JP6002675B2 - 細胞培養培地 - Google Patents

Description

この出願は、２０１０年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／４２４，２７３号；２０１１年５月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／４８８，３５３号；２０１１年９月９日に出願された米国仮特許出願第６１／５３３，０６３号；２０１１年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５３７，９４０号；２０１１年１１月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／５６５，３８０号；および２０１１年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５６５，８４９号からの優先権を主張する。これら全ての仮出願は、本明細書に参考として完全に援用される。

本出願は、細胞生物学、細胞分化、細胞療法、分子生物学、タンパク質、組換えヒトタンパク質、核酸、およびラミニンに関する。

基底板（基底膜）は、細胞成長、細胞の分化、細胞表現型の維持、組織発生、および組織維持において中心的な役割を果たす、シート状の細胞結合型細胞外マトリックスである。それらは、事実上、すべての組織に存在し、胚発生の最も初期の段階に現れる。

基底板は、様々な構造的および細胞相互作用的機能の中心となる。
たとえば、
１．それらは、組織の構造的支持体としての役目を果たし、細胞に接着性基層（ｓｕｂｓｔｒａｔａ）を提供する。

２．それらは、組織コンパートメントの間に、細胞の遊走を妨げ、高分子の交換を受動的に調節する選択透過性関門を作り出す。これらの特性は、腎糸球体基底膜によって例証される。腎糸球体基底膜は、重要な濾過構造物として機能し、ほとんどのタンパク質および細胞が透過しない有効な血液−組織関門を作り出す。

３．基底板は、胚形成中および創傷治癒中に細胞遊走および細胞伸長を促すことができる、高度に相互作用的な表面を作り出す。外傷の後には、基底板は、細胞がその上で再生して正常組織機能を回復させる表面を提供する。

４．基底板は、接触する細胞に、細胞分化、アポトーシスの防止、および組織維持にとって重要である、それらの構造中にコードされた情報を提示する。この情報は、インテグリン、ジストログリカン、および細胞表面プロテオグリカンを含む様々な受容体を介して細胞に伝えられる。シグナル伝達は、十分な親和性で相互作用するマトリックスリガンドおよび対応する受容体の存在だけでなく、三次元マトリックス「環境」におけるリガンド密度のような組織分布的因子（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｆａｃｔｏｒ）および基底板構成成分が受容体をクラスター形成させる能力にも依存する。これらのマトリックスタンパクは長寿命であり得るので、基底板は、常在性および一過性の細胞の基底板中に「表面記憶」を作り出す。

基底板は、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンヘテロ三量体から大部分構成され、それらは、次には複雑な重合体構造に組織化される。さらなる構成成分は、アグリンおよびパールカンなどのプロテオグリカンならびにナイドジェン（エンタクチン）を含む。現在までに、６つの型のＩＶ型コラーゲンポリペプチド鎖および少なくとも１２の型のラミニンサブユニット鎖が同定されている。これらの鎖は、共有のユニークな機能を持ち、特異的な時間的（発生的）および空間的（組織部位特異的）パターンで発現される。

ラミニンは、主に基底板に存在するヘテロ三量体糖タンパク質のファミリーである。それらは、一方で、近傍の細胞の受容体との結合性相互作用を介して機能し、そして他のラミニン分子またはコラーゲン、ナイドジェン、もしくはプロテオグリカンなどの他のマトリックスタンパク質への結合によって機能する。ラミニン分子は、細胞の行動および機能に強く影響を及ぼし得る重要なシグナル伝達分子でもある。ラミニンは、細胞／組織表現型の維持の両方においてならびに組織修復および発生において細胞成長および分化を促すのに重要である。

ラミニンは、一般的な構造的組織を有する、大きなマルチドメインタンパク質である。ラミニン分子は、様々なマトリックスおよび細胞の相互作用的な機能を１つの分子に統合する。

ラミニンタンパク質分子は、１つのα−鎖サブユニット、１つのβ−鎖サブユニット、および１つのγ−鎖サブユニットを含み、これらはすべてコイルドコイルドメインを介して三量体に一体化している。図１は、この結果生じるラミニン分子の構造を示す。１２の公知のラミニンサブユニット鎖は、天然の組織において、少なくとも１５の三量体ラミニン型を形成することができる。他のラミニン分子および基底板分子ならびに膜結合型受容体に対して結合活性を持つドメインが、この三量体ラミニン構造内に同定できる。図２は、３つのラミニン鎖サブユニットを別々に示す。たとえば、ドメインＶＩ、ＩＶｂ、およびＩＶａは、球状構造を形成し、ドメインＶ、ＩＩＩｂ、およびＩＩＩａ（システインリッチＥＧＦ様エレメントを含む）は、棒状構造を形成する。３つ鎖のドメインＩおよびＩＩは、三本鎖コイルドコイル構造（長いアーム）の形成に関与する。

５つの異なるアルファ鎖、３つのベータ鎖、および３つのガンマ鎖が存在し、ヒト組織では、これらが少なくとも１５の異なる組み合わせで見出されている。これらの分子は、それらの歴史的な発見に基づいて、ラミニン−１〜ラミニン−１５と称されるが、代替の命名法は、それらの鎖組成に基づいてアイソフォームを表し、たとえばアルファ−１、ベータ−１、およびガンマ−１鎖を含むラミニン−１１１（ラミニン−１）と称する。ラミニンの４つの構造的に定められたファミリーグループが、同定されている。５つの同定されたラミニン分子の第１のグループは、すべてがβ１およびγ１鎖を共有し、それらのα−鎖組成（α１〜α５鎖）が異なる。ラミニン−５２１を含む、５つの同定されたラミニン分子の第２のグループは、すべてがβ２およびγ１鎖を共有し、これもまた、それらのα−鎖組成が異なる。同定されたラミニン分子の第３のグループは、α３β３γ２の鎖組成を有する、１つの同定されたメンバー、ラミニン−３３２を有する。同定されたラミニン分子の第４のグループは、新たに同定されたγ３鎖を有する、１つの同定されたメンバー、ラミニン−２１３（α２β１γ３）を有する。

他のラミニン鎖を含まない単離されたラミニン−５２１についての報告はない。したがって、これまでのところ、ラミニン−５２１の機能についての研究はない。ラミニン鎖抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによって細胞供給源からラミニン−５２１を精製するための試みは、たとえば、ラミニン−４１１およびラミニン−５１１の構成成分であるラミニンβ１鎖を排除するのに失敗してきた。ラミニン−５２１（別名ＬＮ−５２１）を含有する組成物およびラミニン−５２１を作製するための方法を提供することは望ましいであろう。

ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、脊髄損傷および心外傷、Ｉ型糖尿病、ならびにパーキンソン病のような神経変性障害など、様々な疾患の再生医療の発展に有望である。幹細胞は、分化した細胞がそれから続いて誘導される未分化細胞である。胚性幹細胞は、３つの胚葉すべての細胞に分化する能力と共に、広範囲な自己再生能および多能性を持つ。それらは、治療目的に有用であり、組織補充療法、薬剤スクリーニング、機能ゲノミクス、およびプロテオミクスに、細胞の無制限の供給源を提供し得る。

再生医療のための幹細胞由来細胞の開発のための必要条件は、多能性幹細胞の長期培養、化学的に特定されそして反復可能な分化プロトコール、ならびに異種由来成分不含（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）細胞培養系を可能にする方法である。しかし、多能性ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）および人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の培養には、多くの課題がある。１つの主な課題は、クラスターの中ではｈＥＳ細胞の成長が遅く、細胞を増やすために手作業で分割する必要があるということであった。細胞の解離は、通常、大幅な細胞死に至り、解離完了後のｈＥＳ細胞のクローニング効率は、１％以下となる。

多能性ｈＥＳ細胞の維持には、免疫原性および毒性となり得、実験の信頼性を低下させる広範囲なバッチ間のばらつきを生じさせる、マウス腫瘍由来のＭａｔｒｉｇｅｌまたは線維芽細胞フィーダー細胞層のような細胞外マトリックスタンパク質混合物などの複雑な培養基層が必要とされてきた。したがって、これまでのところ、ｈＥＳ細胞培養に使用された最も成功したフィーダー細胞なしの基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、すなわち、マウスＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）肉腫腫瘍組織から得られた、複雑な腫瘍およびＢＭ様の抽出物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌは、主に、マウスＬＮ−１１１、ＩＶ型コラーゲン、パールカン、およびナイドジェンだけでなく、成長因子および細胞性タンパク質を含む様々な量の他の物質を含有し、そのため、その組成が特定されず、バッチ間で異なる。このばらつきは、科学的な結果を再現不可能にし得、また、動物由来の基層のために、Ｍａｔｒｉｇｅｌを、ヒト細胞療法のためのｈＥＳ細胞の増殖および維持に許容されないものにしてしまう。

しかし、ｈＥＳ細胞およびｈｉＰＳ細胞の自己再生を支持する、ある程度特定されているコーティング材料の開発の成功が最近報告されている。組換えビトロネクチンがｈＥＳ細胞の接着および自己再生を支持することが報告された。様々なＥＣＭタンパク質由来の様々なペプチドを含有するアクリレートコーティングも以前に開発されており、合成メタクリレートベースのポリマーもｈＥＳ細胞の接着および自己再生を促進したことが示された。

ｈＥＳ細胞を大規模に増やすことに関する主な課題のうちの１つは、単細胞懸濁物に解離した後の再播種（ｒｅｐｌａｔｉｎｇ）におけるそれらの生存率が低いことである。次いで、これにより継代が時間のかかるものになり、大規模な自動化された増殖を不可能にする。しかし、ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤^１０またはブレビスタチン^１１の存在下においてトリプシン処理を使用して単細胞懸濁物へと遊離させたｈＥＳ細胞は、蒔いて、単一のクローンから増殖させることができる。しかし、それらの分子は、天然の幹細胞生育様式の構成成分ではなく、それらは、アクチン細胞骨格に影響を及ぼし、したがって細胞傷害を引き起こし得る。そのため、ＲＯＣＫ阻害剤の使用は、細胞療法目的のために向けられた、ｈＥＳ細胞の長期増殖のための好ましい解決策ではない可能性がある。

再生医療の目的のために、化学的に特定されている、異種由来成分不含で、病原体が存在しない、かつバッチ間で安定した条件下で、多能性幹細胞の誘導および長期培養を可能にする方法を開発する要望がある。さらに、そのような方法は、短期間で大量の多能性ｈＥＳ／ｈｉＰＳ細胞を得るために迅速で、経済的に効率的なスケールアップを可能にするべきである。好ましくは、これらの方法は、セルソーティングまたは細胞における遺伝子ノックアウトを含む科学的および臨床的適用を促進することができる、アポトーシスの合成阻害剤を含有しない培地中のヒトＥＳ細胞のクローン性生存も可能にするべきである。

本開示は、単離されたラミニン−５２１（ＬＮ−５２１またはラミニン−１１としても公知）および単離されたラミニン−５２１を生成するための方法を提供する。さらなる態様では、本開示は、ラミニン−５２１鎖を発現し、組換えラミニン−５２１を分泌する組換え宿主細胞を提供する。

他の態様では、本開示は、ヒト細胞療法のための細胞を開発する目的のための、分化および維持のために細胞を培養するためのＧＭＰ品質のラミニン−５２１を提供する。本開示は、薬学的に許容されるキャリアと一緒に、単離されたラミニン−５２１を含む薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物は、必要に応じて、他の細胞外マトリックス構成成分と共に提供することができる。

本開示は、様々な使用のための、様々な量の単離されたラミニン−５２１を有効に生成するための方法も提供する。それらの使用についての好ましい実施形態では、組換えラミニン−５２１が、使用される。その望まれる効果に有効な、ある量の単離されたラミニン−５２１またはその薬学的組成物と、その使用のための指示とを含むキットも開示される。

本開示は、単層培養において幹細胞を培養するための方法であって、細胞の均一性、細胞培養プレートまたは他の細胞支持体から単細胞懸濁物の状態で幹細胞の移動を促進する方法、ならびに単細胞懸濁物になった幹細胞を再播種するための方法であって、幹細胞培養物の増殖およびそのような細胞の大規模産生を可能にするかなりの希釈度で、継代および増殖させる方法を提供する。

さらなる態様では、本開示は、単層培養においてラミニン−５２１上で多能性幹細胞を培養すること、幹細胞を他の細胞支持物質と共に細胞培養プレートから単細胞懸濁物の状態で移動すること、および単細胞懸濁物由来の幹細胞を単細胞としてラミニン−５２１を含有するマトリックス上に再播種すること（このプロセスは、高性能の自動化ロボットシステムにおいて実行することができるようにする）を記載する。

さらなる態様では、本開示は、改善された医療デバイスおよび移植片であって、改善が、有効量の単離されたラミニン−５２１を医療デバイスおよび移植片に提供することを含む、改善された医療デバイスおよび移植片を提供する。

さらなる態様では、本開示は、改善された細胞培養デバイスならびに細胞付着ならびにその後の細胞静止状態、増殖、分化、および／または遊走のために有効な量の単離されたラミニン−５２１を細胞培養デバイスに提供することによって、培養中の細胞の成長およびその表現型の維持のために、改善された細胞培養デバイスを調製するための方法を提供する。

他の態様では、本開示は、ヒト組換えラミニン−５２１などの組成物および未分化の状態においてｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてヒト胚性幹細胞を培養し、迅速に増殖させるための方法を提供する。方法は、ヒト胚性幹細胞の単細胞への解離および任意のＲｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤なしの（たとえばＹ−２７６３２なしの）培地においてラミニン−５２１をコーティングした細胞培養ディッシュ上にそれらを蒔くことを含む（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２５巻、６８１〜６８６頁（２００７年））。その改善により、従来のヒト胚性幹細胞培養においてよりも迅速に、多能性状態でヒト胚性幹細胞を増殖させる可能性を提供する。

さらなる態様では、本開示は、単細胞懸濁物への解離の後にヒト胚細胞の生存を可能にする、ヒト組換えラミニン−５２１などの新しい材料を提供する。その改善により、クローンを単離すること（たとえば遺伝子操作の後に）、または、均一で均質なヒト胚性幹細胞集団を得ることのために有利となり得る、ヒト胚性幹細胞の、クローニングにおけるよりよい生存をもたらす。

いくつかの実施形態では、配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含むアルファ鎖と、配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含むベータ鎖と、配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含むガンマ鎖とを含み、アルファ、ベータ、およびガンマ鎖が集合して組換えラミニン−５２１を構築する、単離された組換えラミニン−５２１が開示される。

さらなる実施形態では、アルファ鎖ポリペプチドが、配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。ベータ鎖ポリペプチドも配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し得る。ガンマ鎖ポリペプチドも配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し得る。

他の実施形態では、アルファ鎖が、配列番号１のポリペプチド配列を有する。さらに、ベータ鎖が、配列番号２のポリペプチド配列を有し得る。さらにより詳細には、ガンマ鎖が、配列番号３のポリペプチド配列を有し得る。

ベータ鎖ポリペプチドは、配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し得る。ガンマ鎖ポリペプチドは、配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し得る。

実施形態では、ａ）請求項１に記載の単離された組換えラミニン−５２１と、ｂ）薬学的に許容されるキャリアとを含む薬学的組成物も開示される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて成長させた多能性幹細胞の自己再生を可能にする組成物であって、成長培地およびその上のコーティングを含み、コーティングが組換えラミニン５２１（ラミニン−１１）を含む、組成物も実施形態において開示される。

組成物は、成長因子をさらに含んでいてもよい。

組成物は、いかなる分化阻害剤も欠いていてもよい。組成物は、いかなるフィーダー細胞も欠いていてもよい。組成物は、いかなる分化誘導物質も欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物が、いかなる分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質も欠く。

