WO2022145490A1

WO2022145490A1 - ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法

Info

Publication number: WO2022145490A1
Application number: PCT/JP2021/049028
Authority: WO
Inventors: 新金子; 良輔五ノ坪; 光次郎大澤; 泰道等; 和男山下; ニコラクロードポールサックス
Original assignee: サイアス株式会社; Ｋｏｔａｉバイオテクノロジーズ株式会社
Priority date: 2021-01-04
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-07-07
Also published as: EP4273234A1; US20240052309A1; JPWO2022145490A1

Abstract

【課題】腫瘍組織浸潤ＣＤ１０６陽性Ｔ細胞より単離されたＴＣＲを導入したｉＰＳ細胞を介する、再生Ｔ細胞を製造する方法の提供。【解決手段】１：被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有し、かつＣＤ１０６陽性Ｔ細胞集団から、単一細胞ごとに、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、２：被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、３：前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未成熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および、４：工程３において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。

Description

ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法

　本発明は、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に由来するｉＰＳ細胞に対して、ＣＤ１０６陽性Ｔ細胞集団から得られるＴ細胞受容体を導入し、腫瘍抗原特異的な再生Ｔ細胞を製造する方法、該方法により製造された再生Ｔ細胞、該再生Ｔ細胞を有効成分とする、がんの予防または治療剤、該再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物および該医薬組成物を使用するがんの予防または治療方法に関する。

　Ｔ細胞は、細菌もしくはウイルス等の外来病原体またはがん細胞等の異常な細胞に対する免疫応答において中心的な役割を果たしている。このため、Ｔ細胞の機能低下は、病原体感染やがんの発生に寄与すると考えられている。Ｔ細胞の機能低下に起因する疾患を有する患者に対するＴ細胞の補充療法または再生療法は、患者における疾患の病態改善や治療に極めて有効な手段となり得る。

　ヒトおよびマウスを用いた研究において、感染症またはがんに対してＴ細胞補充療法を行う場合、細菌もしくはウイルス等の外来病原体またはがん細胞等の異常な細胞が有する抗原を特異的に認識するＴ細胞を用いることにより、高い治療効果が得られることが知られている。一方で、Ｔ細胞を十分量確保することが難しいこと、またＴ細胞における増殖能の低下および標的細胞等の抗原に対する免疫反応の低下などのＴ細胞の疲弊化がＴ細胞補充療法における障害となっている。また、腫瘍に特異的なＴ細胞をどのようにして取得するかは大きな課題である。

　Ｔ細胞補充療法における上記の障害を克服するため、抗原特異的なＴ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立し、増殖させた後、Ｔ細胞へ分化させた再生Ｔ細胞を用いるＴ細胞補充療法が提案されている。標的抗原を認識するためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ゲノムの遺伝子再構成により形成されるため、Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞には、初期化前のＴ細胞が持つＴＣＲ遺伝子が保存されている。したがって、ｉＰＳ細胞を製造するための原料として、標的抗原に対して特異的なＴ細胞を使用することにより、元のＴ細胞と同じ抗原特異性を示す再生Ｔ細胞を製造することが可能である（特許文献１および非特許文献１）。

　厳密な抗原特異性は、安全かつ効率的なＴ細胞補充療法に必要である。しかしながら、上記のようにＴ細胞からｉＰＳ細胞を経由して得られた再生Ｔ細胞において、元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度は必ずしも高くないことが報告されている（特許文献２）。また、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を経由して得られたＣＤ８αβ再生Ｔ細胞が、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ段階でのＴＣＲα鎖遺伝子の追加的な再構成により、抗原特異性を失うことも報告されている（非特許文献２）。

ＷＯ２０１１／０９６４８２号パンフレットＷＯ２０１３／１７６１９７号パンフレット

Nishimura T, et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 2013; 12:114-126. Minagawa A, et al. Enhancing T cell receptor stability in rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer immunotherapy. Cell Stem Cell. 2018; 23: 850-858.

　ｉＰＳ細胞を介して製造された再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）を用いるがん治療において、腫瘍細胞または腫瘍組織に存在する標的抗原を特異的に認識するｉＰＳ－Ｔ細胞を使用することは、がん治療におけるｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法の安全性および有効性を担保する上で重要である。また、がんの発症またはがんの再発が検出された場合、速やかにｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法を開始することが、治療成績を向上させるために重要である。

　本発明は、腫瘍組織浸潤ＣＤ１０６陽性Ｔ細胞より単離されたＴＣＲを導入したｉＰＳ－Ｔ細胞を迅速に製造する方法および該方法により製造されたｉＰＳ－Ｔ細胞を提供することを目的とする。さらに本発明は、該方法により製造されたｉＰＳ－Ｔ細胞、該ｉＰＳ－Ｔ細胞を含有する医薬組成物および該医薬組成物を使用するがんの予防または治療方法を提供することを目的とする。

　最近の研究で、１つの抗原エピトープに対しても、複数のＴ細胞クローン（５～１０クローン）がそれぞれ異なるＴＣＲを用いて抗原を認識していることが明らかになっている。現時点では、患者から得られた細胞からｉＰＳ－Ｔ細胞を得るまでの過程において、抗原特異的なすべてのＴ細胞クローンを維持することは極めて難しい。ｉＰＳ－Ｔ細胞まで分化したクローンが、標的を傷害するのに最適なＴＣＲを有するＴ細胞クローンである可能性についても、ｉＰＳ－Ｔ細胞を製造するための細胞を採取する被験者の個体差またはｉＰＳ－Ｔ細胞の製造バッチによって影響を受ける。また、腫瘍を特異的に認識するＴ細胞を単離するためには、腫瘍抗原の患者への投与、または試験管内において、Ｔ細胞と腫瘍抗原との共培養が必要であるが、腫瘍抗原が不明である場合には、そのような方法を採用することは極めて難しい。

　現状では、患者から得られた細胞由来のｉＰＳ細胞クローンを用いてｉＰＳ－Ｔ細胞を製造する場合、その製造に要する期間は長期にわたる。ｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法を、それが必要な患者に速やかに提供するためには、製造期間の短縮が大きな課題となっている。

　本発明者らは、腫瘍組織より単離されたＣＤ１０６陽性Ｔ細胞集団が、腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞集団であって、がん細胞に対する特異的な攻撃性を有すること、腫瘍関連抗原を認識するこれらＴ細胞集団から、抗原特異性を持つ種々のＴＣＲプールを取得できること、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞から樹立したｉＰＳ細胞にＴＣＲを導入することにより、ｉＰＳ－Ｔ細胞を製造することができること、予めＴ細胞への分化効率の良いｉＰＳ細胞クローンを選択することにより、再生Ｔ細胞の品質の均一化および製造期間の短縮ができること、同時に前記ＴＣＲプールの取得およびｉＰＳ細胞の樹立のタイミングを調整することにより、前記ｉＰＳ－Ｔ細胞の製造を迅速に行うことができること、ならびに前記ＴＣＲプールおよび前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞の起源が同一個体または別個体であってもよいことを見出し、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明の目的は、以下の発明により達成される。
　〔１〕
　（１）被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有し、かつＣＤ１０６陽性Ｔ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、　
を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
　〔２〕
　工程（２）の実施が、工程（１）の実施に先行する、または工程（１）の実施と並行する、〔１〕に記載の方法。
　〔３〕
　工程（１）および（２）における被験者が、同一個体であって、がんの予防または治療対象である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
　〔４〕
　工程（１）および（２）における被験者が、互いに別個体であって、工程（２）における被験者が、がんの予防または治療対象である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
　〔５〕
　工程（１）および（２）における被験者が、互いに別個体であって、工程（１）における被験者が、がんの予防または治療対象である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
　〔６〕
　工程（１）および（２）における被験者が、同一個体または互いに別個体であって、工程（１）および（２）における被験者とは異なる被験者が、がんの予防または治療対象である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
　〔７〕
　さらに、工程（４）において得られる前記ｃＤＮＡが導入されたＴ細胞から、がんの予防または治療対象である被験者に由来する細胞に対してアロ反応を示さないＴ細胞を選別する工程を含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
　〔８〕
　さらに、工程（１）で調製されたｃＤＮＡから、がんの予防または治療対象である被験者に由来する細胞に対してアロ反応を誘導しないＴ細胞受容体をコードするｃＤＮＡを選別する工程を含む、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
　〔９〕
　がんの予防または治療対象である被験者に由来する前記細胞が、末梢血単核球である、〔７〕または〔８〕に記載の方法。
　〔１０〕
　工程（３）において、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した前記成熟Ｔ細胞への前記ｃＤＮＡの導入が、ウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターを用いる、またはゲノム編集技術を用いる、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
　〔１１〕
　前記ゲノム編集技術が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮである、〔１０〕に記載の方法。
　〔１２〕
　前記非ウイルスベクターが、トランスポゾンベクターである、〔１０〕に記載の方法。
　〔１３〕
　前記トランスポゾンベクターが、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターである、〔１２〕に記載の方法。
　〔１４〕
　工程（４）において、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程が、フィーダー細胞およびＰＨＡ（phytohemagglutinin）の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で行われる、〔１〕～〔１３〕のいずれかに記載の方法。
　〔１５〕
　前記フィーダー細胞が、自家または他家の末梢血単核球である、〔１４〕に記載の方法。
　〔１６〕
　工程（１）または（２）における前記被験者が、肝細胞がん、肝芽腫、胃がん、食道がん、肺がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫などの皮膚がん、膀胱がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がん、脳腫瘍、肉腫またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫の患者である、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
　〔１７〕
　工程（１）または（２）における前記被験者が、免疫原性の高いがんの患者である、〔１〕～〔１５〕のいずれかに記載の方法。
　〔１８〕
　前記免疫原性の高いがんが、肝細胞がん、肝芽腫、大腸がん、肺がんまたは悪性黒色腫である、〔１７〕に記載の方法。
　〔１９〕
　工程（１）における前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ３／ＣＤ１０６ダブルポジティブである、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載の方法。
　〔２０〕
　前記造血幹細胞が、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブである、〔１〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
　〔２１〕
　前記未熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブである、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載の方法。
　〔２２〕
　工程（２）において選別された、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローン、または工程（３）における前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞を保存し、マスターセルバンクを構成する、〔１〕～〔２１〕のいずれかに記載の方法。
　
　〔２３〕
　前記保存が凍結保存である、〔２２〕に記載の方法。
　〔２４〕
　前記マスターセルバンクに保存された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞に対して、工程（３）および（４）を行う、〔２２〕に記載の方法。
　〔２５〕前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞を含む、〔２２〕に記載のマスターセルバンク。
　〔２６〕
　〔１〕～〔２４〕のいずれかに記載の方法により製造された再生Ｔ細胞。
　〔２７〕
　〔２６〕に記載の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
　〔２８〕
　〔２７〕に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。

