KR101764100B1

KR101764100B1 - 신규한 핵 재프로그래밍 물질

Info

Publication number: KR101764100B1
Application number: KR1020117022584A
Authority: KR
Inventors: 신야 야마나카; 나오키 고시마; 모모코 마에카와; 요시후미 가와무라; 히로미 모치즈키
Original assignee: 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠; 고쿠리츠켄큐카이하츠호진 상교기쥬츠 소고켄큐쇼; 샤단호진 바이오산교죠호카 콘소시아무
Priority date: 2009-02-27
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2017-08-02
Also published as: CA2753845C; CN102388136A; SG173876A1; JP2012518988A; KR20120003867A; IL214833A0; EP2401372A4; EP2607476A1; EP2607476B1; CN102388136B; EP2401372A1; JP5553289B2; CA2753845A1; WO2010098419A1; US20120052583A1; IL214833A; US8951801B2

Abstract

IRX 패밀리의 일원 (예를 들어, IRX6), GLIS 패밀리의 일원 (예를 들어, GLIS1), PTX 패밀리의 일원 (예를 들어, PITX2), DMRTB1, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, Klf4 를 대체할 수 있는 재프로그래밍 물질이 제공된다. 또한 제공되는 것은, 1 종류 이상의 상기 기술된 핵 재프로그래밍 물질 및 Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 물질 둘다를 체세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, iPS 세포를 생산하는 방법이다. 또한 제공되는 것은, 상기 방법에 의해 수득될 수 있는, 상기 기술된 핵 재프로그래밍 물질 중 임의의 하나를 인코딩하는 외래 핵산을 포함하는 iPS 세포, 및 iPS 세포의 분화를 유도함으로써 체세포를 생산하는 방법이다.

Description

신규한 핵 재프로그래밍 물질 {NOVEL NUCLEAR REPROGRAMMING SUBSTANCE}

본 발명은 신규한 핵 재프로그래밍 물질 및 그의 용도, 더욱 구체적으로는 Klf4 를 대체할 수 있는 신규한 핵 재프로그래밍 물질, 및 이를 사용하여 유도된 다능성 줄기 (이하에서 iPS 로 언급됨) 세포를 확립하는 방법에 관한 것이다.

최근, 마우스 및 인간 iPS 세포가 잇따라 확립되었다. Yamanaka 등은 EST 데이타베이스를 분석함으로써 다능성 세포 예컨대 ES 세포 및 생식 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자를 동정했고, 녹아웃 (knockout) 마우스 기술 등을 사용하여 기능적 분석을 수행했다. 그들은 다른 연구 그룹에 의한 몇몇 보고들을 고려하여 24 가지 유전자를 체세포에서 다능성을 유도하는 (핵을 재프로그래밍하는) 후보 물질로서 선별했다 [WO 2007/069666 A1; Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)]. 그들은, 레트로바이러스를 이용하여, 네오마이신 내성 유전자가 Fbx15 유전자자리에 녹-인 (knocked-in) 된 리포터 마우스로부터의 섬유모세포 (MEF) 에 상기 24 가지 유전자를 도입하고, 상기 세포가 상기 유전자를 발현하게 함으로써 iPS 세포를 유도했다. 그들은 24 가지 유전자 중 23 가지를 전달함으로써 핵 재프로그래밍에 가장 중요한 유전자의 범위를 계속 좁혀나갔고, 결국 4 가지 유전자 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 를 체세포에서의 핵재프로그래밍에 관한 핵심 인자로서 동정했다 [WO 2007/069666 A1; Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)].

또한, Yamanaka 등은 Fbx15 발현보다 다능성 세포에 국한되어 발현되는 Nanog 의 유전자자리에 녹색 형광 단백질 (GFP) 및 푸로마이신-내성 유전자가 통합되어 있는 트랜스제닉 마우스를 생산하고, 이 마우스로부터 유래된 MEF 가 상술한 4 가지 유전자를 발현하게 하고, 푸로마이신-내성 및 GFP-양성 세포를 선별함으로써, 배아 줄기 (ES) 세포와 거의 동일한 유전자 발현 및 후생적 개질 프로파일을 보이는 iPS 세포 (Nanog iPS 세포) 를 확립하고 키메라 마우스를 제조하는데 성공했다. [Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)]. 그후, 키메라 마우스의 생식계열에도 기여하는 c-Myc 유전자 이외의 3 가지 인자에 의해서도 iPS 세포가 생산될 수 있음이 밝혀졌다 [Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)].

게다가, Yamanaka 등은 상기 마우스에서 사용된 것과 동일한 4 가지 유전자 또는 3 가지 유전자를 인간 피부 섬유모세포에 도입함으로써 iPS 세포를 확립하는데 성공했다 [WO 2007/069666 Al; Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)]. 따라서, 규정된 인자를 체세포에 도입함으로써, 다능성의 면에서 ES 세포와 비슷한 iPS 세포가 인간 및 마우스 둘다에서 생산될 수 있음이 입증되었다.

4 가지 유전자 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 중에서, Oct3/4 및 Sox2 는 보고에 따르면 ES 세포의 자가재생성 및 다능성을 유지하는데 필수적이고, c-Myc 도 ES 세포의 자가재생성 및 다능성을 유지하는데 관여하는 것으로 보고되었다. 한편, Klf4 는 다양한 생물학적 과정, 예컨대 증식, 분화, 발달, 및 세포자멸사를 제어하는 전사 인자인 Kruppel-유사 인자 (Kruppel-like factor, Klf) 의 패밀리에 속하나 [McConnell, B.B. et al., Bioassays, 29: 549-557 (2007)], 그것의 기능의 세부사항은 여전히 명확하지 않다. 이식후 배아의 외배엽으로부터 확립된 외배엽 줄기 세포 (EpiSC) 는 ES 세포와는 달리 심지어 숙주 주머니배 내로 주사되는 경우에도 키메라 배아를 형성할 수 없다. 그러나, EpiSC 에서, Oct3/4 및 Sox2 는 ES 세포에서와 유사한 수준으로 발현되는 한편, Klf4 유전자는 현저히 더 낮은 수준으로 발현된다. 최근에, Klf4 유전자 단독을 EpiSC 내로 전달함으로써, ES 세포와 유사한 성질이 획득될 수 있음이 보고되었다 [Guo, G. et al., Development, 136: 1063-1069 (2009)].

심지어 Klf4 가 RNAi 에 의해 녹다운되는 경우에도 ES 세포는 형태적 변화를 보이지 않으므로 [Nakatake, Y. et al., Mol. Cell. Biol., 26: 7772-7782 (2006)], 그러나, Klf4 는 ES 세포의 미분화된 상태의 유지에 필수적이지 않을 수 있다. Yamanaka 등은 동일한 4 가지 유전자가 동일한 개별 패밀리에 속하는 다른 유전자로 대체될 수 있다는 가설을 세웠고, 심지어 Klf4 가 Klf1, Klf2 또는 Klf5 로 대체되는 경우에도 iPS 세포가 확립될 수 있음을 밝혔다 [WO 2007/069666 Al; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)]. Thomson 등의 그룹은 Klf4 및 c-Myc 대신 Nanog 및 Lin28 을 사용하여 인간 iPS 세포가 생성될 수 있음을 보고했다 [WO 2008/118820 A2; Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)]; Klf4 의 기능은 Nanog 에 비해 많은 흔한 양상을 갖는 것으로 여겨질 수 있다.

ES 세포가 레티노산으로 처리되어 분화가 유도될 때, Klf4 의 발현 뿐만 아니라, Klf2 및 Klf5 의 발현도 감소한다. 이 사실에 주목하여, Jiang 등은 Klf2, Klf4 및 Klf5 를 동시에 녹다운시키고, ES 세포에서 분화가 유도되었음을 발견하여, ES 세포에서 Klf 패밀리의 일원 중 적어도 일부, 예컨대 Klf2 및 Klf5 가 Klf4 를 기능적으로 대체할 수 있음을 보였다 [Jiang, J. et al., Nat. Cell Biol., 10: 353-360 (2008)]. 그들은 계속해서 Klf2 또는 Klf5 유전자, 또는 다른 전사 인자 및 후생적 조절 인자를, 3 가지 유전자 Oct3/4, Sox2 및 c-Myc 와 함께, MEF 내로 전달했다; 그들은 Klf2 및 Klf5 가 Klf4 를 대체할 수 있음을 확인했고, 에스트로겐 수용체와 유사한 고아 핵 수용체인 Esrrb 도 Klf4 를 대체할 수 있음을 발견했다 [Feng, B. et al., Nat. Cell Biol., 11: 197-203 (2009)].

발명의 요약

iPS 세포에 대한 임상적 적용을 찾을 때, 핵 재프로그래밍 메카니즘의 모든 세부사항을 해명하는 것이 가장 중요하다. 공지된 기존의 핵 재프로그래밍 물질을 대체할 수 있는 공지되지 않은 핵 재프로그래밍 물질을 동정하는 것은, 핵 재프로그래밍 메카니즘을 해명하는 것을 도움에 있어서 뿐만 아니라, 임상적 적용에 가장 적합한 iPS 세포를 확립하는 방법을 개발함에 있어서 매우 중요하다. 따라서, 본 발명의 목적은 신규한 핵 재프로그래밍 물질, 특히 Klf4 를 대체할 수 있는 신규한 핵 재프로그래밍 물질을 동정하고, 이를 사용하여 iPS 세포를 확립하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

이 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 광범위한 유전자 분석을 수행했는데, 이 분석은 다능성 세포 예컨대 ES 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자의 유전자 라이브러리 뿐만 아니라, 더 넓은 범위의 전사 인자의 유전자 라이브러리 중에서, iPS 세포를 Klf4 의 대체물로서 확립하는데 사용될 수 있다. 그 결과, 본 발명자들은 IRX 패밀리에 속하는 유전자, GLIS 패밀리에 속하는 유전자, PTX 패밀리에 속하는 유전자 또는 프롤린-풍부 C-말단을 갖는 DMRT-유사 패밀리 B, 1 (DMRTB1) 유전자가, 3가지 유전자 Oct3/4, Sox2 및 c-Myc 와 함께 성체 마우스 피부 섬유모세포 또는 MEF 내로 전달되는 경우, iPS 세포가 효율적으로 확립될 수 있음을 발견하고, 이들 전사 인자를 Klf4 를 기능적으로 대체할 수 있는 신규한 핵 재프로그래밍 물질로서 동정하여, 본 발명은 개발했다.

따라서, 본 발명은 하기를 제공한다:

[1] 하기 (1) 및 (2) 를 체세포 내로 전달하는 단계를 포함하는, iPS 세포를 생산하는 방법:

(1) IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원, DMRTB1, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 물질,

(2) Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 물질.

[2] 상기 [1] 에 있어서, 상기 (1) 에서 언급된 물질이 이로쿠와 (iroquois) 호메오박스 단백질 6 (IRX6), GLIS 패밀리 아연 핑거 1 (GLIS1), 쌍연합형 (paired-like) 호메오도메인 전사 인자 2 아이소형 b (PITX2), DMRTB1 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 물질을 포함하는 방법.

[3] 상기 [1] 에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct 패밀리의 일원, Sox 패밀리의 일원, Myc 패밀리, Nanog 및 Lin 패밀리의 일원, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.

[4] 상기 [1] 에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4 인 방법.

[5] 상기 [1] 에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4 및 Sox2 인 방법.

[6] 상기 [1] 에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4 및 c-Myc 인 방법.

[7] 상기 [1] 에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4, Sox2 및 c-Myc 인 방법.

[8] 하기 (1) 및 (2) 를 포함하는, 체세포로부터의 iPS 세포의 유도인자:

[9] 상기 [8] 에 있어서, 상기 (1) 에서 언급된 물질이 IRX6, GLIS1, PITX2, DMRTB1 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 물질을 포함하는 유도인자.

[10] IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원 및 DMRTB1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 인자를 인코딩하는 외래 핵산을 함유하는 iPS 세포.

[11] 상기 [10] 에 있어서, IRX6, GLIS1, PITX2 및 DMRTB1 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 인자를 인코딩하는 외래 핵산을 함유하는 iPS 세포.

[12] 상기 [10] 에 있어서, 1 종류 이상의 외래 핵산이 게놈 내에 통합되어 있는 iPS 세포.

[13] 상기 [10] 에 따른 iPS 세포를 처리하여 체세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 체세포의 생산 방법.

[14] Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 물질과 함께 체세포 내로 전달되는, IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원, DMRTB1, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 물질을 포함하는, 체세포로부터의 iPS 세포의 유도인자.

[15] Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 물질과 함께 체세포 내로 전달되는, IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원, DMRTB1, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 종류 이상의 물질의, iPS 세포를 생산하기 위한 용도.

[16] Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 물질과 함께 체세포 내로 전달되는, IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원, DMRTB1, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 체세포로부터의 iPS 세포의 유도인자로서의 물질.

[17] 체세포를 생산함에 있어서, 상기 [10] 에 따른 iPS 세포의 용도.

[18] 체세포를 생산함에 있어서 세포의 공급원으로서의, 상기 [10] 에 따른 iPS 세포.

본 발명에 따라서, IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원 및 DMRTB1 은 핵 재프로그래밍에서 Klf4 를 기능적으로 대체할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 핵 재프로그래밍 물질의 작용 메카니즘에 대한 연구는 핵 재프로그래밍 메카니즘의 해명을 촉진시킬 것으로 예상된다. ES 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자 이외의 유전자가 본 발명에 의한 핵 재프로그래밍 물질로서 새롭게 동정되었다는 사실은 현재 공지되지 않은 다른 핵 재프로그래밍 물질이 장래에 발견될 것임을 시시한다.

도 1 은 인간 Gateway^® 엔트리 클론으로부터의 기능에 의한 엔트리 클론의 선별에 대한 단계를 나타내는 계통도이다 (N.. Goshima et al., Nature methods, 2008).
도 2 는 전사 인자의 엔트리 클론으로부터의 체세포 재프로그래밍 인자 스크리닝을 위한 전사 인자 발현 라이브러리 생성의 흐름도를 나타낸다.
도 3 은 총 4 종류의 유전자, 즉 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G06 (유전자 명칭: GLIS1), H08 (유전자 명칭: DMRTB1) 또는 H10 (유전자 명칭: PITX2) 을 레트로바이러스에 의해 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포에 전달시켜 수득한 GFP-양성 콜로니 형태의 사진 표현이다. "Klf-G6-1" 은 3 가지 유전자와 함께 G06 (유전자 명칭: GLIS1) 을 전달시켜 수득한 iPS 세포 클론을 나타내고; "Klf-H8-2" 는 3 가지 유전자와 함께 H08 (유전자 명칭: DMRTB1) 을 전달시켜 수득한 iPS 세포 클론을 나타내고; "Klf-H10-1" 및 "Klf-H10" 은 3 가지 유전자와 함께 H10 (유전자 명칭: PITX2) 을 전달시켜 수득한 iPS 세포 클론을 나타낸다. P0 은 콜로니 확립시 수득한 영상을 나타내고; P1 은 제 1 세대에 대한 영상을 나타내고 (24 웰); P2 는 제 2 세대에 대한 영상을 나타낸다 (6 웰). 3 개 사진의 각 집합에 대해서, 좌측 패널은 GFP-양성 콜로니의 영상을 나타내고, 중앙 패널은 상반전 영상을 나타내고, 우측 패널은 GFP-양성 콜로니 영상과 상반전 영상의 겹쳐진 사진을 나타낸다. Klf-H10-1 만이 재파종법 (Reseed method) 에 의해 확립된 한편, 다른 것들은 MSTO 방법에 의해 확립되었다.
도 4 는 콜로니 확립의 시점에서, 총 4 종류의 유전자, 즉 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 F09 (유전자 명칭: IRX6), G06 (유전자 명칭: GLIS1), H08 (유전자 명칭: DMRTB1) 또는 H10 (유전자 명칭: PITX2) 를 레트로바이러스에 의해 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포에 전달시켜 수득한 GFP-양성 콜로니 형태의 사진 표현이다. "Klf-F9" 는 3 가지 유전자와 함께 F09 (유전자 명칭: IRX6) 를 전달시켜 수득한 iPS 세포 클론을 나타내고; "Klf-G6-1" 및 "Klf-G6-2" 는 3 가지 유전자와 함께 G06 (유전자 명칭: GLIS1) 을 전달시켜 수득한 iPS 세포 클론을 나타내고; "Klf-H8-1 및 "Klf-H8-2" 는 3 가지 유전자와 함께 H08 (유전자 명칭: DMRTB1) 을 전달시켜 수득한 iPS 세포 클론을 나타내고; "Klf-H10" 은 3 가지 유전자와 함께 H10 (유전자 명칭: PITX2) 을 전달시켜 수득한 iPS 세포 클론을 나타낸다. "재파종" 은 재파종법에 의해 수득한 결과를 나타내고; "MSTO" 은 MSTO 방법에 의해 수득한 결과를 나타낸다.
도 5 는 G6-1 (Klf-G6-1), H8-2 (Klf-H8-2) 및 H10 (Klf-H10) iPS 세포 클론에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 6 은 도 5 의 것 외의 또다른 H10 (Klf-H10) iPS 세포 클론에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 7 은 G6-1 (Klf-G6-1), H8-2 (Klf-H8-2) 및 H10 (Klf-H10) iPS 세포 클론에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고; "ES" 및 "iPS" 는 마우스 ES 세포 및 iPS 세포를 나타내고; "Sox2 RT-" 는 음성 대조군이다.
도 8 은 도 7 의 것 외의 또다른 H10 (Klf-H10) iPS 세포 클론에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고; "ES" 및 "iPS" 는 마우스 ES 세포 및 iPS 세포를 나타내고; "Sox2 RT-" 는 음성 대조군이다.
도 9 는 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포에 전달하여 확립된 iPS 세포 (GFP-양성 세포) 의 콜로니 수 계수 결과의 그래프 표현이다. 6 개의 독립적 실험 결과가 요약되어 있다.
도 10 은 2 가지 인자 (Oct3/4, Sox2) 및 G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포에 전달하여 확립된 iPS 세포 (GFP-양성 세포) 의 콜로니 수 계수 결과의 그래프 표현이다. 2 개의 독립적 시험 결과가 요약되어 있다.
도 11 은 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포에 전달하여 확립된 iPS 세포의 콜로니, 및 2 가지 인자 (Oct3/4, Sox2) 및 G6 (GLIS1) 또는 H8 (DMRTB1) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포에 전달하여 확립된 iPS 세포의 콜로니의 사진 표현이다. P0 은 콜로니 확립시 수득한 영상을 나타내고; P1 은 제 1 세대에 대한 영상을 나타내고; P2 는 제 2 세대에 대한 영상을 나타낸다. 3 개 사진의 각 집합에 대해서, 좌측 패널은 GFP-양성 콜로니의 영상을 나타내고, 중앙 패널은 상반전 영상을 나타내고, 우측 패널은 GFP-양성 콜로니 영상과 상반전 영상의 겹쳐진 사진을 나타낸다.
도 12 는 도 11 에서 나타낸 iPS 세포 클론에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 13 은 도 11 에서 나타낸 iPS 세포 클론에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "ES" 및 "iPS" 는 4 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 를 사용하여 확립된 마우스 ES 세포 및 iPS 세포를 나타낸다.
도 14 는 2 가지 인자 (Oct3/4, c-Myc) 및 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포에 전달하여 확립된 iPS 세포의 콜로니의 사진 표현이다. P0 은 콜로니 확립시에 수득한 영상을 나타내고; P1 은 제 1 세대에 대한 영상을 나타내고; P2 는 제 2 세대에 대한 영상을 나타낸다. 3 개 사진의 각 집합에 대해서, 좌측 패널은 GFP-양성 콜로니 영상을 나타내고, 중앙 패널은 상반전 영상을 나타내고, 우측 패널은 GFP-양성 콜로니 영상과 상반전 영상의 겹쳐진 사진을 나타낸다.
도 15 는 도 14 에서 나타낸 iPS 세포 클론에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 16 은 도 14 에서 나타낸 iPS 세포 클론에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "ES" 및 "iPS" 는 4 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 를 사용하여 확립된 마우스 ES 세포 및 iPS 세포를 나타낸다.
도 17 은 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 MEF 에 전달하여 확립된 iPS 세포 (GFP-양성 세포) 의 콜로니 수 계수 결과의 그래프 표현이다. 4 개의 독립적 실험의 결과가 요약되어 있다.
도 18 은 2 가지 인자 (Oct3/4, Sox2) 및 G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 MEF 에 전달하여 확립된 iPS 세포 (GFP-양성 세포) 의 콜로니 수 계수 결과의 그래프 표현이다. 2(OS)+H10 에서 확립된 콜로니 수는 MSTO 방법의 경우 1 이었고 재파종법의 경우 1 이었다.
도 19 는 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 MEF 에 전달하여 확립된 iPS 세포의 콜로니, 및 2 가지 인자 (Oct3/4, Sox2) 및 G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H10 (PITX2) 의 조합을 Nanog-GFP 마우스 MEF 에 전달하여 확립된 iPS 세포의 콜로니의 사진 표현이다. P0 은 콜로니 확립시 수득한 영상을 나타내고; P1 은 제 1 세대에 대한 영상을 나타내고; P2 는 제 2 세대에 대한 영상을 나타낸다. OS+G6, OS+H8 및 OS+H10 의 사진은 P0 의 것과 같다. 3 개 사진의 각 집합에 대해서, 좌측 패널은 GFP-양성 콜로니 영상을 나타내고, 중앙 패널은 상반전 영상을 나타내고, 우측 패널은 GFP-양성 콜로니 영상과 상반전 영상의 겹쳐진 사진을 나타낸다.
도 20 은 도 19 에서 나타낸 iPS 세포 클론 (3 가지 인자 + G6, H8 또는 H10) 에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 21 은 도 19 에서 나타낸 iPS 세포 클론 (3 가지 인자 + G6, H8 또는 H10) 에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "ES" 및 "iPS" 는 4 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 를 사용하여 확립된 마우스 ES 세포 및 iPS 세포를 나타낸다.
도 22 는 성체 마우스 (Nanog-GFP 마우스) 피부 섬유모세포로부터 확립된 iPS 클론 (G6-1 클론, G6-6 클론, H8-2 클론, H10 클론) 을 면역결핍 마우스에 피하 주사하여 생성된 기형종에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "피부" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 섬유모세포를 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 23 은 G6-1 클론 또는 G6-6 클론을 면역결핍 마우스에 피하 주사하여 생성된 기형종의 조직학적 염색 영상 (헤마톡실린-에오신 염색) 을 나타낸다.
도 24 는 H8-2 클론 또는 H10 클론을 면역결핍 마우스에 피하 주사하여 생성된 기형종의 조직학적 염색 영상 (헤마톡실린-에오신 염색) 을 나타낸다.
도 25 는 K-G6 과 MEF 사이, 또는 K-G6 과 4F 유전자 사이에 유전자 발현 패턴에서의 차이가 존재하는지 여부를 확인하기 위해 수행한 DNA 마이크로어레이 분석 결과를 보여주는 산포도를 나타낸다 (배수 변화선: 2 배).
도 26 은 K-H8 과 MEF 사이, 또는 K-H8 과 4F 사이에 유전자 발현 패턴에서의 차이가 존재하는지 여부를 확인하기 위해 수행한 DNA 마이크로어레이 분석 결과를 보여주는 산포도를 나타낸다 (배수 변화선: 2 배).
도 27 은 K-H10 과 MEF 사이, 또는 K-H10 과 4F 유전자 사이에 유전자 발현 패턴에서의 차이가 존재하는지 여부를 확인하기 위해 수행한 DNA 마이크로어레이 분석 결과를 보여주는 산포도를 나타낸다 (배수 변화선: 2 배).
도 28 은 각각의 세포 사이의 상관 계수를 기반으로 수행한 군집화 결과를 나타낸다.
도 29 는 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1) 을 HDF 에 전달하여 확립된 iPS 세포의 알칼리성 포스파타아제 염색 영상 및 콜로니 영상의 사진 표현이다. 대조를 위해, 4 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 로 확립된 iPS 세포의 콜로니 영상이 또한 나타나 있다.
도 30 은 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1) 을 HDF 에 전달하여 확립된 iPS 세포의 제 2 세대 콜로니의 사진 표현이다. 대조를 위해, 4 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 로 확립된 iPS 세포의 콜로니 영상이 또한 나타나 있다.
도 31 은 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1) 을 HDF 에 전달하여 확립된 iPS 세포 클론에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "4 가지 인자" 는 4 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 로 확립된 iPS 세포를 나타내고, "AHDF" 는 체세포의 공급원으로서 사용된 성체 피부 섬유모세포를 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 32 는 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1) 을 HDF 에 전달하여 확립된 iPS 세포 클론에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "4 가지 인자" 및 "AHDF" 는 도 31 에서와 동일하며, "KhES1" 은 인간 ES 세포를 나타내고, "201B7" 은 과거에 확립된 iPS 세포를 나타낸다 [Cell, 131:861-872 (2007)].
도 33 은 2 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2) 및 H8 (DMRTB1), 또는 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 H10 (PITX2) 을 DP31 에 전달하여 확립된 iPS 세포의 알칼리성 포스파타아제 염색 영상 및 콜로니 영상의 사진 표현이다. 대조를 위해, 4 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, Klf4) 로 확립된 iPS 세포의 콜로니 영상이 또한 나타나 있다.
도 34 는 2 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2) 및 H8 (DMRTB1) 을 DP31 에 전달하여 확립된 iPS 세포의 제 1 세대 콜로니의 사진 표현이다.
도 35 는 2 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2) 및 H8 (DMRTB1) 을 DP31 에 전달하여 확립된 iPS 세포 클론에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "DP31" 은 체세포의 공급원으로서 사용된 치수 줄기 세포 클론을 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 36 은 2 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2) 및 H8 (DMRTB1) 을 DP31 에 전달하여 확립된 iPS 세포 클론에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "DP31" 은 체세포의 공급원으로서 사용된 치수 줄기 세포 클론을 나타내고, "hES" 는 인간 ES 세포를 나타내고, "201B7" 은 과거에 확립된 iPS 세포를 나타낸다 [Cell, 131:861-872 (2007)].
도 37 은 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 H10 (PITX2) 을 DP31 에 전달하여 확립된 iPS 세포의 제 1 세대 콜로니의 사진 표현이다.
도 38 은 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 H10 (PITX2) 을 DP31 에 전달하여 확립된 iPS 세포 클론에 대한 게놈-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "DP31" 은 체세포의 공급원으로서 사용된 치수 줄기 세포 클론을 나타내고, "플라스미드" 는 pMX 에 통합된 각 유전자를 증폭시켜 생성된 양성 대조군을 나타낸다.
도 39 는 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 H10 (PITX2) 을 DP31 에 전달하여 확립된 iPS 세포 클론에 대한 RT-PCR 결과의 사진 표현이다. 이 도면에서, "DP31" 은 체세포의 공급원으로서 사용된 치수 줄기 세포 클론을 나타내고, "hES" 는 인간 ES 세포를 나타내고, "201B7" 은 과거에 확립된 iPS 세포를 나타낸다 [Cell, 131:861-872 (2007)].
도 40 은 3 가지 유전자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 및 G6 (GLIS1) 으로 확립된 iPS 세포 클론을 Scid 마우스 고환에 주사하여 생성된 기형종의 조직학적 염색 영상 (헤마톡실린-에오신 염색) 을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 Klf4 를 대체할 수 있는 신규한 핵 재프로그래밍 물질, 및 상기 물질 및 Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질을 체세포에 전달함으로써 iPS 세포를 생성하는 방법을 제공한다.

