CN112513255A - 介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法 - Google Patents
介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112513255A CN112513255A CN201980048222.1A CN201980048222A CN112513255A CN 112513255 A CN112513255 A CN 112513255A CN 201980048222 A CN201980048222 A CN 201980048222A CN 112513255 A CN112513255 A CN 112513255A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- cell population
- cell
- population
- regenerative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 320
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 214
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 title claims description 56
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 107
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 100
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 100
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 90
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 43
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 46
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 claims description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 claims description 9
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 claims description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 3
- 208000005228 Pericardial Effusion Diseases 0.000 claims description 3
- 210000002203 alpha-beta t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004912 pericardial fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims 1
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 63
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 49
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 44
- 102100032530 Glypican-3 Human genes 0.000 description 30
- 101001014668 Homo sapiens Glypican-3 Proteins 0.000 description 30
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 29
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 27
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 26
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 22
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 22
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- -1 EPR-MRA Proteins 0.000 description 12
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 11
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 11
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 11
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 8
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 8
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 8
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 8
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 102000002574 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Human genes 0.000 description 8
- 108010068338 p38 Mitogen-Activated Protein Kinases Proteins 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 8
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102100020715 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Human genes 0.000 description 7
- 101710162577 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand protein Proteins 0.000 description 7
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 5
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 5
- 239000012826 P38 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 5
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 5
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 4
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 4
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 4
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 4
- QHKYPYXTTXKZST-UHFFFAOYSA-N SB-202190 Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C(C=2C=CN=CC=2)N1 QHKYPYXTTXKZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003470 adrenal cortex hormone Substances 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101000896234 Homo sapiens Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Proteins 0.000 description 3
- 101000877379 Homo sapiens ETS-related transcription factor Elf-3 Proteins 0.000 description 3
- 101000617130 Homo sapiens Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 3
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 3
- 102000043525 human CXCL12 Human genes 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 3
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 3
- 235000011649 selenium Nutrition 0.000 description 3
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 3
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 3
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 3
- JBNWDYGOTHQHOZ-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[4-[(4-fluorophenyl)methyl]piperidine-1-carbonyl]-6-methoxy-1-methylindol-3-yl]-n,n-dimethyl-2-oxoacetamide Chemical compound COC1=CC=2N(C)C=C(C(=O)C(=O)N(C)C)C=2C=C1C(=O)N(CC1)CCC1CC1=CC=C(F)C=C1 JBNWDYGOTHQHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010008655 Epstein-Barr Virus Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 2
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 2
- 101000980827 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD1a Proteins 0.000 description 2
- 101000716149 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD1b Proteins 0.000 description 2
- 101000716124 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD1c Proteins 0.000 description 2
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 239000002211 L-ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 235000000069 L-ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000000996 L-ascorbic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 2
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 2
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 2