　本発明のｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）の製造方法では、Ｔ細胞およびＢ細胞が除去された末梢血単核球（非Ｔ非Ｂ細胞または単球）またはＴ細胞を初期化し、ｉＰＳ細胞を得た後、Ｔ細胞への分化効率が良いｉＰＳ細胞クローンを予め選別する。このため、治療に必要とされるタイミングに合わせて、治療に必要なｉＰＳ－Ｔ細胞を十分量確保することができる。また本発明の方法では、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に対してＴＣＲを導入するため、これらの細胞をｉＰＳ－Ｔ細胞へ分化させた後、拡大培養した場合に、ＴＣＲ遺伝子の再構成が起きにくく、導入されたＴＣＲの抗原特異性が維持される。さらに、拡大培養に起因する疲弊化が少ないｉＰＳ－Ｔ細胞を製造することができる。さらに、ｉＰＳ－Ｔ細胞を製造する際には、Ｔ細胞への分化効率が良いｉＰＳ細胞クローンを選別して用いるため、ｉＰＳ－Ｔ細胞の製造バッチ間における収量および分化程度の変動、ならびに細胞を採取する被験者の個体差が、得られるｉＰＳ－Ｔ細胞の品質等に及ぼす影響を最小にすることが可能となる。また抗原を認識し、標的を効率よく殺傷するＴＣＲを持つＴ細胞を、効率よく製造することが可能となる。

　本発明の方法によれば、ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製は、遺伝的多様性を有するＴ細胞集団から単一細胞ごとに行うため、多様な抗原特異性を持つｃＤＮＡ群を準備することができる。腫瘍組織より単離されたＣＤ１０６陽性Ｔ細胞集団は、腫瘍抗原を認識するＴ細胞集団であるため、腫瘍特異的なＴＣＲを単離するにあたり、予め腫瘍抗原による免疫または試験管内でのＴ細胞と腫瘍抗原との共培養の必要がない。このため、本発明の方法によれば、ｉＰＳ－Ｔ細胞の製造期間が短縮されると同時に、がん患者における腫瘍抗原が不明である場合においても、腫瘍特異的なｉＰＳ－Ｔ細胞を製造することが可能である。また、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球由来またはＴ細胞由来のｉＰＳ細胞クローンの作製および保存を、抗原特異的ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製に先行して、または前記ｃＤＮＡの調製と並行して行うため、これらを順次行う方法に比べて、ｉＰＳ－Ｔ細胞を短期間に製造することができる。このため、ｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法を適用するがん治療において、治療対象のがん患者における腫瘍の抗原変化もしくは治療耐性の発現またはがんの再発に対して、発現している抗原に特異的なｉＰＳ－Ｔ細胞の準備を迅速に行うことが可能となる。

　本発明の方法によれば、ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製するために使用するＴ細胞を採取する被験者は、ｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法による治療対象のがん患者である被験者と同一個体であってもよく、また互いに別個体であってもよい。このため、多様な抗原に対応するＴＣＲプールを作製することが可能となり、個々のがん患者に最適な抗原特異性を有するＴＣＲを選択することができる。

末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程の概略を示す図である。末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程の詳細を示す図である。図２において、上段部分図は、ＣＤ１０６陽性Ｔ細胞からＴＣＲ遺伝子を単離する工程および抗原特異的反応性の検証を行う工程を示し、下段部分図は、ＴＣＲ遺伝子導入ｉＰＳ細胞を製造する工程および前記ｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程を示す。 pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターを使用して、ＴＣＲ遺伝子を導入する工程を示す図である。ｉＰＳ細胞から誘導された再生Ｔ細胞（腫瘍関連抗原特異的ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞）の表現型を示す図である。再生Ｔ細胞における細胞老化マーカーとして、テロメアを解析した結果を示す図である。再生Ｔ細胞における細胞疲弊マーカーとして、ＰＤ－１およびＴＩＧＨＴ分子の発現を解析した結果を示す図である。健常者の末梢血単核球中の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ細胞）および再生Ｔ細胞において、ＰＭＡおよびイオノマイシンによる刺激により産生されるＩＬ－２およびＩＦＮ－γ量を比較した図である。腫瘍浸潤Ｔ細胞における、種々のマーカーの発現を示す図である。各パネルにおいて、パネル内に記載されるマーカーの発現が陽性である細胞が着色して示される。細胞は発現パターンによりクラスタリングされており、丸で囲まれた部分が腫瘍傷害性Ｔ細胞に対応する。腫瘍浸潤Ｔ細胞を、マーカー発現によりソートした細胞亜集団において、自己腫瘍刺激を行った場合のＩＦＮ－γ産生を示す図である。ＣＤ１０６陽性細胞亜集団においてのみ、自己腫瘍刺激によりＩＦＮ－γが産生されること、また、ＣＤ１０６以外のマーカー陽性細胞亜集団では、自己腫瘍刺激によりＩＦＮ－γが産生されるものの、マーカー陰性細胞亜集団においてもＩＦＮ－γが産生されることから、特異性がＣＤ１０６より劣ることが理解できる。ＧＰＣ３抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を導入した、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞の表現型を示す図である。ＣＤ１９遺伝子は、同一のpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターに、前記ＴＣＲ遺伝子とタンデムに組み込まれた遺伝子であり、宿主染色体への遺伝子挿入および遺伝子発現のマーカーとして使用される。末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する方法を説明する図である。末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高い細胞として選別されたｉＰＳ細胞クローンに対してゲノム編集を行い、再生Ｔ細胞を製造する方法を説明する図である。ホストＴ細胞から、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞を製造する方法を説明する図である。末梢血Ｔ細胞を初期化した同種のｉＰＳ細胞から、再生Ｔ細胞を製造する工程の概略を示す図である。

〔Ｔ細胞〕
　本発明において、被験者から得られる「Ｔ細胞」とは、細胞表面にＴ細胞受容体（T cell receptor：ＴＣＲ）と呼ばれる抗原受容体を発現している細胞である。ＴＣＲには、α鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体と、γ鎖およびδ鎖からなるヘテロ二量体がある。α鎖およびβ鎖からなるＴＣＲを有するＴ細胞は、αβ型Ｔ細胞と呼ばれ、またγ鎖およびδ鎖からなるＴＣＲを有するＴ細胞は、γδ型Ｔ細胞と呼ばれる。本発明の一態様において、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／αβ型Ｔ細胞が好ましいが、ＣＤ３／γδ型Ｔ細胞であってもよい。本発明におけるＴ細胞のＴＣＲは、遺伝子導入したものである。

　本発明において、「Ｔ細胞集団」とは、上記のＴ細胞であって、抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子配列が全体として多様な細胞集団を指す。従って、生体から採取されたＴ細胞は、多様な抗原に対する特異性を有するＴ細胞集団である。生体内に存在するＴ細胞は、Ｔ前駆細胞が胸腺内で発生分化する際に、ＴＣＲ遺伝子のランダムな組み換えが生じることにより、個々のＴ細胞が異なるＴＣＲ遺伝子配列を有し、あらゆる抗原に対して免疫反応を引き起こすことが可能となっている。本発明において、ＣＤ１０６は、がん細胞に対する攻撃性を有するＴ細胞を同定するための特異性の高いマーカーであり、個々のＣＤ１０６陽性Ｔ細胞が有するＴＣＲは、腫瘍抗原特異的である。このため、ＣＤ１０６陽性Ｔ細胞を集団として捉えることにより、そのＴ細胞集団が、多様な腫瘍抗原を免疫対象とすることが理解できる。従って、生体から採取されたＣＤ１０６陽性Ｔ細胞集団は、その意味で遺伝的多様性を有するＴ細胞集団である。

