CN112513255A - 介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种介由iPS细胞来制造维持重编程前的T细胞群体的遗传多样性且对抗原具有指向性的再生T细胞群体的方法。该方法包括(1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或溶解物接触，浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序，(2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序，以及(3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。
Description
技术领域
本发明涉及制造具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法、通过该方法制造的再生T细胞群体以及含有该再生T细胞群体的医药组合物。
背景技术
T细胞在对细菌或者病毒等外来病原体或癌细胞等异常细胞的免疫应答中发挥核心作用。因此，T细胞功能低下被认为会促使病原体感染或癌的产生。对起因于T细胞功能低下的疾病而言，T细胞的补充、再生可成为改善或治疗疾病症状的极为有效的手段。
已提出使用iPS细胞等多能干细胞诱导的T细胞进行的T细胞补充疗法。通过使用对目标抗原具有特异性的T细胞作为用于制备iPS细胞的原料，可制备与原始T细胞示出相同抗原特异性的再生T细胞(非专利文献1；本文献的内容，以其整体引入本说明书中作为参照)。在此方法中，所建立的iPS细胞是以来自单一细胞的细胞群体(集落，colony)单位进行重编程的。根据该方法，可以利用细胞性状稳定，向目标细胞、组织的分化效率高，通过基因分析等确认无变异或异常的iPS细胞株。在此，为了确认克隆的质量或对患者的适用性，有必要逐个检查克隆，因此克隆化被认为是重要的工序。
另一方面，在使用人及小鼠的研究中，在针对感染性疾病、肿瘤进行T细胞补充疗法时，已知使用具有遗传多样性的T细胞群体的方法可诱导针对目标组织或抗原的多种免疫反应，同时该方法不易受到由于抗原表达低下或变异而产生的免疫逃逸(immuneescape)的影响，因此可获得较好的治疗效果。
作为现有技术，将T细胞受体(T cell receptor：TCR)或嵌合抗原受体(chimericantigen receptor：CAR)的基因导入T细胞的基因修饰T细胞已被报道，但导入的所述受体的基因序列是单一的(专利文献1～3)。此外，使从外周血T细胞制备的iPS细胞再分化而制造具有与原始T细胞相同的抗原特异性的T细胞的方法已被报道，但并未示出赋予遗传多样性的相关内容(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特表2017-534261
专利文献2：特表2017-530694
专利文献3：特表2018-514204
专利文献4：特开2017-158559
非专利文献
非专利文献1：Nishimura T，et al.Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.CellStem Cell.2013 Jan 3；12(1)：114-126.
发明内容
发明要解决的课题
通常，在利用iPS细胞株的方法中，要进行克隆化，但克隆化意味着将选定的克隆以外排除。因此在将通过T细胞建立的iPS细胞进行克隆化时，存在于原始T细胞群体的遗传多样性会完全丧失。这意味着只能利用以单一的抗原表位为对象的免疫反应。然而，在以单一的抗原表位为对象的免疫反应中，可能会产生易于受到抗原分子的表达低下或变异等引起的免疫逃逸(immune escape)的影响，在T细胞补充疗法中难以获得较好治疗效果的问题。另一方面，在现行的T细胞补充疗法中，尽管能够使用具有遗传多样性的T细胞群体，但会产生由于T细胞群体在体外的扩增使得T细胞疲劳，针对抗原的免疫反应下降的问题。为此，期望开发制备具有遗传多样性的再生T细胞群体的新的方法，以用于T细胞补充疗法中。
本发明的目的是提供一种介由iPS细胞来制造具有遗传多样性的再生T细胞群体的方法以及通过该方法制造的再生T细胞群体。本发明的目的是通过提供该再生T细胞群体来解决以单一抗原表位为对象的上述课题和由T细胞群体疲劳引起的上述课题。本发明的目的还为提供一种含有该再生T细胞群体的医药组合物以及使用该医药组合物的治疗癌症的方法。
解决课题的方法
本发明的目的通过如下发明实现。
[1]一种方法，是介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法，其包括
(工序1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触，浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序，
(工序2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序，以及
(工序3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其中所述再生T细胞群体是维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性，且对所述肿瘤相关抗原具有指向性的再生T细胞群体。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体来自哺乳动物。
[4]根据[3]所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[5]根据[4]所述的方法，其中所述人是癌症患者或非癌症患者。
[6]根据[5]所述的方法，其中所述癌症患者或非癌症患者已施予癌疫苗，或正在施予癌疫苗，或预定今后施予癌疫苗。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体来自体液。
[8]根据[7]所述的方法，其中所述体液选自血液，淋巴液，组织液，以及体腔液包括腹水、胸水、心包液、脑脊髓液、关节液和眼房水，以及鼻水和尿。
[9]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体是来自肿瘤组织的T细胞。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体是αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞或其混合物。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中所述工序1中的生物组织是原发癌组织和转移癌组织。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括分离通过与一种以上的肿瘤相关抗原接触而激活并增殖的T细胞的工序。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序和选择产生IFN-γ的T细胞的工序中的至少一种工序。
[14]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序，选择产生IFN-γ的T细胞的工序和选择结合抗原肽-HLA复合体的T细胞的工序中的至少一种工序。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的方法，其中所述工序2包括不克隆化而回收、继代处理iPS细胞的步骤。
[16]根据[1]～[15]中任一项所述的方法，其中在所述工序3中得到的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法。
[17]根据[1]～[16]中任一项所述的方法，其中在所述再生T细胞群体中，维持的Vβ种类为两种以上。
[18]一种再生T细胞群体，通过[1]～[17]中任一项所述的方法制造。
[19]根据[18]所述的再生T细胞群体，其维持存在于生物体内的T细胞群体的遗传多样性。
[20]一种医药组合物，其含有[18]或[19]所述的再生T细胞群体。
