JP2023516632A - 多能性幹細胞からナチュラルキラー細胞を産生するための方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、とりわけ、人工多能性細胞からナチュラルキラー細胞を効率的に産生するための方法を提供する。この方法は、（Ｉ）多能性幹細胞を培養培地で培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生するステップを含む。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０２１年２月２８日に出願された米国仮出願番号６２／９８３，５１１の優先権を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
［背景技術］
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、免疫系の細胞傷害性リンパ球である。ＮＫ細胞は、がん細胞、病原体感染細胞、その他の損傷を受けた細胞に対して細胞傷害性である。ＮＫ細胞は、自然リンパ球（ＩＬＣ）であり、特に免疫応答の自然アームと適応アームとを架橋する細胞傷害性の大型顆粒リンパ球である。それらは、末梢血中の循環リンパ球の１０～１５％を構成する。ＮＫ細胞はまた、免疫系内で最高レベルの細胞傷害性活性を呈する。したがって、ＮＫ細胞の機能及び数の変化は、感染及びがんに対する免疫系の機能に影響を与える。
ＮＫ細胞は、特定の細胞表面抗原受容体を含まない。このため、ＮＫ細胞は、事前の感作なく、がん細胞及び病原体感染細胞を死滅させ得、自然免疫応答の一部にし得る。それらはまた、適応免疫応答に直接影響を与えることにより、腫瘍免疫監視においてある役割を有する。これらの特徴及び他の特徴により、ＮＫ細胞は、養子細胞治療で使用するために、特に魅力的な細胞種となる。
前駆細胞からＮＫ細胞を得るための様々なプロトコルについて記載されている。しかし、該プロトコルは、労力を要し、細胞単離のステップなど、時間を要する複数のステップを必要し、ＮＫ細胞を産生するための製造／産生時間及び財政上のコストの増大となる。
本出願は、とりわけ、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞（すなわち、ＮＫ細胞またはＮＫ様細胞）の改善された産生方法を提供する。本出願は、細胞単離ステップを必要とせずに、少なくとも部分的には、多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））に由来するバルク細胞集団からのＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞の効率的かつ安定な産生の驚くべき発見に基づく。本出願の前に、ＮＫ細胞を誘導するための方法は、多くの場合、ＮＫ細胞に対する既知の細胞系譜に基づいて、特定の細胞種を単離する必要がある。本明細書に記載されるように、本出願は、予想外に、系譜をベースにした任意の細胞種の単離を必要とすることなく、ＮＫ細胞がバルク細胞集団から首尾よく誘導され得ることを示している。したがって、この方法は、例えば、コスト及び時間効率の良い方法でスケールアップして、大量のＮＫ細胞を産生する能力など、ＮＫ細胞を産生する既存の方法よりも、多くの利点を有する。したがって、本発明は、細胞療法分野における重要な進歩を表す。
本明細書に記載の方法によって産生されるｉＰＳＣ由来のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞（本明細書では「ｉＮＫ細胞」とも呼ばれる）は、機能的であり、特定の細胞集団を標的とするために、ＣＡＲの導入などを通じて、さらに遺伝子改変され得る。
いくつかの態様では、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞を産生する方法は、（Ａ）多能性幹細胞に由来する造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含むバルク細胞集団（ＨＰ細胞バルク）を提供すること、（Ｂ）１つ以上の培養培地中で、ＨＰ細胞バルクを培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生産することと、を含み、この方法は、細胞単離ステップを含まない。
いくつかの実施形態では、本方法は、ステップ（Ａ）及び（Ｂ）において、細胞単離ステップを含まない。
いくつかの実施形態では、（Ａ）のＨＰ細胞バルクは、ＣＤ３４＋細胞を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク中の細胞の２０％以上がＣＤ３４＋細胞である。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの２０％～９０％がＣＤ３４＋細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの約３０％がＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの約４０％がＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの約５０％がＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの約６０％がＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの約７０％がＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの約８０％がＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの約９０％がＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクの７０％超がＣＤ３４＋細胞である。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）は、（ｉ）ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地中でＨＰ細胞バルクを培養して、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含む中間の異種細胞集団を生成することと、（ｉｉ）ＮＫ誘導培地で中間の異種細胞集団を培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を産生することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ａ）は、ＨＰＣ誘導培地において多能性幹細胞を培養して、ＨＰ細胞バルクを産生することを含む。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つの化合物、または化合物の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰ４を含む。
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、濃度５０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍｌの濃度でＶＥＧＦを含む。
いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦは、濃度約５０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍｌの濃度でｂＦＧＦを含む。
いくつかの実施形態では、ｂＦＧＦは、濃度５０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍｌの濃度でアスコルビン酸を含む。
いくつかの実施形態では、アスコルビン酸は、濃度５０μｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＦｌｔ３Ｌを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、濃度５０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍｌの濃度でＴＰＯを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＰＯは、濃度１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物または化合物の任意の組み合わせを含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、アスコルビン酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＳＣＦを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＩＬ－７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、Ｆｌｔ３Ｌを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＴＰＯを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ｐ３８阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＳＤＦ－１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、５μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの濃度で、アスコルビン酸を含む。
いくつかの実施形態では、アスコルビン酸は、濃度５０μｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＳＣＦを含む。
いくつかの実施形態では、ＳＣＦは、濃度５０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ－７を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－７は、濃度５０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＦｌｔ３Ｌを含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、濃度５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍｌの濃度でＴＰＯを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＰＯは、濃度１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、０．５μＭ～１００μＭの濃度で、ｐ３８阻害剤を含む。
いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ＳＢ２０３５８０である。いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ＢＩＲＢ７９６である。いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ＶＸ－７０２である。いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ＳＢ２３９０６３である。いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ＳＢ２０２１９０である。いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤は、ＢＭＳ５８２９４９である。
いくつかの実施形態では、ＳＢ２０３５８０は、濃度１５μＭである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＳＤＦ－１阻害剤を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１阻害剤は、濃度３０ｎＭである。
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１阻害剤は、濃度３０ｎＭであり、ｐ３８阻害剤、例えば、ＳＢ２０３５８０は、濃度１５μＭである。
いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地は、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２及びＩＬ７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地は、ＣＤ３活性化因子を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地は、ＩＬ－２を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地は、ＩＬ－７を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地は、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ－２を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、濃度１０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地は、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度でＩＬ－７を含む。
いくつかの実施形態では、ＩＬ－７は、濃度１０ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、培養ステップの各々は、約５％の酸素で実施される。
いくつかの実施形態では、培養ステップの各々は、１４％を超える酸素で実施される。
いくつかの実施形態では、培養ステップの各々は、大気中酸素で実施される。
いくつかの実施形態では、培養ステップの各々は、５％未満の酸素で実施される。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクを得るためにバルク細胞培地中で多能性幹細胞を培養することは、１０日を超えて継続する。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクを得るためにバルク細胞培地中で多能性幹細胞を培養することは、１１日～１５日継続する。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクを得るためにバルク細胞培地中で多能性幹細胞を培養することは、１４日間継続する。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血単核細胞から得られる。
いくつかの実施形態では、産生された細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％以上は、濃縮のステップのない、例えば、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞のさらなるステップ、選別／単離／精製のないＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。したがって、いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約５０％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約５５％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約６０％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約６５％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約７０％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約７５％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約８０％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約８５％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約９０％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約９５％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。いくつかの実施形態では、濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約９７％以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。
いくつかの実施形態では、産生された細胞の約２５％未満、２０％、１５％、１０％または５％が、ＣＤ３＋細胞である。
いくつかの実施形態では、産生された細胞の表現型は、当技術分野における様々な手段によって確認することができる。例えば、産生された細胞の表現型は、フローサイトメトリーまたは単一細胞ＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって確認できる。
いくつかの実施形態では、産生された細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーによって決定される。いくつかの実施形態では、産生された細胞のパーセンテージは、ｓｃＲＮＡｓｅｑによって決定される。
いくつかの実施形態では、この方法は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を単離するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気ソーティングによって単離される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、ＦＡＣＳによって単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、磁気ソーティング（ＭＡＣＳ）によって単離される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞は、ＮＫ細胞である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、単離されたＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ１９である。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５複合体を発現するようにさらに遺伝子改変されている。
いくつかの態様では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生する方法が提供され、本方法は、（１）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びアスコルビン酸から選択される少なくとも１つの化合物を含むＨＰＣ誘導培地において、ｉＰＳＣを培養して、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む異種細胞集団（ＨＰ細胞バルク）を得るステップと；（２）アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地において、（１）で得たＨＰ細胞バルクを培養して、中間の異種細胞集団を得るステップと；（３）ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含むＮＫ誘導培地において、（２）の中間の異種細胞集団を培養するステップと、を含む。
いくつかの態様では、ＮＫ細胞集団が提供され、この集団は、本明細書に記載の方法を使用して産生される。
いくつかの態様では、選別されていない細胞集団が提供され、この集団は、多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋免疫細胞全体の６０％以上の比率で、多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を含む。
いくつかの実施形態では、細胞の２５％未満が、ＣＤ３＋細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞の５％未満が、単球である。
いくつかの実施形態では、細胞の５％未満が、Ｂ細胞である。
いくつかの態様では、細胞療法を必要とする対象を治療する方法が提供され、本方法は、本明細書に記載のＮＫ細胞を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。
いくつかの実施形態では、がんは、白血病またはリンパ腫である。
いくつかの態様では、多能性幹細胞由来のＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生する方法が提供され、本方法は、（Ｉ）１つ以上の培養培地において、多能性幹細胞を培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生するステップを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｉ）は、（Ａ）培養培地において多能性幹細胞を培養して、造血前駆細胞（ＨＰＣ）（ＨＰ細胞バルク）を産生することと；（Ｂ）培養培地においてステップ（Ａ）で得た細胞を培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ｂ）は、（ａ）培養培地において、ステップ（Ａ）で得た細胞を培養して、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生することと；（ｂ）培養培地において、ステップ（ａ）で得た細胞を培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生することと、を含む。
いくつかの実施形態では、前のステップのいずれも、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団の単離ステップを実施することを含まない。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
いくつかの態様では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生する方法が提供され、本方法は、（ＩＩ）培養培地において、造血前駆細胞（ＨＰＣ）（ＨＰ細胞バルク）を含む細胞を培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生するステップを含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ＩＩ）は、（Ｘ）培養培地において、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む細胞を培養して、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を産生することと；（Ｙ）培養培地において、ステップ（Ｘ）で得た細胞を培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生することと、を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ＩＩ）は、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞の単離ステップを実施することを含まない。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ａ）は、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つの化合物を有する培養培地を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）またはステップ（Ｘ）は、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有する培養培地を含む。
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）またはステップ（Ｙ）は、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２及びＩＬ７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有する培養培地を含む。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＩＬ－７及び／またはＩＬ－１５を含む培養培地において、ステップ（ｂ）またはステップ（Ｙ）の後に産生された細胞を培養することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、培養することは、約５％の酸素で実施される。
いくつかの実施形態では、ステップ（Ａ）は、約１０日間継続する。別の実施形態では、ステップ（Ａ）は、約１０～１８日間継続する。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血単球細胞から産生される。
いくつかの実施形態では、産生された細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％または９０％は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞の約２５％未満が、ＣＤ３＋細胞である。
いくつかの実施形態では、本方法は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を単離するステップをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって単離される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋免疫細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－である。
いくつかの実施形態では、任意の多能性、多分化能、または患者由来のＨＰＣを、本明細書に記載の方法で使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は成体幹細胞である。様々な成体幹細胞が当技術分野で知られており、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、臍帯由来細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。したがって、本明細書に記載の方法に従って産生されるＮＫ細胞は、ドナーに直接由来する一次ＨＰＣなどの任意の多能性、多分化能、または患者由来のＨＰＣから作製することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、細胞分化の任意の段階で、遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多能性、多分化能、または単能性の段階で遺伝子改変されている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多能性段階で、遺伝子改変されている。例えば、細胞は、胚性幹細胞の段階またはｉＰＳＣ幹細胞の段階で遺伝子改変され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多分化能段階で遺伝子改変されている。例えば、細胞は、ＨＳＣ段階で、遺伝子改変され得る。
いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、単離されたＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ１９である。
いくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５複合体を発現するようにさらに遺伝子改変されている。
いくつかの態様では、選別されていない細胞集団が提供され、この細胞集団は、多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋免疫細胞全体の６０％以上の比率で、多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を含む。
いくつかの実施形態では、細胞の２５％未満がＣＤ３＋細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞の５％未満が、単球である。
いくつかの実施形態では、細胞の５％未満が、Ｂ細胞である。
いくつかの態様では、細胞療法を必要とする対象を治療する方法が提供され、本方法は、前記請求項のいずれか１項に記載の多能性幹細胞由来のＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。
いくつかの実施形態では、がんは、白血病またはリンパ腫である。
本明細書に記載の方法では、例えば、ＨＰＣ誘導培地、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地、及びＮＫ誘導培地など、様々な培養培地が使用される。
いくつかの態様では、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）は、造血前駆細胞を含む細胞集団を生成するために、ＨＰＣ誘導培地において、ある一定期間培養され、この細胞集団は、本明細書においてＨＰ細胞バルクと呼ばれる。いくつかの実施形態では、この期間は、約１０～１４日である。いくつかの実施形態では、この期間は、約１３日である。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、ＴＧＦβ阻害剤、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチンＴＰＯ、及びＦｌｔ３Ｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸を含むＨＰＣ誘導培地において、１日目から約１０日目まで培養される。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦは、濃度約５０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ｂＦＧＦは、濃度約５０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、アスコルビン酸は、濃度約５０μｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＢＭＰ４を含むＨＰＣ誘導培地において１日目～約３日目まで培養される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、濃度約５０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、濃度約６μＭのＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ阻害剤と共に、約２日目～約３日目まで培養される。いくつかの実施形態では、培養の７日目～１３日目の間、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチンＴＰＯ、及びＦｌｔ３Ｌのうちの１つ以上を培養物に添加させる。いくつかの実施形態では、ＳＣＦは、濃度約５０ｎｇ／ｍＬで添加される。いくつかの実施形態では、ＴＰＯは、濃度約３０ｎｇ／ｍＬで添加される。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、濃度約１０ｎｇ／ｍＬで添加される。
いくつかの態様では、ＨＰ細胞バルク集団は、ある一定期間、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養され、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含む中間の異種細胞集団を含む細胞の集団を生成する。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク集団は、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で１９～２２日間培養させる。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク集団は、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で約２１日間培養させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、アスコルビン酸、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ｐ３８ＭＡＰＫｉ阻害剤、例えば、ＳＢ２０３５８０、ＳＤＦ１ａなどのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、アスコルビン酸は、濃度約５０μｇである。いくつかの実施形態では、ＳＣＦは、濃度５０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＴＰＯは、濃度約１００ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３Ｌは、濃度約５０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＩＬ７は、濃度約５０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＳＢ２０３５８０は、濃度約１５μＭである。いくつかの実施形態では、ＳＤＦ１ａは、濃度約３０ｎＭである。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクは、ｈＤＬＬ４／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎがコーティングされた培養ディッシュ上で培養される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ｐ３８阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＳＤＦ－１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１を含む。
いくつかの態様では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含む異種細胞集団は、ある一定期間、ＮＫ誘導培地で培養し、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を含む細胞集団を生成する。いくつかの実施形態では、異種細胞集団は、ＮＫ誘導培地において約５～９日の期間培養する。いくつかの実施形態では、細胞集団は、約７日間培養する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞誘導培地は、ＩＬ－７、ＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、異種細胞集団は、ＩＬ－７及びＩＬ－２を含むＮＫ細胞誘導培地において、約７日間培養する。いくつかの実施形態では、ＩＬ－７は、濃度約１０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２は、濃度約１０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、異種集団は、抗ＣＤ３を含むＮＫ細胞誘導培地において約３日間培養させる。いくつかの実施形態では、本方法は、５０％超、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生成する。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、５０％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生成する。いくつかの実施形態では、本方法では、６０％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生成する。いくつかの実施形態では、本方法では、７０％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生成する。いくつかの実施形態では、本方法では、８０％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生成する。いくつかの実施形態では、本方法では、９０％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生成する。いくつかの実施形態では、本方法では、９５％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を生成する。
本明細書に記載の方法を使用して得られたＮＫ細胞バルク集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す一連のフローサイトメトリープロットである。簡潔に述べると、ｉＰＳ細胞は、中間の単離ステップなく、本明細書に記載のとおり培養された。フローサイトメトリーグラフは、ＣＤ５６ｈｉｇｈであるＣＤ３陰性細胞の集団（ＮＫ細胞バルク集団の約６３．５％）及びＣＤ５６ｄｉｍであるＣＤ３陰性細胞の集団（ＮＫ細胞バルク集団の約２６．７％）の存在を示している。これらの集団は両方とも、ＮＫ細胞である。したがって、得られたＣＤ５６陽性、ＣＤ３陰性のＮＫ細胞集団の合計は、細胞集団全体の９０％を超えている。 本明細書に記載の方法を使用して得られたＮＫ細胞バルク集団のｓｃＲＮＡ分析の結果を示す図である。簡潔に述べると、ｉＰＳ細胞は、中間の単離ステップなく、本明細書に記載のとおり培養させた。細胞は、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ細胞の４つの細胞集団に分類した。ＮＫ細胞バルク集団中の細胞の約７５％が、ＮＫ細胞として同定され（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞）、バルク細胞集団中の細胞の約２５％が、Ｔ細胞として同定された。本明細書に記載のＴ細胞は、ＮＫＴ細胞（ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋細胞）を含み得る。 ルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ６細胞を投与し、その後、ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞を投与したＮＳＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２Ｒガンマヌル）マウスにおける抗腫瘍活性アッセイの結果を示す一連の写真を示す図である。Ｎａｌｍ６細胞を移植したＮＳＧマウスを、（ａ）ＰＢＳバッファー（ｂ）ｉＮＫ－ＣＡＲ細胞で処理し、これらの処理の抗腫瘍効果を観察した。データは、ｉＮＫ－ＣＡＲ細胞がＮａｌｍ６細胞の増殖を減少させたことを示している。
［発明の詳細な説明］
定義
投与：本明細書で使用される場合、「投与する」、「投与すること」、「投与」、「導入すること」または「導入」という用語は、治療用細胞、例えば、ｉＰＳＣまたはＨＰＣ由来ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を、このような細胞の送達をもたらす方法または経路によって対象に送達する文脈において、互換的に使用される。例えば、静脈内、局所、経口、筋肉内、腹腔内、髄腔内、皮下または経皮など、細胞を投与するための様々な方法が当技術分野で知られている。細胞は、担体の有無にかかわらず投与させ得る。
養子細胞療法：本明細書で互換的に使用される場合、「養子細胞療法」または「養子細胞移植」または「細胞療法」または「ＡＣＴ」という用語は、細胞、例えば、本明細書に記載の方法を使用して生成され、必要とする対象または患者に投与されるＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞の集団を移植することを指す。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載の方法を使用して作製され、さらにＣＡＲを発現するＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞である。
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発育の任意の段階におけるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発育の任意の段階における非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては、これらに限定されないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫が挙げられる。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物及び／またはクローンであり得る。
抗原特異的標的ドメイン：「抗原特異的標的化ドメイン」は、目的の標的抗原に結合する能力をＣＡＲにもたらす。いくつかの実施形態では、抗原特異的標的化ドメインは、腫瘍死滅をもたらすエフェクター免疫応答を誘発することが望ましいであろう、臨床的に関心のある抗原を標的とする。抗原特異的標的化ドメインは、生体分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、またはそれらの成分）を特異的に認識して結合する能力を保有する任意のタンパク質またはペプチドであり得る。抗原特異的標的化ドメインには、目的の生体分子に対して、天然に存在する、合成の、半合成の、または組換えにより産生された任意の結合パートナーが含まれる。
例示的な抗原特異的標的化ドメインとしては、例えば、抗体もしくは抗体断片もしくは誘導体、受容体の細胞外ドメイン、細胞表面分子／受容体のリガンド、またはその受容体結合ドメイン、及び腫瘍結合タンパク質が挙げられる。
いくつかの実施形態では、抗原特異的標的化ドメインは、抗体であるか、または抗体に由来する。抗体由来標的化ドメインは、抗体の断片、または抗体の１つ以上の断片の遺伝子操作産物であり得、この断片は、抗原との結合に関与している。例としては、可変領域（Ｆｖ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、Ｆａｂ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、及びラクダ科抗体（ＶＨＨ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ｓｃＦｖは、マウス、ヒト、またはヒト化ｓｃＦｖであり得る。
同種異系：本明細書で使用される「同種異系」は、物質が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の物質を指す。１以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２以上の個体は、互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様では、同じ種の個体からの同種異系物質は、抗原的に相互作用するために遺伝的に十分に異なり得る。
およそまたは約：本明細書で使用する場合、１つ以上の目的の値に適用される通り、用語「およそ」または「約」は、述べられた基準値と類似する値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限り、あるいは別様に前後関係から明白な場合を除いて、表示された参照値（を上回るかまたは下回る）のいずれかの２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、もしくはそれ未満の範囲内に含まれる値域を指す（この数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。「約」または「およそ」という用語が、記載された基準値を修飾するために使用される場合、記載された基準値自体は、記載された基準値のいずれかの側の記載された基準値に近い値と共に網羅されることが理解される。
アスコルビン酸またはビタミンＣ：本明細書で使用する場合、「アスコルビン酸」または「ビタミンＣ」は、Ｌ－アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、「Ｌ－アスコルビン酸誘導体」は、生体内で酵素反応によりビタミンＣになる誘導体を意味する。Ｌ－アスコルビン酸の誘導体の例としては、ビタミンＣホスフェート、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンＣエステル、アスコルビルテトラヘキシルデカノエート、アスコルビルステアレート、及びアスコルビル２－ホスフェート６－パルミテートが挙げられる。ビタミンＣホスフェートの例としては、Ｌ－アスコルビン酸ホスフェートの塩、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ホスフェートＮａ及びＬ－アスコルビン酸ホスフェートＭｇなどが挙げられる。一実施形態では、ビタミンＣは、アスコルビン酸２－ホスフェートであり得る。
バルク細胞集団：「バルク細胞集団」、「バルク細胞」などの用語は、異種細胞集団を指す。いくつかの実施形態では、バルク細胞集団は、造血細胞を含む。いくつかの実施形態では、バルク細胞集団は、多能性細胞、例えば、人工多能性幹細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、バルク細胞集団は、ドナー組織、例えば、血液などから得られる。
ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地：本明細書で使用される用語ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む細胞の集団を得るために使用される細胞培養培地を指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＨＰ細胞バルクをＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む細胞集団に分化させるために使用される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、アスコルビン酸、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ７、ｐ３８ＭＡＰＫｉ阻害剤、例えば、ＳＢ２０３５８０、ＳＤＦ１ａなどのうちの１つ以上またはすべてを含む。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」操作受容体という用語は、細胞（例えば、ＮＫ細胞、ナイーブＴ細胞などのＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞またはそれらの組み合わせ）に抗原特異性を付与できる受容体である。ＣＡＲは、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても既知である。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲは、抗原特異的標的化ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意により１つ以上の共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、所望の細胞表面抗原またはＭＨＣペプチド複合体に対する特異性を再配向するように、本明細書に記載の方法を使用して作製されたＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞（例えば、ＮＫまたはＮＫ様細胞）に導入されている。これらの合成受容体は、典型的には、単一の融合分子内の柔軟なリンカーを介して１つ以上のシグナル伝達ドメインに関連する標的結合ドメインを含む。標的結合ドメインは、免疫細胞（例えば、ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋免疫細胞）を病的細胞（例えば、がん細胞）の表面上で、特定の標的に配向するために使用され、シグナル伝達ドメインは、免疫細胞（例えば、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞）の活性化及び増殖のための分子機械を含む。通常、免疫細胞を通過する柔軟なリンカー（例えば、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞）膜（すなわち、膜貫通ドメインの形成）により、ＣＡＲの標的結合ドメインの細胞膜表示が可能になる。ＣＡＲは、リンパ腫及び固形腫瘍など、様々な悪性腫瘍の腫瘍細胞の表面に発現する抗原に対して免疫細胞を上手く再配向できている（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．，２１（１ Ｐｔ １）：１２７－３０；Ｊｅｎａ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ，１１６（７）：１０３５－４４）。ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、マウスまたはヒト化モノクローナル抗体の可変重鎖領域と軽鎖領域との融合に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成されていてもよい。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含む。あるいは、（例えば、Ｆａｂライブラリーから得られた抗体からではなく）Ｆａｂに由来するｓｃＦｖを使用してもよい。様々な実施形態において、このｓｃＦｖは、膜貫通ドメインに融合され、次に細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。少なくとも３世代のＣＡＲを開発した。第１世代のＣＡＲは、ＣＤ３ゼータの細胞質領域またはＦｃ受容体ガンマ鎖に由来するシグナル伝達ドメインに付着した標的結合ドメインで構成させた。第１世代のＣＡＲは、免疫細胞を選択された標的にうまく再配向することが示されたが、ｉｎ ｖｉｖｏでの長期の拡大及び抗腫瘍活性をもたらすことはできなかった。第２世代及び第３世代のＣＡＲでは、ＣＤ２８、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、及び４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの共刺激分子を含めることにより、改変細胞の生存率を高め、増殖を増加させることに重点を置いている。
培養：「培養」または「細胞培養」または「培養すること」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境での細胞の維持、成長、及び／または分化を指す。本明細書に記載の様々な方法において、細胞は、ある種の細胞の異なる種の細胞への成長または分化を容易にするかまたは促進する特定の細胞培養培地（複数可）で培養される。例えば、本明細書に記載の特定の実施形態では、細胞培養培地中でｉＰＳＣを培養することにより、細胞集団全体の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％の８０％の細胞が、ＣＤ３４＋細胞（すなわち、ＨＰＣ）になる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％の３０％ＨＰＣは、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含む細胞集団をもたらす。さらに他の実施形態では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含む細胞集団を培養することにより、濃縮したＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞集団がもたらされる（すなわち、細胞集団全体の少なくとも５０％の細胞が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－である）。細胞培養培地は、栄養素、ホルモン、及び／または細胞の伝播及び／または維持に役立つ他の因子の供給源として作用する。
分化すること：「分化すること」、「誘導すること」、「変換すること」、「由来すること」などの用語は、ある表現型の細胞が別の表現型の細胞に変化するプロセスを指す。
操作：本明細書で使用される「操作」という用語は、設計または改変され、その存在及び産生に、介入及び／または活性を必要とするポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を表す。例えば、操作細胞は、特定の効果を引き出すように意図的に設計されており、かつ同じ種の天然に存在する細胞の効果とは異なる。いくつかの実施形態では、操作細胞は、本明細書に記載の方法を使用した、ｉＰＳＣまたはＨＰＣ由来のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞であり、キメラ抗原受容体をさらに発現する。
濃縮：特定の細胞種に関して本明細書で使用される「濃縮された」という用語は、フローサイトメトリーまたは他の分析方法によって判断したときに、細胞集団内の特定の細胞種の少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％を有する細胞集団を意味する。
Ｅｘ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、細胞が生物から除去され、生物の外部で増殖するプロセスを意味する（例えば、試験管内、培養バッグ内、バイオリアクター内）。
機能的同等物または派生物：本明細書で使用される場合、「機能的同等物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体の文脈において、元の配列と実質的に類似している生物学的活性（機能または構造のいずれか）を保持している分子を意味する。機能性誘導体または同等物は、天然誘導体であり得るか、または合成的に調製される。例示的な機能的誘導体としては、タンパク質の生物学的活性が保存されているという条件で、１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列が挙げられる。置換アミノ酸は、望ましくは、置換アミノ酸と同様の化学的物理的特性を有する。望ましい類似の化学的物理的特性としては、電荷の類似性、かさ高さ、疎水性、親水性などが挙げられる。
造血前駆細胞：「造血前駆細胞（複数可）」または「ＨＰＣ（複数可）」という用語は、造血系譜に関与しているが、さらなる造血分化が可能であり、造血幹細胞、多分化能造血幹細胞、一般的な骨髄系前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、及びリンパ系前駆細胞を含むＣＤ３４＋細胞を指す。
ＨＰＣバルク：「ＨＰＣバルク」、「造血前駆細胞バルク」、または「ＨＰ細胞バルク」という用語は、造血前駆細胞を含む異種細胞集団を意味する。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、ｉＰＳＣに由来する。いくつかの実施形態では、ＨＰＣバルクは、血液に由来する。
ＨＰＣ由来ＮＫ細胞：「ＨＰＣ由来ＮＫ細胞」という用語は、細胞培養培地での培養後にＨＰＣバルク集団から得られるＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞（例えば、ＮＫまたはＮＫ様細胞）を意味する。
ＨＰＣ誘導培地：本明細書で使用される用語ＨＰＣ誘導培地は、開始細胞集団から、造血細胞を含む細胞集団を産生するために使用される培養培地を指す。いくつかの実施形態では、開始細胞集団は、ｉＰＳＣである。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アスコルビン酸、ＴＧＦβ阻害剤、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチンＴＰＯ、及びＦｌｔ３Ｌのうちの１つ以上を含む。
免疫細胞：本明細書で使用される場合、「免疫細胞（複数可）」という用語は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、赤血球、単球、好塩基球、好中球、肥満細胞、好中球、及びそれらの任意の組み合わせなどの免疫系の細胞を指す。様々な実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して産生される免疫細胞は、ＮＫ細胞であり、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を特徴とする。
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）：本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、例えば、１つ以上の遺伝子（ＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子ＩＤ；５４６０）と、これらに限定されないが、ＳＯＸ２（遺伝子ＩＤ；６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子ＩＤ；９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子ＩＤ；４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子ＩＤ；７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子ＩＤ；７９７２７））との組み合わせの発現を誘導することによって、非多能性細胞、典型的には成体細胞から人工的由来である（例えば、人工）多能性幹細胞を指す。幹細胞は、マーカーまたは遺伝子が培養の任意の段階まで保持されるように、マーカーまたは遺伝子を用いて任意の段階で遺伝子改変させ得る。マーカーは、培養の任意の段階で、分化したまたは未分化の幹細胞集団を精製または濃縮するために使用してもよい。
誘導培地：「誘導培地」という用語は、一般に、細胞の集団を第１の細胞表現型から第２の細胞表現型に分化するために使用される細胞培養培地を指す。いくつかの実施形態では、第１の細胞表現型及び第２の細胞表現型は、異種細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、第１の細胞表現型は、異種細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、第２の細胞表現型は、異種細胞集団を含む。いくつかの実施形態では、誘導培地は、異種細胞集団を実質的に同種である細胞の集団に分化させるために使用される。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用する場合、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、多細胞生物の内部ではなく人工環境、例えば、試験管内または反応容器内、細胞培養内などで生じる事象を指す。
Ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物内で発生する事象を指す。細胞ベースの系の文脈では、この用語は、生細胞内で生じる事象を指すために使用され得る（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系の反対である）。
単離ステップ：本明細書で使用される「単離ステップ」または「細胞単離ステップ」という用語は、細胞の混合物から特定の細胞種を分離するステップを意味する。細胞の混合物から特定の細胞種を分離する様々な方法が当技術分野で知られており、例えば、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）及び磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）などの磁気ビーズベースのソーティング戦略が挙げられる。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞：本明細書で使用される場合、「ナチュラルキラー細胞」またはＮＫ細胞は、そのマーカー発現及び機能／活性によって定義されるリンパ系細胞である。例えば、ヒトでは、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現する。さらなる実施形態では、このようなＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６を発現し得る。別の例では、このようなＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞であり得る。ＮＫ細胞は、様々なレベルのＣＤ５６を発現し得る。例えば、ＮＫ細胞は、「ＣＤ５６ｈｉｇｈ」であり得、これは、当技術分野の方法によって評価されたときに、例えばフローサイトメトリーによって評価されたときに、ＮＫ細胞が高レベルのＣＤ５６を発現することを意味する。別の例として、ＮＫ細胞は「ＣＤ５６ｄｉｍ」であり得、これは、当技術分野の方法によって評価されたときに、例えばフローサイトメトリーによって評価されたときに、ＮＫ細胞が低いが検出可能なレベルであるＣＤ５６を発現することを意味する。
ＮＫ誘導培地：いくつかの実施形態では、「ＮＫ誘導培地」という用語は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を含む細胞の集団を生成するために使用される細胞培養培地を指す。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞誘導培地は、１つ以上のＩＬ－７、ＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体を含む。
ｉＰＳ ＮＫ細胞：本明細書で使用される場合、「ｉＰＳ ＮＫ細胞」は、ｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞、例えば、出発物質として、ｉＰＳＣに由来するＮＫ細胞である。このようなｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現する。さらなる実施形態では、このようなｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６を発現し得る。別の例では、このようなｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し得るか、ＣＤ３－（ＣＤ５６＋／ＣＤ３－）であり得る。ｉＰＳ ＮＫ細胞は、本明細書では「ｉＮＫ細胞」とも呼ばれる。
Ｔ細胞：本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」は、そのマーカー発現及び機能／活性によって定義されるリンパ系細胞である。例えば、ヒトでは、Ｔ細胞はが、ＣＤ３を発現する。ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋細胞は、ＮＫＴ細胞として知られている。
「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」は、直接またはペプチドリンカー配列を介して互いに接続されている軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む操作された抗体を指す。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトは、出生前及び出生後の形態を含む。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は、患者であり得、患者は、疾患の診断または治療のために医療提供者を訪れるヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書において、「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害に罹患しているか、またはそれに対して感受性であるが、疾患または障害の症状を表していても、表していなくてもよい。
に罹患している：疾患、障害、及び／または状態に「罹患している」個体は、疾患、障害、及び／または状態の１つ以上の症状があると診断されているか、またはそれらを示す。この疾患には、がん、例えばリンパ腫及び白血病が含まれ得る。
治療的有効量：本明細書で使用される場合、治療剤（例えば、細胞療法）の「治療的有効量」という用語は、疾患、障害及び／または状態に罹患しているかまたはそれらに対して感受性があるそれらにかかり易い対象へ投与するときに、疾患、障害及び／または状態の症状（複数可）の発現を治療、診断、予防及び／または遅延させるために十分な量（例えば、特定の種または複数の種の細胞（複数可）の特定のパーセンテージで濃縮された特定の数の細胞または細胞集団）を意味する。治療的有効量は典型的に、少なくとも１回用量を含む投与計画によって投与されるものであることが当業者には分かるであろう。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、１つ以上の導入遺伝子を発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、例えばＣＤ１９などのキメラ抗原受容体を発現するように改変されている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約１億～９億のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約１億～７億のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約１億～５億のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約２億～９億のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約２億～７億のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、それを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の約２億～５億のＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、それを必要とする対象に投与される。
治療すること：本明細書で使用する場合、「治療する」、「治療」または「治療すること」という用語は、特定の疾患、傷害及び／または状態の１つ以上の症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に軽減、改善、緩和、阻害もしくは予防するために、それらの開始を遅らせるために、その重症度を軽減するために、及び／またはそれらの発生率を低下させるために用いられる任意の方法を指す。治療は、疾患に関連する病状の発症リスクを低下させる目的で、疾患の兆候を示さない及び／または疾患の初期兆候のみを示す対象へも施されてよい。
本明細書でのエンドポイントによる数値範囲の列挙には、その範囲内に含まれるすべての数値及び分数が含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９、４、及び５が含まれる）。また、そのすべての数及び分数は、「約」という用語によって修飾されると推定されることも理解されたい。
本発明の様々な態様は、以下の節において詳細に記載される。節の使用は、本発明を限定するものではない。各節は、本発明の任意の態様に適用できる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が別段であると明確に指示しない限り、単数及び複数の指示対象を両方とも含む。
本発明の様々な態様は、以下の節において詳細に記載される。節の使用は、本発明を限定するものではない。各節は、本発明の任意の態様に適用できる。本出願において、「または」の使用は、別途記載のない限り、「及び／または」を意味する。
本開示は、ｉＰＳ細胞または造血前駆細胞（ＨＰＣ）などの多能性細胞からＮＫ細胞を産生する方法を提供する。ｉＰＳＣから産生されたＮＫ細胞は、本明細書では、ｉＰＳ由来ＮＫ細胞、ｉＰＳ ＮＫ細胞またはｉＮＫ細胞と称する。本開示は、単離ステップを必要とすることなく、ｉＰＳＣまたはＨＰＣなどの前駆細胞をＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞に高効率で分化させることができる細胞培養方法を提供する。本開示はまた、得られたｉＰＳ ＮＫ細胞が機能的であり、例えば、がんなどの様々な疾患または障害の治療に有用なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の導入を通じて、さらに遺伝子改変され得ることを示す。
ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞（ＮＫ細胞）の様々な産生方法については、以下にさらに詳述する。
単離ステップなく、多能性細胞からＮＫまたはｉＰＳ由来ＮＫ細胞を産生する方法
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ由来ＮＫ細胞を産生する方法が提供され、この方法では、単離ステップを必要としない。
培養法の概説
本明細書で提供される方法は、いかなる単離ステップも介在させずに、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞の産生が可能である。いくつかの実施形態では、本方法は、造血細胞（ＨＰＣ）（ＨＰ細胞バルク）を含む細胞の集団を得るために、ＨＰＣ誘導培地において、ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞を培養することを含む。ＨＰ細胞バルク集団は、その後、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を得るために、単離ステップを実施することなく、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地において培養される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団はまた、ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む。その後、培養期間において、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞が豊富な集団を得るために、単離ステップを実施することなく、細胞をＮＫ誘導培地で培養する。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を産生する方法は、１）造血細胞を含む集団（ＨＰ細胞バルク）を得るために、ＨＰＣ誘導培地で多能性細胞を培養することと；２）ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む細胞の集団を得るためのＣＤ４／ＣＤ８誘導培地において、ＨＰ細胞バルクを培養することと；及び３）一定期間、ＮＫ誘導において、ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、及びＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む細胞の集団を培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を得ることと、を含む。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞を産生する方法は、造血前駆細胞を含む細胞（例えば、ＨＰ細胞バルク）を培養して、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生することを含み、その後の培養期間、単離ステップを実施することなく、細胞集団を培地で培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞で濃縮された集団を得る。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生する方法は、１つ以上の培地で多能性幹細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生する方法は、１つ以上の培地で造血前駆細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生する方法は、１つ以上の培地において、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞の混合物または集団を培養することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を豊富に含む集団は、その後、例えば、ＦＡＣＳソーティングまたは磁気ビーズベースの単離技術など、当技術分野で知られている任意の好適な方法によって分離することができる。一実施形態では、ｉＰＳ細胞は、約４～８週間、５～７週間、または約６週間でｉＰＳ ＮＫ細胞に分化させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、約４～８週間でＮＫ細胞に分化させ得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、約５～７週間でＮＫ細胞に分化させ得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、約６週間でＮＫ細胞に分化させ得る。
細胞分化プロセスは、当技術分野で知られている様々な手段によって評価することができる。例えば、いくつかの実施形態では、培養細胞の細胞分化は、培養細胞のサンプルを得て、培養細胞のそのサンプルを１つ以上の分析方法に供して、細胞の細胞表現型を確認することによって評価することができる。細胞表現型を確認する既知の方法としては、例えば、フローサイトメトリー及び免疫蛍光イメージングが挙げられる。任意の好適なサンプリング及び表現型アッセイを、本明細書に記載の細胞培養法と共に使用して、細胞分化プロセスの進行を確認することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、所与の時間に細胞表現型を決定するための１つ以上のサンプリングステップを含む。
ｉＰＳＣからＨＰ細胞バルクへの概説
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣなどの多能性細胞をＨＰＣ誘導培地で培養して、ＨＰ細胞バルクを含む集団を産生する。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクを得るためにＨＰＣ誘導培地においてｉＰＳＣを培養することは、ＨＰＣ誘導培地においてｉＰＳＣを培養することを含む。ＨＰＣ誘導培地は、ＨＰ細胞バルクの生産が可能になる様々な成分を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、ＲＯＣＫ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つ以上の化合物を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導するためのＨＰＣ誘導培地は、ＢＭＰ４を含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導するための培養培地は、ＶＥＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導するための培養培地は、ｂＦＧＦを含む。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰＣを誘導するための培養培地は、ＴＧＦβを含む。
ｉＰＳＣは、ＨＰＣ誘導培地期間で、ＨＰ細胞バルクを産生するのに十分な期間培養される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、約７～２１日、または１０～１８日、または約１４日の期間、ＨＰＣ誘導培地中で培養される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、約１３日間、ＨＰＣ誘導培地中で培養される。
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、約３％Ｏ２で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、約４％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約５％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６％Ｏ２で培養される。
ＨＰ細胞バルクからＣＤ４／ＣＤ８への概説
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルク、または他の方法で得られたＨＰＣ、例えば、ヒトドナーから単離された一次ＨＰＣまたは胚性幹細胞由来など他の幹細胞源／種から分化したＨＰＣは、培地中で任意の単離ステップを介在させることなくさらに培養し、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性（ＤＰ）細胞を含む細胞の集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルク、または他の方法で得られたＨＰＣ、例えば、ヒトドナーから単離された一次ＨＰＣまたは胚性幹細胞由来など他の幹細胞源／種から分化したＨＰＣは、培地中で任意の単離ステップを介在させることなくさらに培養し、ＣＤ４＋／ＣＤ８細胞を含む細胞集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルク、または他の方法で得られたＨＰＣ、例えば、ヒトドナーから単離された一次ＨＰＣまたは胚性幹細胞由来など他の幹細胞源／種から分化したＨＰＣは、培地中で任意の単離ステップを介在させることなくさらに培養し、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞を含む細胞集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルク、または他の方法で得られたＨＰＣ、例えば、ヒトドナーから単離された一次ＨＰＣまたは胚性幹細胞由来など他の幹細胞源／型から分化したＨＰＣは、培地中で任意の単離ステップを介在させることなくさらに培養し、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞を含む細胞集団を得る。この方法によって得られる細胞集団としては、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞が含まれることを理解されたい。細胞集団には、例えば、リンパ球が含まれる。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクは、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、フィブロネクチンまたはそのバリアント、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えば、Ｊａｇ－１、Ｊａｇ－２、ＤＬＬ－１、ＤＬＬ－３、ＤＬＬ－４）、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を有するＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養させ、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクは、アスコルビン酸を含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養させ、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクは、ＳＣＦを含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養させ、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクは、ＩＬ－７を含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養させ、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクは、Ｆｌｔ３Ｌを含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養させ、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクは、ｐ３８阻害剤を含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養させ、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ細胞バルクは、ＳＤＦ－１を含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地で培養させ、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得る。
ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団を得るのに好適な時間までの培養期間。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞の集団を得るためにＨＰ細胞バルクを培養することは、約２～６週間、３～５週間または約３週間である。したがって、いくつかの実施形態では、細胞培養期間は、約２～６週間である。いくつかの実施形態では、細胞培養期間は、約３～５週間である。いくつかの実施形態では、細胞培養期間は、約３週間である。
いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約４％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約５％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。
ＣＤ４／ＣＤ８細胞からＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞への概説
ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞の集団を得るために、上記のように、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞の集団は、細胞培養培地でさらに培養することができる。いくつかの実施形態では、培養培地は、ＮＫ誘導培地である。いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地は、ＩＬ－７、ＩＬ－２及び抗ＣＤ３抗体のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、細胞の集団は、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞の集団は、単離ステップの介在なく、培養培地でさらに培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を豊富に含む細胞の集団を得る。このようなＣＤ５６＋細胞には、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団は、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２及び／またはＩＬ－７を含む培地で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団は、ＣＤ３活性化因子を含む培地で培養される。ＣＤ３活性化因子は、当技術分野で知られており、例えば、ＣＤ３及び／またはＣＤ２８表面リガンドに結合する抗体複合体を含む。ＣＤ３活性化因子としては、例えば、抗ＣＤ３抗体またはそれに結合した断片を使用することができる。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体が使用される場合、抗ＣＤ３抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ポリクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＧの任意の免疫グロブリンクラスに属していてもよい。様々な種類の抗ＣＤ３抗体を使用することができ、例えば、ＯＫＴ３クローンまたはＵＣＨＴ１クローンから産生された抗体を使用することができる。培地中の抗ＣＤ３抗体の濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞の集団は、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２を含む培地で培養される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞の集団は、ＩＬ－７を含む培地で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、約３％Ｏ２で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、約４％Ｏ２で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、約５％Ｏ２で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、約６％Ｏ２で培養される。
ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、ＮＫ誘導培地でさらに培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞の細胞を豊富に含むように、ＮＫ誘導培地で培養され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、ＣＤ５６＋細胞をさらに豊富に含むように、ＩＬ－７及び／またはＩＬ－１５を含むＮＫ誘導培地で培養される。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、ＩＬ－７を含むＮＫ誘導培地で培養される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋細胞を含む細胞集団は、ＩＬ－１５を含むＮＫ誘導培地で培養される。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、約３％、４％、５％、または６％Ｏ２などの低酸素条件で培養される。いくつかの実施形態では、産生されたＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞は、ＮＫ細胞である。産生されるＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞の割合は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％超である。したがって、いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約５０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約５５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約６０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約６５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約７０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約７５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約８０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約８５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約９０％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、少なくとも約９５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。いくつかの実施形態では、この方法は、約９５％を超えるＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞をもたらす。
いくつかの実施形態では、この培養法で産生された細胞の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または約３０％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の５％未満が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約５％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約１０％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約１５％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約２０％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約２５％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、産生された細胞の約３０％が、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋ＣＤ３－細胞を豊富に含む集団は、当技術分野で知られている方法によって単離される。このような方法としては、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）ベースの選別方法及び磁気ベースの選別方法（ＭＡＣＳ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む集団からのＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を得るための培養期間は、約４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７または１８日である。いくつかの実施形態では、培養期間は、約７日である。
いくつかの実施形態では、濃縮されたＣＤ５６＋細胞集団は、ＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３－細胞を含む。いくつかの実施形態では、濃縮されたＣＤ５６＋細胞は、ＣＤ３＋細胞を含む。
ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞への分化にとって好適である多能性細胞
いくつかの実施形態では、任意の多能性、多分化能、または患者由来のＨＰＣを、本明細書に記載の方法で使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、成体幹細胞である。様々な成体幹細胞が当技術分野で知られており、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、臍帯由来細胞、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞などが挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。したがって、本明細書に記載の方法に従って産生されるＮＫ細胞は、ドナーに直接由来する一次ＨＰＣなどの任意の多能性、多分化能、または患者由来のＨＰＣから作製することができる。
いくつかの実施形態では、多能性細胞は、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植によって得られたクローン化胚に由来する胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、生殖幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、ｉＰＳ細胞、及び培養線維芽細胞または骨髄幹細胞（ミューズ細胞）に由来する多能性細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、健康な個体の末梢血単核細胞に由来することができる。ｉＰＳ細胞を産生するための方法は、当技術分野で知られている。これらの細胞は、任意の体細胞に再プログラミング因子を導入することによって産生することができる。本明細書における再プログラミング因子の例としては、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘｌ ７、Ｋｉｆ ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｅｌ１、ベータカテニン、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌｌ、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３、及びＧｌｉｓｌなどの遺伝子、及びそれらの遺伝子産物が挙げられる。これらの再プログラミング因子は、個別に使用することも、２つ以上を組み合わせて使用することもできる。再プログラミング因子の組み合わせの例としては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６；７９５－７９７，Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２；５２５－５２８，Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６；２４６７－２４７４，Ｅｌｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６；１２６９－１２７５，Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，５６８－５７４，Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３；４７５－４７９，Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，１３２－１３５，Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１；１９７－２０３，Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７；４５９－４６１，Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ Ａ．１０６；８９１２－８９１７，Ｋｉｍ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１；６４９－６４３，Ｉｃｈｉｄａ Ｊ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５；４９１－５０３，Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．６；１６７－７４，Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３；１０９６－１００，Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８；７１３－７２０、及びＭａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４；２２５－９に記載のものが挙げられる。
ｉＰＳＣは、任意の好適な組織から得ることができる。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、末梢血単核細胞から得られる。
造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球、及び巨核球などの血液細胞に分化できる細胞である。造血前駆細胞または造血幹細胞は、例えば、ＣＤ３４及び／またはＣＤ４３表面抗原の存在に基づいて、同定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、細胞分化の任意の段階で、遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞は、所望のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または他の操作されたタンパク質を含むように遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多能性、多分化能、または単能性の段階で遺伝子改変されている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多能性段階で、遺伝子改変されている。例えば、細胞は、胚性幹細胞の段階またはｉＰＳＣ幹細胞の段階で遺伝子改変させ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞を産生するために使用される細胞は、多分化能段階で遺伝子改変されている。例えば、細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の段階で遺伝子改変させ得る。
培養条件－ｉＰＳＣからＨＰＣ細胞バルク
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣから造血前駆細胞を産生するための培地（すなわち、ＨＰＣ誘導培地）は、動物細胞の培養に使用される基礎培地にビタミンＣを添加することによって調製され得る。基礎培地の例としては、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、フィッシャー培地、及び神経基礎培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びこれらの培地の２つ以上の混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は、無血清である。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、ＳｔｅｍＰｒｏ商標－３４を含み得る。ＳｔｅｍＰｒｏ商標－３４は、培養中のヒト造血細胞の発育をサポートするために処方された無血清培地である。
必要に応じて、いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地はまた、アルブミン、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、セレンまたはセレン酸ナトリウム、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、α－モノチオグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、低分子量化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝液、無機塩、及びサイトカインなどの１つ以上の物質を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地としては、血清、インスリン、トランスフェリン、セレン、チオールグリセロールまたはα－モノチオグリセロール、Ｌ－グルタミン、及びアスコルビン酸を含むＩＭＤＭ培地を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これに限定されないが、ＢＭＰ４が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これに限定されないが、ＶＥＧＦが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これらに限定されないが、ｂＦＧＦ及びＦＧＦ２が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、幹細胞因子／ｋｉｔのシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これに限定されないが、ＳＣＦが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、Ｆｌｔ３リガンドシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これらに限定されないが、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、トロンボポエチンシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これに限定されないが、ＴＰＯが挙げられる。
ＴＧＦβ阻害剤は、ＴＧＦβファミリーのシグナル伝達を妨害する低分子阻害剤であり、例えば、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ ２：２０（２００３））、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）などが挙げられる。
ＳＢ４３１５４２は、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーＩ型アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、及びＡＬＫ７の強力かつ特異的な阻害剤である。
例えば、ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２である場合、培地中のその濃度は、好ましくは、０．５μＭ～１００μＭである。
ＨＰ細胞バルク集団を産生するためのＨＰＣ誘導培地は、ＢＭＰ４（骨形成タンパク質４）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＴＰＯ（トロンボポエチン）、及びＦｌｔ３Ｌ（Ｆｌｔ３リガンド）からなる群から選択されるサイトカイン（複数可）をさらに添加され得る。
一実施形態では、ＨＰＣ誘導培地は、ヒトインスリン（約１０μｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（約５．５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（約６．７ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ－グルタミン（約２ｍＭ）、α－モノチオグリセロール（約０．４ｍＭ）、及びＳＢ４３１５４２（約６μＭ）が添加されたＳｔｅｍＰｒｏ３４を含み得る。
いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培養期間中、４日ごと、３日ごと、２日ごと、または毎日添加することができる。培地へのビタミンＣの添加は、約５μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌに相当する量で行うことができる。いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培地中に約５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌで存在する。
本明細書では、「ビタミンＣ」とは、Ｌ－アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、「Ｌ－アスコルビン酸誘導体」とは、生体内で酵素反応によりビタミンＣとなる誘導体を意味する。Ｌ－アスコルビン酸の誘導体の例としては、ビタミンＣホスフェート（例えば、アスコルビン酸２－ホスフェート）、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンＣエステル、アスコルビルテトラヘキシルデカノエート、アスコルビルステアレート、及びアスコルビル２－ホスフェート６－パルミテートが挙げられる。好ましいのは、ビタミンＣホスフェートである。ビタミンＣホスフェート（例えば、アスコルビン酸２－ホスフェート）の例としては、Ｌ－アスコルビン酸ホスフェートの塩、例えば、Ｌ－アスコルビン酸ホスフェートＮａ及びＬ－アスコルビン酸ホスフェートＭｇなどが挙げられる。
いくつかの実施形態では、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＢＭＰ４である場合、造血前駆細胞を産生するためのＨＰＣ誘導培地中でのＢＭＰ４の濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌまたは５００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質が、ＶＥＧＦである場合、造血前駆細胞を産生するためのＨＰＣ誘導培地中でのＶＥＧＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、約５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌまたは５００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質が、ｂＦＧＦである場合、造血前駆細胞を産生するためのＨＰＣ誘導培地中でのｂＦＧＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、例えば、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌまたは５００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、幹細胞因子／ｋｉｔシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＳＣＲである場合、造血前駆細胞を産生するためのＨＰＣ誘導培地中でのＳＣＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＦｌｔ３Ｌである場合、造血前駆細胞を産生するためのＨＰＣ誘導培地中でのＦｌｔ３Ｌの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、トロンボポエチンシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＴＰＯである場合、造血前駆細胞を産生するためのＨＰＣ誘導培地中でのＴＰＯの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００、１２５ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１７５ｎｇ／ｍｌ、または２００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、付着培養または浮遊培養によって培養され得る。付着培養の場合、培養は、コーティング剤でコーティングされた培養容器内で実施してもよく、及び／または他の細胞と共培養してもよい。共培養用の他の細胞の例としては、Ｃ３Ｈ１０Ｔｌ／２（Ｔａｋａｙａｍａ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２８１７－２８３０，２０１０）及び異なる種に由来する間質細胞（Ｎｉｗａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｎｏｖ；２２１（２）：３６７－７７）が挙げられる。コーティング剤の例としては、マトリゲル（Ｎｉｖｅａ Ａ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．６（７）：ｅ２２２６１，２０１１）、ｉＭａｔｒｉｘ５１１（Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ２０１２；３：１２３６）、ゼラチン、コラーゲン、エラスチンなど、グリコサミノグリカン及びプロテオグリカン、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸など、細胞接着タンパク質、例えば、フィブロネクチンまたはその変形、ビトロネクチン、ラミニンなどが挙げられる。浮遊培養の方法の例としては、Ｃｈａｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２００３，１０２：９０６－１５，Ｖｉｊａｙａｒａｇａｖａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２００９，４：２４８－６２、及びＳａｅｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００９，２７：５９－６７に記載されている方法が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクはまた、多能性幹細胞の培養によって得られたネット様構造（これは、ＥＳ－ｓａｃまたはｉＰＳ－ｓａｃとも呼ばれる）から調製され得る。本明細書における「ネット様構造」は、多能性幹細胞に由来する三次元の嚢状構造（内部に空間を有する）である。この構造は、内皮細胞集団内で形成されており、内部に造血前駆細胞を含む。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクを産生するための培養の温度条件は、約３７℃～約４２℃である。いくつかの実施形態では、温度は、例えば、約３７℃～約４２℃、好ましくは約３７℃～約３９℃である。培養期間は、造血前駆細胞の数を監視することなど、表現型分析のために細胞培養物からサンプルを得ることによって、当業者によって適切に決定され得る。細胞サンプルの表現型分析に関連する様々な種類の方法が当技術分野で知られており、例えば、フローサイトメトリー及び免疫蛍光法が挙げられる。