実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞の多能性を維持するための方法であって、成長培地およびその上のコーティングを含む基質を提供するステップであって、コーティングが、組換えラミニン５２１（ラミニン−１１）を含むステップと、多能性幹細胞を単細胞懸濁物へ解離させるステップと、コーティング上に単細胞懸濁物状態の多能性幹細胞を配置するステップとを含む方法も開示される。

成長培地は、成長因子（複数可）を含み得る。例示的な成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子およびインスリン成長因子を含む。

時に、成長培地およびコーティングは、いかなる分化阻害剤も欠く。たとえば、白血病インヒビター因子は、存在しない。

組成物は、マウス線維芽細胞またはヒト包皮線維芽細胞などのいかなるフィーダー細胞を欠いていてもよい。組成物は、ノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）またはケラチノサイト成長因子などのいかなる分化誘導物質を欠いていてもよい。いくつかの実施形態では、組成物が、いかなる分化阻害剤、フィーダー細胞、または分化誘導物質を欠く。

多能性幹細胞は、単層として、ラミニン−５２１コーティング上に配置されてもよい。

多能性幹細胞は、２００細胞／ｍｍ^２以下の密度でコーティング上に配置されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、２００細胞／ｍｍ^２以上の密度でコーティング上に配置されてもよい。多能性幹細胞は、あるいは、２つの幹細胞が互いに接触しないように、コーティング上に配置することができる。

組換えラミニン−５２１を発現する宿主細胞を提供するステップであって、組換えラミニン−５２１が、配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む第１の鎖、配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む第２の鎖、および配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む第３の鎖を含み、第１、第２、および第３の鎖が集合して組換えラミニン−５２１を構築するステップと、組換えラミニン−５２１鎖の発現を刺激するための条件下で、細胞培養培地中で宿主細胞を成長させるステップと、宿主細胞培養培地をカラムに通過させるステップであって、カラムが、組換えラミニン−５２１に結合する化合物を含有するステップと、非結合物質を除去するためにカラムを洗浄するステップと、結合した組換えラミニン−５２１をカラムから溶離するステップとを含む方法によって生成される単離された組換えラミニン−５２１も実施形態において開示される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて多能性幹細胞の多能性を維持する方法であって、その上にコーティングを有する基質を得るステップであって、コーティングが完全なラミニンを含有するステップと、基質上に多能性幹細胞および細胞培養培地を配置するステップと、ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路を活性化するステップとを含む方法が、他の実施形態において記載される。

完全なラミニンは、ラミニン−５２１またはラミニン−５１１であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地が、ベータ線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などのいかなる成長因子も含有しない。コーティングは、また、カドヘリンを含有してもよい。多能性幹細胞は、２００細胞／ｍｍ^２以下の密度でコーティング上に配置されてもよい。

本開示は、多能性状態の幹細胞を維持するために使用することができる細胞培養培地にも関する。０を超える値〜３．９ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、多能性幹細胞に栄養を提供する細胞培養培地が、様々な実施形態において記載される。

細胞培養培地は、０．５〜３．５ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む、３．５ｎｇ／ｍｌ以下のｂＦＧＦを含んでいてもよい。

細胞培養培地は、少なくとも１つの無機塩、少なくとも１つの微量ミネラル、少なくとも１つのエネルギー基質、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つのビタミン、または少なくとも１つのさらなる成長因子をさらに含んでいてもよい。特定の実施形態では、細胞培養培地は、少なくとも１つの無機塩、少なくとも１つの微量ミネラル、少なくとも１つのエネルギー基質、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのアミノ酸、および少なくとも１つのビタミンをさらに含む。

細胞培養培地は、（１）アルブミン、（２）インスリンもしくはインスリン代替物、または（３）トランスフェリンもしくはトランスフェリン代替物のうちのいずれか１つを含有しなくてもよい。

細胞培養培地は、アルブミン、インスリン、塩化リチウム、ＧＡＢＡ、ＴＧＦベータ１、ピペコリン酸、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、およびＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液をさらに含んでいてもよい。

細胞培養培地は、少なくとも１つのさらなる成長因子、少なくとも１つの微量ミネラル、および少なくとも１つの脂質をさらに含んでいてもよい。

０を超える値〜３．９ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む細胞培養培地および幹細胞に支持体を提供するための基質を含む、多能性幹細胞を維持するためのシステムも開示される。

基質は、ラミニン−５２１またはラミニン−５１１を含有し得る。基質は、また、カドヘリンを含有してもよい。

これらのおよび本開示の他の非限定的な特徴は、下記により詳しく開示される。

本特許または出願包袋は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を有する本特許または特許出願公開のコピーは、請求し必要な料金の支払いをすると特許庁によって提供される。

下記は、本明細書において開示される例示的な実施形態を限定する目的ではなく、本明細書において開示される例示的な実施形態を例証する目的のために提示される図面の簡単な説明である。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する：
（項目１）
多能性幹細胞を維持するためのシステムであって、該システムは：
０を超える値〜３．９ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む細胞培養培地；および
該幹細胞に支持体を提供するための基質
を含む、システム。
（項目２）
上記基質が、ラミニン−５２１またはラミニン−５１１を含む、項目１に記載のシステム。
（項目３）
上記基質がカドヘリンも含む、項目２に記載のシステム。
（項目４）
上記基質がラミニン−５２１を含み、かつ上記ｂＦＧＦの量が、３．５ｎｇ／ｍＬであるかまたはそれより少ない、項目１に記載のシステム。
（項目５）
上記細胞培養培地が、０．５ｎｇ／ｍＬ〜３．５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む、項目１に記載のシステム。
（項目６）
上記細胞培養培地が、少なくとも１つのさらなる成長因子、少なくとも１つの微量ミネラルおよび少なくとも１つの脂質をさらに含む、項目１に記載のシステム。
（項目７）
多能性幹細胞に栄養を提供する細胞培養培地であって、該細胞培養培地は、０を超える値〜３．９ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、細胞培養培地。
（項目８）
３．５ｎｇ／ｍＬまたはそれより少ないｂＦＧＦを含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目９）
０．５ｎｇ／ｍＬ〜３．５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１０）
少なくとも１つの無機塩をさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１１）
少なくとも１つの微量ミネラルをさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１２）
少なくとも１つのエネルギー基質をさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１３）
少なくとも１つの脂質をさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１４）
少なくとも１つのアミノ酸をさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１５）
少なくとも１つのビタミンをさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１６）
少なくとも１つのさらなる成長因子をさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１７）
少なくとも１つの無機塩、少なくとも１つの微量ミネラル、少なくとも１つのエネルギー基質、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのアミノ酸および少なくとも１つのビタミンをさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１８）
上記細胞培養培地が、（１）アルブミン、（２）インスリンもしくはインスリン代替物、または（３）トランスフェリンもしくはトランスフェリン代替物のうちのいずれか１つを含まない、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目１９）
アルブミン、インスリン、塩化リチウム、ＧＡＢＡ、ＴＧＦベータ１、ピペコリン酸、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液およびＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液をさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。
（項目２０）
少なくとも１つのさらなる成長因子、少なくとも１つの微量ミネラルおよび少なくとも１つの脂質をさらに含む、項目７に記載の細胞培養培地。

図１は、組換えラミニン分子のロータリーシャドウイング電子顕微鏡写真を示す図である。 図２は、ラミニンα、β、およびγ鎖の構造モチーフを示す図である。Ｎ末端、内部、およびＣ末端球状ドメインは、白色の楕円形として示す。コイルドコイル形成ドメイン（ＩおよびＩＩ）は、白色の長方形として示す。棒状構造（ドメインＶ、ＩＩＩｂ、およびＩＩＩａ）は、灰色の長方形として示す。 図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用する、ヒト組換えラミニン−５２１の特徴付けの結果を示す図である。組換えラミニン−５２１の免疫ブロットは、非還元（ｏｘとして表示）、還元（ｒｅｄとして表示）条件下で行った。３〜８％ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ膜上に移し、その後、ラミニンα５に対する抗体（２Ｆ７）、β２に対する抗体（ＭＡＢ２０６６）、β１に対する抗体（ＭＡＢ１９２１）、およびγ１に対する抗体（Ｈ−１９）により染色した。 図４および図５は、１日培養した後の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、マウスラミニン−１１１（ｍＬＮ１１１）、ヒト組換えラミニン−５１１（ｒ−ラミニン−５１１もしくはｒ−ＬＮ−５１１）、ヒト組換えラミニン−５２１（ｒ−ラミニン−５２１もしくはｒ−ＬＮ−５２１）、またはｒ−ラミニン−５１１およびｒ−ラミニン−５２１の混合物（ｍｉｘ）でコーティングしたディッシュに接着したヒトＥＳ細胞のクリスタルバイオレット染色を示す図である。両方の図は、５×に拡大したものである。図４では、細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤なしで培養した。図５では、細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２ありで培養した。 図４および図５は、１日培養した後の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、マウスラミニン−１１１（ｍＬＮ１１１）、ヒト組換えラミニン−５１１（ｒ−ラミニン−５１１もしくはｒ−ＬＮ−５１１）、ヒト組換えラミニン−５２１（ｒ−ラミニン−５２１もしくはｒ−ＬＮ−５２１）、またはｒ−ラミニン−５１１およびｒ−ラミニン−５２１の混合物（ｍｉｘ）でコーティングしたディッシュに接着したヒトＥＳ細胞のクリスタルバイオレット染色を示す図である。両方の図は、５×に拡大したものである。図４では、細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤なしで培養した。図５では、細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２ありで培養した。 図６は、ＲＯＣＫ阻害剤なしで１時間培養した後の、ヒトｒ−ラミニン−５２１（ＬＮ５２１として表示）、ヒトｒ−ラミニン−５１１（ＬＮ５１１）、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）をコーティングしたディッシュへのヒトＥＳ細胞の接着を示すグラフである。誤差のバーは、測定の標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図７は、１日培養した後の、ＲＯＣＫ阻害剤なしの、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、マウスラミニン−１１１（ｍＬＮ１１１）、ヒトｒ−ラミニン−５１１（ＬＮ５１１）、ヒトｒ−ラミニン−５２１（ＬＮ５２１）、またはｒ−ラミニン−５１１およびｒ−ラミニン−５２１の混合物（ｍｉｘ）のいずれかでコーティングしたディッシュへのヒトＥＳ細胞の接着を示すグラフである。これもまた１日培養した後の、ＲＯＣＫ阻害剤ならびにＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｉｎ＆Ｍｇ）、マウスラミニン−１１１（Ｉｎ＆ｍＬＮ１１１）、ヒトｒ−ラミニン−５１１（Ｉｎ＆ＬＮ５１１）、ヒトｒ−ラミニン−５２１（Ｉｎ＆ＬＮ５２１）、またはｒ−ラミニン−５１１およびｒ−ラミニン−５２１の混合物（Ｉｎ＆ｍｉｘ）のいずれかを有するディッシュについての結果も含まれる。両方の実験についての細胞は、同じ細胞培養ディッシュ上で同じ密度で蒔いた。誤差のバーは、測定の標準誤差を示す（ｎ＝３）。 図８は、単細胞解離継代を使用して、ｒ−ラミニン−５２１（ＬＮ−５２１＿１およびＬＮ−５２１＿２）上で培養されたヒトＥＳ細胞についてのならびに小さな凝集塊での継代を使用して、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ＿１およびＭｇ＿２）上で培養されたヒトＥＳ細胞についての成長曲線を示す図である。後者の細胞は、Ｒｏｄｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２８巻、６１１〜６１５頁（２０１０年）において記載されるように継代した。 図９は、多能性のマーカーである、ＯＣＴ４についての、ｒ−ラミニン−５２１上での数回の単細胞解離継代後のヒトＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析を示す図である。陽性細胞のパーセンテージを括弧中に記載する。 図１０は、ＯＣＴ４についての、小さな凝集塊への分割を使用する、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上での数回の継代後のヒトＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析を示す図である。陽性細胞のパーセンテージを括弧中に記載する。 図１１は、数回の単細胞解離継代後のヒトｒ−ラミニン−５２１（ＬＮ５２１）上で培養したヒトＥＳ細胞における、および凝集塊における細胞の数回の継代後にＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）上で培養した細胞における、多能性マーカーのＯｃｔ４およびＮａｎｏｇのｍＲＮＡ転写物の数を比較するために使用したリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図である。誤差のバーは、９５％の信頼区間を示す。 図１２は、蒔いてから１時間後の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１上で成長させた幹細胞におけるリン酸化ミオシン軽鎖（Ｐ−ＭＬＣ）のレベルを比較するウエスタンブロットを示す図である。 図１３は、蒔いてから６時間後の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１上で成長させた幹細胞におけるリン酸化ミオシン軽鎖（Ｐ−ＭＬＣ）のレベルを比較するウエスタンブロットを示す図である。 図１４は、蒔いてから後、５〜７時間の間の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１上で成長させたヒト胚性幹細胞の相対的な遊走を比較するグラフである。 図１５は、ＩｇＧおよびＩｇＭの遮断抗体（ＩｇＧＭ）を適用した、ならびにインテグリンβ１（ｂ１）に対する機能遮断抗体を適用した、ＬＮ−５２１上で成長させたヒト胚性幹細胞の相対的な遊走を比較するグラフである。これは、インテグリンの遮断が運動性を著しく低下させたことを示す。 図１６は、水、ＤＭＳＯ、ＬＹ２９４００２（Ａｋｔ阻害剤）、ウォルトマニン（ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤）、およびＰＤ ９８０５９（ＭＥＫ１阻害剤）の存在下における、ＬＮ−５２１上でのｈＥＳ細胞の相対的な生存を比較するグラフである。これは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化が、ＬＮ−５２１上でのｈＥＳ細胞生存に必要であったことを示した。培地は、ｂＦＧＦを含有した。 図１７は、ＤＭＳＯ、ＬＹ２９４００２（Ａｋｔ阻害剤）、およびＰＤ ９８０５９（ＭＥＫ１阻害剤）の存在下における、ＬＮ−５２１上でのｈＥＳ細胞の相対的な生存を比較するグラフである。外因性のｂＦＧＦは、存在しなかった。 図１８は、対照細胞（ＤＭＳＯ）に対して、ＬＹ ２９４００２により処理し、ＬＮ−５２１上に蒔いてから１時間後に収集した細胞を比較するウエスタンブロットを示す図である。 図１９は、対照細胞（ＤＭＳＯ）に対して、ＰＤ９８０５９により処理し、ＬＮ−５２１上に蒔いてから１時間後に収集した細胞を比較するウエスタンブロットを示す図である。 図２０は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、またはＬＮ−５２１上に蒔いてから１時間後に収集し、ＥＬＩＳＡを使用して得られた細胞溶解産物上のＡｋｔ２リン酸化の相対的なレベルを示すグラフである。 図２１は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｍｇ）、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、またはＬＮ−５２１上に蒔いてから１時間後に収集し、ＥＬＩＳＡを使用して得られた細胞溶解産物上のＡｋｔ１リン酸化の相対的なレベルを示すグラフである。 図２２は、高ｂＦＧＦ培地（Ｏ３＿１００）と比較した、低ｂＦＧＦ培地（Ｏ３＿３．９）において培養したＨＳ１８１ ｈＥＳ細胞の成長曲線を示すグラフである。 図２３は、高ｂＦＧＦ培地（Ｏ３＿１００）と比較した、低ｂＦＧＦ培地（Ｏ３＿３．９）において培養したＨＳ１８１ ｈＥＳ細胞における２つの多能性マーカー（Ｏｃｔ４およびＮａｎｏｇ）についての相対的なｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。 図２４は、ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス上での新しいヒト胚性幹ＨＳ８４１細胞系の早期の誘導を示す写真である。

本明細書において開示される組成物および方法についてのより完全な理解は、添付図面に対する参照によって得ることができる。これらの図は、単に、本開示を実証することにおける利便性および容易性に基づく略図であり、そのため、例示的な実施形態の範囲を定めるまたは限定するようには意図されない。