- MIJPAVRNWPDMOR-UHFFFAOYSA-N [2-(1,2-dihydroxyethyl)-3-hydroxy-5-oxo-2h-furan-4-yl] dihydrogen phosphate Chemical compound OCC(O)C1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 108010074108 interleukin-21 Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000003716 rejuvenation Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 2
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 2
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- DBSABEYSGXPBTA-RXSVEWSESA-N (2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O DBSABEYSGXPBTA-RXSVEWSESA-N 0.000 description 1
- FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,4r,5r,6s)-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-[(2r,4r,5r,6s)-4,5,6-trihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1[C@@H](CO)O[C@@H](OC2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O FYGDTMLNYKFZSV-URKRLVJHSA-N 0.000 description 1
- RQVKVJIRFKVPBF-VWLOTQADSA-N 2-[[(2s)-2-amino-3-phenylpropyl]amino]-3-methyl-5-naphthalen-2-yl-6-pyridin-4-ylpyrimidin-4-one Chemical compound C([C@H](N)CNC=1N(C(C(C=2C=C3C=CC=CC3=CC=2)=C(C=2C=CN=CC=2)N=1)=O)C)C1=CC=CC=C1 RQVKVJIRFKVPBF-VWLOTQADSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEOVWJYINDYNSM-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-fluorophenyl)-2-(4-methylsulfonylphenyl)-1H-imidazol-5-yl]pyridine Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)C)=CC=C1C1=NC(C=2C=CC(F)=CC=2)=C(C=2C=CN=CC=2)N1 XEOVWJYINDYNSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQUSFAUAYSEREK-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-fluorophenyl)-5-(2-methoxy-4-pyrimidinyl)-1-imidazolyl]-1-cyclohexanol Chemical compound COC1=NC=CC(C=2N(C=NC=2C=2C=CC(F)=CC=2)C2CCC(O)CC2)=N1 ZQUSFAUAYSEREK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004261 Ascorbyl stearate Substances 0.000 description 1
- LITUBCVUXPBCGA-WMZHIEFXSA-N Ascorbyl stearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O LITUBCVUXPBCGA-WMZHIEFXSA-N 0.000 description 1
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010001572 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000000806 Basic-Leucine Zipper Transcription Factors Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 101100257372 Caenorhabditis elegans sox-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N Cortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)CC2=O ITRJWOMZKQRYTA-RFZYENFJSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 208000020402 Enthesitis-related juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010069621 Epstein-Barr virus EBV-associated membrane antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001103039 Homo sapiens Inactive tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000972282 Homo sapiens Mucin-5AC Proteins 0.000 description 1
- 101000972278 Homo sapiens Mucin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101001103036 Homo sapiens Nuclear receptor ROR-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 101001136981 Homo sapiens Proteasome subunit beta type-9 Proteins 0.000 description 1
- 101000880770 Homo sapiens Protein SSX2 Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000814512 Homo sapiens X antigen family member 1 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150072501 Klf2 gene Proteins 0.000 description 1
- MLSJBGYKDYSOAE-DCWMUDTNSA-N L-Ascorbic acid-2-glucoside Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)=C1O MLSJBGYKDYSOAE-DCWMUDTNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102100022430 Melanocyte protein PMEL Human genes 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M Methylprednisolone sodium succinate Chemical compound [Na+].C([C@@]12C)=CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@](O)(C(=O)COC(=O)CCC([O-])=O)CC[C@H]21 FQISKWAFAHGMGT-SGJOWKDISA-M 0.000 description 1
- 208000003445 Mouth Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100022496 Mucin-5AC Human genes 0.000 description 1
- 102100022493 Mucin-6 Human genes 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101000804949 Mus musculus Developmental pluripotency-associated protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100257376 Mus musculus Sox3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101150072008 NR5A2 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001894 Nasopharyngeal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010061306 Nasopharyngeal cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 1
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 1
- 102100039614 Nuclear receptor ROR-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 description 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102100035764 Proteasome subunit beta type-9 Human genes 0.000 description 1
- 102100037686 Protein SSX2 Human genes 0.000 description 1
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- ZQUSFAUAYSEREK-WKILWMFISA-N SB-239063 Chemical compound COC1=NC=CC(C=2N(C=NC=2C=2C=CC(F)=CC=2)[C@@H]2CC[C@@H](O)CC2)=N1 ZQUSFAUAYSEREK-WKILWMFISA-N 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101150001847 Sox15 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710088580 Stromal cell-derived factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100021669 Stromal cell-derived factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 230000006043 T cell recruitment Effects 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150111019 Tbx3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 description 1
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 description 1
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100039490 X antigen family member 1 Human genes 0.000 description 1
- OEWBEINAQKIQLZ-CMRBMDBWSA-N [(2s)-2-[(2r)-3,4-bis(2-hexyldecanoyloxy)-5-oxo-2h-furan-2-yl]-2-(2-hexyldecanoyloxy)ethyl] 2-hexyldecanoate Chemical compound CCCCCCCCC(CCCCCC)C(=O)OC[C@H](OC(=O)C(CCCCCC)CCCCCCCC)[C@H]1OC(=O)C(OC(=O)C(CCCCCC)CCCCCCCC)=C1OC(=O)C(CCCCCC)CCCCCCCC OEWBEINAQKIQLZ-CMRBMDBWSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 229940067599 ascorbyl glucoside Drugs 0.000 description 1