(a) 신규한 핵 재프로그래밍 물질 (Klf4 에 대한 대체물)

본 발명에서, "핵 재프로그래밍 물질" 은 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 임의의 물질(들)을 지칭하며, 이는 임의의 물질 예컨대 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산 (벡터에 통합되는 형태 포함), 또는 저분자 화합물로 이루어질 수 있다. 본 발명에 의해 확인된, Klf4 를 대체할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질은 IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원 및 프롤린-풍부 C-말단을 갖는 DMRT-유사 패밀리 B, 1 (DMRTB1) 중의 단백질, 또는 이들을 인코딩하는 핵산이다.

IRX (이로쿠와 호메오박스) 패밀리는 호메오박스 도메인을 가지며, 척추 배아에서의 패턴 형성 과정 동안 여러 역할을 수행하는 것으로 여겨진다. 이 유전자 패밀리 일원의 예는 비제한적으로, 이로쿠와 호메오박스 단백질 1 (IRX1), IRX2, IRX3, IRX4, IRX5, IRX6 등을 포함하며, IRX6 이 바람직하다. IRX6 은 인간 및 마우스 ES 세포에서 발현되지 않는 유전자이다.

GLIS 패밀리는 5 개 C2H2 유형 아연 핑거 부위를 가지며 배아 발생 과정에서 다양한 유전자의 발현을 양성적 또는 음성적으로 제어하는 전사 인자를 포함한다. 이 유전자 패밀리의 일원의 예는 비제한적으로, GLIS 패밀리 아연 핑거 1 (GLIS1), GLIS2, GLIS3 등을 포함하며, GLIS1 이 바람직하다. GLIS1 은 마우스 ES 세포에서 발현되지 않는 유전자이다.

PTX 패밀리는 호메오박스 도메인을 가지며, 측면 비대칭성의 결정 및 기관발생에 관여한다. 이 유전자 패밀리 일원의 예는 비제한적으로, 쌍연합형 호메오도메인 전사 인자 1 (PITX1), PITX2, PITX3 등을 포함하며, PITX2 가 바람직하다. PITX2 는 3 가지 아이소형 (아이소형 a, b 및 c) 으로 존재하는 것으로 알려져 있다. 임의의 아이소형이 사용될 수 있으나, 예를 들어 아이소형 b 가 바람직하게 사용된다.

프롤린-풍부 C-말단을 갖는 DMRT-유사 패밀리 B, 1 (DMRTB1) 은 이중성별 (doublesex) DNA 결합 모티프를 갖는 알려져 있지 않은 기능의 전사 인자이다. DMRTB1 은 인간 및 마우스 ES 세포에서 발현되지 않는 유전자이다.

본 발명에서 사용되는 IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원 및 DMRTB1 이 임의로 선택되는 포유류 (예를 들어 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 소, 말, 돼지, 개 등) 에서 유래하는 단백질 또는 이를 인코딩하는 핵산일 수 있으나, 인간 또는 마우스 기원의 단백질 또는 핵산이 바람직하다.

인간 또는 마우스 기원의 상술한 핵 재프로그래밍 물질의 아미노산 서열 및 cDNA 서열에 대한 정보는 하기 표 1 에 나타낸 NCBI 접근 번호를 참조하여 획득될 수 있으며; 당업자는 cDNA 서열 정보에 기초하여 각각의 단백질을 인코딩하는 핵산을 용이하게 단리할 수 있으며, 필요한 재조합 단백질을 용이하게 생성할 수 있다.

표 1

상기 나타낸 각각의 아미노산 서열과 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 특히 바람직하게는 99% 이상의 동일성을 갖고, 야생형 단백질의 것과 동등한 Klf4 에 대한 대체물 및 이를 인코딩하는 핵산으로서 핵 재프로그래밍에 대한 가능성을 보유하는, 자연적 또는 인공 돌연변이체 단백질이, Klf4 을 대체할 수 있는 본 발명의 핵 재프로그래밍 물질로서 또한 이용될 수 있다.

IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원 및 DMRTB1 (이들을 인코딩하는 핵산 포함) 중에, 임의의 한 종류가 단독으로 사용될 수 있고, 2 종류 이상이 조합으로 사용될 수 있다.

(b) Klf4 과 조합되는 경우 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질

최근에, Klf4 를 포함하는 핵 재프로그래밍 물질의 하기 조합이 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 것으로 알려졌다 (이하, 단백질 인자의 명칭만 제시됨).

(1) Oct3/4, Klf4, c-Myc

(2) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2 (Sox2 는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18 로 대체가능하고; c-Myc 는 T58A (활성 돌연변이체), N-Myc 또는 L-Myc 로 대체가능함)

(3) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Ebx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-카테닌 (활성 돌연변이체 S33Y)

(4) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 거대 T

(5) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6

(6) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7

(7) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7

(8) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil

[상기 제시된 인자들에 대한 더 많은 정보는, WO 2007/069666 참조 (상기 조합 (2) 에서, Sox2 의 Sox18 로의 대체에 대한 정보는 Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008) 참조); 조합 "Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2" 에 대해서는 Cell, 126, 663-676 (2006), Cell, 131, 861-872 (2007) 등 참조; 조합 "Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, hTERT, SV40 거대 T" 에 대해서는 Nature, 451, 141-146 (2008) 참조.]

(9) Oct3/4, Klf4, Sox2 [Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008) 참조]

(10) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28 [Cell Research (2008) 600-603 참조]

(11) Oct3/4, Klf4, c-Myc, Sox2, SV40 거대 T (Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008) 참조)

(12) Oct3/4, Klf4 [Nature, 454, 646-650 (2008); Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008) 참조]

(13) Oct3/4, Klf4, L-Myc

그러므로, Klf4 와 조합되는 경우 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질의 바람직한 조합은 상기 (1)-(13) 과 동일한 물질들의 조합 (그러나, Klf4 는 제외함), 즉, 하기이다:

(i) Oct3/4, c-Myc

(ii) Oct3/4, c-Myc, Sox2 (Sox2 는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18 로 대체가능하고; c-Myc 는 T58A (활성 돌연변이체), N-Myc 또는 L-Myc 로 대체가능함)

(iii) Oct3/4, c-Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, Eras, ECAT15-2, TclI, β-카테닌 (활성 돌연변이체 S33Y)

(iv) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, SV40 거대 T

(v) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6

(vi) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7

(vii) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7

(viii) Oct3/4, c-Myc, Sox2, TERT, Bmil

(ix) Oct3/4, Sox2

(x) Oct3/4, c-Myc, Sox2, Nanog, Lin28

(xi) Oct3/4, c-Myc, Sox2, SV40 거대 T

(xii) Oct3/4, 및

(xiii) Oct3/4, L-Myc.

상기 (i)-(xiii) 과 관련하여, Oct3/4 는 Oct 패밀리의 다른 일원, 예를 들어 Oct1A, Oct6 등으로 대체될 수 있다. 또한, Sox2 (또는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Sox18) 는 Sox 패밀리의 다른 일원, 예를 들어 Sox7 등으로 대체될 수 있다.

이들 사실을 함께 조합하여 판단하면, Klf4 와 조합되는 경우 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질은 Oct 패밀리의 일원 (예, Oct3/4, Oct1A, Oct6), Sox 패밀리의 일원 (예, Sox2, Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17, Sox18), Myc 패밀리의 일원 (예, c-Myc, n-Myc, L-Myc), 및 Nanog 및 Lin 패밀리의 일원 (예, Lin28, Lin28b) 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 적어도 Oct3/4 를 포함하고, 임의로 Sox2 및/또는 c-Myc 를 추가로 포함할 수 있는 조합 [즉, (a) Oct3/4, (b) Oct3/4+Sox2, (c) Oct3/4+c-Myc, 및 (d) Oct3/4+Sox2+c-Myc 중 임의의 하나] 이 이용될 수 있고, 이는 Nanog 및/또는 Lin28 과 추가로 조합되어 사용될 수 있다. 이 경우, c-Myc 대신 L-Myc 를 포함하는 조합이 또한 바람직한 구현에 해당한다.

상기 (i) 내지 (xiii) 은 아니나, 그의 임의의 하나의 모든 구성요소를 포함하고, 임의의 다른 임의로 선택된 물질을 추가로 포함하는 임의의 조합이 또한 본 발명에서 "핵 재프로그래밍 물질"의 범주에 포함될 수도 있다. 예를 들어, Klf 패밀리의 일원 (예, Klf1, Klf2, Klf5) 또는 다른 공지된 대체 인자 (예, Esrr 패밀리의 일원, 예컨대 Esrrb, Esrrg 및 동일한 것) 가 다른 물질로서 조합되어 사용될 수 있다. 핵 재프로그래밍을 하는 체세포가 상기 (i) 내지 (xiii) 중 임의의 하나의 구성요소 하나 이상을 핵 재프로그래밍을 야기하기에 충분한 수준으로 내생적으로 발현하는 경우, 발현되는 하나 이상의 구성요소를 제외하고 나머지 구성요소들만의 조합도 또한 본 발명의 "Klf4 와 조합되는 경우 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질" 의 범주에 포함될 수 있다.

이들 조합 중에서, 2 가지 인자 Oct3/4 및 Sox2 의 조합 [즉, 상기 (ix)] 또는 3 가지 인자 Oct3/4, Sox2 및 L-Myc 의 조합 [즉, 상기 (ii)] 이 수득되는 iPS 세포를 치료 목적으로 사용하려는 경우에 바람직하다. 한편, iPS 세포를 치료 목적으로 사용하려는 것이 아닌 경우에 (예를 들어, 약물 발견 스크리닝을 위한 연구 도구 등으로서 사용하려는 경우에), 4 가지 인자 Oct3/4, c-Myc (또는 L-Myc), Sox2 및 Lin28 의 조합, 또는 이 4 가지 인자와 Nanog 로 이루어지는 5 가지 인자의 조합 [즉, 상기 (x)] 이 바람직하다.

상술된 각각의 단백질성 인자의 마우스 및 인간 cDNA 서열에 대한 정보는 WO 2007/069666 (이 공보에서, Nanog 는 ECAT4 로 기재되어 있음) 에 기술된 NCBI 접근 번호를 참고하여 획득할 수 있다. Lin28 의 마우스 및 인간 cDNA 서열에 대한 정보는 NCBI 접근 번호 NM_145833 및 NM_024674 를 각각 참고하여 획득할 수 있다. Lin28b 의 마우스 및 인간 cDNA 서열에 대한 정보는 NCBI 접근 번호 NM_001031772 및 NM_001004317 을 각각 참고하여 획득할 수 있고; L-Myc 의 마우스 및 인간 cDNA 서열에 대한 정보는 NCBI 접근 번호 NM_008506 및 NM_001033081 을 각각 참고하여 획득될 수 있고; 당업자는 이들 cDNA 를 용이하게 단리할 수 있다. 핵 재프로그래밍 물질로서 이용되는 경우, 단백질 인자 그 자체는, 수득한 cDNA 를 적당한 발현 벡터에 삽입하고, 이 벡터를 숙주 세포로 전달하고, 이 세포를 배양하고, 수득한 배양물로부터 재조합 단백질성 인자를 회수함으로써 제조할 수 있다. 한편, 사용되는 핵 재프로그래밍 물질이 단백질성 인자를 인코딩하는 핵산인 경우에는, 수득되는 cDNA 를 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 구축하고, 벡터를 핵 재프로그래밍 단계에 적용한다.

Klf4 와 조합되는 경우 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질은, 상기의 종래에 공지된 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산의 조합 뿐만 아니라, 새롭게 발견될 단백질성 인자 또는 이를 인코딩하는 핵산의 조합도 포함하며, Klf4 와 함께 체세포에 도입되는 경우 체세포를 iPS 세포로 전환시킬 수 있는 한, 비단백질성 인자 예컨대 저분자 화합물을 포함하는 조합을 추가로 포함할 수 있다.

(c) 체세포의 공급원

포유류 기원 (예, 인간, 마우스, 원숭이, 돼지, 랫트 등) 의, 그러나 생식 세포는 아닌, 임의의 세포가 본 발명에서 iPS 세포의 생산을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 그 예는, 각화성 상피 세포 (예, 각질화 표피 세포), 점막 상피 세포 (예, 혀의 표피층의 상피 세포), 외분비선 상피 세포 (예, 유선 세포), 호르몬-분비 세포 (예, 부신수질 세포), 대사 또는 저장 세포 (예, 간세포), 접점을 구성하는 내막 상피 세포 (예, 유형 I 폐포 세포), 폐쇄관의 내막 상피 세포 (예, 혈관 내피 세포), 운송능을 지닌 섬모가 있는 세포 (예, 기도 상피 세포), 세포외 기질 분비를 위한 세포 (예, 섬유모세포), 협착성 세포 (예, 민무늬근육 세포), 혈관 및 면역계 세포 (예, T 림프구), 감각-관련 세포 (예, 간균성 세포), 자율신경계 뉴런 (예, 콜린성 뉴런), 말초 뉴런 및 감각 기관의 버팀 세포 (예, 위성세포), 중추 신경계의 아교 세포 및 신경 세포 (예, 성상 세포), 색소 세포 (예, 망막 색소 상피 세포), 이의 전구 세포 (조직 전구 세포) 등이 있다. 세포 분화도, 세포가 수집되는 동물의 연령 등에는 제한이 없다; 심지어는 미분화된 조상 세포 (체세포 줄기 세포 포함) 및 최종적으로 분화된 성숙 세포도 마찬가지로 본 발명에서 체세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 미분화된 조상 세포의 예는, 조직 줄기 세포 (체세포 줄기 세포) 예컨대 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 및 치수 줄기 세포를 포함한다.

체세포의 공급원으로서 각 포유류의 선택은 특별히 제한되지 않는다; 그러나 수득한 iPS 세포가 인간의 재생 의학에 사용되는 경우, 이식 거부 방지의 면에서, 체세포는 환자 자신의 세포이거나, HLA 유형이 환자와 동일 또는 실질적으로 동일한 또다른 사람 (공여자) 으로부터 수집되는 것이 특히 바람직하다. 이 경우, HLA 유형이 "실질적으로 동일" 하다는 말은, 체세포-유래 iPS 세포로부터 분화를 유도함으로써 수득된 세포를 수령한 환자에서, 면역억제제 등을 사용하여 이식된 세포 이식편이 살아남게 할 정도로 HLA 유형이 일치함을 의미한다. 그 예는 주 HLA 유형 (예, 3 가지 유전자자리 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DR) 이 동일한 경우 등을 포함한다 (이하에서 동일하게 적용됨). 수득되는 iPS 세포가 인간에게 투여 (이식) 되지 않고, 예를 들어 환자의 약물 감수성 또는 부작용을 평가하는 스크리닝을 위한 세포 공급원으로서 사용되는 경우, 마찬가지로 체세포를 그 환자, 또는 약물 감수성 및 부작용과 연관되는 동일한 유전자 다형성을 갖는 또다른 사람으로부터 수집하는 것이 바람직하다.

포유류, 예컨대 마우스 또는 인간으로부터 분리된 체세포는 세포의 종류에 따라 이의 배양에 적합한 그 자체로 공지된 배지를 이용하여 예비배양될 수 있다. 이러한 배지의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 약 5 내지 20% 소태아 혈청을 포함하는 최소 기본 배지 (MEM), Dulbecco 변형 필수 배지 (Dulbecco's modified Eagle medium; DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, F12 배지 등을 포함한다. 세포를 핵 재프로그래밍 물질과 (또한, 필요한 경우, 하기 iPS 확립 효율 개선제와) 접촉시킬 때 양이온성 리포솜과 같은 전달 시약을 사용하는 경우, 전달 효율 감소를 방지하기 위해 배지를 무혈청 배지로 교환하는 것이 때때로 바람직하다.

(d) 핵 재프로그래밍 물질을 체세포로 전달하는 방법

상기 (a) 에 기재한 "Klf4 를 대체할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질" 및 상기 (b) 에 기재한 "Klf4 와 조합되는 경우 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질" 의 체세포로의 전달은, 그 자체로 공지된 세포로의 단백질 전달 방법을 이용하여 수행할 수 있는데, 단, 물질이 단백질성 인자인 경우이다. 이러한 방법은, 예를 들어, 단백질 전달 시약을 이용하는 방법, 단백질 전달 도메인 (PTD)- 또는 세포 침투 펩티드 (CPP)- 융합 단백질을 이용하는 방법, 미세주입 방법 등을 포함한다. 단백질 전달 시약은 시판되며, 예를 들어 양이온성 지질 기재의 것, 예컨대 BioPOTER 단백질 전달 시약 (Genlantis), Pro-Ject^TM 단백질 트랜스펙션 시약 (PIERCE), PULSin^TM 전달 시약 (Polyplus-transfection) 및 ProVectin (IMGENEX); 지질 기재의 것, 예컨대 Profect-1 (Targeting Systems); 막-투과성 펩티드 기재의 것, 예컨대 Penetrain Peptide (Q biogene), Chariot Kit (Active Motif), 및 GenomONE (Ishihara Sangyo) (HVJ 외피 (비활성화된 센다이 (Sendai) 바이러스) 를 이용함) 등이다. 전달은 이들 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 달성될 수 있으며, 통상의 절차는 이하에 기술한다. 핵 재프로그래밍 물질(들)을 적당한 용매 (예를 들어, 완충액, 예컨대 PBS 또는 HEPES) 에 희석시키고, 전달 시약을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 약 5 내지 15 분 동안 인큐베이션하여 복합체를 형성하고, 이 복합체를 배지를 무혈청 배지로 교환한 후 세포에 첨가하고, 세포를 37℃ 에서 1 내지 수 시간 동안 인큐베이션한다. 그후, 배지를 제거하고 혈청-함유 배지로 교체한다.

발달된 PTD 는 단백질의 세포횡단 도메인을 이용하는 것 예컨대 초파리-유래 AntP, HIV-유래 TAT (Frankel, A. et al, Cell 55, 1189-93 (1988); Green, M. & Loewenstein, P.M. Cell 55, 1179-88 (1988)), Penetratin (Derossi, D. et al, J. Biol. Chem. 269, 10444-50 (1994)), Buforin II (Park, C. B. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 8245-50 (2000)), Transportan (Pooga, M. et al. FASEB J. 12, 67-77 (1998)), MAP (모델 양친매성 펩티드) (Oehlke, J. et al. Biochim. Biophys. Acta. 1414, 127-39 (1998)), K-FGF (Lin, Y. Z. et al. J. Biol. Chem. 270, 14255-14258 (1995)), Ku70 (Sawada, M. et al. Nature Cell Biol. 5, 352-7 (2003)), Prion (Lundberg, P. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 299, 85-90 (2002)), pVEC (Elmquist, A. et al. Exp. Cell Res. 269, 237-44 (2001)), Pep-1 (Morris, M. C. et al. Nature Biotechnol. 19, 1173-6 (2001)), Pep-7 (Gao, C. et al. Bioorg. Med. Chem. 10, 4057-65 (2002)), SynBl (Rousselle, C. et al. Mol. Pharmacol. 57, 679-86 (2000)), HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res. 60, 6551-6 (2000)), 및 HSV-유래 VP22 를 포함한다. PTD-유래 CPP 에는, 폴리아르기닌, 예컨대 11R [Cell Stem Cell, 4:381-384(2009)] 및 9R [Cell Stem Cell, 4:472-476(2009)] 이 포함된다.

핵 재프로그래밍 물질의 cDNA 및 PTD 또는 CPP 서열을 통합하고 있는 융합 단백질 발현 벡터를 제조하여 융합 단백질의 재조합 발현을 가능하게 하고, 이 융합 단백질을 회수하여 전달에 사용한다. 이러한 전달은, 단백질 전달 시약을 첨가하지 않는 것을 제외하고는, 상기 기술된 바와 같이 달성될 수 있다.

미세주입은, 종단 직경이 약 1 ㎛ 인 유리 바늘에 단백질 용액을 넣어 이 용액을 세포에 주사하는 방법으로서, 단백질을 세포에 확실히 전달한다.

다른 유용한 단백질 전달 방법은 전기천공, 반-무손상 세포 방법 [Kano, F. et al. Methods in Molecular Biology, Vol. 322, 357-365(2006)], Wr-t 펩티드를 이용하는 전달 [Kondo, E. et al., Mol. Cancer Ther. 3(12), 1623-1630(2004)] 등을 포함한다.

단백질 전달 작업은 하나 이상의 임의로 선택된 횟수 (예, 1 회 이상 내지 10 회 이하, 또는 1 회 이상 내지 5 회 이하, 등) 로 수행될 수 있고; 바람직하게는, 전달 작업은 2 회 이상 (예, 3 회 또는 4 회) 반복적으로 수행될 수 있다. 반복되는 전달의 시간 간격은 예를 들어 6 내지 48 시간, 바람직하게는 12 내지 24 시간이다.

iPS 세포 확립 효율에 주안점을 두는 경우, 핵 재프로그래밍 물질은 단백질성 인자 그 자체로서 보다는 이를 인코딩하는 핵산 형태로 사용되는 것이 바람직하다. 핵산은 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 키메라일 수 있고, 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 이중-가닥 DNA, 특히 cDNA 이다.

핵 재프로그래밍 물질의 cDNA 는 숙주 체세포에서 기능할 수 있는 프로모터를 포함하는 적당한 발현 벡터에 삽입된다. 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, 바이러스 벡터 예컨대 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스바이러스 및 센다이 바이러스, 동물 세포에서의 발현을 위한 플라스미드 (예를 들어, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo) 등을 포함한다.

사용되는 벡터의 종류는 수득되는 iPS 세포의 의도된 용도에 따라 적당히 선택될 수 있다. 유용한 벡터는, 예를 들어 아데노바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함한다.

발현 벡터에 사용되는 프로모터의 예는 EF1알파 프로모터, CAG 프로모터, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV (사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV (라우스 육종 바이러스) 프로모터, MoMuLV (몰로니 마우스 백혈병 바이러스) LTR, HSV-TK (헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터 등을 포함하고, EF1알파 프로모터, CAG 프로모터, MoMuLV LTR, CMV 프로모터, SRα 프로모터 등이 바람직하다.

발현 벡터는 원하는 경우 프로모터 외에도 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 선별 마커 유전자, SV 40 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 유용한 선별 마커 유전자의 예는 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 푸로마이신 내성 유전자 등을 포함한다.