特定の用語は、明瞭さのために以下の説明において使用されるが、これらの用語は、図面における例証のために選択した実施形態の特定の構造のみを指すように意図され、本開示の範囲を定めるまたは限定するようには意図されない。下記の図面および以下の説明では、同様の数字表示が同様の機能の構成成分を指すことが理解される。

本明細書において取り上げられた刊行物、特許、および特許出願はすべて、それらの全体が参照によってこれによって組み込まれる。

特に指定のない限り、本出願において利用される技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ｄ． Ｇｏｅｄｄｅｌ編、１９９１年 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、「Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ． Ｐ． Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編、（１９９０年） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら １９９０年 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ． １９８７年 Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、１０９〜１２８頁、Ｅ． Ｊ． Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、またはＡｍｂｉｏｎ １９９８年 Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）などのいくつかの周知の参考文献のうちのいずれかにおいても見出され得る。

本明細書において使用されるように、用語「単離された核酸配列」は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接する遺伝子配列（すなわち、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の単離された核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子についての遺伝子に隣接して位置する遺伝子配列）がない核酸配列を指す。しかしながら、「単離された」配列は、異種プロモーター配列または他のベクター配列などの、列挙される配列に天然では隣接しない他のヌクレオチド配列に連結されてもよい。本開示による核酸配列が、宿主細胞をトランスフェクトするために使用される発現ベクターの一部であってもよいので、単離された核酸配列は、「単離された」と見なされるために、他の細胞物質がないことが必要とされるわけではない（下記を参照されたい）。

本開示は、ヒトラミニンβ２鎖の完全長ラミニンβ２鎖核酸配列（配列番号４）を含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、異種プロモーター（すなわち、所定のβ２ラミニン鎖についての天然に存在するプロモーターでない）に動作可能に連結された、配列番号４によってコードされる核酸を含む。プロモーターがラミニンβ２鎖ＤＮＡのＲＮＡへの発現を駆動することができる場合、プロモーターおよびラミニンβ２鎖核酸配列は、「動作可能に連結されている」。

本明細書において使用されるように、用語「ベクター」は、それが連結している他の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。あるタイプのベクターは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがその中にクローニングされ得る環状の二本鎖ＤＮＡを指す。他のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムの中にクローニングされ得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製が可能である（たとえば、細菌複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（たとえば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入に際して宿主細胞のゲノムの中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが動作可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と本明細書において呼ばれる。本開示では、ラミニンポリペプチド配列の発現は、本開示のプロモーター配列を、発現される遺伝子に動作可能に連結することによって、本開示のプロモーター配列によって指示される。一般に、組換えＤＮＡ技術において有益な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態をしている。本明細書では、プラスミドがベクターのうちで最も一般に使用されている形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は、区別なく使用されてもよい。しかしながら、本開示は、等価な機能を果たすウイルスベクター（たとえば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むように意図される。

ベクターは、さらなる核酸配列のサブクローニングのためのポリリンカーまたは転写物の適切なポリアデニル化を達成するためのポリアデニル化シグナルなどのさらなる配列も含有し得る。ポリアデニル化シグナルの性質は、本開示の方法の実施の成功にとって重大であると考えられず、ＳＶ４０およびウシ成長ホルモンポリ−Ａ部位を含むが、これらに限定されない任意のそのような配列が、用いられてもよい。メッセージレベルを増強し、かつ構築物から他の配列への読み過ごしを最小限にするために果たすことができる終止配列もベクターのエレメントとして企図される。さらに、発現ベクターは、典型的に、これらのベクターを持つ細胞の選択を可能にする、多くの場合、抗生物質耐性遺伝子の形態をした選択マーカーを有する。

さらなる実施形態では、本開示は、本明細書において開示されるラミニンβ２鎖発現組換え発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。本明細書において使用されるように、用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターなどの本開示の核酸が導入されている細胞を指すように意図される。そのような細胞は、たとえば、本開示の大量の発現ベクターを迅速に産生するために使用することができる原核生物であってもよく、または機能的な研究については真核生物であってもよい。

用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、区別なく本明細書において使用される。そのような用語が、特定の対象の細胞だけでなくそのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解されたい。ある種の修飾が変異または環境上の影響のいずれかのために続く世代において起こり得るので、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一でなくてもよいが、本明細書において使用されるような用語の範囲内になお含まれる。

宿主細胞は、１つまたは複数の本開示の発現ベクターにより一時的にまたは安定してトランスフェクトすることができる。原核生物細胞および真核生物細胞の中への発現ベクターのそのようなトランスフェクションは、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介性の、ＤＥＡＥデキストラン媒介性の、ポリカチオン媒介性の、もしくはウイルス媒介性のトランスフェクションを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の技術を介して達成することができる（たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第２版追補（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ． １９８７年 Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。

他の態様では、本開示は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、単離された完全長ヒトラミニンβ２鎖ポリペプチドを提供する。

本明細書において使用されるように、「単離されたポリペプチド」は、他のラミニン鎖を含む他のタンパク質ならびにポリアクリルアミドおよびアガロースなどのゲル剤を実質的に含まないポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、単離されたラミニンポリペプチドは、検出可能な混入ラミニン鎖を含まない。したがって、タンパク質は、天然の供給源から単離することができるまたは組換えタンパク質は、上記に開示されるトランスフェクト宿主細胞から単離することができる。

他の態様では、本開示は、単離されたラミニン−５２１を提供する。本明細書において使用されるように、用語「ラミニン−５２１」は、α５、β２、およびγ１鎖をともにつなぐことによって形成されたタンパク質を指す。この用語は、組換えラミニン−５２１および天然に存在する供給源由来のヘテロ三量体ラミニン−５２１の両方を包含するとして解釈されるべきである。好ましい実施形態では、ラミニン−５２１は、組換えラミニン−５２１（または「ｒ−ラミニン−５２１」）を含む。

本明細書において使用されるように、用語「ｒ−ラミニン−５２１」は、α５、β２、およびγ１鎖から選択されるラミニン−５２１鎖をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む１つまたは複数の発現ベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞によって発現される組換えヘテロ三量体ラミニン−５２１またはそのプロセシング形態もしくは分泌形態を指す。そのようなｒ−ラミニン−５２１は、したがって、単一の生物または異なる生物由来のα５、β２、およびγ１配列を含むことができる。様々なラミニン−５２１鎖のＤＮＡ配列は、当技術分野において公知であり、本開示のｒ−ラミニン−５２１を調製するための任意のそのような配列の使用が企図される（たとえばＰｏｕｌｉｏｔ， Ｎ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６１巻（２号）：３６０〜７１頁、（２０００年）；Ｋｉｋｋａｗａ， Ｙ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１３巻（第５部）：８６９〜７６頁、（２０００年）；Ｃｈｕｒｃｈ， Ｈ Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ３３２巻（第２部）：４９１〜８頁、（１９９８年）；Ｓｏｒｏｋｉｎ， Ｌ Ｍ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８９巻（２号）：２８５〜３００頁（１９９７年）；Ｍｉｎｅｒ， Ｊ Ｈ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７０巻（４８号）：２８５２３〜６頁（１９９５年）；Ｓｏｒｏｋｉｎ， Ｌ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２３巻（２号）：６０３〜１０頁（１９９４年）を参照されたい）。好ましい実施形態では、ｒ−ラミニン−５２１は、組換えヒトα５、β２、およびγ１ポリペプチド鎖から形成される。

本開示は、組換えヘテロ三量体ラミニン−５２１を構成する１つまたは２つの鎖のみが内因性ラミニン−５２１鎖によってコードされるラミニン分子を包含する。好ましい実施形態では、α５、β２、およびγ１ポリペプチド鎖の各々は、組換えで発現される。

ラミニン−５２１は、完全なタンパク質である。用語「完全な」は、α−鎖、β−鎖、およびγ−鎖のドメインのすべてから構成され、３つの鎖が、ヘテロ三量体構造を形成するようにともにつながれているタンパク質を指す。タンパク質は、別々の鎖、断片、または機能的ドメインに分解されない。用語「鎖」は、ラミニンタンパク質のアルファ、ベータ、またはガンマ鎖の全体を指す。用語「断片」は、他の分子または受容体に対して結合活性を持つ、１つ、２つ、または３つの機能的ドメインを含有する任意のタンパク質断片を指す。しかしながら、鎖が各々、３つを超えるそのようなドメインを持つので、鎖は、断片と考えられるべきではない。同様に、完全なラミニンタンパク質は、断片と考えられるべきではない。機能的ドメインの例として、ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、およびＧドメインが挙げられる。

ラミニン−５２１は、分泌タンパク質であり、これは、シグナル配列の結果として、小胞体（ＥＲ）、分泌小胞、および細胞外空間に導かれ得る。分泌タンパク質が細胞外空間に放出される場合、分泌タンパク質は、細胞外プロセシングを受けて、「成熟」タンパク質を産生することができる。そのようなプロセシング事象は、多様となり得、したがって、最終「成熟タンパク質」の異なるバージョンをもたらし得る。たとえば、α５、β２、およびγ１鎖の長さは、タンパク質の間で異なり得る。しかしながら、たとえ鎖長が異なっても、最終成熟タンパク質はなお、同じ機能性を有する。本開示の単離されたラミニン−５２１は、完全長ポリペプチド鎖および任意のそのような天然にプロセシングされたラミニン−５２１ポリペプチド鎖の両方を含むヘテロ三量体を含む。

本明細書において使用されるように、ラミニン−５２１ポリペプチド鎖は、以下：
（ａ）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ４、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ４、Ｒ２−Ｒ３、およびＲ２−Ｒ４からなる群から選択されるポリペプチド構造を含むポリペプチド鎖であって、ここで、Ｒ１は、アミノ末端メチオニンであり、Ｒ２は、ポリペプチドの分泌を指示することができるシグナル配列であって、該シグナル配列が、特定のラミニン鎖についての天然のシグナル配列、他の分泌タンパク質についての天然のシグナル配列、もしくは人工配列であってもよいシグナル配列であり、Ｒ３は、α５鎖、β２鎖、およびγ１鎖からなる群から選択される分泌ラミニン鎖であり、Ｒ４は、ラミニン鎖アミノ酸配列内の任意の位置に配置することができるエピトープタグ（下記に記載されるものなど）をさらに含む、分泌α５、β２、もしくはγ１ラミニン鎖である、または、
（ｂ）本明細書において開示される１つもしくは複数の組換えラミニン−５２１鎖ＤＮＡ配列（配列番号４、配列番号５、配列番号６）のコード領域もしくはその部分またはその相補的配列に、高または低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド鎖、または、
（ｃ）１つもしくは複数の開示されるラミニン−５２１ポリペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３）に対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するポリペプチド鎖、
の１つまたは複数に従うポリペプチド鎖を指す。

「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、洗浄条件であって、核酸のハイブリッドがそのもとで安定している洗浄条件を指すために本明細書において使用される。本開示は、本明細書において開示されるラミニン鎖ポリヌクレオチドのコード配列のすべてもしくは部分またはそれらの相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）に高ストリンジェンシー条件（本明細書において定義される）下でハイブリダイズする核酸も含む。ハイブリダイズする核酸におけるハイブリダイズする部分は、典型的に、長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_Ｍ）に反映される。Ｔ_Ｍは、配列相同性が１％減少する毎におよそ１〜１．５℃減少する。一般に、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーの条件下で実行され、様々であるが、より高度なストリンジェンシーの洗浄が後続する。本明細書において使用されるように、高ストリンジェンシーは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌ変性断片処理済みサケ精子ＤＮＡを含む溶液において４２℃で一晩のインキュベーションと、これに後続する、０．１×ＳＳＣ中、約６５℃でのフィルターの洗浄を指す。

低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件で本開示のポリヌクレオチドにハイブリダイズするラミニン−５２１コード核酸配列も企図される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよびシグナル検出における変化は、ホルムアミド濃度（ホルムアミドのパーセンテージが低いと、ストリンジェンシーの低下をもたらす）、塩条件、または温度の操作により主に達成される。たとえば、低ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ＝３Ｍ ＮａＣｌ；０．２Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４；０．０２Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、１００μｇ／ｍｌサケ精子遮断ＤＮＡを含む溶液における３７℃での一晩のインキュベーションと、これに後続する、１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳによる５０℃での洗浄を含む。さらに、さらに低いストリンジェンシーを達成するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの後に実行される洗浄は、より高い塩濃度（たとえば５×ＳＳＣ）で行うことができる。

ハイブリダイゼーション実験においてバックグラウンドを抑制するために使用される代替の遮断試薬の包含および／または置換を通して上記の条件における変化が達成され得ることに注意されたい。典型的な遮断試薬は、デンハート試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性サケ精子ＤＮＡ、および市販で入手可能な専売の剤（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を含む。特定の遮断試薬の包含は、適合性に関する課題のために、上記に記載されるハイブリダイゼーション条件の改良を必要とし得る。

本明細書において使用されるように、２つのアミノ酸または２つの核酸の「同一性パーセント」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０巻：５８７３〜５８７７頁、１９９３年）におけるように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７巻：２２６４．２２６８頁、１９９０年）のアルゴリズムを使用して決定される。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５巻：４０３〜４１０頁、１９９０年）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムの中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本開示の核酸分子に対するヌクレオチド配列同一性を決定するために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア１００、およびワード長＝１２により実行される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本開示のポリペプチドに対するアミノ酸配列同一性を決定するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、およびワード長＝３により実行される。比較の目的のためのギャップアライメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． ２５巻：３３８９〜３４０２頁、１９９７年）において記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが、使用される。

さらに、本開示の実施形態は、配列番号４、配列番号５、および配列番号６中に含有される１つまたは複数のポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有するラミニン−５２１鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

本明細書において使用されるように、「α５ポリヌクレオチド」は、ラミニンα５鎖をコードするポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチドは、１つまたは複数の以下のものによって特徴付けることができる：（ａ）配列番号５の選択される配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号５もしくはその相補的配列のコード配列に対して、低もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ｃ）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ４、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ４、Ｒ２−Ｒ３、およびＲ２−Ｒ４からなる群から選択される一般的な構造を有するラミニンα５鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、Ｒ１およびＲ２が、上記に記載されるとおりであり、Ｒ３が、分泌α５鎖であり、Ｒ４が、エピトープタグを含む分泌α５鎖である、ポリヌクレオチド。

本明細書において使用されるように、「β２ポリヌクレオチド」は、同じ名称のβ２ラミニン鎖をコードするポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチドは、１つまたは複数の以下のものによって特徴付けることができる：（ａ）配列番号４の配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号４もしくはその相補的配列のコード配列に対して、低もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ｃ）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ４、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ４、Ｒ２−Ｒ３、およびＲ２−Ｒ４から選択される一般的な構造を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、Ｒ１およびＲ２が、上記に記載されるとおりであり、Ｒ３が、分泌β２鎖であり、Ｒ４が、エピトープタグを含む分泌β２鎖である、ポリヌクレオチド。

本明細書において使用されるように、「γ１ポリヌクレオチド」は、同じ名称のγ１ラミニン鎖をコードするポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチドは、１つまたは複数の以下のものによって特徴付けることができる：（ａ）配列番号６の配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を共有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号６もしくはその相補的配列のコード配列に対して、低もしくは高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、または（ｃ）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ４、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ１−Ｒ３、Ｒ１−Ｒ４、Ｒ２−Ｒ３、およびＲ２−Ｒ４から選択される一般的な構造を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ここで、Ｒ１およびＲ２が、上記に記載されるとおりであり、Ｒ３が、分泌γ１鎖であり、Ｒ４が、エピトープタグを含む分泌γ１鎖である、ポリヌクレオチド。

本明細書において使用されるように、用語「エピトープタグ」は、キメラタンパク質の一部として発現されるポリペプチド配列を指し、エピトープタグは、エピトープタグに対して生成される抗体の結合についての、または該タグを含有する配列をアフィニティー精製するために使用することができる他の分子の結合についての認識部位としての役目を果たす。