- 235000019276 ascorbyl stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 229940092705 beclomethasone Drugs 0.000 description 1
- NBMKJKDGKREAPL-DVTGEIKXSA-N beclomethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(Cl)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O NBMKJKDGKREAPL-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 229960002537 betamethasone Drugs 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N betamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-DVTGEIKXSA-N 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000004697 chelate complex Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960003290 cortisone acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- MVCOAUNKQVWQHZ-UHFFFAOYSA-N doramapimod Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1N1C(NC(=O)NC=2C3=CC=CC=C3C(OCCN3CCOCC3)=CC=2)=CC(C(C)(C)C)=N1 MVCOAUNKQVWQHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003317 double-positive, alpha-beta immature T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N fludrocortisone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O SYWHXTATXSMDSB-GSLJADNHSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960003336 fluorocortisol acetate Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000012987 lip and oral cavity carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229960004584 methylprednisolone Drugs 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 244000309459 oncolytic virus Species 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N perfluorobutanesulfonyl fluoride Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)S(F)(=O)=O LUYQYZLEHLTPBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001992 poloxamer 407 Polymers 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 210000003240 portal vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 1
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000003537 structural cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 206010042863 synovial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940119168 tetrahexyldecyl ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 description 1
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 description 1
- HTJNEBVCZXHBNJ-XCTPRCOBSA-H trimagnesium;(2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;diphosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O HTJNEBVCZXHBNJ-XCTPRCOBSA-H 0.000 description 1
- IRJHMGSFUSXXQJ-JBEKKHDOSA-K trisodium;(2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O.OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O IRJHMGSFUSXXQJ-JBEKKHDOSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464452—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
- A61K39/464453—Wilms tumor 1 [WT1]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464474—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/464838—Viral antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/30—Coculture with; Conditioned medium produced by tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/45—Artificially induced pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种介由iPS细胞来制造维持重编程前的T细胞群体的遗传多样性且对抗原具有指向性的再生T细胞群体的方法。该方法包括(1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或溶解物接触,浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序,(2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞,在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序,以及(3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。
Description
技术领域
本发明涉及制造具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法、通过该方法制造的再生T细胞群体以及含有该再生T细胞群体的医药组合物。
背景技术
T细胞在对细菌或者病毒等外来病原体或癌细胞等异常细胞的免疫应答中发挥核心作用。因此,T细胞功能低下被认为会促使病原体感染或癌的产生。对起因于T细胞功能低下的疾病而言,T细胞的补充、再生可成为改善或治疗疾病症状的极为有效的手段。
已提出使用iPS细胞等多能干细胞诱导的T细胞进行的T细胞补充疗法。通过使用对目标抗原具有特异性的T细胞作为用于制备iPS细胞的原料,可制备与原始T细胞示出相同抗原特异性的再生T细胞(非专利文献1;本文献的内容,以其整体引入本说明书中作为参照)。在此方法中,所建立的iPS细胞是以来自单一细胞的细胞群体(集落,colony)单位进行重编程的。根据该方法,可以利用细胞性状稳定,向目标细胞、组织的分化效率高,通过基因分析等确认无变异或异常的iPS细胞株。在此,为了确认克隆的质量或对患者的适用性,有必要逐个检查克隆,因此克隆化被认为是重要的工序。
另一方面,在使用人及小鼠的研究中,在针对感染性疾病、肿瘤进行T细胞补充疗法时,已知使用具有遗传多样性的T细胞群体的方法可诱导针对目标组织或抗原的多种免疫反应,同时该方法不易受到由于抗原表达低下或变异而产生的免疫逃逸(immuneescape)的影响,因此可获得较好的治疗效果。
作为现有技术,将T细胞受体(T cell receptor:TCR)或嵌合抗原受体(chimericantigen receptor:CAR)的基因导入T细胞的基因修饰T细胞已被报道,但导入的所述受体的基因序列是单一的(专利文献1~3)。此外,使从外周血T细胞制备的iPS细胞再分化而制造具有与原始T细胞相同的抗原特异性的T细胞的方法已被报道,但并未示出赋予遗传多样性的相关内容(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:特表2017-534261
专利文献2:特表2017-530694
专利文献3:特表2018-514204
专利文献4:特开2017-158559
非专利文献
非专利文献1:Nishimura T,et al.Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.CellStem Cell.2013 Jan 3;12(1):114-126.
发明内容
发明要解决的课题
通常,在利用iPS细胞株的方法中,要进行克隆化,但克隆化意味着将选定的克隆以外排除。因此在将通过T细胞建立的iPS细胞进行克隆化时,存在于原始T细胞群体的遗传多样性会完全丧失。这意味着只能利用以单一的抗原表位为对象的免疫反应。然而,在以单一的抗原表位为对象的免疫反应中,可能会产生易于受到抗原分子的表达低下或变异等引起的免疫逃逸(immune escape)的影响,在T细胞补充疗法中难以获得较好治疗效果的问题。另一方面,在现行的T细胞补充疗法中,尽管能够使用具有遗传多样性的T细胞群体,但会产生由于T细胞群体在体外的扩增使得T细胞疲劳,针对抗原的免疫反应下降的问题。为此,期望开发制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的新的方法,以用于T细胞补充疗法中。
本发明的目的是提供一种介由iPS细胞来制造具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法以及通过该方法制造的再生T细胞群体。本发明的目的是通过提供该再生T细胞群体来解决以单一抗原表位为对象的上述课题和由T细胞群体疲劳引起的上述课题。本发明的目的还为提供一种含有该再生T细胞群体的医药组合物以及使用该医药组合物的治疗癌症的方法。
解决课题的方法
本发明的目的通过如下发明实现。
[1]一种方法,是介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法,其包括
(工序1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触,浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序,
(工序2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞,在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序,以及
(工序3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。
[2]根据[1]所述的方法,其中所述再生T细胞群体是维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性,且对所述肿瘤相关抗原具有指向性的再生T细胞群体。
[3]根据[1]或[2]所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体来自哺乳动物。
[4]根据[3]所述的方法,其中所述哺乳动物是人。
[5]根据[4]所述的方法,其中所述人是癌症患者或非癌症患者。