[21]根据[20]所述的医药组合物，其用于通过自体或同种移植治疗癌症治疗对象。
[22]一种癌症治疗方法，其使用[20]或[21]所述的医药组合物。
发明的效果
通过本发明，可介由iPS细胞制造对抗原具有指向性和遗传多样性的再生T细胞群体。通过用肿瘤相关抗原刺激存在于生物体内的T细胞群体，可浓缩对该肿瘤相关抗原具有指向性和遗传多样性的T细胞，但通过将该浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，进而使之再分化为T细胞群体，可获得维持了浓缩的T细胞群体对该肿瘤相关抗原的指向性和遗传多样性的再生T细胞群体。如此获得的再生T细胞群体在T细胞补充疗法中可示出高的治疗效果。特别是，已知肿瘤浸润T细胞(Tumor Infiltrating Lymphocyte：TIL)对肿瘤具有特异性且识别多种抗原，通过介由将TIL重编程为iPS细胞而制造再生TIL群体，可利用具有遗传多样性的复壮(rejuvenating)后T细胞实施具有肿瘤特异性且有效的T细胞补充疗法。
附图说明
[图1]是示出从肺癌患者体内摘除的肿瘤中分离的T细胞群体具有TCR β链的多样性的图。本图横轴的Vβ1～Vβ23表示TCR β链的种类(24种)，纵轴示出具有各TCR β链的T细胞所占的比例。虽然Vβ种类不同，所占的比例也不同(约1～12％)，但T细胞群体中存在所有的Vβ。但是，本例中使用的TCR库试剂盒(TCR Repertoire Kit)的检测限存在未被检测到的Vβ，因此本图的比例相加也不会是100％。
[图2]是示出从肺癌患者体内摘除的肿瘤中分离的T细胞群体介由iPS细胞制造的再生T细胞群体具有TCR β链的多样性的图。相对于原始T细胞群体中存在全部24种Vβ(图1)，再生T细胞群体中所含的Vβ为13种(Vβ1、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ9、Vβ11、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ17、Vβ18、Vβ22、Vβ23)，保存有约54％的Vβ的多样性。
[图3]是示出利用流式细胞仪对使用GPC3肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体进行解析的结果的图。对CD4和CD14中任一者都未表达的部分(左图)进行门控，用CD8和CD137显像(右图)。根据本图，显示出对GPC3具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。
[图4]是示出对使用GPC3肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体，浓缩表达CD8和CD137两者的细胞群体，与图3一样利用流式细胞仪进行解析的结果的图。与图3相比，通过CD8阴性筛选(negative selection)，表明表达CD4的细胞被去除(左图)。此外，通过CD137阳性筛选(positive selection)，表明未表达CD137的细胞也被去除(右图)。因此，显示出对GPC3具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例浓缩。
[图5]是示出诱导从对GPC3具有指向性的T细胞群体重编程的iPS细胞再次再分化为CD8单阳性T细胞的结果的图。对进行了再分化诱导的细胞，用抗体(CD3-APC/Cy7、CD4-BV421、CD8-PerCP/Cy5.5、TCRab-FITC、CD45-BV510以及GPC3-HLA复合体(Dextramer)-APC)染色，使用流式细胞仪(BD FACSAria(注册商标)II)，解析对GPC3具有指向性的T细胞群体的比例。
[图6]是示出对于使用WT1重叠肽对非癌症患者(健康人)的外周血单核细胞进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体，与图3一样进行解析的结果的图。通过本图，示出对WT1具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。
[图7]是示出对于使用WT1重叠肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体，与图4一样进行解析的结果的图。通过本图，示出对WT1具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例浓缩。
[图8]是示出对于使用EBV LMP2A重叠肽对非癌症患者(健康人)的外周血单核细胞进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体，与图3一样进行解析的结果的图。通过本图，示出对EBV LMP2A具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。
[图9]是示出对于使用EBV LMP2A重叠肽进行扩增培养并表达了激活标记的T细胞群体，与图4一样进行解析的结果的图。通过本图，示出对EBV LMP2A具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例浓缩。
[图10]是示出通过诱导从对GPC3具有指向性的T细胞群体重编程的iPS细胞再分化为CD8单阳性T细胞从而得到的再生T细胞群体对表达GPC3肽的靶细胞具有特异性细胞毒活性的图。(A)为示出再生T细胞群体的流式细胞术的分析结果的图。(B)为示出以表达了或未表达GPC3肽的靶细胞对再生T细胞群体的细胞毒活性进行比较的结果的图。
具体实施方式
本发明提供一种介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法。该方法包括(工序1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触，浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序，(工序2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序，以及(工序3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。本发明的特征还在于，通过本发明得到的再生T细胞群体维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性，且对所述肿瘤相关抗原具有指向性。
在本发明中，“介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法”是指从具有遗传多样性的T细胞群体，介由重编码为iPS细胞，再生为在维持遗传多样性的同时对抗原具有指向性的T细胞群体的方法。在本发明中，将通过该方法制造的T细胞群体称为“再生T细胞群体”。此外“T细胞”是指在细胞表面表达被称为T细胞受体(T cell receptor：TCR)的抗原受体的细胞。
[工序1]
本发明的工序1是使具有遗传多样性的T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触，浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序。
在本发明中，“T细胞群体”是CD3和CD45为阳性的淋巴细胞，是识别抗原的T细胞受体(TCR)的基因序列作为群体而言是多样的细胞群体。因此，从生物体采集的T细胞是对多样的抗原具有特异性的T细胞群体。在存在于生物体内的T细胞中，在前体T细胞在胸腺内发育并分化时，TCR基因发生随机重组，使得各个T细胞具有不同的TCR基因序列，从而可能对所有抗原产生免疫反应。尽管各个T细胞所具有的TCR是分别由特异性识别的抗原或肽的序列决定的，但可理解通过将T细胞视为群体，该T细胞群体是以多样的抗原作为免疫对象的。因此，在这个意义上，自生物体采集的T细胞群体是具有遗传多样性的T细胞群体。自这样的T细胞群体建立的iPS细胞虽未表达TCR基因，但发生了重组的TCR的基因信息保留在iPS细胞的DNA中。维持遗传多样性的iPS细胞是自具有遗传多样性的T细胞群体建立的iPS细胞，对于各个细胞，是指TCR的基因序列不同的细胞群体。