　本発明において、「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍に特異的または非特異的に発現する抗原であって、腫瘍細胞で過剰発現しているタンパク質由来の抗原およびその変異体、腫瘍ウイルス由来抗原、ある種の分化抗原および遺伝子変異およびスプライス異常による新規腫瘍関連抗原（ネオアンチゲン）などである。「腫瘍関連抗原」に反応するＴ細胞は、ＣＤ１０６陽性Ｔ細胞として認識される。本明細書においては、腫瘍関連抗原を腫瘍抗原と記載する場合もある。タンパク質抗原である場合には、これを断片化したペプチド（ペプチド断片）であってもよい。腫瘍に特異的または非特異的に発現する抗原としては、ＷＴ１、ＧＰＣ３、ＸＡＧＥ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ６、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥＡ３、ＭＡＧＥＡ１、テロメラーゼ、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２／４、ＰＳＣＡ、ＣＴＬＡ－４、ｇｐ１００、ＧＤ２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｓＬｅ（ａ）、糖脂質Ｆ７７、メソテリン、ＰＤ－Ｌ１、ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ｃ－Ｍｅｔ、ｐ５３、ｐ５３変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、ＥｐｈＡ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＯＹ－ＴＥＳ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、サバイビン、Ｒａｓ、Ｒａｓ変異体、ＥＲＧ、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＸＢＰ１などが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス抗原としては、不活化ＨＢＶおよびＨＰＶ等の不活化ウイルス、ならびに各種ウイルス由来のタンパク質であるＥＢＶＬＭＰ１、ＥＢＶＬＭＰ２、ＥＢＮＡ（ＥＢＶ nuclear antigen）、ＨＰＶＥ１、ＨＰＶＥ２、ＨＰＶＥ６、ＨＰＶＥ７、ＨＢＶ　ＨＢｓ、ＨＴＬＶ－１ＴａｘおよびＨＢＺ（ＨＴＬＶ－１ｂＺＩＰＦａｃｔｏｒ）等が挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明において、「腫瘍関連抗原に対して反応性を有する」とは、Ｔ細胞が、抗原提示細胞上の主要組織適合抗原（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）クラスIまたはクラスIIに提示された腫瘍関連抗原に由来するエピトープペプチドに、ＴＣＲを介して選択的に結合／接合して生じる反応をＴ細胞が有することを意味し、前記エピトープペプチド以外のものへのＴ細胞の結合／接合ではＴ細胞の反応が生じないことを指す。ＴＣＲを介して、ＭＨＣクラスIまたはクラスIIに提示された腫瘍関連抗原に由来するエピトープペプチドへの結合／接合により生じるＴ細胞の反応には、細胞傷害性、ＩＦＮ－γおよびグランザイムの産生、Ｔ細胞活性化マーカーの発現、ならびにＮＦ－ＡＴ等の転写因子の活性化が挙げられる。

　本発明において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞が好ましい。Ｔ細胞の採取源としては、侵襲性が低いことから末梢血が好ましいが、それに限定されない。その他の好ましい採取源として、がん組織もしくは腫瘍組織、リンパ節もしくはその他の組織もしくは臓器、または血液、臍帯血、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液および間質液）、体腔液（腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、関節液および眼房水）等の体内のすべての採取源が挙げられる。本発明の一態様において、好ましいＴ細胞は、腫瘍組織由来Ｔ細胞である。腫瘍組織由来Ｔ細胞は、通常、腫瘍浸潤Ｔ細胞である。

　被験者ががん患者である場合、前記がん患者のがんは、肝細胞がん、肝芽腫、胃がん、食道がん、肺がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫などの皮膚がん、膀胱がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がん、脳腫瘍、肉腫またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫から選ばれる。前記がんは、好ましくは肝細胞がんまたは肝芽腫である。

〔ｉＰＳ細胞クローン〕
　本発明において、ｉＰＳ細胞は、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞を初期化して作製することが好ましいが、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に限定されるわけではない。「非Ｔ非Ｂ細胞」とは、Ｔ細胞として分類されず、かつＢ細胞とも分類されない単核球を意味する。本発明において、非Ｔ非Ｂ細胞または単球は、被験者の末梢血単核球として採取した後、単核球に含まれるＴ細胞およびＢ細胞を除去することにより調製することができる。末梢血単核球は、ヒト全血から単核球分離溶液により単離することができる。単核球分離溶液としては、例えばLymphoprep（登録商標）が挙げられる。単核球よりＢ細胞およびＴ細胞を除去するためには、Ｂ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢ細胞受容体、およびＴ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８に対する抗体を利用して、例えばフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）ビーズなどの磁気ビーズを使用してもよい。Ｔ細胞は、ヒト全血から単核球分離溶液により単離することができる。単核球分離溶液としては、例えばLymphoprep（登録商標）が挙げられる。Ｔ細胞の精製は、Ｔ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４もしくはＣＤ８またはＴ細胞受容体を利用して行うことができるする。例えばフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）ビーズなどの磁気ビーズを使用してもよい。

　ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知である。本発明において、ｉＰＳ細胞は、好ましくは、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。細胞初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、ｋｌｆ４、ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３およびＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が挙げられる。これらの細胞初期化因子は、単独で用いてもよく、また組み合わせて用いてもよい。これらの細胞初期化因子の中で、効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点からは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ（いわゆる山中４因子）を、前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入することが好ましい。

　前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞への細胞初期化因子を導入する方法としては特に制限はなく、当該分野で公知の方法を採用することができる。例えば、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を前記非Ｔ非Ｂ細胞または単球に導入する場合においては、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞内で機能するプロモーターを含む発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを、感染、リポフェクション法、リポソーム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法またはエレクトロポレーション法により非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入することができる。前記細胞初期化因子がタンパク質の形態にあって、該タンパク質を前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が挙げられる。前記細胞初期化因子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態にあって、該ｍＲＮＡを前記非Ｔ非Ｂ細胞または単球に導入する場合においては、ｍＲＮＡ導入試薬を用いる方法および培養液に添加する方法が挙げられる。

　感染による遺伝子導入に用いる発現ベクターとしては、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、挿入変異が生じにくく、また遺伝子導入効率が高く、導入される遺伝子のコピー数も多いという観点から、センダイウイルスを用いて、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入することが好ましい。

　前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入する場合に用いる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーターは、テトラサイクリン等の薬剤の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、プロモーターに加えて、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含むことができる。

　非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞を初期化して得られたｉＰＳ細胞の培養に用いられる培養液としては、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにｉＰＳ細胞の未分化能を維持するためのサイトカイン類を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer'培養液、Neurobasal Medium (ライフテクノロジーズ社)、StemFit（登録商標）AK03N（味の素ヘルシーサプライ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。サイトカイン類としては、好ましくは、bFGFが挙げられ、培養液中におけるその濃度は、例えば、1～100μg/mL（好ましくは50μg/mL）である。

　本発明の一態様において、ｉＰＳ細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、接着培養が好ましい。ｉＰＳ細胞の単離方法としては、例えば、セルスクレーパー等により物理的に単離する方法、プロテアーゼ活性を有する解離溶液、コラゲナーゼ活性を有する解離溶液、またはプロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等）を用いた単離方法が挙げられる。

　本発明の一態様において、ｉＰＳ細胞は、好ましくは、１×１０^３～１×１０^４ cells/cm²、１×１０^４～１×１０^５ cells/cm²または１×１０^５～１×１０^６ cells/cm²の細胞密度に到達した場合に、別の培養器に継代される。継代の回数は、必要な量のｉＰＳ細胞が得られれば何回でもよく、好ましくは、１～５回または５～１０回である。

　製造したｉＰＳ細胞は多数のｉＰＳ細胞クローンからなる。後述するが、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別するために、コロニーピックアップ法によりｉＰＳ細胞のクローン化を行うことが好ましい。コロニーピックアップ法としては、特に制限はされないが、顕微鏡下にピペットマンを用いる方法、限界希釈法および全自動コロニーピッカーを用いた方法等が用いられる。得られたｉＰＳ細胞クローンは、拡大培養後、マスターセルバンクを構成してもよい。前記ｉＰＳ細胞クローンにより構成される「マスターセルバンク」とは、単一のｉＰＳ細胞クローンの単一プールごとに、独立した細胞保存容器に分注して集積したものである。前記マスターセルバンクでは、ｉＰＳ細胞クローンを凍結保存することが好ましい。細胞の凍結保存方法は、当業者に周知である。例えば、培養したｉＰＳ細胞クローンを回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数し、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、10％ DMSOを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存することができる。本発明のマスターセルバンクは、凍結保存ができる任意の施設または貯蔵庫に保管することができる。凍結保存する場合、保存温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－２０℃、－８０℃および－１２０～－１９６℃が挙げられるが、－１５０℃以下が好ましい。

　「分化効率」とは、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞、造血幹細胞から未熟Ｔ細胞および未熟Ｔ細胞から成熟Ｔ細胞への各分化段階において、全生存細胞におけるそれぞれ造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞の存在割合を指す。各分化段階における分化細胞の同定は、表面マーカーのＦＡＣＳ解析により行うことができる。造血幹細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ細胞の割合として、未熟Ｔ細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞の割合またはＣＤ５ポジティブ細胞の割合として、また成熟Ｔ細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ８α鎖、ＣＤ８β鎖、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のすべてがポジティブである細胞の割合として示される。

　「分化効率が高い」または「分化効率が良い／良好」とは、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞への分化において、造血幹細胞であるＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ細胞の割合が５～１５％またはそれ以上であることを指し；造血幹細胞から未熟Ｔ細胞への分化において、未熟Ｔ細胞であるＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞の割合またはＣＤ５ポジティブ細胞の割合が、それぞれ１０％以上または５０％以上であることを指し；未熟Ｔ細胞から成熟Ｔ細胞への分化において、ＣＤ８α鎖、ＣＤ８β鎖、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のすべてがポジティブである細胞の割合が５０％以上であることを指す。

　本発明の再生Ｔ細胞は、好ましくは、前記ｉＰＳ細胞クローンを、先ず造血幹細胞に分化させ、次に前記造血幹細胞を未熟Ｔ細胞に分化させ、最終的に、未熟Ｔ細胞をＣＤ８シングルポジティブＴ細胞である成熟Ｔ細胞に分化させることにより製造する。