[6]根据[5]所述的方法,其中所述癌症患者或非癌症患者已施予癌疫苗,或正在施予癌疫苗,或预定今后施予癌疫苗。
[7]根据[1]~[6]中任一项所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体来自体液。
[8]根据[7]所述的方法,其中所述体液选自血液,淋巴液,组织液,以及体腔液包括腹水、胸水、心包液、脑脊髓液、关节液和眼房水,以及鼻水和尿。
[9]根据[1]~[6]中任一项所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体是来自肿瘤组织的T细胞。
[10]根据[1]~[9]中任一项所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体是αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞或其混合物。
[11]根据[1]~[10]中任一项所述的方法,其中所述工序1中的生物组织是原发癌组织和转移癌组织。
[12]根据[1]~[11]中任一项所述的方法,其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括分离通过与一种以上的肿瘤相关抗原接触而激活并增殖的T细胞的工序。
[13]根据[1]~[12]中任一项所述的方法,其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序和选择产生IFN-γ的T细胞的工序中的至少一种工序。
[14]根据[1]~[12]中任一项所述的方法,其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序,选择产生IFN-γ的T细胞的工序和选择结合抗原肽-HLA复合体的T细胞的工序中的至少一种工序。
[15]根据[1]~[14]中任一项所述的方法,其中所述工序2包括不克隆化而回收、继代处理iPS细胞的步骤。
[16]根据[1]~[15]中任一项所述的方法,其中在所述工序3中得到的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法。
[17]根据[1]~[16]中任一项所述的方法,其中在所述再生T细胞群体中,维持的Vβ种类为两种以上。
[18]一种再生T细胞群体,通过[1]~[17]中任一项所述的方法制造。
[19]根据[18]所述的再生T细胞群体,其维持存在于生物体内的T细胞群体的遗传多样性。
[20]一种医药组合物,其含有[18]或[19]所述的再生T细胞群体。
[21]根据[20]所述的医药组合物,其用于通过自体或同种移植治疗癌症治疗对象。
[22]一种癌症治疗方法,其使用[20]或[21]所述的医药组合物。
发明的效果
通过本发明,可介由iPS细胞制造对抗原具有指向性和遗传多样性的再生T细胞群体。通过用肿瘤相关抗原刺激存在于生物体内的T细胞群体,可浓缩对该肿瘤相关抗原具有指向性和遗传多样性的T细胞,但通过将该浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞,进而使之再分化为T细胞群体,可获得维持了浓缩的T细胞群体对该肿瘤相关抗原的指向性和遗传多样性的再生T细胞群体。如此获得的再生T细胞群体在T细胞补充疗法中可示出高的治疗效果。特别是,已知肿瘤浸润T细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte:TIL)对肿瘤具有特异性且识别多种抗原,通过介由将TIL重编程为iPS细胞而制造再生TIL群体,可利用具有遗传多样性的复壮(rejuvenating)后T细胞实施具有肿瘤特异性且有效的T细胞补充疗法。
附图说明
[图1]是示出从肺癌患者体内摘除的肿瘤中分离的T细胞群体具有TCR β链的多样性的图。本图横轴的Vβ1~Vβ23表示TCR β链的种类(24种),纵轴示出具有各TCR β链的T细胞所占的比例。虽然Vβ种类不同,所占的比例也不同(约1~12%),但T细胞群体中存在所有的Vβ。但是,本例中使用的TCR库试剂盒(TCR Repertoire Kit)的检测限存在未被检测到的Vβ,因此本图的比例相加也不会是100%。
[图2]是示出从肺癌患者体内摘除的肿瘤中分离的T细胞群体介由iPS细胞制造的再生T细胞群体具有TCR β链的多样性的图。相对于原始T细胞群体中存在全部24种Vβ(图1),再生T细胞群体中所含的Vβ为13种(Vβ1、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ9、Vβ11、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ17、Vβ18、Vβ22、Vβ23),保存有约54%的Vβ的多样性。
[图3]是示出利用流式细胞仪对使用GPC3肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体进行解析的结果的图。对CD4和CD14中任一者都未表达的部分(左图)进行门控,用CD8和CD137显像(右图)。根据本图,显示出对GPC3具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。
[图4]是示出对使用GPC3肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体,浓缩表达CD8和CD137两者的细胞群体,与图3一样利用流式细胞仪进行解析的结果的图。与图3相比,通过CD8阴性筛选(negative selection),表明表达CD4的细胞被去除(左图)。此外,通过CD137阳性筛选(positive selection),表明未表达CD137的细胞也被去除(右图)。因此,显示出对GPC3具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例浓缩。
[图5]是示出诱导从对GPC3具有指向性的T细胞群体重编程的iPS细胞再次再分化为CD8单阳性T细胞的结果的图。对进行了再分化诱导的细胞,用抗体(CD3-APC/Cy7、CD4-BV421、CD8-PerCP/Cy5.5、TCRab-FITC、CD45-BV510以及GPC3-HLA复合体(Dextramer)-APC)染色,使用流式细胞仪(BD FACSAria(注册商标)II),解析对GPC3具有指向性的T细胞群体的比例。
[图6]是示出对于使用WT1重叠肽对非癌症患者(健康人)的外周血单核细胞进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体,与图3一样进行解析的结果的图。通过本图,示出对WT1具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。
[图7]是示出对于使用WT1重叠肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体,与图4一样进行解析的结果的图。通过本图,示出对WT1具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例浓缩。
[图8]是示出对于使用EBV LMP2A重叠肽对非癌症患者(健康人)的外周血单核细胞进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体,与图3一样进行解析的结果的图。通过本图,示出对EBV LMP2A具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。
[图9]是示出对于使用EBV LMP2A重叠肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体,与图4一样进行解析的结果的图。通过本图,示出对EBV LMP2A具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例浓缩。
[图10]是示出通过诱导从对GPC3具有指向性的T细胞群体重编程的iPS细胞再分化为CD8单阳性T细胞从而得到的再生T细胞群体对表达GPC3肽的靶细胞具有特异性细胞毒活性的图。(A)为示出再生T细胞群体的流式细胞术的分析结果的图。(B)为示出以表达了或未表达GPC3肽的靶细胞对再生T细胞群体的细胞毒活性进行比较的结果的图。
具体实施方式
本发明提供一种介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法。该方法包括(工序1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触,浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序,(工序2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞,在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序,以及(工序3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。本发明的特征还在于,通过本发明得到的再生T细胞群体维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性,且对所述肿瘤相关抗原具有指向性。
在本发明中,“介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法”是指从具有遗传多样性的T细胞群体,介由重编码为iPS细胞,再生为在维持遗传多样性的同时对抗原具有指向性的T细胞群体的方法。在本发明中,将通过该方法制造的T细胞群体称为“再生T细胞群体”。此外“T细胞”是指在细胞表面表达被称为T细胞受体(T cell receptor:TCR)的抗原受体的细胞。
[工序1]
本发明的工序1是使具有遗传多样性的T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触,浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序。
在本发明中,“T细胞群体”是CD3和CD45为阳性的淋巴细胞,是识别抗原的T细胞受体(TCR)的基因序列作为群体而言是多样的细胞群体。因此,从生物体采集的T细胞是对多样的抗原具有特异性的T细胞群体。在存在于生物体内的T细胞中,在前体T细胞在胸腺内发育并分化时,TCR基因发生随机重组,使得各个T细胞具有不同的TCR基因序列,从而可能对所有抗原产生免疫反应。尽管各个T细胞所具有的TCR是分别由特异性识别的抗原或肽的序列决定的,但可理解通过将T细胞视为群体,该T细胞群体是以多样的抗原作为免疫对象的。因此,在这个意义上,自生物体采集的T细胞群体是具有遗传多样性的T细胞群体。自这样的T细胞群体建立的iPS细胞虽未表达TCR基因,但发生了重组的TCR的基因信息保留在iPS细胞的DNA中。维持遗传多样性的iPS细胞是自具有遗传多样性的T细胞群体建立的iPS细胞,对于各个细胞,是指TCR的基因序列不同的细胞群体。
在本发明中,T细胞优选来自哺乳动物,更优选来自人(癌症患者或非癌症患者)。所述癌症患者或非癌症患者优选已施予癌疫苗,或正在施予癌疫苗,或预定今后施予癌疫苗的患者。所施予的癌疫苗可以施予一种或一种以上。T细胞没有特别限制、但例如可列举αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、以及自然杀伤(NK)T细胞。此外,作为T细胞的采集来源,由于侵袭性低而优选外周血,但不限于此。作为其他优选的采集来源,可列举癌组织或肿瘤组织或其他组织或器官、或血液、脐带血、淋巴液、组织液(组织间液、细胞间液和间质液)、体腔液(腹水、胸水、心包液、脑脊髓液、关节液和眼房水)、鼻水、尿等体内所有的采集来源。在本发明的一个实施方式中,优选的T细胞为来自肿瘤组织的T细胞。来自肿瘤组织的T细胞通常为肿瘤浸润T细胞。
“癌疫苗”是癌或肿瘤特异性蛋白质或肽,是包含来自癌或肿瘤相关抗原,用于诱导癌或肿瘤特异性免疫应答的疫苗抗原的组合物。“癌疫苗”也包括用作为癌或肿瘤特异性抗原的癌组织或蛋白质或肽进行了抗原脉冲的树突状细胞等细胞疫苗,在被给药的生物体内表达抗原的病毒DNA或RNA疫苗,及抑制了增殖的癌或肿瘤细胞和其破碎物或溶解物的组合物。进一步,“癌疫苗”也包括细菌菌体、细菌提取物、β葡聚糖等非特异性免疫赋活剂、及腺病毒等溶瘤病毒。一般而言,癌疫苗包括用于增强疫苗抗原诱导的特异性免疫应答的佐剂。包含于癌疫苗的疫苗抗原在给药至生物体后,被抗原呈递细胞(主要是树突状细胞和巨噬细胞)吞噬,在其细胞内被处理,成为由约8~30个残基的氨基酸构成的表位肽(epitopepeptide),作为与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex:MHC)I类或II类结合的复合体,在抗原呈递细胞的表面被呈递。表位肽的长度为,在MHC I类时是氨基酸8~11个残基,在MHC II类时是氨基酸13~30个残基。在细胞毒性T细胞和辅助T细胞的表面表达的T细胞受体(TCR)分别特异性识别MHC I类/肽复合体或MHC II类/肽复合体。其结果,这些T细胞被激活,发挥抗肿瘤的效果。即,细胞毒性T细胞识别、破坏呈递与疫苗抗原所含相同的表位肽的癌细胞,辅助T细胞通过干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2等细胞因子和趋化因子的分泌,增强细胞毒性T细胞的功效。辅助T细胞也具有经由CD40配体(CD40L)/CD40路径,增强抗原呈递细胞的抗原呈递能力和B细胞的抗原特异性免疫球蛋白(Ig)G抗体产生的功效。