在本发明中，T细胞优选来自哺乳动物，更优选来自人(癌症患者或非癌症患者)。所述癌症患者或非癌症患者优选已施予癌疫苗，或正在施予癌疫苗，或预定今后施予癌疫苗的患者。所施予的癌疫苗可以施予一种或一种以上。T细胞没有特别限制、但例如可列举αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、以及自然杀伤(NK)T细胞。此外，作为T细胞的采集来源，由于侵袭性低而优选外周血，但不限于此。作为其他优选的采集来源，可列举癌组织或肿瘤组织或其他组织或器官、或血液、脐带血、淋巴液、组织液(组织间液、细胞间液和间质液)、体腔液(腹水、胸水、心包液、脑脊髓液、关节液和眼房水)、鼻水、尿等体内所有的采集来源。在本发明的一个实施方式中，优选的T细胞为来自肿瘤组织的T细胞。来自肿瘤组织的T细胞通常为肿瘤浸润T细胞。
“癌疫苗”是癌或肿瘤特异性蛋白质或肽，是包含来自癌或肿瘤相关抗原，用于诱导癌或肿瘤特异性免疫应答的疫苗抗原的组合物。“癌疫苗”也包括用作为癌或肿瘤特异性抗原的癌组织或蛋白质或肽进行了抗原脉冲的树突状细胞等细胞疫苗，在被给药的生物体内表达抗原的病毒DNA或RNA疫苗，及抑制了增殖的癌或肿瘤细胞和其破碎物或溶解物的组合物。进一步，“癌疫苗”也包括细菌菌体、细菌提取物、β葡聚糖等非特异性免疫赋活剂、及腺病毒等溶瘤病毒。一般而言，癌疫苗包括用于增强疫苗抗原诱导的特异性免疫应答的佐剂。包含于癌疫苗的疫苗抗原在给药至生物体后，被抗原呈递细胞(主要是树突状细胞和巨噬细胞)吞噬，在其细胞内被处理，成为由约8～30个残基的氨基酸构成的表位肽(epitopepeptide)，作为与主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex：MHC)I类或II类结合的复合体，在抗原呈递细胞的表面被呈递。表位肽的长度为，在MHC I类时是氨基酸8～11个残基，在MHC II类时是氨基酸13～30个残基。在细胞毒性T细胞和辅助T细胞的表面表达的T细胞受体(TCR)分别特异性识别MHC I类/肽复合体或MHC II类/肽复合体。其结果，这些T细胞被激活，发挥抗肿瘤的效果。即，细胞毒性T细胞识别、破坏呈递与疫苗抗原所含相同的表位肽的癌细胞，辅助T细胞通过干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-2等细胞因子和趋化因子的分泌，增强细胞毒性T细胞的功效。辅助T细胞也具有经由CD40配体(CD40L)/CD40路径，增强抗原呈递细胞的抗原呈递能力和B细胞的抗原特异性免疫球蛋白(Ig)G抗体产生的功效。
本发明的具有遗传多样性的再生T细胞群体对于任何抗原或组织都能起作用。特别是将本发明的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法的情况下，所采集的T细胞群体优选对治疗对象的癌、肿瘤、肿瘤相关抗原或其变异抗原或病毒等具有指向性。作为治疗对象的癌或肿瘤可列举乳腺癌、肺癌、肝癌、口腔癌、鼻咽癌、头颈癌、胃癌、食道癌、大肠癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、肾癌、胰腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、膀胱癌、滑膜肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤和多发性骨髓瘤等，但不限于此。
作为上述肿瘤相关抗原或其变异抗原，可列举对各肿瘤特异性或非特异性地表达的WT1、GPC3、XAGE1、MUC1、MUC5AC、MUC6、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、MAGE A1、端粒酶、PRAME、SSX2/4、PSCA、CTLA-4、gp100、GD2、GD3、岩藻糖GM1、GM3、sLe(a)、糖脂类F77、间皮素、PD-L1、trp1、trp2、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33、c-Met、p53、p53变异体、NY-ESO-1、PSMA、ETV6-AML、CEA、PSA、AFP、hTERT、EpCAM、ALK、雄激素受体、EphA2、CYP1B1、OY-TES-1、MAD-CT-2、MelanA/MART1、生存素(Survivin)、Ras、Ras变异体、ERG、bcr-abl、XBP 1、及基因变异和剪接异常产生的肿瘤新抗原(Neoantigen)等肿瘤相关抗原，但不限于此。另外，作为病毒抗原，可列举灭活HBV和HPV等灭活病毒，以及来自各种病毒的蛋白质EBV LMP1、EBV LMP2、EBNA(EBV核抗原)、HPV E1、HPV E2、HPV E6、HPV E7、HBV HBs、HTLV-1 Tax和HBZ(HTLV-1bZIP因子)等，但不限于此。进一步，在是蛋白质抗原时，也可以将上述抗原肽片段化。
在本发明的工序1中，生物体组织是指哺乳动物特别是人的上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织、体液等。包含肿瘤相关抗原的生物体组织包括原发癌组织和转移癌组织。这些组织可以通过均化器、超声波发生器、冷冻破碎机等进行物理破碎而得到破碎物。另外，这些组织可通过例如磷酸盐平衡缓冲液等溶剂或通过例如作为两性表面活性剂的CHAPS和作为非离子表面活性剂的Triton X和Tween 20等表面活性剂溶解而作为溶解液。
生物体内存在非常多样的T细胞以能与任何抗原发生反应，但大多数都是在T细胞补充疗法中与目标抗原无关的T细胞。因此，作为介由重编程为iPS细胞制造的T细胞的原料，预先浓缩了对作为T细胞补充疗法的对象的癌、肿瘤或病毒有反应性的T细胞群体，从而在再生T细胞群体的治疗效果显著提高的同时，可以抑制对预想外抗原的免疫反应并提高安全性。
在本发明的一个实施方式中，工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括分离通过与一种以上的肿瘤相关抗原接触而激活并增殖的T细胞的工序。使T细胞与肿瘤相关抗原接触后，通过接受T细胞受体对肿瘤相关抗原识别和共刺激的信号，T细胞被激活。作为接触的方法，例如使用添加有肿瘤相关抗原或包含肿瘤相关抗原的生物体组织或其破碎物或其溶解物的培养液，对包含抗原呈递细胞和T细胞的外周血单核细胞进行培养。在培养液中，通过添加IL-2、IL-7、IL-15、IL-21等细胞因子，可以使目标T细胞高效扩增。在扩增培养后，通过以浓缩对肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞为目的而施加上述刺激，被激活的T细胞在细胞膜表面表达CD137分子或IFN-γ等功能性分子。对于这些功能性分子，可以通过用荧光蛋白或磁珠标记的特异性抗体染色，通过使用流式细胞仪分选或使用磁石分离，浓缩对目标的肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞。
本发明的工序1中，“对肿瘤相关抗原具有指向性”是指各个T细胞分别特异性识别各抗原表位或肽序列，同时作为T细胞群体，示出对目标组织或抗原的免疫反应。
在本发明的一个实施方式中，作为浓缩对目标组织或抗原具有指向性的T细胞群体的方法，例如可列举使抗原蛋白质或肽与T细胞接触，激活T细胞，分离增殖的T细胞的方法。在该方法中，培养含有抗原呈递细胞的单核细胞部分，向培养液中添加抗原蛋白质或肽。通过重复让T细胞与抗原蛋白质或肽接触，反应性T细胞增殖，相对于T细胞群体整体的比率上升。另一方面，不与添加的抗原蛋白质或肽反应的T细胞不被激活，在体外(invitro)培养过程中比率渐渐减低，最终死亡。因此，在经过一定时间的培养后，可以浓缩而得到对向培养液中添加的抗原蛋白质或肽具有特异反应性，同时在识别的抗原表位或肽序列中具有多样性的T细胞群体。