　本発明において、「造血幹細胞」とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球および巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞である。なお造血幹細胞と造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cells、HPC）とは区別されるものではなく、特に断らない限り同一の細胞を指す。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、表面抗原であるＣＤ３４およびＣＤ４３がダブルポジティブであることによって認識される。

　本発明において、「未熟Ｔ細胞」とは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方ともが発現していないＴ細胞の段階から、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現し、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞を経てＣＤ８シングルポジティブ細胞までの各段階のＴ細胞を指す。未熟Ｔ細胞としては、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブであることが好ましい。

　本発明において、「成熟Ｔ細胞」とは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現し、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞を経てＣＤ８シングルポジティブ細胞に至ったＴ細胞を指す。成熟Ｔ細胞としては、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブであることが好ましい。

〔造血幹細胞および未熟Ｔ細胞の培養〕
　造血幹細胞は、好ましくは、ビタミンC類を添加した培養液中でｉＰＳ細胞を培養することによって製造される。ここで、「ビタミンC類」とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を指し、「L-アスコルビン酸誘導体」とは、生体内で酵素反応によりビタミンCに変換されるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体としては、例えば、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が挙げられる。L-アスコルビン酸の誘導体は、好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-Lアスコルビン酸ナトリウムまたはリン酸-L-アスコルビン酸マグネシウム等のリン酸-Lアスコルビン酸塩が挙げられる。ビタミンC類は、例えば、培養液において、5～500μg/mLの濃度で含有される。

　造血幹細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにビタミンC類等を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えば、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's培養液、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ社）、StemPro34（ライフテクノロジーズ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清が含有されていてもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる１つ以上の物質も含有し得る。

　造血幹細胞の製造に用いる培養液には、BMP4（Bone morphogenetic protein 4）、VEGF（vascular endothelial growth factor）、bFGF（basic fibroblast growth factor）、SCF（stem cell factor）、TPO（トロンボポエチン）、およびFLT3L（Flt3 ligand）からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。これらの濃度は、例えば、BMP4は1～100 ng/mLであり、VEGFは1～100 ng/mLであり、bFGFは1～100 ng/mLであり、SCFは10～100 ng/mLであり、TPOは1～100 ng/mLであり、またFLT3Lは1～100 ng/mLである。

　造血幹細胞の培養液には、TGFβ阻害剤を培養液に添加してもよい。「TGFβ阻害剤」とは、TGFβファミリーのシグナル伝達に干渉する低分子阻害剤であり、例えば、SB431542およびSB202190（R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer 2: 20 (2003))、SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908およびSD208 (Scios)、ならびにLY2109761、LY364947およびLY580276（Lilly Research Laboratories）が挙げられ、培養液への添加濃度は、好ましくは0.5～100μMである。

　ｉＰＳ細胞は、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、または異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Ce11 Physiol. 2009 Nov; 221 (2) :367-77）等のフィーダー細胞と共培養してもよい。

　造血幹細胞の製造時のｉＰＳ細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、浮遊培養が好ましい。例えば、ｉＰＳ細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを遊離し、単細胞に解離させたのちに、浮遊培養に供することができる。ｉＰＳ細胞の単離方法としては、例えば、セルスクレーパー等で物理的に単離する方法、プロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等)、またはコラゲナーゼ活性を有する解離溶液を用いた単離方法が挙げられる。

　浮遊培養とは、細胞を培養容器に対して非接着の状態で培養することである。浮遊培養は、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的な処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）が施されていない培養容器、または人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（po1y-HEMA）もしくは非イオン性の界面活性ポリオール（Pluronic F-127等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。浮遊培養の際には、胚様体（EB）を形成させて培養することが好ましい。胚様体を浮遊培養して造血幹細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。

　造血幹細胞は、ｉＰＳ細胞を培養することにより得られる嚢胞様構造物（iPS-sacとも称する）から調製することもできる。ここで、「嚢胞様構造物」とは、ｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団等で形成され、内部に造血幹細胞を含む構造体である。

　ｉＰＳ細胞から造血幹細胞を製造するために培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、好ましくは約37℃～約39℃程度である。また、培養期間については、当業者であれば造血幹細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血幹細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、または14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血幹細胞の製造において問題とされない。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明の一態様において、低酸素条件としては、例えば、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら未満の酸素濃度が挙げられる。

　「ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞」は、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４およびＣＤ８が共に陽性である細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４^＋）であり、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ４５が陽性であることによって認識できることから、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる。ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、誘導によってＣＤ４シングルポジティブ細胞またはＣＤ８シングルポジティブ細胞へと分化させることができる。

　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、p38阻害剤および／またはSDF-1を添加した培養液中で、造血幹細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。

　「p38阻害剤」とは、p38タンパク質（p38MAPキナーゼ）の機能を阻害する物質として定義される。p38阻害剤は、例えば、p38の化学的阻害剤、p38のドミナントネガティブ変異体、またはそれをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。

　p38の化学的阻害剤としては、SB203580(4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-メチルスルホニルフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB202190 (4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB239063 (trans-4-[4-(4-フルオロフェニル)-5-(2-メトキシ-4-ピリミジニル)-1H-イミダゾール-1-イル]シクロヘキサノール)およびその誘導体、SB220025およびその誘導体、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCl0-469、SCIO-323、VX-702、またはFR167653が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えば、SB203580、SB202190、SC239063、SB220025およびPD169316についてはCalbiochem社、SCl0-469およびSCIO-323についてはScios社等から入手可能である。p38阻害剤は、例えば、約1μM～約50μMの範囲で培養液に添加される。

　p38のドミナントネガティブ変異体としては、p38のDNA結合領域に位置する180位のスレオニンをアラニンに点変異させたp38T180A、ならびにヒトおよびマウスにおけるp38の182位のチロシンをフェニルアラニンに点変異させたp38Y182F等が挙げられる。

　SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）は、SDF-1αまたはその成熟型だけでなく、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1εもしくはSDF-1φ等のアイソフォーム、またはそれらの成熟型であってもよく、もしくはこれらの任意の割合の混合物等であってもよい。好ましくは、SDF-1αが使用される。なお、SDF-1は、CXCL-12またはPBSFと称される場合もある。

　SDF-1は、そのケモカインとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の1または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失および／または付加されていてもよい。SDF-1において少なくとも４つのシステイン残基（ヒトSDF-1αの場合、Cys30、Cys32、Cys55およびCys71）が保持されており、かつ天然体のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有する範囲であれば、アミノ酸変異が許容される。SDF-1は、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウス等の非ヒト哺乳動物のものであってもよい。例えば、ヒトのSDF-1αとして、GenBank登録番号:NP_954637で登録されているタンパク質が使用でき、SDF-1βとして、GenBank登録番号:NP_000600で登録されているタンパク質が使用できる。

　SDF-1は、市販のものを使用してもよいし、天然から精製されたものを使用してもよいし、またはペプチド合成や遺伝子工学的手法によって製造されたものを使用してもよい。SDF-1は、例えば、約10 ng/mL～約100 ng/mLの範囲で培養液に添加される。

　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにp38阻害剤および／またはSDF-1、さらに好ましくはビタミンC類を添加して調製することができる。なお、CD4／CD8ダブルポジティブＴ細胞の製造において使用されるビタミンC類の種類は、例えば上述のとおりであるが、ビタミンC類の濃度は、例えば、5～200μg/mLである。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's　Neurobasal Medium培養液（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液には、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる1つ以上の物質も含有し得る。

　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液には、SCF、TPO（トロンボポエチン）、FLT3LおよびIL-7からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。これらの濃度は、例えば、SCFは10～100 ng/mLであり、TPOは1O～200 ng/mLであり、FLT3Lは1～100 ng/mLであり、IL-7は1～100 ng/mLである。

　造血幹細胞は、接着培養しても、または浮遊培養してもよいが、接着培養することが好ましい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよい。例えば、コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One. 6(7):e22261, 2011）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、Fc-DLL4またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。

　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を製造するために造血幹細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度が好ましく、約37℃～約39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であれば、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、または23日以上であり、好ましくは23日である。

　得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、単離して用いても良く、他の細胞種が含有される細胞集団として用いても良い。単離する場合、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３および／またはＣＤ４５に対する抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。

　「ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞」、すなわち成熟Ｔ細胞は、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ８が陽性である細胞（ＣＤ８^＋ＣＤ４^－）であり、細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる。Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ４５が陽性であることによって認識できることから、ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ４５が陽性であり、ＣＤ４が陰性である細胞として同定することができる。

　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞は、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。

　副腎皮質ホルモン剤は、好ましくは、糖質コルチコイドまたはその誘導体であり、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、またはプロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。好ましくは、副腎皮質ホルモン剤は、デキサメタゾンである。培養液中におけるその濃度は、例えば、1～100 nMである。

　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これに副腎皮質ホルモン剤を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えば、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's　Neurobasal Medium培養液（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオールグリセロール、脂質、アミノ殿、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる１つ以上の物質も含有し得る。

　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、抗ＣＤ３抗体、ビタミンC類、またはサイトカインをさらに含有することが好ましい。当該サイトカインとしては、例えば、IL-2、IL-7、IL-15およびIL-21等が挙げられる。

　抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗ＣＤ３抗体の培養液中における濃度は、例えば、10～1000 ng/mLである。

　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いるビタミンC類は、例えば上述したものであり、上述と同じ条件で用いることができる。