本发明的具有遗传多样性的再生T细胞群体对于任何抗原或组织都能起作用。特别是将本发明的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法的情况下,所采集的T细胞群体优选对治疗对象的癌、肿瘤、肿瘤相关抗原或其变异抗原或病毒等具有指向性。作为治疗对象的癌或肿瘤可列举乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈癌、胃癌、食道癌、大肠癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、滑膜肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤和多发性骨髓瘤等,但不限于此。
作为上述肿瘤相关抗原或其变异抗原,可列举对各肿瘤特异性或非特异性地表达的WT1、GPC3、XAGE1、MUC1、MUC5AC、MUC6、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、MAGE A1、端粒酶、PRAME、SSX2/4、PSCA、CTLA-4、gp100、GD2、GD3、岩藻糖GM1、GM3、sLe(a)、糖脂类F77、间皮素、PD-L1、trp1、trp2、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33、c-Met、p53、p53变异体、NY-ESO-1、PSMA、ETV6-AML、CEA、PSA、AFP、hTERT、EpCAM、ALK、雄激素受体、EphA2、CYP1B1、OY-TES-1、MAD-CT-2、MelanA/MART1、生存素(Survivin)、Ras、Ras变异体、ERG、bcr-abl、XBP 1、及基因变异和剪接异常产生的肿瘤新抗原(Neoantigen)等肿瘤相关抗原,但不限于此。另外,作为病毒抗原,可列举灭活HBV和HPV等灭活病毒,以及来自各种病毒的蛋白质EBV LMP1、EBV LMP2、EBNA(EBV核抗原)、HPV E1、HPV E2、HPV E6、HPV E7、HBV HBs、HTLV-1 Tax和HBZ(HTLV-1bZIP因子)等,但不限于此。进一步,在是蛋白质抗原时,也可以将上述抗原肽片段化。
在本发明的工序1中,生物体组织是指哺乳动物特别是人的上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织、体液等。包含肿瘤相关抗原的生物体组织包括原发癌组织和转移癌组织。这些组织可以通过均化器、超声波发生器、冷冻破碎机等进行物理破碎而得到破碎物。另外,这些组织可通过例如磷酸盐平衡缓冲液等溶剂或通过例如作为两性表面活性剂的CHAPS和作为非离子表面活性剂的Triton X和Tween 20等表面活性剂溶解而作为溶解液。
生物体内存在非常多样的T细胞以能与任何抗原发生反应,但大多数都是在T细胞补充疗法中与目标抗原无关的T细胞。因此,作为介由重编程为iPS细胞制造的T细胞的原料,预先浓缩了对作为T细胞补充疗法的对象的癌、肿瘤或病毒有反应性的T细胞群体,从而在再生T细胞群体的治疗效果显著提高的同时,可以抑制对预想外抗原的免疫反应并提高安全性。
在本发明的一个实施方式中,工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括分离通过与一种以上的肿瘤相关抗原接触而激活并增殖的T细胞的工序。使T细胞与肿瘤相关抗原接触后,通过接受T细胞受体对肿瘤相关抗原识别和共刺激的信号,T细胞被激活。作为接触的方法,例如使用添加有肿瘤相关抗原或包含肿瘤相关抗原的生物体组织或其破碎物或其溶解物的培养液,对包含抗原呈递细胞和T细胞的外周血单核细胞进行培养。在培养液中,通过添加IL-2、IL-7、IL-15、IL-21等细胞因子,可以使目标T细胞高效扩增。在扩增培养后,通过以浓缩对肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞为目的而施加上述刺激,被激活的T细胞在细胞膜表面表达CD137分子或IFN-γ等功能性分子。对于这些功能性分子,可以通过用荧光蛋白或磁珠标记的特异性抗体染色,通过使用流式细胞仪分选或使用磁石分离,浓缩对目标的肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞。
本发明的工序1中,“对肿瘤相关抗原具有指向性”是指各个T细胞分别特异性识别各抗原表位或肽序列,同时作为T细胞群体,示出对目标组织或抗原的免疫反应。
在本发明的一个实施方式中,作为浓缩对目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的方法,例如可列举使抗原蛋白质或肽与T细胞接触,激活T细胞,分离增殖的T细胞的方法。在该方法中,培养含有抗原呈递细胞的单核细胞部分,向培养液中添加抗原蛋白质或肽。通过重复让T细胞与抗原蛋白质或肽接触,反应性T细胞增殖,相对于T细胞群体整体的比率上升。另一方面,不与添加的抗原蛋白质或肽反应的T细胞不被激活,在体外(invitro)培养过程中比率渐渐减低,最终死亡。因此,在经过一定时间的培养后,可以浓缩而得到对向培养液中添加的抗原蛋白质或肽具有特异反应性,同时在识别的抗原表位或肽序列中具有多样性的T细胞群体。
在本发明的一个实施方式中,作为T细胞群体的浓缩方法,可列举在激活T细胞群体后,选择表达CD137的T细胞的方法和选择产生IFN-γ的T细胞的方法。在这些方法中,可以在结合对CD137或IFN-γ特异性的抗体后,使用磁珠进行磁性分离或通过使用荧光标记的流式细胞仪进行选择性分离。也可以使用双特异性抗体(相对于T细胞和IFN-γ的双特异性抗体)捕获产生IFN-γ的细胞的系统。进一步,在本发明其他实施方式中,也可以举例选择抗原肽-HLA(human leukocyte antigen,人类白细胞抗原)复合体的寡聚物结合的T细胞的方法。在该方法中,通过用荧光色素标记由特定HLA型和该HLA可呈递的目标抗原肽的复合体组成的寡聚物,使用流式细胞仪对寡聚物结合的细胞进行分选,能够得到具有针对目标组织或抗原的指向性的T细胞。在浓缩T细胞群体时,这些方法可以单独或组合使用。
[工序2]
本发明的工序2是将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞,在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序。
iPS细胞的制造方法在本领域中是公知的。在本发明中,iPS细胞优选通过向工序(1)中浓缩的T细胞群体中导入重编程因子而制备。在此,作为重编程因子,可列举Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物,这些重编程因子可单独使用,也可组合使用。
对生物体内存在的T细胞群体而言,TCR基因序列作为群体是多样的,在这种意义上具有遗传多样性。自该T细胞群体建立的iPS细胞在维持该遗传多样性的同时进行培养。在培养iPS细胞时优选进行继代。但是,在一般的继代方法中,由于除了用于继代的细胞以外的细胞被舍弃,因此自具有遗传多样性的T细胞群体建立的iPS细胞的多样性逐渐丧失。与此相对地,在本发明中,优选建立iPS细胞后,洗涤培养器,优选去除iPS细胞以外的细胞,不经克隆化而回收iPS细胞,在其它的培养器中继代。然后反复进行这样的继代。
本发明的工序2中所用的培养液没有特别的限制,可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液,向其中添加用于维持iPS细胞的未分化能力的细胞因子类来调配。作为基础培养液,例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司)、StemFit(注册商标)AK03N(味之素Healthy Supply公司)及其混合培养液。培养液中可添加血清或无血清。细胞因子类优选可列举bFGF,其在培养液中的浓度例如为1~100μg/ml(优选50μg/ml)。
在本发明的一个实施方式中,iPS细胞的培养方法可为贴壁培养或悬浮培养,但优选贴壁培养。iPS细胞的分离方法例如可列举通过细胞刮刀等进行力学分离的方法以及使用具有蛋白酶活性的分离溶液、具有胶原酶活性的分离溶液、或具有蛋白酶活性及胶原酶活性的分离溶液(例如Accutase(注册商标)及Accumax(注册商标)等)进行的分离方法。
在本发明的一个实施方式中,iPS细胞优选在细胞密度达到1x103~1x104个细胞/cm2、1x104~1x105个细胞/cm2或1x105~1x106个细胞/cm2的情况下向其它的培养器中继代。继代的次数可为足以得到T细胞补充疗法所必要的量的iPS细胞的任何次数,优选1~5次或5~10次。
本发明的一个实施方式中,获得的具有遗传多样性的iPS细胞可直接使用,或可以冷冻保存至必要时。细胞的冷冻保存方法是本领域技术人员所周知的。
[工序3]
本发明的工序3是自上述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。在本发明的一个实施方式中,该再生T细胞维持工序1中浓缩的T细胞群体的遗传多样性,并且具有针对工序1中使用的肿瘤相关抗原的指向性。
在本发明的一个实施方式中,再生T细胞群体优选自本发明的工序2中培养的iPS细胞经由造血祖细胞分化为CD4/CD8双阳性T细胞而得,或自本发明的工序2中培养的iPS细胞经由造血祖细胞及CD4/CD8双阳性T细胞分化为CD8单阳性T细胞而得。
造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells,HPC)为可能分化为淋巴细胞、嗜酸粒细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、红细胞、或巨核细胞等血细胞系细胞的细胞。在本发明的一个实施方式中,造血祖细胞和造血干细胞之间没有区别,只要无特别否定则表示相同的细胞。造血干细胞/祖细胞例如可通过表面抗原CD34及/或CD43为阳性而识别。
在本发明的一个实施方式中,造血祖细胞优选通过在添加维生素C类的培养液中培养iPS细胞而制备。在此,“维生素C类”是指L-抗坏血酸及其衍生物,“L-抗坏血酸衍生物”是指在生物体内经酶反应变为维生素C的物质。L-抗坏血酸的衍生物例如可列举磷酸维生素C,抗坏血酸葡糖苷,抗坏血酸乙酯,维生素C酯,四己基癸醇抗坏血酸酯,抗坏血酸硬脂酸酯及抗坏血酸-2-磷酸-6软脂酸。L-抗坏血酸的衍生物优选磷酸维生素C,例如可列举磷酸-L-抗坏血酸钠或磷酸-L-抗坏血酸镁等磷酸-L抗坏血酸盐。在培养液中例如可含有5~500μg/ml浓度的维生素C类。
在本发明的一个实施方式中,造血祖细胞的制备中所用的培养液没有特别限制,可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液,向其中添加维生素C类等进行调配。基础培养液例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司)、StemPro34(Life Technologies公司)及其混合培养液。培养液中可含有血清或可无血清。根据需要,基础培养液例如可含有选自白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等的1种以上物质。
在本发明的一个实施方式中,可向用于制造造血祖细胞的培养液中进一步添加选自BMP4(骨形成蛋白4)、VEGF(血管内皮生长因子)、bFGF(基本成纤维细胞生长因子)、SCF(干细胞因子)、TPO(血小板生成素)、及FLT-3L(Flt3配体)的细胞因子。
在本发明的一个实施方式中,其浓度例如为:BMP4为1~100ng/ml,VEGF为1~100ng/ml,bFGF为1~100ng/ml,SCF为10~100ng/ml,TPO为1~100ng/ml,FLT-3L为1~100ng/ml。
在本发明的一个实施方式中,可向培养液中添加TGF β抑制剂。“TGF β抑制剂”是指干扰TGF β家族信号传导的小分子抑制剂,例如可列举SB431542和SB202190(R.K.Lindemann et al.,Mol.Cancer 2:20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908和SD208(Scios)、以及LY2109761、LY364947及LY580276(LillyResearch Laboratories),向培养液中添加的浓度优选为0.5~100μM。
在本发明的一个实施方式中,iPS细胞可与C3H10T1/2(Takayama N.,et al.J ExpMed.2817-2830,2010)或异种来源的间质细胞(Niwa A et al.J Ce11 Physiol.2009Nov;221(2):367-77)等饲养细胞共培养,但优选不使用饲养细胞而培养iPS细胞。
在本发明的一个实施方式中,制备造血祖细胞时的iPS细胞培养方法可为贴壁培养或悬浮培养,但优选悬浮培养。例如,iPS细胞可在将培养至相对于所使用的培养皿融合度达80%的集落分离,并在解离为单细胞后进行悬浮培养。iPS细胞的分离方法例如可列举使用细胞刮刀等进行力学分离的方法以及使用具有蛋白酶活性及胶原酶活性的分离溶液(例如Accutase(注册商标)及Accumax(注册商标)等)或具有胶原酶活性的分离溶液的分离方法。