在本发明的一个实施方式中，作为T细胞群体的浓缩方法，可列举在激活T细胞群体后，选择表达CD137的T细胞的方法和选择产生IFN-γ的T细胞的方法。在这些方法中，可以在结合对CD137或IFN-γ特异性的抗体后，使用磁珠进行磁性分离或通过使用荧光标记的流式细胞仪进行选择性分离。也可以使用双特异性抗体(相对于T细胞和IFN-γ的双特异性抗体)捕获产生IFN-γ的细胞的系统。进一步，在本发明其他实施方式中，也可以举例选择抗原肽-HLA(human leukocyte antigen，人类白细胞抗原)复合体的寡聚物结合的T细胞的方法。在该方法中，通过用荧光色素标记由特定HLA型和该HLA可呈递的目标抗原肽的复合体组成的寡聚物，使用流式细胞仪对寡聚物结合的细胞进行分选，能够得到具有针对目标组织或抗原的指向性的T细胞。在浓缩T细胞群体时，这些方法可以单独或组合使用。
[工序2]
本发明的工序2是将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序。
iPS细胞的制造方法在本领域中是公知的。在本发明中，iPS细胞优选通过向工序(1)中浓缩的T细胞群体中导入重编程因子而制备。在此，作为重编程因子，可列举Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物，这些重编程因子可单独使用，也可组合使用。
对生物体内存在的T细胞群体而言，TCR基因序列作为群体是多样的，在这种意义上具有遗传多样性。自该T细胞群体建立的iPS细胞在维持该遗传多样性的同时进行培养。在培养iPS细胞时优选进行继代。但是，在一般的继代方法中，由于除了用于继代的细胞以外的细胞被舍弃，因此自具有遗传多样性的T细胞群体建立的iPS细胞的多样性逐渐丧失。与此相对地，在本发明中，优选建立iPS细胞后，洗涤培养器，优选去除iPS细胞以外的细胞，不经克隆化而回收iPS细胞，在其它的培养器中继代。然后反复进行这样的继代。
本发明的工序2中所用的培养液没有特别的限制，可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液，向其中添加用于维持iPS细胞的未分化能力的细胞因子类来调配。作为基础培养液，例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司)、StemFit(注册商标)AK03N(味之素Healthy Supply公司)及其混合培养液。培养液中可添加血清或无血清。细胞因子类优选可列举bFGF，其在培养液中的浓度例如为1～100μg/ml(优选50μg/ml)。
在本发明的一个实施方式中，iPS细胞的培养方法可为贴壁培养或悬浮培养，但优选贴壁培养。iPS细胞的分离方法例如可列举通过细胞刮刀等进行力学分离的方法以及使用具有蛋白酶活性的分离溶液、具有胶原酶活性的分离溶液、或具有蛋白酶活性及胶原酶活性的分离溶液(例如Accutase(注册商标)及Accumax(注册商标)等)进行的分离方法。
在本发明的一个实施方式中，iPS细胞优选在细胞密度达到1x103～1x104个细胞/cm2、1x104～1x105个细胞/cm2或1x105～1x106个细胞/cm2的情况下向其它的培养器中继代。继代的次数可为足以得到T细胞补充疗法所必要的量的iPS细胞的任何次数，优选1～5次或5～10次。
本发明的一个实施方式中，获得的具有遗传多样性的iPS细胞可直接使用，或可以冷冻保存至必要时。细胞的冷冻保存方法是本领域技术人员所周知的。
[工序3]
本发明的工序3是自上述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。在本发明的一个实施方式中，该再生T细胞维持工序1中浓缩的T细胞群体的遗传多样性，并且具有针对工序1中使用的肿瘤相关抗原的指向性。
在本发明的一个实施方式中，再生T细胞群体优选自本发明的工序2中培养的iPS细胞经由造血祖细胞分化为CD4/CD8双阳性T细胞而得，或自本发明的工序2中培养的iPS细胞经由造血祖细胞及CD4/CD8双阳性T细胞分化为CD8单阳性T细胞而得。
造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPC)为可能分化为淋巴细胞、嗜酸粒细胞、嗜中性细胞、嗜碱性细胞、红细胞、或巨核细胞等血细胞系细胞的细胞。在本发明的一个实施方式中，造血祖细胞和造血干细胞之间没有区别，只要无特别否定则表示相同的细胞。造血干细胞/祖细胞例如可通过表面抗原CD34及/或CD43为阳性而识别。
在本发明的一个实施方式中，造血祖细胞优选通过在添加维生素C类的培养液中培养iPS细胞而制备。在此，“维生素C类”是指L-抗坏血酸及其衍生物，“L-抗坏血酸衍生物”是指在生物体内经酶反应变为维生素C的物质。L-抗坏血酸的衍生物例如可列举磷酸维生素C，抗坏血酸葡糖苷，抗坏血酸乙酯，维生素C酯，四己基癸醇抗坏血酸酯，抗坏血酸硬脂酸酯及抗坏血酸-2-磷酸-6软脂酸。L-抗坏血酸的衍生物优选磷酸维生素C，例如可列举磷酸-L-抗坏血酸钠或磷酸-L-抗坏血酸镁等磷酸-L抗坏血酸盐。在培养液中例如可含有5～500μg/ml浓度的维生素C类。
在本发明的一个实施方式中，造血祖细胞的制备中所用的培养液没有特别限制，可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液，向其中添加维生素C类等进行调配。基础培养液例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司)、StemPro34(Life Technologies公司)及其混合培养液。培养液中可含有血清或可无血清。根据需要，基础培养液例如可含有选自白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等的1种以上物质。
在本发明的一个实施方式中，可向用于制造造血祖细胞的培养液中进一步添加选自BMP4(骨形成蛋白4)、VEGF(血管内皮生长因子)、bFGF(基本成纤维细胞生长因子)、SCF(干细胞因子)、TPO(血小板生成素)、及FLT-3L(Flt3配体)的细胞因子。
在本发明的一个实施方式中，其浓度例如为：BMP4为1～100ng/ml，VEGF为1～100ng/ml，bFGF为1～100ng/ml，SCF为10～100ng/ml，TPO为1～100ng/ml，FLT-3L为1～100ng/ml。
在本发明的一个实施方式中，可向培养液中添加TGF β抑制剂。“TGF β抑制剂”是指干扰TGF β家族信号传导的小分子抑制剂，例如可列举SB431542和SB202190(R.K.Lindemann et al.，Mol.Cancer 2：20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908和SD208(Scios)、以及LY2109761、LY364947及LY580276(LillyResearch Laboratories)，向培养液中添加的浓度优选为0.5～100μM。
在本发明的一个实施方式中，iPS细胞可与C3H10T1/2(Takayama N.，et al.J ExpMed.2817-2830，2010)或异种来源的间质细胞(Niwa A et al.J Ce11 Physiol.2009Nov；221(2)：367-77)等饲养细胞共培养，但优选不使用饲养细胞而培养iPS细胞。
在本发明的一个实施方式中，制备造血祖细胞时的iPS细胞培养方法可为贴壁培养或悬浮培养，但优选悬浮培养。例如，iPS细胞可在将培养至相对于所使用的培养皿融合度达80％的集落分离，并在解离为单细胞后进行悬浮培养。iPS细胞的分离方法例如可列举使用细胞刮刀等进行力学分离的方法以及使用具有蛋白酶活性及胶原酶活性的分离溶液(例如Accutase(注册商标)及Accumax(注册商标)等)或具有胶原酶活性的分离溶液的分离方法。
悬浮培养是指以细胞对培养容器非贴壁的状态进行培养。在本发明的一个实施方式中，对悬浮培养没有特别限制，可以使用未进行以提高与细胞的粘附性为目的的人工处理(例如通过细胞外基质等进行涂布处理)的培养容器，或使用经人工进行抑制粘附处理(例如通过聚羟乙基甲基丙烯酸(po1y-HEMA)或非离子性的表面活性多元醇(Pluronic F-127等)进行涂布处理)的培养容器进行。在悬浮培养时，优选使胚状体(EB)形成而培养。
在本发明的另一实施方式中，造血祖细胞可自培养iPS细胞而得的网状构造物(称为iPS-sac)调配。在此，“网状构造物”是指来自iPS细胞的立体囊状(伴有内部空间)的构造体，为由内皮细胞群体等形成，在内部含有造血祖细胞的构造体。