　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いるサイトカインの培養液中における濃度は、例えば、IL-2は10～1000 U/mLであり、IL-7は1～100 ng/mLである。

　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を製造するためのＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度が好ましく、約37℃～約38℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、または5日以上であり、好ましくは3日である。

〔ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製〕
　本発明において、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡの調製は、単一細胞ごとに行うことが好ましい。被験者から採取されるＴ細胞は、全体として遺伝的多様性を有するＴ細胞集団であるが、個々のＴ細胞が有するＴＣＲが認識する抗原またはペプチド配列が決定されないままＣＤ１０６陽性Ｔ細胞として同定されたものであり、個々のＴ細胞の抗原特異性は異なる。個々の腫瘍関連抗原に対して最適な、すなわち個々の腫瘍関連抗原に対する反応性が高いＴＣＲを選択するために、単一細胞ごとにｃＤＮＡを調製することが好ましい。

被験者から得られたＴ細胞から、腫瘍関連抗原に応答するＴ細胞集団を、ＣＤ１０６をマーカーとして用いて、セルソーターなどにより単一の細胞として単離してもよい。細胞を単離するマーカーとして、ＣＤ１０６に加えて、細胞表面ＣＤ１３７を用いてもよい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、ＣＤ１０６、ＣＤ３およびＣＤ１３７等のＴ細胞表面マーカーに対する抗体とセルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。得られた単一Ｔ細胞よりＰＣＲ法を用いて遺伝子クローニングを行い、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを増幅することができる。

〔ベクターの構築〕
　単離したＴＣＲのｃＤＮＡを鋳型として増幅したＰＣＲ断片を、例えばギブソン・アッセンブリー・システムを用いて、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに組み込むことができる。具体的には、ユビキチンプロモーターの下流に、単離したＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子とをＴ２Ａ配列を介して連結した遺伝子を結合し、さらにその下流に、ＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）配列に対してリガンド結合部位および細胞内ドメインを除いたＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ、truncated EGFR）または細胞内ドメインを欠損するＣＤ１９等のマーカー遺伝子を連結し、この構築物をウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに組み込む。ベクターとしては、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを用いることができるが、非ウイルスベクターが好ましい。非ウイルスベクターとしては、トランスポゾンベクターが好ましく、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターがさらに好ましい。トランスポゾン法は、従来のウイルスベクター法と比較して、安価で安全な次世代の遺伝子導入法である。

〔ＴＣＲｃＤＮＡの細胞導入〕
　Ｔ細胞への分化状態が良好な非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞由来のｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した前記成熟Ｔ細胞へのＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡ対を導入する方法としては、ウイルスベクターを用いる方法もしくは非ウイルスベクターを用いる方法またはゲノム編集技術を用いるＴＣＲの置き換えのいずれも採用することができる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびセンダイウイルス等のウイルスベクター、ならびに動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、レトロウイルスまたはレンチウイルスが好ましい。レトルウイルスまたはレンチウイルス感染を行う場合は、スピンインフェクション法等を用いることが好ましい。非ウイルスベクターを用いる場合は、トランスポゾン法が好ましい。ゲノム編集技術を用いるＴＣＲの置き換えには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、ＣＲＩＳＰＲ／ＭＡＤ法およびＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ３法を用いてもよい。非ウイルスベクターの遺伝子導入方法またはゲノム編集のためのガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡの導入方法としては、リポフェクション法、リポソーム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法およびエレクトロポレーション法が挙げられる。ベクターを用いずに、ＰＣＲ産物を直接細胞に導入することもできる。トランスポゾンベクターまたはＰＣＲ産物の細胞導入には、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。エレクトロポレーション機器としては、遺伝子導入装置ExPERT（登録商標）システム（MaxCyte社）が好ましい。ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡ対を導入する方法としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＴＡＬＥＮ等のゲノム編集技術を用いてもよい。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるＴＣＲ遺伝子の導入は、例えば、内在性ＴＣＲα鎖およびβ鎖の遺伝子中にデザインされたガイドＲＮＡ（センス鎖に対するガイドＲＮＡおよびアンチセンス鎖に対するガイドＲＮＡ）、ならびに内在性ＴＣＲα鎖の相同組み換え部を５’側と３’側とに持つ目的のＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子をＰ２Ａ配列 (自己切断部位)でつないだ遺伝子を、Ｃａｓ９をコードするベクターとともに目的の細胞へ導入することにより達成される。この場合は、目的のＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子の発現に、内在性のプロモーターおよびエンハンサーが用いられる。

　前記ｃＤＮＡ対を前記細胞に導入する場合に用いる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターおよびユビキチンプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーターは、テトラサイクリン等の薬剤の有無等によって、該プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、プロモーターに加えて、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含むことができる。

　前記ｃＤＮＡ対が導入されたｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞より分化した前記成熟Ｔ細胞は、上述した培養液、培養液組成、培養温度等の培養条件で培養することにより、前記ｃＤＮＡ対がそれぞれコードするα鎖およびβ鎖からなるＴＣＲを発現する再生Ｔ細胞が得られる。この培養において、これらの細胞の増殖を行う場合には、フィーダー細胞およびＰＨＡ（phytohemagglutinin）の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で行うことが好ましい。前記フィーダー細胞は、自家または他家の末梢血単核球が好ましい。「自家の」とは、末梢血単核球および前記ｉＰＳ細胞クローンが由来する被験者が同一であることを意味し、「他家の」とは、末梢血単核球および前記ｉＰＳ細胞クローンが由来する被験者が異なることを意味する。

　前記ｃＤＮＡ対が導入された前記ｉＰＳ細胞、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞は、クローン化してもよい。クローンの選別には、コロニーピックアップ法を行いてクローン化を行うことが好ましい。コロニーピックアップ法としては、特に制限はされないが、顕微鏡下にピペットマンを用いる方法、限界希釈法および全自動コロニーピッカーを用いた方法等が挙げられる。

　目的のＴＣＲが発現しているか否かは、例えば、ＴＣＲＶβ解析キット（BECKMAN COULTER社：カタログ番号IM-3497）を用いるＴＣＲβ遺伝子のレパトア解析に基づき、確認することができる。ベクターには、ＥＧＦＲｔ（truncated EGFR）およびＣＤ１９ｔ（truncated CD19）等のマーカー遺伝子が組み込まれているため、マーカー遺伝子の発現を解析することにより、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現を推測することができる。

　前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞は、拡大培養後、マスターセルバンクを構成してもよい。ここで言及する「マスターセルバンク」とは、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞を、単一クローンの単一プールごとに、独立した細胞保存容器に分注して集積したものである。通常、細胞の性質に変化が生じない範囲で前記細胞を増殖させ、複数の細胞保存容器に分注することが好ましい。マスターセルバンクに保存された前記細胞は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ（chimeric antigen receptor）遺伝子を導入し、再生Ｔ細胞を製造するための出発原料となる細胞であり、前記再生Ｔ細胞の製造ごとに、マスターセルバンクから必要数の前記細胞を含む細胞保存容器を取り出すことができる。したがって、本発明の再生Ｔ細胞を、同一品質で、繰り返し供給することができる。

　前記マスターセルバンクでは、細胞保存容器に分注された前記細胞を凍結保存することが好ましい。細胞の凍結保存方法は、当業者に周知である。例えば、拡大培養した細胞の単一クローンを回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数し、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、10％ DMSOを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存することができる。例えば、１本あたり１×１０^６～１０^７個の細胞を含む細胞保存容器を、細胞保存容器ストッカー等に２００～１０００本集積して、マスターセルバンクを構築することができる。本発明のマスターセルバンクは、凍結保存ができる任意の施設または貯蔵庫に保管することができる。凍結保存する場合、保存温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－２０℃、－８０℃および－１２０～－１９６℃が挙げられるが、－１５０℃以下が好ましい。

〔ｉＰＳ細胞からの再生Ｔ細胞の製造〕
　腫瘍関連抗原に対応するＴＣＲ対は、１エピトープあたりに５～１０個と言われており、それぞれのＴＣＲ対は、腫瘍関連抗原の点変異変異体に対して異なる感受性を持つことが予測されている。したがって、例えば腫瘍関連抗原に点変異が起こった場合でも、前記エピトープを認識することのできるＴＣＲが存在する可能性が高く、点変異変異体に対しても抗原に特異的な再生Ｔ細胞の準備を迅速に行うことができる。また、変異の結果、腫瘍関連抗原がまったく変化した場合であって、再生Ｔ細胞補充療法によるがん治療に耐性が生じた場合であっても、複数の腫瘍抗原に対する患者の反応性を解析し、それらの腫瘍関連抗原に応答するＴＣＲを、すでに取得されているＴ細胞への分化能の高いｉＰＳ細胞またはｉＰＳ細胞由来の分化細胞から製造を開始できるため、迅速に再生Ｔ細胞を製造することが可能である。

〔ＴＣＲ取得源のＴ細胞〕
　腫瘍関連抗原に対応するＴＣＲ対の取得源となるＴ細胞は、腫瘍組織から採取することが好ましい。採取されたＴ細胞は、試験管内で腫瘍組織との共培養により腫瘍応答性の細胞集団を増幅した後、ＣＤ１０６をマーカーとして用いた細胞単離を行ってもよい。

　ＴＣＲ対を得るためのＴ細胞を採取する被験者と、再生Ｔ細胞補充療法によるがん治療の対象となる被験者が互いに別個体である場合には、治療対象被験者から抗原特異的Ｔ細胞を採取する必要はない。したがって、再生Ｔ細胞補充療法の治療時期とは独立して、任意の時期に予めＴＣＲ対を得るためのＴ細胞を採取することができるので、再生Ｔ細胞補充療法を迅速に開始することができる。

　ＴＣＲ対を得るためのＴ細胞を採取する被験者と、再生Ｔ細胞補充療法によるがん治療の対象となる被験者とが互いに別個体である場合には、得られたＴＣＲ対が、治療対象被験者の細胞に対するアロ反応を示さないことの確認が必要である。確認の方法は、既知の方法によって行われる。例えば、得られたＴＣＲ対を持つＴ細胞が治療対象被験者の細胞に対して応答しないことを、混合リンパ球培養（ＭＬＲ）等で確認することができる。または、抗原の構成アミノ酸の一残基もしくは複数残基を他のアミノ酸で置換した抗原に対して、得られたＴＣＲ対を持つＴ細胞が応答しないことによって確認される。

〔医薬組成物〕
　本発明の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物は、がん治療対象を処置するために使用することができる。本発明の医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。該添加剤としては、例えば、細胞培養液、生理食塩水や適当な緩衝液（例えば、リン酸系緩衝液）等が挙げられる。

　本発明の医薬組成物は、再生Ｔ細胞を生理食塩水や適当な緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁することによって製造することができる。所望の治療効果が発揮されるように、一回投与分の量として、例えば１×１０^７個以上の細胞を含有することが好ましい。より好ましい細胞含有量は１×１０^８個以上、さらに好ましくは１×１０^９個以上である。細胞の含有量は、投与対象の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態等を考慮して適宜調整することができる。本発明の医薬組成物は、再生Ｔ細胞の他、細胞を保護する目的でジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）および血清アルブミン等を含有してもよい。また、細菌の混入を防止するために、抗生物質等ならびに細胞の活性化および分化を促す目的でビタミン類やサイトカイン等を含有してもよい。さらに本発明の医薬組成物は、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等）を含有してもよい。

本発明の再生Ｔ細胞を有効成分として含む医薬組成物は、凍結保存することができる。凍結保存する場合、保存温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－２０℃、－８０℃および－１２０～－１９６℃が挙げられるが、－１５０℃以下が好ましい。凍結保存する場合、細胞は、凍結バイアルおよび凍結バッグ等の適切な容器中で保存することが好ましい。再生Ｔ細胞の凍結時および解凍時の細胞損傷リスクを最小限にするための操作は、当業者に周知である。

　本発明の再生Ｔ細胞の冷凍保存においては、前記Ｔ細胞を培養液から回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数した後、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、１０％ＤＭＳＯを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存する。再生Ｔ細胞はクローンごとまたは各クローンを混合して保存してもよい。本発明の再生Ｔ細胞を含む医薬組成物は、凍結バイアルおよび凍結バッグ等の容器当たり、例えば、５×１０^４個～９×１０^１０個の再生Ｔ細胞を含むが、対象とするがんの種類、投与対象、投与経路等に応じて変更することができる。

　本発明の再生Ｔ細胞を含む医薬組成物の投与経路としては、例えば、輸注、腫瘍内注射、動注、門脈注、腹腔内投与等が挙げられる。ただし、本発明の医薬組成物中の有効成分である再生Ｔ細胞が患部に送達される限り、投与経路はこれらに限られるものではない。投与スケジュールとしては、単回投与または複数回投与とすることができる。複数回投与の期間は、例えば、２～４週に１回投与を繰り返す方法または半年から１年に１回投与を繰り返す方法等を採用することができる。投与スケジュールの作成においては、対象患者の性別、年齢、体重、病態等を考慮することができる。

　本発明の再生Ｔ細胞を含む医薬組成物を、がん患者におけるがんの予防または治療に使用する場合において、再生Ｔ細胞上のＴＣＲが他家である場合、がん患者の体内でのアロ反応を避けるため、がん患者の正常細胞に対してアロ反応を示さないＴＣＲを導入した再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物が使用される。

　本発明の医薬組成物は、がんの予防または治療のために用いられる。がんとしては、肝細胞がん、肝芽腫、胃がん、食道がん、肺がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫などの皮膚がん、膀胱がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がん、脳腫瘍、肉腫およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物は、免疫原性の高いがん、例えば、肝細胞がん、肝芽腫、大腸がん、肺がんおよび悪性黒色腫に対して好適に用いることができる。「免疫原性の高いがん」とは、免疫応答を誘導する能力が高いがんであり、がん細胞に遺伝子変異が多く認められ(細胞あたり1000以上、または5000以上)、Ｔ細胞をはじめとする免疫細胞により認識され、免疫チェックポイント阻害剤が効果を示し、かつ腫瘍組織に免疫細胞が多く浸潤をしている（病理組織染色により多くの免疫細胞を認める)がんを指す。

　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

〔末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球を初期化したｉＰＳ細胞からの再生Ｔ細胞の製造〕
　図１は、本発明の再生Ｔ細胞の製造工程を示す。治療を受けているがん患者（被験者）の腫瘍組織中の単核球を採取し、腫瘍抗原に特異的に反応するＴ細胞をＣＤ１０６陽性Ｔ細胞として単離し、前記ＣＤ１０６陽性Ｔ細胞からＴＣＲ遺伝子を単離した（図１-(2')）。前記ＴＣＲ遺伝子がコードするＴＣＲの腫瘍への結合能より、より高い治療効果が期待されるＴＣＲ遺伝子を選択した（図１-(3')）。治療を受けている患者において腫瘍の再発および腫瘍細胞の変異が生じた場合には、治療に有効なＴＣＲ遺伝子を再度選択することが可能である。十分な治療効果を得るためには、ＴＣＲの種類（ＴＣＲレパトア）を多く取得することが重要である。

　別途、前記患者の末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球より、ｉＰＳ細胞を製造した（図１-(1)および(2)）。次に、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が良好なｉＰＳ細胞クローンの選別を行った（図１-(3)）。この選別により、ｉＰＳ細胞クローンの違いによるＴ細胞への誘導効率のばらつきが顕著に低減され、再生Ｔ細胞製造の堅牢性・効率性が向上することが確認された。上記の、腫瘍抗原特異的に反応する選択されたＴＣＲ遺伝子群を、前記のＴ細胞への分化効率が良好なｉＰＳ細胞クローンに発現させ（図１-(4)）、選択されたＴＣＲ遺伝子ごとに成熟Ｔ細胞への分化および増殖を行った（図１-(5)）。なお、前記成熟Ｔ細胞は、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞であって、再生Ｔ細胞である。この再生Ｔ細胞は、がん患者に投与される（図１-(6)）。

　本発明の方法においては、ｉＰＳ細胞の製造工程（図１-(1)～(3)）と腫瘍抗原に反応するＴＣＲ遺伝子を取得する工程（図１-(2')および(3')）とを並行して行うことができるため、これらの工程を順次行う場合と比較してより短期間（約５５日）でこれらの工程を完了することができる。

　上記をより詳細に説明する。下記の通りに、腫瘍抗原特異的ＴＣＲ遺伝子の単離および抗原特異的反応性の検証を行った（図２上段部分図を参照）。がん患者（被験者）から単離された腫瘍（検体）とＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞との共培養を行った後、セルソーターにより、活性化されたＣＤ１０６陽性細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性およびＣＤ１０６陽性の細胞）の単一細胞ソーティングを行った（図２-(2)）。単離された単一細胞から、シングルセルＰＣＲによりＴＣＲ遺伝子対（ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子）を単離し、単離したＴＣＲ遺伝子対についてシークエンス解析を行い、腫瘍反応性Ｔ細胞の種類（ＴＣＲレパトア）とその出現頻度の解析を行った（図２-(3)）。単離されたＴＣＲ遺伝子対は、レポーター遺伝子を組み込んだＴＣＲ遺伝子欠損Ｔ細胞株に発現させて、ＴＣＲ遺伝子複合体を再構築した（図２-(4)）。続いて、再構築したＴＣＲ遺伝子複合体と、腫瘍との反応性（抗原特異的反応性）について検証を行った（図２-(5)）。すなわち、前記ＴＣＲ遺伝子対を発現させたＴ細胞株および目的とする腫瘍細胞を共培養するが、発現した前記ＴＣＲと腫瘍とが抗原特異的に結合した場合、ＴＣＲ遺伝子シグナルが活性化され、標的遺伝子プロモーターの下流に組み込まれたレポーター遺伝子が発現される。その後、レポーター遺伝子活性の測定を行い、腫瘍抗原特異的なＴＣＲの結合評価を行うことにより、抗原特異的反応性を検証した。以上の工程を経て、腫瘍に特異的な反応性を示したＴＣＲ遺伝子対の中から、出現頻度が高いものを複数選択し、後述の非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来ｉＰＳ細胞(Ｍ－ｉＰＳ細胞)への導入遺伝子として用いた。

　ＴＣＲ遺伝子導入ｉＰＳ細胞および再生Ｔ細胞の製造を下記の通りに行った（図２下段部分図を参照）。がん患者の末梢血単核球よりｉＰＳ細胞を作製した（図２-(2'))。図内に記載されるＭ－ｉＰＳ細胞は、Ｔ細胞に由来しないｉＰＳ細胞であり、ＴＣＲ遺伝子の遺伝子再構成が行われていない細胞である。次に、作製したＭ－ｉＰＳ細胞株群から、Ｔ細胞への分化効率が良好なＭ－ｉＰＳ細胞株を選別した（図２-(3')）。選別したＭ－ｉＰＳ細胞株に対して、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子（ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子の両遺伝子、図２-(3)を参照）を、トランスポゾンベクターを用いて遺伝子導入し（図２-(6)および図３を参照）、マーカー分子であるＣＤ１９の発現を指標に、セルソーター（MACSQuant Tyto（登録商標）セルソーター、Miltenyi Biotec社）を用いて、ＴＣＲ遺伝子を発現するＭ－ｉＰＳ細胞株（ＴＣＲ－ｉＰＳ細胞株）の選別を行った。次に、胚様体法を用いて造血幹前駆細胞を誘導し、生体内でのＴ細胞発生を模倣した段階的分化誘導法により、未熟Ｔ細胞を経て成熟Ｔ細胞への分化誘導を行った。

