JP5761826B2 - 改変ラミニンおよびその利用 - Google Patents
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Description
[1]ラミニン、または、ヘテロ3量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のN末端、α鎖のC末端、β鎖のN末端およびγ鎖のN末端の少なくとも1箇所に細胞増殖制御分子が結合していることを特徴とする改変ラミニン。
[2]細胞増殖制御分子が、細胞接着分子である前記[1]に記載の改変ラミニン。
[3]細胞増殖制御分子が、増殖因子結合分子である前記[1]に記載の改変ラミニン。
[4]ラミニンフラグメントが、インテグリン結合活性を有していることを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の改変ラミニン。
[5]ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである前記[4]に記載の改変ラミニン。
[6]ラミニンが、α1〜α5から選択される1種のα鎖、β1〜β3から選択される1種のβ鎖、γ1〜γ3から選択される1種のγ鎖からなることを特徴とする前記[1]〜[5]のいずれかに記載の改変ラミニン。
[7]ラミニンが、ラミニンα5β1γ1またはラミニンα3β3γ2である前記[6]に記載の改変ラミニン。
[8]細胞接着分子が、以下の(a)〜(e)から選択される少なくとも1種以上であることを特徴とする前記[2]に記載の改変ヒトラミニン。
(a)インテグリンと結合する細胞接着分子
(b)膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子
(c)ジスコイジンドメイン受容体と結合する細胞接着分子
(d)ジストログリカンと結合する細胞接着分子
(e)細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子
[9]細胞接着分子が、以下の(a)〜(k)から選択される少なくとも1種以上であることを特徴とする前記[2]に記載の改変ヒトラミニン。
(a)フィブロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(b)コラーゲンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(c)ビトロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(d)ネフロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(e)オステオポンティンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(f)MAEGまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(g)テネイシンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(h)SVEP1またはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(i)TGF−β1 latency associated peptideまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(j)TGF−β3 latency associated peptideまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(k)ラミニンα鎖の球状ドメイン4および/または5
ラミニンα鎖の球状ドメイン4および/または5
[10]増殖因子結合分子が、以下の(a)〜(f)から選択される少なくとも1種以上であることを特徴とする前記[3]に記載の改変ヒトラミニン。
(a)パールカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(b)アグリンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(c)XVIII型コラーゲンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(d)シンデカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(e)グリピカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(f)latent TGF−βbinding proteinまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
[11]ヒト由来である前記[1]〜[10]のいずれかに記載の改変ラミニン。
[12]哺乳動物細胞の培養方法であって、前記[1]〜[11]のいずれかに記載の改変ヒトラミニンの存在下で培養することを特徴とする培養方法。
[13]哺乳動物細胞が、ES細胞、iPS細胞または体性幹細胞である前記[12]に記載の培養方法。
[14]フィーダー細胞を用いないことを特徴とする前記[12]または[13]に記載の培養方法。
[15]前記[1]〜[11]のいずれかに記載の改変ヒトラミニンがコーティングされていることを特徴とする培養基材。
[16]改変ヒトラミニンが0.03〜25μg/cm2の濃度でコーティングされていることを特徴とする前記[15]に記載の培養基材。
[17]前記[1]〜[11]のいずれかに記載の改変ラミニンの存在下で、核初期化物質を体細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするiPS細胞の樹立方法。
[18]前記核初期化物質は、Octファミリー、Soxファミリー、Klfファミリー、LinファミリーおよびGlisファミリー並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種類以上の物質を含むことを特徴とする前記[17]に記載のiPS細胞の樹立方法。
本発明は、ラミニン、または、ヘテロ3量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のN末端、α鎖のC末端、β鎖のN末端およびγ鎖のN末端の少なくとも1箇所に細胞増殖制御分子が結合していることを特徴とする改変ラミニンを提供する。
ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の3本のサブユニット鎖からなるヘテロ3量体分子である。α鎖はα1〜α5の5種類、β鎖はβ1〜β3の3種類、γ鎖はγ1〜γ3の3種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも12種類以上のアイソフォームが存在する(表1参照)。本発明の改変ラミニンを構成するラミニンは、いずれのアイソフォームであってもよい。すなわち、本発明の改変ラミニンを構成するラミニンは、α1〜α5から選択される1種のα鎖、β1〜β3から選択される1種のβ鎖、γ1〜γ3から選択される1種のγ鎖からなるものであればよい。具体的には、表1に記載の12種類、およびこれら以外のすべてのアイソフォームを好適に用いることができる。好ましくはラミニンα3β3γ2、ラミニンα5β1γ1である。
(a)インテグリンと結合する細胞接着分子
(b)膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子
(c)ジスコイジンドメイン受容体と結合する細胞接着分子
(d)ジストログリカンと結合する細胞接着分子
(e)細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子
本発明は、上記本発明の改変ラミニンの存在下で哺乳動物細胞を培養する培養方法を提供する。本発明の改変ラミニンは、高い細胞接着活性および/または増殖刺激活性を有しているので、哺乳動物細胞の足場となる細胞外基質として用いることにより、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養することが可能となる。
(i) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(ii) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(iii) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(iv) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(v) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
(1)フィーダー細胞との共培養系からヒトiPS細胞を回収する
以下の方法1または方法2のいずれかの方法で、フィーダー細胞との共培養系からヒトiPS細胞を回収する。
方法1:
フィーダー細胞(例えばMEF)と共培養しているヒトiPS細胞の培養ディッシュ(3〜5日目)に0.25%トリプシン/DMEM−F12を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で2〜3分間恒温処理し、培養ディッシュをDMEM−F12で洗浄してフィーダー細胞を除去する。培養液を加えて全体細胞を物理的に剥離した細胞懸濁液をBD Falconセルストレーナー100μm(BD Falcon #352460)に通した後、ストレーナーを洗浄することでヒトiPS細胞のコロニーのみを分離し、回収する。
フィーダー細胞(例えばMEF)と共培養しているヒトiPS細胞の培養ディッシュ(3〜5日目)に細胞剥離液(例えば、ES/iPS細胞用剥離液(リプロセル RCHETP002)、1mg/ml dispase/DMEM−F12、10mg/ml collagenaseIV/DMEM−F12など)を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で5分間恒温処理し、ヒトiPS細胞とMEFを剥離する。細胞を15ml遠心チューブに移し、培養液を約10ml入れて細胞を懸濁した後、5分間チューブを静置してコロニーのみを沈降させる。上清を除去し、同様の操作を2回以上繰り返して、ヒトiPS細胞のコロニーのみを沈降させ、回収する。
回収したヒトiPS細胞のコロニーを単一細胞に分散させる。単一細胞に分散させる方法は特に限定されないが、例えば、トリプシン処理する方法、P−1000ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりコロニーを砕く方法等が挙げられる。単一細胞に分散させた後、適切な培養液(例えばTeSR2など)に懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング(例えば1.0μg/cm2)した培養ディッシュに播種する。培養は、用いた培養液に適合するCO2濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
拡大エリアの不足あるいはコロニー内に死細胞の出現が目立つようになるのを目安に、継代操作を行う。本発明の培養方法では、従来の方法と同様にヒトiPS細胞を適度な大きさのコロニー形態を維持した状態で播種する方法で継代培養を行ってもよく、ヒトiPS細胞を単一細胞に分散させて播種する方法で継代培養を行ってもよい。ここで、単一細胞に分散された状態は、細胞懸濁液中の全細胞が単一細胞に分散されていることを要するものではなく、単一細胞に分散された細胞以外に数個〜十数個程度が接着した状態の細胞が細胞懸濁液中に含まれている状態も単一細胞に分散された状態に含まれる。
ヒトiPS細胞を培養している培養ディッシュに、TrypLE Select(商品名、Invitrogen #12563011)を添加して(例えば1ml/100mmディッシュ)、37℃で5分間恒温処理する。例えばP−1000ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトiPS細胞のコロニーを砕き、単一細胞に分散させる。培養液を加えて細胞を懸濁し、遠心チューブに回収する。遠心(1000×g、3分)と同培養液による洗浄操作を2度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング(例えば1.0μg/cm2)した培養ディッシュに、例えば約40000細胞/cm2の播種密度で単一細胞に分散したヒトiPS細胞を播種する。培養は、用いた培養液に適合するCO2濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
ヒトiPS細胞を単一細胞に分散しない場合は、細胞の剥離にCollagenaseIV、Dispase、Accutase等の酵素を用いる。ヒトiPS細胞を培養している培養ディッシュに、10mg/ml collagenase/DMEM−F12、または2mg/ml dispase/DMEM−F12、またはAccutase(Millipore #SCR005)を添加して(例えば1ml/60mmディッシュ)、37℃で5分間恒温処理する。酵素液を除いて培養液を加え、例えばP−1000のピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトiPS細胞が約50〜約100個のコロニー状を維持する程度に小さく砕く。細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、遠心(200×g、3分)と同培養液による洗浄操作を2度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、ヒト由来の改変ラミニンをコーティング(例えば1.5μg/cm2)した培養ディッシュに2分の1〜4分の1希釈量を播種する。培養は、用いた培養液に適合するCO2濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
本発明は、上記本発明の改変ラミニンの存在下でiPS細胞を樹立する方法を提供する。本発明のiPS細胞樹立方法は、上記本発明の改変ラミニンの存在下で核初期化物質を体細胞に接触させる工程を含むものであればよい。さらに核初期化物質の接触を受けた体細胞を、本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程を含むことが好ましい。
(vi) Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)
(vii) Okita, K. et al., Nature, 448: 313-317 (2007)
(viii) Wernig, M. et al., Nature, 448: 318-324 (2007)
(ix) Maherali, N. et al., Cell Stem Cell, 1: 55-70 (2007)
(x) Nakagawa, M. et al., Nat. Biotethnol., 26: 101-106 (2008)
(xi) Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)
(xii) Yu, J. et al., Science, 318: 1917-1920 (2007)
(xiii) Maekawa, M. et al., Nature, 474: 225-229 (2011)
このように、体細胞に特定因子を導入することにより、ヒトおよびマウスで、分化多能性においてES細胞と遜色のないiPS細胞を作製できることが示された。当該特定因子については、本発明において「核初期化物質」と定義を行うものとし、体細胞に導入することにより、あるいはiPS細胞の樹立効率改善因子と共に体細胞に接触させることにより、該体細胞からiPS細胞を誘導することができる物質(群)であれば、タンパク性因子またはそれをコードする核酸(ベクターに組み込まれた形態を含む)、あるいは低分子化合物等のいかなる物質から構成されてもよい。
(1) Oct3/4, Klf4, c−Myc
(2) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。さらに、c−MycはT85A(活性型変異体), L−Mycで置換可能である。)
(3) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, Fbx15, Nanog, ERas, TcelI
(4) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, TERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(5) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, TERT, HPV16 E6
(6) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, TERT, HPV16 E7
(7) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, TERT, HPV6 E6, HPV16 E7
(8) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, TERT, Bmil
(以上、WO 2007/069666を参照(但し、上記(2)の組み合わせにおいて、Sox2からSox18への置換、Klf4からKlf1もしくはKlf5への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)。「Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Oct3/4, Klf4(またはKlf5),c−Myc, Sox2」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, hTERT, SV40LT」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。)
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2(Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照)
(10) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28(Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照)
(11) Oct3/4, Sox2, Nanog, Lin28, hTERT, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照)
(12) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, Nanog, Lin28(Cell Research (2008) 600-603を参照)
(13) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, SV40LT(Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照)
(14) Oct3/4, Klf4(Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照)
(15) Oct3/4, c−Myc(Nature 454:646-650 (2008)を参照)
(16) Oct3/4, Sox2(Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照)
(17) Oct3/4, Sox2, Nanog(WO2008/118820を参照)
(18) Oct3/4, Sox2, Lin28(WO2008/118820を参照)
(19) Oct3/4, Sox2, c−Myc, Esrrb(ここで、EsrrbはEsrrgで置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(20) Oct3/4, Sox2, Esrrb(Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照)
(21) Oct3/4, Klf4, L−Myc(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107, 14152-14157 (2010) を参照)
(22) Oct3/4, Nanog
(23) Oct3/4(Cell 136: 411-419 (2009)、Nature, 08436, doi:10.1038 published online(2009)
(24) Oct3/4, Klf4, c−Myc, Sox2, Nanog, Lin28, SV40LT(Science, 324: 797-801 (2009)を参照)
(25) Oct3/4, Klf4, Sox2, c−Myc, Glis1(Nature, 474: 225-229 (2011), WO2010/098419, WO2011/102531を参照)
(26) Oct3/4, Klf4, Sox2, Glis1(Nature, 474: 225-229 (2011) , WO2010/098419, WO2011/102531を参照)
上記(1)〜(26)において、Oct3/4に代えて他のOctファミリーのメンバー、例えばOct1A、Oct6などを用いることもできる。また、Sox2(またはSox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18)に代えて他のSoxファミリーのメンバー、例えばSox7などを用いることもできる。また、Glis1に代えて他のGlisファミリーメンバーGlis2、Glis3などを用いることもできる。さらに上記(1)〜(26)においてc−MycまたはLin28を核初期化物質として含む場合、c−MycまたはLin28に代えてそれぞれL−MycまたはLin28Bを用いることもできる。
これらの組み合わせの中で、Oct3/4, Sox2, Klf4, L−Myc, Lin28およびGlis1から選択される少なくとも1つ、好ましくは2つ以上、より好ましくは3つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。
本発明は、幹細胞の急速拡大方法を提供する。本発明の急速拡大方法は、幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散された幹細胞を、上記本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程とを含み、単一細胞に分散された幹細胞を約2×104〜約20×104cell/cm2の密度で播種するものであればよい。播種密度は、約3×104〜約10×104cell/cm2がより好ましく、約4×104〜約5×104cell/cm2がさらに好ましい。従来の培養系では、単一に分散された幹細胞を上記細胞密度で播種した場合の接着効率は非常に低いものであるが、本発明の急速拡大方法によれば、顕著に高い接着効率が得られ、その後旺盛に増殖するので、従来法と比較して格段の速度で幹細胞を増殖させることができる。
本発明の幹細胞の急速拡大方法は、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞に適用することが好ましく、ES細胞に適用することがより好ましい。また、ヒト多能性幹細胞に適用することが好ましく、ヒトES細胞に適用することがより好ましい。本発明の幹細胞の急速拡大方法をヒト幹細胞に適用する場合には、ヒト由来の改変ラミニンを使用することが好ましい。
本発明は、幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法を提供する。本発明の単一細胞由来クローン分離方法は、幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散された幹細胞を、上記本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程とを含み、単一細胞由来のコロニーを形成させるものであればよい。本発明の単一細胞由来クローン分離方法によれば、従来の培養系では困難であった幹細胞の単一細胞由来クローンを形成させ、分離することができ、均一な幹細胞を容易に取得することが可能となる。
本発明の幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法は、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞に適用することが好ましく、ES細胞に適用することがより好ましい。また、ヒト多能性幹細胞に適用することが好ましく、ヒトES細胞に適用することがより好ましい。本発明の幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法をヒト幹細胞に適用する場合には、ヒト由来の改変ラミニンを使用することが好ましい。
本発明は、幹細胞の単一細胞培養方法を提供する。本発明の単一細胞培養方法は、幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散された幹細胞を、上記本発明の改変ラミニンの存在下で培養する工程とを含み、細胞を増殖させることなく単一細胞の状態で維持するものであればよい。コロニーを形成した幹細胞は、コロニー周辺部とコロニー内部とで細胞の状態が異なる場合があるが、本発明の単一細胞培養方法によれば、細胞はコロニーを形成しないので、状態の均一な幹細胞を得ることができ、分化誘導効率の向上が期待できる。
本発明の幹細胞の単一細胞培養方法は、ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞に適用することが好ましく、ES細胞に適用することがより好ましい。また、ヒト多能性幹細胞に適用することが好ましく、ヒトES細胞に適用することがより好ましい。本発明の幹細胞の単一細胞培養方法をヒト幹細胞に適用する場合には、ヒト由来の改変ラミニンを使用することが好ましい。
本発明は、上記本発明の改変ラミニンがコーティングされている培養基材を提供する。本発明の培養基材を用いて培養する細胞は特に限定されず、培養可能な哺乳動物細胞であればどのような細胞でも本発明の培養基材を用いて培養することができる。好ましくは幹細胞である。幹細胞には体性幹細胞、多能性幹細胞などが含まれる。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、ES細胞(胚性幹細胞)、iPS細胞(人工多能性幹細胞)、mGS細胞(多能性生殖幹細胞)、ES細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。より好ましくは多能性幹細胞であり、さらに好ましくはES細胞、iPS細胞である。哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。本発明の培養基材は、従来フィーダー細胞を用いて培養している細胞を、フィーダー細胞を用いることなく培養する場合に非常に有用である。
(1)Plus#1ラミニンE8用発現ベクターの作製
Plus#1ラミニンE8(組換えヒトラミニンα5β1γ1のE8フラグメントとヒトラミニンα1鎖球状ドメイン4−5番目を融合させた改変ヒトラミニン)は、組換えヒトラミニン511E8(以下「rhLM511E8」と記す)を作製した後に、ヒトラミニンα5鎖のE8のC末端部にヒトラミニンα1鎖球状ドメイン4−5番目(以下「ヒトラミニンα1鎖LG45」と記す)を付加して作製した。
rhLM511E8は、Idoら(Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins”, The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007)に記載の方法に従い、以下のように作製した。
(i) 6×Hisタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号1)
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’(reverse、配列番号2)
(ii) HAタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号3)
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号4)
(iii) FLAGタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’(forward、配列番号5)
5’-GATGATGATAAGGATATCGAATTCCT-3’(reverse、配列番号6)
(iv) α5鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’(forward、配列番号7)
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’(reverse、配列番号8)
(v) β1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’(forward、配列番号9)
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’(reverse、配列番号10)
(vi) γ1鎖E8フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’(forward、配列番号11)
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’(reverse、配列番号12)
5’側から、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド−6×Hisタグ−ヒトラミニンα5鎖E8−ヒトラミニンα1鎖LG45を順にコードするDNA断片を獲得するために、ヒトラミニンα5鎖E8をコードするDNA断片と、ヒトラミニンα1鎖LG45をコードするDNA断片をそれぞれ取得し、エクステンションPCRによってこれら2種類のDNA断片を連結・増幅した。増幅産物を制限酵素AscIで消化し、ヒトラミニンα5鎖E8発現ベクターのAscI−PmeI部位に挿入し、ヒトラミニンα1鎖LG45融合ヒトラミニンα5鎖E8フラグメント発現ベクターを作製した。
(vii) ヒトラミニンα5鎖部分断片増幅用プライマー
5’-CAATGATCTGGAGCTGGCCGACGCCTACTACCTG-3’(forward、配列番号13)
5’-CTCTGCATCAGGCCCCAGGCCCGGGGTC-3’(reverse、配列番号14)
(viii) ヒトラミニンα1鎖LG45部位増幅用プライマー
5’-CCTGGGGCCTGATGCAGAGGACAGCAA-3’(forward、配列番号15)
5’-AAACTCAGGACTCGGTCCCAGGACAGGAATGAAGG-3’(reverse、配列番号16)
(ix) ヒトラミニンα5鎖E8のC末端部とヒトラミニンα1鎖LG45部位増幅用プライマー
5’-CAATGATCTGGAGCTGGCCGACGCCTACTACCTG-3’(forward、配列番号13)
5’-AAACTCAGGACTCGGTCCCAGGACAGGAATGAAGG-3’(reverse、配列番号16)
Plus#2ラミニンE8(rhLM511E8とヒトフィブロネクチンIII型モジュールの7番目〜10番目を融合させた改変ヒトラミニン)はrhLM511E8を作製した後に、ヒトラミニンγ1鎖のE8のN末端部にヒトフィブロネクチンの細胞接着部位(ヒトフィブロネクチンIII型モジュールの7番目〜10番目、以下「FNIII7〜10」と記す)を付加して作製した。
上記(1−1)と同様の方法でヒトラミニンα5鎖E8フラグメント(N末端側に6×Hisタグを含む)、β1鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)、γ1鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)の発現ベクターをそれぞれ作製した。
5’側から、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド−FLAGタグ−FNIII7〜10−γ1鎖E8を順にコードするDNA断片を獲得するために、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド−FLAGタグをコードするDNA断片、FNIII7〜10をコードするDNA断片、およびγ1鎖E8フラグメントをコードするDNA断片をそれぞれ取得し、エクステンションPCRによってこれら3種類のDNA断片を連結・増幅した。増幅産物を制限酵素NheIとNotIで消化し、哺乳細胞用発現ベクターpSecTag2B(Invitrogen、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチドをコードする遺伝子配列を内在的に有する。)の当該部位に挿入し、FNIII7−10融合ヒトラミニンγ1E8フラグメント発現ベクターの発現ベクターを作製した。
(x) シグナルペプチド配列−FLAGタグ配列増幅用プライマー
5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’(forward、配列番号17)
5’-TGGTGGAGACAATGGATCCTTATCATCATCATCC-3’(reverse、配列番号18)
(xi) γ1鎖E8フラグメント配列増幅用プライマー
5’-TAATTACCGAACAGATAATGACATTCTCAACAACC-3’(forward、配列番号19)
5’-GAAAGGACAGTGGGAGTGGCACC-3’(reverse、配列番号20)
(xii) FNIII7〜10配列増幅用プライマー
5’-GATGATGATAAGGATCCATTGTCTCCACCAACAA-3’(forward、配列番号21)
5’-ATGTCATTATCTGTTCGGTAATTAATGGAAATTGG-3’(reverse、配列番号22)
(xiii) FNIII7〜10融合ヒトラミニンγ1E8フラグメント増幅用プライマー
5’-GAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTA-3’(forward、配列番号17)
5’-GAAAGGACAGTGGGAGTGGCACC-3’(reverse、配列番号20)
Plus#1ラミニンE8とPlus#2ラミニンE8の発現は、作製した各鎖の発現ベクターをFreeStyle293−F細胞(商品名、Invitrogen、以下「293−F細胞」と記す)に導入して行った。すなわち、Plus#1ラミニンE8の場合は、ヒトラミニンα1鎖LG45融合ヒトラミニンα5鎖E8フラグメント発現ベクター、ヒトβ1鎖E8フラグメント発現ベクターおよびヒトγ1鎖E8フラグメント発現ベクターを293−F細胞に導入し、Plus#2ラミニンE8の場合は、ヒトα5鎖E8フラグメント発現ベクター、ヒトβ1鎖E8フラグメント発現ベクターおよびFNIII7〜10融合ヒトラミニンγ1E8フラグメント発現ベクターを293−F細胞に導入した。300mlの293−F細胞(1.0×106個/ml)にトランスフェクション試薬293fectin(商品名、Invitrogen)およびOpti−MEM(商品名、Invitrogen)を用いて各鎖発現ベクターを150μgずつ同時にトランスフェクトし、72時間培養を行った後、培養液を回収した。培養液は1000×gで10分間遠心し、その上清をさらに15,000×gで30分間遠心し、細胞や不溶物を除去した。培養上清に10mlのNi−NTA agarose(キアゲン)を添加し一晩インキュベートして目的タンパク質を吸着させた。Ni−NTA agaroseを回収し、TBS(−)(Ca、Mgを含まないトリス緩衝生理的食塩水)および10mMイミダゾール/TBS(−)で洗浄したのち200mMイミダゾール/TBS(−)で溶出した。A280の吸光度により溶出画分中におけるタンパク質量を確認し、目的タンパク質が溶出された画分に3mlのANTI−FLAG M2 affinity Gel(シグマ)を添加し、4℃で一晩旋回させた。ゲルをポリプレップカラム(Bio-Rad、#731-1550B04)に移し、TBS(−)で洗浄後、100μg/ml FLAG peptide(Sigma、#F3290)を含むTBS(−)で溶出した。溶出フラクションを銀染色で確認し、溶出された画分を合わせてPBS(−)(リン酸緩衝生理的食塩水)に対して透析を行った。透析後の精製物を0.22μmのディスクシリンジフィルター(Millipore、#SLGV033RS)に通すことで滅菌し、−80℃で保存した。
SDS−PAGE法により精製したPlus#1ラミニンE8とPlus#2ラミニンE8の電気泳動パターンをrhLM511E8と比較した。5%〜20%の濃度勾配をもつポリアクリルアミドゲル(ATTO、#2331830)の1ウェルにrhLM511E8を1.5μg、Plus#1ラミニンE8を1.9μg、Plus#2ラミニンE8を1.9μgそれぞれアプライし、20mAで75分間電気泳動した。電気泳動は、Laemmli法に従い、25mMトリス、192mMグリシン、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムからなる緩衝液を用いて還元条件下で行った。タンパク質の染色にはQuick−CBB(WAKO、#299-50101)を用いた。
結果を図1に示した。Plus#1ラミニンE8では3本のバンド(高分子側からα5E8+α1LG45、γ1E8、β1E8)が観察された。α5E8+α1LG45のバンド位置はα5E8より高分子側にシフトしていた。この結果は、α5E8にα1LG45が付加されていることを示している。Plus#2ラミニンE8でも3本のバンド(高分子側からα5E8、γ1E8+FNIII7〜10、β1E8)が観察された。γ1E8+FNIII7〜10のバンド位置はγ1E8より高分子側にシフトしていた。この結果は、γ1E8にFNIII7〜10が付加されていることに示している。以上の結果から、設計したPlus#1ラミニンE8およびPlus#2ラミニンE8が得られていることを確認した。
(1)ヒトiPS細胞
ヒトiPS細胞は独立行政法人医薬基盤研究所生物資源バンクより購入した株(クローン名:tic(JCRB1331))を使用した。tic細胞は、独立行政法人医薬基盤研究所生物資源バンクが推奨する方法に従い、マウスフィーダー細胞との共培養で維持した。共培養ディッシュに、1U/mlディスパーゼ/DMEM−F12を添加し、tic細胞のコロニーをスクレーパーでかき集めた。このtic細胞コロニーとマウスフィーダー細胞を含む溶液をBD Falconセルストレーナー100μmに通し、ストレーナーを洗浄することでtic細胞コロニーを分離した。残留したコロニーをゼノフリー培地であるTeSR2(商品名、STEMCELL TECHNOLOGIES)で回収し、P−1000ピペットマンで細かく砕いた後、TeSR2に再懸濁し、マトリゲルをコートした培養器に播種した。37℃、5%CO2条件下、毎日培養液交換を行い、4−5日まで拡大培養を行った。このように拡大培養された細胞を実験に供した。
細胞外基質として、Plus#1ラミニンE8、Plus#2ラミニンE8およびBDマトリゲルヒトES細胞用(商品名、BD Bioscience #354277、以下「マトリゲル」と記す)を使用した。Plus#1ラミニンE8溶液、Plus#2ラミニンE8溶液、マトリゲル溶液をリン酸緩衝生理的食塩水(Invitrogen、#10010−023)で希釈した後、BD FALCON MICROTEST96ウェルマイクロプレート(商品名、BD Biosciences、#353072)に添加し、4℃で一晩静置してコーティングを行った。なお、マトリゲル溶液は0.1〜30μg/cm2、Plus#1ラミニンE8溶液およびPlus#2ラミニンE8溶液は0.0038〜3.8μg/cm2の範囲になるようにプレートへ添加した。
TeSR2を用いて培養したヒトiPS細胞(tic)から培地を除去した後、4.8mM EDTAを含むリン酸緩衝生理的食塩水を加えて、3分間37℃で恒温処理した。次に、TrypLE Select(商品名、Invitrogen、#12563-011)を加えて3分間、37℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。細胞数をカウントした後、プレートに2.7×104cell/well(8.2×104cell/cm2)の密度で細胞を播種した。細胞播種から6時間後、上清を除いてDMEM−F12で1度ウェルを洗浄し、10%中性ホルマリンを含むリン酸緩衝生理的食塩水を加えて10分間細胞を固定した。細胞の染色には、ディフ・クイック(登録商標、シスメックス株式会社、#16920)を用いた。風乾の後、1%SDSを加えて細胞を可溶化し、マルチプレートリーダーを用いて波長595nmの吸光度を測定した。
結果を図2に示した。Plus#1ラミニンE8とPlus#2ラミニンE8は低濃度のコーティング(0.13μg/cm2)でも顕著に高い接着細胞数を示した。一方、汎用されているマトリゲルは10μg/cm2のコーティングで接着細胞数が最大値に達した。しかし、この最大値はPlus#1ラミニンE8およびPlus#2ラミニンE8の最大値より低かった。この結果から、Plus#1ラミニンE8およびPlus#2ラミニンE8は、マトリゲルの約1/80のタンパク質量でマトリゲルより高いヒトiPS細胞の細胞接着活性を示すことが明らかとなった。加えて、Plus#1ラミニンE8とPlus#2ラミニンE8の至適コーティング濃度は約0.13〜3.8μg/cm2と考えられた。
(1)ヒトiPS細胞
ヒトiPS細胞は32R1(Masato Nakagawa, Nanako Takizawa, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Shinya Yamanaka, “Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc.”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(32), 14152-14157, 2010)を使用した。32R1細胞は、MSTOマウスフィーダー細胞上で維持した(Kazutoshi Takahashi, Koji Tanabe, Mari Ohnuki, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Kiichiro Tomoda, Shinya Yamanaka, “Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.”, Cell,131(5), 861-872, 2007)。
細胞外基質として、Plus#1ラミニンE8、Plus#2ラミニンE8およびマトリゲルを用いた。Plus#1ラミニンE8溶液とPlus#2ラミニンE8溶液をリン酸緩衝生理的食塩水で希釈した後、6ウェルマイクロプレートに0.5μg/cm2の濃度で添加し、4℃で一晩静置、または37℃で1時間静置してコーティングを行った。マトリゲル溶液はDMEM/F12溶液で希釈した後、6ウェルマイクロプレートに35μg/cm2の濃度で添加し、室温で1時間静置してコーティングを行った。
フィーダー細胞上で培養した32R1細胞をリン酸緩衝生理的食塩水で洗浄し、細胞剥離剤(CTK溶液)を加え37℃で2分間程度処理しフィーダー細胞を除去した。その後、セルスクレーパーにて32R1細胞を回収し、細胞外基質をコーティングしたウェルに32R1細胞を播種した。24時間ごとに培地を交換した。5日目に細胞の状態を観察して写真撮影した(1st Passage)。7日目および14日目に細胞を継代し、21日目に細胞の状態を観察して写真撮影した(3rd Passage)。
ヒトiPS細胞(32R1細胞)の観察結果を図3に示した。上段の1st Passageは、各種細胞外基質をコーティングした培養器で培養を開始してから5日目の細胞の状態を示す写真であり、中段および下段の3rd Passageは、2回継代した後(各種細胞外基質をコーティングした培養器で培養を開始してから21日目)の細胞の状態を示す写真である。1st Passage(5日目)では、マトリゲルコーティング上ではほとんど細胞が残っていなかったのに対して、Plus#1ラミニンE8コーティング上、およびPlus#2ラミニンE8コーティング上では、ヒトiPS細胞が生着していた。3rd Passage(21日目)では、ヒトiPS細胞のコロニーを観察することができ、Plus#1ラミニンE8コーティング上、およびPlus#2ラミニンE8コーティング上でヒトiPS細胞を継続して培養できることが明らかとなった。Plus#1ラミニンE8とPlus#2ラミニンE8を比較すると、Plus#2ラミニンE8コーティング上のほうが、Plus#1ラミニンE8コーティング上より細胞の数が多いことが確認された。
(1)実験方法
Plus#2ラミニンE8、rhLM511E8またはフィブロネクチンと、組換えヒトα5β1インテグリンまたはα6β1インテグリンとの結合活性を測定した。フィブロネクチンは、Sekiguchiらの方法(Kiyotoshi Sekiguchi and Sen-itiroh Hakomori, “Domain structure of human plasma fibronectin. Differences and similarities between human and hamster fibronectins.”, The Journal of Biological Chemistry, 258, 3967-3973, 1983)に従い、ゼラチン不溶化アフィニティーカラムを用いて精製したものを使用した。組換えヒトα5β1インテグリンはTakagiらが作製した発現ベクターを用いて作製した(Junichi Takagi, Harold P. Erickson, and Timothy A. Springer, “C-terminal opening mimics 'inside-out' activation of integrin alpha5beta1.”, Nature structural & molecular biology, 8(5), 412-416, 2001)。この組換えヒトα5β1インテグリンはα5サブユニットとβ1サブユニットの細胞外ドメインから構成されている。また、両サブユニットを2量体化するために、α5のC末端部には主に酸性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基からなる配列が、また、β1のC末端部には主に塩基性アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基からなる配列がそれぞれ付加されている。さらに、α5のC末端部にはFLAGタグ、β1のC末端部には6×Hisタグが付加されている。組換えヒトインテグリンα6β1はIdoらの方法(Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Yoshiko Yagi, Kiyotoshi Sekiguchi, “Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511 with the function-blocking monoclonal antibody 4C7.”, Matrix Biology, 25(2), 112-117, 2006)に従い作製した。分子構造は上記組換えヒトα5β1インテグリンと同様である。
結果を図4に示した。Plus#2ラミニンE8はヒトフィブロネクチンと同程度の組換えヒトα5β1インテグリンに対する結合活性を示した。また、rhLM511E8は組換えヒトα5β1インテグリンに対する結合活性を示さなかった。一方、Plus#2ラミニンE8はrhLM511E8と同程度の組換えヒトα6β1インテグリンに対する結合活性を示した。また、ヒトフィブロネクチンはヒトα6β1インテグリンに対する結合活性を示さなかった。以上の結果から、Plus#2ラミニンE8はα5β1インテグリンとα6β1インテグリンに対する結合活性を有する組換えタンパク質であることが示された。
(1)ヒトES細胞
ヒトES細胞はNational Stem Cell Bankより購入したH9株を使用した。フィーダー細胞には、マイトマイシンCで処理し細胞分裂を止めたSNL細胞(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073−1085 (1990))を用い、H9細胞のフィーダー細胞上への播き直しを行った。培地には霊長類ES細胞培養用培地(ReproCELL)を用い、共培養を行った。
細胞外基質として、(全長ラミニン511は、Idoら(Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada, Ariana C. Combs, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular dissection of the α-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10” Jhe Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004.)に記載の方法に従って作製した。
H9細胞は以下の方法により、SNLフィーダー細胞との共培養系から回収した。
(3−1)培地の準備
必要量の維持培養培地(mTeSR1(StemCell Technologies社)とNutriStem(コスモバイオ社)の1:1混合溶液)に1/1000量の10mM Y−27632を加えた。
(3−2)プレートのコーティング
6ウェルマイクロプレートにPBS(−)を1.5ml/wellを入れ、Plus#1ラミニンE8(コート量:0.5μg/cm2)を4.8μg/well加え、37℃ CO2 5%インキュベーターで60分反応させた後、維持培養培地1ml/well加え培地をなじませた後、上澄みを除去した。同様に、Plus#2ラミニンE8をコーティングしたウェルマイクロプレートを準備した。全長ラミニン511も同様にコーティングした(コート量:2.0μg/cm2)。それぞれのコーティングプレートは、維持培養培地(Y−27632入り)を1.5ml/well加え、インキュベーター下で保管した。なお、マトリゲル溶液については上記条件下で、0.1〜30μg/cm2の範囲になるようにプレートへ添加した。
培地を除去し、PBS4mlで一回洗浄した後に、PBSを完全に吸引除去し、CTK液を0.5ml加え、37℃でインキュベートした。殆どのフィーダー細胞が剥がれたらCTK液を吸引し、4mlのPBSで1回洗浄、その後にX0.5 TrypLE Select(Invitrogen社より購入)を600μl/wellずつ加えてなじませ、37℃ CO2 5%インキュベーターで1分さらに3分反応させた。その後、インキュベーターから取り出し顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞間接着が破壊され細胞が丸くなっている様子を確認した。先に加えたX0.5 TrypLE Selectを除去し、維持培養培地を3ml/well加えた後にセルスクレーパーで細胞を剥がした。
(3−4)細胞の培養
フィーダー細胞を除去し、単一に分散したH9細胞13,000個を上記にて予め調製したコーティングプレート(6-well plate)に播種し、37℃ CO2 5%インキュベーターで単一分散培養を行った。翌日、維持培養用培地に交換した。培地交換は1日おきに行い、培養開始後6、7日頃から毎日行った。
各種細胞外基質をコーティングした培養器でH9細胞の単一分散培養を行い、7日間培養を行った後、増殖した細胞コロニーをアルカリフォスファターゼ(ALP)染色した結果を図5に示した。図5中、上段左からコートなし(図中、None)、マトリゲルコート(図中、Matrigel)、全長ラミニン511コート(図中、LN511FL)、下段左からPlus#1ラミニンE8コート(図中、LN511E8plus#1)、Plus#2ラミニンE8コート(図中、LN511E8plus#2)である。アルカリフォスファターゼ染色により、下段のPlus#1ラミニンE8コートおよびPlus#2ラミニンE8コートの培養器においてH9細胞の良好な増殖が観察された。一方、上段のコートなしおよびマトリゲルコートの培養器ではH9細胞はほとんど観察されなかった。以上の結果から、Plus#1ラミニンE8またはPlus#2ラミニンE8をコーティングした培養基材を用いれば、単一分散によるヒトES細胞の培養方法を容易に提供できることが示された。
(1)ヒトiPS細胞
ヒトiPS細胞には、成人皮膚由来線維芽細胞(aHDF−Slc7al)に対してOct3/4、KLF4、SOX2、およびL−MYCの4遺伝子をレトロウイルスを用いて導入することにより樹立された32R1細胞(Masato Nakagawa, Nanako Takizawa, Megumi Narita, Tomoko Ichisaka, Shinya Yamanaka, “Promotion of direct reprogramming by transformation-deficient Myc.”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 107(32), 14152-14157, 2010)を使用した。
Plus#1ラミニンE8、Plus#2ラミニンE8、Plus#3ラミニンE8(rhLM511E8とヒトパールカンのドメインI〜IIIを融合させた改変ラミニン)、rhLM511E8およびマトリゲルを使用した。Plus#3ラミニンE8は、rhLM511E8を作製した後に、ヒトラミニンβ1鎖のE8のN末端部にヒトパールカンのドメインI〜III(以下「Pln−D1/2/3」と記す)を付加して、以下のとおり作製した。
上記(1−1)と同様の方法でヒトラミニンα5鎖E8フラグメント(N末端側に6×Hisタグを含む)、β1鎖E8フラグメント(N末端側にHAタグを含む)、γ1鎖E8フラグメント(N末端側にFLAGタグを含む)の発現ベクターをそれぞれ作製した。
5’側から、マウスIg−κ鎖V−J2−Cシグナルペプチド−Pln−D1/2/3−HAタグ−β1鎖E8を順にコードするDNA断片を獲得するために、Pln−D1/2/3をコードするDNA断片を取得し、制限酵素HindIIIで消化した。消化産物をヒトラミニンβ1鎖E8フラグメント発現ベクターの当該部位に挿入し、Pln−D1/2/3融合ヒトラミニンβ1鎖E8フラグメント発現ベクターを作製した。
まず、ヒトパールカン発現ベクター(Shaoliang Li, Chisei Shimono, Naoko Norioka, Itsuko Nakano, Tetsuo Okubo, Yoshiko Yagi, Maria Hayashi, Yuya Sato, Hitomi Fujisaki, Shunji Hattori, Nobuo Sugiura, Koji Kimata and Kiyotoshi Sekiguchi, “Activin A Binds to Perlecan through Its Pro-region That Has Heparin/Heparan Sulfate Binding Activity”, Journal of Biological Chemistry, 285(47), 36645-36655, 2010)を鋳型として、以下のプライマーを用いてPCRを行い、Pln−D1/2/3に相当する領域(Gly25−Glu1680)を増幅した。なお、プライマーの5’側には制限酵素HindIII認識配列が付加されている。得られたDNA断片を、制限酵素HindIIIで消化し、ヒトラミニンβ1鎖E8フラグメント発現ベクターの当該部位に挿入し、Pln−D1/2/3融合ヒトラミニンβ1鎖E8フラグメント発現ベクターを作製した。
(xiv) Pln−D1/2/3配列増幅用プライマー
5’-ACGAAGCTTGGGCTGAGGGCATACGATGGC-3’(forward、配列番号23)
5’-ATAAAGCTTCTCGACCACCAGTGGGGCTTGG-3’(reverse、配列番号24)
実施例1の(3)と同様の方法で、Plus#3ラミニンE8の発現および精製を行った。すなわち、ヒトα5鎖E8フラグメント発現ベクター、Pln−D1/2/3融合ヒトラミニンβ1鎖E8フラグメント発現ベクターおよびヒトγ1鎖E8フラグメント発現ベクターを293−F細胞に導入した以外は、実施例1の(3)と同様に行った。
32R1細胞は以下の方法により、SNLフィーダー細胞との共培養系から回収した。
(3−1)培地の準備
必要量の維持培養培地(mTeSR1(StemCell Technologies社)とNutriStem(コスモバイオ社)の1:1混合溶液)に1/1000量の10mM Y−27632を加えた。
(3−2)プレートのコーティング
6ウェルマイクロプレートにPBS(−)を1.5ml/wellを入れ、Plus#1ラミニンE8(コート量:0.5μg/cm2)を4.8μg/well加え、37℃ CO2 5%インキュベーターで60分反応させた後、維持培養培地1ml/well加え培地をなじませた後、上澄みを除去した。同様に、Plus#2および#3ラミニンE8をコーティングしたウェルマイクロプレートを準備した(いずれもコート量は0.5μg/cm2)。それぞれのコーティングプレートは、維持培養培地(Y−27632入り)を1.5ml/well加え、インキュベーター下で保管した。なお、マトリゲル溶液については上記条件下で、0.1〜30μg/cm2の範囲になるようにプレートへ添加した。
培地を除去し、PBS4mlで一回洗浄した後に、PBSを完全に吸引除去し、CTK液を0.5ml加え、37℃でインキュベートした。殆どのフィーダー細胞が剥がれたらCTK液を吸引し、4mlのPBSで1回洗浄、その後にX0.5 TrypLE Select(Invitrogen社より購入)を600μl/wellずつ加えてなじませ、37℃ CO2 5%インキュベーターで1分さらに3分反応させた。その後、インキュベーターから取り出し顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞間接着が破壊され細胞が丸くなっている様子を確認した。先に加えたX0.5 TrypLE Selectを除去し、持培養用培地を3ml/well加えた後にセルスクレーパーで細胞を剥がした。
(3−4)細胞の培養
フィーダー細胞を除去し、単一に分散した32R1細胞13,000個を上記にて予め調製したコーティングプレート(6-well plate)に播種し、37℃ CO2 5%インキュベーターで単一分散培養を行った。翌日、維持培養用培地に交換した。培地交換は1日おきに行い、培養開始後6、7日頃から毎日行った。細胞の継代は7〜9日ごとに行った。培養開始7日目の継代前の細胞の状態を写真撮影した(対物4倍)。その後10代継代培養を行った後、Oct3/4、SSEA−4およびTRA−1−60について免疫染色を行い、位相差像および蛍光像を写真撮影した(それぞれ対物10倍)。
培養開始7日目における継代前のヒトiPS細胞の状態を図6に示した。図6中、上段左からマトリゲルコート(図中、Matrigel(コート量:30μg/cm2))、rhLM511E8コート(図中、E8)、Plus#1ラミニンE8コート(図中、E8plus#1)、下段左からPlus#2ラミニンE8コート(図中、E8plus#2)、Plus#3ラミニンE8コート(図中、E8plus#3)である。各種細胞外基質をコーティングした培養器において、32R1細胞の生着が確認された。
(1)ヒトiPS細胞
実施例3、6と同じ32R1細胞を使用した。
(2)細胞外基質
実施例5と同様に、Plus#1ラミニンE8、Plus#2ラミニンE8、全長ラミニン511およびマトリゲルを使用した。
実施例3と同様にプレートのコーティングを行った。実施例6と同様にフィーダー細胞を除去し、単一に分散した32R1細胞13,000個を、予め調製したコーティングプレート(6-well plate)に播種し、37℃ CO2 5%インキュベーターで単一分散培養を行った。翌日、維持培養用培地に交換した。培地交換は1日おきに行い、培養開始後6、7日頃から毎日行った。
各種細胞外基質をコーティングした培養器で32R1細胞の単一分散培養を行い、7日間培養を行った後、増殖した細胞コロニーをアルカリフォスファターゼ(ALP)染色した結果を図8に示した。図8中、上段左からコートなし(図中、None)、マトリゲルコート(図中、Matrigel)、全長ラミニン511コート(図中、LN511FL)、下段左からPlus#1ラミニンE8コート(図中、LN511E8plus#1)、Plus#2ラミニンE8コート(図中、LN511E8plus#2)である。アルカリフォスファターゼ染色により、下段のPlus#1ラミニンE8コートおよびPlus#2ラミニンE8コートの培養器において32R1細胞の良好な増殖が観察された。一方、上段のコートなしおよびマトリゲルコートの培養器では32R1細胞はほとんど観察されなかった。以上の結果から、Plus#1ラミニンE8またはPlus#2ラミニンE8をコーティングした培養基材を用いれば、単一分散によるヒトiPS細胞の培養方法を容易に提供できることが示された。
(1)実験方法
上記実施例6および7のように予め樹立されたヒトiPS細胞株を用いるのではなく、Plus#1ラミニンE8またはPlus#2ラミニンE8をコーティングした培養器を用いてヒトiPS細胞の樹立を試みた。コーティング濃度は0.5μg/cm2とした。具体的には、Plus#1ラミニンE8またはPlus#2ラミニンE8をコーティングしたディッシュ上で、米国仮出願61/521,153に記載の方法に従い、成人皮膚由来線維芽細胞(HDF1388細胞)にエピソーマルプラスミドベクターpCEB−hSK−OおよびpCEB−hUL−Gを用いて初期化遺伝子を導入し、維持培養培地(mTeSR1(StemCell Technologies社)とNutriStem(コスモバイオ社)の1:1混合溶液)で培養を行った。初期化遺伝子の導入後30日目にヒトiPS細胞のコロニー数をカウントした。
これらのエピソーマルプラスミドは、Okita et al., “A more efficient method to generate integration-free human iPS cells”, Nature Methods, 8(5), 409 (2011)および国際公報WO2011/016588に記載のプラスミド等を用いて作製した。
3つの独立した実験(Exp.1、2、および3)における、ノンコートディッシュ、Plus#1ラミニンE8コートディッシュおよびPlus#2ラミニンE8コートディッシュ条件下でのヒトiPS細胞コロニー数(樹立数)を図9に示した。いずれの実験においても左がノンコートディッシュ、中央がPlus#1ラミニンE8コートディッシュ、右がPlus#2ラミニンE8コートディッシュを表す。図9から明らかなように、Exp.2のPlus#1ラミニンE8コートディッシュを除き、Plus#1ラミニンE8コートディッシュまたはPlus#2ラミニンE8コートディッシュにおけるヒトiPS細胞コロニー数(樹立数)が、ノンコートディッシュより増加した。この結果から、Plus#1ラミニンE8またはPlus#2ラミニンE8をコーティングした培養基材は、iPS細胞の樹立においても非常に有用であることが示された。
Claims (16)
- ラミニン、または、ヘテロ3量体を形成しているラミニンフラグメントのα鎖のN末端、α鎖のC末端、β鎖のN末端およびγ鎖のN末端の少なくとも1箇所に増殖因子結合分子が結合していることを特徴とする改変ラミニン。
- ラミニンフラグメントが、インテグリン結合活性を有していることを特徴とする請求項1に記載の改変ラミニン。
- ラミニンフラグメントが、ラミニンE8フラグメントである請求項2に記載の改変ラミニン。
- ラミニンが、α1〜α5から選択される1種のα鎖、β1〜β3から選択される1種のβ鎖、γ1〜γ3から選択される1種のγ鎖からなることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の改変ラミニン。
- ラミニンが、ラミニンα5β1γ1またはラミニンα3β3γ2である請求項4に記載の改変ラミニン。
- 増殖因子結合分子が、以下の(a)〜(f)から選択される少なくとも1種以上であることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の改変ラミニン。
(a)パールカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(b)アグリンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(c)XVIII型コラーゲンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(d)シンデカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(e)グリピカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント
(f)latent TGF−β binding proteinまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメント - ヒト由来である請求項1〜6のいずれかに記載の改変ラミニン。
- 哺乳動物細胞の培養方法であって、請求項1〜7のいずれかに記載の改変ラミニンの存在下で培養することを特徴とする培養方法。
- 哺乳動物細胞が、ES細胞、iPS細胞または体性幹細胞である請求項8に記載の培養方法。
- フィーダー細胞を用いないことを特徴とする請求項8または9に記載の培養方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の改変ラミニンがコーティングされていることを特徴とする培養基材。
- 改変ラミニンが0.03〜25μg/cm2の濃度でコーティングされていることを特徴とする請求項11に記載の培養基材。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の改変ラミニン、または、請求項1〜7のいずれかに記載の改変ラミニンにおいて増殖因子結合分子に代えて細胞接着分子が結合している改変ラミニンの存在下で、核初期化物質を体細胞に接触させる工程を含むことを特徴とするiPS細胞の樹立方法。
- 前記核初期化物質は、Octファミリー、Soxファミリー、Klfファミリー、LinファミリーおよびGlisファミリー並びにそれらをコードする核酸からなる群より選択される1種類以上の物質を含むことを特徴とする請求項13に記載のiPS細胞の樹立方法。
- 細胞接着分子が、以下の(a)〜(e)から選択される少なくとも1種以上であることを特徴とする請求項13または14に記載のiPS細胞の樹立方法。
(a)インテグリンと結合する細胞接着分子
(b)膜結合型プロテオグリカンと結合する細胞接着分子
(c)ジスコイジンドメイン受容体と結合する細胞接着分子
(d)ジストログリカンと結合する細胞接着分子
(e)細胞表面の糖鎖と結合する細胞接着分子 - 細胞接着分子が、以下の(a)〜(k)から選択される少なくとも1種以上であることを特徴とする請求項13または14に記載のiPS細胞の樹立方法。
(a)フィブロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(b)コラーゲンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(c)ビトロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(d)ネフロネクチンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(e)オステオポンティンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(f)MAEGまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(g)テネイシンまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(h)SVEP1またはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(i)TGF−β1 latency associated peptideまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(j)TGF−β3 latency associated peptideまたはその細胞接着活性部位を含むフラグメント
(k)ラミニンα鎖の球状ドメイン4および/または5
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