悬浮培养是指以细胞对培养容器非贴壁的状态进行培养。在本发明的一个实施方式中,对悬浮培养没有特别限制,可以使用未进行以提高与细胞的粘附性为目的的人工处理(例如通过细胞外基质等进行涂布处理)的培养容器,或使用经人工进行抑制粘附处理(例如通过聚羟乙基甲基丙烯酸(po1y-HEMA)或非离子性的表面活性多元醇(Pluronic F-127等)进行涂布处理)的培养容器进行。在悬浮培养时,优选使胚状体(EB)形成而培养。
在本发明的另一实施方式中,造血祖细胞可自培养iPS细胞而得的网状构造物(称为iPS-sac)调配。在此,“网状构造物”是指来自iPS细胞的立体囊状(伴有内部空间)的构造体,为由内皮细胞群体等形成,在内部含有造血祖细胞的构造体。
在本发明的一个实施方式中,用于培养自iPS细胞制备造血祖细胞时的温度条件没有特别限制,但可列举例如为约37℃~约42℃左右,优选约37℃~约39℃左右。另外,关于培养期间时间,本领域技术人员可在监控造血祖细胞的细胞数等的同时适当决定。只要获得造血祖细胞,则不特别限定天数,但例如可列举至少6天以上,7天以上,8天以上,9天以上,10天以上,11天以上,12天以上,13天以上,或14天以上,优选为14天。较长的培养期间时间不会在造血祖细胞的制备中成为问题。另外,可在低氧条件下培养,在本发明的一个实施方式中,低氧条件例如可列举15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%或更少的氧浓度。
在本发明中,“CD4/CD8双阳性T细胞”是指在T细胞中表面抗原CD4及CD8共同呈阳性的细胞(CD8+CD4+),由于T细胞可通过表面抗原CD3及CD45为阳性来识别,因此CD4/CD8双阳性T细胞可作为CD4、CD8、CD3及CD45为阳性的细胞而加以鉴定。CD4/CD8双阳性T细胞可通过诱导而分化为CD4单阳性细胞或CD8单阳性细胞。
在本发明的一个实施方式中,CD4/CD8双阳性T细胞可通过使用包括在添加p38抑制剂及/或SDF-1的培养液中培养造血祖细胞的工序的方法制备。
在本发明中,“p38抑制剂”定义为抑制p38蛋白质(p38MAP激酶)的功能的物质。在本发明的一个实施方式中,p38抑制剂例如可列举p38的化学抑制剂、p38的显性阴性变异体或编码其的核酸等,但不限于此。
在本发明的一个实施方式中,p38的化学抑制剂可列举SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB239063(反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇)及其衍生物、SB220025及其衍生物、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCl0-469、SCIO-323、VX-702、或FR167653,但不限于此。这些化合物是市售的,例如SB203580、SB202190、SC239063、SB220025及PD169316可从Calbiochem公司购买,SCl0-469及SCIO-323可从Scios公司等购买。
在本发明的一个实施方式中,作为p38的显性阴性变异体,可列举位于p38的DNA结合域的180位的苏氨酸发生点突变成为丙氨酸的p38T180A,以及人及小鼠中的p38的182位的酪氨酸发生点突变成为苯丙氨酸的p38Y182F等。
向培养液中添加例如约1μM~约50μM的范围的p38抑制剂。
在本发明的一个实施方式中,SDF-1(Stromal cell-derived factor间质1,细胞衍生因子1)不仅为SDF-1α或其成熟型,也可以为SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε或等异构体或它们的成熟型,或者可以为它们的任意比例的混合物等。优选使用SDF-1α。此外,SDF-1有时称为CXCL-12或PBSF。
在本发明的一个实施方式中,SDF-1只要保有其趋化因子活性即可,其氨基酸序列中的1或数个氨基酸可取代、缺失及/或添加,同样地,糖链也可以被取代、缺失及/或添加。SDF-1中只要在至少保持4个半胱氨酸残基(人SDF-1α的情况下为Cys30、Cys32、Cys55及Cys71)、并且相对于天然体氨基酸序列具有90%以上的同一性的范围内,可允许氨基酸变异。SDF-1可为哺乳动物的SDF-1,例如人的SDF-1,例如猴、羊、牛、马、猪、狗、猫、兔、大鼠、或小鼠等非人哺乳动物的SDF-1。例如,人的SDF-1α可使用以GenBank登录编号NP_954637登录的蛋白质,SDF-1β可使用以GenBank登录编号NP_000600登录的蛋白质。
在本发明的一个实施方式中,SDF-1可使用市售品,也可使用天然提纯的物质,或使用肽合成或基因工程学手段制备的物质。
在本发明的一个实施方式中,向培养液中添加例如约10ng/ml~约100ng/ml的范围的SDF-1。
在本发明的一个实施方式中,制备CD4/CD8双阳性T细胞所用的培养液没有特别限制,可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液,向其中添加p38抑制剂及/或SDF-1,进一步优选添加维生素C类而调配。此外,CD4/CD8双阳性T细胞制备工序中使用的维生素C类的种类例如为上述种类,但维生素C类的浓度例如为5~200μg/ml。基础培养液,例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、OP9培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司),及其混合培养液等。培养液中可添加血清或也可无血清。根据需要,基础培养液例如可含有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等1种以上物质。
在本发明的一个实施方式中,在CD4/CD8双阳性T细胞的制备中所用的培养液中,可进一步添加选自SCF、TPO(血小板生成素)、FLT-3L及IL-7的细胞因子。其浓度例如为:SCF为10~100ng/ml,TPO为10~200ng/ml,FLT-3L为1~100ng/ml,IL-7为1~100ng/ml。
在本发明的一个实施方式中,在制备CD4/CD8双阳性T细胞时,可使用饲养细胞培养造血祖细胞,但优选不使用饲养细胞进行培养。
在本发明的一个实施方式中,造血祖细胞可贴壁培养或悬浮培养,但本工序优选为贴壁培养。在贴壁培养的情况下,可使用经涂布的培养容器。作为涂布剂例如可列举:基质胶(Niwa A,et al.PLoS One.6(7):e22261,2011)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、RetroNectin、Fc-DLL4或巢蛋白,及其组合。
在本发明的另一实施方式中,悬浮培养胚状体获得造血祖细胞时,优选在将其解离为单细胞后实施贴壁培养。
在本发明的一个实施方式中,为了制备CD4/CD8双阳性T细胞而培养造血祖细胞时的温度条件没有特别限定,但例如优选约37℃~约42℃左右,更优选约37℃~约39℃左右。另外,关于培养期间,本领域技术人员可在监控CD4/CD8双阳性T细胞的细胞数等的同时适当决定。只要获得CD4/CD8双阳性T细胞,则不特别限定培养天数,但可列举例如至少10天以上,12天以上,14天以上,16天以上,18天以上,20天以上,22天以上,或23天以上,优选23天。
在本发明的一个实施方式中,获得的CD4/CD8双阳性T细胞可在分离后使用,也可作为含有其它种类细胞的细胞群体使用。分离时,可使用CD4、CD8、CD3及CD45中的任一者作为指标进行分离。该分离的方法可使用本领域技术人员周知的方法,例如可列举通过CD4、CD8、CD3及CD45的抗体来进行标记,使用流式细胞仪进行分离的方法,或使用将所需的抗原固定化的亲和柱等进行提纯的方法。
“CD8单阳性T细胞”是指T细胞中表面抗原CD8为阳性的细胞(CD8+CD4-),也称为细胞毒性T细胞。由于可通过表面抗原CD3及CD45为阳性来识别T细胞,CD8单阳性T细胞可作为CD8、CD3及CD45为阳性且CD4为阴性的细胞加以鉴定。
在本发明的一个实施方式中,CD8单阳性T细胞可通过包括在添加肾上腺皮质激素剂的培养液中培养CD4/CD8双阳性T细胞的工序的方法制备。
在本发明的一个实施方式中,肾上腺皮质激素剂优选糖皮质激素或其衍生物,例如可列举醋酸可的松、氢化可的松、醋酸氟氢可的松、泼尼松龙、去炎松、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松或丙酸倍氯米松。优选肾上腺皮质激素剂为地塞米松。其在培养液中的浓度例如为1~100nM。
在本发明的一个实施方式中,制备CD8单阳性T细胞所用的培养液没有特别限制,可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液,向其中添加肾上腺皮质激素剂进行调配。作为基础培养液,例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司)、及其混合培养液等。培养液中可添加血清或也可无血清。根据需要,基础培养液可含有例如选自白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等1种以上物质。
在本发明的一个实施方式中,制备CD8单阳性T细胞所用的培养液优选进一步含有抗CD3抗体、维生素C类或细胞因子。该细胞因子例如可列举IL-2及IL-7等。
在本发明的一个实施方式中,抗CD3抗体只要是特异性识别CD3的抗体即可,没有特别限制,但例如可列举由OKT3克隆产生的抗体。抗CD3抗体在培养液中的浓度例如为10~1000ng/mL。
在本发明的一个实施方式中,制备CD8单阳性T细胞所用的维生素C类例如为上述物质,可在与上述相同的条件下使用。
在本发明的一个实施方式中,制备CD8单阳性T细胞所用的细胞因子在培养液中的浓度例如为:IL-2为10~1000U/mL,IL-7为1~100ng/mL。
在本发明的一个实施方式中,为制备CD8单阳性T细胞而培养CD4/CD8双阳性T细胞时的温度条件没有特别限制,但例如优选约37℃~约42℃左右,更优选约37℃~约39℃左右。另外,关于培养期间,本领域技术人员可在监控CD8单阳性T细胞的细胞数等的同时适当决定。只要获得CD8阳性T细胞,则不特别限定培养天数,但例如为至少1天以上,2天以上,3天以上,4天以上,或5天以上,优选3天。
在本发明的一个实施方式中,就所维持的遗传多样性的程度而言,维持的Vβ种类优选2种以上,更优选3种以上,进一步优选4种以上。
在本发明的一个实施方式中,所制备的再生T细胞群体优选用于T细胞补充疗法中。在本发明中,T细胞补充疗法是指向生物体补充T细胞的治疗方法,在本发明的一个实施方式中,T细胞补充疗法优选可列举包括再生T细胞的输注、肿瘤内注入、动脉注射、门静脉注射等细胞移植治疗方法。
在T细胞补充疗法中使用通过本发明获得的再生T细胞群体时,在同种移植的情况下,从不易引起排斥反应的角度,优选被采集T细胞的癌症患者或非癌症患者与为治疗癌症而施予通过本发明获得的T细胞的癌症患者的HLA型一致。此外,更优选施予通过本发明获得的T细胞的癌症患者和被采集T细胞的癌症患者是同一个人。即,更优选通过自体移植进行癌症治疗。
本发明包含维持着生物体内存在的T细胞群体的遗传多样性、介由iPS细胞而得的再生T细胞群体。可将包含本发明的再生T细胞群体的医药组合物用于处理癌症治疗对象。在本发明的一个实施方式中,包括使用本发明的医药组合物的治疗癌症的方法。本发明的医药组合物可包含药学上可接受的添加剂。该添加剂例如可列举细胞培养液,磷酸缓冲食盐水等。
通过以下实施例对本发明进行进一步的具体说明,但本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例
[工序1的具体步骤]
将肿瘤相关抗原添加至培养液中,使之与T细胞群体接触,在添加有200U/mL IL-2、10ng/mL IL-15和10ng/mL IL-21的RPMI-1640培养液(包含10%人AB血清、1%青霉素-链霉素-谷氨酰胺)中培养12天。培养液中添加的肿瘤相关抗原优选在肽的情况下以1~100mg/mL的浓度添加,另外,在使用生物体组织或其破碎物作为肿瘤相关抗原的情况下,每个含有培养液的管中添加约1~5个切片为1~2mm见方的组织片,使之与T细胞群体接触。在使用生物体组织的溶解物的情况下,优选将该溶解物添加至培养液中,使之与T细胞群体接触。在培养后第12天,通过再次接触同一肿瘤相关抗原肽,进一步培养24小时,对对肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞表达了激活标记。对培养的细胞群体,进行使用CD8分子以外的血细胞部分的标记的阴性筛选(CD8+T细胞分离试剂盒,Miltenyi Biotech公司),以及对激活标记CD137或IFN-γ的阳性筛选(CD137 MicorBead Kit或Cytokine capture system-IFN-γ,Miltenyi Biotech公司),由此仅浓缩对肿瘤相关抗原具有指向性的CD8单阳性T细胞。