　上記のようにしてｉＰＳ細胞より誘導された再生Ｔ細胞（腫瘍抗原特異的ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞）の表現型を解析した。細胞表面抗原マーカーによる再生Ｔ細胞のフローサイトメーターによる解析結果を図４に示す。ｉＰＳ細胞より誘導された再生Ｔ細胞は、生体内の成熟した細胞傷害性Ｔ細胞において発現が認められるＣＤ４５^＋ＴＣＲαβ^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^－ＣＤ８αβ^＋の発現が確認された

　本発明のｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞について、細胞老化マーカーであるテロメア（若返りの指標）を解析した結果を図５に示す。患者末梢血単核球（Ａ）および再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（Ｂ）のテロメア長に比較して、前記腫瘍抗原特異的Ｔ細胞から作製されたｉＰＳ細胞（Ｃ）では約３倍、また本発明の腫瘍抗原特異的再生Ｔ細胞（Ｄ）では約２倍のテロメア長であり、ＣおよびＤにおいてテロメア長の回復が確認された。すなわち、本発明の再生Ｔ細胞においては、細胞老化の改善が示唆される。

　本発明のｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞について、免疫チェックポイントに関連する細胞疲弊マーカーのひとつあるＰＤ－１およびＴＩＧＩＴ分子の発現を、抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＤ－１抗体で染色し、フローサイトメーターにより解析した。比較として、再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞についても解析した。結果を図６に示す。本発明の再生Ｔ細胞は、再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞に比べて、ＰＤ－１およびＴＩＧＩＴ分子の発現が大きく低下していることが確認された。したがって、本発明の再生Ｔ細胞は、高い細胞傷害活性を有することが示唆される。

　細胞傷害性能の重要な指標となるサイトカイン産生能解析を行った。健常人から採取した末梢血単核球中の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ細胞）および本発明の再生Ｔ細胞を、ＰＭＡ（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate）およびイオノマイシン（Ionomycin）により刺激し、産生されるＩＬ－２およびＩＦＮ－γ量を比較した。結果を図７に示す。健常人から得られた細胞傷害性Ｔ細胞に比べ、本発明の再生Ｔ細胞では、ＩＬ－２およびＩＦＮγを産生する細胞が顕著に増加していることが確認された。

〔ｉＰＳ細胞クローンの作製〕
　肝細胞がんまたは肝芽腫患者から採取された末梢血から、単核球分離溶液Lymphoprep（登録商標）を用いて単核球を単離した。得られた単核球から、ＣＤ１９／ＣＤ２０陽性のＢ細胞およびＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８陽性のＴ細胞を、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳビーズを用いて除去し、非Ｔ非Ｂ細胞または単球を得た。得られた非Ｔ非Ｂ細胞または単球細胞集団に、山中４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ）を搭載したセンダイウイルス（CytoTune（登録商標）2.0）およびＳＶ４０Ｔａｇをコードしたセンダイウイルスを、５～２０のＭＯＩ（multiplicity of infection）で感染させた。なおＳＶ４０は除いてもよい。

　得られたｉＰＳ細胞は、数多くのｉＰＳ細胞クローンからなる。このため、コロニーピックを行い、クローン化した。すべてのクローン化されたｉＰＳ細胞は凍結保存した。クローン化されたｉＰＳ細胞を、分化培地により約１０日培養して造血幹細胞を誘導し、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ造血幹細胞を単離した。単離した造血幹細胞は、ＤＬＬ４タンパク質と免疫イムノグロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であるＦｃＤＬＬ４でコートされたプレート上で約２１日間培養し、Ｔ細胞への分化誘導を行った。

　上記２１日間培養後に得られる未熟細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ率で検証し、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ細胞の出現頻度が最も高いクローンを選別した。

　Ｔ細胞への分化効率が良好ないくつかのｉＰＳ細胞クローンは、ｉＰＳ細胞維持培地により２週間の拡大培養を行った後、細胞保存容器に分注し、凍結保存することにより、マスターセルバンクを構築した。

〔ｉＰＳ細胞クローンに対するＴＣＲ遺伝子の導入〕
　実施例２において得られた、Ｔ細胞への分化効率が良好な非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来のｉＰＳ細胞クローンに対し、腫瘍抗原特異性が確認されたＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖をコードした遺伝子を有するｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターを、エレクトロポレーション法を用いて導入した。次に、目的のＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現するｉＰＳ細胞を、マーカー分子であるＣＤ１９の発現を指標に、セルソーターにより単離した。単離されたｉＰＳ細胞は、分化培地により約１０日培養し、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブの造血幹細胞を誘導し、セルソーターにより単離した。単離した血幹細胞は、ＦｃＤＬＬ４でコートされたプレート上で約２１日間培養し、Ｔ細胞への分化誘導を行った。

　上記２１日間培養後に得られるＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブの未熟Ｔ細胞を、セルソーターを用いて単離精製した。次に、未熟Ｔ細胞を、ＰＨＡ（phytohemagglutinin）およびフィーダー細胞として末梢血単核球の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で共培養し、成熟細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導した。これらの刺激は１回以上行った。得られたＴ細胞の性能は、ＧＰＣ３特異的な標的細胞の細胞傷害活性、ＩＦＮ－γ産生および抗原結合能で確認した。

〔腫瘍傷害性Ｔ細胞におけるＣＤ１０６発現の特異性〕
　抗ＰＤ－１抗体が著効したメラノーマ患者において、抗ＰＤ－１抗体による治療開始前の手術検体から腫瘍組織を得た。得られた腫瘍組織に対してコラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを加え、37℃で30分間撹拌することにより酵素処理し、細胞を分離させた。腫瘍組織に由来する細胞と腫瘍浸潤免疫細胞との細胞混合物から、BD FACSAria III（登録商標）セルソーター（BD Biosciences社）を用いて、ＣＤ３陽性細胞をソートし、ＴＣＲを発現している細胞を得た。

　得られたＴ細胞のそれぞれに対して、Ｃｈｒｏｍｉｕｍシステム（10X Genomics社）の５プライムキットおよびＶ（Ｄ）Ｊエンリッチメントキットを用いて、マーカー候補の遺伝子発現およびＴＣＲ配列の両方について、シークエンスによりシングルセル遺伝子発現解析を行った。シークエンサーとして、HiSeq 3000（イルミナ社）を用いた。

　得られたｆａｓｔｇファイルから、Ｐｙｔｈｏｎのｕｍａｐライブラリを用いてＵＭＡＰプロットを作成した。得られたＵＭＡＰプロット上に、各遺伝子の表示をマッピングした。

　結果を図８に示す。図８の各パネルにおいて、パネル内に記載されるマーカーの発現が陽性である細胞が着色して示される。細胞は発現パターンによりクラスタリングされており、丸で囲まれた部分が腫瘍傷害性Ｔ細胞に対応する。ＣＤ１０６（ＶＣＡＭ１）陽性細胞は、腫瘍傷害性Ｔ細胞の集団に高い特異性をもって発現していることが理解される。ＣＤ１０６は、ＣＤ１０６以外の表面マーカーよりも高い特異性を有する腫瘍傷害性Ｔ細胞の選択マーカーとして使用できることが示される。ＴＣＲ配列は、β鎖が９割以上の細胞で、またα鎖が６～９割の細胞で取得された。

〔ＣＤ１０６陽性細胞集団の腫瘍攻撃性〕
　実施例５と同様にして、腫瘍組織の細胞を分離し、得られた細胞混合物から、BD FACSAria IIIを用いてＣＤ３陽性細胞をソートし、ＴＣＲを発現しているＴ細胞を腫瘍浸潤Ｔ細胞として得た。この腫瘍浸潤Ｔ細胞と、刺激剤として自己腫瘍から樹立した細胞株とを共培養し、ＩＦＮ－γ産生を無刺激の場合と比較した。ＩＦＮ－γ産生は、抗ＩＦＮ－γ抗体を用いた細胞内染色により測定した。細胞染色は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、および抗ＣＤ１０６抗体を用いて行った。ネガティブコントロールとして、抗ＣＤ１０６抗体に対するアイソタイプ・コントロール抗体を用いた。

　結果を図９に示す。ＣＤ１０６陽性細胞亜集団においてのみ、自己腫瘍細胞株による刺激によりＩＦＮ－γが産生されること、また、ＣＤ１０６以外のマーカー陽性細胞亜集団では、自己腫瘍刺激によりＩＦＮ－γが産生されるものの、マーカー陰性細胞亜集団においてもＩＦＮ－γが産生されることから、特異性がＣＤ１０６より劣ることが理解できる。

〔ｉＰＳ細胞クローンから分化した成熟Ｔ細胞に対するＴＣＲ遺伝子の導入〕
　実施例２において得られた、Ｔ細胞への分化効率が良好な非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来のｉＰＳ細胞クローンから、造血幹細胞および未熟Ｔ細胞を経由して分化した成熟Ｔ細胞に対し、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）システムを用いて、実施例３と同様にして導入した。