在本发明的一个实施方式中，用于培养自iPS细胞制备造血祖细胞时的温度条件没有特别限制，但可列举例如为约37℃～约42℃左右，优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养期间时间，本领域技术人员可在监控造血祖细胞的细胞数等的同时适当决定。只要获得造血祖细胞，则不特别限定天数，但例如可列举至少6天以上，7天以上，8天以上，9天以上，10天以上，11天以上，12天以上，13天以上，或14天以上，优选为14天。较长的培养期间时间不会在造血祖细胞的制备中成为问题。另外，可在低氧条件下培养，在本发明的一个实施方式中，低氧条件例如可列举15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％或更少的氧浓度。
在本发明中，“CD4/CD8双阳性T细胞”是指在T细胞中表面抗原CD4及CD8共同呈阳性的细胞(CD8+CD4+)，由于T细胞可通过表面抗原CD3及CD45为阳性来识别，因此CD4/CD8双阳性T细胞可作为CD4、CD8、CD3及CD45为阳性的细胞而加以鉴定。CD4/CD8双阳性T细胞可通过诱导而分化为CD4单阳性细胞或CD8单阳性细胞。
在本发明的一个实施方式中，CD4/CD8双阳性T细胞可通过使用包括在添加p38抑制剂及/或SDF-1的培养液中培养造血祖细胞的工序的方法制备。
在本发明中，“p38抑制剂”定义为抑制p38蛋白质(p38MAP激酶)的功能的物质。在本发明的一个实施方式中，p38抑制剂例如可列举p38的化学抑制剂、p38的显性阴性变异体或编码其的核酸等，但不限于此。
在本发明的一个实施方式中，p38的化学抑制剂可列举SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB202190(4-(4-氟苯基)-2-(4-羟基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)及其衍生物、SB239063(反式-4-[4-(4-氟苯基)-5-(2-甲氧基-4-嘧啶基)-1H-咪唑-1-基]环己醇)及其衍生物、SB220025及其衍生物、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCl0-469、SCIO-323、VX-702、或FR167653，但不限于此。这些化合物是市售的，例如SB203580、SB202190、SC239063、SB220025及PD169316可从Calbiochem公司购买，SCl0-469及SCIO-323可从Scios公司等购买。
在本发明的一个实施方式中，作为p38的显性阴性变异体，可列举位于p38的DNA结合域的180位的苏氨酸发生点突变成为丙氨酸的p38T180A，以及人及小鼠中的p38的182位的酪氨酸发生点突变成为苯丙氨酸的p38Y182F等。
向培养液中添加例如约1μM～约50μM的范围的p38抑制剂。
在本发明的一个实施方式中，SDF-1(Stromal cell-derived factor间质1，细胞衍生因子1)不仅为SDF-1α或其成熟型，也可以为SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1ε或
等异构体或它们的成熟型，或者可以为它们的任意比例的混合物等。优选使用SDF-1α。此外，SDF-1有时称为CXCL-12或PBSF。
在本发明的一个实施方式中，SDF-1只要保有其趋化因子活性即可，其氨基酸序列中的1或数个氨基酸可取代、缺失及/或添加，同样地，糖链也可以被取代、缺失及/或添加。SDF-1中只要在至少保持4个半胱氨酸残基(人SDF-1α的情况下为Cys30、Cys32、Cys55及Cys71)、并且相对于天然体氨基酸序列具有90％以上的同一性的范围内，可允许氨基酸变异。SDF-1可为哺乳动物的SDF-1，例如人的SDF-1，例如猴、羊、牛、马、猪、狗、猫、兔、大鼠、或小鼠等非人哺乳动物的SDF-1。例如，人的SDF-1α可使用以GenBank登录编号NP_954637登录的蛋白质，SDF-1β可使用以GenBank登录编号NP_000600登录的蛋白质。
在本发明的一个实施方式中，SDF-1可使用市售品，也可使用天然提纯的物质，或使用肽合成或基因工程学手段制备的物质。
在本发明的一个实施方式中，向培养液中添加例如约10ng/ml～约100ng/ml的范围的SDF-1。
在本发明的一个实施方式中，制备CD4/CD8双阳性T细胞所用的培养液没有特别限制，可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液，向其中添加p38抑制剂及/或SDF-1，进一步优选添加维生素C类而调配。此外，CD4/CD8双阳性T细胞制备工序中使用的维生素C类的种类例如为上述种类，但维生素C类的浓度例如为5～200μg/ml。基础培养液，例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、OP9培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司)，及其混合培养液等。培养液中可添加血清或也可无血清。根据需要，基础培养液例如可含有白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等1种以上物质。
在本发明的一个实施方式中，在CD4/CD8双阳性T细胞的制备中所用的培养液中，可进一步添加选自SCF、TPO(血小板生成素)、FLT-3L及IL-7的细胞因子。其浓度例如为：SCF为10～100ng/ml，TPO为10～200ng/ml，FLT-3L为1～100ng/ml，IL-7为1～100ng/ml。
在本发明的一个实施方式中，在制备CD4/CD8双阳性T细胞时，可使用饲养细胞培养造血祖细胞，但优选不使用饲养细胞进行培养。
在本发明的一个实施方式中，造血祖细胞可贴壁培养或悬浮培养，但本工序优选为贴壁培养。在贴壁培养的情况下，可使用经涂布的培养容器。作为涂布剂例如可列举：基质胶(Niwa A，et al.PLoS One.6(7)：e22261，2011)、胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、RetroNectin、Fc-DLL4或巢蛋白，及其组合。
在本发明的另一实施方式中，悬浮培养胚状体获得造血祖细胞时，优选在将其解离为单细胞后实施贴壁培养。
在本发明的一个实施方式中，为了制备CD4/CD8双阳性T细胞而培养造血祖细胞时的温度条件没有特别限定，但例如优选约37℃～约42℃左右，更优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养期间，本领域技术人员可在监控CD4/CD8双阳性T细胞的细胞数等的同时适当决定。只要获得CD4/CD8双阳性T细胞，则不特别限定培养天数，但可列举例如至少10天以上，12天以上，14天以上，16天以上，18天以上，20天以上，22天以上，或23天以上，优选23天。
在本发明的一个实施方式中，获得的CD4/CD8双阳性T细胞可在分离后使用，也可作为含有其它种类细胞的细胞群体使用。分离时，可使用CD4、CD8、CD3及CD45中的任一者作为指标进行分离。该分离的方法可使用本领域技术人员周知的方法，例如可列举通过CD4、CD8、CD3及CD45的抗体来进行标记，使用流式细胞仪进行分离的方法，或使用将所需的抗原固定化的亲和柱等进行提纯的方法。
“CD8单阳性T细胞”是指T细胞中表面抗原CD8为阳性的细胞(CD8+CD4-)，也称为细胞毒性T细胞。由于可通过表面抗原CD3及CD45为阳性来识别T细胞，CD8单阳性T细胞可作为CD8、CD3及CD45为阳性且CD4为阴性的细胞加以鉴定。
在本发明的一个实施方式中，CD8单阳性T细胞可通过包括在添加肾上腺皮质激素剂的培养液中培养CD4/CD8双阳性T细胞的工序的方法制备。
在本发明的一个实施方式中，肾上腺皮质激素剂优选糖皮质激素或其衍生物，例如可列举醋酸可的松、氢化可的松、醋酸氟氢可的松、泼尼松龙、去炎松、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松或丙酸倍氯米松。优选肾上腺皮质激素剂为地塞米松。其在培养液中的浓度例如为1～100nM。