好ましい実施形態では、ラミニンα５、β２、およびγ１鎖またはその断片をコードするｃＤＮＡは、発現ベクターの中にサブクローニングされる。あるいは、１つまたは複数のイントロンを含むラミニンα５、β２、および／またはγ１遺伝子配列は、発現ベクターの中にサブクローニングするために使用することができる。

他の態様では、本開示は、ラミニン−５２１のα５、β２、およびγ１鎖からなる群から選択される配列を含む、少なくとも１つのポリペプチド配列をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含有する発現ベクターによりトランスフェクトされているラミニン−５２１発現細胞であって、該トランスフェクトされた細胞が、組換えラミニン鎖を含有するヘテロ三量体ラミニン−５２１を分泌する、ラミニン−５２１発現細胞を提供する。好ましい実施形態では、細胞が、さらにより好ましくはすべてヒトの鎖であるラミニン−５２１のα５、β２、およびγ１鎖を含むポリペプチド配列をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーター配列を含有する組換え発現ベクターにより系統的にトランスフェクトされる。複数のトランスフェクションの後に、細胞は、ヘテロ三量体ｒ−ラミニン−５２１を形成する組換えラミニン−５２１鎖を発現する。

真核生物細胞の中への発現ベクターのトランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、またはリポソーム媒介性の、ＤＥＡＥデキストラン媒介性の、ポリカチオン媒介性の、もしくはウイルス媒介性のトランスフェクションを含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の任意の技術を介して達成することができる。細菌細胞のトランスフェクションは、標準的な方法によって行うことができる。

好ましい実施形態では、細胞は、安定してトランスフェクトされる。適切なトランスフェクトされた細胞の安定したトランスフェクションおよび選択のための方法は、当技術分野において公知である。他の好ましい実施形態では、ＣＭＶプロモーターにより駆動される発現ベクターは、ヒト胎児腎２９３細胞系において使用される。

ｒ−ラミニン−５２１を発現し、分泌することができる任意の細胞を使用することができる。好ましくは、真核生物細胞が使用され、そして最も好ましくは、腎臓および上皮細胞系を含むが、これらに限定されない哺乳動物細胞が使用される。個々の鎖またはｒ−ラミニン−５２１の発現を駆動するために使用されるプロモーター配列は、構成的（ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦを含むが、これらに限定されない様々なプロモーターのいずれかによって駆動される）または誘導性（テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド応答性を含むが、これらに限定されない、多くの誘導性プロモーターのいずれかによって駆動される）であってもよい。炭水化物およびジスルフィドの翻訳後修飾は、ラミニン−５２１タンパク質のフォールディングおよび機能のために必要とされると考えられる。他の系が、たとえば、抗体産生のための抗原を得るのに有用であるが、これは、真核生物細胞の使用を、機能的なｒ−ラミニン−５２１の産生にとって好ましいものにする。最も好ましい実施形態では、哺乳動物細胞は、ラミニンβ２鎖を内因的に発現しない。他の好ましい実施形態では、細胞は、ラミニン−５２１鎖のすべてを内因的に発現するとは限らない。

タンパク質は、エピトープタグおよび輸送シグナルなどの、タンパク質の精製を促すのに有用なさらなる配列を含んでいてもよい。そのようなエピトープタグの例としては、ＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、ｍｙｃ（９Ｅ１０）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、６−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、およびＨＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。そのような輸送シグナルの例としては、排出シグナル、分泌シグナル、核移行シグナル、および形質膜局在化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのラミニン鎖ポリペプチド配列またはその断片は、「エピトープタグ」をコードする核酸配列に動作可能に連結され、その結果、少なくとも１つの鎖は、発現されたエピトープタグを有する融合タンパク質として発現される。エピトープタグは、結果として生じるｒ−ラミニン−５２１が機能的なままである限り、ｒ−ラミニン−５２１を含むポリペプチド鎖のいずれに対してもアミノ末端、カルボキシ末端、または内部にあるものとして発現されてもよい。

他の実施形態では、ｒ−ラミニン−５２１鎖の一方は、第１のエピトープタグを有する融合タンパク質として発現され、少なくとも１つの他のｒ−ラミニン鎖は、第２の異なるエピトープタグを有する融合タンパク質として発現される。これは、複数回の精製が実行されるのを可能にする。あるいは、１つを超えるｒ−ラミニン鎖を有する融合タンパク質を作り出すために、同じエピトープタグを使用することができる。

さらなる実施形態では、エピトープタグは、ｒ−ラミニン−５２１鎖（複数可）から切断可能となるように操作することができる。あるいは、エピトープタグは、ｒ−ラミニン−５２１鎖のいずれにも融合されず、ｒ−ラミニン−５２１は、ラミニン−５２１特異的抗体または他のラミニン−５２１結合分子を使用する、アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない標準的な技術によって単離される。

単一のラミニン鎖によりトランスフェクトされた細胞から得られる培地は、ラミニン鎖特異的抗体を使用して、ウエスタンブロット上で最初に分析される。トランスフェクションの後の単一のラミニン鎖の発現は、一般的に、細胞内でのものある。個々のトランスフェクトされた鎖（複数可）に対する反応性を示すクローンは、トランスフェクトされた遺伝子の組み込みを確認するために、ＰＣＲ、逆転写−ＰＣＲ、または核酸ハイブリダイゼーションなどの、任意の適切な方法によって検証される。好ましくは、そのようなクローン由来のゲノムＤＮＡ調製物の分析は、ラミニン鎖特異的プライマー対を使用して、ＰＣＲによって行われる。３つの鎖をすべて産生する、トランスフェクトされたクローンから得られる培地は、ウエスタンブロット解析および細胞結合アッセイを含む、任意の適切な方法によって、ｒ−ラミニン−５２１分泌および／または活性についてさらに分析される。

好ましい実施形態では、ｒ−ラミニン−５２１の精製は、トランスフェクトされた細胞から得られる培地を抗体アフィニティーカラムに通過させることによって達成される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの組換え鎖上に発現されたペプチドエピトープに対する抗体は、アフィニティーカラムに付着され、培地中に分泌されたｒ−ラミニン−５２１に結合する。ｒ−ラミニン−５２１は、カラムに過剰量のペプチドを通過させることによってカラムから取り出される。溶離した画分は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって分析される。さらなる実施形態では、ペプチドエピトープは、精製後に切断することができる。他の実施形態では、それぞれ異なるエピトープタグを有する２つまたは３つの別々のｒ−ラミニン鎖が、融合タンパク質として発現され、２または３回の精製およびｒ−ラミニン−５２１の二重または三重の単離を可能にする。エピトープタグは、精製後に、ｒ−ラミニン−５２１鎖（複数可）から切断可能となるように操作することができる。あるいは、エピトープタグは、ｒ−ラミニン−５２１鎖のいずれにも融合されず、ｒ−ラミニン−５２１は、ラミニン−５２１特異的抗体または他のラミニン−５２１結合分子を使用して、アフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない標準的な技術によって単離される。

他の実施形態では、ｒ−ラミニン−５２１の精製は、トランスフェクトされた細胞から得られる培地をゲル濾過クロマトグラフィーカラムに通過させることによって達成される。溶離した画分は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって分析される。ｒ−ラミニン−５２１を含有する画分は、収集され、被検物の純度は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって評価される。いくつかの実施形態では、タンパク質溶液は、より高純度のタンパク質を得るために再びゲル濾過クロマトグラフィーカラムに通過させることができる。いくつかの実施形態では、より高純度のｒ−ラミニン−５２１溶液を達成するために、前の精製ステップから得られる培地またはｒ−ラミニン−５２１溶液は、イオン交換カラムに通過させることができる。溶離した画分は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロット解析を含む任意の適切な方法によって分析される。ｒ−ラミニン−５２１を含有する画分は、収集され、被検物の純度は、上記に挙げられるものを含む任意の適切な方法によって評価される。

本開示のラミニン−５２１ポリペプチド鎖は、（ｉ）１つもしくは複数の非保存アミノ酸残基による置換であって、置換アミノ酸残基が、遺伝子コードによってコードされるものであってもよいかもしくはそれでなくてもよい置換、または（ｉｉ）置換基を有する１つもしくは複数のアミノ酸残基による置換、または（ｉｉｉ）ポリペプチドの安定性および／もしくは溶解性を増加させるための化合物（たとえばポリエチレングリコール）などの他の化合物との、成熟ポリペプチドの融合、または（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドもしくはリーダーもしくは分泌配列もしくは精製を促進する配列などのさらなるアミノ酸との、ポリペプチドの融合も含む。そのような変異体ポリペプチドは、本明細書における教示から当業者の範囲内にあると考えられる。

たとえば、他の荷電または中性アミノ酸との荷電アミノ酸のアミノ酸置換を含有するポリペプチド変異体は、凝集がより少ないなど改善された特徴を有するタンパク質を産生し得る。薬学的製剤の凝集は活性を低下させ、また、凝集体の免疫原性活性によりクリアランスを増加させもする。（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２巻：３３１〜３４０頁（１９６７年）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６巻：８３８〜８４５頁（１９８７年）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０巻：３０７〜３７７頁（１９９３年））。

特定の実施形態では、単離されたラミニン−５２１は、３つの鎖を含む。第１の鎖は、配列番号１のポリペプチド配列（すなわちα５ラミニン鎖）に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを含む。第２の鎖は、配列番号２のポリペプチド配列（すなわちβ２ラミニン鎖）に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む。第３の鎖は、配列番号３のポリペプチド配列（すなわちγ１ラミニン鎖）に対して少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドを含む。これらの第１、第２、および第３の鎖は、集合して、組換えラミニン−５２１を構築する。

より特定の実施形態では、第１の鎖のポリペプチドが、配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、第２の鎖のポリペプチドが、配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、第３の鎖のポリペプチドが、配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する。

より特定の実施形態では、第１の鎖のポリペプチドが、配列番号１のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、第２の鎖のポリペプチドが、配列番号２のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有し、第３の鎖のポリペプチドが、配列番号３のポリペプチド配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する。

特定の実施形態では、第１の鎖が、配列番号１のポリペプチド配列を含み、第２の鎖が、配列番号２のポリペプチド配列を含み、第３の鎖が、配列番号３のポリペプチド配列を含む。

特定の実施形態では、第１の鎖が、配列番号１のポリペプチド配列であり、第２の鎖が、配列番号２のポリペプチド配列であり、第３の鎖が、配列番号３のポリペプチド配列である。

本開示は、単離されたラミニン−５２１および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的組成物をさらに提供する。好ましい実施形態では、薬学的組成物が、単離されたｒ−ラミニン−５２１を含む。本開示のこれらの態様によれば、他の作用物質は、処理されている状態に依存して、薬学的組成物中に含むことができる。薬学的組成物は、コラーゲン、他のラミニン型、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、α−ジストログリカン、エンタクチン／ナイドジェン、α−ジストログリカン、糖タンパク質、プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、上皮成長因子、血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、もしくは神経成長因子またそれらのペプチド断片を含むが、これらに限定されない、１つまたは複数の他の化合物をさらに含み得る。

単離されたラミニン−５２１を含む薬学的調製物は、任意の適した形態で調製することができ、一般的に、薬学的に許容されるキャリアと組み合わせた単離されたラミニン−５２１を含む。キャリアは、注射用のキャリア、局所用のキャリア、経皮的なキャリアなどとすることができる。調製物は、有利には、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、噴霧剤、分散剤、懸濁剤、または泥膏などの局所投与のための形態をしていてもよい。調製物は、有利には、従来どおりの組成および量で、保存剤、抗菌薬、抗真菌薬、酸化防止剤、浸透圧剤、および同様の材料をさらに含んでいてもよい。本開示に従う使用に適した溶液は無菌であり、提唱された適用について有害ではなく、無菌化などの従来の薬学的作業にかけることができそして／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などのような従来のアジュバントを含有し得る。本開示の組成物の製剤化を助けるために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９７５年）が参照されてもよい。

さらなる態様では、本開示は、生体適合性が改善された医療デバイスであって、デバイスの外表面が、単独でまたはデバイス表面の生体適合性を増加させる役目を果たす他のタンパク質または作用物質と組み合わせて、単離されたラミニン−５２１またはその薬学的組成物によりコーティングされる医療デバイスを含む。コーティングされたデバイスは、細胞付着（内皮細胞付着など）を促進し、デバイスの侵入の部位での炎症および／または感染の減少をもたらす。

そのような医療デバイスは、身体への移植に使用される任意の材料とすることができ、好ましくは、ステンレス鋼またはチタンなどの生体適合性金属からできているまたはそれによりコーティングされている。あるいは、デバイスは、セラミックス材料またはポリエステル、ポリグリコール酸、もしくはポリガラクトース−ポリグリコール酸コポリマーなどのポリマーからできているまたはそれによりコーティングされている。

デバイスが、メッシュ、シート、または布の形態をした天然または合成の生分解性材料からできている場合、単離されたラミニン−５２１またはその薬学的組成物は、その表面に直接適用され得る。適切な細胞は、その後、単離されたラミニン−５２１によるコーティングが望ましい歯の橋脚歯部分、針、金属ピンまたは棒、留置カテーテル、人工肛門形成チューブ、外科用メッシュ、および任意の他の器具を含む、移植できるまたは植え込み型のデバイスを形成するために、そのマトリックス上で培養されてもよい。あるいは、デバイスは、移植されてもよく、細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて付着させてもよい。

単離されたラミニン−５２１のカップリングは、非共有結合であってもよい（吸着によってなど）または共有結合の手段によるものであってもよい。デバイスは、単離されたラミニン−５２１またはその薬学的組成物中に浸してもよく、インキュベートしてもよく、またはそれを噴霧してもよい。

本開示の単離されたラミニン−５２１を使用する様々な処置についての投薬レジメンは、外傷または状態のタイプ、年齢、体重、性別、個人の医学的な状態、状態の重症度、および投与のルートを含む、様々な因子に基づく。したがって、投薬レジメンは、広く異なり得るが、標準的な方法を使用して、医師によって日常的に決定することができる。ラミニンは、非常に有力な分子であり、細胞当たり１つまたは少数の分子により効果をもたらすことができる。したがって、送達が最適化される場合、ミリリッターの範囲当たりピコグラムの有効用量が、可能である。

他の態様では、本開示は、単細胞懸濁物への解離の後にヒト胚性幹細胞の生存を可能にする、新しい材料である、単離されたラミニン−５２１を提供する。幹細胞は、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって単細胞懸濁物へと解離させ、遠心分離によってペレットにし、Ｏ３培地に再懸濁し、４０μｍのふるいで濾過し、単離されたラミニン−５２１、ラミニン−５１１、またはＭａｔｒｉｇｅｌのいずれかによってあらかじめコーティングした細胞培養ディッシュに３００００細胞／ｃｍ^２の密度で蒔いた。１日培養した後に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に蒔いた細胞は、当技術分野において公知のように死滅した。ラミニン−５２１上に蒔いたヒト胚性幹細胞は生存し、また、ラミニン−５１１上に蒔いたヒト胚性幹細胞はほとんどの場合生存し、増殖し始め、多能性細胞の小さなコロニーを形成した。

さらなる態様では、本開示は、多能性状態のヒト胚性幹細胞を増殖させるための方法を提供する。ラミニン−５２１上に単細胞懸濁物で蒔いたヒト胚性幹細胞は、生存し、当技術分野において公知の古典的な方法よりも速い速度で増殖することが示された。３回の継代（１か月）後に、単細胞懸濁物で継代された細胞は、２０回の継代（３か月）後にＭａｔｒｉｇｅｌ上で分けて継代された細胞培養物のそれと同数の細胞分裂を行った。そのため、新しい方法は、時間および労力の点から有利であり、これは、著しい経済的利益をもたらし得る。