在工序1中使用抗原肽-HLA复合体的情况下,使用的T细胞群体可以是与上述肿瘤相关抗原接触并培养了12天的细胞群体或未进行该培养的细胞群体的任一种。向获得的细胞群体添加进行了荧光标记的目标抗原肽-HLA复合体并先进行30分钟染色后,添加对其他血细胞标记(CD8、CD4及CD14)的荧光标记抗体并进一步进行30分钟染色。染色后,将回收的细胞用磷酸缓冲液洗涤后,通过使用流式细胞仪,仅分选表达抗原肽-HLA复合体和CD8分子的细胞,从而浓缩对目标的肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞。
[工序2的具体步骤:重编程为iPS细胞]
接着,将T细胞回收至15ml管中,悬浮在约250μL的RPMI-1640培养液中,然后使用CytoTune-iPS 2.0试剂盒(ID Pharma株式会社:目录编号DV-0304),以MOI=5的效价,将含有重编程所必需的四种因子(Oct3/4,Sox2,Klf4及c-Myc)的仙台病毒添加至培养液中,在37℃条件下温育2小时。温育后,用RPMI-1640培养液洗涤T细胞,从培养液中去除病毒。
接着,为了除去磁珠,通过移液将磁珠与细胞分离后,将管静置于配有磁石的基座上,由此仅回收培养液中悬浮的T细胞。
将获得的T细胞接种于以0.5μg/cm2涂布有iMatrix-511(Nippi公司:目录编号892011)的6cm培养皿上,在RPMI-1640培养液中使用设定为37℃、5%CO2的温育箱开始培养。
在6cm培养皿上开始培养的翌日起,除去一半量的不含细胞的培养上清液,并以与除去的培养液相同的量向StemFit(注册商标)AK03N(味之素Healthy Supply公司)中加入添加了1mM丙戊酸的建立用培养液。
此后,每天交换相同的半量培养液,继续培养20~40天,由此在6cm培养皿中得到大量的iPS细胞集落。在获得了一定数量集落的阶段,将建立用培养液换为iPS细胞用培养液(仅StemFit AK03N)继续培养。
[工序2的具体步骤:在维持所建立的iPS细胞的遗传多样性的同时进行培养]
在iPS细胞的集落成长到肉眼可确认的程度的阶段,将iPS细胞向新涂布有iMatrix-511的6cm培养皿中继代。
在继代时,用PBS(-)清洗贴附于培养皿的iPS细胞之后,添加TrypLeSelect(LifeTechnologies公司:A12859-01)并温育约7分钟,以剥离iPS细胞,使其分散为单个的细胞。使用iPS细胞用培养液洗涤细胞,测得细胞数。然后将分散的细胞以1500个细胞/cm2的密度接种于新涂布有iMatrix-511的6cm培养皿。此时,所回收的iPS细胞不舍弃,而是全部接种于新的培养皿。
将所回收的细胞全部继续接种,由此逐渐扩大培养规模。因此,在建立后进行3~5次继代,在获得使用iPS细胞进行T细胞补充疗法所需量的iPS细胞的阶段,通过以下步骤将细胞冷冻保存。
在使用与继代相同的步骤回收iPS细胞后,将细胞悬浮在TC Protector(DSPharma公司:目录编号KBTCP001)等细胞冷冻液中,以-1℃/分钟的速度降温至-80℃,冷冻iPS细胞。为了长期稳定地保存iPS细胞,期望进一步将其保存于液氮(-196℃)中。
[工序3的具体步骤]
在经超低粘附处理的6孔板(CORNING公司:目录编号3471)上,以3x105~6x105个/孔接种由工序(2)获得的iPS细胞(第0天),向EB培养液(包含10μg/mL人胰岛素、5.5μg/mL人转铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠、2mM L-谷氨酰胺、45mMα-单硫甘油及50μg/mL抗坏血酸的StemPro34)中添加10ng/mL BMP4,5ng/mL bFGF,15ng/mL VEGF,2μM SB431542,在低氧条件下(5%O2)培养5天(第5天)。
接着,添加50ng/mL SCF、30ng/mL TPO、10ng/mL Flt3L,进一步培养5~9天(~第14天)。
在涂布有Fc-DLL4(5μg/mL)(Sino Biological Inc.)及RetroNectin(5μg/mL)(TAKARA-BIO株式会社)的4孔板上,在添加有50ng/mL SCF、50ng/mL IL-7、50ng/mL Flt3L、100ng/mL TPO、15μM SB203580(Tocris Bioscience)和30ng/mL SDF-1α(PeproTech)的OP9培养液(包含15%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ng/mL链霉素、55μM 2-巯基乙醇、50μg/ml抗坏血酸、10μg/mL人胰岛素、5.5μg/mL人转铁蛋白和5ng/mL亚硒酸钠)中培养获得的造血祖细胞21天(第35天)。
在第35天,用FACS分离CD45、CD3、CD4及CD8全部为阳性的部分,得到CD4/CD8双阳性细胞(称为DP细胞)。
在96孔板上,在添加15%胎牛血清、500ng/mL抗CD3抗体(eBioscience)、200U/mLIL-2、10ng/mL IL-7及10nM地塞米松的RPMI 1640培养液中培养获得的CD4/CD8双阳性细胞2天(第37天)。用添加有15%胎牛血清的RPMI 1640培养液洗涤细胞,由此去除抗体,用添加有15%胎牛血清及10ng/mL IL-7的RPMI 1640培养液进一步培养5天,由此获得CD8单阳性T细胞(第42天)。
实施例1
基于上述方法,自肺癌患者体内摘除的肿瘤分离的具有遗传多样性的T细胞群体建立iPS细胞,诱导其再分化为具有遗传多样性的T细胞。
T细胞所表达的T细胞受体(TCR)的遗传多样性通常由DNA或RNA的测序来确定,但也可使用与TCR的Vβ链各区段特异性结合的抗体面板进行简单的检测。
使用TCRVβ分析试剂盒(BECKMAN COULTER公司:目录编号IM-3497),分析自肺癌患者体内摘除的肿瘤分离的T细胞群体的TCR库(repertoire)(图1)。在患者检测样本中,含有约1~13%比例的表达各Vβ链的细胞,确认了其为具有遗传多样性的T细胞群体。通过上述方法将这些T细胞群体重编程为iPS细胞。
iPS细胞是具有多能性的干细胞,不表达包括TCR基因的T细胞相关基因。即,难以在未分化的iPS细胞的阶段分析TCR基因的多样性。以不丧失遗传多样性的方式将所建立的iPS细胞继代后,经造血祖细胞阶段将其诱导分化为T细胞。
使用上述试剂盒分析再生的T细胞表达的TCR库(图2)。伴随iPS细胞的建立及T细胞的分化诱导,表达Vβ的2、3、4、7.1、7.2、8、12、14、16、20及21.3号区段的T细胞的多样性丧失,但仍保存了约半数的Vβ库,确认了再生的T细胞是具有遗传多样性的T细胞群体。
实施例2
对于肿瘤抗原之一GPC3,向已施予肽疫苗的患者采集外周血,使用密度梯度离心法分离单核细胞细胞群体。将该细胞群体的2x106个细胞添加到24孔板上,使用浓度为10mg/mL的GPC3肽,按照上述“工序1的具体步骤”,扩增培养对GPC3具有指向性的T细胞。通过使所培养的细胞再次与GPC3肽接触并培养24小时,表达激活标记。将该细胞群体用抗体(CD4-BV421、CD8-PerCP/Cy5.5、CD14-FITC及CD137-PE)染色,使用流式细胞仪(BDFACSAria(注册商标)II)分析具有GPC3指向性的T细胞群体的比例(图3)。其结果,显示出对GPC3具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。对该细胞群体,使用磁珠,浓缩表达CD8和CD137两者并对GPC3具有指向性的T细胞群体(图4)。将该细胞群体按照上述“工序2的具体步骤(重编程为iPS细胞以及在维持所建立的iPS细胞的遗传多样性的同时进行培养)”重编程为iPS细胞后,按照上述“工序3的具体步骤”,诱导再分化为CD8单阳性细胞。获得的再生CD8单阳性细胞以高比例被GPC3肽-HLA复合体(Dextramer)染色,由此显示出其为对GPC3具有指向性的T细胞群体(图5)。
实施例3
通过从非癌症患者(健康人)的外周血分离单核细胞,使其与肿瘤抗原之一WT1的重叠肽(PepTivator WT1,Miltenyi Biotech公司)接触,与实施例2同样地,扩增培养对WT1具有指向性的T细胞群体。WT1重叠肽以1μg/mL添加至培养液中。通过使所培养的细胞再次与WT1重叠肽接触,表达激活标记。对其进行分析的结果,显示出对WT1具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增(图6)。对该细胞群体,使用磁珠浓缩表达CD8和CD137两者并对WT1具有指向性的T细胞群体(图7)。
实施例4
通过从非癌症患者(健康人)的外周血分离单核细胞,使其与病毒抗原之一EBVLMP2A的重叠肽(PepTivator EBV LMP2A,Miltenyi Biotech公司)接触,与实施例2同样地,扩增培养对EBV LMP2A具有指向性的T细胞群体。EBV LMP2A重叠肽以1μg/mL添加至培养液中。通过使所培养的细胞再次与EBV LMP2A重叠肽接触,表达激活标记。对其进行分析的结果,显示出对EBV LMP2A具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增(图8)。对该细胞群体,使用磁珠浓缩表达CD8和CD137两者并对EBV LMP2A具有指向性的T细胞群体(图9)。
实施例5
确认了自对GPC3具有指向性的T细胞群体经由iPS细胞而制备的再生T细胞群体对表达GPC3肽的靶细胞具有特异性细胞毒活性。
通过从肝癌患者的外周血分离单核细胞,与实施例2同样地,使之与GPC3肽接触,从而扩增培养对GPC3具有指向性的T细胞群体,进一步浓缩。将该浓缩的细胞群体按照上述工序2和3重编程为iPS细胞后,按照上述工序4,诱导再分化为CD8单阳性细胞。通过对获得的再生T细胞群体进行流式细胞术分析,确认了CD8以CD8αβ异二聚体的形式存在(图10A)。
作为靶细胞,使用感染EB病毒而永生化的B细胞。在存在或不存在GPC3肽(1μM)的情况下培养该靶细胞,制备表达GPC3肽的细胞及不表达GPC3肽的细胞。使用N-SPC非RI细胞毒性检测试剂盒P(Techno Suzuta公司)测定再生T细胞群体对靶细胞的细胞毒活性。用BM-HT试剂处理表达或不表达GPC3肽的靶细胞,并使BM-HT试剂摄入细胞内。然后洗涤靶细胞以去除过量的BM-HT试剂。将该靶细胞和再生T细胞群体共培养2小时,并将培养上清液加入到Eu溶液(铕溶液)中。从损伤的靶细胞漏出到培养液中的HT螯合物变成HT/Eu复合体,将其用激光激发并使用时间分辨荧光进行检测,从而评估细胞毒活性。通过下式计算细胞毒活性。
细胞毒活性(%)=[(存在再生T细胞时培养上清液中的荧光量)-(不存在再生T细胞时培养上清液中的荧光量)]/[(溶解有所有靶细胞的溶解液中的荧光量)-(不存在再生T细胞时培养上清液中的荧光量)]×100
将共培养时再生T细胞与靶细胞的细胞数比设为20∶1、10∶1和5∶1。其结果,显示出再生T细胞群体对表达GPC3肽的靶细胞的细胞毒活性,并且该活性随着再生T细胞相对于靶细胞的细胞数增加而增强(图10B)。另一方面,再生T细胞群体对不表达GPC3肽的靶细胞未示出细胞毒活性(图10B)。从这些结果表明,获得的再生T细胞群体维持对GPC3的抗原特异性,并对表达GPC3的靶细胞具有抗原特异性细胞毒活性。
Claims (22)
1.一种方法,是介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法,其包括
(工序1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触,浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序,
(工序2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞,在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序,以及
(工序3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述再生T细胞群体是维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性,且对所述肿瘤相关抗原具有指向性的再生T细胞群体。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体来自哺乳动物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述哺乳动物是人。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述人是癌症患者或非癌症患者。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述癌症患者或非癌症患者已施予癌疫苗,或正在施予癌疫苗,或预定今后施予癌疫苗。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体来自体液。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述体液选自血液,淋巴液,组织液,以及体腔液包括腹水、胸水、心包液、脑脊髓液、关节液和眼房水,以及鼻水和尿。
9.根据权利要求1~6中任一项所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体为来自肿瘤组织的T细胞。