在本发明的一个实施方式中，制备CD8单阳性T细胞所用的培养液没有特别限制，可将用于培养动物细胞的培养液作为基础培养液，向其中添加肾上腺皮质激素剂进行调配。作为基础培养液，例如可列举伊思柯夫改良培养液(IMDM)、199培养液、Eagle最低必需培养液(EMEM)、αMEM培养液、杜氏改良Eagle培养液(DMEM)、Ham氏F12培养液、RPMI 1640培养液、Fischer氏培养液、神经基础培养液(Life Technologies公司)、及其混合培养液等。培养液中可添加血清或也可无血清。根据需要，基础培养液可含有例如选自白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、脂肪酸、微量元素、2-巯基乙醇、硫醇甘油、脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、小分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类、及细胞因子等1种以上物质。
在本发明的一个实施方式中，制备CD8单阳性T细胞所用的培养液优选进一步含有抗CD3抗体、维生素C类或细胞因子。该细胞因子例如可列举IL-2及IL-7等。
在本发明的一个实施方式中，抗CD3抗体只要是特异性识别CD3的抗体即可，没有特别限制，但例如可列举由OKT3克隆产生的抗体。抗CD3抗体在培养液中的浓度例如为10～1000ng/mL。
在本发明的一个实施方式中，制备CD8单阳性T细胞所用的维生素C类例如为上述物质，可在与上述相同的条件下使用。
在本发明的一个实施方式中，制备CD8单阳性T细胞所用的细胞因子在培养液中的浓度例如为：IL-2为10～1000U/mL，IL-7为1～100ng/mL。
在本发明的一个实施方式中，为制备CD8单阳性T细胞而培养CD4/CD8双阳性T细胞时的温度条件没有特别限制，但例如优选约37℃～约42℃左右，更优选约37℃～约39℃左右。另外，关于培养期间，本领域技术人员可在监控CD8单阳性T细胞的细胞数等的同时适当决定。只要获得CD8阳性T细胞，则不特别限定培养天数，但例如为至少1天以上，2天以上，3天以上，4天以上，或5天以上，优选3天。
在本发明的一个实施方式中，就所维持的遗传多样性的程度而言，维持的Vβ种类优选2种以上，更优选3种以上，进一步优选4种以上。
在本发明的一个实施方式中，所制备的再生T细胞群体优选用于T细胞补充疗法中。在本发明中，T细胞补充疗法是指向生物体补充T细胞的治疗方法，在本发明的一个实施方式中，T细胞补充疗法优选可列举包括再生T细胞的输注、肿瘤内注入、动脉注射、门静脉注射等细胞移植治疗方法。
在T细胞补充疗法中使用通过本发明获得的再生T细胞群体时，在同种移植的情况下，从不易引起排斥反应的角度，优选被采集T细胞的癌症患者或非癌症患者与为治疗癌症而施予通过本发明获得的T细胞的癌症患者的HLA型一致。此外，更优选施予通过本发明获得的T细胞的癌症患者和被采集T细胞的癌症患者是同一个人。即，更优选通过自体移植进行癌症治疗。
本发明包含维持着生物体内存在的T细胞群体的遗传多样性、介由iPS细胞而得的再生T细胞群体。可将包含本发明的再生T细胞群体的医药组合物用于处理癌症治疗对象。在本发明的一个实施方式中，包括使用本发明的医药组合物的治疗癌症的方法。本发明的医药组合物可包含药学上可接受的添加剂。该添加剂例如可列举细胞培养液，磷酸缓冲食盐水等。
通过以下实施例对本发明进行进一步的具体说明，但本发明的范围不受这些实施例的限制。
实施例
[工序1的具体步骤]
将肿瘤相关抗原添加至培养液中，使之与T细胞群体接触，在添加有200U/mL IL-2、10ng/mL IL-15和10ng/mL IL-21的RPMI-1640培养液(包含10％人AB血清、1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺)中培养12天。培养液中添加的肿瘤相关抗原优选在肽的情况下以1～100mg/mL的浓度添加，另外，在使用生物体组织或其破碎物作为肿瘤相关抗原的情况下，每个含有培养液的管中添加约1～5个切片为1～2mm见方的组织片，使之与T细胞群体接触。在使用生物体组织的溶解物的情况下，优选将该溶解物添加至培养液中，使之与T细胞群体接触。在培养后第12天，通过再次接触同一肿瘤相关抗原肽，进一步培养24小时，对对肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞表达了激活标记。对培养的细胞群体，进行使用CD8分子以外的血细胞部分的标记的阴性筛选(CD8+T细胞分离试剂盒，Miltenyi Biotech公司)，以及对激活标记CD137或IFN-γ的阳性筛选(CD137 MicorBead Kit或Cytokine capture system-IFN-γ，Miltenyi Biotech公司)，由此仅浓缩对肿瘤相关抗原具有指向性的CD8单阳性T细胞。
在工序1中使用抗原肽-HLA复合体的情况下，使用的T细胞群体可以是与上述肿瘤相关抗原接触并培养了12天的细胞群体或未进行该培养的细胞群体的任一种。向获得的细胞群体添加进行了荧光标记的目标抗原肽-HLA复合体并先进行30分钟染色后，添加对其他血细胞标记(CD8、CD4及CD14)的荧光标记抗体并进一步进行30分钟染色。染色后，将回收的细胞用磷酸缓冲液洗涤后，通过使用流式细胞仪，仅分选表达抗原肽-HLA复合体和CD8分子的细胞，从而浓缩对目标的肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞。
[工序2的具体步骤：重编程为iPS细胞]
接着，将T细胞回收至15ml管中，悬浮在约250μL的RPMI-1640培养液中，然后使用CytoTune-iPS 2.0试剂盒(ID Pharma株式会社：目录编号DV-0304)，以MOI＝5的效价，将含有重编程所必需的四种因子(Oct3/4，Sox2，Klf4及c-Myc)的仙台病毒添加至培养液中，在37℃条件下温育2小时。温育后，用RPMI-1640培养液洗涤T细胞，从培养液中去除病毒。
接着，为了除去磁珠，通过移液将磁珠与细胞分离后，将管静置于配有磁石的基座上，由此仅回收培养液中悬浮的T细胞。
将获得的T细胞接种于以0.5μg/cm2涂布有iMatrix-511(Nippi公司：目录编号892011)的6cm培养皿上，在RPMI-1640培养液中使用设定为37℃、5％CO2的温育箱开始培养。
在6cm培养皿上开始培养的翌日起，除去一半量的不含细胞的培养上清液，并以与除去的培养液相同的量向StemFit(注册商标)AK03N(味之素Healthy Supply公司)中加入添加了1mM丙戊酸的建立用培养液。
此后，每天交换相同的半量培养液，继续培养20～40天，由此在6cm培养皿中得到大量的iPS细胞集落。在获得了一定数量集落的阶段，将建立用培养液换为iPS细胞用培养液(仅StemFit AK03N)继续培养。
[工序2的具体步骤：在维持所建立的iPS细胞的遗传多样性的同时进行培养]
在iPS细胞的集落成长到肉眼可确认的程度的阶段，将iPS细胞向新涂布有iMatrix-511的6cm培养皿中继代。
在继代时，用PBS(-)清洗贴附于培养皿的iPS细胞之后，添加TrypLeSelect(LifeTechnologies公司：A12859-01)并温育约7分钟，以剥离iPS细胞，使其分散为单个的细胞。使用iPS细胞用培养液洗涤细胞，测得细胞数。然后将分散的细胞以1500个细胞/cm2的密度接种于新涂布有iMatrix-511的6cm培养皿。此时，所回收的iPS细胞不舍弃，而是全部接种于新的培养皿。
将所回收的细胞全部继续接种，由此逐渐扩大培养规模。因此，在建立后进行3～5次继代，在获得使用iPS细胞进行T细胞补充疗法所需量的iPS细胞的阶段，通过以下步骤将细胞冷冻保存。
在使用与继代相同的步骤回收iPS细胞后，将细胞悬浮在TC Protector(DSPharma公司：目录编号KBTCP001)等细胞冷冻液中，以-1℃/分钟的速度降温至-80℃，冷冻iPS细胞。为了长期稳定地保存iPS细胞，期望进一步将其保存于液氮(-196℃)中。
[工序3的具体步骤]
在经超低粘附处理的6孔板(CORNING公司：目录编号3471)上，以3x105～6x105个/孔接种由工序(2)获得的iPS细胞(第0天)，向EB培养液(包含10μg/mL人胰岛素、5.5μg/mL人转铁蛋白、5ng/mL亚硒酸钠、2mM L-谷氨酰胺、45mMα-单硫甘油及50μg/mL抗坏血酸的StemPro34)中添加10ng/mL BMP4，5ng/mL bFGF，15ng/mL VEGF，2μM SB431542，在低氧条件下(5％O2)培养5天(第5天)。
接着，添加50ng/mL SCF、30ng/mL TPO、10ng/mL Flt3L，进一步培养5～9天(～第14天)。
在涂布有Fc-DLL4(5μg/mL)(Sino Biological Inc.)及RetroNectin(5μg/mL)(TAKARA-BIO株式会社)的4孔板上，在添加有50ng/mL SCF、50ng/mL IL-7、50ng/mL Flt3L、100ng/mL TPO、15μM SB203580(Tocris Bioscience)和30ng/mL SDF-1α(PeproTech)的OP9培养液(包含15％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100ng/mL链霉素、55μM 2-巯基乙醇、50μg/ml抗坏血酸、10μg/mL人胰岛素、5.5μg/mL人转铁蛋白和5ng/mL亚硒酸钠)中培养获得的造血祖细胞21天(第35天)。
在第35天，用FACS分离CD45、CD3、CD4及CD8全部为阳性的部分，得到CD4/CD8双阳性细胞(称为DP细胞)。
在96孔板上，在添加15％胎牛血清、500ng/mL抗CD3抗体(eBioscience)、200U/mLIL-2、10ng/mL IL-7及10nM地塞米松的RPMI 1640培养液中培养获得的CD4/CD8双阳性细胞2天(第37天)。用添加有15％胎牛血清的RPMI 1640培养液洗涤细胞，由此去除抗体，用添加有15％胎牛血清及10ng/mL IL-7的RPMI 1640培养液进一步培养5天，由此获得CD8单阳性T细胞(第42天)。
实施例1
基于上述方法，自肺癌患者体内摘除的肿瘤分离的具有遗传多样性的T细胞群体建立iPS细胞，诱导其再分化为具有遗传多样性的T细胞。
T细胞所表达的T细胞受体(TCR)的遗传多样性通常由DNA或RNA的测序来确定，但也可使用与TCR的Vβ链各区段特异性结合的抗体面板进行简单的检测。
使用TCRVβ分析试剂盒(BECKMAN COULTER公司：目录编号IM-3497)，分析自肺癌患者体内摘除的肿瘤分离的T细胞群体的TCR库(repertoire)(图1)。在患者检测样本中，含有约1～13％比例的表达各Vβ链的细胞，确认了其为具有遗传多样性的T细胞群体。通过上述方法将这些T细胞群体重编程为iPS细胞。
iPS细胞是具有多能性的干细胞，不表达包括TCR基因的T细胞相关基因。即，难以在未分化的iPS细胞的阶段分析TCR基因的多样性。以不丧失遗传多样性的方式将所建立的iPS细胞继代后，经造血祖细胞阶段将其诱导分化为T细胞。
使用上述试剂盒分析再生的T细胞表达的TCR库(图2)。伴随iPS细胞的建立及T细胞的分化诱导，表达Vβ的2、3、4、7.1、7.2、8、12、14、16、20及21.3号区段的T细胞的多样性丧失，但仍保存了约半数的Vβ库，确认了再生的T细胞是具有遗传多样性的T细胞群体。
实施例2
对于肿瘤抗原之一GPC3，向已施予肽疫苗的患者采集外周血，使用密度梯度离心法分离单核细胞细胞群体。将该细胞群体的2x106个细胞添加到24孔板上，使用浓度为10mg/mL的GPC3肽，按照上述“工序1的具体步骤”，扩增培养对GPC3具有指向性的T细胞。通过使所培养的细胞再次与GPC3肽接触并培养24小时，表达激活标记。将该细胞群体用抗体(CD4-BV421、CD8-PerCP/Cy5.5、CD14-FITC及CD137-PE)染色，使用流式细胞仪(BDFACSAria(注册商标)II)分析具有GPC3指向性的T细胞群体的比例(图3)。其结果，显示出对GPC3具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增。对该细胞群体，使用磁珠，浓缩表达CD8和CD137两者并对GPC3具有指向性的T细胞群体(图4)。将该细胞群体按照上述“工序2的具体步骤(重编程为iPS细胞以及在维持所建立的iPS细胞的遗传多样性的同时进行培养)”重编程为iPS细胞后，按照上述“工序3的具体步骤”，诱导再分化为CD8单阳性细胞。获得的再生CD8单阳性细胞以高比例被GPC3肽-HLA复合体(Dextramer)染色，由此显示出其为对GPC3具有指向性的T细胞群体(图5)。
实施例3
通过从非癌症患者(健康人)的外周血分离单核细胞，使其与肿瘤抗原之一WT1的重叠肽(PepTivator WT1，Miltenyi Biotech公司)接触，与实施例2同样地，扩增培养对WT1具有指向性的T细胞群体。WT1重叠肽以1μg/mL添加至培养液中。通过使所培养的细胞再次与WT1重叠肽接触，表达激活标记。对其进行分析的结果，显示出对WT1具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增(图6)。对该细胞群体，使用磁珠浓缩表达CD8和CD137两者并对WT1具有指向性的T细胞群体(图7)。
实施例4
通过从非癌症患者(健康人)的外周血分离单核细胞，使其与病毒抗原之一EBVLMP2A的重叠肽(PepTivator EBV LMP2A，Miltenyi Biotech公司)接触，与实施例2同样地，扩增培养对EBV LMP2A具有指向性的T细胞群体。EBV LMP2A重叠肽以1μg/mL添加至培养液中。通过使所培养的细胞再次与EBV LMP2A重叠肽接触，表达激活标记。对其进行分析的结果，显示出对EBV LMP2A具有指向性的CD8/CD137双阳性细胞以高比例扩增(图8)。对该细胞群体，使用磁珠浓缩表达CD8和CD137两者并对EBV LMP2A具有指向性的T细胞群体(图9)。
实施例5
确认了自对GPC3具有指向性的T细胞群体经由iPS细胞而制备的再生T细胞群体对表达GPC3肽的靶细胞具有特异性细胞毒活性。
通过从肝癌患者的外周血分离单核细胞，与实施例2同样地，使之与GPC3肽接触，从而扩增培养对GPC3具有指向性的T细胞群体，进一步浓缩。将该浓缩的细胞群体按照上述工序2和3重编程为iPS细胞后，按照上述工序4，诱导再分化为CD8单阳性细胞。通过对获得的再生T细胞群体进行流式细胞术分析，确认了CD8以CD8αβ异二聚体的形式存在(图10A)。
作为靶细胞，使用感染EB病毒而永生化的B细胞。在存在或不存在GPC3肽(1μM)的情况下培养该靶细胞，制备表达GPC3肽的细胞及不表达GPC3肽的细胞。使用N-SPC非RI细胞毒性检测试剂盒P(Techno Suzuta公司)测定再生T细胞群体对靶细胞的细胞毒活性。用BM-HT试剂处理表达或不表达GPC3肽的靶细胞，并使BM-HT试剂摄入细胞内。然后洗涤靶细胞以去除过量的BM-HT试剂。将该靶细胞和再生T细胞群体共培养2小时，并将培养上清液加入到Eu溶液(铕溶液)中。从损伤的靶细胞漏出到培养液中的HT螯合物变成HT/Eu复合体，将其用激光激发并使用时间分辨荧光进行检测，从而评估细胞毒活性。通过下式计算细胞毒活性。
细胞毒活性(％)＝[(存在再生T细胞时培养上清液中的荧光量)-(不存在再生T细胞时培养上清液中的荧光量)]/[(溶解有所有靶细胞的溶解液中的荧光量)-(不存在再生T细胞时培养上清液中的荧光量)]×100
将共培养时再生T细胞与靶细胞的细胞数比设为20∶1、10∶1和5∶1。其结果，显示出再生T细胞群体对表达GPC3肽的靶细胞的细胞毒活性，并且该活性随着再生T细胞相对于靶细胞的细胞数增加而增强(图10B)。另一方面，再生T细胞群体对不表达GPC3肽的靶细胞未示出细胞毒活性(图10B)。从这些结果表明，获得的再生T细胞群体维持对GPC3的抗原特异性，并对表达GPC3的靶细胞具有抗原特异性细胞毒活性。
Claims (22)
1.一种方法，是介由iPS细胞制造再生T细胞群体的方法，其包括
(工序1)使T细胞群体与一种以上的肿瘤相关抗原或包含一种以上的肿瘤相关抗原的生物组织或其破碎物或其溶解物接触，浓缩对所述肿瘤相关抗原具有指向性的T细胞群体的工序，