ラミニン−５２１は、通常、ヒト多能性胚性幹細胞によって発現され、かつ分泌され、腎臓、神経筋接合部、肺、および胎盤に見出すことができる。

純粋なラミニン−５２１の利用可能性は、細胞の分化に対するタンパク質の効果および細胞の表現型の維持に関する研究を可能にすることになる。したがって、組織に対する外傷の処置、細胞付着を促すこと、増殖および遊走、ｅｘ ｖｉｖｏ細胞療法、医療デバイスの生体適合性の改善、ならびに改善された細胞培養デバイスおよび培地の調製を含むが、これらに限定されない多数の研究および治療の目的は、純粋な完全な単離されたラミニン−５２１が利用可能であるならば、進展することになる。また、幹細胞に対する純粋なラミニン−５２１の効果は、このタンパク質が初期哺乳動物胚において発現されるので、研究することは重要であろう。

したがって、研究および治療の目的のための単離されたラミニン−５２１ならびに単離されたラミニン−５２１を作製するための方法についての必要性が当技術分野において存在するる。ラミニン−５２１は、十分に化学的に特定されている、フィーダーなしで、かつ動物タンパク質がない（異種由来成分不含）条件下で、解離されたヒトＥＳおよび人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の長期自己再生および迅速な増殖のためのマトリックスとして果たすことができる。ＬＮ−５２１ベースのシステムは、使用するのが容易であり、自動化するのが容易であり、また、ヒトＥＳ／ｉＰＳ培養の迅速なスケールアップを可能にする。

本開示は、細胞、特に幹細胞に栄養を提供するために使用することができる細胞培養培地にも関する。この点に関して、幹細胞は、典型的に、培養される２つのものを必要とする：（１）幹細胞に構造的支持体を提供する基質またはコーティングおよび（２）幹細胞に栄養を提供するための細胞培養培地。基質またはコーティング（１）は、たとえばペトリディッシュまたは他のある容器上に一般的に配置される。

本明細書において使用されるように、用語「自己再生」は、幹細胞が多数のサイクルの細胞分裂を経て、未分化（すなわち多能性）のままである能力を指す。多能性はそれ自体、幹細胞があらゆる細胞型に分化する能力を指す。用語「増殖」は、幹細胞が分裂する能力を指す。生存は、分化していても未分化であっても幹細胞の生育する能力を指し、幹細胞が、分裂するまたは分化するその能力を維持することを必要としない。

本開示の細胞培養培地は、ラミニン−５２１および／またはラミニン−５１１を含有する基質と共に使用されるのに特に適している。これらのラミニンは、α６β１インテグリンを活性化し、これは、順番に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化につながる。これは、幹細胞の多能性、自己再生、および／または増殖を増大させる。基質が、完全な、別々の鎖としての、またはその断片としてのラミニン−５２１またはラミニン−５１１からなってもよいことが企図される。組換えラミニン−５２１および組換えラミニン−５１１は、市販で入手可能である。多くの様々な分子が、様々な効率によってであるが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化することができる。たとえば、ＴＧＦベータ１およびｂＦＧＦは、この経路を活性化する。ラミニン−５２１および／またはラミニン−５１１の使用により、そのような分子の量を細胞培養培地において低減させることができる。ラミニン−５２１は、α６β１インテグリンを介して最大量のシグナルを伝達し、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化する。ラミニン−５２１の使用は、単細胞への酵素学的解離の後に、細胞生存を増大させるために、細胞に有害なｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の添加をせずに、単細胞懸濁物を継代するのを可能にする。以前は、人工アポトーシス阻害剤を使用しないヒトＥＳ細胞の単細胞への酵素学的継代は、不可能であった。継代手順の単純さは、実験的変動が低下し、プロセスがハイスループット細胞培養用に自動化されることを可能にし、その結果として、細胞培養スタッフの広範囲なトレーニングおよびコストを伴わないことを意味する。さらに、ラミニン−５２１またはラミニン−５１１上に蒔かれたヒトＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞は、単層として成長し、細胞がマトリックスおよび細胞培養培地に等しく曝露されるので、これにより培養物が均一になる。ラミニン−５２１上で化学的に特定されている、異種由来成分不含の環境において成長し、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で単細胞として継代されたそのようなヒトＥＳ細胞培養物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で成長し、凝集塊として継代された細胞と比較して、さらによりよい成長速度で継続的に数か月間も増殖する。これらの多能性で長期間増殖された細胞は、Ｏｃｔ４を均一に発現し、核型は正常なままである。したがって、生存および増殖能力が保持されたヒトＥＳ細胞およびヒトｉＰＳ細胞を得ることができる。

平均接触面積および拡散の均一性は、他の利用可能な基層と比較して、ラミニン−５１１上で培養された細胞についてはるかに大きい。３か月間を超えてラミニン−５１１上で成長させたヒトＥＳ細胞は、多能性を維持し、ＳＣＩＤマウスへの移植後に奇形腫を生成し得る。ラミニン−５１１はまた、他の公知のマトリックスが２週間よりも長く支持することができないにもかかわらず、ＬＩＦまたはフィーダー細胞の不在下において、５か月間を超える期間、マウスＥＳ細胞の自己再生を支持する。

この細胞培養培地により成長する幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、成体幹細胞、胎児幹細胞、羊膜幹細胞、および一般的にあらゆる多能性幹細胞であり得る。

典型的に、細胞培養培地は、分化を阻害し、かつ増殖を改善するために、多数のかつ多量の様々な成長因子およびサイトカインを含む。本開示の細胞培養培地の１つの利点は、それほど多くのまたはそのような多量の成長因子またはサイトカイン含有していないということである。

最も一般的には、本開示の細胞培養培地は、典型的に使用されるものよりも低量の塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を必要とする。細胞培養培地は、１ミリリッター当たり０を超える値〜３．９ナノグラム（ｎｇ／ｍＬ）のｂＦＧＦを含んでいてもよいことが企図される。ｂＦＧＦは、ヒトｂＦＧＦであり、それにより細胞培養培地は、完全に、ヒト型の限定培地（ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｄｅｆｉｎｅｄ）である。いくつかのより詳細な実施形態では、細胞培養培地は、３．５ｎｇ／ｍＬ以下のｂＦＧＦを含み得る。他の実施形態では、細胞培養培地は、０．５〜３．５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ゼロのｂＦＧＦを有し得る、すなわち、ｂＦＧＦは、存在しない。

一般的に、細胞培養培地は、少なくとも１つの無機塩、少なくとも１つの微量ミネラル、少なくとも１つのエネルギー基質、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも１つのビタミン、および少なくとも１つの成長因子（ｂＦＧＦに加えて）が溶解している液相を含む。下記の表１は、本開示の細胞培養培地中に存在してもよい様々なそのような成分のリストならびにその成分が存在する場合、最小濃度および最大濃度を含む。値は、科学的表記法で提示する。たとえば、「４．１Ｅ−０１」は、４．１×１０^−０１として解釈されるべきである。

細胞培養培地の液相は、水、血清、またはアルブミンであってもよい。

表１において上記に列挙される成分または構成成分の多くは、必要ではないかまたはより低濃度で使用することができる。

細胞培養培地がインスリンまたはインスリン代替物を含有し得ることが企図される。同様に、細胞培養培地は、トランスフェリンまたはトランスフェリン代替物を含有し得る。

より詳細な実施形態では、細胞培養培地が、（１）アルブミンを含有せずともよい、（２）インスリンもしくはインスリン代替物を含有せずともよい、（３）トランスフェリンもしくはトランスフェリン代替物を含有せずともよい、またはこれらの３つの構成成分の任意の組み合わせを含有せずともよいことが企図される。

他の細胞培養培地が、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ−１βもしくはカタボリン（ｃａｔａｂｏｌｉｎ））、インターロイキン−６（ＩＬ６）、または色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）などの成長因子を含有してもよいことに注意されたい。そのような成長因子は、本開示の細胞培養培地中に存在しない。

細胞培養培地の１つの詳細な組成を表２に提供する。

この点に関して、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液は、１００×濃縮物において典型的に提供される。表２のＭＥＭは、１×に希釈を戻した後に使用され、表３において列挙される以下の濃度の以下のアミノ酸を含有する。

ＤＭＥＭ／Ｆ１２は、表４において記載される以下の成分を含有する。

本開示の細胞培養培地との、ラミニン基質の組み合わせは、より安価になり得る細胞培養系をもたらすが、多能性幹細胞を維持する際に、より高い効率をもたらす。本質的に、必要とされるのは、ラミニンおよび最小量の栄養だけである。この細胞培養培地と組み合わせて使用されるラミニンは、ＬＮ−５１１またはＬＮ−５２１のいずれかであることが特に企図される。

以下の実施例は、本開示をさらに例証する目的のためのものである。実施例は、単に例証であり、そこに記載される材料、条件、またはプロセスパラメーターに対する開示に従って作製されたデバイスを限定するようには意図されない。

（実施例１）
ヒトラミニンβ２ ｃＤＮＡのクローニング
ヒトラミニンβ２ ｃＤＮＡの５．６ｋｂ断片は、プライマー５’−ＧＴＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＡＧＡＧＴＴＧＡＣ−３’（配列番号７）および５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＴＧＣＡＴＡＧＧＣ−３’（配列番号８）を使用して、ヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＰＣＲ増幅し、それにより、断片の端末上に人工のＸｂａＩおよびＫｐｎＩ切断部位を導入した。ＰＣＲ増幅の間のエラー率を減少させるために、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＰＣＲキット（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用した。続いて、断片は、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩにより消化し、同じ制限エンドヌクレアーゼにより消化したｐＳＫベクター（ｐＳＫＨＬＡＭＢ２プラスミド）へとサブクローニングした。配列の完全性を検証するために、ｐＳＫＨＬＡＭＢ２プラスミドのいくつかのクローンについて配列決定した。配列決定は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標） ＢｉｇＤｙｅ（商標） Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標） ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で実行した。ＮＣＢＩデータベースのヒトラミニンβ２配列と完全にマッチするもののみを、さらなるクローニングのために選択した。

発現構築物
ヒトラミニンβ２鎖の発現のために、ｐＳＫＨＬＡＭＢ２プラスミドは、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩにより消化し、ＸｂａＩ−ＫｐｎＩ処理ｐｃＤＮＡ ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとサブクローニングした。

ヒトラミニンα５（ＨＬＮ５Ｆｕｌｌ．ｐｃＤＮＡ構築物）およびγ１（ＨＧ１構築物）の発現に使用された構築物は、以前に記載されている（Ｄｏｉ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７巻（１５号）、１２７４１〜８頁（２００２年））。

抗体
抗ラミニンβ２（ＭＡＢ２０６６）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｒ＠Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。抗ラミニンα５ ｍＡｂ（２Ｆ７）は、Ａｂｎｏｖａから購入した。抗ラミニンβ１ ｍＡｂ（ＭＡＢ１９２１）は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎから購入した。抗ラミニンγ１（Ｈ−１９０）ウサギポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．から購入した。

組換えラミニン−５２１の産生および精製
ｒ−ラミニン−５２１は、３７℃の加湿５％ＣＯ_２大気中で、ＤＭＥＭ、１０％ ＦＣＳで培養したヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）において産生した。野生型細胞は、標準的なリン酸カルシウム法を使用してＨＧ１構築物でトランスフェクトし、安定したコロニーは、１００ｍｇ／ｍｌハイグロマイシン（Ｃａｙｌａ）を使用して選択した。すべてのさらなる細胞培養およびクローンの増殖は、適切な選択抗生物質の継続的な存在下において実行した。その後、高度に発現するクローンは、ヒトラミニンβ２構築物によりトランスフェクトし、安定したクローンは、５００ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して選択した。ラミニンγ１およびラミニンβ２の両方を高度に発現するクローンは、最終的に、ＨＬＮ５Ｆｕｌｌ．ｐｃＤＮＡ構築物によりトランスフェクトし、安定したコロニーは、２００ｍｇ／ｍｌ ゼオシン（Ｃａｙｌａ）を使用して選択した。最も高度な分泌を示すクローンは、さらに増殖させた。

ｒ−ラミニン−５２１の産生のために、コンフルエントな細胞は、５日間までＤＭＥＭ中で培養した。ｒ−ラミニン−５２１は、抗ＦＬＡＧ Ｍ２マトリックス（Ｓｉｇｍａ）を使用してアフィニティー精製した。収集した培地は、撹拌しながら、４℃で、一晩、マトリックスと共にバッチモードでインキュベートした。結合したｒ−ラミニン−５２１は、室温で、ＴＢＳ／Ｅ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で５０ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチド（Ｓｉｇｍａ）により競合的に溶離した。溶離物は、濃縮し、緩衝液は、３０ｋＤカットオフ限外濾過（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＢＳと交換した。最終的に、濃縮溶液は、０．２ｍｍフィルターを通過させ、自己凝集ポリマーを除去した。

組換えラミニン−５２１の特徴付け
培地中の分泌ラミニン、および精製後の分泌ラミニンは、３〜８％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して特徴付けた。タンパク質は、Ｓｙｐｒｏ染色（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して可視化するかまたは、ＰＶＤＦ上に移した（図３）。膜は、上記に記載される抗体によりプローブした。洗浄後に、膜は、ＨＲＰ結合体化ヤギ抗体と共にインキュベートした。免疫反応性は、製造業者の指示に従って、化学発光キット（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）によって検出した。

方法
ヒトＥＳ細胞培養物
ヒトＥＳ細胞は、５％ＣＯ_２中、３７℃において、化学的に特定されているＯ３培地（Ｒｏｄｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２８巻、６１１〜６１５頁（２０１０年）に記載）を含む、ｒ−ラミニン−５２１でコーティングした実験室用ディッシュ（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｄｉｓｈ）上で培養した。細胞は、１０〜１２日間ごとに１回、常習的に通過させ、３７℃で５分間トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に曝露させた。それらは、その後、穏やかにピペッティングして、単細胞懸濁物へとばらばらにし、特定されているトリプシン阻害剤（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。細胞懸濁物は、４分間、遠心分離し、上清は廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたＯ３培地中に再懸濁し、細胞は、その後、４０μｍのふるいに通過させた。その後、細胞は、３００００細胞／ｃｍ^２の濃度（１：２５〜１：３０の分割比）で新しいｒ−ラミニン−５２１をコーティングしたディッシュ上に蒔いた。ほんの数滴の新鮮な培地を加えるときには、継代後の第１日を除いて、１時間インキュベーター中であらかじめ温めた新鮮な培地を１日に１回、細胞に与えた。同じ系統の対照細胞は、Ｒｏｄｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２８巻、６１１〜６１５頁（２０１０年）において記載されるように、Ｏ３培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で培養した。対照細胞は、分けて継代した。

細胞培養ディッシュのコーティング
９６ウェル組織細胞培養プレートは、すべて３０μｇ／ｍｌ（５μｇ／ｃｍ^２）の濃度のＥＣＭタンパク質である、マウスＬＮ−１１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヒト組換えＬＮ−５１１、およびヒト組換えＬＮ−５２１の無菌溶液により、４℃で一晩コーティングした。対照細胞については、ｈＥＳＣに適したＢＤ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示に従って使用した。

細胞接着アッセイ
アッセイは、記載されるように実行した（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０００年）。手短に言えば、９６ウェルプレートは、上記に記載されるように細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するＯ３培地によってブロッキングした。ＥＳ細胞は、細胞外マトリックスをコーティングしたプレート上で６００細胞／ｍｍ^２の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーターで１時間または１日間接着させた。非接着細胞は、洗い流し、接着細胞は、５％グルタルアルデヒドによって２０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットによって染色した。

ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲによる定量化
全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡは、Ｒｏｄｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２８巻、６１１〜６１５頁（２０１０年）において記載されるように合成した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ Ｔａｑｍａｎアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを使用して実行した。反応はすべて、対象のｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブを含有する以前に開発された遺伝子発現アッセイミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により４連で行った。各実験についての追加の反応は、ＲＮＡインプットを標準化するために使用した、ＧＡＰＤＨについての以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスを含んだ。データはすべて、７３００ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ バージョン１．４により分析した。

ＦＡＣＳ分析
ＯＣＴ４発現は、Ｌｕｄｗｉｇ， Ｔ．Ｅ．ら Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｄｅｆｉｎｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２４巻、１８５〜１８７頁（２００６年）において記載されるように分析した。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に流した。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析した。

実施例１についての結果
異なる細胞培養コーティングがいかなる添加剤もなしで、Ｏ３培地におけるヒトＥＳ細胞の単細胞の生存にどのように影響を及ぼすかを調べるために、本発明者らは、ＨＳ１８１細胞を完全に解離し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、マウスラミニン−１１１、ヒトｒ−ラミニン−５１１、ヒトｒ−ラミニン−５２１、またはｒ−ラミニン−５１１およびｒ−ラミニン−５２１の混合物上にそれらを蒔いた。結果は図４に認められる。予想されたように、蒔いてから後２４時間の間に、Ｍａｔｒｉｇｅｌおよびマウスラミニン−１１１に付着し続けた細胞は、ほとんどなかった。対照的に、ヒトｒ−ラミニン−５２１、上記混合物、および程度は少ないがヒトｒ−ラミニン−５１１上の細胞は、生存した。

実験は、ＲＯＣＫ阻害剤のＹ−２７６３２により処理したＯ３培地中のヒトＥＳ細胞について繰り返した。これらの結果は図５に認められる。幹細胞は、５つすべてのコーティング上に付着したままであった。

この効果を定量化するために、本発明者らは、蒔いてから１時間および１日後に前述のすべてのコーティング上で細胞接着実験を実行した。（すなわち、Ｙ−２７６３２ありおよびなしの５つのコーティングの各々）。図６は、Ｙ−２７６３２なしのＬＮ−５２１、ＬＮ−５１１、およびＭａｔｒｉｇｅｌ（ＭＧ）についての１時間の実験についての結果を示す。いかなる添加剤もないＯ３培地におけるヒトＥＳ細胞の接着は、この時点でほぼ同じであった。

図７は、すべてのコーティングについての１日間の実験についての結果を示す。Ｙ−２７６３２阻害剤を含有するプレートは、コーティングと共に「Ｉｎ＆」と表示する。蒔いてから１日後に、幹細胞は、添加剤なしのＭａｔｒｉｇｅｌに比べ２０倍良好に、添加剤なしのＬＮ−５２１に接着した。さらに、結果は、添加剤なしのＬＮ−５２１に対する細胞の接着が、ＲＯＣＫ阻害剤を含むすべてのディッシュ上の細胞の接着と同様であったことを示した。言い換えれば、ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫ阻害剤を含有するコーティングと同様の結果を得るために、ＬＮ−５３２コーティングに必要とされない。

本発明者らは、ヒトｒ−ラミニン−５２１上でヒトＥＳ細胞を培養し、１：２５〜１：３０の比で１０〜１２日ごとに単細胞懸濁物へと完全に解離させた後にそれらを継代した。細胞は、少なくとも９回の継代（３か月間）の間、安定した速い速度で強健に増殖した。さらに、３回の継代（１か月間）後に、それらは、従来の方法を使用して培養された２０回の継代（１００日間）後の幹細胞と同数の細胞倍加を遂げた。これは、時間に対する細胞の数の増加を示す図８に示される。ＬＮ−５２１上の細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上のものよりもはるかに迅速な速度で増加した。したがって、新しいｒ−ラミニン−５２１ ｈＥＳ細胞培養方法は、時間および労力の点から有利であった。

いかなる添加剤もなしでＯ３培地中のヒトｒ−ラミニン−５２１上での数回の単細胞懸濁物を継代した後のｈＥＳ細胞の同一性を確認するために、本発明者らは、多能性のマーカーであるＯｃｔ４についてのＦＡＣＳ分析を実行した。図９は、ｒ−ＬＮ−５２１上で成長させた細胞についての結果を示し、一方、図１０は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で成長させた細胞についての結果を示す。陽性細胞のパーセンテージを括弧内に記載する。Ｒ−ＬＮ−５２１は、はるかに高いパーセンテージの多能性細胞を有した。

さらに、多能性マーカーであるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇのｍＲＮＡの転写物の数を定量化した。図１１はこれらの結果を示す。両方のマーカーについて、ＬＮ−５２１上の細胞は、より多数の転写物を示した。

両方の方法は、新しい方法が、細胞培養ディッシュコーティング材料としてＭａｔｒｉｇｅｌを使用し、小さな凝集塊で細胞を継代する現在の方法と同じまたはそれよりもよい品質のｈＥＳ細胞をもたらすことを示した。

（実施例２）
本実施例２において、多能性ｈＥＳ細胞においても発現される、発現させ、精製した組換えＬＮ−５２１を、培養したｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞に対するその効果について研究した。結果は、ＬＮ−５２１が、単独で、多能性ｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の自己再生を強く支持することを示した。そして、重要なことには、それは、高い希釈度のＬＮ−５２１上の単細胞懸濁物におけるトリプシン処理幹細胞を蒔いてから後に、多能性幹細胞の生存を可能にする。ＬＮ−５２１の効果は、ｈＥＳ細胞遊走およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路活性化の誘導を通じての、α６β１インテグリンを介したシグナル伝達によって媒介されることが示された。結果は、多能性ｈＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞の大規模産生のための有効で、さらに自動化された増殖方法ならびに多能性幹細胞の自己再生のための新しい培地剤の開発に適用され得る。ここで記載された新しいｈＥＳ／ｈｉＰＳ細胞培養方法は、たとえば、線維芽細胞を培養するために使用される標準的な細胞培養方法に密に類似しており、そのため、それは特殊技能を必要としない。それは、１回の細胞分裂あたりに消費する細胞コーティング物質が著しくより少なく、時間効率的であり、したがって、ｈＥＳ／ｈｉＰＳ細胞を培養するための以前の手順と比較して著しい経済的利益をもたらす。

以前は純粋な形態で入手可能ではなかったヒト組換えＬＮ−５２１は、完全長ラミニンβ２ ｃＤＮＡをクローニングし、ヒトラミニンα５、β２、およびγ１鎖によるＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションを実行することによって産生した。ヒト組換えＬＮ−１１１およびＬＮ−１２１は、完全長α１およびβ２鎖のｃＤＮＡのクローニングならびにそれぞれヒトα１、β１、およびγ１鎖ならびにα１、β２、およびγ１鎖のｃＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクション後に、同様に生成した。精製したＬＮ−５２１、ＬＮ−１１１、およびＬＮ−１２１タンパク質は、それぞれ、タンパク質染色およびウエスタンブロット解析によって示されたように、純粋なα５、β２、およびγ１鎖、α１、β１、およびγ１鎖、ならびにα１、β２、およびγ１鎖を含有することが示された。

方法
ヒトＥＳ細胞培養物およびヒトｉＰＳ細胞培養物
ＨＳ１８１およびＨＳ４０１のヒトＥＳ細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で、Ｏ３培地（Ｒｏｄｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第２８巻、６１１〜６１５頁（２０１０年）に記載、ｐＨは７．３５に調整した）、ｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および化学的に特定されており、異種由来成分不含のＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ＬＮ−５２１をコーティングした培養ディッシュ上で培養した。最初に、その系統の細胞を、無菌のナイフを使用して注意深く掻いて剥がして、続いてトリプシン処理することによって、ヒトフィーダー細胞層からＬＮ−５２１コーティング上に移すか、または細胞は、ＬＮ−５１１コーティングから単細胞懸濁物へとトリプシン処理した。ほんの数滴の新鮮な培地を加えたときに、蒔いてから後の第１日を除いて、１時間インキュベーター中であらかじめ温めた新鮮な培地を１日に１回、細胞に提供した。細胞は、１０〜１２日間に１回、常習的に通過させ、３７℃、５％ＣＯ_２で５分間Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に曝露させた。それらは、その後、穏やかにピペッティングして単細胞懸濁物へとばらばらにし、特定されているトリプシン阻害剤（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。細胞懸濁物は、４分間、２５ ｒｃｆで遠心分離し、上清は、廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたＯ３培地に再懸濁し、細胞は、その後、４０μｍのふるいに通過させた。続いて、細胞は、１：２５〜１：３０の分割比で３０，０００細胞／ｃｍ^２の濃度で新しいＬＮ−５２１でコーティングしたディッシュ上に蒔いた。同じ系統の対照細胞は、以前に記載されるようにＯ３培地において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＬＮ−５１１上で培養した^９。

特定された、かつ異種由来成分不含の培養については、ＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地および特定されており、いかなる動物由来の構成成分も含まないＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）酵素を使用した。細胞は、１０〜１４日間ごとに通過させ、３７℃、５％ＣＯ_２で４〜５分間ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔに曝露させた。その後、酵素を注意深く吸引し、あらかじめ温めたＴｅＳＲ２培地を加えた。その後、細胞は、穏やかにピペッティングして単細胞懸濁物へとばらばらにし、遠心分離し、上清は、廃棄し、細胞ペレットは、あらかじめ温めたＴｅＳＲ２に再懸濁した。細胞は、その後、４０μｍのふるいに通過させ、新鮮なＬＮ−５２１をコーティングしたディッシュ上に蒔いた。

組織細胞培養プレートは、すべて３０μｇ／ｍｌ（５μｇ／ｃｍ^２）の濃度の、ヒト組換えＬＮ−５２１などのＥＣＭタンパク質の無菌溶液により、４℃で一晩コーティングした。対照プレートは、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの指示に従ってＭａｔｒｉｇｅｌによりコーティングした。使用に先立って、ディッシュを１時間、インキュベーター中であらかじめ温め、その後に、あらかじめ温めたＯ３培地を、ディッシュをさらに洗浄することなく、加えた。新しいディッシュに新鮮なＬＮ−５２１溶液を適用した後に、残りのＬＮ−５２１溶液は、少なくとももう１回使用することができた。生存実験における接着、生存、および阻害はすべて、新鮮なコーティング材料を使用して実行した。

ヒトｉＰＳ細胞のＣｈｉＰＳＷ系統は、Ｏｃｔ−４／ＳＯＸ２／ＮＡＮＯＧ／ＬＩＮ２８リプログラミング遺伝子を用いてレンチウイルスにより（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｌｙ）形質導入されたヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）に由来した。ＣｈｉＰＳＷ系統は、様々な継代時点における繰り返しの試験において、正常な男性核型、４６，ＸＹを有した。細胞培養および継代実験に先立って、細胞は、多能性マーカーの発現について最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴付けた。Ｏｃｔ３／４（ＳＣ−５２７９）、Ｎａｎｏｇ（ＳＣ−３３７５９）、ＴＲＡ−１−６０（ＳＣ−２１７０５）、およびＳＳＥＡ４（ｓｃ−２１７０４）に対する抗体を用いる免疫蛍光検査による調査により、細胞が多能性のそれらのマーカーをすべて発現したことが示された。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、細胞がウイルス性の導入遺伝子の発現を欠くことを確認した。ＣｈｉＰＳＷ細胞の多能性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（胚様体形成および免疫蛍光検査による調査）およびｉｎ ｖｉｖｏ（ＳＣＩＤベージュマウスへの皮下注射）実験によって確認した。ＣｈｉＳＷ系統の細胞は、拍動する心筋細胞にさらに分化することができた。それらは、造血分化を遂げることもできた。

本発明のフィーダーなしの培養を始める前に、ｉＰＳ細胞は、照射ヒト包皮線維芽細胞上で維持し、増殖させた。ノックアウト血清（ＫＳＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の補充培池は、８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充して、増殖に使用した。細胞は一日単位で養分を与え、必要とされる場合に、コラゲナーゼＩＶ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）を使用してまたは手作業による解離により毎週継代した。

これらの実験に先立って、ＣｕｔＢ１．２細胞は、多能性マーカーのＯｃｔ４／Ｎａｎｏｇ／Ｓｏｘ２／ＴＲＡ−１−６０／ＴＲＡ−１−８１を発現し、ウイルス性の導入遺伝子の発現を欠くことが示され、細胞の多能性は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方における分化の調査によって確認した。

ラミニン−５２１および他のコーティング材料
ＢｉｏＬａｍｉｎａ、ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ（ｗｗｗ．ｂｉｏｌａｍｉｎａ．ｃｏｍ）から入手可能なヒト組換えＬＮ−５２１は、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３）において産生され、本質的に以前に記載されるように、完全長ラミニンγ１、β２、およびα５構築物により逐次的にトランスフェクトした。タンパク質産生のために、ＨＥＫ２９３細胞は、６日間まで、ＧｌｕｔａＭａｘ Ｉを補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。ＬＮ−５２１分子は、抗ＦＬＡＧマトリックス（Ｓｉｇｍａ）を使用してアフィニティー精製し、その後、還元および非還元条件下で３〜８％および４〜１５％の勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して特徴付けた。タンパク質は、ポリビニリデンジフルオリド膜上の鎖の、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）タンパク質染色および免疫染色を使用して可視化した。タンパク質をさらに特徴付けるために、ラミニンα５、β２、およびγ１鎖に対する抗体を用いるウエスタンブロット解析を実行した。ヒト組換えラミニン−１１１およびラミニン−１２１は、ＬＮ−５２１と同様に産生され、ウエスタンおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって予測分子サイズの正確な鎖を含有することが示された。その他に指定されない限り、対応するマウスラミニン−１１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ＬＮ−１１１として示された。

試薬および抗体
ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎＴＭ ＬＹ ２９４００２（特異的Ａｋｔ阻害剤）、ＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎＴＭ ウォルトマニン（特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤）、およびＩｎＳｏｌｕｔｉｏｎＴＭ ９８０５９（特異的ＭＥＫ１／Ｅｒｋ阻害剤）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ホスホＡｋｔ（＃４０６０）、全Ａｋｔ（＃９２７２）、ホスホＥｒｋ（＃９１０１）、および全Ｅｒｋ（＃９１０２）に対する抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た。ＰａｔｈＳｃａｎ ホスホＡｋｔ１サンドイッチＥＬＩＳＡキット（＃７１６０）、ＰａｔｈＳｃａｎ 全Ａｋｔ１サンドイッチＥＬＩＳＡキット（＃７１７０）、ＰａｔｈＳｃａｎ ホスホＡｋｔ２サンドイッチＥＬＩＳＡキット（＃７０４８）、およびＰａｔｈＳｃａｎ 全Ａｋｔ２サンドイッチＥＬＩＳＡキット（＃７０４６）もＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。カルネキシン（＃ａｂ１０２８６）に対する抗体は、Ａｂｃａｍから得た。様々なインテグリンサブユニットに対する機能遮断抗体、マウスアイソタイプ抗体およびα−ジストログリカンは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。αＶに対する機能遮断抗体（ＭＡＢ１９８０）およびα６に対する機能遮断抗体（ＭＡＢ１３７８）は、アジ化ナトリウムを有する溶液中で提供されたので、生存実験における阻害の前に、アルファインテグリンサブユニットに対する抗体はすべて、毎回、２時間、Ｏ３培地に対して３回透析した。Ｌｕｔｈｅｒａｎ受容体およびα−フェトプロテインに対する抗体ならびにラットアイソタイプ対照抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから得た。Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４、平滑筋アクチン、およびＭＡＰ−２に対する抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。

免疫蛍光検査
免疫蛍光検査による調査のために、ＥＳ細胞は、培養し、４％パラホルムアルデヒドによって、８ウェルスライドチャンバー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または９６ウェルプレートウェルにおいて固定し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘによって透過処理し、１時間、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ）を含有するリン酸塩−食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によってブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションは、室温で１．５時間実行した。二次抗体および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とのインキュベーションは、４０分間実行した。インキュベーションの間、被検物は、ＰＢＳ緩衝液中０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０により３〜５回洗浄した。被検物は、蛍光封入剤（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄａｋｏ．ｃｏｍ）中に保持し、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ、Ｈｅｅｒｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｅｉｃａ．ｃｏｍ）下で観察した。

様々なｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲによる定量化
全ＲＮＡは、製造業者の指示に従って、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ、ｗｗｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）を使用して単離した。ｃＤＮＡは、製造業者の指示に従って、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８プライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含有する２０μｌ反応混合物中の０．２μｇの全ＲＮＡを使用して合成した。リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ Ｔａｑｍａｎアッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して実行した。反応はすべて、対象のｍＲＮＡについてのプライマーおよびプローブを含有する以前に開発された遺伝子発現アッセイミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して４連で行った。各実験についての追加の反応は、ＲＮＡインプットを標準化するためのＧＡＰＤＨについての以前に開発された遺伝子発現アッセイミックスを含んだ。データはすべて、７３００ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．４により分析した。

ＦＡＣＳ分析
細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡにより培養ディッシュから取り出し、単細胞懸濁物へと解離させ、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液（ハンクス緩衝液中２％ウシ胎仔血清、０．１％アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄ））中に再懸濁させた。ＳＳＥＡ−４に対する一次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍからの）とのインキュベーションは、氷上で１時間実行した。その後、細胞は、氷冷ＦＡＣＳ緩衝液により３回洗浄した。続いて、細胞は、暗所中、３０分間、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ抗マウス二次抗体（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の１：４００希釈物により、ＦＡＣＳ緩衝液中でプローブし、４回洗浄した。対照細胞は、マウス免疫グロブリン、続いて上記に記載される二次抗体と共にインキュベートした。細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。データは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｓａｎ， Ｊｏｓｅ， ＣＡ）により分析した。

核型分析
細胞系の核型分析は、標準的なＱバンド技術を使用して実行した。細胞の試料は、４時間まで、コルセミドＫａｒｙｏＭＡＸ（０．１μｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により処理し、その後、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（Ｇｉｂｃｏ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により解離させた。細胞は、遠心分離を介してペレットにし、あらかじめ温めた０．０３７５Ｍ ＫＣｌ低張溶液中に再懸濁し、１０分間インキュベートした。遠心分離の後に、細胞は、固定液（３：１メタノール：酢酸）中に再懸濁した。分裂中期スプレッド（ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｓｐｒｅａｄ）は、ガラス製顕微鏡用スライドグラス上で調製し、トリプシンに対する短時間の曝露によってＧバンド染色し、４：１ Ｇｕｒｒ／Ｌｅｉｓｈｍａｎｎ染色（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．）により染色した。最低１０個の分裂中期スプレッドを分析し、さらに２０個を集計した。

奇形腫形成
奇形腫形成実験は、若い（７週齢）重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの睾丸被膜下におよそ１０^６細胞を移植することによって実行した。各細胞系当たり３匹の動物を使用した。奇形腫成長は、毎週の触診によって観察し、マウスは、移植の８週間後に犠牲にした。奇形腫は、固定し、切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）によりまたはヘマトキシリン、エオシン、およびＰＡＳ（ＨＥ−ＰＡＳ）により染色した。３つの胎児性生殖系列層すべての組織構成成分の存在が、染色した切片から分析されるように実証された。動物実験はすべて、倫理委員会の承認に従って、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの感染のない動物施設で実行した。

胚様体形成
ＬＮ−５２１をコーティングした細胞培養ディッシュからのＥＳ細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２で１分間、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔに曝露し、培地により２回洗浄し、多くの小片へとばらばらにし、低接着プレート中で懸濁培養した。これに使用した培地は、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、および１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を補充したノックアウトＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とした。懸濁物で１〜２週間経った後、胚様体は、ゼラチンをコーティングした組織細胞培養９６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移し、１〜２週間培養し、その後、固定し、３つの胎児性生殖系列層すべてのマーカー（平滑筋アクチン、ＭＡＰ−２、およびα−フェトプロテイン）に対する抗体により染色し、免疫蛍光検査について上記に記載されるように分析した。

細胞接着アッセイ
手短に言えば、９６ウェルプレートは、上記に記載されるように細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するＯ３培地によってブロッキングした。ＥＳ細胞は、細胞外マトリックスでコーティングしたプレート上に５０，０００細胞／ｃｍ^２の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーター中で１時間接着させた。その後、プレートは、非接着細胞を除去するために培地により３回洗浄し、その後、接着細胞は、５％グルタルアルデヒドによって２０分間固定し、０．１％クリスタルバイオレットによって染色した（Ｋｅｂｏ Ｌａｂ、Ｓｐａｎｇａ、Ｓｗｅｄｅｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｂｏｌａｂ．ｓｅ）。水による１時間および３回の洗浄後に、クリスタルバイオレットは、１０％酢酸により抽出し、５７０ｎｍでの光学濃度を測定することによって定量化した。実験はすべて、４連で実行した。

生存アッセイにおける細胞生存および阻害
細胞を２４時間、細胞インキュベーター中に置いておいた以外は、上記の細胞接着アッセイについて記載されるように、生存アッセイを実行した。生存アッセイにおける阻害については、製造業者によって推奨される濃度の機能遮断抗体またはテキストに示される濃度の経路阻害剤と共に、細胞を、３０分間、培地中に保ち、その後、コーティングしたディッシュ上に蒔いた。実験はすべて、４連で実行した。

ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ
ＨＳ １８１細胞は、上記に記載されるように、単細胞懸濁物へとトリプシン処理した。阻害実験については、細胞は、３０分間、遮断抗体または経路阻害剤と共にＯ３培地中に保ち、その後、４５０Ｋの細胞は、適切なマトリックスコーティングによりあらかじめコーティングした３５ｍｍディッシュ上に蒔いた。他の実験については、同数の細胞を、トリプシン処理後に直接蒔いた。すべての場合において、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間、細胞を拡散させた。氷冷ＰＢＳでの２回の洗浄の後に、細胞を有するプレートは、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡのための試料を調製するために、プレートは、ゆっくり解凍し、上に１００〜１５０μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％デオキシコレート、０．５％ ＳＤＳ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ Ｉｇｅｐａｌ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、およびＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔｏｐ（商標）（Ｒｏｃｈｅ））を乗せて、氷上で保った。その後、細胞は、こすり取り、ピペットで移し、２７Ｇ ３／４”針により煎断した。その後、細胞ペレットは、４℃で１５分間、１６，１００ ｒｃｆで遠心分離することによって澄明にした。ウエスタンブロットについては、４〜１２％勾配ゲルをＳＤＳ電気泳動に使用し、タンパク質はＰＶＤＦ膜に移した。膜は、製造業者の指示に従って対象の抗体とハイブリダイズさせた。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの化学発光ＨＲＰ基質を視覚化に使用した。デンシトメトリー分析については、フィルムは、２，４００ｄｐｉでスキャンし、ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ５５００プログラム（１Ｄ−Ｍｕｌｔｉ Ｌｉｎｅデンシトメトリーモード）によって分析した。ＥＬＩＳＡについては、試料は、製造業者の指示に従ってウェルに適用した。

ｉｎ ｖｉｖｏ画像処理および遊走アッセイ
２４ウェルプレートは、細胞外マトリックスタンパク質によってコーティングし、ウシ血清アルブミンを含有するＯ３培地によってブロッキングした。ＥＳ細胞は、細胞外マトリックスでコーティングしたプレート上に３０，０００〜４０，０００細胞／ｃｍ^２の細胞密度で蒔き、細胞インキュベーター中で３０分間接着させた。その後、プレートは、３７℃、５％ＣＯ_２に保つのを可能にする環境制御ユニットを装備したハイコンテントイメージングシステムＯｐｅｒｅｔｔａ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の中に移した。作製した２つの動画について、Ｈａｒｍｏｎｙソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、蒔いた後２４時間の間に、１５分間に１回、明視野画像を撮り、エクスポートし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、ＵＳ）を使用して分析した。遊走アッセイについては、蒔いた後１８時間の間に７分ごとに画像を撮った。蒔いた後５〜７時間目に得られる画像は、ＭＴｒａｃｋＪプラグイン（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して分析した。各コーティング上の１００の付着細胞を、追跡し、現在の位置から以前の位置までの進路の平均距離を計算した。誤差のバーは、平均値の標準誤差、ｓ．ｅ．ｍ．を示す（ｎ＝１００）。

統計 統計的有意性は、不等分散について、スチューデントの両側ｔ検定によって決定した。

実施例２の結果についての議論
多能性ｈＥＳ細胞は、α１、α５、β１、β２、およびγ１ラミニン鎖を発現する。単様々なコーティング基層に蒔いた細胞懸濁物由来のｈＥＳ細胞の接着およびクローン性生存を比較するために、ＬＮ−５１１上で単層としてまたはフィーダー層上でクラスターとして成長しているｈＥＳ細胞を、Ｏ３培地中で単細胞懸濁物へとトリプシン処理し、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）の非存在下または存在下において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、ＬＮ−５２１、またはＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１の混合物でコーティングした細胞培養ディッシュ上に蒔き、２４時間後に分析した。

細胞は、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＬＮ−１１１上で生存しなかったが、それらは、ヒト組換えＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１ならびに上記２つの混合物上で単細胞として生存した。しかしながら、ＬＮ−５２１上の細胞の生存は、ＬＮ−５１１よりも（下記のように数で比較して）有意に高かった。ヒト組換えＬＮ−１１１またはＬＮ−１２１上に蒔いた細胞は、２４時間後に生存せず（データ示さず）、これは、ラミニン三量体中のβ２鎖の存在が、そのため、効果を支持するのに十分ではないことを実証する。ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ−２７６３２の存在下において、ｈＥＳ細胞は、すべての表面上で生存した。

しかしながら、蒔いてから２４時間後に、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下または存在下においてＬＮ−５２１上で成長する細胞の間で細胞形状に関して明確な差異があった。ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下において、蒔いてから２４時間後に、ＬＮ−５２１上で成長している細胞は、円形であったが、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下において成長している細胞は、アクチン細胞骨格の再配列によっておそらく引き起こされた、紡錘体または三日月形様の形状をとっていた。

ヒト多能性細胞の長期の自己再生のための細胞コーティング材料としてＬＮ−５２１を使用することができるかどうかを試験するために、ＨＳ１８１細胞、ＨＳ４０１細胞、Ｈ１細胞、ならびにヒトｉＰＳ ＣｈｉＰＳＷ細胞およびＣｕｔＢ１．２細胞を、Ｏ３培地、ｍＴｅＳＲ１培地、またはＴｅＳＲ２培地中の上記タンパク質上で培養した。Ｏ３培地またはＴｅＳＲ１培地において成長している細胞は、１０〜１４日間ごとに、単細胞浮懸濁物の状態で１：２０〜１：３０の比で通過させた。多能性ｈＥＳ細胞は、小さな凝集塊の状態で通過させた場合に、ＬＮ−５１１またはＭａｔｒｉｇｅｌ上で成長させた細胞と同様のまたはそれよりも速い、安定した速度で増殖した。したがって、ＬＮ−５２１上での１回の継代は、凝集塊の状態で２回通過させた対照細胞のそれと同数のまたはそれよりも多数の細胞分裂をもたらした。ＨＳ１８１細胞、ＨＳ４０１細胞、およびＨ１細胞は、Ｏ３培地において、それぞれ少なくとも２４、５、および１５回の継代（９、２、および６か月間）の間に増殖した。ＣｕｔＢ１．２ ｉＰＳ細胞およびＣｈｉＰＳＷ細胞は、それぞれ、ｍＴｅＳＲ１中で５および３回の継代にわたって培養した。興味深いことには、解離させたｈＥＳ細胞は、ＴｅＳＲ２培地およびＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ酵素を使用して、完全に特定されかつ異種由来成分不含条件下で、ＬＮ−５２１上で培養することができた。継代後の播種の有効性は、Ｏ３培地またはｍＴｅＳＲ１培地中の細胞のそれよりもわずかに低く、解離させた細胞は、通常１０〜１４日間ごとに１：１５〜１：２０比で通過させた。Ｈ１細胞およびＨＳ４０１細胞は、ＴｅＳＲ２において、それぞれ１２および４回の継代にわたって（５および１．５か月間）培養した。

ｈＥＳ細胞は、通常、ＬＮ−５２１でコーティングした培養ディッシュの１ｃｍ^２当たり３０，０００細胞の単細胞懸濁物で蒔き、この後、個々の細胞は、互いにあらゆる直接的な接触を欠いた。蒔いてから８時間後に、ｈＥＳ細胞は、多能性マーカーのＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳｏｘ２を発現する単細胞として観察することができた。蒔いてから２４時間後に、細胞は、ウェルの大部分を覆う単層の大きな島へと最終的に組み合わせられる、小さな単層コロニーを形成した。

ＬＮ−５２１上で成長させた細胞は、多能性マーカーのＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、およびＳＳＥＡ４の安定した発現レベルを示し、これは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に蒔き、小さな凝集塊として通過させた細胞におけるそれと同様であった。ＬＮ−５２１培養物およびＭａｔｒｉｇｅｌ培養物における自発的な分化のレベルを比較するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ培養物およびＬＮ−５２１培養物において発現された分化マーカーのＰＡＸ６、ＳＯＸ１７、およびＳＯＸ７についてのｍＲＮＡの量を、１回（１０日間）および１０回の継代（４か月間）後に比較した。定量的ＲＴ−ＰＣＲは、継代数に非依存的に、ＬＮ−５２１培養物における分化の３つのマーカーすべてについて、同様のまたはより少ないレベルの発現を明らかにした。

核型は、Ｏ３培地において、ＬＮ−５２１上で、それぞれ１２および１０回の継代後の、ｈＥＳ細胞系であるＨＳ１８１およびＨ１について、ならびにＴｅＳＲ２培地において７回の継代後のＨ１について正常であることを確認した。Ｏ３培地において、ＬＮ−５２１上で、それぞれ１３および１２回の継代にわたって培養したＨＳ１８１およびＨ１細胞、ならびにＴｅＳＲ２においてＬＮ−５２１上で７回の継代にわたって培養したＨ１細胞の注射後にＳＣＩＤマウスにおいて形成された奇形腫の組織学的検査は、ヒト胚の３つの胚系列をすべて含有する組織の発生を明らかにした。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける分化も明らかにした。３つの場合すべてにおける細胞が、中胚葉（平滑筋アクチン）、外胚葉（ＭＡＰ−２）、および内胚葉（α−フェトプロテイン）のマーカーを発現する胚様体を形成する完全性を保持した。

コーティング基層の有効性を定量化するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、ＬＮ−５２１、ならびにＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１の同じ割合の混合物上の解離ｈＥＳ細胞の１時間後の接着および２４時間後の生存について研究した。興味深いことには、１時間後に、ほぼ同じ７５〜８０％の細胞が、すべてのコーティングに接着したが、細胞の拡散は、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＬＮ−１１１上よりもＬＮ−５２１およびＬＮ−５１１上で明らかによかった（示さず）。２４時間後、細胞が、ＭａｔｒｉｇｅｌまたはＬＮ−１１１上でほとんど生存しておらず、またＬＮ−５１１上では極めて僅か生存した。対照的に、ＬＮ−５２１上のｈＥＳ細胞の生存は、Ｍａｔｒｉｇｅｌのおよそ２０倍高く、ＬＮ−５１１の３倍高かった。

ＬＮ−５２１およびＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）の効果を定性的に比較するために、本発明者らは、１０μＭのＹ−２７６３２を含有する培地において同じ播種密度（１ｃｍ^２当たり４０，０００細胞）で同じ単細胞懸濁物由来の細胞を蒔き、様々なコーティング上でのそれらの生存を研究した。ＬＮ−５２１上の未処理細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌ上のＹ−２７６３２処理細胞は、蒔いてから２４時間後に同様の生存率を示した。興味深いことには、さらに、Ｙ−２７６３２処理ヒトＥＳ細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上でよりもＬＮ−５２１上でよりよく生存した。