10.根据权利要求1~9中任一项所述的方法,其中所述工序1中的T细胞群体为αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞或其混合物。
11.根据权利要求1~10中任一项所述的方法,其中所述工序1中的生物组织为原发癌组织和转移癌组织。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的方法,其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括分离通过与一种以上的肿瘤相关抗原接触而激活并增殖的T细胞的工序。
13.根据权利要求1~12中任一项所述的方法,其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序和选择产生IFN-γ的T细胞的工序中的至少一种工序。
14.根据权利要求1~12中任一项所述的方法,其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序,选择产生IFN-γ的T细胞的工序和选择结合抗原肽-HLA复合体的T细胞的工序中的至少一种工序。
15.根据权利要求1~14中任一项所述的方法,其中所述工序2包括不克隆化而对iPS细胞进行回收、继代处理的步骤。
16.根据权利要求1~15中任一项所述的方法,其中所述工序3获得的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法。
17.根据权利要求1~15中任一项所述的方法,其中对所述再生T细胞群体而言,维持的Vβ种类为两种以上。
18.再生T细胞群体,通过权利要求1~17中任一项所述的方法制造。
19.根据权利要求18所述的再生T细胞群体,其维持生物体内存在的T细胞群体的遗传多样性。
20.一种医药组合物,其含有权利要求18或19所述的再生T细胞群体。
21.根据权利要求20所述的医药组合物,其用于通过自体或同种移植治疗癌症治疗对象。
22.一种癌症治疗方法,其使用权利要求20或21所述的医药组合物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018-144514 | 2018-07-31 | ||
JP2018144514 | 2018-07-31 | ||
PCT/JP2019/029750 WO2020027094A1 (ja) | 2018-07-31 | 2019-07-30 | iPS細胞を介して再生T細胞集団を製造する方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112513255A true CN112513255A (zh) | 2021-03-16 |
Family
ID=69231880
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201980048222.1A Pending CN112513255A (zh) | 2018-07-31 | 2019-07-30 | 介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210238550A1 (zh) |
EP (1) | EP3831936A4 (zh) |
JP (1) | JPWO2020027094A1 (zh) |
CN (1) | CN112513255A (zh) |
WO (1) | WO2020027094A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113939302A (zh) * | 2019-06-14 | 2022-01-14 | 赛雅思株式会社 | 医药组合物 |
JPWO2022059780A1 (zh) * | 2020-09-18 | 2022-03-24 | ||
WO2022220146A1 (ja) * | 2021-04-16 | 2022-10-20 | サイアス株式会社 | T細胞受容体遺伝子を導入するためのiPS細胞により構成される細胞バンク |
CN113462642A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-10-01 | 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 | 间充质干细胞的快速诱导分化方法、试剂盒及其应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011096482A1 (ja) * | 2010-02-03 | 2011-08-11 | 国立大学法人東京大学 | 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 |
WO2016076415A1 (ja) * | 2014-11-13 | 2016-05-19 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からt細胞への誘導方法 |
WO2017078807A1 (en) * | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
WO2017203356A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Methods of immunotherapy |
WO2018005712A1 (en) * | 2016-06-28 | 2018-01-04 | Geneius Biotechnology, Inc. | T cell compositions for immunotherapy |
WO2018009847A1 (en) * | 2016-07-08 | 2018-01-11 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103380212B (zh) * | 2010-12-22 | 2017-04-05 | 菲特治疗公司 | 用于单细胞分选与增强ipsc重新编程的细胞培养平台 |
WO2013176197A1 (ja) | 2012-05-22 | 2013-11-28 | 国立大学法人 東京大学 | 抗原特異的t細胞の製造方法 |
DK3183268T3 (da) | 2014-08-19 | 2020-05-11 | Univ Pennsylvania | Behandling af cancer ved anvendelse af en cd123-kimær antigenreceptor |
CN114621969A (zh) | 2014-09-17 | 2022-06-14 | 诺华股份有限公司 | 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞 |
GB201507368D0 (en) | 2015-04-30 | 2015-06-17 | Ucl Business Plc | Cell |
JPWO2019070021A1 (ja) * | 2017-10-06 | 2021-01-21 | サイアス株式会社 | iPS細胞由来の遺伝的多様性を有するT細胞集団の製造方法 |
-
2019
- 2019-07-30 US US17/264,485 patent/US20210238550A1/en active Pending
- 2019-07-30 EP EP19844833.4A patent/EP3831936A4/en active Pending
- 2019-07-30 WO PCT/JP2019/029750 patent/WO2020027094A1/ja unknown
- 2019-07-30 JP JP2020534650A patent/JPWO2020027094A1/ja active Pending
- 2019-07-30 CN CN201980048222.1A patent/CN112513255A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011096482A1 (ja) * | 2010-02-03 | 2011-08-11 | 国立大学法人東京大学 | 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 |
WO2016076415A1 (ja) * | 2014-11-13 | 2016-05-19 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からt細胞への誘導方法 |
WO2017078807A1 (en) * | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
WO2017203356A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Methods of immunotherapy |
WO2018005712A1 (en) * | 2016-06-28 | 2018-01-04 | Geneius Biotechnology, Inc. | T cell compositions for immunotherapy |
WO2018009847A1 (en) * | 2016-07-08 | 2018-01-11 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
TOSHINOBU NISHIMURA ET AL.: "Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation", 《CELL STEM CELL.》, vol. 12, no. 1, pages 114 - 126, XP055567898, DOI: 10.1016/j.stem.2012.11.002 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2020027094A1 (ja) | 2020-02-06 |
JPWO2020027094A1 (ja) | 2021-09-16 |
EP3831936A1 (en) | 2021-06-09 |
EP3831936A4 (en) | 2022-04-13 |
US20210238550A1 (en) | 2021-08-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11578310B2 (en) | Method for producing CD4/CD8 double-positive T cells | |
JP6736003B2 (ja) | 多能性幹細胞からt細胞への誘導方法 | |
EP3572502B1 (en) | Method for producing cd8alpha +beta + cytotoxic t cells | |
CN112513255A (zh) | 介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法 | |
JP7016102B2 (ja) | T細胞又はnk細胞の製造方法、t細胞又はnk細胞の培養用培地、t細胞又はnk細胞の培養方法、未分化t細胞の未分化状態を維持する方法及びt細胞又はnk細胞の増殖促進剤 | |
WO2016010155A1 (ja) | 抗原特異的t細胞受容体遺伝子を有する多能性幹細胞の製造方法 | |
WO2016010153A1 (ja) | 免疫細胞療法用t細胞の誘導方法 | |
WO2022059780A1 (ja) | iPS細胞を介する再生T細胞の製造方法 | |
WO2015099134A1 (ja) | 再構成されたt細胞レセプター遺伝子を有する多能性幹細胞由来のt前駆細胞を用いる免疫細胞療法 | |
EP3693456A1 (en) | Production method for ips cell-derived genetically diverse t cell colony | |
US20220233665A1 (en) | Medicinal composition | |
TW202345878A (zh) | 控制性t細胞之製造方法 | |
EP4324917A1 (en) | Cell bank composed of ips cells for introducing t cell receptor gene | |
US20220162551A1 (en) | Methods for making, compositions comprising, and methods of using rejuvenated t cells | |
WO2022145490A1 (ja) | iPS細胞を介する再生T細胞の製造方法 | |
CN116744947A (zh) | 一种通过iPS细胞生产再生T细胞的方法 | |
CN116615209A (zh) | 制备再生t细胞的方法、包含再生t细胞的组合物及使用再生t细胞的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |