抗原来源的表位肽上而发生的反应，并且指T细胞不发生向上述表位肽以外的表位肽结合/缀合的反应。通过经由TCR与源自MHC I类或II类呈递的肿瘤相关抗原的表位肽结合/缀合而产生的T细胞反应的实例包括细胞毒性、IFN-γ和颗粒酶的产生、T细胞活化标记物的表达和NF-AT等转录因子的活化。

在本发明中，导入到构成细胞库的细胞中的TCR是从癌症患者或非癌症患者的受试者中采集的。采集T细胞的受试者可以是已施用过癌症疫苗、正在施用或预计未来施用癌症疫苗的癌症患者，也可以是未施用癌症疫苗的非癌症患者。可以施用一种或多种癌症疫苗。癌症疫苗是包含疫苗抗原的组合物，所述疫苗抗原是癌症或肿瘤特异性蛋白质或肽，源自癌症或肿瘤相关抗原，用于诱导癌症或肿瘤特异性免疫应答。通常，癌症疫苗包含用于增强疫苗抗原诱导的特异性免疫应答的佐剂。T细胞优选为αβT细胞。作为T细胞的采集源，由于侵袭性低，因此优选外周血，但不限于此。作为其他优选的采集源，可以举出癌症组织或肿瘤组织、淋巴结或其他组织或器官、或血液、脐带血、淋巴液、组织液(组织间液、细胞间液和间质液)、体腔液(腹水、胸膜液、心包液、脑脊液、关节液和房水)。在本发明的一个实施方案中，优选的T细胞是源自肿瘤组织的T细胞。源自肿瘤组织的T细胞通常是肿瘤浸润的T细胞。

当受试者是癌症患者时，所述癌症患者的癌症选自卵巢癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、神经母细胞肿瘤、慢性淋巴细胞白血病、甲状腺乳头状癌、结直肠癌或B细胞非霍奇金淋巴瘤。所述癌症优选为肝细胞癌或肝母细胞瘤。

在本发明中，iPS细胞可以通过重编程非T非B细胞或单核细胞来制备。另外，也可以是已经由非T非B细胞或单核细胞制成的细胞。“非T非B细胞”是指既不分类为T细胞也不分类为B细胞的单核细胞。非T非B细胞可以通过采集外周血单核细胞，然后去除单核细胞中含有的T细胞和B细胞来制备。使用单核细胞分离溶液可以从人全血中分离外周血单核细胞。作为单核细胞分离溶液，例如可以举出为了从单核细胞中去除B细胞和T细胞，可以利用针对B细胞具有的表面抗原CD19、CD20、CD22或B细胞受体、以及T细胞具有的表面抗原CD3、CD4或CD8，而使用例如流式细胞术或磁珠如/> 珠。

“T细胞”可以作为外周血单核细胞采集，然后制备成表达CD3和CD8的细胞。为了从外周血单核细胞中纯化T细胞，可以利用针对T细胞表面抗原的CD3、CD4或CD8的抗体，而使用例如流式细胞术或磁珠如珠。

iPS细胞的制造方法是本领域公知的。在本发明中，可以优选地通过将细胞重编程因子导入非T非B细胞或单核细胞或T细胞来诱导iPS细胞。作为细胞重编程因子，可以举出Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、klf4、klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas和ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3和Glis1等基因或基因产物。这些细胞重编程因子可以单独使用，也可以组合使用。在这些细胞重编程因子中，从高效地建立iPS细胞的观点出发，优选将Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc(所谓的Yamanaka4因子)导入上述非T非B细胞或单核细胞或T细胞。

对于将细胞重编程因子导入上述非T非B细胞、单核细胞或T细胞的方法没有特别限制，可以采用本领域公知的方法。例如，在将编码所述细胞重编程因子的基因导入所述非T非B细胞、单核细胞或T细胞时，将编码所述细胞重编程因子的基因(例如，cDNA)插入含有在细胞内发挥作用的启动子的表达载体中，可以通过感染、脂质转染法、脂质体法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、显微注射法或电穿孔法将该表达载体导入细胞中。当细胞重编程因子为蛋白质的形式，将该蛋白质导入非T非B细胞或单核细胞或T细胞时，使用蛋白质导入试剂的方法或使用蛋白质导入域融合蛋白的方法、电穿孔法和显微注射法。当细胞重编程因子是信使RNA(mRNA)的形式，将该mRNA导入非T非B细胞或单核细胞或T细胞时，使用mRNA导入试剂的方法以及将其添加到培养基中的方法。

作为用于通过感染进行基因导入的表达载体，例如可以举出慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和仙台病毒等病毒载体和动物细胞表达质粒，但从不易产生插入变异、且基因导入效率高、导入基因的复制数也多的角度来看，优选使用仙台病毒将编码所述细胞重编程因子的基因导入所述细胞中。

作为将编码所述细胞重编程因子的基因导入细胞时所使用的表达载体中使用的启动子，可以举出SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、RSV启动子、HSV-TK启动子、泛素启动子等。这些启动子也可以是能够通过四环素等药物的有无等来控制插入该启动子下游的基因的表达的物质。除了启动子之外，表达载体还可以含有增强子、polyA加尾信号、筛选标记基因(例如新霉素抗性基因)、SV40复制起点等。

作为用于培养重编程获得的iPS细胞的培养基，没有特别限制，可以使用用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基，并向其中添加用于维持iPS细胞的未分化能力的细胞因子类来制备。作为基础培养基，例如可以举出Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、培养基199，Eagle最低必需培养基(EMEM)、αMEM培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Ham F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer培养基、神经基础培养基(Life TechnologiesCo.)、AK03N(Ajinomoto Healthy Supply Co.)及其混合培养基。可以向培养基中添加血清，或者也可以是无血清的。作为细胞因子类，优选为bFGF，培养基中其浓度例如为1～100μg/mL(优选50μg/mL)。

在本发明的一个实施方案中，iPS细胞的培养方法可以是粘附培养或悬浮培养，优选粘附培养。作为iPS细胞的分离方法，例如可以举出使用细胞刮刀等进行物理分离的方法，以及使用具有蛋白酶活性的解离溶液、具有胶原酶活性的解离溶液、或具有蛋白酶活性和胶原酶活性的解离溶液(例如，和/>等)的分离方法。

在本发明的一个实施方案中，当iPS细胞达到1×10³～1×10⁴细胞/cm²、1×10⁴～1×10⁵细胞/cm²或1×10⁵～1×10⁶细胞/cm²的细胞密度时，优选将其传代到另一个培养容器中。传代次数可以是任意次数，只要能够得到所需量的iPS细胞即可，优选为1～5次或5～10次。

通过导入Yamanaka因子重编程的iPS细胞由大量iPS细胞克隆组成。如后所述，为了筛选向T细胞分化效率良好的iPS细胞克隆，优选通过菌落拾取来进行iPS细胞的克隆化。作为菌落拾取的方法，没有特别限定，可以使用在显微镜下使用移液器的方法、极限稀释法以及使用全自动菌落选择器的方法等。所得到的iPS细胞克隆储存1种以上，优选储存3种以上，更优选储存6种以上，以构成细胞库。在细胞库中，优选冷冻保存iPS细胞克隆。细胞冷冻保存的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，可以回收培养的iPS细胞克隆，用缓冲液或培养基洗涤，在细胞数计数后，通过离心分离等浓缩，悬浮于冷冻介质(例如含有10％DMSO的培养基)中后，低温冷冻保存。在另一个实施方案中，还可以使用作为已经建立的iPS细胞克隆，向T细胞的分化效率良好的克隆。

“分化效率”是指在从iPS细胞到造血干细胞、从造血干细胞到未成熟T细胞和从未成熟T细胞到成熟T细胞的每个分化阶段中，造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞分别在所有活细胞中的存在比例。每个分化阶段的分化细胞的鉴定可以通过表面标记的FACS分析来进行。将向造血干细胞的分化效率表示为CD34/CD43双阳性细胞占所有活细胞的比例，将向未成熟T细胞的分化效率表示为CD4/CD8双阳性细胞占所有活细胞的比例或CD5阳性细胞占所有活细胞的比例，另外，将向成熟T细胞的分化效率表示为所有活细胞中CD8α链、CD8β链、TCRα链和TCRβ链全部呈阳性的细胞的比例。

“分化效率良好”是指在从iPS细胞向造血干细胞的分化中，作为造血干细胞的CD34/CD43双阳性细胞的比例为5％～15％或更高；在从造血干细胞向未成熟T细胞的分化中，作为未成熟T细胞的CD4/CD8双阳性细胞的比例或CD5阳性细胞的比例分别为10％以上或50％以上；在从未成熟T细胞向成熟T细胞的分化中，CD8α链、CD8β链、TCRα链和TCRβ链全部呈阳性的细胞的比例为50％以上。

本发明中的成熟T细胞优选首先将所述iPS细胞克隆分化为造血干细胞，然后将所述造血干细胞分化为未成熟T细胞，最后将未成熟T细胞转化为CD8单阳性T细胞来制备。本发明中的未成熟T细胞优选通过首先将所述iPS细胞克隆分化为造血干细胞，然后将所述造血干细胞分化为未成熟T细胞来制备。本发明中的造血干细胞优选通过将所述iPS细胞克隆分化为造血干细胞来制备。

[造血干细胞和未成熟T细胞的培养]

造血干细胞优选通过在添加维生素C的培养基中培养iPS细胞来制备。此处，“维生素C”是指L-抗坏血酸及其衍生物，“L-抗坏血酸衍生物”是指在生物体内通过酶促反应转化为维生素C的物质。作为L-抗坏血酸的衍生物，例如可以举出维生素C磷酸酯、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸乙酯、维生素C酯、抗坏血酸四己基癸酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯和抗坏血酸-2-磷酸-6-棕榈酸酯。L-抗坏血酸的衍生物优选为维生素C磷酸盐，例如可以举出磷酸-L-抗坏血酸钠或磷酸-L-抗坏血酸镁等磷酸-L-抗坏血酸盐。维生素C例如以5μg/mL～500μg/mL的浓度包含在培养基中。

用于制造造血干细胞的培养基没有特别限制，可以将用于动物细胞培养的培养基作为基础培养基并向其中添加维生素C等来制备。作为基础培养基，例如可以举出Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、培养基199，Eagle最低必需培养基(EMEM)、αMEM培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Ham F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer培养基、神经基础培养基(Life Technologies Co.)、StemPro34(Life Technologies Co.)及其混合培养基。培养基可以含有血清，或者也可以是无血清的。根据需要，基础培养基可以含有选自例如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、单硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子量化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐和细胞因子等中的一种或多种物质。

在用于制造造血干细胞的培养基中，可以进一步添加选自BMP4(骨形态发生蛋白4)、VEGF(血管内皮生长因子)、bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，SCF(干细胞因子)、TPO(血小板生成素)和FLT3L(Flt3配体)的细胞因子。它们的浓度，例如BMP4为1～100ng/mL，VEGF为1～100ng/mL，bFGF为1～100ng/mL，SCF为10～100ng/mL，TPO为1～100ng/mL，FLT3L为1～100ng/mL。

在造血干细胞的培养基中，可以将TGFβ抑制剂添加到培养基中。“TGFβ抑制剂”是指干扰TGFβ家族信号传导的低分子抑制剂，例如可以举出SB431542和SB202190(R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer2:20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908和SD208(Scios)，以及LY2109761、LY364947和LY580276(LillyResearch Laboratories)，其添加到培养基中的浓度优选为0.5～100μM。

iPS细胞可与C3H10T1/2(Takayama N.，et al.J Exp Med.2817-283010)或异种来源的基质细胞(Niwa Aet al.J Ce 11Physiol.2009Nov；221(2)：367-77)等饲养细胞共培养。

造血干细胞制造时的iPS细胞的培养方法可以是粘附培养，也可以是悬浮培养，优选悬浮培养。例如，iPS细胞可以在所使用的培养皿中释放培养的菌落80％融汇后，进行悬浮培养并将它们分离成单细胞。作为iPS细胞的分离方法，例如可以举出使用细胞刮刀等进行物理分离的方法、使用具有蛋白酶活性和胶原酶活性的解离溶液(例如，和等)、或使用具有胶原酶活性的解离溶液的分离方法。

悬浮培养是指以细胞不粘附于培养容器的状态培养细胞。悬浮培养没有特别限制，可以在未经过人工处理(例如，用细胞外基质等进行涂覆处理)的培养容器中进行，以提高与细胞的粘附性，或者使用经过人工处理以抑制粘附的培养容器(例如，用聚羟乙基甲基丙烯酸酯(poly-HEMA)或非离子表面活性剂多元醇(Pluronic F-127等)进行涂覆处理)来进行。当进行悬浮培养时，优选形成拟胚体(EB)进行培养。在将拟胚体悬浮培养而得到造血干细胞时，优选将其解离成单细胞后进行粘附培养。

造血干细胞也可以由通过培养iPS细胞获得的囊样结构(也称为iPS-sac)来制备。此处，“囊样结构”是指源自iPS细胞的立体囊状(内部具有空间)结构体，其是由内皮细胞群等形成，内部含有造血干细胞的结构体。