　遺伝子導入したｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞の表現型を、フローサイトメーターにより解析した結果を図１０に示す。図１０において、「ＮｏＥＰ」は、遺伝子導入に用いた前記成熟Ｔ細胞であって、ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖を発現させた前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「ＥＧＦＰ」は、遺伝子導入操作の指標とするトレーサー遺伝子（ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）遺伝子）を組み込んだ発現ベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「Ｅｍｐｔｙ‐ＣＤ１９」は、トレーサー遺伝子として細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子のみを組込んだpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「ＴＣＲ‐ＣＤ１９」は、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子および細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子をタンデムに組込んだpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果を示す。

　「ＮｏＥＰ」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３のみが検出された。すなわち、遺伝子導入に用いた細胞は、Ｔ細胞であることが確認された。

　「ＥＧＦＰ」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子の発現が検出された。すなわち、遺伝子導入操作は適切に行われたことが分かる。

　「Ｅｍｐｔｙ‐ＣＤ１９」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターに組み込まれたトレーサー遺伝子である細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子の発現が検出された。すなわち、遺伝子導入操作は適切に行われたことが分かる。

　「ＴＣＲ‐ＣＤ１９」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターに組み込まれたトレーサー遺伝子である細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子の発現に加え、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖が認識するＧＰＣ３ペプチド／ＨＬＡ複合体（ＧＰＣ３‐Ｄｅｘ）との結合が検出された。すなわち、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）システムを用いて、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞にＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子を導入することにより、前記細胞上に発現したＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖が、ＧＰＣ３ペプチド／ＨＬＡ複合体（ＧＰＣ３‐Ｄｅｘ）を認識する分子として機能することが示された。したがって、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞に導入するＴ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子として、新規腫瘍関連抗原（ネオアンチゲン）およびその他の腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子を用いることにより、これらの抗原を認識するｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞を作製することができることが示された。

〔末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞からの再生Ｔ細胞の製造〕
　図１１は、末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する方法を示す。ＥＢＶ（Epstein-Barrウイルス）に感染者した被験者の末梢血より単核球を分離し、分離した単核球を、試験管内でＥＢＶ抗原により刺激し、ＥＢＶ抗原を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞集団を単離した。単離したＣＤ８陽性Ｔ細胞集団に、山中４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ）およびＳＶ４０Ｔ抗原を、センダイウイルスベクターを用いて導入し、ｉＰＳ細胞集団を得た。得られたｉＰＳ細胞集団からｉＰＳ細胞クローンを分取し、それぞれのクローンについて、Ｔ細胞への分化能を調べ、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別した。ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞は、同種移植を行った場合であっても、アロ反応を生じにくい細胞である。

　図１２は、末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高い細胞として選別されたｉＰＳ細胞クローンに対してゲノム編集を行い、再生Ｔ細胞を製造する方法を示す。ＥＢＶ抗原を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞に由来し、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に関与するβ２Ｍ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に関与するＰＶＲ遺伝子ならびにＴ細胞受容体の再々構成に関与するＲａｇ２遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて削除し、一方で、ＮＫ細胞の抑制性のリガンドであるβ２Μ／結合ペプチド／ＨＬＡ－Ｅの融合遺伝子（ＨＬＡ－Ｅ^＊）を発現させて、宿主のＴ細胞およびＮＫ細胞からの攻撃を受けないｉＰＳ細胞とした。このゲノム編集において、薬剤誘導型カスパーゼ９などの自殺遺伝子および／または特異的なマーカー遺伝子（ＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor）、ＣＤ１９およびＣＤ２０など）を発現させることにより、生体内への投与後に細胞を除去することも可能となる。ゲノム編集後に再クローン化を行い、Ｔ細胞への分化効率が高いことを確認後、ｉＰＳ細胞由来の再生Ｔ細胞のクローンとして保存し、マスターセルバンクを構築してもよい。ｉＰＳ細胞から分化および増殖させた再生Ｔ細胞は、がん治療用再生Ｔ細胞を製造するためのホストＴ細胞であり、前記ホストＴ細胞によりマスターセルバンクを構築してもよい。前記ホストＴ細胞は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ（chimeric antigen receptor）遺伝子を導入した再生Ｔ細胞を作製する材料として使用することができる。前記ホストＴ細胞は、ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞であるため、生体内に移入されてもアロ反応を起こしにくい。「ホストＴ細胞」とは、この細胞そのものは患者の治療に供されることはないが、再生Ｔ細胞を有効成分とするがんの予防または治療剤を製造するための出発原料として使用されるＴ細胞を意味する。

　図１３は、前記ホストＴ細胞から、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞を製造する方法を示す。ＥＢＶ抗原を認識するホストＴ細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集による遺伝子置換により、再構成を生じたＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞受容体β鎖を、それぞれがん抗原を認識するＴ細胞受容体β鎖とＴ細胞受容体α鎖とのＴ２ａを介する連結体に置換した。一方、ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞受容体α鎖は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集により除去した。図１３に記載された方法により、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞の製造を行うことが可能であった。

　図１４は、図１１～１３に示された方法をまとめて説明するものである。末梢血Ｔ細胞を初期化した同種のユニバーサルｉＰＳ細胞から製造された再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を導入したＴ細胞を作製するための出発原料とすることができる。「ユニバーサルｉＰＳ細胞」とは、免疫原性が非常に低いため、どのような種類のＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex；主要組織適合性複合体）を持つ患者に対しても、拒絶反応を招来することなく使用することができるｉＰＳ細胞を意味する。即ち、ＭＨＣのマッチングを考慮することなく、患者に投与することができるｉＰＳ細胞である。ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子をノックアウトし、ＮＫ細胞を抑制するリガンドを発現させることにより、ユニバーサルｉＰＳ細胞を作製することができる。

　ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子の導入には、従来のＴ細胞の補充療法または再生療法に用いられるＴ細胞の製造に使用されるウイルスベクターを用いてもよい。ｉＰＳ－Ｔ細胞を出発原料とすることにより、がんの予防または治療剤の有効成分となる所望のＴ細胞を短期間に製造することが可能となる。またネオアンチゲンを認識するＴＣＲの導入も容易であり、異なるネオアンチゲンを認識する複数のＴＣＲ遺伝子を導入することにより、多クローン性を維持したままのｉＰＳ－Ｔ細胞の製造も可能である。

Claims

　（１）被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有し、かつＣＤ１０６陽性Ｔ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、
を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
　工程（２）の実施が、工程（１）の実施に先行する、または工程（１）の実施と並行する、請求項１に記載の方法。
　工程（１）および（２）における被験者が、同一個体であって、がんの予防または治療対象である、請求項１または２に記載の方法。
　工程（１）および（２）における被験者が、互いに別個体であって、工程（２）における被験者が、がんの予防または治療対象である、請求項１または２に記載の方法。
　工程（１）および（２）における被験者が、互いに別個体であって、工程（１）における被験者が、がんの予防または治療対象である、請求項１または２に記載の方法。
　工程（１）および（２）における被験者が、同一個体または互いに別個体であって、工程（１）および（２）における被験者とは異なる被験者が、がんの予防または治療対象である、請求項１または２記載の方法。
　さらに、工程（４）において得られる前記ｃＤＮＡが導入されたＴ細胞から、がんの予防または治療対象である被験者に由来する細胞に対してアロ反応を示さないＴ細胞を選別する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
　さらに、工程（１）で調製されたｃＤＮＡから、がんの予防または治療対象である被験者に由来する細胞に対してアロ反応を誘導しないＴ細胞受容体をコードするｃＤＮＡを選別する工程を含む、請求項１または２に記載の方法。
　がんの予防または治療対象である被験者に由来する前記細胞が、末梢血単核球である、請求項７または８に記載の方法。
　工程（３）において、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した前記成熟Ｔ細胞への前記ｃＤＮＡの導入が、ウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターを用いる、またはゲノム編集技術を用いる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
　前記ゲノム編集技術が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＴＡＬＥＮである、請求項１０に記載の方法。
　前記非ウイルスベクターが、トランスポゾンベクターである、請求項１０に記載の方法。
　前記トランスポゾンベクターが、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンベクターである、請求項１２に記載の方法。
　工程（４）において、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程が、フィーダー細胞およびＰＨＡ（phytohemagglutinin）の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で行われる、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
　前記フィーダー細胞が、自家または他家の末梢血単核球である、請求項１４に記載の方法。
　工程（１）または（２）における前記被験者が、肝細胞がん、肝芽腫、胃がん、食道がん、肺がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、卵巣がん、悪性黒色腫などの皮膚がん、膀胱がん、頭頸部がん、子宮がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がん、脳腫瘍、肉腫またはＢ細胞非ホジキンリンパ腫の患者である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
　工程（１）または（２）における前記被験者が、免疫原性の高いがんの患者である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
　前記免疫原性の高いがんが、肝細胞がん、肝芽腫、大腸がん、肺がんまたは悪性黒色腫である、請求項１７に記載の方法。
　工程（１）における前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ３／ＣＤ１０６ダブルポジティブである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
　前記造血幹細胞が、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
　前記未熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
　工程（２）において選別された、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローン、または工程（３）における前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞を保存し、マスターセルバンクを構成する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
　前記保存が凍結保存である、請求項２２に記載の方法。
　前記マスターセルバンクに保存された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞に対して、工程（３）および（４）を行う、請求項２２に記載の方法。
　前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞を含む、請求項２２に記載のマスターセルバンク。
　請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法により製造された再生Ｔ細胞。
　請求項２６に記載の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
　請求項２７に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。