ＨＰ細胞バルクを得るための培養期間は、変動し得、例えば、６日～１４日であり得る。培養期間の例としては、少なくとも６日、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、及び１４日以上が挙げられる。いくつかの実施形態では、この培養期間は、６日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、７日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、８日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、９日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１０日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１０日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１１日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１２日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１３日間である。いくつかの実施形態では、この培養期間は、１４日間である。いくつかの実施形態では、培養期間は、１４日を超える。培養は、低酸素条件下で実施することができる。低酸素条件の例としては、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％またはそれ以下が挙げられる。培地交換の頻度は、当業者によって決定することができる。いくつかの実施形態では、培地は、２日ごとに交換することができる。他のいくつかの実施形態では、培地は、３日ごとに交換できる。いくつかの実施形態では、培地は、毎日交換する。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクを産生するための培養は、上記の条件のうちの１つ以上を組み合わせることによって実施される。例えば、いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣからＨＰ細胞バルクを得る方法は、（ｉ）多能性幹細胞を低酸素条件下でビタミンＣを添加した基礎培地中においてＣ３Ｈ１０Ｔｌ／２上で培養することと；（ｉｉ）（１）の培養液にＶＥＧＦ、ＳＣＦ、及びＦｌｔ３Ｌをさらに添加することと、通常の酸素条件下で細胞を培養することと、を含む。ステップ（ｉ）が実施される期間は、少なくとも６日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは７日である。ステップ（ｉｉ）が実施される期間は、少なくとも６日以上、好ましくは７日以上、より好ましくは７日である。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク中で得られた造血前駆細胞は、さらなる使用前に単離され得る。いくつかの他の実施形態では、得られた造血前駆細胞は、他の細胞種も含む細胞集団（ＨＰ細胞バルク）として使用され得る。ＨＰ細胞バルク集団は、分離されていない細胞調製物である。いくつかの実施形態では、この方法は、単離ステップを含まない。
培養条件－ＨＰ細胞バルクからＣＤ４／ＣＤ８細胞
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞集団をもたらす。「ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞」（ＤＰ細胞）とは、ＣＤ４及びＣＤ８の両方を発現する細胞を意味する。ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、及びＣＤ４５陽性の細胞として同定できる。「ＣＤ４／ＣＤ８二重陰性細胞」（ＤＮ細胞）とは、ＣＤ４－及びＣＤ８－の両方を発現しない細胞を意味する。「ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞」とは、ＣＤ４－を発現しないが、ＣＤ８＋を発現する細胞を意味する。「ＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞」とは、ＣＤ４を発現するが、ＣＤ８を発現しない細胞を意味する。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞集団は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞に分化するように誘導することができる。
いくつかの実施形態では、とりわけ、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団は、ビタミンＣを添加した培地で、造血前駆細胞またはＨＰ細胞バルクを培養するステップを含む方法によって産生することができる。基礎培地に添加されるビタミンＣは、ＨＰ細胞バルクの上記の誘導におけるものと同じである。
いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルクからＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、及びＣＤ４＋／ＣＤ８－細胞を含む細胞集団を産生するために使用される培地は、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、動物細胞の培養に使用される基礎培地にビタミンＣを添加することによって調製され得る。基礎培地の例としては、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｇｉｂｃｏ））、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムのＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、フィッシャー培地、及び神経基礎培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びこれらの培地の２つ以上の混合物が挙げられる。培地は、血清を含めてもよく、無血清を含まなくてもよい。
必要に応じて、基礎培地はまた、アルブミン、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、セレンまたはセレン酸ナトリウム、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、低分子量化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝液、無機塩、及びサイトカインなどの物質のうちの１つ以上を含み得る。
他の細胞の中でも、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生するためのＣＤ４／ＣＤ８誘導培地は、アスコルビン酸、ＳＣＦ、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、フィブロネクチンまたはそのバリアント、Ｎｏｔｃｈリガンド、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１からなる群から選択されるサイトカイン（複数可）でさらに添加され得る。
いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培養期間中、４日ごと、３日ごと、２日ごと、または毎日添加することができる。培地へのビタミンＣの添加は、約５μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌに相当する量で行うことができる。いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、培地中に約５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、または５００μｇ／ｍｌで存在する。
いくつかの実施形態では、基礎培地は、幹細胞因子／ｋｉｔのシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これに限定されないが、ＳＣＦが挙げられる。
いくつかの実施形態では、基礎培地は、Ｆｌｔ３リガンドのシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これらに限定されないが、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、基礎培地は、トロンボポエチンシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす１つ以上の物質を含む。このような物質としては、これに限定されないが、ＴＰＯが挙げられる。
いくつかの実施形態では、基礎培地は、ｐ３８α及びｐ３８βの阻害剤である１つ以上のｐ３８阻害剤を含み、これは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ－２及び熱ショックタンパク質２７の下流の活性化を抑制する。本発明で使用されるｐ３８の化学的阻害剤の例としては、ＳＢ２０３５８０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－メチルスルホニルフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、及びその誘導体、ＳＢ２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）及びその誘導体、ＳＢ２３９０６３（トランス－４－［４－（４－フルオロフェニル）－５－（２－メトキシ－４－ピリミジニル）－１Ｈ－イミダゾール－１－イル］シクロヘキサノール）及びその誘導体、ＳＢ２２００２５及びその誘導体、ＰＤ１６９３１６、ＲＰＲ２００７６５Ａ、ＡＭＧ－５４８、ＢＩＲＢ－７９６、ＳＣｌＯ－４６９、ＳＣＩＯ－３２３、ＶＸ－７０２及びＦＲ１６７６５３が挙げられる。これらの化合物は市販されており、例えば、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０２１９０、ＳＣ２３９０６３、ＳＢ２２００２５及びＰＤ１６９３１６は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能であり、ＳＣｌＯ－４６９及びＳＣＩＯ－３２３は、Ｓｃｉｏｓなどから入手可能である。ｐ３８阻害剤の他の例としては、ｐ３８のＤＮＡ結合領域にある１８０位のスレオニンのアラニンへの点突然変異によって得られるｐ３８Ｔ１８０Ａ、ヒト及びマウスにおけるｐ３８の１８２位のチロシンのフェニルアラニンへの点突然変異によって得られるｐ３８Ｙ１８２Ｆなどを含むｐ３８のドミナント陰性突然変異体を含む。ｐ３８阻害剤は、例えば、約０．５μＭ～約５０μＭの培地に含まれる。
いくつかの実施形態では、基礎培地は、ＳＤＦ－１を含む。
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１は、ＳＤＦ－１αまたはその成熟形態のみでなく、ＳＤＦ－１β、ＳＤＦ－１γ、ＳＤＦ－１δ、ＳＤＦ－１ε、ＳＤＦ－１φなどのアイソフォームもしくはそれらの成熟形態でもあり得るか、またはこれらの任意の比率での混合物であり得る。好ましくは、ＳＤＦ－１αが使用される。ＳＤＦ－１は、ＣＸＣＬ－１２またはＰＢＳＦと呼ばれることもある。
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１のアミノ酸配列中の１つまたはいくつかのアミノ酸は、ケモカインとしての活性を有する限り、置換され、欠失され、及び／または付加され得る。同様に糖鎖は、置換され、欠失され、及び／または付加され得る。少なくとも４つのシステイン残基（ヒトＳＤＦ－１α中のＣｙｓ３０、Ｃｙｓ３２、Ｃｙｓ５５及びＣｙｓ７１）が維持され、天然物質のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を呈する限り、アミノ酸突然変異は許容される。ＳＤＦ－１は、哺乳動物、例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどのヒトまたは非ヒト哺乳動物から得ることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９５４６３７として登録されているタンパク質は、ヒトＳＤＦ－１αとして使用でき、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００６００として登録されているタンパク質は、ＳＤＦ－１βとして使用できる。いくつかの実施形態では、Ｆｌｔ３リガンドシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＦｌｔ３Ｌである場合、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生するための培地中のＦｌｔ３Ｌの濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、幹細胞因子／ｋｉｔシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＳＣＦである場合、ＳＣＦは、上記と同じ条件下で、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団の産生に使用される。
いくつかの実施形態では、幹細胞因子／ｋｉｔシグナル伝達経路のシグナル伝達を引き起こす物質がＴＰＯである場合、ＴＰＯは、上記と同じ条件下で、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団の産生に使用される。
本発明で使用されるフィブロネクチンまたはそのバリアントは、それがＣＤ３陽性細胞に結合することができる分子である限り、特に限定されない。フィブロネクチンのバリアントは、ＣＤ３陽性細胞の表面で、ＶＬＡ－５及びＶＬＡ－４に結合できる分子である限り、特に限定されるものではなく、その例としては、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎが挙げられる。フィブロネクチン及びそのバリアントは、培地中において任意の形態で存在し得る。例えば、これらは、培養中に培地に含まれ得るか、または培養容器に固定化され得、好ましくは培養容器に固定化される。
フィブロネクチンまたはそのバリアントが培地中に含まれる場合、フィブロネクチンまたはそのバリアントの濃度の下限は、１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌ以上であり得、上限は、１００００μｇ／ｍｌ以下、好ましくは、１０００μｇ／ｍｌ以下であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生するために使用される培地中でのＩＬ－７の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。
ＳＤＦ－１は、市販され得る、自然界から精製され得る、またはペプチド合成もしくは遺伝子工学技術によって産生され得る。ＳＤＦ－１は、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌの範囲で培地中に含まれる。さらに、ＳＤＦ－１の代わりに、ＳＤＦ－１のような活性を有するＳＤＦ－１代替物を使用することもできる。そのようなＳＤＦ－１代替物の例としては、ＣＸＣＲ４アゴニストが挙げられ、ＣＸＣＲ４アゴニスト活性などを有する低分子量化合物を、ＳＤＦ－１の代わりに培地に添加してもよい。
いくつかの実施形態では、ＳＤＦ－１がＳＤＦ１αである場合、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生するための培地中のＳＤＦ－１αの濃度は、約１ｎＭ～１００ｎＭ、例えば、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、または１００ｎＭである。
いくつかの実施形態では、ｐ３８阻害剤がＳＢ２０３５８０である場合、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞の細胞集団を産生するための培地中のＳＢ２０３５８０の濃度は、約０．５μＭ～１００μＭ、例えば、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、ｏｒ５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、または１００μＭである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生するための基礎培地は、約１５％ＦＢＳ、約４ｍＭのＬ－グルタミン、約１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、約５５μＭの２－メルカプトエタノール、約５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸２－ホスフェート、約１０μｇ／ｍｌのヒトインスリン、約５．５μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、約６．７ｎｇ／ｍｌのセレン酸ナトリウム、約５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、約５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌ、約１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約１５μＭのＳＢ２０３５８０、約３０ｎＭのＳＤＦ－１αを添加したαＭＥＭ培地を含む。
ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団の生産において、造血前駆細胞は、付着培養または浮遊培養によって培養することができる。いくつかの実施形態では、培養容器／培養ディッシュは、ＤＬＬ１もしくはＤＬＬ４、またはＤＬＬ４もしくはＤＬＬ１の融合タンパク質、及びＦｃなどでコーティングされている。ＤＬＬ１またはＤＬＬ４は、組換えヒト（ｒｈ）－ＤＬＬ１またはｒｈ－ＤＬＬ４であり得る。いくつかの実施形態では、培養容器／培養ディッシュは、ｒｈ－ＤＬＬ４／Ｆｃ キメラ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）でコーティングされている。付着培養の場合、コーティングされた培養容器を使用してもよく、及び／または造血前駆細胞は、フィーダー細胞などと共培養してもよい。共培養用のフィーダー細胞の例としては、骨髄間質細胞株、ＯＰ９細胞（Ｒｉｋｅｎ ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能）が挙げられる。ＯＰ９細胞は、好ましくは、Ｄｌｌｌを絶えず発現するＯＰ－ＤＬ１細胞（Ｈｏｌｍｅｓ Ｒ Ｉ ａｎｄ Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ ＪＣ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ．２００９（２））であり得る。いくつかの実施形態では、ＯＰ９細胞が、フィーダー細胞、別々に調製されたＤｌｌｌまたはＤｌｌｌとＦｃなどとの融合タンパク質として使用される場合、培地に添加されて、共培養を実施し得る。いくつかの実施形態では、Ｄｌｌｌは、ヒトの場合、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＃００５６１８、マウスの場合、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＃００７８６５のヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質及びこれらのタンパク質に対して高い配列同一性（例えば、９０％以上の配列同一性を有する）を有し、同等の機能を有する天然に存在する突然変異体を含むことができる。フィーダー細胞が、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団を産生するために使用される場合、フィーダー細胞は、培養中に適切に交換できる。フィーダー細胞の交換は、培養されている対象細胞を、予備的にプレーティングされたフィーダー細胞に移すことによって実施することができる。交換は、５日ごと、４日ごと、３日ごと、または２日ごとに実施し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞の細胞集団を産生するためのＨＰ細胞バルクの培養のための培養温度条件は、以下を含む。ＣＤ４／ＣＤ８ 二重陽性細胞は、約３７℃～約４２℃、及び約３７℃～約３９℃である。いくつかの実施形態では、培養は、低酸素条件下で実施され得る。低酸素状態の例としては、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、及びこれらより低い酸素濃度が挙げられる。培養期間は、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞などを含む異なる種の細胞の数を監視することによって、当業者によって適切に決定され得る。培養期間の例としては、１０日以上、１２日以上、１４日以上、１６日以上、１８日以上、２０日以上、２１日以上、２３日以上、２５日以上、２８日以上、３０日以上、３５日以上、または４２日以上が挙げられる。他のいくつかの実施形態では、培養から得られたＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞は、他の細胞種も含む細胞集団（ＤＰ細胞バルク）である。
ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団から特定の細胞種（例えば、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞）の集団が単離される場合、単離される細胞種に応じて、これらに限定されないが、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、及びＣＤ４５など、任意の１つの指標を使用して単離を実施してもよい。単離方法は、当業者に周知の方法、例えば、細胞を特定の抗体（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、またはＣＤ４５抗体）で標識し、次いで、フローサイトメータを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化するアフィニティーカラムなどを用いて細胞を精製する方法であり得る。
ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団からＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を誘導するステップ
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞である。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ビタミンＣを添加した培地中で、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む細胞集団またはＤＰ細胞バルクを培養するステップを含む方法によって産生される。いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地を使用して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を産生する。
いくつかの実施形態では、培地は、動物細胞の培養に使用される基礎培地にビタミンＣを添加することによって調製する。基礎培地の例としては、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムのＦ１２培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、フィッシャー培地、及び神経基礎培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びこれらの培地の２つ以上の混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地は、血清を含む。いくつかの実施形態では、培地は、無血清である。必要に応じて、基礎培地はまた、アルブミン、ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、セレンまたはセレン酸ナトリウム、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、成長因子、低分子量化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝液、無機塩、及びサイトカインなどの物質のうちの１つ以上を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞の産生に使用される培地は、抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）及びサイトカインをさらに含む。好適なサイトカインの例としては、ＩＬ－２及びＩＬ－７が挙げられる。