用于从iPS细胞制造造血干细胞的培养温度条件没有特别限制，例如为约37℃～约42℃左右，优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养时间，本领域技术人员可以在监测造血干细胞的细胞数量等的同时适当地确定。只要能够获得造血干细胞，培养天数没有特别限制，例如为至少6天以上、7天以上、8天以上、9天以上、10天以上、11天以上、12天以上、13天以上、或14天以上，优选14天。培养时间长在造血干细胞的制造中不成为问题。此外，培养可在低氧条件下进行，在本发明的一个实施方式中，低氧条件例如可以举出15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或低于此的氧浓度。

“CD4/CD8双阳性T细胞”是对表面抗原CD4和CD8均呈阳性(CD8⁺CD4⁺)的T细胞，由于T细胞可以通过表面抗原CD3和CD45呈阳性来识别，因此CD4/CD8双阳性T细胞可以被鉴定为对CD4、CD8、CD3和CD45呈阳性的细胞。CD4/CD8双阳性T细胞可被诱导分化为CD4单阳性细胞或CD8单阳性细胞。

CD4/CD8双阳性T细胞可以通过包括在添加p38抑制剂和/或SDF-1的培养基中培养造血干细胞的步骤的方法来制造。

“p38抑制剂”被定义为抑制p38蛋白(p38MAP激酶)功能的物质。p38抑制剂包括但不限于例如p38的化学抑制剂、p38的显性负性突变体、或编码其的核酸。

作为p38的化学抑制剂，可以举出SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB202190(4-(4-氟苯基)-2)-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物，SB239063(反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇)及其衍生物、SB220025及其衍生物、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCl0-469、SCIO-323、SCIO-323、VX-702或FR167653，但不限于此。这些化合物是市售的，例如可从Calbiochem公司获得SB203580、SB202190、SC239063、SB220025和PD169316，可从Scios公司等获得SCl0-469和SCIO-323。p38抑制剂以例如约1μM～约50μM添加至培养基中。

作为p38的显性负性突变体，可以举出使位于p38的DNA结合区域的180位苏氨酸点突变为丙氨酸的p38T180A，以及人和小鼠体内p38的182位酪氨酸点突变为苯丙氨酸的p38Y182F。

SDF-1(基质细胞衍生因子1)不仅是SDF-1α或其成熟型，还可以是SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε或SDF-1φ等亚型，或它们的成熟型，也可以是它们的任意比例的混合物等。优选使用SDF-1α。另外，SDF-1有时也被称为CXCL-12或PBSF。

只要SDF-1具有作为趋化因子的活性，其氨基酸序列中的一个或多个氨基酸可以被取代、缺失和/或添加，并且糖链也可以同样地被取代或缺失和/或添加。只要SDF-1中至少保留4个半胱氨酸残基(在人SDF-1α的情况下为Cys30、Cys32、Cys55和Cys71)且其与天然形式的氨基酸序列具有90％以上的同一性，则允许氨基酸突变。SDF-1可以来自哺乳动物，例如人，或非人哺乳动物，例如猴、羊、牛、马、猪、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。例如，作为人的SDF-1α，可以使用在GenBank中注册的注册号为NP_954637的蛋白质，作为SDF-1β，可以使用在GenBank中注册的注册号为NP_000600的蛋白质。

SDF-1可以使用市售的产品，也可以使用从天然产物中纯化的产品，或者也可以使用通过肽合成或基因工程方法制造的产品。例如，将SDF-1以约10ng/mL～约100ng/mL的范围添加到培养基中。

用于制备CD4/CD8双阳性T细胞的培养基没有特别限制，可以通过将用于动物细胞培养的培养基作为基础培养基，并向其中添加p38抑制剂和/或SDF-1，更优选添加维生素C来制备。另外，CD4/CD8双阳性T细胞的制造中使用的维生素C的种类例如如上所述，维生素C的浓度例如为5～200μg/mL。作为基础培养基，例如可以举出Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、培养基199，Eagle最低必需培养基(EMEM)、αMEM培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Ham F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer神经基础培养基(LifeTechnologies Co.)及其混合培养基。培养基可以含有血清，或者也可以是无血清的。根据需要，基础培养基可以含有选自例如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子量化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐和细胞因子等中的一种或多种物质。

用于制备CD4/CD8双阳性T细胞的培养基中还可以添加选自SCF、TPO(血小板生成素)、FLT3L和IL-7的细胞因子。它们的浓度，例如SCF为10～100ng/mL、TPO为10～200ng/mL、FLT3L为1～100ng/mL、IL-7为1～100ng/mL。

造血干细胞可以粘附培养或悬浮培养，优选粘附培养。在粘附培养的情况下，培养容器可以被涂覆来使用。例如，作为涂层剂，可以举出基质胶(Niwa A,et al.PLoS One.6(7):e22261,2011)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、纤维连接蛋白、Fc-DLL4或巢蛋白，及其组合。

培养造血干细胞以制造CD4/CD8双阳性T细胞时的培养温度条件没有特别限制，例如优选约37℃～约42℃左右，更优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养时间，本领域技术人员可以在监测CD4/CD8双阳性T细胞的细胞数量等的同时适当地确定。只要能够获得CD4/CD8双阳性T细胞，培养天数没有特别限制，例如为至少10天以上、12天以上、14天以上、16天以上、18天以上、20天以上、22天以上、或23天以上，优选23天。

得到的CD4/CD8双阳性T细胞可以分离使用，也可以作为含有其他细胞类型的细胞群使用。分离时，可以使用本领域技术人员众所周知的方法。例如，可以举出用针对CD4、CD8、CD3和/或CD45的抗体进行标记并使用流式细胞仪进行分离的方法，或者使用其上固定有所需抗原的亲和柱等进行纯化的方法。

“CD8单阳性T细胞”是T细胞中表面抗原CD8呈阳性的细胞(CD8⁺CD4^-)，也称为细胞毒性T细胞。由于T细胞可以通过表面抗原CD3和CD45是阳性的来识别，因此CD8单阳性T细胞可以被鉴定为CD8、CD3和CD45是阳性的而CD4是阴性的细胞。

CD8单阳性T细胞可以通过以下方法制造，所述方法包括在添加有皮质类固醇的培养基中培养CD4/CD8双阳性T细胞的步骤。

皮质类固醇优选为糖皮质激素或其衍生物，例如醋酸可的松、氢化可的松、醋酸氟氢可的松、泼尼松龙、去炎松、甲基强的松龙、地塞米松、倍他米松或二丙酸倍氯米松。优选地，皮质类固醇是地塞米松。其在培养基中的浓度例如为1～100nM。

用于制造CD8单阳性T细胞的培养基没有特别限制，可以将用于动物细胞培养的培养基作为基础培养基，向其中添加肾上腺皮质激素来制备。作为基础培养基，例如可以举出Iscove改良的Dulbecco培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium，IMDM)、培养基199，Eagle最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)、αMEM培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle’sMedium，DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer神经基础培养基(Fischer’s Neurobasal Medium)(LifeTechnologiesCo.)及其混合培养基。培养基中可以添加血清，或者也可以是无血清的。根据需要，基础培养基可以含有选自例如白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫代甘油、单硫代甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、生长因子、低分子量化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐和细胞因子等中的一种以上物质。

用于制备CD8单阳性T细胞的培养基优选进一步含有抗CD3抗体、维生素C或细胞因子。作为该细胞因子，例如可以举出IL-2、IL-7、IL-15及IL-21等。

作为抗CD3抗体，只要是特异性地识别CD3的抗体就没有特别限定，例如可以举出由OKT3克隆产生的抗体。抗CD3抗体在培养基中的浓度例如为10～1000ng/mL。

CD8单阳性T细胞的制备中使用的维生素C类例如是上述那些，可以在与上述相同的条件下使用。

用于制备CD8单阳性T细胞的细胞因子在培养基中的浓度例如为：IL-2为10～1000U/mL，IL-7为1～100ng/mL。

培养用于制造CD8单阳性T细胞的CD4/CD8双阳性T细胞时的温度条件没有特别限定，例如优选约37℃～约42℃左右，更优选约37℃～约38℃左右。另外，关于培养时间，本领域技术人员可以在监测CD8单阳性T细胞的细胞数量等的同时适当地确定。只要能够获得CD8单阳性T细胞，培养天数没有特别限制，例如为至少1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、或5天以上，优选3天。

[编码TCR的cDNA的制备]

在本发明中，优选对单个细胞制备分别编码导入构成细胞库的细胞的TCRα链和β链的cDNA。从受试者采集的T细胞是整体上具有遗传多样性的T细胞群，每个T细胞所具有的识别TCR的抗原或肽序列已经确定，每个T细胞的抗原特异性不同。为了选择对每个肿瘤相关抗原最佳的TCR，即对每个肿瘤相关抗原具有高反应性的TCR，优选对单个细胞制备cDNA。

[编码CAR的cDNA的制备]

在本发明中，关于编码导入到构成细胞库的细胞中的CAR的cDNA，是通过接头和细胞跨膜位点(例如CD8分子的跨膜位点)，将和靶细胞表面抗原结合的抗体或噬菌体或配体或受体的靶结合位点与CD3ζ基因和CD28或CD137的细胞内信号位点连接的基因构建在质粒载体或病毒载体上来制备。

优选将从受试者获得的T细胞与目标肿瘤相关抗原一起培养和增殖。可以使用活化标记通过细胞分选仪等从对所用肿瘤相关抗原有反应的T细胞群中分离单个细胞。作为活化标记，优选细胞表面CD137。作为用于分离人T细胞的已知方法，例如可以举出使用CD3和CD137等针对T细胞表面标志物的抗体和细胞分选仪的流式细胞术。使用PCR方法从获得的单个T细胞进行基因克隆，可以扩增分别编码TCRα链和β链的cDNA。

[通过单细胞PCR分离TCR基因]

为了获得单细胞，可以将从外周血等中获得的对肿瘤抗原具有特异性的CD8阳性T细胞和与抗原肽形成复合物的MHC Dextramer(注册商标)结合，使用细胞分选仪进行单细胞分选。MHC Dextramer是由MHC与荧光色素分子结合而成的葡聚糖聚合物骨架构成的化合物。可以使用MHC四聚体代替MHC Dextramer。MHC四聚体是指抗原肽和MHC分子的复合物通过生物素和抗生物素蛋白制成的四聚体。在另一个实施方案中，可以在所述抗原的存在下将对获自外周血等的肿瘤抗原具有特异性的CD8阳性T细胞进行培养并使其增殖，然后使用细胞分选仪对CD3/CD137双阳性细胞进行单细胞分选。在另一个实施方案中，可以使用细胞分选仪从CD3/CD137双阳性细胞中，对与抗原肽形成复合体的MHC Dextramer结合的细胞群进行单细胞分选。从得到的单细胞中提取RNA，可以使用通过逆转录反应得到的cDNA通过PCR法分离TCR基因对(TCRα链基因和TCRβ链基因)。可以对分离的TCR基因对进行序列分析，以分析肿瘤抗原反应性T细胞的种类(TCR库)及其出现频率。

[载体的构建]

可以使用例如吉布森组装系统将以分离的TCR的cDNA作为模板扩增的PCR片段整合到病毒载体或非病毒载体(转座子载体)中。具体而言，将分离的TCRα链基因和TCRβ链基因通过T2A序列连接而得到的基因连接在泛素启动子的下游，进而在其下游连接相对于IRES(内部核糖体进入位点)序列去除了配体结合部位和细胞内结构域的EGFR(EGFRt，截短的EGFR)或缺失细胞内结构域的CD19等标记基因，并将该构建体整合到病毒载体或非病毒载体中。作为载体，可以使用病毒载体和非病毒载体，优选非病毒载体。作为非病毒载体，在转座子载体中也优选PiggyBac载体。转座子方法与现有的病毒载体方法相比，是廉价且安全的新一代基因导入方法。

〔TCR cDNA的细胞导入〕

作为将分别编码TCRα链和β链的cDNA对导入向T细胞的分化状态良好的非T非B细胞或源自单核细胞的iPS细胞克隆、从所述iPS细胞克隆分化的所述造血干细胞或从所述造血干细胞分化的所述未熟T细胞的方法，可以采用使用病毒载体的方法或使用非病毒载体的方法中的任一种。作为病毒载体，可以举出慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和仙台病毒等病毒载体，以及动物细胞表达质粒，优选逆转录病毒或慢病毒。进行逆转录病毒或慢病毒感染时，优选使用旋转感染法等。使用非病毒载体时，优选转座子法。作为使用非病毒载体的基因导入方法，可以举出脂转染法、脂质体法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法和电穿孔法。PCR产物也可以不使用载体直接导入细胞。优选使用电穿孔将转座子载体或PCR产物导入细胞中。作为电穿孔装置，ExPERT(注册商标)系统(MaxCyte公司)的基因导入装置是优选的。

作为将所述cDNA对导入所述细胞时使用的表达载体中使用的启动子，例如可以举出EF-1α启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子、RSV启动子、HSV-TK启动子、泛素启动子等。这些启动子可以是通过四环素等药物的有无等来控制插入该启动子下游的基因表达的物质。除了启动子之外，表达载体还可以含有增强子、polyA添加信号、选择标记基因(例如新霉素抗性基因)、SV40复制起点等。

[使用基因组编辑技术将TCR导入成熟T细胞]

可以使用基因组编辑技术将TCR导入成熟T细胞。关于作为目标的内源TCRα链和β链基因序列，确认其序列(包括上游)，制备对内源TCRα链和β链基因具有高切割活性且不切割靶基因以外的基因组上的序列的向导RNA(用于正义链的向导RNA和用于反义链的向导RNA)。同时，制备在作为导入对象的TCRα链和β链的插入位点上游和下游含有同源重组位点的供体DNA。通过将所述向导RNA、Cas9和所述供体DNA导入成熟T细胞，可以导入目标TCR。上述向导RNA、Cas9及上述供体DNA的导入可以通过使用病毒载体、非病毒载体及电穿孔法等来进行。内源性TCR作为目标的TCR被取代的成熟T细胞可以根据与靶肿瘤相关抗原的结合作为指标来选择。

导入了上述cDNA对的由上述iPS细胞克隆分化的上述造血干细胞、由上述造血干细胞分化的上述未成熟T细胞和成熟T细胞，通过在上述培养基、培养基组成、培养温度等培养条件下培养，可以得到表达由上述cDNA对分别编码的α链和β链组成的TCR的再生T细胞。例如，可以基于使用TCRVβ分析试剂盒(BECKMAN COULTER公司，目录号IM-3497)对TCRβ基因的全库分析来确认是否表达目标TCR。由于在载体中整合了EGFRt(截短的EGFR)和CD19t(截短的CD19)等标记基因，因此可以通过分析标记基因的表达来推测TCRα链和β链的表达。

[再生T细胞的制造]

通过将对肿瘤相关抗原具有反应性的TCR对导入构成本发明细胞库的成熟T细胞、未成熟T细胞或造血干细胞，可以开始制造再生T细胞。因此，能够迅速地制造用于癌症或感染症的预防和/或治疗的再生T细胞。

〔TCR取得源的T细胞〕

作为与肿瘤相关抗原对应的TCR对的取得源的T细胞，优选从患者肿瘤组织或患者外周血中采集。如果需要预先向受试者施用肿瘤相关抗原以使肿瘤相关抗原特异性T细胞出现在肿瘤组织或外周血中，则优选在向受试者施用所述肿瘤相关抗原后从肿瘤组织或外周血中采集T细胞。作为此类肿瘤相关抗原，例如可以举出GPC3。另一方面，即使不施用肿瘤相关抗原在外周血中也存在肿瘤特异性T细胞的情况下，也可以不施用肿瘤相关抗原，例如使用MHC Dextramer从外周血中分离肿瘤相关抗原特异性T细胞.作为此类肿瘤相关抗原，例如可以举出WT1、NYESO-1和EBV抗原等。

如上所述，在向受试者施用肿瘤相关抗原之后或未施用肿瘤相关抗原而从受试者的肿瘤组织或外周血采集的T细胞，无论在哪种情况下，优选在试管内用肿瘤相关抗原刺激，扩增肿瘤应答性的细胞群后可以使用活化标记进行细胞分离。在外周血中，如果肿瘤相关抗原特异性T细胞的出现频率极高，则可以不在试管内进行肿瘤相关抗原的刺激。

当采集用于获得TCR对的T细胞的受试者和要通过使用导入所获得的TCR的再生T细胞的再生T细胞补充疗法进行癌症治疗的受试者是不同的个体时，则优选确认所述TCR对不会引起作为癌症治疗对象的受试者的细胞发生同种异体反应。

[药物组合物]

含有通过将抗原特异性TCR导入本发明的iPS细胞来源的分化细胞中而制备的再生T细胞的药物组合物可用于癌症和感染症治疗。本发明的药物组合物可以通过药物制剂技术领域中常用的方法来制备，例如日本药典中记载的方法等。本发明的药物组合物可以含有药学上可接受的添加剂。作为该添加剂，例如可以举出细胞培养基、生理盐水和适当的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)。

所述药物组合物可以通过将再生T细胞悬浮在生理盐水或合适的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)等中制备。为了达到所期望的治疗效果，优选单剂量含有例如1×10⁷个以上的细胞。细胞含量更优选为1×10⁸个以上，进一步更优选为1×10⁹个以上。可以考虑给药对象的性别、年龄、体重、患处的状态和细胞的状态等适当地调节细胞含量。为了保护细胞，所述药物组合物除了作为有效成分的再生T细胞外，还可以含有二甲基亚砜(DMSO)和血清白蛋白等。此外，为了防止细菌混入，其可以含有抗生素等以及用于促进细胞的活化和分化的维生素、细胞因子等。此外，所述药物组合物可以含有药学上可接受的其他成分(例如，载体、赋形剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浮液、止痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。

构成本发明的细胞库的造血干细胞、未成熟T细胞或成熟T细胞按照1次TCR导入中的用量(1×10⁷～1×10⁹)进行分注，可以冷冻保存。在冷冻保存的情况下，储存温度没有特别限制，只要其适合于细胞的保存即可。例如，可以举出-150℃～-196℃，优选-150℃以下。在冷冻保存的情况下，优选将细胞保存在冷冻小瓶及冷冻袋等适当的容器中。用于使再生T细胞在冷冻和解冻期间细胞损伤的风险最小化的操作是本领域技术人员所熟知的。

构成本发明细胞库的细胞的保存量优选为TCR导入能够实施1000次或以上的数量。

所述药物组合物用于预防和/或治疗癌症或感染症。作为癌症，可以举出卵巢癌、肝母细胞瘤、肝细胞癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌、子宫宫颈癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、慢性淋巴细胞白血病、甲状腺乳头状癌、结肠癌或B细胞非霍奇金淋巴瘤，但不限于此。

下面根据实施例对本发明进行说明，但本发明不限于以下实施例。

实施例1

[使用由iPS细胞制造的分化细胞构建的细胞库制造再生T细胞(1)]

图1示出了从构成本发明细胞库的成熟T细胞制备抗原特异性再生T细胞的步骤。将从源自患者的T细胞中分离出的与肿瘤抗原X特异性反应的TCR基因、现有的针对肿瘤抗原X特异性的TCR基因、或针对肿瘤抗原X特异性的嵌合受体基因导入构成细胞库的成熟T细胞中。从构成细胞库的成熟T细胞制造再生T细胞所需的时间约为2周。由于用于癌症治疗的再生T细胞可以在上述时间段内制造，因此即使正在接受癌症治疗的患者肿瘤复发或肿瘤细胞发生突变，也可以再次筛选用于治疗的有效TCR基因。对于肿瘤抗原X特异性的TCR基因或CAR基因的导入，可以采用使用了CRISPR/Cas9等的基因组编辑或者慢病毒或转座子载体。图3示出了使用转座子导入TCR基因的步骤。

使用由iPS细胞制造的成熟T细胞构建本发明的细胞库，该细胞库是冷冻细胞的集合体。所述成熟T细胞是识别单一抗原且不引起同种异体反应的T细胞，将构成所述细胞库的冷冻细胞解冻后，向肿瘤导入特异性TCR。

在本发明的细胞库中，可以通过向从iPS细胞分化诱导并预先冷冻保存的成熟T细胞导入与肿瘤抗原X反应的TCR基因来进行再生T细胞的制造。因此，与依次进行iPS细胞的制备步骤、从iPS细胞向成熟T细胞的分化诱导步骤以及向成熟T细胞导入TCR基因来制造再生T细胞的步骤的情况相比，能够在更短时间(约2周)内制造肿瘤特异性再生T细胞。因此，肿瘤特异性再生T细胞可以快速施用于患者。

分析了如上所述从iPS细胞诱导的成熟T细胞(肿瘤抗原特异性CD8阳性细胞毒性T细胞)的表型。用流式细胞仪根据细胞表面的抗原标记物分析再生T细胞的结果如图4所示。从iPS细胞诱导的成熟T细胞被确认表达CD45⁺TCRαβ⁺CD3⁺CD4^-CD8αβ⁺，其被发现在活体内成熟的细胞毒性T细胞中表达。

对于由iPS细胞诱导分化并构成本发明的细胞库的成熟T细胞，分析作为细胞老化标记物的端粒(恢复活力的指标)的结果如图5所示。与患者外周血单核细胞的端粒长度(A)和再生前的肿瘤抗原特异性T细胞的端粒长度(B)相比，由所述肿瘤抗原特异性T细胞(C)制造的iPS细胞的端粒长度约为3倍，此外，肿瘤抗原特异的再生T细胞(D)的端粒长度约为2倍，在(C)和(D)中证实端粒长度恢复。即在由构成本发明细胞库的细胞制备的再生T细胞中表明细胞老化的改善。

对于由iPS细胞诱导分化并构成本发明的细胞库的成熟T细胞，将与免疫检查点相关的细胞衰竭标记之一的PD-1和TIGIT分子的表达用抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体染色，并用流式细胞仪分析。为了进行比较，还分析了再生前的肿瘤抗原特异性T细胞。结果如图6所示。确认了与再生前的肿瘤抗原特异性T细胞相比，本发明的再生T细胞显著降低了PD-1和TIGIT分子的表达。因此，表明本发明的再生T细胞具有高细胞毒性活性。

实施例2

[使用由iPS细胞制造的分化细胞构建的细胞库制造再生T细胞(2)]

图2示出了从构成本发明细胞库的未成熟T细胞制备抗原特异性再生T细胞的步骤。将从源自患者的T细胞中分离出的与肿瘤抗原X特异性反应的TCR基因、现有的针对肿瘤抗原X特异性的TCR基因、或针对肿瘤抗原X特异性的嵌合受体基因导入构成细胞库的未成熟T细胞中。即使正在接受癌症治疗的患者肿瘤复发或肿瘤细胞发生突变，也可以再次筛选有效用于治疗的TCR基因。从构成细胞库的未成熟T细胞制造再生T细胞所需的时间约为4周。对于肿瘤抗原X特异性的TCR基因或CAR基因的导入，可以采用使用了CRISPR/Cas9等的基因组编辑或者慢病毒或转座子载体。

使用由iPS细胞制造的未成熟T细胞构建本发明的细胞库，该细胞库是冷冻细胞的集合体。所述未成熟T细胞是不表达T细胞受体的T细胞，将构成所述细胞库的冷冻细胞解冻后，导入肿瘤特异性TCR。

在本发明的细胞库中，可以通过向从iPS细胞分化诱导并预先冷冻保存的未成熟T细胞导入与肿瘤抗原X反应的TCR基因来进行再生T细胞的制造。因此，与依次进行iPS细胞的制备步骤、从iPS细胞向未成熟T细胞的分化诱导步骤以及向未成熟T细胞导入TCR基因来制造再生T细胞的步骤的情况相比，能够在更短时间(约4周)内制造肿瘤特异性再生T细胞。因此，肿瘤特异性再生T细胞可以快速施用于患者。

分析了如上所述从iPS细胞诱导的未成熟T细胞(肿瘤抗原特异性CD8阳性细胞毒性T细胞)的表型。用流式细胞仪根据细胞表面的抗原标记物分析未成熟T细胞的结果如图7所示。从iPS细胞诱导的未成熟T细胞被确认表达CD45⁺TCRαβ^-CD3⁺CD4^±CD8αβ⁺，其被发现在活体内成熟的细胞毒性T细胞中表达。

实施例3

[iPS细胞克隆的制备]

从肝细胞癌或肝母细胞瘤患者中采集的外周血中，使用单核细胞分离液Lymphoprep(注册商标)分离出单核细胞。从获得的单核细胞中，使用FACS或MACS珠去除CD19/CD20阳性B细胞和CD3/CD4/CD8阳性T细胞，以获得非T非B细胞或单核细胞。用获得的非T非B细胞或单核细胞群感染装载了山中四因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)的仙台病毒(CytoTune(注册商标)2.0)和编码SV40Tag的仙台病毒，其MOI(感染复数)为5至20。注意SV40可以省略。

获得的iPS细胞由许多iPS细胞克隆组成。因此，挑选并克隆了菌落。所有克隆的iPS细胞均被冷冻保存。将克隆的iPS细胞在分化培养基中培养约10天以诱导造血干细胞，并分离出CD34/CD43双阳性造血干细胞。将分离的造血干细胞在涂有FcDLL4(其为DLL4蛋白质和免疫球蛋白的Fc区的融合蛋白质)的平板上培养约21天，并分化为T细胞。

通过CD8α链/β链双阳性率验证上述培养21天后获得未成熟细胞毒性T细胞的频率，并筛选CD8α链/β链双阳性细胞出现频率最高的克隆。

将几个向T细胞的分化效率良好的iPS细胞克隆通过iPS细胞维持培养基进行两周的扩增培养，然后将其分注到细胞储存容器中，然后进行冷冻保存，从而构建了一个主细胞库。

实施例4

[将TCR基因导入到iPS细胞克隆]

对于在实施例2中获得并源自向T细胞的分化效率良好的非T非B细胞或单核细胞的iPS细胞克隆，使用电穿孔法导入具有编码T细胞受体α和β链的基因(其中肿瘤抗原特异性已被确认)的piggyBac(注册商标)转座子载体。然后，使用标记分子CD19的表达作为指标，通过细胞分选仪分离表达目标T细胞受体α链和β链的iPS细胞。将分离的iPS细胞在分化培养基中培养约10天，诱导CD34/CD43双阳性造血干细胞并通过细胞分选仪分离。将分离的血液干细胞在涂布有FcDLL4的平板上培养约21天，进行向T细胞的分化诱导。

使用细胞分选仪分离纯化上述培养21天后获得的CD8α链/β链双阳性未成熟T细胞。然后，在存在PHA(植物血凝素)和作为饲养细胞的外周血单核细胞的情况下、在存在RetroNectin(注册商标)和抗CD3抗体的情况下、或在存在抗CD3抗体和抗CD28抗体的情况下，将未成熟T细胞共培养，以诱导为成熟细胞毒性T细胞。这些刺激进行了一次以上。所获得的T细胞的性能通过GPC3特异性靶标细胞的细胞毒性活性、IFN-γ的产生和抗原结合能力来确认。

实施例5

[将TCR基因导入到从iPS细胞克隆分化的成熟T细胞]

对于由实施例3中获得的并源自向T细胞的分化效率良好的非T非B细胞或单核细胞的iPS细胞克隆经过造血干细胞和未成熟T细胞而分化的成熟T细胞，使用piggyBac(注册商标)系统以与实施例4相同的方式导入编码GPC3抗原特异性T细胞受体α链和β链的基因(cDNA)。

用流式细胞仪分析基因导入的源自iPS细胞的成熟T细胞的表型的结果如图8所示。在图8中，“No EP”示出了作为用于基因导入的所述成熟T细胞的、表达了WT1抗原特异性T细胞受体α链和β链的成熟T细胞的分析结果。“EGFP”示出了导入了整合有作为基因导入操作标志的示踪基因(EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因)的表达载体的所述成熟T细胞的分析结果。“Empty-CD19”示出了导入了仅整合有作为示踪基因的细胞内缺损型人CD19基因的PiggyBac(注册商标)转座子载体的所述成熟T细胞的分析结果。“TCR-CD19”示出了导入了串联整合有GPC3抗原特异性T细胞受体α链/β链基因和细胞内缺损型人CD19基因的PiggyBac(注册商标)转座子载体的所述成熟T细胞的分析结果。

在由“No EP”表示的源自iPS细胞的成熟T细胞中，仅检测到T细胞标记CD3。即，用于基因导入的细胞被确认是T细胞。

在由“EGFP”表示的源自iPS细胞的成熟T细胞中，检测到CD3基因和EGFP基因的表达。即，可以看出已经适当地进行了基因导入操作。

在由“Empty-CD19”表示的源自iPS细胞的成熟T细胞中，检测到CD3基因和整合至PiggyBac(注册商标)转座子载体中的作为示踪基因的细胞内缺损型人CD19基因的表达。即，可以看出已经适当地进行了基因导入操作。

在由“TCR-CD19”表示的源自iPS细胞的成熟T细胞中，除了表达CD3基因和整合至PiggyBac(注册商标)转座子载体中的作为示踪基因的细胞内缺损型人CD19基因外，还检测到与GPC3抗原特异性T细胞受体α链和β链识别的GPC3肽/HLA复合物(GPC3-Dex)的结合。即，已经表明，通过使用PiggyBac(注册商标)系统将GPC3抗原特异性T细胞受体α链和β链基因导入到源自iPS细胞的成熟T细胞中，在所述细胞上表达的GPC3抗原特异性T细胞受体α链和β链作为识别GPC3肽/HLA复合物(GPC3-Dex)的分子起作用。因此，已经表明，通过使用新型肿瘤相关抗原(新抗原)和对其他肿瘤相关抗原特异性的T细胞受体α链/β链基因作为导入至源自iPS细胞的成熟T细胞中的T细胞受体α链/β链基因，可以制备识别这些抗原的源自iPS细胞的成熟T细胞。

实施例6

[从已将外周血T细胞重编程的iPS细胞生产再生T细胞]

图9示出了在由外周血T细胞已重编程的iPS细胞制造再生T细胞的步骤中筛选向T细胞的分化效率高的iPS细胞克隆的方法。从感染了EBV(Epstein-Barr病毒)的受试者的外周血中分离出单核细胞，在试管中用EBV抗原刺激分离的单核细胞，分离识别EBV抗原的CD8阳性T细胞群。使用仙台病毒载体将山中四因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)和SV40T抗原导入分离的CD8阳性T细胞群中，以获得iPS细胞群。从获得的iPS细胞群中分离出iPS细胞克隆，对于每个克隆，检查了向T细胞的分化能力，并筛选了向T细胞的分化效率高的iPS细胞克隆。识别EBV抗原的T细胞是即使在同种异体移植的情况下也难以引起同种异体反应的细胞。

图10示出了在由外周血T细胞重编程的iPS细胞制造再生T细胞的步骤中，对被筛选为向T细胞的分化效率高的细胞的iPS细胞克隆进行基因组编辑并制造再生T细胞的方法。关于源自识别EBV抗原的CD8阳性T细胞并向T细胞的分化效率高的iPS细胞克隆，使用CRISPR/cas9删除了与MHC I类和MHC II类表达有关的β2M和CIITA基因、与活化自然杀伤细胞(NK)有关的PVR基因、和与T细胞受体重排有关的Rag2基因，另一方面，表达了作为NK细胞的抑制性配体的β2M/结合肽/HLA-E的融合基因(HLA-E*)，从而使iPS细胞免受宿主的T细胞和NK细胞的攻击。在所述基因组编辑中，可以通过表达药物诱导型caspase9等自杀基因和/或特异性标记基因(EGFR(表皮生长因子受体)、CD19和CD20))，在给予到活体中后将细胞去除。基因组编辑后，进行了重新克隆。当确认向T细胞的分化效率高后，可以将源自iPS细胞的再生T细胞的克隆保存，以构建主细胞库。由iPS细胞分化和增殖的再生T细胞是用于制造治疗癌症的再生T细胞的宿主T细胞，并且可以由宿主T细胞构建主细胞库。所述宿主T细胞可用作制备已导入TCR基因或CAR(嵌合抗原受体)基因的再生T细胞的材料。由于所述宿主T细胞是识别EBV抗原的T细胞，因此即使转移到活体中，也难以引起同种异体反应。“宿主T细胞”是指该细胞本身不用于患者治疗，而是用作制造将再生T细胞作为活性成分的癌症预防剂或治疗剂的起始材料的T细胞。

图11示出了用于制造来自所述宿主T细胞的、识别癌症抗原的再生T细胞的方法。在识别EBV抗原的宿主T细胞中，通过使用CRISPR/cas9的基因组编辑进行的基因置换，识别发生重排的EBV抗原的T细胞受体β链被隔着分别识别癌症抗原的T细胞受体β链和T细胞受体α链的T2a的连接体取代。另一方面，通过使用CRISPR/cas9进行基因组编辑，去除了识别EBV抗原的T细胞受体α链。根据图11所述的方法，可以制造识别癌症抗原的再生T细胞。

图12总结了图9至11所示的方法。由外周血T细胞已重编程的同种通用iPS细胞制造的再生T细胞(iPS-T细胞)可以用作制备导入了TCR基因或CAR基因的T细胞的起始材料。“通用iPS细胞”是指由于低免疫原性，即使对具有任何种类的MHC(MajorHistocompatibility Complex；主要组织相容性复合体)的患者也可以在不引起排斥反应的情况下使用的iPS细胞。即，它们是可以在不考虑MHC匹配的情况下即可施用于患者的iPS细胞。通用iPS细胞可以通过敲除MHC I类或MHC II类分子并表达抑制NK细胞的配体来制备。

为了导入TCR基因或CAR基因，可以使用用于现有的T细胞补充疗法或再生疗法的T细胞的制造中使用的病毒载体。通过使用iPS-T细胞作为起始材料，可以在短时间内制造作为癌症预防或治疗剂的活性成分的所需的T细胞。此外，导入识别新抗原的TCR也很容易，并且通过导入多个识别不同新抗原的TCR基因，还可以在保持多克隆特性的同时制造iPS-T细胞。

序列表

<110> 赛雅思株式会社

<120>由用于导入T细胞受体基因的iPS细胞构成的细胞库

<130>

<160> 2

<170>

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220> 肿瘤相关抗原

<223> HLA-A24限制性GPC3表位肽

<400> 1

Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220> 肿瘤相关抗原

<223> HLA-A2限制性GPC3表位肽

<400> 2

Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val

1 5

Claims (30)

1.一种细胞库，其由用于导入T细胞受体基因的细胞构成，其中，所述细胞是选自iPS细胞和从所述iPS细胞分化的造血干细胞、未成熟T细胞和成熟T细胞的一种以上的细胞。

2.根据权利要求1所述的细胞库，其中，所述细胞是用于进一步导入嵌合抗原受体基因的细胞。

3.根据权利要求1或2所述的细胞库，其中，所述iPS细胞是受试者的外周血单核细胞，是通过重编程去除了B细胞和T细胞的外周血单核细胞而得到的iPS细胞。

4.根据权利要求3所述的细胞库，其中，使用病毒载体、转座子载体或基因组编辑技术将T细胞受体基因导入所述iPS细胞克隆或由所述iPS细胞克隆分化的所述造血干细胞或所述未成熟T细胞中。

5.根据权利要求1或2所述的细胞库，其中，所述iPS细胞是通过重编程受试者的T细胞而得到的iPS细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞库，其中，使用基因组编辑技术将T细胞受体基因导入所述成熟T细胞。

7.根据权利要求1至6任一项中所述的细胞库，其中，所述iPS细胞是向成熟T细胞分化效率良好的iPS细胞克隆。

8.根据权利要求1至7任一项中所述的细胞库，其中，所述细胞被冷冻保存。

9.根据权利要求5所述的细胞库，其中，所述细胞是经过基因修饰以能够控制内源性T细胞受体的表达的细胞。

10.根据权利要求1至9任一项中所述的细胞库，其中，所述造血干细胞和所述未成熟T细胞是不表达T细胞受体的细胞。

11.根据权利要求5所述的细胞库，其中，所述成熟T细胞表达T细胞受体，所述T细胞受体不识别来自与成熟T细胞来源的受试者不同的受试者的非肿瘤细胞。

12.根据权利要求11所述的细胞库，其中，所述成熟T细胞识别单一抗原。

13.根据权利要求12所述的细胞库，其中，所述单一抗原是流感病毒抗原、EB病毒抗原、HPV抗原、HBV抗原、HCV抗原、HI V抗原、冠状病毒抗原或HTLV抗原。

14.根据权利要求1至13任一项中所述的细胞库，其中，所述造血干细胞为CD34/CD43双阳性。

15.根据权利要求1至14任一项中所述的细胞库，其中，所述未成熟T细胞是CD8α链/β链双阳性。

16.根据权利要求1至15任一项中所述的细胞库，其中，所述成熟T细胞是CD8α链/β链双阳性和TCRα链/β链双阳性。

17.根据权利要求1至16任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞受体基因是由从受试者获得的T细胞而对肿瘤相关抗原具有反应性的T细胞群中的每单个细胞制备的。

18.根据权利要求1至16任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞受体基因是由通过将从受试者获得的T细胞与肿瘤相关抗原接触而对所述肿瘤相关抗原具有反应性的T细胞群中的每单个细胞制备的。

19.根据权利要求1至16任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞受体基因是由将从施用了肿瘤相关抗原的受试者获得的T细胞与所述肿瘤相关抗原接触而对所述肿瘤相关抗原具有反应性的T细胞群中的每单个细胞制备的。

20.根据权利要求17至19任一项中所述的细胞库，其中，肿瘤相关抗原选自GPC3、WT1、XAGE1、LMP2、NY-ESO-1、EB病毒抗原和新抗原以及它们的肽片段。

21.根据权利要求17至19任一项中所述的细胞库，其中，所述肿瘤相关抗原是HLA-A24限制性GPC3肽EYILSLEEL(序列号1)、HLA-A2限制性GPC3肽FVGEFFTDV(序列号2)或它们的混合物。

22.根据权利要求17至19任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞群是CD3/CD137双阳性。

23.根据权利要求17至19任一项中所述的细胞库，其中，所述T细胞群和与所述肿瘤相关抗原肽形成复合体的MHC四聚体或结合。

24.根据权利要求1至23任一项中所述的细胞库，其中，提供用于获得所述iPS细胞的细胞的受试者和提供用于制备所述T细胞受体基因的细胞的受试者是同一个体。

25.根据权利要求1至23任一项中所述的细胞库，其中，提供用于获得所述iPS细胞的细胞的受试者和提供用于制备所述T细胞受体基因的细胞的受试者是彼此不同的个体。

26.根据权利要求1至25任一项中所述的细胞库，其中，用于导入T细胞受体基因或T细胞受体基因和嵌合抗原受体的所述细胞是用于制造癌症预防和/或治疗用的T细胞制剂的中间体。

27.根据权利要求1至26任一项中所述的细胞库用于制造癌症预防和/或治疗用的T细胞制剂的用途。

28.一种由根据权利要求1至26任一项中所述的细胞库制造的再生T细胞。

29.一种含有权利要求28所述的再生T细胞的药物组合物。

30.一种使用根据权利要求29所述的药物组合物的癌症的预防或治疗方法。