(工序2)将所述浓缩的T细胞群体重编程为iPS细胞，在维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性的同时进行培养的工序，以及
(工序3)自所述培养的iPS细胞制造再生T细胞群体的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述再生T细胞群体是维持所述浓缩的T细胞群体的遗传多样性，且对所述肿瘤相关抗原具有指向性的再生T细胞群体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体来自哺乳动物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述人是癌症患者或非癌症患者。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述癌症患者或非癌症患者已施予癌疫苗，或正在施予癌疫苗，或预定今后施予癌疫苗。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体来自体液。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述体液选自血液，淋巴液，组织液，以及体腔液包括腹水、胸水、心包液、脑脊髓液、关节液和眼房水，以及鼻水和尿。
9.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体为来自肿瘤组织的T细胞。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中所述工序1中的T细胞群体为αβT细胞、γδT细胞、辅助T细胞、调节性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞或其混合物。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中所述工序1中的生物组织为原发癌组织和转移癌组织。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括分离通过与一种以上的肿瘤相关抗原接触而激活并增殖的T细胞的工序。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序和选择产生IFN-γ的T细胞的工序中的至少一种工序。
14.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中所述工序1中的浓缩T细胞群体的工序包括选自从所述T细胞群体选择表达CD137的T细胞的工序，选择产生IFN-γ的T细胞的工序和选择结合抗原肽-HLA复合体的T细胞的工序中的至少一种工序。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的方法，其中所述工序2包括不克隆化而对iPS细胞进行回收、继代处理的步骤。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中所述工序3获得的再生T细胞群体用于T细胞补充疗法。
17.根据权利要求1～15中任一项所述的方法，其中对所述再生T细胞群体而言，维持的Vβ种类为两种以上。
18.再生T细胞群体，通过权利要求1～17中任一项所述的方法制造。
19.根据权利要求18所述的再生T细胞群体，其维持生物体内存在的T细胞群体的遗传多样性。
20.一种医药组合物，其含有权利要求18或19所述的再生T细胞群体。
21.根据权利要求20所述的医药组合物，其用于通过自体或同种移植治疗癌症治疗对象。
22.一种癌症治疗方法，其使用权利要求20或21所述的医药组合物。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011096482A1 (ja) * | 2010-02-03 | 2011-08-11 | 国立大学法人東京大学 | 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 |
| WO2016076415A1 (ja) * | 2014-11-13 | 2016-05-19 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からｔ細胞への誘導方法 |
| WO2017078807A1 (en) * | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
| WO2017203356A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Methods of immunotherapy |
| WO2018005712A1 (en) * | 2016-06-28 | 2018-01-04 | Geneius Biotechnology, Inc. | T cell compositions for immunotherapy |
| WO2018009847A1 (en) * | 2016-07-08 | 2018-01-11 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103380212B (zh) * | 2010-12-22 | 2017-04-05 | 菲特治疗公司 | 用于单细胞分选与增强ipsc重新编程的细胞培养平台 |
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Patent Citations (6)
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|---|---|---|---|---|
| WO2011096482A1 (ja) * | 2010-02-03 | 2011-08-11 | 国立大学法人東京大学 | 多能性幹細胞を用いた免疫機能再建法 |
| WO2016076415A1 (ja) * | 2014-11-13 | 2016-05-19 | 国立大学法人京都大学 | 多能性幹細胞からｔ細胞への誘導方法 |
| WO2017078807A1 (en) * | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inducing hematopoietic cell differentiation |
| WO2017203356A1 (en) * | 2016-05-25 | 2017-11-30 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | Methods of immunotherapy |
| WO2018005712A1 (en) * | 2016-06-28 | 2018-01-04 | Geneius Biotechnology, Inc. | T cell compositions for immunotherapy |
| WO2018009847A1 (en) * | 2016-07-08 | 2018-01-11 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv pre-immunization and immunotherapy |
Non-Patent Citations (1)
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| TOSHINOBU NISHIMURA ET AL.: "Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation", 《CELL STEM CELL.》, vol. 12, no. 1, pages 114 - 126, XP055567898, DOI: 10.1016/j.stem.2012.11.002 * |
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