ＣＤ３抗体は、ＣＤ３を特異的に認識する限り制限されない。いくつかの実施形態では、ＮＫ誘導培地中のＣＤ３抗体の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｒｉｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、または１０００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ビタミンＣは、上記と同じ条件下でＣＤ５６陽性Ｋ細胞を産生するために使用される。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞を産生するためのＮＫ誘導培地におけるＩＬ－２の濃度は、約１Ｕ／ｍｌ～１０００Ｕ／ｍｌ、例えば、約１Ｕ／ｍｌ、５Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌ、２０Ｕ／ｍｌ、３０Ｕ／ｍｌ、４０Ｕ／ｍｌ、５０Ｕ／ｍｌ、６０Ｕ／ｍｌ、７０Ｕ／ｍｌ、８０Ｕ／ｍｌ、９０Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ、５００Ｕ／ｍｌ、または１０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞を産生するためのＮＫ誘導培地におけるＩＬ－２の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞を産生するためのＮＫ誘導培地におけるＩＬ－７の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、または１００ｎｇ／ｍｌである。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞を産生するためのＣＤ４／ＣＤ８二重陽性細胞を含む集団を培養するための培養温度条件は、約３７℃～約４２℃、または約３７℃～約３９℃である。培養期間は、当業者がＣＤ５６陽性ＮＫ細胞の数などを監視することにより、適切に決定することができる。ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞が得ることができる限り、培養日数は制限しない。培養期間の例としては、少なくとも１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上が挙げられる。
いくつかの実施形態では、得られたＣＤ５６＋ＮＫ細胞は、さらに使用する前に単離させてもよい。いくつかの他の実施形態では、得られたＣＤ５６陽性ＮＫ細胞は、Ｔ細胞（ＮＫ細胞バルク）など、他の細胞種も含む細胞集団として使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞バルクは、５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９０％以上のＮＫ細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞バルクは、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または、５０％のＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞バルクは、約７５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３－ＮＫ細胞及び約２５％のＣＤ５６＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞バルクはまた、Ｂ細胞及び単球を含み得る。
ＣＤ５６＋ＮＫ細胞が単離される場合、単離方法は、当技術分野で周知の方法、例えば、細胞を抗ＣＤ５６抗体及び抗ＣＤ３抗体で標識し、次に、フローサイトメータ（蛍光活性化セルソーティング）を使用して単離する方法、または所望の抗原を固定化するアフィニティーカラムなどを使用して細胞を精製する方法であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３＋である。いくつかの実施形態では、ＣＤ５６陽性ＮＫ細胞は、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－である。
ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、１つ以上の導入遺伝子を含むように操作される。例えば、ＮＫ細胞は、腫瘍指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子操作することができ、それによって抗腫瘍エフェクター細胞を産生する。一例では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作することができる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞に対する細胞前駆体は、ＣＡＲを発現するように操作される。例えば、いくつかの実施形態では、ｉＰＳ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、ＨＰ細胞バルク中の細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。さらに、いくつかの実施形態では、これらのトランスジェニック受容体は、タンパク質由来ではない腫瘍関連抗原に配向させ得る。特定の実施形態では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、少なくとも１つのＣＡＲを含むように改変される。いくつかの実施形態では、単一のＣＡＲは、２つ以上の抗原を標的とする。
いくつかの実施形態では、ｉＮＫ細胞は、キメラであり、非天然であり、操作された受容体を含む。いくつかの実施形態では、操作されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の成分を有し、いくつかの実施形態では、１つ以上の成分は、リンパ球の１つ以上の腫瘍抗原含有がん細胞への標的化または結合を促進する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、一般に、少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む少なくとも１つの膜貫通ポリペプチド及び少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む１つの膜貫通ポリペプチドを含み、これにより、ポリペプチドが互いに集合して、キメラ抗原受容体を形成する。
本明細書で使用される「細胞外リガンド結合ドメイン」という用語は、リガンドに結合することができるオリゴまたはポリペプチドとして定義される。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用することができるであろう。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。
特に、細胞外リガンド結合ドメインは、標的の抗原に対する抗体に由来する抗原結合ドメインを含むことができる。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変させ得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ４４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ８９、ＣＤ１２３、ＣＳ－１、ＲＯＲ１、メソセリン、ｃ－Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＧＤ－２、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ Ａ３ ＴＣＲ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥＲＢＢ２／ｎｅｕ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡ、ＢＣＭＡのうちの１つ以上から選択される腫瘍抗原を標的とする細胞外リガンド結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ＣＤ１９を含む。
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、柔軟なリンカーによって結合された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖（ＶＬ）可変断片及び重鎖（ＶＨ）可変断片を含む一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のストーク領域をさらに含む。本明細書で使用される「ストーク領域」という用語は、一般に、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴまたはポリペプチドを意味する。特に、ストーク領域は、細胞外リガンド結合ドメインにより多くの柔軟性及びアクセス可能性を付与するために使用される。ストーク領域は、最大３００アミノ酸、１０～１００アミノ酸、及び／または２５～５０アミノ酸を含み得る。ストーク領域は、ＣＤ８、ＣＤ４またはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部など、天然に存在する分子の全部または一部に由来し得る。あるいは、ストーク領域は、天然に存在するストーク配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のストーク配列であり得る。好ましい実施形態では、ストーク領域は、ヒトＣＤ８アルファ鎖の一部である。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインの標的への結合後の細胞内シグナル伝達に寄与し、ｉＰＳ ＮＫ細胞の活性化及び免疫応答をもたらすシグナル伝達ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクターシグナル機能シグナルを伝達し、細胞に特殊な機能を実施するように指示するタンパク質の部分を指す。いくつかの実施形態では、ｉＰＳ ＮＫ細胞は、シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを有する。
いくつかの実施形態では、ｉＰＳ ＮＫ細胞は、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５複合体を発現するように遺伝子改変されている。
いくつかの実施形態では、膜貫通ポリペプチドは、免疫細胞の表面に、例えば、ｉＰＳ ＮＫ細胞上に発現し、予め定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を指示するために合わせて相互作用する能力を含む。細胞外リガンド結合ドメイン及び／またはシグナル伝達ドメインを含むＣＡＲの異なる膜貫通ポリペプチドは、合わせて相互作用して、標的リガンドとの結合後にシグナル伝達に関与し、免疫応答を誘導する。膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲを発現するためのＮＫ細胞の遺伝子改変は、以下のステップを含み得る：（１）特定のＣＡＲに対応する遺伝子を合成する；（２）ＣＡＲに対応する遺伝子を含むベクターを調製する；（３）ＣＡＲ遺伝子を含むベクターでＣＤ５６＋ＮＫ細胞を形質導入する。
ＣＡＲをコードする発現ベクターは、１つ以上のＤＮＡ分子または構築物として導入することができ、構築物（複数可）を含む宿主細胞の選択を可能にするであろう少なくとも１つのマーカーが存在し得る。
構築物は、遺伝子及び調節領域を適宜、単離し、ライゲートし、適切なクローニング宿主にクローン化し、制限もしくは配列決定、または他の簡便な手段によって分析し得る従来の方法で調製することができる。特に、ＰＣＲを使用して、機能ユニットの全部または一部を含む個々の断片を単離することができ、必要に応じて、「プライマー修復」、ライゲーション、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発などを使用して、１つ以上の突然変異を導入することができる。完成し、適切な配列を有することが実証された構築物（複数可）は、その後、任意の簡便な手段によってＣＴＬに導入することができる。構築物は、感染または細胞への形質導入のために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）または他のもの（レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターなど）のような非複製欠陥ウイルスゲノムに組み込み、パッケージ化され得る。構築物は、所望に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、融合、エレクトロポレーション、バイオリスティック、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入され得る。宿主細胞は、構築物（複数可）の導入前に培養物中で成長及び拡大され得、その後、構築物（複数可）の導入及び構築物（複数可）の組み込みのための適切な処理を行う。次に、細胞は、構築物中に存在するマーカーによって拡大され、スクリーニングされる。上手く使用できる様々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが含まれる。
場合によっては、構築物が特定の遺伝子座に組み込まれることが望ましい、相同組換えの標的部位を有し得る。例えば、これは、内因性遺伝子をノックアウトし、それを相同組換えについて当技術分野で知られている物質及び方法を使用して、構築物によってコードされる遺伝子に（同じ遺伝子座または他の場所で）置き換えることができる。相同組換えの場合、ＯＭＥＧＡまたはＯ－ベクターのいずれかを使用し得る。
構築物は、少なくともＣＡＲ及び任意により別の遺伝子をコードする単一のＤＮＡ分子、または１つ以上の遺伝子を有する異なるＤＮＡ分子として導入することができる。他の遺伝子としては、例えば、治療用分子または自殺遺伝子をコードする遺伝子が挙げられる。構築物は、それぞれ、同じまたは異なるマーカーで、同時にまたは連続して導入することができる。
構築物ＤＮＡのストックを調製するために、及びトランスフェクションを実施するために使用され得る細菌または酵母の複製起点、選択可能及び／または増幅可能なマーカー、プロモーター／エンハンサーエレメントなど、原核生物または真核生物での発現のための有用な要素を含むベクターは、当技術分野で周知であり、多くは市販されている。
使用方法
本発明による細胞は、それを必要とする患者において、がん、ウイルス感染または自己免疫障害を治療するために使用することができる。別の実施形態では、本発明による単離された細胞は、それを必要とする患者における、がん、自己免疫障害のウイルス感染の治療のための医薬品の製造において使用され得る。
本発明は、それを必要とする患者を治療するための方法に依存し、本方法は、（ａ）本発明によるキメラ抗原受容体細胞を提供するステップ、及び（ｂ）患者に細胞を投与するステップのうちの少なくとも１つを含む。
この治療は、改善、治癒、または予防的であり得る。それは、自己免疫療法の一部または同種免疫療法治療の一部のいずれかであり得る。自己とは、患者の治療に使用される細胞、細胞株、または細胞集団が、患者またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合ドナーに由来することを意味する。同種異系とは、患者の治療に使用される細胞または細胞集団が、患者に由来するのではなく、ドナーに由来することを意味する。
いくつかの実施形態では、記載された細胞は同種異系である。いくつかの実施形態では、記載された細胞は自己由来である。
治療は、がん、ウイルス感染、自己免疫障害、または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）と診断された患者を治療するために使用できる。治療され得るがんとしては、血管新生されていない、または実質的に血管新生されていない腫瘍、ならびに血管新生された腫瘍が挙げられる。がんは、非固形腫瘍（例えば、白血病及びリンパ腫などの血液腫瘍）を含めてもよく、または固形腫瘍を含めてもよい。本発明のＣＡＲで治療されるがんの種類としては、これらに限定されないが、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、ならびに特定の白血病またはリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、ならびに肉腫、癌腫、及び黒色腫などの悪性腫瘍が挙げられる。成人腫瘍／がん及び小児腫瘍／がんも含まれる。
いくつかの実施形態では、治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法及び放射線療法の群から選択される、がんに対する１つ以上の治療法と組み合わせる。
いくつかの実施形態では、治療は、免疫抑制治療を受けている患者に投与することができる。
さらなる実施形態では、細胞組成物は、１つ以上の追加の治療法と組み合わせて患者に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどの化学療法剤、外部ビーム放射線治療（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨなどのいずれかを使用するＴ細胞切除療法と併せて（例えば、前に、同時にまたは後に）、患者に投与される。別の実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する剤、例えばリツキサンなど、Ｂ細胞切除療法後に投与される。例えば、一実施形態では、対象は、高用量化学療法及びその後の末梢血幹細胞移植による標準治療を受けることができる。特定の実施形態では、移植後、対象は、本発明の拡大された免疫細胞の注入を受ける。追加の実施形態では、拡大させた細胞は、外科手術の前または後に投与される。本明細書に記載の方法のいずれか１つによって得られる改変細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対して、それを必要とする患者を治療するための本発明の特定の態様において使用することができる。したがって、本発明の範囲は、宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してそれを必要とする患者を治療する方法であり、本方法は、不活化ＴＣＲアルファ遺伝子及び／またはＴＣＲベータ遺伝子を含む有効量の改変細胞を患者に投与することによって患者を治療することを含む。
細胞の投与
いくつかの実施形態では、細胞は、多種多様な方法で、宿主生物、例えば、哺乳動物に導入され得る。細胞は、特定の実施形態では、腫瘍の部位に導入され得るが、代替の実施形態では、細胞はがんに進行するか、またはがんに進行するように改変される。使用される細胞の数は、複数の状況、導入の目的、細胞の寿命、使用されるプロトコル、例えば、投与回数、細胞が増殖する能力、組換え構築物などの安定性に依存する。細胞は、分散液として適用してもよく、一般に、目的の部位またはその近くに注入される。細胞は、生理学的に許容される培地中にあり得る。一例では、本発明のＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または高親和性ＣＤ１６など、任意の他の操作されたタンパク質もしくはポリペプチドドメインを発現し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫認識を阻害するために内包化され、腫瘍の部位に配置される。
細胞は、必要に応じて投与することができる。所望の応答、投与方法、細胞の寿命、存在する細胞の数に応じて、様々なプロトコルを使用することができる。投与回数は、少なくとも部分的に上記の要因に依存する。
本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）など、任意の簡便な方法で実施され得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、皮下、皮内、腫瘍内、結節内、髄内、筋肉内、静脈内またはリンパ内注射による、または腹腔内での投与が可能である。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは静脈内注射によって投与される。
核酸ベースの発現系
いくつかの実施形態では、本発明のＮＫ細胞またはｉＰＳ ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または高親和性ＣＤ１６またはＣＤ１９などの任意の他の操作されたタンパク質またはポリペプチドドメインを発現するように操作される。これらのポリペプチドを含む発現ベクターを生成するための組換え技術は、当技術分野で周知であり、以下に一般的に記載されている。
ベクター
「ベクター」という用語は、複製することができる細胞に導入するために核酸配列を挿入することができる担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は「外因性」であり得、これは、ベクターが導入されている細胞にとって外来性であるか、または配列が細胞内の配列と相同であるが、通常、配列が発見されない宿主細胞の核酸内の任意の位置にあることを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、及びウイルス（例えば、バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、ならびに人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を挙げることができる。当技術分野の技術のうちの１つは、標準的な組換え技術を介してベクターを構築するために十分に装備されている（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４を参照、これらは、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。
「発現ベクター」という用語は、転写可能なＲＮＡをコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を指す。場合によっては、ＲＮＡ分子は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生においては、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含むことができ、これは、特定の宿主細胞における操作可能に連結されたコード配列の転写及びおそらく翻訳に必要な核酸配列を指す。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能にも役立つ核酸配列を含み得、以下に記載する。
プロモーター及びエンハンサー
「プロモーター」は、その場所で転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。この配列は、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合して、核酸配列の特定の転写を開始し得る遺伝子エレメントを含み得る。「操作可能に位置付られた」、「操作可能に連結された」、「制御下にある」、及び「転写制御下にある」という句は、プロモーターが正しい機能的場所、及び／または転写開始及び／またはその配列の発現を制御するために、核酸配列に関連する配向にあることを意味する。
プロモーターは一般に、ＲＮＡ合成の開始部位を位置付けるように機能する配列を含む。この最もよく知られている例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを含まない一部のプロモーター、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターなどでは、開始部位に重なる個別のエレメン自体が、開始場所の固定に役立つ。追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０ １１０ｂｐ上流の領域に位置するが、複数のプロモーターが、開始部位の下流にも機能エレメントを含むことが示されている。プロモーターの「制御下にある」コード配列をもたらすために、選択されたプロモーターの「下流」（すなわち、３’）の転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端を位置付ける。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードされたＲＮＡの発現を促す。
プロモーターエレメント間の間隔は、多くの場合、順応性があるため、エレメントが互いに反転する、または移動したときにプロモーター機能が保持されるようになる。ｔｋプロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーターエレメント間の間隔を長くして、５０ｂｐ離すことができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントが協調してまたは独立して機能し、転写を活性化できると考えられる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す「エンハンサー」と組み合わせて使用されてもされなくてもよい。
プロモーターは、コードセグメント及び／またはエクソンの上流に位置する５プライム’非コード配列を単離することによって得ることができるので、核酸配列に自然に関連するものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列に自然に関連するものであり得る。あるいは、特定の利点は、組換えまたは異種プロモーターの制御下にコード核酸セグメントを位置付けることによって得られる。これは、通常、その自然環境では核酸配列と関連しないプロモーターを指す。組換えまたは異種エンハンサーはまた、その自然環境において、核酸配列に通常は関連しないエンハンサーを指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー、及び他のウイルス、または原核生物もしくは真核生物細胞から単離されたプロモーターもしくはエンハンサー、及び「天然に存在しない」、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントを含むプロモーターもしくはエンハンサー、及び／または発現を変える突然変異が含まれ得る。例えば、組換えＤＮＡ構築物で最も一般的に使用されるプロモーターとして、ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース、及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成により産生することに加えて、配列は、本明細書に開示の組成物に関連する組換えクローニング及び／またはＰＣＲ（商標）などの核酸増幅技術（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，２０２号及び第５，９２８，９０６号を参照のこと）を用いて、産生され得る。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核細胞小器官内の配列の転写及び／または発現を指示する制御配列も同様に使用できることが企図されている。
当然のことながら、発現のために選択された細胞小器官、細胞種、組織、器官、または生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／またはエンハンサーを使用することが重要であろう。分子生物学の当業者であれば、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞種の組み合わせの使用を知っている（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、１９８９を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的、組織特異的、誘導性であり、及び／または組換えタンパク質及び／またはペプチドの大規模生産において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示するために、適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは、異種または内因性であり得る。
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを使用して、発現を駆動することもできる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが送達複合体の一部として、または追加の遺伝子発現構築物として提供される場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写をサポートすることができる。
組織特異的プロモーターまたはエレメントの同一性、ならびにそれらの活性の特徴を明らかにするためのアッセイは、当業者に周知である。
コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要になり得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含められる。ＡＴＧ開始コドンなどの外因性翻訳制御シグナルを提供する必要があり得る。当業者であれば、これを容易に決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。
本発明の特定の実施形態では、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多遺伝子またはポリシストロン性のメッセージを創出するために使用され、これらは、本発明において使用され得る。
ベクターは、複数の制限酵素部位を含む核酸領域であるマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、これらのいずれも、ベクターを消化するための標準的組換え技術と併用して使用することができる。「制限酵素消化」とは、核酸分子内の特定の位置でのみ機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは、市販されている。このような酵素の使用は、当業者によって広く理解されている。多くの場合、ベクターは、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を使用して、線形化または断片化され、外因性配列をベクターにライゲートさせ得る。「ライゲーション」とは、２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指し、これは、互いに隣接している場合と隣接していない場合とがある。制限酵素及びライゲーション反応を伴う技術は、組換え技術の当業者によく知られている。
スプライシング部位、終結シグナル、複製起点、及び選択可能なマーカーも使用することができる。
プラスミドベクター
特定の実施形態では、プラスミドベクターは、宿主細胞を形質転換するための使用が企図される。一般に、宿主細胞と適合性のある種由来のレプリコン及び制御配列を含有するプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。このベクターは、通常、複製部位、及び形質転換細胞において表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。非限定的な例では、Ｅ．ｃｏｌｉは、多くの場合、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２には、アンピシリン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子が含まれているため、形質転換細胞を容易に同定する手段をもたらす。ｐＢＲプラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージもまた、例えば、微生物がそれ自体のタンパク質の発現のために使用することができるプロモーターを含むか、または含むように改変される必要がある。
加えて、宿主微生物と適合性のあるレプリコン及び制御配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用され得る。例えば、ファージラムダＧＥＭ（商標）－１１は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２などの宿主細胞を形質転換するために使用することができる組換えファージベクターを作製する際に利用され得る。
さらに有用なプラスミドベクターとしては、その後の精製及び分離または切断のために、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合タンパク質の生成に使用するためのｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５）及びｐＧＥＸベクターが挙げられる。他の適切な融合タンパク質は、ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどを有するものである。
発現ベクターを含む細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、複数の好適な培地のいずれか、例えば、ＬＢで成長させる。特定のベクターにおける組換えタンパク質の発現は、当業者によって理解されるように、宿主細胞を特定のプロモーターに特異的な剤と接触させることによって、例えば、培地にＩＰＴＧを加えることによって、またはインキュベーションを高温に切り替えることによって誘導され得る。細菌をさらに一定期間（通常は２～２４時間）培養後、細胞を遠心分離によって収集し、洗浄して、残留培地を除去する。
ウイルスベクター
特定のウイルスが受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に感染するかまたは細胞に侵入し、宿主細胞のゲノムに組み込まれて、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現する能力により、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移すための魅力的な候補となっている。本発明の成分は、１つ以上のＣＡＲ、ＴＣＲ、または本発明の高親和性ＣＤ１６などの他の任意の操作されたタンパク質またはポリペプチドドメインをコードするウイルスベクターであり得る。本発明の核酸を送達するために使用され得るウイルスベクターの非限定的な例を以下に記載する。
アデノウイルスベクター
核酸を送達するための特定の方法は、アデノウイルス発現ベクターを使用することを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに組み込むには、能力が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる高効率の遺伝子導入によって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングをサポートする、及び（ｂ）クローン化された組織または細胞特異的構築物を最終的に発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むものを意味する。遺伝子構成またはアデノウイルス、３６ｋｂ、直鎖、二本鎖ＤＮＡウイルスに関する知識により、大きな片のアデノウイルスＤＮＡを最大７ｋｂの外来配列に置換できる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。
ＡＡＶベクター
核酸は、アデノウイルス支援トランスフェクションを用いて、細胞に導入させ得る。アデノウイルス連結系を使用した細胞系では、トランスフェクション効率の向上が報告されている（Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ａｎｄ Ｖｏｓ，１９９４；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｃｕｒｉｅｌ，１９９４）。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、高い組み込み頻度を有し、非分裂細胞に感染し得るため、本発明の細胞内で使用するための魅力的なベクター系であり、したがって、例えば、組織培養（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用である。ＡＡＶは、感染性について広い宿主範囲を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの生成及び使用に関する詳細は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。
レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を移し、広範囲の種及び細胞種に感染させ、特殊な細胞株にパッケージングするその能力により、送達ベクターとして有用である（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
レトロウイルスベクターを構築するために、特定のウイルス配列の代わりに、核酸（例えば、所望の配列をコードするもの）をウイルスゲノムに挿入して、複製に欠陥のあるウイルスを産生させる。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と共に、ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが特別な細胞株に導入されたときに（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列により、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物は、ウイルス粒子にパッケージングさせ得、次いで、培養培地に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ ａｎｄ Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３）。次に、組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意により濃縮し、遺伝子導入のために使用される。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞種に感染し得る。しかし、組み込み及び安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Ｐａｓｋｉｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９７５）。
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を含む他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは、当技術分野において周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、及びサル免疫不全ウイルス：ＳＩＶなどが挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成され、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆが欠失し、これにより、ベクターが生物学的に安全になる。
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方での遺伝子導入及び核酸配列の発現に使用可能である。例えば、非分裂細胞に感染することができる組換えレンチウイルスでは、好適な宿主細胞が、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、ならびにｒｅｖ及びｔａｔを担持する２つ以上のベクターでトランスフェクトされることが、５，９９４，１３６号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。特定の細胞種の受容体を標的とするために、エンベロープタンパク質を抗体または特定のリガンドと連結させることによって、組換えウイルスを標的にすることができる。特定の標的細胞上の受容体のリガンドをコードする別の遺伝子と共に、目的の配列（調節領域を含む）をウイルスベクターに挿入することにより、例えば、ここでは、ベクターは、標的特異的となる。
組み合わせ療法
本発明の特定の実施形態では、臨床的態様のための本発明の方法は、抗がん剤など、過剰増殖性疾患の治療において有効な他の剤と組み合わされる。「抗がん剤」剤は、例えば、がん細胞を死滅させること、がん細胞にアポトーシスを誘導すること、がん細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率または数を減少させること、腫瘍サイズを減少させること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍またはがん細胞への血液供給を減少させること、がん細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を予防することもしくは阻害すること、またはがんを有する対象の寿命を延長させることにより、対象において、がんに悪影響を与え得る。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させるまたは細胞の増殖を阻害するのに有効な組み合わせ量で提供されるであろう。このプロセスは、がん細胞を発現構築物及び剤（複数可）または複数の因子と同時に接触させることを含み得る。これは、細胞を単一の組成物または両方の剤を含む薬理学的製剤と接触させることによって、または細胞を２つの別個の組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成することができ、ここで、一方の組成物は、発現構築物を含み、他方の組成物は、第２の剤（複数可）を含む。
化学療法剤及び放射線療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学において主要な問題である。現在のがん研究の１つの目標は、１つの治療法を他の治療法と組み合わせることにより、化学療法及び放射線療法の有効性を改善する方法を見つけることである。本発明の文脈において、細胞療法は、化学療法、放射線療法、または免疫療法の介入の併用、ならびにアポトーシス促進剤または細胞周期調節剤と同様に使用することができると考えている。
あるいは、治療法は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の剤治療の前にまたは後に行うことができる。他の剤及び本発明が個体に別々に適用される実施形態では、確実に、それぞれの送達時間の間に、有意な期間が終了することがなく、これにより、剤及び本発明の治療法は、依然として、細胞に対して有利に組み合わされた効果を発揮できるようになる。このような場合、これらが、両方のモダリティで、互いに約１２～２４時間以内に、より好ましくは、互いに約６～１２時間以内に、細胞に接触し得ることを企図している。状況によっては、治療期間を有意に延長させることが望ましい場合があり得るが、この場合、それぞれの投与と投与の間に、数日（２、３、４、５、６、または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週）経過する。
いくつかの実施形態では、治療サイクルは、必要に応じて繰り返される。様々な標準治療、ならびに外科的介入が、本発明の細胞療法と組み合わせて適用され得ることもまた企図される。
化学療法
がん治療には、化学療法剤及び放射線治療の両方をベースにした治療との様々な組み合わせ療法も含む。組み合わせ化学療法としては、例えば、アブラキサン、アルトレタミン、ドセタキセル、ハーセプチン、メトトレキサート、ノバントロン、ゾラデックス、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びメトトレキサート、またはそれらの任意の類似物または誘導バリアント及びそれらの組み合わせが挙げられる。
特定の実施形態では、個体のための化学療法は、本発明と併用して、例えば、本発明の投与前、本発明の投与中、及び／または本発明の投与後に、使用される。
放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く使用されている他の因子としては、一般に、ガンマ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への放射性同位元素の直接送達である。マイクロ波及び紫外線照射など、他の形態のＤＮＡ損傷因子も考えられる。これらの因子はすべて、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体のアセンブリング及び維持に対して、広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３～４週間）では１日線量５０～２００レントゲン、単回線量では２０００～６０００レントゲンの範囲である。放射性同位元素の線量範囲は、幅広く異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度及び種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
用語「接触させる」及び「曝露させる」は、細胞に適用されるときに、治療用構築物及び化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、もしくは標的細胞と直接並置される処理を説明するために本明細書で使用される。細胞死滅または停滞を達成するために、例えば、両方の剤が、細胞を死滅させる、または細胞の分裂を防ぐために有効な組み合わせ量で、細胞に送達される。
免疫療法
免疫療法は、一般に、がん細胞を標的にして破壊させるために、免疫エフェクター細胞及び分子を使用することに依存する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体のみが治療のエフェクターとして作用し得る、または他の細胞を動員させて、実際に細胞を死滅させ得る。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合させて、単に標的剤として作用し得る。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を担持するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
したがって、本明細書に記載の本発明の療法以外の免疫療法は、本細胞療法と併用して、組み合わせ療法の一部として使用できる。組み合わせ療法の一般的なアプローチについては、以下に論ずる。一般に、腫瘍細胞は、標的化に対応する、すなわち他の細胞の大部分には存在しない多少のマーカーを保持している必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本発明の文脈において、標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、がん胚性抗原、前立腺特異抗原、尿路腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ－７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ及びｐ１５５が挙げられる。
遺伝子
さらに別の実施形態では、二次治療は、治療用ポリヌクレオチドが、本発明の臨床実施形態の前、後、または同時に投与される遺伝子療法である。細胞増殖の誘導物質、細胞増殖の阻害剤、またはプログラム細胞死の調節因子など、様々な発現産物が本発明に含まれる。
外科手術
がん患者の約６０％は、予防的、診断的または病期分類、治癒的及び姑息的手術など、ある種の外科手術を受ける。治癒的手術は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法などの他の療法と併用して使用され得るがん治療である。
治癒的手術としては、がん性組織の全部または一部を物理的に除去する、摘出すること、及び／または破壊すること、切除することを含む。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に除去することを指す。外科手術による治療としては、腫瘍の切除に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気外科、及び顕微鏡制御手術（モース術）が挙げられる。さらに、本発明は、表在性がん、前がん、または付随的な量の正常組織の除去と併用して、使用され得ることが企図される。
すべてのがん性細胞、組織、または腫瘍の一部を切除したときに、身体内に空洞が形成され得る。治療は、灌流、直接注射、または追加の抗がん療法を伴うその領域の局所適用によって達成することができる。このような治療は、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日ごと、または１週、２週、３週、４週、及び５週ごと、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月ごとに繰り返してもよい。これらの治療は、投薬量も変動し得る。
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の実施例において明らかである。しかしながら、本発明の実施形態を示しながら、実施例が、限定ではなく、例示としてのみ、与えられることを理解するべきである。実施例から、本発明の範囲内での様々な変更及び修正が、当業者に明らかになるであろう。
実施例１．ｉＰＳ細胞のＨＰ細胞バルクへの分化
ｉＰＳ細胞株であるＦｆＩ－０１ｓ０４株は、健康な個体の末梢血単核細胞から得た。ＳｔｅｍＦｉｔ完全培地に分散したＦｆＩ－０１ｓ０４細胞を、６ｘ１０５細胞／ウェル、低酸素（５％Ｏ２）条件下（「０日目」）で、超低接着処理６ウェルプレートに播種した。ＳｔｅｍＦｉｔ完全培地には、１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１及び５０μＭ Ｙ－２７６３２を含めた。翌日（すなわち、１日目）、ＦｆＩ－０１ｓ０４細胞をＢＭＰ４（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、及びアスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍｌ）を含む造血前駆細胞（ＨＰＣ）分化培地に分散した。ＨＰＣ誘導培養培地には、ヒトインスリン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒトトランスフェリン（５．５μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（６．７ｎｇ／ｍｌ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）及びα－モノチオグリセロール（０．４ｍＭ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４を含めた。２日目に、ＳＢ４３１５４２（培地中６μＭ）を培養培地（すなわち、細胞を含むＨＰＣ分化培地）に添加し、細胞を２日間培養した。４日目に、細胞をＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、及びアスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍｌ）を含む別の培地に再分散させ、さらに３日間培養した。７日目に、細胞をＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、アスコルビン酸２－ホスフェート（５０μｇ／ｍｌ）、ＴＰＯ（３０ｎｇ／ｍｌ）及びＦｌｔ３Ｌ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む別の培地に曝露し、この培地を使用してさらに７日間培養した。この７日間の培養期間中、培地は、２～３日ごとに交換した。
実施例２．ＨＰ細胞バルクのＣＤ４／ＣＤ８細胞を含む集団への分化
１４日目に、いかなる細胞単離も受けずに、実施例１から得られた細胞集団（「ＨＰ細胞バルク」）を１５ｃｍディッシュに３．１２ｘ１０６細胞／ディッシュで播種し、３７℃、５％Ｏ２で培養した。様々な播種密度を使用してよく、該播種密度は、一実施形態であることに留意されたい。各１５ｃｍディッシュは、ｒｈ－ＤＬＬ４／Ｆｃ キメラ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ）でコーティングした。この培養期間中、培地は２～３日ごとに交換した。１５％ＦＢＳ、４ｍＭＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５５μＭ２－メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、５０ｎｇ／ｍｌＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌＩＬ－７、５０ｎｇ／ｍｌＦｌｔ３Ｌ、１００ｎｇ／ｍｌＴＰＯ、１５μＭ ＳＢ２０３５８０、３０ｎＭ ＳＤＦ－１αを添加したＭＥＭα（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｇｉｂｃｏ））を、これらの細胞を培養するための培地として使用した。２１日目に、新たにｈＤＬＬ４／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングした新しい１５ｃｍディッシュに細胞を継代させた。２８日目に、新たにｈＤＬＬ４／ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎをコーティングした新しい１５ｃｍディッシュに細胞をさらに継代させた。３５日目に、ＣＤ４／ＣＤ８細胞などのすべての細胞（「ＤＰ細胞バルク」）を回収した。
