JP6605618B2 - 細胞支持複合体および細胞支持複合体の製造方法 - Google Patents
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Description
図2は、実施の形態に係る細胞支持複合体10の構成を模式的に示す図である。図2(A)は、基材が水透過性を有する実施の形態に係る細胞支持複合体の構成を示す図である。図2(B)は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、短時間培養した場合を示す図である。図2(C)は、基材が水透過性を有さない実施の形態に係る細胞支持複合体において、長時間培養した場合を示す図である。
基材20は、尿細管上皮細胞の培養に用いられるモジュールである。図2(A)には、基材20が水や各種イオンの透過性を有する場合を示す。この場合、基材20は、糖や低分子タンパク質の透過性も有することが好ましい。そのため、基材20には、孔が形成されている。基材20の平均孔径は、5μm以下である。このような基材20として、たとえば、Transwell(Corning社:平均孔径0.4または3.0μm)を用いることができる。平均孔径が5μm超の場合には、基材20を細胞が通過してしまう場合があるため好ましくない。
ラミニン分子30は、基材の少なくとも一部にコーティングされる接着分子であって、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ1本ずつ持つヘテロ三量体構造をとる。現時点では5種類のα鎖、3種類のβ鎖、3種類のγ鎖が同定されている。ラミニン分子30は、これらの組合せによって少なくとも12種類のアイソフォームを形成することが知られている。本実施の形態では、従来は細胞支持複合体に用いられることがなかったラミニン211、ラミニン221、ラミニン311、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、ラミニン521、もしくはこれらの断片のうち1つ以上を用いる点を特徴とする。本実施の形態におけるラミニン分子30には、上述したアイソフォームの1か所以上に所定の修飾基が付加された改変ラミニンも含まれる。
ラミニン分子30としてラミニン分子30の断片が使用される場合、たとえば完全長ラミニンのうちドメインIの細胞接着部位(インテグリン結合部位)を含むE8領域の改変体(ラミニン***−E8と表記する)を好適に使用することができる。このような改変体として、たとえばラミニン111−E8、ラミニン211−E8、ラミニン421−E8、ラミニン521−E8が挙げられる。これらの分子量は、いずれも完全長ラミニンの1/5程度である。
培養細胞40は、ラミニン分子30もしくはその断片を介して基材20に付着する。細胞支持複合体10に使用されるためには、培養細胞40は、ラミニン分子30もしくはその断片を介して基材20に固定された場合に、細胞頂端膜側のトランスポーター42と、細胞基底膜側のトランスポーター44とを発現する必要がある(図2)。
培養細胞40の培養用の培地として、REGM(Lonza社)を好適に使用することができる。これに代えて、EpiCM(ScienCell社)やKeratinocyteSFM(Life Technologies社)等、尿細管細胞培養培地を用いこともできる。その他の材料についても、従来の細胞支持複合体に用いられていた材料を好適に使用することができる。
次に、細胞支持複合体10の製造方法について説明する。細胞支持複合体10の製造方法は、人工材料で形成された基材20の少なくとも一部に、ラミニン分子30もしくはその断片をコーティングするステップ1と、基材20に接着したラミニン分子30もしくはその断片に対して培養細胞40を播種するステップ2と、培養細胞40を培養することにより、培養細胞40の単層構造を形成するステップ3と、を含む。ここでいう「基材20の少なくとも一部」は、上述のとおりである。
尿細管細胞として機能する培養細胞40が単層上皮構造をとると、細胞頂端膜側のトランスポーター42と細胞基底膜側のトランスポーター44とを介した有用物質50の移動がおこり、基材20を介して有用物質50の再吸収が促進される(図2)。
図3(A)〜図3(C)は、実施の形態に係る細胞支持複合体を用いた装置の構造の一部を示す図である。図3(A)は、基材としてTranswellを用いた装置の構造の一部を示す図である。図3(B)は、基材として中空糸膜を用いた透析装置の構造の一部を示す図である。図3(C)は、基材としてシャーレ、ウェルプレート、微細流路、マイクロキャリア、または中空糸膜を用いた装置の構造の一部を示す図である。
(基材がシャーレ(ウェルプレート)の場合:ラミニンのスクリーニング)
基材である96ウェルプレート(ポリスチレン製:CELLSTAR、GreinerBio−one社)を、ラミニンスクリーニング用キット(LAMscreen、Biolamina社)にてコーティングした。用いたラミニンは、ラミニン111、ラミニン211、ラミニン332、ラミニン421、ラミニン511、ラミニン521である。比較例として、ラミニンをコーティングさせずに細胞を培養した(No coating)。また、ラミニン411を比較例として用いた。ラミニンのコーティングは、10μg/mlに希釈したラミニン溶液をウェルに添加し、4℃にて一晩静置(overnight)した。ここに、1.0×105個/mlのヒト近位尿細管細胞(Lonza社)を140μl(1.4×104個)播種して、培地としてREGM(Lonza社)を用いて37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。播種してから1、8、20日経過後の顕微鏡像(×10)を図4に示す。
96ウェルプレート(ポリスチレン製:CELLSTAR、GreinerBio−one社)を100、10、5、2、1、0.1μg/mlに調整したラミニン521溶液(Biolamina社)でコーティングし、4℃にて一晩静置した。比較例として、接着分子であるラミニン521を用いない実験も行った(Control)。ここに、1.0×105個/mlのヒト近位尿細管細胞(Lonza社)を140μl(1.4×104個)播種して、培地としてREGM(Lonza社)を用いて37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。播種1、12日経過後の顕微鏡像(×10)を図5に示す。
次に、ラミニン分子のコーティング濃度の検討を、より多くのラミニン分子(ラミニン111、211、221、311、332、411、421、511、521)について、濃度をより細かく振って、培養日数を長くして行った。ラミニン521についても条件をより細かく設定した。比較例として、SynthemaxとPoly−L−lysineを用いた。
上述した手法でシャーレに接着分子をコーティング後、PBS(−)で1回洗浄した。ここにタンパク質可溶化剤であるM−PER Mammalian Protein Extraction Reagent(Thermo SCIENTIFIC社)を添加後、ピペッティングして接着分子をシャーレ表面より剥離、回収した。これを2−D Quant Kit(GE Healthcare)または、FluoReporter FITC protein Labeling Kit(invitrogen)にて接着分子をFITC標識して定量した(図6)。接着分子の定量には、wallac 1420ARVO MX/LIGHT(Perkin Elmer社)を用いた。
NMPに溶解したPEPA・PESから、ドクターブレード法によりPEPA・PES平膜を作製後、24ウェルプレート(ポリスチレン製:CELLSTAR、GreinerBio−one社)に設置し、10μg/mlに調整したラミニン521溶液(Biolamina社)を300μl加え、4℃にて一晩静置した。ここに、ヒト近位尿細管上皮細胞(Lonza社)1.0×105個を播種し、培地としてREGM(Lonza社)を用いて37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。接着分子の比較例として、0.1%に調整したゼラチン溶液(コスモ・バイオ株式会社)を300μlずつ用いた。
Ethylene vinylalcohol copolymer(EVOH)中空糸膜ミニモジュール(エバフラックス5A20、川澄化学工業株式会社)の内腔を100%エタノールで洗浄後、10μg/mlに調整したラミニン521溶液(Biolamina社)にてコーティングし、4℃にて一晩静置した。接着分子の比較例として、0.1%に調整したゼラチン溶液(コスモ・バイオ株式会社)、および接着分子を含まないPBS(コーティング無し)を用いた。
ポリスルホン中空糸膜ミニモジュールの内腔を100%エタノールで洗浄後、10μg/mlに調整したラミニン521溶液(Biolamina社)にてコーティングし、4℃にて一晩静置した。比較例として、0.1%に調整したゼラチン溶液(コスモ・バイオ株式会社)を用いた。PBS洗浄後、1.0×107個/mlに調整したヒト近位尿細管細胞(Lonza社)を播種し、37℃にて静置した。3時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、1.0×107個/mlに調整したヒト近位尿細管細胞(Lonza社)を播種し、37℃で静置した。3時間経過後、ミニモジュールを、培地であるREGM(Lonza社)で満たした容器内に浸漬し、37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。
PEPA中空糸膜ミニモジュール(日機装株式会社)の内腔を100%エタノールで洗浄後、10μg/mlに調整したラミニン521溶液(Biolamina社)にてコーティングし、4℃にて一晩静置した。比較例として、0.1%に調整したゼラチン溶液(コスモ・バイオ株式会社)を用いた。PBS洗浄後、1.0×107個/mlに調整したヒト近位尿細管細胞(Lonza社)を播種し、37℃で静置した。3時間経過後、ミニモジュールを上下反転し、再度、1.0×107個/mlに調整したヒト近位尿細管細胞(Lonza社)を播種し、37℃で静置した。3時間経過後、ミニモジュールを、培地であるREGM(Lonza社)で満たした容器内に浸漬し、37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。
図11(A)〜図11(C)は、基材をTranswellに固定した場合におけるラミニン521を用いた実施例およびゼラチンを用いた比較例を示す図である。図11(A)は、Transwellを側面から見た概略図である。図11(A)の「人工膜+コーティング基質」は、ラミニン521でコーティングされた基材を示す。図11(A)に示すように、Transwellセルカルチャーインサート(PC、PET;ポアサイズ0.4μm:Transwell(Corning社))を24ウェルプレートに設置した。その後、インサート下部にPBS(ナカライテスク株式会社)を700μl、インサート上部に10μg/mlに調整したラミニン521溶液(Biolamina社)を300μl加え、4℃にて一晩静置した。比較例として、0.1%に調整したゼラチン溶液(コスモ・バイオ株式会社)を用いた。次に、1.0×105個/mlのヒト近位尿細管上皮細胞(Lonza社)140μl(1.4×104個)を、Transwell(Corning社)をラミニン521でコーティングした基材に播種し、REGM(Lonza社)で37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。
Transwellセルカルチャーインサート(PC;ポアサイズ0.4、3.0、5.0、8.0μm:Transwell(Corning社))を24ウェルプレートに設置した。その後、インサート下部にPBS(ナカライテスク株式会社)を700μl、インサート上部に10μg/mlに調整したラミニン521溶液(Biolamina社)を300μl加え、4℃にて一晩静置した。比較例として、0.1%に調整したゼラチン溶液(コスモ・バイオ株式会社)を用いた。これらに1.0×105個/mlのヒト近位尿細管上皮細胞(Lonza社)140μl(1.4×104個)をラミニン521でコーティングしたTranswell(Corning社)に播種し、培地としてREGM(Lonza社)を用いて37℃、5%CO2の条件下で2日間培養した。接着分子の比較例として、0.1%に調整したゼラチン溶液(コスモ・バイオ株式会社)を300μlずつ用いた。培養後、24ウェルプレート底部を顕微鏡観察し、人工膜より細胞が落下しているか調べた。
試験方法:1.0×105個/mlのヒト近位尿細管上皮細胞(Lonza社)140μl(1.4×104個)をラミニン311、ラミニン511、ラミニン521でコーティングしたTranswell(Corning社)に播種し、REGM(Lonza社)で37℃、5%CO2の条件下で28日間培養した。培地は2日毎に交換した。培養中、細胞のバリア機能の指標である経上皮電気抵抗値(TEER;Transepithelial Electro Resistance)をMillicell ERS−2(Millipore社)で測定した。
24ウェルプレート(ポリスチレン製:CELLSTAR、Greiner Bio−one社)を500、50、2.5、1.0、0.5、0.1、0μg/mlに調整したiMatrix−511(ラミニン511−E8溶液:株式会社ニッピ)にてコーティングした。コーティングは、PBS(−)にてこれらの濃度に希釈したラミニン溶液をウェルに添加し、4℃にて一晩静置することにより行われた。ここにヒト近位尿細管細胞(Lonza社)を1.0×105個播種して、培地としてREGM(Lonza社)を用いて37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。播種15日経過後の顕微鏡像(×10)を示す。
次に、511−E8の濃度を変化させた場合における細胞の増殖状態を経時的により詳細に確認した。iMatrix−511(ラミニン511−E8溶液:株式会社ニッピ)によるコーティングを、500、100、50、10、5、2.5、1.7、1.43、1.25、1.0、0.5、0μg/mlに希釈したラミニン溶液を用いた点、および播種5、9、12、15、18、28日経過後の顕微鏡像(×10)を取得した点が上述した「コーティング濃度の検討1」とは異なる。
上述した「完全長ラミニン分子における接着分子の質量測定」と同様の手法にて、ラミニン分子の改変体としてラミニン分子の断片を用いる場合における接着量の質量測定を行った。播種5、7、9、12、15、18、24、28日経過後の細胞形状とラミニン511−E8の接着量を図14に示す。
試験方法:3.0×105個/mlのヒト近位尿細管上皮細胞(Lonza社)150μl(4.5×104個)を、1.5μg/cm2のラミニン511−E8、1.0μg/cm2のラミニン521でコーティングしたTranswell(Corning社)に播種し、REGM(Lonza社)で37℃、5%CO2の条件下で培養した。培地は2日毎に交換した。培養中、細胞のバリア機能の指標である経上皮電気抵抗値(TEER;Transepithelial Electro Resistance)をMillicell ERS−2(Millipore社)で測定した。
Claims (4)
- 人工材料で形成された基材と、
前記基材の少なくとも一部に接着するラミニン分子もしくはその断片と、
前記ラミニン分子もしくはその断片を介して前記基材に付着した培養細胞である尿細管上皮細胞または尿細管上皮様細胞と、を有し、
前記断片は、完全長ラミニンのうちドメインIの細胞接着部位を含むE8領域の改変体であり、
前記ラミニン分子もしくはその断片は、
前記基材に対する接着量が0.15μg/cm2以上の、ラミニン111もしくはその断片、
前記基材に対する接着量が0.52μg/cm2以上の、ラミニン211もしくはその断片、
前記基材に対する接着量が0.34μg/cm2以上の、ラミニン221もしくはその断片、
前記基材に対する風乾時の最大接着量が0.5μg/cm2以上の、ラミニン311もしくはその断片、
前記基材に対する風乾時の最大接着量が1.2μg/cm2以上の、ラミニン332もしくはその断片、
前記基材に対する接着量が0.50μg/cm2以上の、ラミニン421もしくはその断片、
前記基材に対する接着量が0.32μg/cm2以上のラミニン511、
前記基材に対する接着量が0.15μg/cm2以上のラミニン511の断片、
前記基材に対する接着量が0.44μg/cm2以上の、ラミニン521もしくはその断片、
から選択されることを特徴とする細胞支持複合体。 - 前記ラミニン311もしくはその断片は、前記基材に対する接着量が0.15μg/cm2以上であることを特徴とする請求項1に記載の細胞支持複合体。
- 人工材料で形成された基材の少なくとも一部に、ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップと、
前記基材に接着した前記ラミニン分子もしくはその断片に対して培養細胞である尿細管上皮細胞または尿細管上皮様細胞を播種するステップと、
前記培養細胞を培養することにより、前記培養細胞の単層構造を形成するステップと、を含み、
前記断片は、完全長ラミニンのうちドメインIの細胞接着部位を含むE8領域の改変体であり、
前記ラミニン分子もしくはその断片をコーティングするステップは、
ラミニン111もしくはその断片を3.0μg/ml以上の濃度でコーティングして0.15μg/cm2以上の接着量とすること、
ラミニン211もしくはその断片を10μg/ml以上の濃度でコーティングして0.52μg/cm2以上の接着量とすること、
ラミニン221もしくはその断片を10μg/ml以上の濃度でコーティングして0.34μg/cm2以上の接着量とすること、
ラミニン311もしくはその断片を3.0μg/ml以上の濃度でコーティングして0.5μg/cm2以上の風乾時の最大接着量とすること、
ラミニン332もしくはその断片を8.0μg/ml以上の濃度でコーティングして1.2μg/cm2以上の風乾時の最大接着量とすること、
ラミニン421もしくはその断片を5.0μg/ml以上の濃度でコーティングして0.50μg/cm2以上の接着量とすること、
ラミニン511を10μg/ml以上の濃度でコーティングして0.32μg/cm2以上の接着量とすること、
ラミニン511の断片を1.43μg/ml以上の濃度でコーティングして0.15μg/cm2以上の接着量とすること、
ラミニン521もしくはその断片を5.0μg/ml以上の濃度でコーティングして0.44μg/cm2以上の接着量とすること、
のいずれかを含むことを特徴とする細胞支持複合体の製造方法。 - 前記コーティングするステップにおいて前記ラミニン311もしくはその断片をコーティングする場合、当該ステップは、ラミニン311もしくはその断片を4.0μg/ml以上の濃度でコーティングして0.15μg/cm2以上の接着量とすることを含むことを特徴とする請求項3に記載の細胞支持複合体の製造方法。
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