핵산 재프로그래밍 물질로서의 핵산 (재프로그래밍 유전자) 은 상이한 발현 벡터로 개별적으로 통합될 수 있거나, 2 종류 이상, 바람직하게는 2 내지 3 종류의 유전자가 단일 발현 벡터에 통합될 수 있다. 전자는 높은 유전자 전달 효율을 제공하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용할 때 바람직하고, 후자는 플라스미드, 아데노바이러스 또는 에피솜 벡터 등을 이용할 때 바람직하다. 나아가, 두 종류 이상의 유전자를 통합하는 발현 벡터 및 하나의 유전자만을 통합하는 또다른 발현 벡터가 조합되어 사용될 수 있다.

상기 맥락에서, 복수의 유전자들이 하나의 발현 벡터에 통합되는 경우, 이들 유전자들은 바람직하게는 폴리시스트론 발현을 가능하게 하는 개재 서열을 통해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 폴리시스트론 발현을 가능하게 하는 개재 서열을 이용함으로써, 한 종류의 발현 벡터에 통합된 복수의 유전자를 더욱 효율적으로 발현시킬 수 있다. 폴리시스트론 발현을 가능하게 하는 유용한 서열은, 예를 들어 입발병 바이러스의 2A 서열 (SEQ ID NO:2; PLoS ONE 3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007), IRES 서열 (미국 특허 제 4,937,190 호) 등을 포함하며, 바람직하게는 2A 서열이다.

핵 재프로그래밍 물질로서의 핵산을 포함하는 발현 벡터는, 벡터 선택에 따라 그 자체로 공지된 기술에 의해 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터의 경우, 핵산을 함유하는 플라스미드를 적당한 패키징 (packaging) 세포 (예, Plat-E 세포) 또는 상보 세포주 (예, 293-세포) 에 도입하고, 배양 상청액에서 생성된 바이러스 벡터를 회수하고, 이 바이러스 벡터에 적합한 방법으로 이 벡터를 세포에 감염시킨다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터를 이용하는 구체적인 수단이 WO2007/69666, Cell, 126, 663-676 (2006) 및 Cell, 131, 861-872 (2007) 에 개시되어 있다. 렌티바이러스 벡터를 이용하는 구체적인 수단이 [Science, 318, 1917-1920 (2007)] 에 개시되어 있다. iPS 세포를 재생 의학의 세포 공급원으로서 이용하는 경우, 재프로그래밍 유전자가 세포의 염색체에 통합되지 않고 일시적으로 발현되는 것이 바람직한데, 그 이유는 재프로그래밍 유전자의 발현 (재활성화) 이 iPS 세포에서 분화된 세포로 재생된 조직에서 발암 위험을 증가시킬 수 있기 때문이다. 이러한 관점에서, 염색체로 드물게 통합되는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 아데노바이러스 벡터를 이용하는 구체적인 수단이 [Science, 322, 945-949 (2008)] 에 개시되어 있다. 아데노-연관 바이러스도 염색체로 통합되는 빈도가 낮고, 세포독성 및 염증 유도성이 아데노바이러스 벡터보다 더 낮으므로, 이는 또다른 바람직한 벡터로서 언급될 수 있다. 센다이 바이러스 벡터는 염색체 외부에서 안정적으로 존재할 수 있고, 필요한 경우 siRNA 를 이용하여 분해 및 제거될 수 있으므로, 이를 사용하는 것 또한 바람직하다. 센다이 바이러스 벡터와 관련하여, [J. Biol. Chem., 282, 27383-27391 (2007), Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85, 348-362(2009)] 또는 일본 특허 제 3602058 호에 기재된 것을 이용할 수 있다.

레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 경우, 이식유전자의 침묵 (silencing) 이 발생하더라도 그것은 재활성화될 수 있으므로; 예를 들어, 바람직하게는, 핵 재프로그래밍 물질을 인코딩하는 핵산이 불필요해진 경우 이를 Cre/loxP 시스템을 이용하여 절단하는 방법을 이용할 수 있다. 즉, 사전에 loxP 서열을 핵산의 양쪽 말단에 배열시키고, iPS 세포를 유도한 후, 플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 Cre 재조합효소가 세포에 작용하게 하여, loxP 서열 사이에 끼인 영역을 절단할 수 있다. LTR U3 영역의 인핸서-프로모터 서열은 삽입 돌연변이에 의해 그 근처의 숙주 유전자를 상향조절할 수 있으므로, 서열을 결실시키거나 서열을 예컨대 SV40 의 폴리아데닐화 서열로 치환시킴으로써 제조된 3'-자가-비활성화된 (SIN) LTR 을 이용하여, 게놈 내에 절단되지 않은 채 남아 있는 loxP 서열 밖의 LTR 에 의한 내생 유전자의 발현 조절을 막는 것이 더욱 바람직하다. Cre-loxP 시스템 및 SIN LTR 을 이용하는 구체적인 수단이 [Chang et al., Stem Cells, 27: 1042-1049 (2009)] 에 개시되어 있다.

한편, 비바이러스 벡터인 플라스미드 벡터는 리포펙션 방법, 리포솜 방법, 전기 천공 방법, 칼슘 포스페이트 공동침전 방법, DEAE 덱스트란 방법, 미세주입 방법, 유전자 총 (gun) 방법 등을 이용해 세포에 전달될 수 있다. 플라스미드를 벡터로서 이용하는 구체적인 수단이 예를 들어 [Science, 322, 949-953 (2008)] 등에 기재되어 있다.

플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 등을 사용하는 경우, 유전자 전달은 1 회 이상의 임의로 선택된 횟수 (예, 1 회 내지 10 회 또는 1 회 내지 5 회) 로 수행될 수 있다. 둘 이상의 종류의 발현 벡터를 체세포에 도입하는 경우, 이들 모든 종류의 발현 벡터가 동시에 체세포에 도입되는 것이 바람직하나; 이러한 경우에도, 트랜스펙션은 1 회 이상의 임의로 선택된 횟수 (예, 1 회 내지 10 회, 1 회 내지 5 회 등) 로 수행될 수 있고, 바람직하게는 트랜스펙션은 2 회 이상 (예, 3 회 또는 4 회) 반복적으로 수행될 수 있다.

아데노바이러스 또는 플라스미드를 사용하는 경우에도, 이식유전자가 염색체에 통합될 수 있으므로; 종국에는 서던 블롯팅 (Southern blotting) 또는 PCR 에 의해 유전자가 염색체에 삽입되지 않았음을 확인할 필요가 있다. 이러한 이유로, 상기 Cre-loxP 시스템과 같이, 이식유전자가 염색체에 통합된 후 유전자를 제거하는 수단을 이용하는 것이 유리할 수 있다. 또다른 바람직한 구현예에서, 트랜스포손을 이용하여 이식유전자가 염색체에 통합된 후, 플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스 벡터를 이용하여 트랜스포사아제가 세포에 작용하게 하여 이식유전자를 염색체에서 완전히 제거하는 방법이 사용될 수 있다. 바람직한 트랜스포손의 예로, piggyBac, 인시목 곤충 유래의 트랜스포손 등을 언급할 수 있다. piggyBac 트랜스포손을 이용하는 구체적인 수단이 [Kaji, K. et al., Nature, 458: 771-775 (2009); Woltjen et al., Nature, 458: 766-770 (2009)] 에 개시되어 있다.

또다른 바람직한 비-재조합 유형의 벡터는 염색체 외부에서 자율적으로 복제할 수 있는 에피솜 벡터이다. 에피솜 벡터를 사용하는 특정 과정은 [Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009)] 에 개시되어 있다. 요구되는 경우, 발현 벡터는 에피솜 벡터의 복제에 필수적인 벡터 요소의 5' 및 3' 측 둘 다에서 동일한 방향에 위치한 loxP 서열을 갖는 에피솜 벡터로 재프로그래밍 유전자를 삽입함으로써 구축될 수 있다.

에피솜 벡터의 예는, 벡터 요소로서, EBV, SV40 등으로부터 유래하는, 자율적 복제에 요구되는 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 구체적으로는, 자율적 복제에 요구되는 벡터 요소는, 복제를 조절하는 복제 기점에 결합하는 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 복제 기점이고; 예는 EBV 에 대한 복제 기점 oriP 및 EBNA-1 유전자, 및 SV40 에 대한 복제 기점 ori 및 SV40 거대 T 항원 유전자를 포함한다.

에피솜 발현 벡터는 재프로그래밍 유전자의 전사를 제어하는 프로모터를 함유한다. 사용되는 프로모터는 상기와 동일한 프로모터일 수 있다. 에피솜 발현 벡터는 상기 기재되는 바와 같이, 원한다면 인핸서, 폴리-A 첨가 신호, 선별 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커 유전자의 예는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 loxP 서열의 예는 재프로그래밍 유전자의 복제에 필수적인 벡터 요소를 샌드위칭하는 위치에서 동일한 방향에 위치할 때 재조합에 의해 loxP 서열 사이의 서열을 결실시킬 수 있는 임의로 선택되는 돌연변이 loxP 서열, 및 박테리오파지 P1-유래 야생형 loxP 서열 (SEQ ID NO: 17) 을 포함한다. 돌연변이 loxP 서열의 예는 lox71 (SEQ ID NO: 18) (5' 측 반복 서열에서 돌연변이를 가짐), lox66 (SEQ ID NO: 19) (3' 측 반복 서열에서 돌연변이를 가짐), lox2272, lox511 (이의 스페이서 부분에서 돌연변이를 가짐) 등을 포함한다. 벡터 요소의 5' 및 3' 측상에 위치하는 2 개의 loxP 서열이 동일하거나 동일하지 않더라도, 이의 스페이서 영역에서 돌연변이를 갖는 돌연변이 loxP 서열의 경우에는 동일한 것 (예: 한 쌍의 lox2272 서열, 한 쌍의 lox511 서열) 이 사용된다. 바람직하게는, 5' 측 반복 서열에서 돌연변이를 갖는 돌연변이 loxP 서열 (예: lox71) 및 3' 측 반복 서열에서 돌연변이를 갖는 돌연변이 loxP 서열 (예: lox66) 의 조합이 사용된다. 이 경우에서, 재조합 후 염색체 상에 남아 있는 loxP 서열은 5' 및 3' 측 상의 반복 서열에서 이중의 돌연변이를 갖고, 따라서 Cre 재조합효소에 의해 인지되기 쉽고; 따라서 원치 않는 재조합으로 인해 염색체 중에서 돌연변이 결실을 야기할 위험이 감소된다. lox71 및 lox66 둘 모두가 사용되는 경우, 돌연변이 loxP 서열 중 하나는 상기 언급된 벡터 요소의 5' 및 3' 측 상에서 위치할 수 있으나, 돌연변이 loxP 서열은 변이 위치가 loxP 서열의 외부 말단에 위치하도록 하는 방향에 삽입될 필요가 있다.

2 개의 loxP 서열은 재프로그래밍 유전자 복제에 필수적인 벡터 요소의 5' 및 3' 측 상의 동일한 방향 (즉, 복제 기점, 또는 이의 복제를 조절하기 위해 복제 기점에 결합하는 유전자 서열) 에 위치한다. loxP 서열 사이의 벡터 요소는 복제 기점, 또는 이의 복제를 조절하기 위해 복제 기점에 결합하는 단백질을 인코딩하는 유전자 서열, 또는 둘 다일 수 있다.

에피솜 벡터는 예를 들어, 리포펙션 방법, 리포솜 방법, 전기천공법, 칼슘 포스페이트 공동-침전 방법, DEAE 덱스트란 방법, 미세주입 방법, 유전자 총 방법 등을 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 [Science, 324: 797-801 (2009)] 에 기재된 방법이 사용될 수 있다.

재프로그래밍 유전자의 복제에 요구되는 벡터 요소가 iPS 세포로부터 제거되었는지 여부는, 벡터 요소의 내부의 및/또는 loxP 서열의 근처의 염기 서열을 포함하는 핵산을 프로브 또는 프라이머로서, iPS 세포로부터 단리되는 에피솜 분획을 주형으로서 사용하여, PCR 분석 또는 서던블롯 분석을 수행하여, 밴드의 존재 또는 부재 또는 탐지되는 밴드의 길이를 검사함으로써 확인될 수 있다. 에피솜 분획은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 [Science, 324: 797-801 (2009)] 에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

Klf4 와의 조합에 의해 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질이 저분자 화합물인 경우, 체세포로 이를 도입하는 것은 수성 또는 비수성 용매 중에 적정 농도로 물질을 용해시키고, 인간 또는 마우스로부터 단리되는 체세포의 배양에 적합한 배지 [예: 소태아혈청 약 5 내지 20 % 를 포함하는 최소 필수 배지 (MEM), Dulbecco 의 변형된 Eagle 배지 (DMEM), RPMI1640 배지, 199 배지, F12 배지 및 이의 조합 등] 에 상기 용액을 첨가하여 핵 재프로그래밍 물질의 농도가 체세포에서 핵 재프로그래밍을 야기하고 세포독성을 야기하지 않기에 충분한 범위가 되도록 하고, 소정의 기간 동안 세포를 배양함으로써 달성될수 있다. 핵 재프로그래밍 물질의 농도는 사용되는 핵 재프로그래밍 물질의 종류에 따라 다양하고, 약 0.1 nM 내지 약 100 nM 의 범위에 걸쳐 적정하게 선택된다. 접촉 지속기간은 세포의 핵 재프로그래밍을 야기하기에 충분하기만 하면 특별히 한정되지 않고; 통상적으로 핵 재프로그래밍 물질은 양성 콜로니가 출현할 때까지 배지중에서 동시에 존재하는 것이 허용될 수 있다.

(e) iPS 세포 확립 효능 개선제

최근, iPS 세포의 확립 효능을 개선시키는 많은 (기존에는 소수였던) 다양한 물질이 하나씩 제안되어 왔다. 따라서, 상기 기재된 핵 재프로그래핑 물질 외에도, iPS 세포의 확립 효능은 이들 iPS 세포 확립 효능 개선제를 체세포와 접촉시킴으로써 증가될 것으로 예상될 수 있다.

iPS 세포 확립 효능 개선제의 예는, 히스톤 디아세틸라제 (HDAC) 저해제 [예: 발프로산 (VPA) (Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)], 저분자 저해제, 예컨대 트리코스타틴 A, 나트륨 부티레이트, MC 1293 및 M344, 핵산-계 발현 저해제, 예컨대 HDAC 에 대항하는 siRNA 및 shRNA [예: HDAC1 siRNA Smartpool

(Millipore), HDACl (OriGene) 에 대항하는 HuSH 29mer shRNA 구축물 등) 등], DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제 (예: 5'-아자시티딘) [Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008)], G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제 저해제 [예: 저분자량 저해제, 예컨대 BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008), 핵산-계 발현 저해제, 예컨대 G9a 에 대항하는 siRNA 및 shRNA (예: G9a siRNA (인간) (Santa Cruz Biotechnology) 등) 등], L-채널 칼슘 작용제 (예: Bayk8644) [Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)], p53 저해제 [예: p53 에 대항하는 siRNA 및 shRNA (Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008)), UTFl [Cell Stem Cell, 3, 415-419 (2008)], Wnt 신호 유도제 (예, 가용성 Wnt3a) [Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)], 2i/LIF [2i 는 미토겐-활성화되는 단백질 키나제 신호전달 및 글리코겐 신타제 키나제-3 의 저해제임, PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008)]), ES 세포-특이적 miRNA [예: miR-302-367 클러스터 (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08), miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10), miR-291-3p, miR-294 및 miR-295 (이들은 [Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009)]에 기재되어 있음) 등을 포함한다 (이에 한정되지 않음). 상기 언급된 바와 같이, 핵산-계 발현 저해제는 siRNA 또는 shRNA 를 인코딩하는 DNA 를 포함하는 발현 벡터 형태일 수 있다.

상기 언급된 핵 재프로그래밍 물질의 구성성분 중에서, 예를 들어, SV40 거대 T 등은 또한 체세포 핵 재프로그래밍에 대한 필수 인자가 아닌 보조 인자로 간주되기 때문에 iPS 세포 확립 효능 개선제의 범위 내에 포함될 수 있다. 핵 프로그래밍에 대한 메카니즘이 여전히 불명확한 상황에서, 핵 재프로그래밍에 필수적이지 않은 보조 인자는 편리하게 핵 재프로그래밍 물질 또는 iPS 세포 확립 효능 개선제로서 여겨질 수 있다. 따라서, 체세포 핵 재프로그래밍 과정이 iPS 세포 확립 효능 개선제(들) 및 핵 재프로그래밍 물질(들)과 체세포를 접촉시킴으로써 초래되는 총체적 사건으로 이해되므로, 당업자는 핵 재프로그래밍 물질과 iPS 세포 확립 효능 개선제를 항상 구별할 필요가 없어 보인다.

iPS 세포 확립 효능 개선제를 체세포와 접촉시키는 것은 하기 각각의 경우에 상기 기재된 바와 같이 달성될 수 있다: (a) 개선제는 단백질성 인자이고, (b) 개선제는 단백질성 인자를 인코딩하는 핵산이고, (c) 개선제는 저분자 화합물이다.

체세포로부터의 iPS 세포 확립 효능이 개선제의 부재하에서와 비교하여 현저히 개선되는 한, iPS 세포 확립 효능 개선제는 체세포 및 핵 재프로그래밍 물질과 동시에 접촉되거나, 둘 중 하나와 미리 접촉될 수 있다. 한 구현예에서, 예를 들어, 핵 재프로그래밍 물질이 단백질성 인자를 인코딩하는 핵산이고 iPS 세포 확립 효능 개선제가 화학적 저해제인 경우, iPS 세포 확립 효능 개선제는 유전자 전달 처리 후 소정의 시간 동안 세포를 배양 한 후 배지에 첨가될 수 있는데, 이는 핵 재프로그래밍 물질이 유전자 전달 처리로부터 단백질성 인자의 대량 발현까지 소정의 시간 지연을 수반하는 한편, iPS 세포 확립 효능 개선제는 세포 상에서 신속하게 작용할 수 있기 때문이다. 또다른 구현예에서, 예를 들어 핵 재프로그래밍 물질 및 iPS 세포 확립 효능 개선제가 둘다 바이러스 또는 비바이러스 벡터 형태로 사용되는 경우, 둘다 동시에 세포로 도입될 수 있다.

(f) 배양 조건에 의한 확립 효능의 개선

iPS 세포의 확립 효능은 세포의 핵 재프로그래밍 단계에서 저산소 조건 하에서 체세포를 배양함으로써 추가로 개선될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 저산소 조건이란 세포 배양 동안 주위 대기에서의 산소 농도가 공기중의 산소 농도보다 현저히 더 낮은 것을 의미한다. 구체적으로는, 그러한 조건은 5 내지 10 % CO₂ / 95 내지 90 % 공기의 주위 대기에서의 산소 농도보다 더 낮은 산소 농도를 포함하고, 이는 통상적 세포 배양에 통상적으로 사용되며; 예를 들어, 주위 대기에서 18 % 이하인 산소 농도를 적용할 수 있다. 바람직하게는, 주위 대기에서 산소 농도는 15 % 이하 (예: 14 % 이하, 13 % 이하, 12 % 이하, 11 % 이하 등), 10 % 이하 (예: 9 % 이하, 8 % 이하, 7 % 이하, 6 % 이하 등), 또는 5 % 이하 (예: 4 % 이하, 3 % 이하, 2 % 이하 등) 이다. 주위 대기에서 산소 농도는 바람직하게는 0.1 % 이상 (예: 0.2 % 이상, 0.3 % 이상, 0.4 % 이상 등), 0.5 % 이상 (예: 0.6 % 이상, 0.7 % 이상, 0.8 % 이상, 0.9 % 이상 등), 또는 1 % 이상 (예: 1.1 % 이상, 1.2 % 이상, 1.3 % 이상, 1.4 % 이상 등) 이다.

세포 환경에서 저산소 조건을 만드는 방법에는 제한이 없고; 가장 용이한 적합한 방법은 산소 농도를 제어할 수 있는 CO₂ 인큐베이터에서 세포를 배양하는 것이다. 그러한 CO₂ 인큐베이터는 다수의 장비 제조사로부터 시판된다 (예: Thermo Scientific, Ikemoto Scientific Technology, Juji Field Inc., 및 Wakenyaku Co., Ltd. 사제 저산소 배양용 CO₂ 인큐베이터가 사용될 수 있음).

저산소 조건 하에서 세포 배양을 시작하는 시점은 정상 산소 농도 (20%) 에서 수득되는 것과 비교하여 iPS 세포의 확립 효능의 개선을 방해하지 않는 한, 특별히 한정되지 않는다. 시작 시각은 핵 재프로그래밍 물질을 체세포와 접촉시키기 전 또는 후일 수 있고, 접촉과 동시일 수 있다. 예를 들어, 저산소 조건 하에서의 세포 배양은 핵 재프로그래밍 물질을 체세포와 접촉시킨 직후, 또는 접촉 후 소정의 시간 (예: 1 내지 10 (예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9) 일 후) 이후 시작되는 것이 바람직할 수 있다.

저산소 조건 하에서의 세포 배양 기간은 정상 산소 농도 (20%) 에서 수득되는 것과 비교하여 iPS 세포 확립 효능을 개선시키는 것을 방해하지 않는 한, 특별히 한정되지 않으며, 예는 3 일 이상, 5 일 이상, 7 일 이상 또는 10 일 이상, 내지 50 일 이하, 40 일 이하, 35 일 이하 또는 30 일 이하를 포함한다 (이에 한정되지 않음). 저산소 조건 하의 세포 배양의 바람직한 지속기간은 또한 주위 대기 중의 산소 농도에 따라 다양하며; 당업자는 사용되는 산소 농도에 따라 세포 배양 지속기간을 적당히 조정할 수 있다. 본 발명의 구현예에서, iPS 세포 후보 콜로니가 지표로서의 약물 내성으로 선별되는 경우, 약물 선별의 시작에 의해 저산소 조건으로부터 정상 산소 농도로 복귀하는 것이 바람직할 수 있다.

더욱이, 바람직한 시작 시간 및 저산소 조건 하에서의 세포 배양 지속기간은 사용되는 핵 재프로그래밍 물질의 선택, 정상 산소 농도를 포함하는 조건하에서 iPS 세포 확립 효능, 및 다른 인자에 따라 다양하다.

핵 재프로그래밍 물질(들) (및 iPS 세포 확립 효능 개선제(들)) 을 세포와 접촉시킨 후, 세포는 예를 들어 ES 세포의 배양에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 마우스 세포의 경우, 배양은 분화 억제제로서의 백혈병 저해 인자 (Leukemia Inhibitory Factor (LIF)) 를 정상 배지에 첨가하여 수행된다. 한편, 인간 세포의 경우, LIF 대신 기본 섬유모세포 성장 인자 (bFGF) 및/또는 줄기 세포 인자 (SCF) 가 첨가되는 것이 바람직하다. 통상적으로, 피더 세포로서의, 세포 분열을 종결시키는 항생제 또는 방사선으로 처리된 마우스 배아-유래 섬유모세포 (MEF) 의 동시 존재 하에 세포가 배양된다. 통상적으로, STO 세포 등이 흔히 MEF 로서 사용되나, iPS 세포를 도입하는 경우, SNL 세포 [McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)] 등이 흔히 사용된다. 피더 세포와의 동시 배양은 핵 재프로그래밍 물질의 접촉 전, 접촉시 또는 접촉 후 (예: 1 내지 10 일 후) 에 시작할 수 있다.

iPS 세포의 후보 콜로니는 지표로서 약물 내성 및 리포터 활성을 이용하는 방법에 의해 선별될 수 있고, 또한 형태의 시각적 조사에 기초하는 방법에 의해 선별될 수 있다. 전자의 예로서, 약물 내성 및/또는 리포터 활성에 대한 양성 콜로니는 재조합 체세포를 사용하여 선별되고, 이때 약물 내성 유전자 및/또는 리포터 유전자는 다능성 세포에서 특이적으로 고도로 발현되는 유전자의 유전자자리 (예: Fbxl5, Nanog, Oct3/4 등, 바람직하게는 Nanog 또는 Oct3/4) 를 표적으로 한다. 그러한 재조합 체세포의 예는 βgeo (이는 β-갈락토시다제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제의 융합 단백질을 인코딩함) 유전자가 Fbx 15 유전자자리에서 녹-인된 마우스로부터의 MEF [Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006)], Nanog 유전자자리에 통합된 푸로마이신 내성 유전자 및 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 갖는 트랜스제닉 마우스로부터의 MEF [Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007)] 등을 포함한다. 한편, 형태의 시각적 조사를 기초로 하는 후자의 방법의 예는 [Takahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)] 에 기재된 방법을 포함한다. 리포터 세포를 사용하는 방법이 편리하고 효율적이지만, iPS 세포가 인간 치료를 목적으로 제조되는 경우 콜로니를 시각적 조사에 의해 선별하는 것이 안정성의 관점에서 바람직하다. 2 개의 인자 Oct3/4 및 Sox2 가 Klf4 와의 조합에 의해 iPS 세포를 유도할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질로서 사용되는 경우, 확립되는 클론의 수는 감소되지만, 생성되는 콜로니는 ES 세포와 비슷하게 높은 질의 iPS 세포로 이루어지므로, iPS 세포는 리포터 세포를 사용하지 않더라도 효율적으로 확립될 수 있다.

선별된 콜로니의 세포의 iPS 세포로서의 동정은 상기 기재된 Nanog (또는 Oct3/4) 리포터에 대한 양성 반응 (푸로마이신 내성, GFP 양성 등), 및 가시적인 ES 세포-유사 콜로니 형성에 의해 확인될 수 있으나; 정확도를 증가시키기 위해, 알칼린 포스파타제 염색, 다양한 ES 세포-특이적 유전자의 발현의 분석, 및 마우스에 선별 세포의 이식 및 기형종 형성의 확인과 같은 시험을 수행할 수 있다.

Klf4 를 대체할 수 있는 핵 재프로그래밍 물질이 IRX 패밀리의 일원, GLIS 패밀리의 일원, PTX 패밀리의 일원 및 DMRTB1 중에서 선별되는 단백질을 인코딩하는 핵산의 형태로 체세포로 전달되는 경우, 수득되는 iPS 세포는 외래 핵산이 거기에 함유된다는 점에서 종래에 공지된 iPS 세포와 구별되는 신규한 세포이다. 특히, 외래 핵산이 레트로바이러스, 렌티바이러스 등을 이용하여 체세포로 전달되는 경우, 외래 핵산은 보통 수득되는 iPS 세포의 게놈에 통합되어 외래 핵산을 함유하는 특징이 안정적으로 유지된다.

따라서, 확립되는 iPS 세포는 다양한 목적으로 제공될 수 있다. 예를 들어, iPS 세포의 많은 다양한 세포 (예: 심근 세포, 혈액 세포, 신경 세포, 혈관 내피 세포, 인슐린-분비 세포 등) 로의 분화는 보고되어 있는 ES 세포의 분화 유도 방법에 의해 유도될 수 있다. 따라서, 환자 또는 HLA 유형이 동일 또는 실질적으로 동일한 또다른 사람으로부터 수집된 체세포를 사용하여 iPS 세포를 유도하는 것은 이식에 기초한 줄기 세포 요법을 가능하게 하고, 이때 iPS 세포는 원하는 세포 (환자의 영향 받는 기관의 세포, 질병에 치료 효과를 갖는 세포 등) 로 분화되고, 분화된 세포는 환자에게 이식된다. 더욱이, iPS 세포로부터 분화되는 기능적 세포 (예: 간 세포) 는 상응하는 기존 세포주보다 생체내에서의 기능 세포의 실제 상태를 보다 양호하게 반영하는 것으로 여겨지므로, 이는 또한 약학적 후보 화합물 등의 효과 및 독성에 대한 시험관내 스크리닝에 적합하게 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더 상세히 기술되나, 본 발명은 그에 제한되지 않는다.

실시예

[실시예 1: 신규한 재프로그래밍 인자의 스크리닝]

Goshima 등에 의해 제작된 인간 Gateway^® 엔트리 클론 ([N. Goshima et al., Nature Methods, 2008] 에 기재된 라이브러리를 이용함. 데이터베이스는 [Y. Maruyama et al., Nucleic Acid Res., 2009] 에 개시됨) 을 사용하여, 도 1 에서 기술된 방법에 따라 인간 포괄적 유전자의 약 20000 클론 콘티그 (contig) 를 구축했다. 더 구체적으로, 인간 Gateway^® 엔트리 클론으로부터의 전장 ORF 를 포함하는 약 50000 클론의 blastp 검색을 80% 이상의 범위 (coverage) 및 95% 이상의 아미노산 동일성의 기준을 이용하여 NCBI RefSeq 37900 서열 (24200 유전자) 에 대해 수행했고, ORF 의 3' 말단에 정지 코돈이 있는 N-유형 또는 정지 코돈이 없는 F-유형 내에 중복되는 서열이 없는 약 20000 엔트리 클론으로 이루어진 서브라이브러리를 구축했다. 상기 약 20000 엔트리 클론 콘티그는 생물정보학 기술을 이용하여 단백질 키나제, 단백질 포스파타제, 전사 인자, GPCR 또는 기타 군의 클론으로 분류되며, 전사 인자의 엔트리 클론으로 이루어진 서브라이브러리 (모든 인간 전사 인자의 50% 이상을 포함함) 가 구축되었다 (도 1). 전사 인자의 상기 서브라이브러리로부터, 발현 클론 DNA 는 도 2 에 도시한 pMXs-GW 목적 벡터 (destination vector) 를 이용한 LR 반응으로 모든 엔트리 클론에 대해 제조하고, 상기 반응 용액을 대장균 (E. coli) DH5α 에 트랜스펙션시키고, 클로닝하고, 전사 인자 발현 라이브러리 (재프로그래밍 인자를 스크리닝하기 위한 전사 인자 발현 라이브러리) 를 구축했다. 또한, 인간 유전자, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 를 각각 동일한 pMXs-GW 에 통합시키고, 각 발현 클론을 구축했다. 재조합 레트로바이러스를 상기 DNA 로부터 생성하고, 이를 하기 실험에 이용했다.

iPS 세포의 유도 실험은 Nanog-GFP 마우스의 피부 섬유모세포를 이용해 수행했다 (Okita et al., Nature, 448, 313-317(2007)). 이와 관련하여, 실험은 하기 두 시스템에서 수행했다: 하나는 레트로바이러스의 감염을 MSTO (세포 분열을 정지한 미토마이신-C 처리 SNL 세포) 피더 세포 (feeder cell) 상에서 수행하는 시스템 (이후, MSTO 방법으로 지칭함, Cell, 126, 663-676 (2006)) 이고, 다른 하나는 피더 세포를 감염시 사용하지 않고, 세포를 감염 후 재파종한 후 배양을 MSTO 상에서 수행하는 시스템 (이후, 재파종 (Reseed) 방법으로 지칭함, Nature Biotech., 26, 101-106 (2008)) 이다.

첫번째 스크리닝을 위해, iPS 세포 유도를 24-웰 플레이트에서 수행했다. Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포를 Gelatin (재파종 방법) 또는 MSTO (MSTO 방법) 상에 파종하고, 다음날, 다양한 플라스미드에 의해 생산된 레트로바이러스로 감염시켰다 (제 0 일). 구체적으로, 세포를 3 가지 유전자, Oct3/4, Sox2 및 c-Myc, 및 상기 언급한 전사 인자 라이브러리로부터의 1 가지 유전자로, 1:1:1:1 의 비율로 감염시켰다. 음성 대조군으로서, 세포를 3 가지 유전자, Oct3/4, Sox2 및 c-Myc 로 1:1:1 의 비율로 감염시켰다. 양성 대조군으로서, 세포를 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 로 1:1:1:1 의 비율로 감염시켰다.

감염 제 2 일째가 될 때까지 세포를 10% FBS/DMEM 에서 배양하고, 제 3 일째부터는 ES 배양 배지 (Cell, 126, 663-676 (2006)) 에서 배양했다. 세포를 처음에 Gelatin 에 파종했을 때 (재파종 방법), 이들은 제 3 일째에 MSTO 상에 재파종했다. 그후, 배양 배지를 2 일마다 교체하고, 상기 세포들을 제 21 일째부터는 퓨로마이신 선별에 적용하고, 제 28 일째에 관찰했다. 그 결과, 샘플 FO9 (유전자 명칭: IRX6), 샘플 G06 (유전자 명칭: GLIS1), 샘플 H08 (유전자 명칭: DMRTB1), 또는 샘플 H1O (유전자 명칭: PITX2) 의 유전자가 각각 3 가지 유전자로 트랜스펙션된 웰에서, GFP-양성 콜로니가 나타났고, 마우스 iPS 세포의 확립이 확인되었다. 나아가, iPS 유도를 6-웰 플레이트를 이용하여 다시 수행했을 때, GFP-양성 콜로니가 또한 나타났고, 재현성이 확인되었다. 콜로니 형성, 제 1 계대 및 제 2 계대 시점 각각에서의 iPS 세포의 GFP-양성 콜로니 영상 및 상반전 영상이 도 3 및 4 에 나타나 있다.

상기 결과로부터, 상기 4 가지 인자들이 KIf4 를 대체하는 신규한 재프로그래밍 인자임이 확인되었다. 한편, 성체 마우스 피부 섬유모세포 대신 MEF 를 사용한 경우, iPS 세포 (GFP-양성 콜로니) 가 또한 확립되었다.

[실시예 2: 확립된 마우스 iPS 세포의 분석]

QIAGEN "Gentra Puregene Cell Kit" 및 PCR 효소 (Takara Ex Taq) 를 이용하여 게놈을 추출하고, 게놈-PCR 은 실시예 1 에서 확립한 iPS 세포를 이용하여 실시했다. 결과가 도 5 및 6 에 나타나 있다. 모든 iPS 세포에서, 오직 트랜스펙션된 유전자만이 게놈에 삽입되고, 트랜스펙션에 사용되지 않은 유전자들은 게놈에 삽입되지 않았음을 확인했다. 한편, G6-1 클론 (유전자 명칭: GLIS1) 에서, 트랜스펙션에 사용된 c-Myc 은 게놈에 삽입되지 않았다 (도 5). 레트로바이러스 벡터는 게놈에 삽입되지 않으면 안정하게 발현되지 않기 때문에, 상기 G6-1 클론은 3 가지 인자 Oct3/4, Sox2 및 GLIS1 만의 발현으로 확립된 것으로 추정된다.

후속하여, Rever Tra Ace kit (Takara) 를 이용하여 RT-PCR 분석을 실시했다. 결과는 도 7 및 8 에 나타나 있다. 실시예 1 에서 확립된 iPS 세포는 전부 ES 세포 특이적 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, Sox2, Rex1 및 ECAT1 을 발현했다. 상기 결과로부터, 신규한 재프로그래밍 인자를 이용해 확립된 세포는 iPS 세포인 것으로 확인되었다.

[실시예 3: 마우스 iPS 세포의 확립 및 분석 (2)]

실시예 1 과 동일한 방법을 이용하여, 하기 재프로그래밍 인자를 도입함으로써 마우스 iPS 세포를 확립했다. 실시예 1 과 동일한 Nanog-GFP 마우스 피부 섬유모세포를 사용하고, MSTO 방법 및 재파종 방법을 둘다 수행했다.

(1) Oct3/4, Sox2, c-Myc, 및 G6 (유전자 명칭: GLIS1)

(2) Oct3/4, Sox2, c-Myc, 및 H8 (유전자 명칭: DMRTB1)

(3) Oct3/4, Sox2, c-Myc, 및 H10 (유전자 명칭: PITX2)

(4) Oct3/4, Sox2, 및 G6

(5) Oct3/4, Sox2, 및 H8

(6) Oct3/4, Sox2, 및 H10

유전자 트랜스펙션 후 제 28 일째에 GFP-양성 콜로니의 수를 계수했다. 상기 (1) 내지 (3) 의 결과가 도 9 에 나타나 있다 (6 개 실험의 요약된 결과임). 오직 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 를 이용해서는 콜로니가 확립되지 않은 반면, 본 발명의 재프로그래밍 인자 (GLIS1, DMRTB1 또는 PITX2) 를 첨가함으로써 콜로니가 확립되었다. DMRTB1 를 첨가했을 때 특히 현저한 효과가 관찰되었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 상기 인자들은 재프로그래밍 인자임이 확인되었다.

상기 (4) 내지 (6) 의 결과가 도 10 에 나타나 있다 (2 개 실험의 요약된 결과임). 오직 2 가지 인자 (Oct3/4, Sox2) 를 이용해서는 콜로니가 확립되지 않은 반면, 본 발명의 재프로그래밍 인자 (GLIS1 또는 DMRTB1) 를 첨가함으로써 콜로니가 확립되었다. 한편, PITX2 를 첨가한 2 개 실험에서는 콜로니가 관찰되지 않았다.

콜로니 형성 (PO), 제 1 계대 (P1) 및 제 2 계대 (P2) 시점에서의 GFP-양성 콜로니 영상 및 각 iPS 세포의 상반전 영상이 도 11 에 나타나 있다.

후속하여, QIAGEN "Gentra Puregene Cell Kit", 및 PCR 효소 (Takara Ex Taq) 를 이용하여 게놈을 추출하고, 게놈-PCR 을 상기 확립된 iPS 세포를 이용하여 실시했다. 결과가 도 12 에 나타나 있다. 모든 iPS 세포에서, 오직 트랜스펙션된 유전자만이 게놈으로 삽입되고, 트랜스펙션에 사용되지 않은 유전자들은 게놈에 삽입되지 않음을 확인했다. 한편, 트랜스펙션에 사용된 c-Myc 는 3 가지 인자 + G6 (GLIS1) 를 이용한 실험에서 게놈으로 삽입되지 않았다 (도 12 의 좌측 맨 끝). 레트로바이러스 벡터는 게놈에 삽입되지 않으면 안정하게 발현되지 않으므로, 상기 클론은 오직 3 가지 인자 Oct3/4, Sox2 및 GLIS1 의 발현으로 확립된 것으로 추정된다.

후속하여, Rever Tra Ace kit (Takara) 을 이용하여 RT-PCR 분석을 실시했다. 결과가 도 13 에 나타나 있다. 상기 확립된 iPS 세포는 전부 ES 세포 특이적 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, Sox2, Rex1 및 ECAT1 을 발현했다. 상기 결과로부터, 신규한 재프로그래밍 인자를 이용하여 확립된 세포들은 iPS 세포인 것으로 확인되었다.

[실시예 4: 마우스 iPS 세포의 확립 및 분석 (3)]

실시예 3 에서와 동일한 방법을 이용하여, Oct3/4 및 c-Myc 를 본 발명의 재프로그래밍 인자 (G6 (GLIS1), H8 (DMRTB1) 또는 H1O (PITX2)) 와 조합해 도입함으로써 마우스 iPS 세포를 확립했다. 그 결과, Oct3/4, c-Myc 및 H10 (PITX2) 의 조합에서, GFP-양성 콜로니 (iPS 콜로니) 가 검출되었다. 콜로니 형성 (PO), 제 1 계대 (P1) 및 제 2 계대 (P2) 시점에서의 GFP-양성 콜로니 영상 및 iPS 콜로니의 상반전 영상이 도 14 에 나타나 있다.

후속하여, QIAGEN "Gentra Puregene Cell Kit", 및 PCR 효소 (Takara Ex Taq) 를 이용하여 게놈을 추출하고, 상기 확립된 iPS 세포를 이용하여 게놈-PCR 을 실시했다. 결과가 도 15 에 나타나 있다. 확립된 iPS 세포에서, 오직 트랜스펙션된 유전자만이 게놈으로 삽입되고, 트랜스펙션에 사용되지 않은 유전자는 게놈에 삽입되지 않음을 확인했다.

후속하여, Rever Tra Ace kit (Takara) 를 이용하여 RT-PCR 분석을 실시했다. 결과가 도 16 에 나타나 있다. 상기 확립된 iPS 세포는 ES 세포 특이적 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, Sox2, Rex1 및 ECAT1 을 발현했다. 상기 결과로부터, 신규한 재프로그래밍 인자를 이용해 확립된 세포는 iPS 세포인 것으로 확인되었다.

[실시예 5: 마우스 iPS 세포의 확립 및 분석 (4)]

섬유모세포 (MEF) 를 태아 Nanog-GFP 마우스 (수정 후 13.5 일째) 로부터 단리했다. 하기의 재프로그래밍 인자들을 실시예 3 및 4 에서와 동일한 기술을 이용하여 상기 MEF 로 도입했다.

(1) Oct3/4, Sox2, c-Myc, 및 G6 (유전자 명칭: GLIS1)

(2) Oct3/4, Sox2, c-Myc, 및 H8 (유전자 명칭: DMRTB1)

(3) Oct3/4, Sox2, c-Myc, 및 H10 (유전자 명칭: PITX2)

(4) Oct3/4, Sox2, 및 G6

(5) Oct3/4, Sox2, 및 H8

(6) Oct3/4, Sox2, 및 H10

GFP-양성 콜로니의 수를 유전자 트랜스펙션 28 일 후 계수했다. 상기 (1) 내지 (3) 의 결과가 도 17 에 나타나 있다 (4 개 실험의 요약된 결과임). 오직 3 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, c-Myc) 로는 콜로니가 거의 확립되지 않은 한편, 본 발명의 재프로그래밍 인자 (GLIS1, DMRTB1 또는 PITX2) 를 첨가하여 콜로니가 확립되었고, 특히 현저한 효과가 DMRTB1 을 첨가했을 때 관찰되었다.

상기 (4) 내지 (6) 의 결과가 도 18 에 나타나 있다 (1 개 실험의 결과). 오직 2 가지 인자 (Oct3/4, Sox2) 를 이용해서는 콜로니가 확립되지 않은 한편, 본 발명의 재프로그래밍 인자 (GLIS1, DMRTB1 또는 PITX2) 를 첨가하여 콜로니가 확립되었다. 특히 현저한 효과가 DMRTB1 을 첨가했을 때 관찰되었다.

콜로니 형성 (PO), 제 1 계대 (P1) 및 제 2 계대 (P2) 시점에서의 각 iPS 세포의 GFP-양성 콜로니 영상 및 상반전 영상이 도 19 에 나타나 있다.

후속하여, QIAGEN "Gentra Puregene Cell Kit", 및 PCR 효소 (Takara Ex Taq) 를 이용하여 게놈을 추출하고, 상기 확립된 iPS 세포를 이용하여 게놈-PCR 을 실시했다. 상기 (1) 내지 (3) 의 결과가 도 20 에 나타나 있다. 모든 iPS 세포에서, 오직 트랜스펙션된 유전자만 게놈으로 삽입되고, 트랜스펙션에 사용되지 않은 유전자는 게놈으로 삽입되지 않음이 확인되었다.

후속하여, Rever Tra Ace kit (Takara) 을 이용하여 RT-PCR 분석을 실시했다. 상기 (1) 내지 (3) 의 결과가 도 21 에 나타나 있다. 상기 확립된 iPS 세포는 전부 ES 세포 특이적 마커 유전자 Nanog, Oct3/4, Sox2, Rex1 및 ECAT1 을 발현했다. 상기 결과로부터, 신규한 재프로그래밍 인자를 이용하여 확립된 세포는 iPS 세포인 것으로 확인되었다.

[실시예 6: 기형종의 생성 및 키메라 마우스의 생성]

상기 언급한 실시예에서 확립된 성체 마우스 (Nanog-GFP 마우스) 의 피부 섬유모세포로부터의 하기 iPS 세포 클론을 사용하여 기형종을 생성했다.

G6-1 클론: 3 가지 인자, Oct3/4, Sox2 및 G6 (GLIS1) 을 이용하여 확립

G6-6 클론: 4 가지 인자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 G6 (GLIS1) 을 이용하여 확립

H8-2 클론: 4 가지 인자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 H8 (DMRTB1) 을 이용하여 확립

H1O 클론: 4 가지 인자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 H1O (PITX2) 을 이용하여 확립

기형종의 생성은 [Cell, 126, 663-676 (2006)] 에 기재된 방법에 따라 수행했다. 구체적으로, 1×10⁶ iPS 세포를 면역 결핍 마우스에 피하 주사하고, 그로부터 4 주 후 기형종을 단리했다. 상기 기형종으로부터, 상기 기재된 것과 동일한 방법으로 게놈을 추출하고, PCR 효소 (Takara Ex Taq) 를 이용해 게놈-PCR 을 실시했다. 결과가 도 22 에 나타나 있다. 모든 기형종에서, 오직 트랜스펙션된 유전자만 게놈에 삽입되고, 트랜스펙션에 사용되지 않은 유전자는 게놈에 삽입되지 않았음을 확인했다.

후속하여, 상기 기형종을 절단하여, 4% 포름알데히드를 포함하는 PBS (-) 에 고정시켰다. 파라핀 내입 조직을 얇게 잘라, 헤마톡실린-에오신으로 염색했다. 결과가 도 23 및 24 에 나타나 있다. 조직학적 관점에서, 종양은 여러 유형의 세포로 이루어져 있으며, 지방 조직, 횡문근 조직, 각질 조직, 섬모 원주 상피 조직, 신경 조직, 연골, 콜라겐 섬유 조직, 평활근 조직 등이 관찰되었으므로, iPS 세포의 다능성이 증명되었다.

더욱이, 상기 iPS 세포의 ICR 마우스 유래 수정체로의 미세주입 결과, 성체 키메라가 생성되었다.

[실시예 7: 마이크로어레이 분석]

본 발명의 신규한 재프로그래밍 인자 (G6, H8, H1O) 를 이용해 확립된 iPS 세포와 종래의 4 가지 인자 (Oct3/4, Sox2, KIf4, c-Myc) 를 이용하여 확립된 iPS 세포 사이에 유전자 발현에 있어서 차이가 있는지 여부를 조사하기 위해 DNA 마이크로어레이 분석을 실시했다. [Cell, 131, 861-872 (2007)] 에 기재된 기술에 따라, 하기 기재된 iPS 세포 및 MEF 유래 전체 RNA 를 이용하여 분석을 실시했다.

K-G6: 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 G6 의 MEF 로의 트랜스펙션에 의해 확립된 iPS 세포 (제 5 계대)

K-H8: 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 H8 의 MEF 로의 트랜스펙션에 의해 확립된 iPS 세포 (제 5 계대)

K-H10: 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 H1O 의 MEF 로의 트랜스펙션에 의해 확립된 iPS 세포 (제 5 계대)

4F: 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 KIf4 의 MEF 로의 트랜스펙션에 의해 확립된 iPS 세포 (제 5 계대)

MEF: 트랜스펙션에 사용된 MEF 세포 (제 1 계대)

산포도 결과가 도 25 내지 27 에 나타나 있다 (배수 변화 선: 2-배). 추가적으로, 각 세포 사이의 상관 계수가 표 2 에 나타나 있고, 상관 계수를 기준으로 한 군집화 결과가 도 28 에 나타나 있다.

표 2

본 발명의 신규한 재프로그래밍 인자를 이용하여 확립된 iPS 세포가 전부 종래의 4 가지 인자를 이용해 확립된 iPS 세포의 것과 유사한 유전자 발현 패턴을 나타낸다는 사실로부터, 본 발명의 iPS 세포가 4 가지 인자로 확립된 iPS 세포와 필적한다는, 즉 본 발명의 재프로그래밍 인자가 KIf4 를 대체하는 것으로 나타났다.

[실시예 8: 인간 iPS 세포의 확립 및 분석 (1)]

[Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)] 에 기재된 방법에 따라, 마우스 에코트로픽 바이러스 수용체 Slc7a1 유전자를 성인 또는 신생아 인간 피부 섬유모세포 (HDF) 에서 렌티바이러스 (pLenti6/UbC-Slc7a1) 를 이용하여 발현시켰다. [Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)] 에 기재된 방법에 따라 레트로바이러스를 이용하여 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 G6 (GLIS1) 을 상기 세포 (1×10⁵ 세포/웰, 6 웰 플레이트) 에 트랜스펙션했다. 추가적으로, 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 KIf4 의 트랜스펙션을 대조군으로서 실시했다.

세포를 바이러스 감염 6 일 후 수집하고, 피더 세포 상에 재파종했다 (5×10⁵ 세포/100 ㎜ 디쉬). 세포 분열이 정지된 미토마이신 C 처리된 SNL 세포 (McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) 를 피더 세포로 이용했다. 감염 7 일째부터, 세포를 4 ng/㎖ 의 재조합 인간 bFGF (WAKO) 를 함유하는 영장류 ES 세포 배양 배지 (ReproCELL) 에서 배양했다. 감염 약 35 일째의 iPS 세포의 콜로니 영상이 도 29 에 나타나 있고, 제 2 계대 iPS 세포의 콜로니 영상이 도 30 에 나타나 있다. Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 G6 (GLIS1) 으로 확립된 iPS 세포는 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 KIf4 로 확립된 iPS 세포의 것과 유사한 ES 세포-유사 형태를 나타냈다. 더욱이, 이들은 알칼리성 포스파타제 활성에 대해 양성이었다.

후속하여, QIAGEN "Gentra Puregene Cell Kit" 및 PCR 효소 (Takara Ex Taq) 를 이용하여 게놈을 추출하고, 상기 확립된 iPS 세포를 이용하여 게놈-PCR 을 실시했다. 결과가 도 31 에 나타나 있다. 확립된 iPS 세포에서, 오직 트랜스펙션된 유전자만이 게놈에 삽입되고, 트랜스펙션에 사용되지 않은 유전자들은 게놈에 삽입되지 않음을 확인했다.

후속하여, Rever Tra Ace kit (Takara) 를 이용하여 RT-PCR 분석을 실시했다. 결과가 도 32 에 나타나 있다. 확립된 iPS 세포는 전부 ES 세포 특이적 마커 유전자 Oct3/4, Sox2 및 Rex1 을 발현했다. 상기 결과로부터, 신규한 재프로그래밍 인자 G6 (GLIS1) 을 이용하여 확립된 세포가 iPS 세포임을 확인했다.

[실시예 9: 인간 iPS 세포의 확립 및 분석 (2)]

실시예 8 에서와 동일한 기술을 이용하여, 3 가지 유전자, Oct3/4, Sox2 및 H8 (DMRTB1), 또는 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 H1O (PITX2) 을, 레트로바이러스를 이용해 치수 줄기 세포에 트랜스펙션했다 (J. Dent. Res., 87(7): 676-681 (2008)). 추가로, 4 가지 유전자, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 KIf4 을 대조군으로서 트랜스펙션했다.

실시예 8 에서와 동일한 기술을 이용하여, 감염 후 약 35 일째의 배양된 iPS 세포의 콜로니 영상이 도 33 에 나타나 있고, 제 1 계대 iPS 세포의 콜로니 영상이 도 34 (Oct3/4, Sox2, H8) 및 도 37 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, H1O) 에 나타나 있다. 확립된 iPS 세포는 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 KIf4 를 이용해 확립된 iPS 세포의 것과 유사한, ES 세포-유사 형태를 나타냈다. 더욱이, 그들은 알칼리성 포스파타제 활성에 대해 양성이었다.

후속하여, QIAGEN "Gentra Puregene Cell Kit" 및 PCR 효소 (Takara Ex Taq) 를 이용하여 게놈을 추출하고, 상기 확립된 iPS 세포를 이용하여 게놈-PCR 을 실시했다. 결과가 도 35 (Oct3/4, Sox2, H8) 및 도 38 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, H1O) 에 나타나 있다. 확립된 iPS 세포에서, 오직 트랜스펙션된 유전자만이 게놈에 삽입되고, 트랜스펙션에 사용되지 않은 유전자는 게놈에 삽입되지 않음을 확인했다.

후속하여, Rever Tra Ace kit (Takara) 를 이용하여 RT-PCR 분석을 실시했다. 결과가 도 36 (Oct3/4, Sox2, H8) 및 도 39 (Oct3/4, Sox2, c-Myc, H1O) 에 나타나 있다. 확립된 iPS 세포는 ES 세포 특이적 마커 유전자 Oct3/4, Sox2, Nanog 및 Rex1 을 발현했다. 상기 결과로부터, 신규한 재프로그래밍 인자 H8 (DMRTB1) 및 H1O (PITX2) 를 이용해 확립된 세포는 인간 iPS 세포인 것으로 확인되었다.

[실시예 10: 기형종의 생성]

4 가지 인자 Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 G6 (GLIS1) 의 HDF 로의 도입에 의해 확립된 인간 iPS 세포를 Scid 마우스의 고환에 삽입하고, 그의 다능성 분화에 대해 시험했다. 구체적으로, 상기 언급한 iPS 세포를 먼저 재조합 인간 bFGF (4 ng/㎖) 및 Rho 키나제 저해제 Y-27632 (10 μM) 를 포함하는 영장류 ES 세포 배양 배지 (ReproCELL, Cosmo Bio) 에서 배양했다. 1 시간 후, 세포를 콜라겐 IV 로 시험하고, 수집한 후, 원심분리로 회수하고, Y-27632 (10 μM) 를 포함하는 DMEM/F12 에 현탁시켰다. 1/4 양의 컨플루언트 (confluent) 세포 (100 ㎜ 디쉬) 를 Scid 마우스의 고환에 주입했다. 2 내지 3 개월 후, 종양을 절단하고, 4% 포름알데히드를 포함하는 PBS (-) 를 이용해 고정했다. 파라핀 내입 조직을 얇게 잘라, 헤마톡실린-에오신으로 염색했다. 결과가 도 40 에 나타나 있다. 조직학적 관점에서, 종양은 여러 유형의 세포로 이루어졌으며, 그것이 연골, 상피 평활근, 상피 및 신경 조직과 같은 3 가지 배엽으로 분화되었으므로, iPS 세포의 다능성이 증명되었다.

본 발명은 바람직한 구현예에 역점을 두고 기재되었지만, 상기 바람직한 구현예가 변형될 수 있다는 점이 당업자에게 자명하다. 본 발명은 본 발명이 본 명세서에서 상세하게 기재된 것 외의 방법으로 구현될 수 있다는 점을 의도한다. 따라서, 본 발명은 첨부된 "특허청구범위" 의 요지 및 범위에 속하는 모든 변형을 포함한다.

특허 및 특허 출원을 포함하는 본원에 인용된 임의의 공개문헌들에 개시된 내용들은 그것이 본원에 개시된 정도까지 본원에 그 전부가 참고로 포함된다.

본 출원은 미국 가 특허 출원 번호 제 61/208,853 호 및 제 61/276,123 호를 기초로 하며, 상기 출원들의 내용은 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Kyoto University NATIONAL INSTITUTE OF ADVANCED INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY JAPAN BIOLOGICAL INFORMATICS CONSORTIUM <120> Novel Nuclear Reprogramming Substance <130> 091497 <150> US 61/208,853 <151> 2009-02-27 <150> US 61/276,123 <151> 2009-09-08 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2337 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (534)..(1874) <400> 1 gggtcagggt ttttgacgtt cctcgccagc tgcacaaacc tcccggagca agtgtgagtg 60 tgggtgagag tgcgcgcgcg cgcacgggct ggctgcgctt ggcacgcttg gtggcccagg 120 gtcccggggc ccggggtccc gtctggcggc ccgggattac cgtgacgtca cattgagcct 180 ctggccacct tggactggga cacctccgga gcctcacagc cccgcgccgc gccgcgcctc 240 acctcgccac cacgcgcctt tgggaacccg catcttcttc cttcccctgc ccatccatgg 300 gcccttctgt cttccggacc ccacgggccg gaggggcgcc ttccggagcg cagggctcgg 360 cagccgggct gccctcggct ctgcctccac tggggccaac caggcgaagg aaccggcgct 420 gggcatccgc agcggtgtaa ggaactgaga cacctcactg ctgggggcgc ggaacagctg 480 ggctgagacg ggaactcgac agggaagaga gagacgggcc agggacagcc acc atg 536 Met 1 tcc ttc cca cac ttt gga cac ccg tac cgc ggc gct tcc cag ttt ctg 584 Ser Phe Pro His Phe Gly His Pro Tyr Arg Gly Ala Ser Gln Phe Leu 5 10 15 gcg tcg gca agt tcc agc acc aca tgc tgc gaa tct acc caa cgc tct 632 Ala Ser Ala Ser Ser Ser Thr Thr Cys Cys Glu Ser Thr Gln Arg Ser 20 25 30 gtc tca gat gtg gca tca ggc tcc acc cca gcg ccc gct ctc tgc tgc 680 Val Ser Asp Val Ala Ser Gly Ser Thr Pro Ala Pro Ala Leu Cys Cys 35 40 45 gca ccc tac gat agt cga ctg ctg ggc agt gcg cga ccg gag ctg ggc 728 Ala Pro Tyr Asp Ser Arg Leu Leu Gly Ser Ala Arg Pro Glu Leu Gly 50 55 60 65 gcc gcc ttg ggc atc tat gga gca ccc tat gcg gcc gct gca gct gcc 776 Ala Ala Leu Gly Ile Tyr Gly Ala Pro Tyr Ala Ala Ala Ala Ala Ala 70 75 80 cag agc tac cct ggc tac ctg ccc tat agc cca gag ccc ccc tca ctg 824 Gln Ser Tyr Pro Gly Tyr Leu Pro Tyr Ser Pro Glu Pro Pro Ser Leu 85 90 95 tat ggg gca ctg aat cca cag tat gaa ttt aag gag gct gca ggg agt 872 Tyr Gly Ala Leu Asn Pro Gln Tyr Glu Phe Lys Glu Ala Ala Gly Ser 100 105 110 ttt aca tcc agc ctg gca caa cca gga gcc tat tat ccc tat gag cgg 920 Phe Thr Ser Ser Leu Ala Gln Pro Gly Ala Tyr Tyr Pro Tyr Glu Arg 115 120 125 act ctg ggg cag tac caa tat gaa cgg tat ggc gca gtg gaa ttg agt 968 Thr Leu Gly Gln Tyr Gln Tyr Glu Arg Tyr Gly Ala Val Glu Leu Ser 130 135 140 145 ggc gcc ggt cgc cga aag aac gcg acc cgg gag acc acc agt aca ctc 1016 Gly Ala Gly Arg Arg Lys Asn Ala Thr Arg Glu Thr Thr Ser Thr Leu 150 155 160 aag gcc tgg ctc aac gag cac cgc aaa aac ccc tac ccc act aag ggt 1064 Lys Ala Trp Leu Asn Glu His Arg Lys Asn Pro Tyr Pro Thr Lys Gly 165 170 175 gag aag atc atg ctg gcc atc atc acc aag atg acc ctc acc cag gtg 1112 Glu Lys Ile Met Leu Ala Ile Ile Thr Lys Met Thr Leu Thr Gln Val 180 185 190 tcc acc tgg ttc gcc aac gca cgc cgg cgc ctc aag aaa gag aac aaa 1160 Ser Thr Trp Phe Ala Asn Ala Arg Arg Arg Leu Lys Lys Glu Asn Lys 195 200 205 atg aca tgg gcg ccc aag aac aaa ggt ggg gag gag agg aag gca gag 1208 Met Thr Trp Ala Pro Lys Asn Lys Gly Gly Glu Glu Arg Lys Ala Glu 210 215 220 225 gga gga gag gag gac tca cta ggc tgc cta act gct gac acc aaa gaa 1256 Gly Gly Glu Glu Asp Ser Leu Gly Cys Leu Thr Ala Asp Thr Lys Glu 230 235 240 gtt act gct agc cag gag gcc cgg ggg ctc cgg ctg agt gac ctg gaa 1304 Val Thr Ala Ser Gln Glu Ala Arg Gly Leu Arg Leu Ser Asp Leu Glu 245 250 255 gac ctg gag gaa gag gag gag gag gag gag gaa gct gaa gac gag gag 1352 Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp Glu Glu 260 265 270 gta gtg gcc aca gct ggg gac agg ctg acg gag ttc cga aag ggc gcg 1400 Val Val Ala Thr Ala Gly Asp Arg Leu Thr Glu Phe Arg Lys Gly Ala 275 280 285 cag tca ctg cct ggg ccg tgc gct gca gct cga gag ggc cga ttg gag 1448 Gln Ser Leu Pro Gly Pro Cys Ala Ala Ala Arg Glu Gly Arg Leu Glu 290 295 300 305 cgc agg gag tgc ggc ctg gct gcg ccc cgc ttc tcc ttc aat gac cct 1496 Arg Arg Glu Cys Gly Leu Ala Ala Pro Arg Phe Ser Phe Asn Asp Pro 310 315 320 tcc gga tcg gaa gaa gct gac ttc ctc tcg gcg gag aca ggc agc cct 1544 Ser Gly Ser Glu Glu Ala Asp Phe Leu Ser Ala Glu Thr Gly Ser Pro 325 330 335 agg ttg acc atg cac tac cca tgc ttg gag aaa ccg cgc atc tgg tct 1592 Arg Leu Thr Met His Tyr Pro Cys Leu Glu Lys Pro Arg Ile Trp Ser 340 345 350 ctg gcg cac acc gcg aca gcc agc gct gtt gaa ggt gca ccc cca gcc 1640 Leu Ala His Thr Ala Thr Ala Ser Ala Val Glu Gly Ala Pro Pro Ala 355 360 365 cgg cct agg cca cga agt cct gag tgc cgt atg att cct gga cag cct 1688 Arg Pro Arg Pro Arg Ser Pro Glu Cys Arg Met Ile Pro Gly Gln Pro 370 375 380 385 cct gcc tct gcc cgg cga ctc tca gtc ccc aga gac tcc gcg tgc gac 1736 Pro Ala Ser Ala Arg Arg Leu Ser Val Pro Arg Asp Ser Ala Cys Asp 390 395 400 gag tct tcc tgc ata ccc aaa gcc ttt gga aac ccc aag ttt gcc ctg 1784 Glu Ser Ser Cys Ile Pro Lys Ala Phe Gly Asn Pro Lys Phe Ala Leu 405 410 415 cag gga cta ccg ctg aac tgt gcg ccg tgc ccg cgg agg agc gag cct 1832 Gln Gly Leu Pro Leu Asn Cys Ala Pro Cys Pro Arg Arg Ser Glu Pro 420 425 430 gta gtg cag tgc cag tac ccg tct gga gca gaa gca ggt tag 1874 Val Val Gln Cys Gln Tyr Pro Ser Gly Ala Glu Ala Gly 435 440 445 cgcaatggct gcgatttgcg aaagaatctt ggaaatgggc cccacgtttc gaattcatct 1934 ccaggttaag aagctgccag accttgccag ggaccaggag ctctcacttt gcctaagaga 1994 cagacacaca gaaaccctcc tagcagctgt ccttgcacgc agagctgggg tggtgggccg 2054 acttgaacct tagcagtccc cacgggagat ggcagggcac cttggggaag gccaagtggg 2114 aggctgggag gctgccccac ccaccgactc taccaagtct ctcttcctcc tgtggattca 2174 gcaaggcttc ctctcctgct cacccctgtc tctcacctcc accaacccca ctcactttgt 2234 aacttcatca ctgacccggc caataaggac cctgtgcgtc ttctccccct cctaagccct 2294 tgtgtcctta aaaataatca gtccgaaccc atgtaaaaaa aaa 2337 <210> 2 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Phe Pro His Phe Gly His Pro Tyr Arg Gly Ala Ser Gln Phe 1 5 10 15 Leu Ala Ser Ala Ser Ser Ser Thr Thr Cys Cys Glu Ser Thr Gln Arg 20 25 30 Ser Val Ser Asp Val Ala Ser Gly Ser Thr Pro Ala Pro Ala Leu Cys 35 40 45 Cys Ala Pro Tyr Asp Ser Arg Leu Leu Gly Ser Ala Arg Pro Glu Leu 50 55 60 Gly Ala Ala Leu Gly Ile Tyr Gly Ala Pro Tyr Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gln Ser Tyr Pro Gly Tyr Leu Pro Tyr Ser Pro Glu Pro Pro Ser 85 90 95 Leu Tyr Gly Ala Leu Asn Pro Gln Tyr Glu Phe Lys Glu Ala Ala Gly 100 105 110 Ser Phe Thr Ser Ser Leu Ala Gln Pro Gly Ala Tyr Tyr Pro Tyr Glu 115 120 125 Arg Thr Leu Gly Gln Tyr Gln Tyr Glu Arg Tyr Gly Ala Val Glu Leu 130 135 140 Ser Gly Ala Gly Arg Arg Lys Asn Ala Thr Arg Glu Thr Thr Ser Thr 145 150 155 160 Leu Lys Ala Trp Leu Asn Glu His Arg Lys Asn Pro Tyr Pro Thr Lys 165 170 175 Gly Glu Lys Ile Met Leu Ala Ile Ile Thr Lys Met Thr Leu Thr Gln 180 185 190 Val Ser Thr Trp Phe Ala Asn Ala Arg Arg Arg Leu Lys Lys Glu Asn 195 200 205 Lys Met Thr Trp Ala Pro Lys Asn Lys Gly Gly Glu Glu Arg Lys Ala 210 215 220 Glu Gly Gly Glu Glu Asp Ser Leu Gly Cys Leu Thr Ala Asp Thr Lys 225 230 235 240 Glu Val Thr Ala Ser Gln Glu Ala Arg Gly Leu Arg Leu Ser Asp Leu 245 250 255 Glu Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp Glu 260 265 270 Glu Val Val Ala Thr Ala Gly Asp Arg Leu Thr Glu Phe Arg Lys Gly 275 280 285 Ala Gln Ser Leu Pro Gly Pro Cys Ala Ala Ala Arg Glu Gly Arg Leu 290 295 300 Glu Arg Arg Glu Cys Gly Leu Ala Ala Pro Arg Phe Ser Phe Asn Asp 305 310 315 320 Pro Ser Gly Ser Glu Glu Ala Asp Phe Leu Ser Ala Glu Thr Gly Ser 325 330 335 Pro Arg Leu Thr Met His Tyr Pro Cys Leu Glu Lys Pro Arg Ile Trp 340 345 350 Ser Leu Ala His Thr Ala Thr Ala Ser Ala Val Glu Gly Ala Pro Pro 355 360 365 Ala Arg Pro Arg Pro Arg Ser Pro Glu Cys Arg Met Ile Pro Gly Gln 370 375 380 Pro Pro Ala Ser Ala Arg Arg Leu Ser Val Pro Arg Asp Ser Ala Cys 385 390 395 400 Asp Glu Ser Ser Cys Ile Pro Lys Ala Phe Gly Asn Pro Lys Phe Ala 405 410 415 Leu Gln Gly Leu Pro Leu Asn Cys Ala Pro Cys Pro Arg Arg Ser Glu 420 425 430 Pro Val Val Gln Cys Gln Tyr Pro Ser Gly Ala Glu Ala Gly 435 440 445 <210> 3 <211> 2380 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (634)..(1953) <400> 3 acttctcccg gggaatttgg agagggtctg tgtgcgcgcg cgcgcgtgag ctgcaggcga 60 aagagggtag gatctagcgg cgagtcgagg gtcagggtct ttgacgtttc tcgcccgttg 120 cacaaacctc gcagagcaag aacgagtgta tccgagagtg cgtgcatgta cacgggctgg 180 ctgcccttgg cacactcggt ggcccggggc cccggggccc gcggtcccct ctggcggccg 240 gggattaccg tgacgtcacg ttgagcctct ggccaccttg gactgggaca cctcgggaac 300 ctcacagccc gacgctgcgc tgtacctcac cttgcccctg cgcgcctttg gcaccctact 360 ccttcttcct aattctgccg ccgatccatg ggcccctctg ccttctggaa cccacaggcc 420 gtaggggtgc cttaccaatc gcagaactcg gcagcccctc tgcctttgat tctgcctccc 480 gtctctcccc tcctgccaac gaactggcgg ccagctcctg cagccctgta agaaaaccag 540 acgctgcgct gcgctgctgg ggtcatcgaa tcacagagct gagcaaggga ctcgaaagga 600 aagagggact caagtccctg aagacgccct gct atg gcc ttt tca cct ttt gga 654 Met Ala Phe Ser Pro Phe Gly 1 5 cac ccg tat ggc agc aca tcc cag ttt ctg gtg tct gca agt tcc agt 702 His Pro Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Phe Leu Val Ser Ala Ser Ser Ser 10 15 20 gcc act tgc tgc gaa acg gcc cct cgg cca gtg tca gat gtg gcc tca 750 Ala Thr Cys Cys Glu Thr Ala Pro Arg Pro Val Ser Asp Val Ala Ser 25 30 35 gcc tcc acc tct gcc tct act ctt tgc tgt aca ccc tat gac agt cgg 798 Ala Ser Thr Ser Ala Ser Thr Leu Cys Cys Thr Pro Tyr Asp Ser Arg 40 45 50 55 ctg ctg ggc agt gct cgg cca gag ctg gga gct gcc ttg ggc atc tat 846 Leu Leu Gly Ser Ala Arg Pro Glu Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ile Tyr 60 65 70 gga gca ccc tat gca gct gcc cag agt tac cct ggg tac ctg acc tat 894 Gly Ala Pro Tyr Ala Ala Ala Gln Ser Tyr Pro Gly Tyr Leu Thr Tyr 75 80 85 ggc cca gag cca ccc aca ctg tgt ggc gca ctg aat cct cag tat gag 942 Gly Pro Glu Pro Pro Thr Leu Cys Gly Ala Leu Asn Pro Gln Tyr Glu 90 95 100 ttc aag gat gct gca gga agc ttt gcc ccc agc ctg acc cag cca ggg 990 Phe Lys Asp Ala Ala Gly Ser Phe Ala Pro Ser Leu Thr Gln Pro Gly 105 110 115 gcc tac tac ccc tat gaa aca act ctg ggg cag tat caa tac gac agg 1038 Ala Tyr Tyr Pro Tyr Glu Thr Thr Leu Gly Gln Tyr Gln Tyr Asp Arg 120 125 130 135 tat ggc gga gtg gaa ttg agc agt gct ggc cgc agg aag aat gcc aca 1086 Tyr Gly Gly Val Glu Leu Ser Ser Ala Gly Arg Arg Lys Asn Ala Thr 140 145 150 agg gag agc acc agc gca ctg aag gcc tgg ctc cac gag cac cgc aag 1134 Arg Glu Ser Thr Ser Ala Leu Lys Ala Trp Leu His Glu His Arg Lys 155 160 165 aac ccg tac ccc acc aag ggc gag aag atc atg ctg gcc atc atc acc 1182 Asn Pro Tyr Pro Thr Lys Gly Glu Lys Ile Met Leu Ala Ile Ile Thr 170 175 180 aag atg acc ctc acc cag gtg tcc acc tgg ttc gcc aac gcg cgc cgg 1230 Lys Met Thr Leu Thr Gln Val Ser Thr Trp Phe Ala Asn Ala Arg Arg 185 190 195 cgc ctc aag aag gag aac aag atg aca tgg gcg ccc aag aac aag gga 1278 Arg Leu Lys Lys Glu Asn Lys Met Thr Trp Ala Pro Lys Asn Lys Gly 200 205 210 215 ggg gag gag agg aaa gca gac agt gga gaa gac tct ctg gga tgc ctg 1326 Gly Glu Glu Arg Lys Ala Asp Ser Gly Glu Asp Ser Leu Gly Cys Leu 220 225 230 aat ggt gac acc aaa gat gct act gcc agc cag gaa gcc cgg ggg ctg 1374 Asn Gly Asp Thr Lys Asp Ala Thr Ala Ser Gln Glu Ala Arg Gly Leu 235 240 245 agg ctg agt gac ctg gaa gac ctg gag gaa gag gag gaa gag gaa gaa 1422 Arg Leu Ser Asp Leu Glu Asp Leu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 250 255 260 gca gag gag gag gca gcg gtc tca gca gca cgc agg ctg gcg gat ttt 1470 Ala Glu Glu Glu Ala Ala Val Ser Ala Ala Arg Arg Leu Ala Asp Phe 265 270 275 cag aag agc acg caa ccc ctg cct gct ccc tgc gcc gcc gcc cag gag 1518 Gln Lys Ser Thr Gln Pro Leu Pro Ala Pro Cys Ala Ala Ala Gln Glu 280 285 290 295 aga tgc ttg gag agc aga gag tgc ggc ctg ggg cta ccc cgt ttc tct 1566 Arg Cys Leu Glu Ser Arg Glu Cys Gly Leu Gly Leu Pro Arg Phe Ser 300 305 310 ttt act gag gcc cca caa tca ggg gaa gct gac ttc atc aca gca gag 1614 Phe Thr Glu Ala Pro Gln Ser Gly Glu Ala Asp Phe Ile Thr Ala Glu 315 320 325 cca ggc ggc ccc acg atg atc tta cac tac cca agt ggc cac aaa ccc 1662 Pro Gly Gly Pro Thr Met Ile Leu His Tyr Pro Ser Gly His Lys Pro 330 335 340 cgc att tgg tcc tta gct cac act gcg gca gcc agc gct gtc gaa agt 1710 Arg Ile Trp Ser Leu Ala His Thr Ala Ala Ala Ser Ala Val Glu Ser 345 350 355 gct ccc tca act ccg ccc agg gca caa agt cca gag tgc cac atg att 1758 Ala Pro Ser Thr Pro Pro Arg Ala Gln Ser Pro Glu Cys His Met Ile 360 365 370 375 ccc aga cag ccc agt tct atc agg cga ctc ctg gta ccc aga gac tcc 1806 Pro Arg Gln Pro Ser Ser Ile Arg Arg Leu Leu Val Pro Arg Asp Ser 380 385 390 gaa ggc gaa gag gat tct cct gca gcc aaa gct ttt gga aac tcc acg 1854 Glu Gly Glu Glu Asp Ser Pro Ala Ala Lys Ala Phe Gly Asn Ser Thr 395 400 405 ttc acc ctg cag ggg ctg cca ctg aac tgt gca cca tac ccg agg cgg 1902 Phe Thr Leu Gln Gly Leu Pro Leu Asn Cys Ala Pro Tyr Pro Arg Arg 410 415 420 aga gag cct gaa gtg cgg ttc cag tac cca tct gga gca gaa gca ggt 1950 Arg Glu Pro Glu Val Arg Phe Gln Tyr Pro Ser Gly Ala Glu Ala Gly 425 430 435 tag tgcaatggct gcggtttgca gaagactttt ggaaatggct gcttccggat 2003 ccacattcat attaagaagt ttccagacct tggcatggac tgggagctct cactttgcct 2063 gtgacaaaca cacagaacca tcctagctgt atcttgcacg caggactggg gacaggccag 2123 atgacacaca cctcatcaga cttggaggag agaaggtggg agaccttggg ggaaagccct 2183 gtgtgtgctc acaggatact ttgaccaagt ctctcttcct cccatgaatg gaggccctga 2243 gcagcatctc ctcctgctca cccacccctg cccagcccac tcactgtgta actttcttgc 2303 tgaaatggtc tccaaggact gtctgtgtct ccttcctctt ccccggctct accttcaaaa 2363 ataacttagc tgagtcc 2380 <210> 4 <211> 439 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Ala Phe Ser Pro Phe Gly His Pro Tyr Gly Ser Thr Ser Gln Phe 1 5 10 15 Leu Val Ser Ala Ser Ser Ser Ala Thr Cys Cys Glu Thr Ala Pro Arg 20 25 30 Pro Val Ser Asp Val Ala Ser Ala Ser Thr Ser Ala Ser Thr Leu Cys 35 40 45 Cys Thr Pro Tyr Asp Ser Arg Leu Leu Gly Ser Ala Arg Pro Glu Leu 50 55 60 Gly Ala Ala Leu Gly Ile Tyr Gly Ala Pro Tyr Ala Ala Ala Gln Ser 65 70 75 80 Tyr Pro Gly Tyr Leu Thr Tyr Gly Pro Glu Pro Pro Thr Leu Cys Gly 85 90 95 Ala Leu Asn Pro Gln Tyr Glu Phe Lys Asp Ala Ala Gly Ser Phe Ala 100 105 110 Pro Ser Leu Thr Gln Pro Gly Ala Tyr Tyr Pro Tyr Glu Thr Thr Leu 115 120 125 Gly Gln Tyr Gln Tyr Asp Arg Tyr Gly Gly Val Glu Leu Ser Ser Ala 130 135 140 Gly Arg Arg Lys Asn Ala Thr Arg Glu Ser Thr Ser Ala Leu Lys Ala 145 150 155 160 Trp Leu His Glu His Arg Lys Asn Pro Tyr Pro Thr Lys Gly Glu Lys 165 170 175 Ile Met Leu Ala Ile Ile Thr Lys Met Thr Leu Thr Gln Val Ser Thr 180 185 190 Trp Phe Ala Asn Ala Arg Arg Arg Leu Lys Lys Glu Asn Lys Met Thr 195 200 205 Trp Ala Pro Lys Asn Lys Gly Gly Glu Glu Arg Lys Ala Asp Ser Gly 210 215 220 Glu Asp Ser Leu Gly Cys Leu Asn Gly Asp Thr Lys Asp Ala Thr Ala 225 230 235 240 Ser Gln Glu Ala Arg Gly Leu Arg Leu Ser Asp Leu Glu Asp Leu Glu 245 250 255 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Glu Glu Ala Ala Val Ser Ala 260 265 270 Ala Arg Arg Leu Ala Asp Phe Gln Lys Ser Thr Gln Pro Leu Pro Ala 275 280 285 Pro Cys Ala Ala Ala Gln Glu Arg Cys Leu Glu Ser Arg Glu Cys Gly 290 295 300 Leu Gly Leu Pro Arg Phe Ser Phe Thr Glu Ala Pro Gln Ser Gly Glu 305 310 315 320 Ala Asp Phe Ile Thr Ala Glu Pro Gly Gly Pro Thr Met Ile Leu His 325 330 335 Tyr Pro Ser Gly His Lys Pro Arg Ile Trp Ser Leu Ala His Thr Ala 340 345 350 Ala Ala Ser Ala Val Glu Ser Ala Pro Ser Thr Pro Pro Arg Ala Gln 355 360 365 Ser Pro Glu Cys His Met Ile Pro Arg Gln Pro Ser Ser Ile Arg Arg 370 375 380 Leu Leu Val Pro Arg Asp Ser Glu Gly Glu Glu Asp Ser Pro Ala Ala 385 390 395 400 Lys Ala Phe Gly Asn Ser Thr Phe Thr Leu Gln Gly Leu Pro Leu Asn 405 410 415 Cys Ala Pro Tyr Pro Arg Arg Arg Glu Pro Glu Val Arg Phe Gln Tyr 420 425 430 Pro Ser Gly Ala Glu Ala Gly 435 <210> 5 <211> 2816 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (568)..(2430) <400> 5 cactgtgtac tgagactgga tgcatccttg caataaaaaa gaggttgatc acgacaaatg 60 tgaaccccgc cgttataaaa acagccatca tggctgtaaa tgccaaaaag cagtcagtct 120 tgtaacttga aaaaaaaaaa aaaggaattg tagattgtgc gcatggactc ggagtggggg 180 cggtggacag taagtcatga tgttttggtg gtaccacctg gttgaatttc ttcatctgaa 240 taagaagctc ctgtgatgtt ctggggaggc cttggaaggc tagcgcatcc ctcatagaaa 300 gtgaatggga gctacggaca ccgtaccccg ggctcagaga agagcctgct ggacctggac 360 cttgctgagg gccctggccc cacctgctgc cagggcctgt ttctccctgc aggaagccca 420 ccgccccggg ctcaccccca agcttgtgag aggctgctgc atttccccca ccctgacagg 480 tcacctagac cccaggccac gtatgtgaac ggcagcctcc caaccacaca acacatcaaa 540 caggagtcct tgcccgacta ccaagcc atg gca gag gcc cgc aca tcc ctg tct 594 Met Ala Glu Ala Arg Thr Ser Leu Ser 1 5 gcc cac tgt cgg ggc ccg ctg gcc act ggc ctg cac cca gac ctg gac 642 Ala His Cys Arg Gly Pro Leu Ala Thr Gly Leu His Pro Asp Leu Asp 10 15 20 25 ctc ccg ggc cga agc ctc gcc acc cct gcg cct tcc tgc tac ctt ctg 690 Leu Pro Gly Arg Ser Leu Ala Thr Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu 30 35 40 ggc agc gaa ccc agc tct ggc ctg ggc ctc cag ccc gag acc cac ctc 738 Gly Ser Glu Pro Ser Ser Gly Leu Gly Leu Gln Pro Glu Thr His Leu 45 50 55 ccc gag ggc agc ctg aag cgg tgc tgc gtc ttg ggc cta ccc ccc acc 786 Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg Cys Cys Val Leu Gly Leu Pro Pro Thr 60 65 70 tcc cca gcc tcc tcc tca ccc tgt gcc tcc tcc gac gtc acc tcc atc 834 Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro Cys Ala Ser Ser Asp Val Thr Ser Ile 75 80 85 atc cgc tcc tcc cag acg tct ctg gtc acc tgt gta aat gga ctc cgg 882 Ile Arg Ser Ser Gln Thr Ser Leu Val Thr Cys Val Asn Gly Leu Arg 90 95 100 105 agc ccc cct ctg acg gga gat ctg ggg ggc cct tcc aag cgg gcc cgg 930 Ser Pro Pro Leu Thr Gly Asp Leu Gly Gly Pro Ser Lys Arg Ala Arg 110 115 120 cct ggc cct gca tcg acg gac agc cat gag ggc agc ttg caa ctt gaa 978 Pro Gly Pro Ala Ser Thr Asp Ser His Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu 125 130 135 gcc tgc cgg aag gcg agc ttc ctg aag cag gaa ccc gcg gat gag ttt 1026 Ala Cys Arg Lys Ala Ser Phe Leu Lys Gln Glu Pro Ala Asp Glu Phe 140 145 150 tca gag ctc ttt ggg cct cac cag cag ggc ctg ccg ccc ccc tat ccc 1074 Ser Glu Leu Phe Gly Pro His Gln Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro 155 160 165 ctg tct cag ttg ccg cct ggc cca agc ctt gga ggc ctg ggg ctg ggc 1122 Leu Ser Gln Leu Pro Pro Gly Pro Ser Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly 170 175 180 185 ctg gca ggc agg gtg gtg gcc ggg cgg cag gcg tgc cgc tgg gtg gac 1170 Leu Ala Gly Arg Val Val Ala Gly Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp 190 195 200 tgc tgt gca gcc tat gag cag cag gag gag ctg gtg cgg cac atc gag 1218 Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln Gln Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu 205 210 215 aag agc cac atc gac cag cgc aag ggc gag gac ttc acc tgc ttc tgg 1266 Lys Ser His Ile Asp Gln Arg Lys Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp 220 225 230 gct ggc tgc gtg cgc cgc tac aag ccc ttc aac gcc cgc tac aag ctg 1314 Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr Lys Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu 235 240 245 ctc atc cac atg cga gtg cac tcg ggc gag aag ccc aac aag tgc atg 1362 Leu Ile His Met Arg Val His Ser Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met 250 255 260 265 ttt gaa ggc tgc agc aag gcc ttc tca cgg ctg gag aac ctc aag atc 1410 Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile 270 275 280 cac ctg agg agc cac acg ggc gag aag ccg tac ctg tgc cag cac ccg 1458 His Leu Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro 285 290 295 ggt tgc cag aag gcc ttc agc aac tcc agc gac cgc gcc aag cac cag 1506 Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser Asn Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln 300 305 310 cgc acc cac cta gac acg aag ccg tac gcc tgt cag atc cct ggc tgc 1554 Arg Thr His Leu Asp Thr Lys Pro Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys 315 320 325 tcc aag cgc tac aca gac ccc agc tcc ctc cgc aag cac gtc aag gcc 1602 Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser Ser Leu Arg Lys His Val Lys Ala 330 335 340 345 cat tca gcc aaa gag cag cag gtg cgt aag aag ctg cat gcg ggc cct 1650 His Ser Ala Lys Glu Gln Gln Val Arg Lys Lys Leu His Ala Gly Pro 350 355 360 gac acc gag gcc gac gtc ctg acc gag tgt ctg gtc ctg cag cag ctc 1698 Asp Thr Glu Ala Asp Val Leu Thr Glu Cys Leu Val Leu Gln Gln Leu 365 370 375 cac acg tcc aca cag ctg gct gcc agc gac ggc aag ggt ggc tgt ggc 1746 His Thr Ser Thr Gln Leu Ala Ala Ser Asp Gly Lys Gly Gly Cys Gly 380 385 390 ctg ggc cag gag ctg ctc cca ggt gtg tat cct ggc tcc atc acc ccc 1794 Leu Gly Gln Glu Leu Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Thr Pro 395 400 405 cat aac gga ctt gca tcg ggc ctc ctg ccc cca gcg cac gac gta cct 1842 His Asn Gly Leu Ala Ser Gly Leu Leu Pro Pro Ala His Asp Val Pro 410 415 420 425 tcc agg cac cac ccg ctg gat gcc acc acc agt tcc cac cac cat ctg 1890 Ser Arg His His Pro Leu Asp Ala Thr Thr Ser Ser His His His Leu 430 435 440 tcc cct ctg ccc atg gct gag agc acc cgg gat ggg ttg ggg ccc ggc 1938 Ser Pro Leu Pro Met Ala Glu Ser Thr Arg Asp Gly Leu Gly Pro Gly 445 450 455 ctc ctc tca cca ata gtc agc ccc ctg aag ggg ctg ggg cca ccg ccg 1986 Leu Leu Ser Pro Ile Val Ser Pro Leu Lys Gly Leu Gly Pro Pro Pro 460 465 470 ctg ccc cca tcc tct cag agc cat tct ccg ggg ggc cag ccc ttc ccc 2034 Leu Pro Pro Ser Ser Gln Ser His Ser Pro Gly Gly Gln Pro Phe Pro 475 480 485 aca ctc ccc agc aag ccg tcc tac cca ccc ttc cag agc cct cca ccc 2082 Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Phe Gln Ser Pro Pro Pro 490 495 500 505 ccg cct ctg ccc agc cca caa ggt tac cag ggc agt ttc cac tcc atc 2130 Pro Pro Leu Pro Ser Pro Gln Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His Ser Ile 510 515 520 cag agt tgc ttc ccc tat ggc gac tgc tac cgg atg gct gaa cca gca 2178 Gln Ser Cys Phe Pro Tyr Gly Asp Cys Tyr Arg Met Ala Glu Pro Ala 525 530 535 gcc ggt ggg gac gga ctg gtc ggg gag acc cac ggt ttc aac ccc ctg 2226 Ala Gly Gly Asp Gly Leu Val Gly Glu Thr His Gly Phe Asn Pro Leu 540 545 550 cgg ccc aat ggc tac cac agc ctc agc acg ccc ttg cct gcc aca ggc 2274 Arg Pro Asn Gly Tyr His Ser Leu Ser Thr Pro Leu Pro Ala Thr Gly 555 560 565 tat gag gcc ctg gct gag gcc tca tgc ccc aca gcg ctg cca cag cag 2322 Tyr Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ser Cys Pro Thr Ala Leu Pro Gln Gln 570 575 580 585 cca tct gaa gat gtg gtg tcc agc ggc ccc gag gac tgt ggc ttc ttc 2370 Pro Ser Glu Asp Val Val Ser Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly Phe Phe 590 595 600 ccc aat gga gcc ttt gac cac tgc ctg ggc cac atc ccc tcc atc tac 2418 Pro Asn Gly Ala Phe Asp His Cys Leu Gly His Ile Pro Ser Ile Tyr 605 610 615 aca gac acc tga aggagccccc acatgcgcct gcccatccag cactgcagat 2470 Thr Asp Thr 620 gccacctcgc ccacctgctg tcgctcccac cctccgtgca cctagcagga gtgccaggcc 2530 acagccggaa cagccaggcc atgacccagg ggagccagcg ctgccacccc acccagcgct 2590 gccagggagc cgccatccga gcttgagctg ggcgcacaga ggtgcccgcc aggatctgtg 2650 gccctgtaac attccctcga tcttgtcttc ccgttcctcc ccgcagtggt tttgaaatca 2710 cagacctcgt gtatataaaa tatgcagaac ttgttttccg ttcccctgcc agttttatat 2770 ttttggtttt acaagaaaaa acattaaaaa ctggaaagga gatgtg 2816 <210> 6 <211> 620 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Glu Ala Arg Thr Ser Leu Ser Ala His Cys Arg Gly Pro Leu 1 5 10 15 Ala Thr Gly Leu His Pro Asp Leu Asp Leu Pro Gly Arg Ser Leu Ala 20 25 30 Thr Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu Gly Ser Glu Pro Ser Ser Gly 35 40 45 Leu Gly Leu Gln Pro Glu Thr His Leu Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg 50 55 60 Cys Cys Val Leu Gly Leu Pro Pro Thr Ser Pro Ala Ser Ser Ser Pro 65 70 75 80 Cys Ala Ser Ser Asp Val Thr Ser Ile Ile Arg Ser Ser Gln Thr Ser 85 90 95 Leu Val Thr Cys Val Asn Gly Leu Arg Ser Pro Pro Leu Thr Gly Asp 100 105 110 Leu Gly Gly Pro Ser Lys Arg Ala Arg Pro Gly Pro Ala Ser Thr Asp 115 120 125 Ser His Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Ala Cys Arg Lys Ala Ser Phe 130 135 140 Leu Lys Gln Glu Pro Ala Asp Glu Phe Ser Glu Leu Phe Gly Pro His 145 150 155 160 Gln Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Leu Ser Gln Leu Pro Pro Gly 165 170 175 Pro Ser Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ala Gly Arg Val Val Ala 180 185 190 Gly Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln 195 200 205 Gln Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu Lys Ser His Ile Asp Gln Arg 210 215 220 Lys Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr 225 230 235 240 Lys Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu Leu Ile His Met Arg Val His 245 250 255 Ser Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala 260 265 270 Phe Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile His Leu Arg Ser His Thr Gly 275 280 285 Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser 290 295 300 Asn Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln Arg Thr His Leu Asp Thr Lys 305 310 315 320 Pro Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro 325 330 335 Ser Ser Leu Arg Lys His Val Lys Ala His Ser Ala Lys Glu Gln Gln 340 345 350 Val Arg Lys Lys Leu His Ala Gly Pro Asp Thr Glu Ala Asp Val Leu 355 360 365 Thr Glu Cys Leu Val Leu Gln Gln Leu His Thr Ser Thr Gln Leu Ala 370 375 380 Ala Ser Asp Gly Lys Gly Gly Cys Gly Leu Gly Gln Glu Leu Leu Pro 385 390 395 400 Gly Val Tyr Pro Gly Ser Ile Thr Pro His Asn Gly Leu Ala Ser Gly 405 410 415 Leu Leu Pro Pro Ala His Asp Val Pro Ser Arg His His Pro Leu Asp 420 425 430 Ala Thr Thr Ser Ser His His His Leu Ser Pro Leu Pro Met Ala Glu 435 440 445 Ser Thr Arg Asp Gly Leu Gly Pro Gly Leu Leu Ser Pro Ile Val Ser 450 455 460 Pro Leu Lys Gly Leu Gly Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ser Ser Gln Ser 465 470 475 480 His Ser Pro Gly Gly Gln Pro Phe Pro Thr Leu Pro Ser Lys Pro Ser 485 490 495 Tyr Pro Pro Phe Gln Ser Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Pro Gln 500 505 510 Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His Ser Ile Gln Ser Cys Phe Pro Tyr Gly 515 520 525 Asp Cys Tyr Arg Met Ala Glu Pro Ala Ala Gly Gly Asp Gly Leu Val 530 535 540 Gly Glu Thr His Gly Phe Asn Pro Leu Arg Pro Asn Gly Tyr His Ser 545 550 555 560 Leu Ser Thr Pro Leu Pro Ala Thr Gly Tyr Glu Ala Leu Ala Glu Ala 565 570 575 Ser Cys Pro Thr Ala Leu Pro Gln Gln Pro Ser Glu Asp Val Val Ser 580 585 590 Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly Phe Phe Pro Asn Gly Ala Phe Asp His 595 600 605 Cys Leu Gly His Ile Pro Ser Ile Tyr Thr Asp Thr 610 615 620 <210> 7 <211> 2904 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (222)..(2591) <400> 7 ggggacccag tggcgtccga atccgggagc tctggggtgg cgcggggctc gccgaggggc 60 gaggcgaatt tgggggccct gaggcctcgc tctcgcggga atgatgctgg aaatgatgct 120 gaggctccgg cgtgagactt gcggctgccg gcggagcgga gtgtgagccg gtgaatgggg 180 agcctggcgc gacccccagc cgtgcgcccc gccccggcgc c atg cat tgc gag gtg 236 Met His Cys Glu Val 1 5 gcc gag gca ctt tcg gac aag agg cca aag gag gcc cct ggt gct cct 284 Ala Glu Ala Leu Ser Asp Lys Arg Pro Lys Glu Ala Pro Gly Ala Pro 10 15 20 ggc cag ggc cgc ggg cct gtc agc ctg gga gcg cac atg gcc ttc agg 332 Gly Gln Gly Arg Gly Pro Val Ser Leu Gly Ala His Met Ala Phe Arg 25 30 35 att gct gtg agt ggt ggc ggc tgc ggg gac ggg aac ccg cta gac ctg 380 Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Cys Gly Asp Gly Asn Pro Leu Asp Leu 40 45 50 ctg cct cgg cta ccg gtg cca cca cca cgt gcc cac gat ctc ctt cgg 428 Leu Pro Arg Leu Pro Val Pro Pro Pro Arg Ala His Asp Leu Leu Arg 55 60 65 ccc cgg agc cct cga gac tat ggt gtg tcc aag acc ggc agc ggg aag 476 Pro Arg Ser Pro Arg Asp Tyr Gly Val Ser Lys Thr Gly Ser Gly Lys 70 75 80 85 gtg aac ggg agc tac ggg cac agc tca gag aag agc ctg ctg gac ctg 524 Val Asn Gly Ser Tyr Gly His Ser Ser Glu Lys Ser Leu Leu Asp Leu 90 95 100 gac ctg gcc gag ggt ccc agc ccc tcc tgc cac cag ggt ctg ttt ctt 572 Asp Leu Ala Glu Gly Pro Ser Pro Ser Cys His Gln Gly Leu Phe Leu 105 110 115 cct gca ggg acc cca cca ccc cgg ggt cac ccc cct gtc tgt gag aag 620 Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Arg Gly His Pro Pro Val Cys Glu Lys 120 125 130 ctg ctg cac ttc ccc cac cca aac agg tca ccc aga cct cag gct acg 668 Leu Leu His Phe Pro His Pro Asn Arg Ser Pro Arg Pro Gln Ala Thr 135 140 145 ttt gtg aac ggc agc ctc cca gcc gct cag cac atc aag caa gaa gcc 716 Phe Val Asn Gly Ser Leu Pro Ala Ala Gln His Ile Lys Gln Glu Ala 150 155 160 165 cta ccg gac tac cag gcc atg gtc agc gcc cac aca ccc ctg ccc acc 764 Leu Pro Asp Tyr Gln Ala Met Val Ser Ala His Thr Pro Leu Pro Thr 170 175 180 cac tgc cga gcc cca tcg tcc atg ggt ctg ccc tca gac ctg gac ttt 812 His Cys Arg Ala Pro Ser Ser Met Gly Leu Pro Ser Asp Leu Asp Phe 185 190 195 cca gac cga ggc ctc acc aac cct gca cct tcc tgc tac ctt ctg ggc 860 Pro Asp Arg Gly Leu Thr Asn Pro Ala Pro Ser Cys Tyr Leu Leu Gly 200 205 210 aat gaa ccc atc tca gac ctg ggt ccc caa ccc gag gcc cac ctc ccc 908 Asn Glu Pro Ile Ser Asp Leu Gly Pro Gln Pro Glu Ala His Leu Pro 215 220 225 gag ggc agc ctg aaa cgc tgc tgc ctc ctg ggc ctg ccc ccc acc tct 956 Glu Gly Ser Leu Lys Arg Cys Cys Leu Leu Gly Leu Pro Pro Thr Ser 230 235 240 245 tca gcc tcc tcc tca ccc tgt gcc tcc tca gat atc aat cct gtc atc 1004 Ser Ala Ser Ser Ser Pro Cys Ala Ser Ser Asp Ile Asn Pro Val Ile 250 255 260 cac tcc tcc cag aca gct cta gtt agc tgt gta aat gga ctc cga agc 1052 His Ser Ser Gln Thr Ala Leu Val Ser Cys Val Asn Gly Leu Arg Ser 265 270 275 cca cct ctg ccg gga gac ctg ggg ggc cct ccc aag cgg tca cgg ccc 1100 Pro Pro Leu Pro Gly Asp Leu Gly Gly Pro Pro Lys Arg Ser Arg Pro 280 285 290 ggg cct gca tcc agt gac ggc cag gag ggc agc ttg cag ctt gaa gca 1148 Gly Pro Ala Ser Ser Asp Gly Gln Glu Gly Ser Leu Gln Leu Glu Ala 295 300 305 tgc cgg aag tca ggc ttc ctg aag cag gag ccc atg gac gag ttt tca 1196 Cys Arg Lys Ser Gly Phe Leu Lys Gln Glu Pro Met Asp Glu Phe Ser 310 315 320 325 gag ctt ttt gct cca cac cac cag ggt ttg cca ccc cct tac ccc ttg 1244 Glu Leu Phe Ala Pro His His Gln Gly Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Leu 330 335 340 cct cag ttg cca act ggc ccc ggc ctc gga ggc cta ggg ctg ggc ctg 1292 Pro Gln Leu Pro Thr Gly Pro Gly Leu Gly Gly Leu Gly Leu Gly Leu 345 350 355 gca ggt agg atg gtt gcc ggt cgg cag gca tgc cgc tgg gtg gac tgc 1340 Ala Gly Arg Met Val Ala Gly Arg Gln Ala Cys Arg Trp Val Asp Cys 360 365 370 tgc gca gcc tac gag cag cag gag gag ctg gtg cgg cac atc gag aag 1388 Cys Ala Ala Tyr Glu Gln Gln Glu Glu Leu Val Arg His Ile Glu Lys 375 380 385 agc cac atc gac cag cgc aag ggc gaa gac ttc acc tgc ttc tgg gcc 1436 Ser His Ile Asp Gln Arg Lys Gly Glu Asp Phe Thr Cys Phe Trp Ala 390 395 400 405 ggg tgt gtg cgg cgc tac aag ccc ttc aat gcc cgc tac aag ctg ctc 1484 Gly Cys Val Arg Arg Tyr Lys Pro Phe Asn Ala Arg Tyr Lys Leu Leu 410 415 420 atc cac atg agg gta cac tca ggc gag aag ccc aac aag tgc atg ttc 1532 Ile His Met Arg Val His Ser Gly Glu Lys Pro Asn Lys Cys Met Phe 425 430 435 gaa ggc tgc agt aaa gcc ttt tcc cgt ctg gag aac ctg aag atc cat 1580 Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe Ser Arg Leu Glu Asn Leu Lys Ile His 440 445 450 ctg cgg agc cac aca ggc gag aaa cca tac ctg tgc cag cac cca ggc 1628 Leu Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu Cys Gln His Pro Gly 455 460 465 tgc cag aag gcc ttc agc aac tcc agc gac cgt gcc aag cac caa cgc 1676 Cys Gln Lys Ala Phe Ser Asn Ser Ser Asp Arg Ala Lys His Gln Arg 470 475 480 485 acc cac ctc gac acg aag cca tat gct tgt cag atc cct ggc tgc tcc 1724 Thr His Leu Asp Thr Lys Pro Tyr Ala Cys Gln Ile Pro Gly Cys Ser 490 495 500 aag cgc tac acg gac ccc agc tcc ctc cgc aag cac gtg aag gcc cac 1772 Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser Ser Leu Arg Lys His Val Lys Ala His 505 510 515 tca gcc aaa gag cag cag gtg cgt aag aag ctg cac aca ggt gcc gac 1820 Ser Ala Lys Glu Gln Gln Val Arg Lys Lys Leu His Thr Gly Ala Asp 520 525 530 cca gag gct gat gtt ctg tcc gag tgt ctg tcc ctg cag cag ctc caa 1868 Pro Glu Ala Asp Val Leu Ser Glu Cys Leu Ser Leu Gln Gln Leu Gln 535 540 545 gca tcc aca ctg ttg ccg gcc agc aga ggg aag ggc agc caa acc ctg 1916 Ala Ser Thr Leu Leu Pro Ala Ser Arg Gly Lys Gly Ser Gln Thr Leu 550 555 560 565 agc cag gag ctc ctc cca ggt gtg tat cct ggc tcc gtc acc cca caa 1964 Ser Gln Glu Leu Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly Ser Val Thr Pro Gln 570 575 580 aac ggg ctt gct tca ggc atc ctg tcc ccc tcc cac gat gtc cct tcc 2012 Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ile Leu Ser Pro Ser His Asp Val Pro Ser 585 590 595 agg cac cac cca ctg gag gtc ccc act ggt tcc cac cac cac ctg tcc 2060 Arg His His Pro Leu Glu Val Pro Thr Gly Ser His His His Leu Ser 600 605 610 cct ctg ccc aca gct gag agc acc agg gat ggc ctg ggg ccc agt ctc 2108 Pro Leu Pro Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asp Gly Leu Gly Pro Ser Leu 615 620 625 ctt tca ccc atg gtc agc cca ctg aag ggg ctt ggt ccc cca ccg cta 2156 Leu Ser Pro Met Val Ser Pro Leu Lys Gly Leu Gly Pro Pro Pro Leu 630 635 640 645 cca cca gcc tcc cag agt cag tct cca ggg gga cag tca ttc tct aca 2204 Pro Pro Ala Ser Gln Ser Gln Ser Pro Gly Gly Gln Ser Phe Ser Thr 650 655 660 gtc ccc agc aag cct acc tac cca tcc ttc caa agc cca cca cct ctg 2252 Val Pro Ser Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Phe Gln Ser Pro Pro Pro Leu 665 670 675 ccc agc ccc caa ggc tac caa ggc agt ttc cat tcc atc cag aac tgc 2300 Pro Ser Pro Gln Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His Ser Ile Gln Asn Cys 680 685 690 ttc ccc tac gct gac tgc tac cgg gcc act gag cca gca gcc tcc agg 2348 Phe Pro Tyr Ala Asp Cys Tyr Arg Ala Thr Glu Pro Ala Ala Ser Arg 695 700 705 gat gga ctg gtg ggt gat gcc cac ggt ttc aac ccc ttg cga ccc agc 2396 Asp Gly Leu Val Gly Asp Ala His Gly Phe Asn Pro Leu Arg Pro Ser 710 715 720 725 aca tac tcc agc ctc agc aca cct tta tcc gca cca ggc tac gag acc 2444 Thr Tyr Ser Ser Leu Ser Thr Pro Leu Ser Ala Pro Gly Tyr Glu Thr 730 735 740 ctg gca gaa acg ccg tgt ccc cca gcg ctg cag cca cag cca gct gaa 2492 Leu Ala Glu Thr Pro Cys Pro Pro Ala Leu Gln Pro Gln Pro Ala Glu 745 750 755 gac ctg gta cct agt ggt cct gag gac tgt ggc ttc ttc ccc aat ggg 2540 Asp Leu Val Pro Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly Phe Phe Pro Asn Gly 760 765 770 gcc ttt gac cac tgt ctg agt cac atc ccg tcc atc tac act gac acc 2588 Ala Phe Asp His Cys Leu Ser His Ile Pro Ser Ile Tyr Thr Asp Thr 775 780 785 tga aggaaggggc gctgctctgc ctgcctgcct ggctcctgag ctacttcacc 2641 tacctgccat ctgctggtgc ttcccacacg gggcagcaag gccacaccac agggtacttc 2701 cctacctgga gggctgtctg gtccagagct gcctgccagg agctatggcc ctctgacagc 2761 cccatggctg tgtcttcctc tctctccata aggttctcaa atcacagacc tcgtgtatat 2821 acaatgtaca ggacctcttt tccgccgccc tgcaagtttt atatttttgg ttttacaaga 2881 aaaacattaa aaactggaaa cta 2904 <210> 8 <211> 789 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Met His Cys Glu Val Ala Glu Ala Leu Ser Asp Lys Arg Pro Lys Glu 1 5 10 15 Ala Pro Gly Ala Pro Gly Gln Gly Arg Gly Pro Val Ser Leu Gly Ala 20 25 30 His Met Ala Phe Arg Ile Ala Val Ser Gly Gly Gly Cys Gly Asp Gly 35 40 45 Asn Pro Leu Asp Leu Leu Pro Arg Leu Pro Val Pro Pro Pro Arg Ala 50 55 60 His Asp Leu Leu Arg Pro Arg Ser Pro Arg Asp Tyr Gly Val Ser Lys 65 70 75 80 Thr Gly Ser Gly Lys Val Asn Gly Ser Tyr Gly His Ser Ser Glu Lys 85 90 95 Ser Leu Leu Asp Leu Asp Leu Ala Glu Gly Pro Ser Pro Ser Cys His 100 105 110 Gln Gly Leu Phe Leu Pro Ala Gly Thr Pro Pro Pro Arg Gly His Pro 115 120 125 Pro Val Cys Glu Lys Leu Leu His Phe Pro His Pro Asn Arg Ser Pro 130 135 140 Arg Pro Gln Ala Thr Phe Val Asn Gly Ser Leu Pro Ala Ala Gln His 145 150 155 160 Ile Lys Gln Glu Ala Leu Pro Asp Tyr Gln Ala Met Val Ser Ala His 165 170 175 Thr Pro Leu Pro Thr His Cys Arg Ala Pro Ser Ser Met Gly Leu Pro 180 185 190 Ser Asp Leu Asp Phe Pro Asp Arg Gly Leu Thr Asn Pro Ala Pro Ser 195 200 205 Cys Tyr Leu Leu Gly Asn Glu Pro Ile Ser Asp Leu Gly Pro Gln Pro 210 215 220 Glu Ala His Leu Pro Glu Gly Ser Leu Lys Arg Cys Cys Leu Leu Gly 225 230 235 240 Leu Pro Pro Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Cys Ala Ser Ser Asp 245 250 255 Ile Asn Pro Val Ile His Ser Ser Gln Thr Ala Leu Val Ser Cys Val 260 265 270 Asn Gly Leu Arg Ser Pro Pro Leu Pro Gly Asp Leu Gly Gly Pro Pro 275 280 285 Lys Arg Ser Arg Pro Gly Pro Ala Ser Ser Asp Gly Gln Glu Gly Ser 290 295 300 Leu Gln Leu Glu Ala Cys Arg Lys Ser Gly Phe Leu Lys Gln Glu Pro 305 310 315 320 Met Asp Glu Phe Ser Glu Leu Phe Ala Pro His His Gln Gly Leu Pro 325 330 335 Pro Pro Tyr Pro Leu Pro Gln Leu Pro Thr Gly Pro Gly Leu Gly Gly 340 345 350 Leu Gly Leu Gly Leu Ala Gly Arg Met Val Ala Gly Arg Gln Ala Cys 355 360 365 Arg Trp Val Asp Cys Cys Ala Ala Tyr Glu Gln Gln Glu Glu Leu Val 370 375 380 Arg His Ile Glu Lys Ser His Ile Asp Gln Arg Lys Gly Glu Asp Phe 385 390 395 400 Thr Cys Phe Trp Ala Gly Cys Val Arg Arg Tyr Lys Pro Phe Asn Ala 405 410 415 Arg Tyr Lys Leu Leu Ile His Met Arg Val His Ser Gly Glu Lys Pro 420 425 430 Asn Lys Cys Met Phe Glu Gly Cys Ser Lys Ala Phe Ser Arg Leu Glu 435 440 445 Asn Leu Lys Ile His Leu Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Leu 450 455 460 Cys Gln His Pro Gly Cys Gln Lys Ala Phe Ser Asn Ser Ser Asp Arg 465 470 475 480 Ala Lys His Gln Arg Thr His Leu Asp Thr Lys Pro Tyr Ala Cys Gln 485 490 495 Ile Pro Gly Cys Ser Lys Arg Tyr Thr Asp Pro Ser Ser Leu Arg Lys 500 505 510 His Val Lys Ala His Ser Ala Lys Glu Gln Gln Val Arg Lys Lys Leu 515 520 525 His Thr Gly Ala Asp Pro Glu Ala Asp Val Leu Ser Glu Cys Leu Ser 530 535 540 Leu Gln Gln Leu Gln Ala Ser Thr Leu Leu Pro Ala Ser Arg Gly Lys 545 550 555 560 Gly Ser Gln Thr Leu Ser Gln Glu Leu Leu Pro Gly Val Tyr Pro Gly 565 570 575 Ser Val Thr Pro Gln Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ile Leu Ser Pro Ser 580 585 590 His Asp Val Pro Ser Arg His His Pro Leu Glu Val Pro Thr Gly Ser 595 600 605 His His His Leu Ser Pro Leu Pro Thr Ala Glu Ser Thr Arg Asp Gly 610 615 620 Leu Gly Pro Ser Leu Leu Ser Pro Met Val Ser Pro Leu Lys Gly Leu 625 630 635 640 Gly Pro Pro Pro Leu Pro Pro Ala Ser Gln Ser Gln Ser Pro Gly Gly 645 650 655 Gln Ser Phe Ser Thr Val Pro Ser Lys Pro Thr Tyr Pro Ser Phe Gln 660 665 670 Ser Pro Pro Pro Leu Pro Ser Pro Gln Gly Tyr Gln Gly Ser Phe His 675 680 685 Ser Ile Gln Asn Cys Phe Pro Tyr Ala Asp Cys Tyr Arg Ala Thr Glu 690 695 700 Pro Ala Ala Ser Arg Asp Gly Leu Val Gly Asp Ala His Gly Phe Asn 705 710 715 720 Pro Leu Arg Pro Ser Thr Tyr Ser Ser Leu Ser Thr Pro Leu Ser Ala 725 730 735 Pro Gly Tyr Glu Thr Leu Ala Glu Thr Pro Cys Pro Pro Ala Leu Gln 740 745 750 Pro Gln Pro Ala Glu Asp Leu Val Pro Ser Gly Pro Glu Asp Cys Gly 755 760 765 Phe Phe Pro Asn Gly Ala Phe Asp His Cys Leu Ser His Ile Pro Ser 770 775 780 Ile Tyr Thr Asp Thr 785 <210> 9 <211> 2250 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (583)..(1536) <400> 9 tgggagtccg tgctcctgct cctcggttgg ctcctaagtg ccccgccagg tcccctctcc 60 tttcgctctc ccggctccgg ctcccgactc ttcggcccgc tggcatctgc ttccctcccc 120 tgcctcgttt ctcgtcgccc ctgctcgctc cccccggcgc tcgcccgggc gctgtgctcg 180 ctcctggatc gccagccgcg cagccgggct cggccggccg cccgcgcgcc actgtgcagt 240 ggagtttggt ggaatctctg ctgacgtcac gtcactcccc acacggagta ggagcagagg 300 gaagagagag ggatgagagg gagggagagg agagagagtg cgagaccgag cgagaaagct 360 ggagaggagc agaaagaaac tgccagtggc ggctagattt cggaggcccc agtgcacccg 420 tggactcctt cggaacttgg caccctcagg agccctgcag tcctctcagg cccggctttc 480 gggcgcttgc cgtgcagccg gaggctcggc tcgctggaaa tcgccccggg aagcagtggg 540 acgcggagac agcagctctc tcccggtagc cgataacggg ga atg gag acc aac 594 Met Glu Thr Asn 1 tgc cgc aaa ctg gtg tcg gcg tgt gtg caa tta ggc gtg cag ccg gcg 642 Cys Arg Lys Leu Val Ser Ala Cys Val Gln Leu Gly Val Gln Pro Ala 5 10 15 20 gcc gtt gaa tgt ctc ttc tcc aaa gac tcc gaa atc aaa aag gtc gag 690 Ala Val Glu Cys Leu Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ile Lys Lys Val Glu 25 30 35 ttc acg gac tct cct gag agc cga aaa gag gca gcc agc agc aag ttc 738 Phe Thr Asp Ser Pro Glu Ser Arg Lys Glu Ala Ala Ser Ser Lys Phe 40 45 50 ttc ccg cgg cag cat cct ggc gcc aat gag aaa gat aaa agc cag cag 786 Phe Pro Arg Gln His Pro Gly Ala Asn Glu Lys Asp Lys Ser Gln Gln 55 60 65 ggg aag aat gag gac gtg ggc gcc gag gac ccg tct aag aag aag cgg 834 Gly Lys Asn Glu Asp Val Gly Ala Glu Asp Pro Ser Lys Lys Lys Arg 70 75 80 caa agg cgg cag cgg act cac ttt acc agc cag cag ctc cag gag ctg 882 Gln Arg Arg Gln Arg Thr His Phe Thr Ser Gln Gln Leu Gln Glu Leu 85 90 95 100 gag gcc act ttc cag agg aac cgc tac ccg gac atg tcc aca cgc gaa 930 Glu Ala Thr Phe Gln Arg Asn Arg Tyr Pro Asp Met Ser Thr Arg Glu 105 110 115 gaa atc gct gtg tgg acc aac ctt acg gaa gcc cga gtc cgg gtt tgg 978 Glu Ile Ala Val Trp Thr Asn Leu Thr Glu Ala Arg Val Arg Val Trp 120 125 130 ttc aag aat cgt cgg gcc aaa tgg aga aag agg gag cgc aac cag cag 1026 Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Trp Arg Lys Arg Glu Arg Asn Gln Gln 135 140 145 gcc gag cta tgc aag aat ggc ttc ggg ccg cag ttc aat ggg ctc atg 1074 Ala Glu Leu Cys Lys Asn Gly Phe Gly Pro Gln Phe Asn Gly Leu Met 150 155 160 cag ccc tac gac gac atg tac cca ggc tat tcc tac aac aac tgg gcc 1122 Gln Pro Tyr Asp Asp Met Tyr Pro Gly Tyr Ser Tyr Asn Asn Trp Ala 165 170 175 180 gcc aag ggc ctt aca tcc gcc tcc cta tcc acc aag agc ttc ccc ttc 1170 Ala Lys Gly Leu Thr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Lys Ser Phe Pro Phe 185 190 195 ttc aac tct atg aac gtc aac ccc ctg tca tca cag agc atg ttt tcc 1218 Phe Asn Ser Met Asn Val Asn Pro Leu Ser Ser Gln Ser Met Phe Ser 200 205 210 cca ccc aac tct atc tcg tcc atg agc atg tcg tcc agc atg gtg ccc 1266 Pro Pro Asn Ser Ile Ser Ser Met Ser Met Ser Ser Ser Met Val Pro 215 220 225 tca gca gtg aca ggc gtc ccg ggc tcc agt ctc aac agc ctg aat aac 1314 Ser Ala Val Thr Gly Val Pro Gly Ser Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn 230 235 240 ttg aac aac ctg agt agc ccg tcg ctg aat tcc gcg gtg ccg acg cct 1362 Leu Asn Asn Leu Ser Ser Pro Ser Leu Asn Ser Ala Val Pro Thr Pro 245 250 255 260 gcc tgt cct tac gcg ccg ccg act cct ccg tat gtt tat agg gac acg 1410 Ala Cys Pro Tyr Ala Pro Pro Thr Pro Pro Tyr Val Tyr Arg Asp Thr 265 270 275 tgt aac tcg agc ctg gcc agc ctg aga ctg aaa gca aag cag cac tcc 1458 Cys Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Arg Leu Lys Ala Lys Gln His Ser 280 285 290 agc ttc ggc tac gcc agc gtg cag aac ccg gcc tcc aac ctg agt gct 1506 Ser Phe Gly Tyr Ala Ser Val Gln Asn Pro Ala Ser Asn Leu Ser Ala 295 300 305 tgc cag tat gca gtg gac cgg ccc gtg tga gccgcaccca cagcgccggg 1556 Cys Gln Tyr Ala Val Asp Arg Pro Val 310 315 atcctaggac cttgccggat ggggcaactc cgcccttgaa agactgggaa ttatgctaga 1616 aggtcgtggg cactaaagaa agggagagaa agagaagcta tatagagaaa aggaaaccac 1676 tgaatcaaag agagagctcc tttgatttca aagggatgtc ctcagtgtct gacatctttc 1736 actacaagta tttctaacag ttgcaaggac acatacacaa acaaatgttt gactggatat 1796 gacattttaa cattactata agcttgttat tttttaagtt tagcattgtt aacatttaaa 1856 tgactgaaag gatgtatata tatcgaaatg tcaaattaat tttataaaag cagttgttag 1916 taatatcaca acagtgtttt taaaggttag gctttaaaat aaagcatgtt atacagaagc 1976 gattaggatt tttcgcttgc gagcaaggga gtgtatatac taaatgccac actgtatgtt 2036 tctaacatat tattattatt ataaaaaatg tgtgaatatc agttttagaa tagtttctct 2096 ggtggatgca atgatgtttc tgaaactgct atgtacaacc taccctgtgt ataacatttc 2156 gtacaatatt attgttttac ttttcagcaa atatgaaaca aatgtgtttt atttcatggg 2216 agtaaaatat actgcataca aaaaaaaaaa aaaa 2250 <210> 10 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Glu Thr Asn Cys Arg Lys Leu Val Ser Ala Cys Val Gln Leu Gly 1 5 10 15 Val Gln Pro Ala Ala Val Glu Cys Leu Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ile 20 25 30 Lys Lys Val Glu Phe Thr Asp Ser Pro Glu Ser Arg Lys Glu Ala Ala 35 40 45 Ser Ser Lys Phe Phe Pro Arg Gln His Pro Gly Ala Asn Glu Lys Asp 50 55 60 Lys Ser Gln Gln Gly Lys Asn Glu Asp Val Gly Ala Glu Asp Pro Ser 65 70 75 80 Lys Lys Lys Arg Gln Arg Arg Gln Arg Thr His Phe Thr Ser Gln Gln 85 90 95 Leu Gln Glu Leu Glu Ala Thr Phe Gln Arg Asn Arg Tyr Pro Asp Met 100 105 110 Ser Thr Arg Glu Glu Ile Ala Val Trp Thr Asn Leu Thr Glu Ala Arg 115 120 125 Val Arg Val Trp Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Trp Arg Lys Arg Glu 130 135 140 Arg Asn Gln Gln Ala Glu Leu Cys Lys Asn Gly Phe Gly Pro Gln Phe 145 150 155 160 Asn Gly Leu Met Gln Pro Tyr Asp Asp Met Tyr Pro Gly Tyr Ser Tyr 165 170 175 Asn Asn Trp Ala Ala Lys Gly Leu Thr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Lys 180 185 190 Ser Phe Pro Phe Phe Asn Ser Met Asn Val Asn Pro Leu Ser Ser Gln 195 200 205 Ser Met Phe Ser Pro Pro Asn Ser Ile Ser Ser Met Ser Met Ser Ser 210 215 220 Ser Met Val Pro Ser Ala Val Thr Gly Val Pro Gly Ser Ser Leu Asn 225 230 235 240 Ser Leu Asn Asn Leu Asn Asn Leu Ser Ser Pro Ser Leu Asn Ser Ala 245 250 255 Val Pro Thr Pro Ala Cys Pro Tyr Ala Pro Pro Thr Pro Pro Tyr Val 260 265 270 Tyr Arg Asp Thr Cys Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Arg Leu Lys Ala 275 280 285 Lys Gln His Ser Ser Phe Gly Tyr Ala Ser Val Gln Asn Pro Ala Ser 290 295 300 Asn Leu Ser Ala Cys Gln Tyr Ala Val Asp Arg Pro Val 305 310 315 <210> 11 <211> 1903 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (256)..(1209) <400> 11 gggaggggag agagagtgcg agaccgagag agaaagccgg agagcagcag acagaaactg 60 ccggcgcccg ctagctttag cagccccccg cgtggaccct ctcggaactt ggcaccctca 120 agatccccgc agttccaccc agacccgctc cacggcgctg gctgtgcagc ccgagcctcg 180 gccgcctggc agtcaccctg ggaagcggtg ggacggggag acagccgttc tctctccggt 240 agccgataac cggga atg gag acc aat tgt cgc aaa cta gtg tcg gcc tgc 291 Met Glu Thr Asn Cys Arg Lys Leu Val Ser Ala Cys 1 5 10 gtg caa tta ggc gtg cag ccg gca gcc gtt gaa tgt ctc ttc tcc aaa 339 Val Gln Leu Gly Val Gln Pro Ala Ala Val Glu Cys Leu Phe Ser Lys 15 20 25 gac tcc gaa atc aaa aag gtc gag ttc acg gac tct ccc aag agc cgg 387 Asp Ser Glu Ile Lys Lys Val Glu Phe Thr Asp Ser Pro Lys Ser Arg 30 35 40 aaa gag tcg gcc agc agc aag ctg ttc ccg cgg cag cac ccc ggc gcc 435 Lys Glu Ser Ala Ser Ser Lys Leu Phe Pro Arg Gln His Pro Gly Ala 45 50 55 60 aat gag aaa gat aag ggc cag caa gga aag aat gag gat gtg ggc gcc 483 Asn Glu Lys Asp Lys Gly Gln Gln Gly Lys Asn Glu Asp Val Gly Ala 65 70 75 gag gac ccg tcc aag aag aag cgg caa cgc cgg cag agg act cat ttc 531 Glu Asp Pro Ser Lys Lys Lys Arg Gln Arg Arg Gln Arg Thr His Phe 80 85 90 act agc cag cag ctg cag gag ctg gaa gcc act ttc cag aga aac cgc 579 Thr Ser Gln Gln Leu Gln Glu Leu Glu Ala Thr Phe Gln Arg Asn Arg 95 100 105 tac cca gac atg tcc act cgc gaa gaa atc gcc gtg tgg acc aac ctt 627 Tyr Pro Asp Met Ser Thr Arg Glu Glu Ile Ala Val Trp Thr Asn Leu 110 115 120 acg gaa gcc cga gtc cgg gtt tgg ttc aag aat cgc cgg gcc aaa tgg 675 Thr Glu Ala Arg Val Arg Val Trp Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Trp 125 130 135 140 aga aag cgg gaa cgc aac cag cag gcc gag ctg tgc aag aat ggc ttt 723 Arg Lys Arg Glu Arg Asn Gln Gln Ala Glu Leu Cys Lys Asn Gly Phe 145 150 155 ggg ccg cag ttc aac ggg ctc atg cag ccc tac gat gac atg tac ccc 771 Gly Pro Gln Phe Asn Gly Leu Met Gln Pro Tyr Asp Asp Met Tyr Pro 160 165 170 ggc tat tcg tac aac aat tgg gct gcc aag ggc ctc acg tca gcg tct 819 Gly Tyr Ser Tyr Asn Asn Trp Ala Ala Lys Gly Leu Thr Ser Ala Ser 175 180 185 ctg tcc acc aag agc ttc ccc ttc ttc aac tcc atg aac gtc aat ccc 867 Leu Ser Thr Lys Ser Phe Pro Phe Phe Asn Ser Met Asn Val Asn Pro 190 195 200 ctg tcc tct cag agt atg ttt tcc ccg ccc aac tcc atc tca tct atg 915 Leu Ser Ser Gln Ser Met Phe Ser Pro Pro Asn Ser Ile Ser Ser Met 205 210 215 220 agt atg tcg tcc agc atg gtg ccc tcc gcg gtg acc ggc gtc ccg ggc 963 Ser Met Ser Ser Ser Met Val Pro Ser Ala Val Thr Gly Val Pro Gly 225 230 235 tcc agc ctc aat agc ctg aat aac ttg aac aac ctg agc agc ccg tcg 1011 Ser Ser Leu Asn Ser Leu Asn Asn Leu Asn Asn Leu Ser Ser Pro Ser 240 245 250 ctg aat tcc gcg gtg ccc acg ccc gcc tgt cct tac gcg ccg ccg act 1059 Leu Asn Ser Ala Val Pro Thr Pro Ala Cys Pro Tyr Ala Pro Pro Thr 255 260 265 cct ccg tac gtt tat agg gac aca tgt aac tcg agc ctg gcc agc ctg 1107 Pro Pro Tyr Val Tyr Arg Asp Thr Cys Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu 270 275 280 aga ctg aaa gca aag cag cac tcc agc ttc ggc tac gcc agc gtg cag 1155 Arg Leu Lys Ala Lys Gln His Ser Ser Phe Gly Tyr Ala Ser Val Gln 285 290 295 300 aac ccg gcc tcc aac ctg agt gct tgc cag tat gca gtc gac cgg ccg 1203 Asn Pro Ala Ser Asn Leu Ser Ala Cys Gln Tyr Ala Val Asp Arg Pro 305 310 315 gtg tga accgcgccca gggcgcgggg atccgaggac tgtcggagtg ggcaactctg 1259 Val ccccagaaag actgagaatt gtgctagaag gtcgtgcgca ctatgggaag gaagaggggg 1319 gaaaaaagat cagaggaaaa gaaaccactg aattcaaaga gagagcgcct ttgatttcaa 1379 aggaatgtcc ccaagtgtct acgtctttcg ctaagagtat tcccaacagt tggaggacgc 1439 gtacgcccac aaatgtttga ctggatatga cattttaaca ttactataag cttgttattt 1499 tttaagttta gcattgttaa cattaaaatg actgaaagga tgtatatata tcgaaatgtc 1559 aaattaattt tataaaagca gttgttagta ctatcacgac agtgttttta aaggctaggc 1619 tttaaaataa agcatgttat acagaatcag ttaggatttt tcgcttgcga gcaaaggaat 1679 gtatatacta aatgccacac tgtatgtttc taacatatta ttattataaa aatgtgtgaa 1739 tataagtttt agagtagttt ctctggtgga tgccttgttt ctgaaactgc tatgtacgac 1799 ccatcctgtg tataacattt cgtacgatat tattgtttta cttttcagca aatatgaaaa 1859 aaaatgtgtt ttatttcttg ggagtaaaat atactgcata caaa 1903 <210> 12 <211> 317 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Met Glu Thr Asn Cys Arg Lys Leu Val Ser Ala Cys Val Gln Leu Gly 1 5 10 15 Val Gln Pro Ala Ala Val Glu Cys Leu Phe Ser Lys Asp Ser Glu Ile 20 25 30 Lys Lys Val Glu Phe Thr Asp Ser Pro Lys Ser Arg Lys Glu Ser Ala 35 40 45 Ser Ser Lys Leu Phe Pro Arg Gln His Pro Gly Ala Asn Glu Lys Asp 50 55 60 Lys Gly Gln Gln Gly Lys Asn Glu Asp Val Gly Ala Glu Asp Pro Ser 65 70 75 80 Lys Lys Lys Arg Gln Arg Arg Gln Arg Thr His Phe Thr Ser Gln Gln 85 90 95 Leu Gln Glu Leu Glu Ala Thr Phe Gln Arg Asn Arg Tyr Pro Asp Met 100 105 110 Ser Thr Arg Glu Glu Ile Ala Val Trp Thr Asn Leu Thr Glu Ala Arg 115 120 125 Val Arg Val Trp Phe Lys Asn Arg Arg Ala Lys Trp Arg Lys Arg Glu 130 135 140 Arg Asn Gln Gln Ala Glu Leu Cys Lys Asn Gly Phe Gly Pro Gln Phe 145 150 155 160 Asn Gly Leu Met Gln Pro Tyr Asp Asp Met Tyr Pro Gly Tyr Ser Tyr 165 170 175 Asn Asn Trp Ala Ala Lys Gly Leu Thr Ser Ala Ser Leu Ser Thr Lys 180 185 190 Ser Phe Pro Phe Phe Asn Ser Met Asn Val Asn Pro Leu Ser Ser Gln 195 200 205 Ser Met Phe Ser Pro Pro Asn Ser Ile Ser Ser Met Ser Met Ser Ser 210 215 220 Ser Met Val Pro Ser Ala Val Thr Gly Val Pro Gly Ser Ser Leu Asn 225 230 235 240 Ser Leu Asn Asn Leu Asn Asn Leu Ser Ser Pro Ser Leu Asn Ser Ala 245 250 255 Val Pro Thr Pro Ala Cys Pro Tyr Ala Pro Pro Thr Pro Pro Tyr Val 260 265 270 Tyr Arg Asp Thr Cys Asn Ser Ser Leu Ala Ser Leu Arg Leu Lys Ala 275 280 285 Lys Gln His Ser Ser Phe Gly Tyr Ala Ser Val Gln Asn Pro Ala Ser 290 295 300 Asn Leu Ser Ala Cys Gln Tyr Ala Val Asp Arg Pro Val 305 310 315 <210> 13 <211> 1907 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (56)..(1084) <400> 13 acttgctctg cagctcccag aggtggtggt tgtgttacga aggctgaccc tgcca atg 58 Met 1 gcc gac aaa atg gtg cgc acc ccc aag tgc tcg aga tgc agg aac cat 106 Ala Asp Lys Met Val Arg Thr Pro Lys Cys Ser Arg Cys Arg Asn His 5 10 15 ggc ttc ctg gtg ccc gtc aag gga cac gcg ggc aaa tgc cgc tgg aag 154 Gly Phe Leu Val Pro Val Lys Gly His Ala Gly Lys Cys Arg Trp Lys 20 25 30 cag tgc ctc tgc gag aag tgc tac ctg atc tcc gag cgc cag aag atc 202 Gln Cys Leu Cys Glu Lys Cys Tyr Leu Ile Ser Glu Arg Gln Lys Ile 35 40 45 atg gcc gcg cag aag gtg ctc aag acg cag gcc gcc gag gag gag cag 250 Met Ala Ala Gln Lys Val Leu Lys Thr Gln Ala Ala Glu Glu Glu Gln 50 55 60 65 gag gcg gcc ctg tgt gcg cag ggg ccc aag cag gcc tcc ggg gct gcg 298 Glu Ala Ala Leu Cys Ala Gln Gly Pro Lys Gln Ala Ser Gly Ala Ala 70 75 80 gcc gcc gcc ccc gcc ccc gtc ccc gtc ccg gcc gcg agc ctc cgc ccg 346 Ala Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Ala Ala Ser Leu Arg Pro 85 90 95 ctg tcc ccg ggg act ccc tcc gga gac gcc gac ccg gga ccc gag ggc 394 Leu Ser Pro Gly Thr Pro Ser Gly Asp Ala Asp Pro Gly Pro Glu Gly 100 105 110 cgc gcg gcc gct tgc ttc ttc gag cag ccc ccg cgg ggc cgg aac ccc 442 Arg Ala Ala Ala Cys Phe Phe Glu Gln Pro Pro Arg Gly Arg Asn Pro 115 120 125 ggc ccg aga gcc ctc cag ccg gtt ctg ggc ggc cgc agc cac gtg gag 490 Gly Pro Arg Ala Leu Gln Pro Val Leu Gly Gly Arg Ser His Val Glu 130 135 140 145 ccg agc gag cga gcc gcc gtg gcg atg ccc agc ctt gcg gga ccc cct 538 Pro Ser Glu Arg Ala Ala Val Ala Met Pro Ser Leu Ala Gly Pro Pro 150 155 160 ttt ggg gcg gag gcc gca ggc agt ggc tac cct ggc ccc cta gac ctg 586 Phe Gly Ala Glu Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Pro Gly Pro Leu Asp Leu 165 170 175 cgc agg ccg atg cgg acc gtg ccc ggc cca ctg ttc acc gac ttt gtg 634 Arg Arg Pro Met Arg Thr Val Pro Gly Pro Leu Phe Thr Asp Phe Val 180 185 190 cgc cct ctg aac atc aac ccg gac cgt gca ctg ggc cct gag tac cct 682 Arg Pro Leu Asn Ile Asn Pro Asp Arg Ala Leu Gly Pro Glu Tyr Pro 195 200 205 ggt ggc tcc agc atg cac ccc tac tgc ccg ttc ccg ctg ggc tac ctg 730 Gly Gly Ser Ser Met His Pro Tyr Cys Pro Phe Pro Leu Gly Tyr Leu 210 215 220 225 gac gcc cct cct ggc gtc ccc ctg cag cag ggc ttc cgg cat gtg tcc 778 Asp Ala Pro Pro Gly Val Pro Leu Gln Gln Gly Phe Arg His Val Ser 230 235 240 cgc agc cag tac caa ggc gga ggc ttg gtg tca gaa cca gga gga gac 826 Arg Ser Gln Tyr Gln Gly Gly Gly Leu Val Ser Glu Pro Gly Gly Asp 245 250 255 ttc cag cca agc tac tac ctg ccg ccg ccg ccg ccg cca ctg ccg ccc 874 Phe Gln Pro Ser Tyr Tyr Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro 260 265 270 ctt cca ccg ctt cca ccg cag ccc cag ttc ctc ccg cca ggc tac ctc 922 Leu Pro Pro Leu Pro Pro Gln Pro Gln Phe Leu Pro Pro Gly Tyr Leu 275 280 285 tct gcg ctc cac ttc ctc ccc ccg cca ccg cca cca cca cct cca tca 970 Ser Ala Leu His Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser 290 295 300 305 tct ttc tca ctg acc gtc ctg ttt gat act gac aag gag aac act gat 1018 Ser Phe Ser Leu Thr Val Leu Phe Asp Thr Asp Lys Glu Asn Thr Asp 310 315 320 gac cag gat gca gag gta ctg tcg ggt gag ccc agc cag cca tcg tct 1066 Asp Gln Asp Ala Glu Val Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Pro Ser Ser 325 330 335 cag gag cag tcc gac tag gccccaggcc cgccctcctg gccagcagag 1114 Gln Glu Gln Ser Asp 340 tggggcactg gggggcaaca gcaacagttt tcctgtcttc attcagtgat atgtagggag 1174 gaaggaggtt gatagcatag atggcaactg attcccagtt taagatagga ggaaggagag 1234 caatttctaa gtttcaatcc tgcgctgtac agttgaagaa gagtgtggag gaagctatta 1294 ccaggggagg gccagggctc tgaggagtgg gcgctgggag aagctcccat ttaggaatga 1354 atttaactgt ccttgggtta cactaccatt tattggaaca agccccagag gcagtatttg 1414 atttcctcag gccccactct aggacaggag gcaccatcta tttcagcctt ctgctgcctt 1474 tgcctggtcc tccaggttgc tgggggcacc acagacatca agattccagt tcatccaggt 1534 ggctggagcc agcagccagg accagggtcg ttgacagcag gttctgcagc atcctgcctt 1594 gctgctctgt cccccacatc ttcctggcca cagccccttg cccctcctct aaggggtttt 1654 actagcaagc atcctggctg ctggggctac ttcattcccc ctccataaag tttcagccat 1714 tatgggcact ggttttaaaa aatttattag tttgactatt tgatggtttt atagtgattg 1774 ccaactttaa aaagtaggct gttcataagc actgatgcag tccctaggga atagaatggt 1834 gcttctgatc acctgtgaca tgaacagttt cttctgtgag gacagttggc tattgaaata 1894 aaatgagcaa tgg 1907 <210> 14 <211> 342 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Ala Asp Lys Met Val Arg Thr Pro Lys Cys Ser Arg Cys Arg Asn 1 5 10 15 His Gly Phe Leu Val Pro Val Lys Gly His Ala Gly Lys Cys Arg Trp 20 25 30 Lys Gln Cys Leu Cys Glu Lys Cys Tyr Leu Ile Ser Glu Arg Gln Lys 35 40 45 Ile Met Ala Ala Gln Lys Val Leu Lys Thr Gln Ala Ala Glu Glu Glu 50 55 60 Gln Glu Ala Ala Leu Cys Ala Gln Gly Pro Lys Gln Ala Ser Gly Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Ala Ala Ser Leu Arg 85 90 95 Pro Leu Ser Pro Gly Thr Pro Ser Gly Asp Ala Asp Pro Gly Pro Glu 100 105 110 Gly Arg Ala Ala Ala Cys Phe Phe Glu Gln Pro Pro Arg Gly Arg Asn 115 120 125 Pro Gly Pro Arg Ala Leu Gln Pro Val Leu Gly Gly Arg Ser His Val 130 135 140 Glu Pro Ser Glu Arg Ala Ala Val Ala Met Pro Ser Leu Ala Gly Pro 145 150 155 160 Pro Phe Gly Ala Glu Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Pro Gly Pro Leu Asp 165 170 175 Leu Arg Arg Pro Met Arg Thr Val Pro Gly Pro Leu Phe Thr Asp Phe 180 185 190 Val Arg Pro Leu Asn Ile Asn Pro Asp Arg Ala Leu Gly Pro Glu Tyr 195 200 205 Pro Gly Gly Ser Ser Met His Pro Tyr Cys Pro Phe Pro Leu Gly Tyr 210 215 220 Leu Asp Ala Pro Pro Gly Val Pro Leu Gln Gln Gly Phe Arg His Val 225 230 235 240 Ser Arg Ser Gln Tyr Gln Gly Gly Gly Leu Val Ser Glu Pro Gly Gly 245 250 255 Asp Phe Gln Pro Ser Tyr Tyr Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro 260 265 270 Pro Leu Pro Pro Leu Pro Pro Gln Pro Gln Phe Leu Pro Pro Gly Tyr 275 280 285 Leu Ser Ala Leu His Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 290 295 300 Ser Ser Phe Ser Leu Thr Val Leu Phe Asp Thr Asp Lys Glu Asn Thr 305 310 315 320 Asp Asp Gln Asp Ala Glu Val Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Pro Ser 325 330 335 Ser Gln Glu Gln Ser Asp 340 <210> 15 <211> 1790 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1080) <400> 15 atg ctt cgc gcc ccc aag tgc tct agg tgc cgg aac cat ggc tat ctg 48 Met Leu Arg Ala Pro Lys Cys Ser Arg Cys Arg Asn His Gly Tyr Leu 1 5 10 15 gta cca gtc aag ggc cat acg ggc aaa tgc cgc tgg aag cag tgc atc 96 Val Pro Val Lys Gly His Thr Gly Lys Cys Arg Trp Lys Gln Cys Ile 20 25 30 tgt gac aag tgc tac ctg atc acc gag cgc cag aag atc atg gct gcc 144 Cys Asp Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Glu Arg Gln Lys Ile Met Ala Ala 35 40 45 cag aag gtt ctc aga acc caa gct gcc gag gag cag gtg gcg acc gtg 192 Gln Lys Val Leu Arg Thr Gln Ala Ala Glu Glu Gln Val Ala Thr Val 50 55 60 ggc acg cag ggt ccc cag ctg cct cct agg gct cca gca gcg gcg gcc 240 Gly Thr Gln Gly Pro Gln Leu Pro Pro Arg Ala Pro Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 acc gcc ttg agc tcc agc att tgc cca ctg cct agg gcg gtt ccg gga 288 Thr Ala Leu Ser Ser Ser Ile Cys Pro Leu Pro Arg Ala Val Pro Gly 85 90 95 ggc gtt ggg cca ggc ccc acg gcc act tgc ttc ctc gag agg ccc ccg 336 Gly Val Gly Pro Gly Pro Thr Ala Thr Cys Phe Leu Glu Arg Pro Pro 100 105 110 cag gcc ccg agc cca ggc ccg agc acc ttc cag ctg ggc cca agt ggc 384 Gln Ala Pro Ser Pro Gly Pro Ser Thr Phe Gln Leu Gly Pro Ser Gly 115 120 125 cgc ccg ggc ccc agc acc ttc cag cct gga cca ggg gcc ccc ggg gga 432 Arg Pro Gly Pro Ser Thr Phe Gln Pro Gly Pro Gly Ala Pro Gly Gly 130 135 140 ctg cgc gac cgt tcc tcc gcg tgg ctg ccc cag ctc atg cca cag gcg 480 Leu Arg Asp Arg Ser Ser Ala Trp Leu Pro Gln Leu Met Pro Gln Ala 145 150 155 160 ccc agg ccg gag ctt tgc tac ccg gat cag cac ctg cca gtg cgg ccc 528 Pro Arg Pro Glu Leu Cys Tyr Pro Asp Gln His Leu Pro Val Arg Pro 165 170 175 gtg cca gtg cca ggg cca gtg cgg ccc gtg ccc cga ctg ccg ttc gcc 576 Val Pro Val Pro Gly Pro Val Arg Pro Val Pro Arg Leu Pro Phe Ala 180 185 190 gac tac ggg cat cct ctg aga ttc aag tct gat cat gtg gta gga gct 624 Asp Tyr Gly His Pro Leu Arg Phe Lys Ser Asp His Val Val Gly Ala 195 200 205 ggg aat cct gag aga gag ccg ttc aag cag tgc cct gcc tgc gtc cct 672 Gly Asn Pro Glu Arg Glu Pro Phe Lys Gln Cys Pro Ala Cys Val Pro 210 215 220 gtt tca ccc tac cag tcc ttt cca ctt tcg gaa ggc cag gat tca tcc 720 Val Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Pro Leu Ser Glu Gly Gln Asp Ser Ser 225 230 235 240 tct gct ctg ggg gtc cct caa caa aga ggc ttc cgg cat gtc tcc tgc 768 Ser Ala Leu Gly Val Pro Gln Gln Arg Gly Phe Arg His Val Ser Cys 245 250 255 agc ccc tac cat aga agc ggc ttg gtg tca gag cca gcc aga gac ctg 816 Ser Pro Tyr His Arg Ser Gly Leu Val Ser Glu Pro Ala Arg Asp Leu 260 265 270 cag cca acc tac tgc tca ccg ccg ccg cca cca ccg ccg cca cct ccg 864 Gln Pro Thr Tyr Cys Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 275 280 285 cca cca cta cca gca ccc cca ccc cag cca cag cag ccc cac ttc ctc 912 Pro Pro Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gln Pro Gln Gln Pro His Phe Leu 290 295 300 cca cca ggc tac ctc tct gct ctc cac ttc ctg cca ccg ccg cca ccg 960 Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Ala Leu His Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro 305 310 315 320 cca cca tct cca cca tct ttc tcg ctg acc tac gat aca gac aag gag 1008 Pro Pro Ser Pro Pro Ser Phe Ser Leu Thr Tyr Asp Thr Asp Lys Glu 325 330 335 aat acc aat gac cag gat gca gaa gca ccc acc gag ccc agc cag gac 1056 Asn Thr Asn Asp Gln Asp Ala Glu Ala Pro Thr Glu Pro Ser Gln Asp 340 345 350 tct ccc cag gag cag tcc aac taa gctgcaggcc acctggaagg ccaccgggtg 1110 Ser Pro Gln Glu Gln Ser Asn 355 gggacgggca tagatggcgg gggttatttt ttcaccatgt tcatgttata taggagaaag 1170 gatactgata ggtgtaagaa ggcagcgaat tcctactcca ggttagaagg gcacaggtgg 1230 tttccaaggt tctctgggtc ctgggtgggt gttgaagtgg tgtacaaagg gagagaaagt 1290 ctgggatggg cagggctttt gaagagtggg ggctggtgaa acacaagttt agaaatgaat 1350 ttaaccatct gagccatgta tgaaattcac ttctagaggt ggcccctgat ttccccaagc 1410 ctcactcagg acagaaggca ccattcagtt cagccttctg ccccctttgc ctgaccccca 1470 agcctgggta ccgcaaacac caaggcctcc agacagtgca gggcaggtgc cagggcctga 1530 gatgctgaca gcaggttctg cagcatccac ctttgcccaa cactgcctct cgtcctcttc 1590 cagagagtga gcgtcctgac aactgagcca cttcacttcc ctgggaaact caagcatagg 1650 tgtcctttct catttaaaaa tgtagatttt agcatttgat gttcttatgg tggggaactc 1710 atgggcactg cagcagttct cggagcaaaa aaaatggcca tttgttctct ggggacagta 1770 ttaaataaag tgagcattag 1790 <210> 16 <211> 359 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Met Leu Arg Ala Pro Lys Cys Ser Arg Cys Arg Asn His Gly Tyr Leu 1 5 10 15 Val Pro Val Lys Gly His Thr Gly Lys Cys Arg Trp Lys Gln Cys Ile 20 25 30 Cys Asp Lys Cys Tyr Leu Ile Thr Glu Arg Gln Lys Ile Met Ala Ala 35 40 45 Gln Lys Val Leu Arg Thr Gln Ala Ala Glu Glu Gln Val Ala Thr Val 50 55 60 Gly Thr Gln Gly Pro Gln Leu Pro Pro Arg Ala Pro Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Thr Ala Leu Ser Ser Ser Ile Cys Pro Leu Pro Arg Ala Val Pro Gly 85 90 95 Gly Val Gly Pro Gly Pro Thr Ala Thr Cys Phe Leu Glu Arg Pro Pro 100 105 110 Gln Ala Pro Ser Pro Gly Pro Ser Thr Phe Gln Leu Gly Pro Ser Gly 115 120 125 Arg Pro Gly Pro Ser Thr Phe Gln Pro Gly Pro Gly Ala Pro Gly Gly 130 135 140 Leu Arg Asp Arg Ser Ser Ala Trp Leu Pro Gln Leu Met Pro Gln Ala 145 150 155 160 Pro Arg Pro Glu Leu Cys Tyr Pro Asp Gln His Leu Pro Val Arg Pro 165 170 175 Val Pro Val Pro Gly Pro Val Arg Pro Val Pro Arg Leu Pro Phe Ala 180 185 190 Asp Tyr Gly His Pro Leu Arg Phe Lys Ser Asp His Val Val Gly Ala 195 200 205 Gly Asn Pro Glu Arg Glu Pro Phe Lys Gln Cys Pro Ala Cys Val Pro 210 215 220 Val Ser Pro Tyr Gln Ser Phe Pro Leu Ser Glu Gly Gln Asp Ser Ser 225 230 235 240 Ser Ala Leu Gly Val Pro Gln Gln Arg Gly Phe Arg His Val Ser Cys 245 250 255 Ser Pro Tyr His Arg Ser Gly Leu Val Ser Glu Pro Ala Arg Asp Leu 260 265 270 Gln Pro Thr Tyr Cys Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro 275 280 285 Pro Pro Leu Pro Ala Pro Pro Pro Gln Pro Gln Gln Pro His Phe Leu 290 295 300 Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Ala Leu His Phe Leu Pro Pro Pro Pro Pro 305 310 315 320 Pro Pro Ser Pro Pro Ser Phe Ser Leu Thr Tyr Asp Thr Asp Lys Glu 325 330 335 Asn Thr Asn Asp Gln Asp Ala Glu Ala Pro Thr Glu Pro Ser Gln Asp 340 345 350 Ser Pro Gln Glu Gln Ser Asn 355 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Bacteriophage P1 <400> 17 ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant loxP (lox71) sequence <400> 18 taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant loxP (lox66) sequence <400> 19 ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34

Claims

하기 (1) 및 (2) 를 체세포 내로 전달하는 단계를 포함하는, iPS 세포를 생산하는 방법:
(1) GLIS 패밀리 아연 핑거 1 (GLIS1) 및/또는 이를 인코딩하는 핵산,
(2) Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 물질, 여기서 상기 물질은 Oct3/4, Oct1A 및 Oct6 으로 이루어지는 Oct 패밀리의 일원, Sox2, Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17 및 Sox18 로 이루어지는 Sox 패밀리의 일원, c-Myc, L-Myc 및 N-Myc 로 이루어지는 Myc 패밀리의 일원, Nanog, 및 Lin28 및 Lin28b 로 이루어지는 Lin28 패밀리의 일원, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함함.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4 또는 이를 인코딩하는 핵산, 및 Sox2 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4 또는 이를 인코딩하는 핵산, 및 c-Myc 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (2) 에서 언급된 물질이 Oct3/4 또는 이를 인코딩하는 핵산, Sox2 또는 이를 인코딩하는 핵산, 및 c-Myc 또는 이를 인코딩하는 핵산을 포함하는 방법.
하기 (1) 및 (2) 를 포함하는, 체세포로부터의 iPS 세포 유도용 조성물:
(1) GLIS1 및/또는 이를 인코딩하는 핵산,
(2) Klf4 와 조합되는 경우 체세포로부터 iPS 세포를 유도할 수 있는 물질, 여기서 상기 물질은 Oct3/4, Oct1A 및 Oct6 으로 이루어지는 Oct 패밀리의 일원, Sox2, Sox1, Sox3, Sox7, Sox15, Sox17 및 Sox18 로 이루어지는 Sox 패밀리의 일원, c-Myc, L-Myc 및 N-Myc 로 이루어지는 Myc 패밀리의 일원, Nanog, 및 Lin28 및 Lin28b 로 이루어지는 Lin28 패밀리의 일원, 및 이들을 인코딩하는 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함함.
삭제
GLIS1 을 인코딩하는 외래 핵산을 함유하는 iPS 세포.
삭제
제 10 항에 있어서, 외래 핵산이 게놈 내에 통합되어 있는 iPS 세포.
제 10 항에 따른 iPS 세포를 처리하여 체세포로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 체세포의 생산 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제