実施例３．ＤＰ細胞バルクからＮＫ細胞バルクへの分化
３５日目に、ＤＰ細胞バルク、すなわち、細胞単離を受けることなく実施例２で得られた細胞を、１ｘ１０６細胞／ウェルで、４８ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２、３７℃で３日間培養した。１５％ＦＢＳ、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、５００ｎｇ／ｍ１ 抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１）、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－７を添加したＭＥＭα培地を、培養培地として使用した。３８日目に、１５％ＦＢＳ、４ｍＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｎｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸２－ホスフェート、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン、５．５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、６．７ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－２、及び１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－７を添加した別のＭＥＭα培地に細胞を分散させ、培養培地として使用した。４２日目に、ＮＫ細胞を含むすべての細胞（「ＮＫ細胞バルク」）を回収した。
実施例４．フローサイトメトリー分析
次に、ＮＫ細胞バルクを表１に記載の抗体のセットで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図１に示すとおり、ＣＤ３陰性ＮＫ細胞バルクの一部は、ＣＤ５６（「ＣＤ５６陽性免疫細胞」）を発現した。図１ＣＤ５６陽性免疫細胞及びＣＤ３陰性免疫細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。したがって、ＣＤ５６陽性免疫細胞及びＣＤ３陰性免疫細胞は、ｉＰＳ細胞（ＦｆＩ－０１ｓ０４株）由来のＨＰ細胞バルクから調製した。上記のプロセスで得られたＣＤ５６を発現する細胞は、ｉＰＳ ＮＫ細胞と呼ばれることもある。フローサイトメトリーに使用した抗体を表１に示す。
Figure 2023516632000002
実施例５．単一細胞ＲＮＡ配列（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）分析
ＮＫ細胞バルク集団（すなわち、実施例３で得られた細胞）中の異なる細胞種を同定するために、非線形次元圧縮法（単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）をベースにしたＵＭＡＰ（ｕｎｉｆｏｒｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ））を適用した。
ＧｅｎｅｗｉｚのＩＩｕｍｉｎａＮｅｘｔＳｅｑ５００で、ＮＫ細胞バルクの１万個の細胞に対して、単一細胞ＲＮＡシーケンスを行った。ＳｉｎｇｌｅＲアルゴリズム及び手動クラスターラベリングを使用して、イベントを４つの幅広い細胞集団（ＰＢＭＣサンプル中の単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ細胞）に分類した。１０ＸＧｅｎｏｍｉｃｓから無料で入手できるＰＢＭＣのデータセットを、データ分析の対照として使用した。
図２に示すとおり、ＮＫ細胞バルク中の細胞の約７５％が、ＮＫ細胞として同定され、ＮＫ細胞バルク中の細胞の約２５％が、Ｔ細胞として同定された。したがって、ＮＫ細胞バルクには、単一細胞ＲＮＡシーケンスによるｍＲＮＡプロファイリングに基づいて、ＮＫ細胞及びＴ細胞の両方が含まれていた。
実施例６．ＣＡＲ－ＮＫ細胞の調製
ＮＫ細胞は、１つ以上のＣＡＲを発現するようにさらに改変させた。ＮＫ細胞の改変には、（１）抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を合成するステップと；（２）抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターを調製するステップと；（３）抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターでＮＫ細胞を形質導入するステップと、を含む。
ＣＡＲ／ＩＬ１５－ＮＫ細胞の調製
抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子は、表２に示すとおり、Ｎ末端から配置されるように設計されたオリゴペプチドを合成することによって調製した。
Figure 2023516632000003
抗ＣＤ１９ＣＡＲは、ＷＯ２０１４／１５３２７０（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に従って構築した。
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子の調製
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子は、Ｎ末端から配置されるように設計されたオリゴペプチドを合成することによって調製した。ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５は、Ｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ ２８１，Ｎｏ ３，ｐａｇｅｓ １６１２－１６１９，Ｊａｎｕａｒｙ ２０，２００６；Ｃｈｅｒｔｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２８８，Ｎｏ．２５，Ｐａｇｅｓ １８０９３－１８１０３，Ｊｕｎｅ ２１，２０１３；及びＲｏｗｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；３９（２）：４９１－５０６に従って構築した（それぞれ、その全体が、参照によって、組み込まれる）。
Figure 2023516632000004
抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子を含むレトロウイルスベクターの調製
抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子は、ｐＭＹレトロウイルスベクターのマルチクローニング部位に組み込ませた。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを産生するために、ＦＲＹ－ＲＤ１８細胞を使用して生成した。
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターの調製
ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子は、別のｐＭＹレトロウイルスベクターのマルチクローニング部位に組み込ませた。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを生産するために、ＦＲＹ－ＲＤ１８細胞を使用して生成した。
抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子のｉＰＳ ＮＫ細胞への形質導入
ｉＰＳ ＮＫ細胞は、抗ＣＤ１９ＣＡＲ遺伝子を含むレトロウイルスベクター、及びＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５遺伝子を含むレトロウイルスベクターで形質導入させて、抗ＣＤ１９ＣＡＲ発現ｉＰＳＮＫ細胞（「ｉＮＫ－ＣＡＲ１９」）を生成した。
実施例７．ｉＮＫ－ＣＡＲ１９のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性
ルシフェラーゼ発現Ｎａｌｍ６細胞（ＡＴＣＣ；がん細胞）（５ｘ１０５細胞）を、尾静脈を介して、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄＩＬ－２Ｒガンマヌルマウス（「ＮＳＧマウス」）に移植した。ＮＳＧマウス（雄、４～５週齢）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｎａｌｍ６細胞移植の４日後、０．２ｍｌのＰＢＳまたは細胞を含まないわずか０．２ｍｌのＰＢＳに分散させたｉＮＫ－ＣＡＲ１９（１ｘ１０７細胞）を、尾静脈を介してＮａｌｍ６移植ＮＳＧマウスに投与した。ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞またはＰＢＳを投与後、尾静脈を介してルシフェリンをマウスに投与した。ルシフェラーゼ活性は、ＩＶＩＳイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、７０日以上測定した。
図３は、未処理（バッファーのみで処理）及びｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞で処理したＮａｌｍ６移植ＮＳＧマウスの抗腫瘍効果を示している。３日後、Ｄ－ＰＢＳバッファーで処理したすべてのマウスにおいて、発光が検出された。対照的に、他のマウス（初代ＣＡＲ Ｔ細胞またはｉＮＫ－ＣＡＲ細胞のいずれかで処理）では、投与後２８日まで、発光は検出されず、また、処理後７０日目でも、ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞で処理された１匹のマウスでは、発光は検出されなかった。したがって、ｉＮＫ－ＣＡＲ１９細胞は、Ｎａｌｍ６がん細胞に対する毒性の増強を明確に示した。
添加均等物及び特許請求の範囲
当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの添加均等物を認識する、または確認することができるだろう。本発明の特許請求の範囲は、上記説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に記載される通りである。

Claims (73)

  1. 多能性幹細胞由来ＮＫ細胞を産生する方法であって、
    （Ａ）多能性幹細胞に由来する造血前駆細胞（ＨＰＣ）（ＨＰ細胞バルク）を含むバルク細胞集団を提供することと、
    （Ｂ）前記ＨＰ細胞バルクを１つ以上の培養培地で培養して、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を産生することと、を含み、
    細胞単離ステップを含まない、方法。
  2. 前記方法が、ステップ（Ａ）及び（Ｂ）において、細胞単離ステップを含まない、請求項１に記載の方法。
  3. （Ａ）の前記ＨＰ細胞バルクが、ＣＤ３４＋細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ＨＰ細胞バルク中の前記細胞の２０％以上が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＨＰ細胞バルクの２０％～９０％が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. ステップ（Ｂ）が、
    （ｉ）ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地中で前記ＨＰ細胞バルクを培養して、ＣＤ４－／ＣＤ８－細胞、ＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、及びＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を含む中間の異種細胞集団を生成することと、
    （ｉｉ）ＮＫ誘導培地で前記中間の異種細胞集団を培養して、前記ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を産生することと、を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記方法が、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞を単離するステップを含まない、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  8. ステップ（Ａ）が、ＨＰＣ誘導培地において多能性幹細胞を培養して、ＨＰ細胞バルクを産生することを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記ＨＰＣ誘導培地が、骨形成タンパク質－４（ＢＭＰ４）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、アスコルビン酸、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）及びＴＧＦβ阻害剤から選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記ＨＰＣ誘導培地が、５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＢＭＰ４を含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記ＢＭＰ４が、濃度５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１１に記載の方法。
  13. バルク細胞培地が、５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＶＥＧＦを含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記ＶＥＧＦが、濃度約５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記ＨＰＣ誘導培地が、５ｎｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ｂＦＧＦを含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ｂＦＧＦが、濃度５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記バルク細胞培地が、５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍｌの濃度でアスコルビン酸を含む、請求項１０～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記アスコルビン酸が、濃度５０μｇ／ｍｌである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ＨＰＣ誘導培地が、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、Ｆｌｔ３Ｌを含む、請求項１０～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記Ｆｌｔ３Ｌが、濃度５０ｎｇ／ｍｌである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記ＨＰＣ誘導培地が、１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＯを含む、請求項１０～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記ＴＰＯが、濃度１００ｎｇ／ｍｌである、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、アスコルビン酸、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－７、Ｆｌｔ３Ｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項６～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、５μｇ／ｍｌ～約５００μｇ／ｍｌの濃度のアスコルビン酸を含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記アスコルビン酸が、濃度５０μｇ／ｍｌである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＳＣＦを含む、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＳＣＦが、濃度５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ－７を含む、請求項２３～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記ＩＬ－７が、濃度５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、Ｆｌｔ３Ｌを含む、請求項２３～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記Ｆｌｔ３Ｌが、濃度５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ３Ｌである、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、１ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＴＰＯを含む、請求項２３～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記ＴＰＯが、濃度１００ｎｇ／ｍｌである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、０．５μＭ～１００μＭの濃度で、ｐ３８阻害剤を含む、請求項２３～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記ｐ３８阻害剤が、ＳＢ２０３５８０である、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記ＳＢ２０３５８０が、濃度１５μＭである、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記ＣＤ４／ＣＤ８誘導培地が、１０ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＳＤＦ－１阻害剤を含む、請求項２３～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記ＳＤＦ－１阻害剤が、濃度３０ｎＭである、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記ＮＫ誘導培地が、ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２及びＩＬ７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項６～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記ＮＫ誘導培地が、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ－２を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記ＩＬ－２が、濃度１０ｎｇ／ｍｌである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記第２の誘導培地が、１ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ－７を含む、請求項３９～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記ＩＬ－７が、濃度１０ｎｇ／ｍｌである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記培養ステップのそれぞれが、約５％酸素で実施される、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記培養ステップのそれぞれが、１４％を超える酸素で実施される、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記培養ステップのそれぞれが、大気中酸素で実施される、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記培養ステップのそれぞれが、５％未満の酸素で実施される、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記バルク細胞培地中で多能性幹細胞を培養して、１０日を超えて持続して、ＨＰ細胞バルクを得る、請求項８～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記バルク細胞培地中で多能性幹細胞を培養して、１１～１５日の間持続して、ＨＰ細胞バルクを得る、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記バルク細胞培地中で多能性幹細胞を培養して、１４日間持続して、ＨＰ細胞バルクを得る、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ｉＰＳＣが、末梢血単核細胞から得られる、請求項９～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 濃縮ステップなく、産生された細胞の少なくとも約５０％、５５％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれ以上が、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  53. 産生された細胞の約２５％未満が、ＣＤ３＋細胞である、請求項５２に記載の方法。
  54. 産生された細胞のパーセンテージが、フローサイトメトリーによって決定される、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 産生された細胞のパーセンテージが、単一細胞ＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって決定される、請求項５２または５３に記載の方法。
  56. ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を単離するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  57. ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気ソーティングによって単離される、請求項５６に記載の方法。
  58. 前記ＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞が、ＮＫ細胞である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記単離されたＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞が、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子改変されている、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記抗原が、ＣＤ１９である、請求項６０記載の方法。
  62. 前記細胞が、ＩＬ－１５Ｒα／ＩＬ－１５複合体を発現するように、さらに遺伝子改変されている、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. （１）血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及びアスコルビン酸から選択される少なくとも１つの化合物を含むＨＰＣ誘導培地においてｉＰＳＣを培養し、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む異種細胞集団（ＨＰ細胞バルク）得るステップと；
    （２）アスコルビン酸、ｐ３８阻害剤及びＳＤＦ－１のうちの１つ以上を含むＣＤ４／ＣＤ８誘導培地において、（１）で得られた前記ＨＰ細胞バルクを培養し、中間の異種細胞集団を得るステップと；
    （３）ＣＤ３活性化因子、ＩＬ－２及びＩＬ－７からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を含むＮＫ誘導培地において、（２）の前記中間の異種細胞集団を培養するステップと、を含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のＣＤ５６＋／ＣＤ３－免疫細胞を産生する方法。
  64. 前記請求項のいずれか１項に記載の方法を使用して産生されたＮＫ細胞集団。
  65. 多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋免疫細胞全体の６０％以上の比率で、多能性幹細胞由来ＣＤ５６＋／ＣＤ３－細胞を含む、選別されていない細胞集団。
  66. 細胞の２５％未満が、ＣＤ３＋細胞である、請求項６５に記載の選別されていない細胞集団。
  67. ５％未満の細胞が、単球である、請求項６５または６６に記載の選別されていない細胞集団。
  68. ５％未満の細胞が、Ｂ細胞である、請求項６５または６６に記載の選別されていない細胞集団。
  69. 細胞のパーセンテージが、フローサイトメトリーによって決定される、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の選別されていない集団。
  70. 細胞のパーセンテージが、単一細胞ＲＮＡシーケンス（ｓｃＲＮＡｓｅｑ）によって決定される、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の選別されていない集団。
  71. 細胞療法を必要とする対象を治療する方法であって、前記請求項のいずれか１項に記載のＮＫ細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
  72. 前記対象が、がんを有する、請求項６８に記載の方法。
  73. 前記がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項６９に記載の方法。
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