外因性ｂＦＧＦをＯ３培地から除去した場合、細胞は、なお、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上でよりもＬＮ−５２１上で２０倍高い生存を示した。さらに、ｈＥＳ細胞は、ＴｅＳＲ１剤の成長因子のすべて（ｂＦＧＦ、ＬｉＣｌ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ピペコリン酸、およびＴＧＦβ）^１６を欠く培地においてでさえ、蒔いてから２４時間後にＬＮ−５２１上で生存し、このことは、生存メカニズムが、それらの因子によって誘導されるシグナル伝達に非依存性であることを示唆する。

形質膜上の、ＬＮ−５２１の潜在的受容体に対する機能遮断抗体を使用する、細胞生存の阻害についてのアッセイは、インテグリンα６に対する抗体および程度がわずかにより低いが、β１に対する抗体が、ＬＮ−５２１上でのヒトＥＳ細胞の生存を阻害することを示した。他の試験したインテグリンサブユニットならびにＬｕｔｈｅｒａｎ受容体およびα−ジストログリカンに対する機能遮断抗体は、ＬＮ−５２１上のヒトＥＳ細胞生存に対する効果を、たとえあったとしてもほとんど示さなかった。

最近、ＲＯＣＫ阻害剤およびブレビスタチンが、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）のリン酸化によって媒介されるアクチン−ミオシン収縮性の抑止により作用することが示された。ＬＮ−５２１が同様の活性を有するかどうかを試験するために、リン酸化ＭＬＣのレベルを、蒔いてから１時間および６時間後の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１上の解離細胞間で比較した（図１２および図１３）。興味深いことには、ウエスタンブロットは、ＭＬＣのリン酸化が、ＭａｔｒｉｇｅｌおよびＬＮ−１１１上の細胞におけるそれよりもＬＮ−５１１およびＬＮ−５２１上の細胞においてさらに高度いことを示した。アクチン−ミオシン再配列が、収縮だけでなく細胞の運動性にとっても不可欠であるので、本発明者らは、細胞遊走が、ＬＮ−５２１とそのインテグリン受容体α６β１との間の相互作用によって引き起こされ得ると推測した。ＭａｔｒｉｇｅｌおよびＬＮ−５２１上の細胞のｉｎ ｖｉｖｏにおける画像処理は、細胞が、後者においてはるかに迅速に遊走し、小さな、動きの速いコロニーへの凝集によって生存したことを明らかにした。４つのコーティング上のｈＥＳ細胞の遊走も、細胞がなおすべての場合において付着しているときの、蒔いてから５および７時間目の間でも比較した（図１４）。ＬＮ−５２１上のｈＥＳ細胞の運動性は、他のコーティング上の細胞のそれよりも高く、それらの上で生存する能力と相関した。インテグリンβ１に対する機能遮断抗体による処理は、ＬＮ−５２１上の細胞の運動性（図１５）および接着（データ示さず）を有意に低下させた。

広範囲なデータにより、インテグリンによるＭＥＫ１／ＥｒｋまたはＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路の活性化が、アノイキスを遮断することができることを示した。それぞれＡｋｔおよびＭＥＫ１の特異的阻害剤であるＬＹ ２９４００２およびＰＤ ９８０５９の効果は、ＬＮ−５２１上のｈＥＳ細胞生存におけるこれらの経路の潜在的な役割を調査するために検査した。ＬＹ ２９４００２によるＡｋｔ活性化の遮断は、脱離およびｈＥＳ細胞死を促進することが分かり、ＬＮ−５２１上に蒔いてから２４時間後に生存した細胞はなかった（図１６）。対照的に、ＰＤ ９８０５９による処理は、生存にそれほど激しく影響を及ぼさなかった。他のＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ特異的阻害剤、ウォルトマニンにより処理したｈＥＳ細胞もＬＮ−５２１上に蒔いてから２４時間後に生存せず、このことから、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔの活性化が、ＬＮ−５２１上の細胞生存に必要であることが確認された。

ｂＦＧＦがＭＥＫ１／Ｅｒｋ経路の有力な活性化因子であることが公知であり、その影響は、ＰＤ ９８０５９によって完全に阻害することはできないので、本発明者らは、外因性ｂＦＧＦなしのＯ３培地において、同様の実験を実行し、同様の結果を得た（図１７）。ＬＹ ２９４００２およびＰＤ ９８０５９処理の有効性は、ＬＮ−５２１上に蒔いてから１時間後に収集した処理細胞および対照細胞のウエスタンブロット分析によって確認した（図１８および図１９）。

ホスホ−Ａｋｔに対する抗体による、ＭａｔｒｉｇｅｌおよびＬＮ−５２１上で成長する細胞の抽出物のウエスタンブロット解析は、両方の場合においてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路が活性であったことを示した（データ示さず）。異なるコーティング上の細胞におけるＡｋｔ活性化のレベルを決定するために、ＥＬＩＳＡを、細胞がまだ互いに直接接触していないときに、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、ＬＮ−１１１、ＬＮ−５１１、およびＬＮ−５２１上に蒔いてから１時間後に収集した細胞溶解産物で実行した（図２０および図２１）。異なるコーティング上の細胞におけるＡｋｔ２リン酸化のレベルは、それらのコーティング上での生存性と相関した。

α６およびβ１インテグリンが、それぞれ、アルファサブユニットおよびベータサブユニットの中で、ヒトＥＳ細胞において最も豊富に発現されるインテグリンアイソフォームであることが実証された。インテグリンα６β１は、様々なラミニンに対して広範囲の特異性を示すが、ＬＮ−５２１またはＬＮ−５１１に対する結合親和性は、ＬＮ−１１１に対する結合親和性よりも高い。最近、β２ラミニンがβ１ラミニンよりもインテグリンに対するより高い親和性を有することが確立された。インテグリンに対して最も高い親和性を有するので、ＬＮ−５２１は、遊走に対して最良の足場をもたらすことができ、α６β１インテグリンを介して最大量のシグナルを伝達することができ、その結果、解離した多能性ｈＥＳ細胞の最良の生存性をもたらすことができるが、たとえばＬＮ−５１１も程度がより低いが、最良の生存性をもたらすことができる。

この研究の結果は、一般に、多能性ヒト幹細胞の培養および増殖を促進し得、さらに、臨床的適用を目的とする細胞を含むそのような細胞の自動化された増殖を可能にする。ＬＮ−５２１上の解離したｈＥＳ細胞の生存は、遊走に依存性であるようであり、そのため、細胞は、超低密度での播種後に生存することができない。ここで記載される新しいｈＥＳ細胞培養方法は、ＲＯＣＫ阻害剤またはブレビスタチン処理がするように細胞骨格を損傷しない、天然に存在するＬＮ−５２１接着タンパク質のみを利用する。したがって、ＬＮ−５２１は、おそらく、細胞表面上の正確なインテグリンプロファイルによってのみ細胞の生存に有利に働く。これらの結果は、１ｃｍ^２当たり２０，０００〜３０，０００細胞の比較的低密度でＬＮ−５２１上に蒔いたｈＥＳ細胞が、生存することができ、他のｈＥＳ培養物系における増殖と少なくとも同じように効率的に増殖することができることも示した。新しい方法は、標準的な細胞培養手順、たとえば線維芽細胞の培養に密に類似しており、そのため、ＬＮ−５２１上のｈＥＳ細胞培養は、特別に訓練された人材を必要としない。ｈＥＳ細胞を培養することが技術的な難題であったので、特別に訓練された人材は、以前の主要な問題であった。

ヒト多能性幹細胞の自己再生のための、広く使用されるＴｅＳＲ１剤は、Ｍａｔｒｉｇｅｌとの使用のために最初に開発され、それは、ほとんどＭＥＫ１／Ｅｒｋ経路を標的にする、多能性ｈＥＳ細胞に対し有益な効果を有するとは広くは考えられていない、高用量のｂＦＧＦを含有する。本発明の結果は、コーティング材料としてのＬＮ−５２１の利点を利用する、詳細には、ヒトＥＳ細胞の自己再生にとって重要である経路を標的にする、新しい培地剤の開発につながることができる。

要約すれば、本発明の研究は、多能性ｈＥＳによって通常分泌されるＬＮ−５２１が、ＬＮ−５１１と同様に、培養におけるヒト多能性幹細胞の自己再生を、単独のコーティング材料として支持することができることを実証した。両方のラミニンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて均質の単層として細胞の成長を促進した。しかしながら、上記２つのラミニンの間の重要な差異は、Ｍａｔｒｉｇｅｌまたはフィーダー細胞上で成長させたｈＥＳ／ｉＰＳ細胞の増殖のために現在必要とされるような、細胞クラスターの手作業による分割とは対照的に、ｈＥＳ／ｈｉＰＳ細胞を単細胞懸濁物へとトリプシン処理し、蒔いて、ＬＮ−５２１上で単細胞から有効に増殖させることができたということである。この研究の結果は、多能性ヒト幹細胞の培養を促進し、そのような細胞の自動化された増殖を促進し得る。

（実施例３）
ヒト胚性幹細胞を、２つの異なる細胞培養培地においてラミニン−５２１基質上で培養した。２つの細胞培養培地は、ｂＦＧＦの量、３．９ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌが異なった。

図２２は、５回の継代（４０日間）後にラミニン−５２１基質と共に、３．９ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＯ３培地中で培養したＨＳ１８１ ｈＥＳ細胞の成長曲線を黒い実線で示す。Ｏ３培地は、唯一の動物由来構成成分としてウシ血清アルブミンを有する、市販の化学的に特定されているｍＴｅＳＲ１培地の変形であった。ラミニン−５２１基質と共に、１００ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含むＯ３培地中で培養したＨＳ１８１ ｈＥＳ細胞の成長曲線は、破線で示す。細胞は、継代のために単細胞懸濁物へと解離させた。ここで見出されるように、より低量のｂＦＧＦについての成長曲線は、より高量のｂＦＧＦと同様であったまたはそれよりも良好であった。

図２３は、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を使用して得られた、両方の培地についての、５回の継代（４０日間）後の多能性マーカーであるＯｃｔ４およびＮａｎｏｇについてのｍＲＮＡの転写物の相対量を示す。さらに、同様の量が、両方の細胞培養培地において得られ、このことから、より低量のｂＦＧＦにおける幹細胞が多能性を維持したことが示された。したがって、より低量のｂＦＧＦは、使用することができ、そして、なお、特にラミニン−５２１基質と組み合わせて、好結果を得ることができる。

（実施例４）
実施例１および２において、解離した幹細胞は、ＬＮ−５２１上での活性な運動性および小さな、有効に成長し、遊走する単層の、島へと会合することを介してほとんど生存した。非常に低いクローニング密度で蒔いた細胞は、プログラム細胞死の特殊な形態であるアノイキスにより死滅した。通常、細胞外マトリックス分子、たとえばラミニンからのインテグリン関連性のシグナル伝達およびカドヘリン関連性の細胞間シグナル伝達は、アノイキスを予防することができる。ヒトＥＳ細胞表面上の最も豊富なカドヘリンアイソフォームは、上皮カドヘリン（Ｅ−カドヘリン）である。実施例３における実験は、ＬＮ−５２１およびＥ−カドヘリンの組み合わせが、アノイキスからヒトＥＳ細胞を保護することができ、細胞のクローン性生存を可能にすることができるかどうかを調べるために実行した。

ｈＥＳ細胞は、１ｃｍ^２当たり２５０細胞の密度で様々なコーティング上のｍＴｅＳＲ１培地に蒔き、アルカリホスファターゼ染色キットを使用して、培養の５日後にモニターした。ラミニン−５２１のみもＥ−カドヘリンのみも、個々に区別されたｈＥＳ細胞の効率的なクローン性生存を可能にしなかった。

次に、ラミニン−５２１およびＥ−カドヘリンの組み合わせは、組み合わせにより細胞のクローン性生存を保持することができるかどうかを決定するために試験した。固定量のラミニン−５２１を、滴定したＥ−カドヘリンと組み合わせて、細胞培養ディッシュのコーティングに使用した。細胞のクローン性生存は、約１：１０ｗ／ｗ〜約１：５ｗ／ｗを含む、ラミニン−５２１に対するＥ−カドヘリンの様々な比で達成された。

ｍＴｅＳＲ１培地に対する様々な改変の効果を試験するために追加の試験を実行した。約１：１０ｗ／ｗの比の、ラミニン−５２１に対するＥ−カドヘリンの混合物を、プレートをコーティングするために使用した。予想外に、アルブミン濃度における２×の増加が、ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス上でのｈＥＳ細胞のクローン性生存を著しく改善したことが発見された。これらの条件下での、個々に区別されたｈＥＳ細胞生存の率は、１０〜１５％であり、ｍＴｅＳＲ１培地およびアルブミンをさらに有するｍＴｅＳＲ１培地の両方において、Ｍａｔｒｉｇｅｌのみの上、ラミニン−５２１のみの上、またはＥ−カドヘリンのみの上の細胞のそれよりも少なくとも１桁高かった。細胞の経時的写真法により、ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンコーティングが、様々な細胞の凝集を介してではなく単細胞の増殖を介して細胞生存を促進したことを確認した。ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンは、同様に、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）を追加した、十分に化学的に特定され、かつ異種由来成分不含ＴｅＳＲ２培地において細胞のクローン性生存を保持した。

追加の試験で、ｈＥＳ細胞系が誘導された。２４ウェル組織細胞培養ディッシュプレートを、ダルベッコリン酸塩緩衝食塩水により２回洗浄した。次に、ディッシュプレートは、ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックスを生成するための、４８μＬの１００μｇ／ｍｌラミニン−５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ ＡＢ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）、６μＬの８２μｇ／ｍｌ Ｅ−カドヘリン（Ｒ＠ＤＳｙｓｔｅｍｓ）、ならびにカルシウムおよびマグネシウムを有する３００μＬのＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ）を含有する無菌溶液により３７℃で２時間コーティングした。

ｈＥＳ細胞系を誘導するために使用した寄贈の胚は、両者のパートナーの同意および倫理の承認が得られた後に、公認のインビトロ受精クリニックから得た。不妊治療に使用することができない新鮮なまたは冷凍の胚のみを誘導手順に使用した。１つまたは２つの細胞は、この目的のために設計されたレーザー装置により透明帯に小さな穴を作製した後にマイクロピペットを使用して８細胞段階の胚から単離した。この手順は、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）において臨床的使用するために公認されている。細胞は、ｒＨＳＡをさらに有するＴｅＳＲ２培地中のラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス上に配置した。細胞は、付着に成功し、増殖し始めた。親の胚を、胚盤胞段階まで成長させ、凍結した。胚の培養は、３７℃および５％ Ｏ_２／１０％ ＣＯ_２で、オイル下の液滴中の異種由来成分不含標準化インビトロ受精培養培地を使用して実行した。透明帯の除去後に、５つのヒト胚盤胞の内部細胞塊を、機械的に単離し、４ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）中のラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス上に蒔いた。培養の最初の４８時間後に、培養培地は、一日単位で交換した。１０〜１４日後に、増殖物を機械的に単離し、ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス上に再播種した。機械的な継代を、続く２〜３回の継代にわたって使用し、その後、コロニーを、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（ＧＩＢＣＯ）を使用して継代した。

ウシアルブミンをさらに含むｍＴｅＳＲ１培地と共に、上記に記載されるラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックスを使用すると、３つの新しいｈＥＳ細胞系が、６つの培養胚盤胞から誘導された。蒔いてから４日後に、内部細胞塊は、幹細胞様の増殖物を生じた。図２４は、ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス上での新しいヒト胚性幹ＨＳ８４１細胞系の早期の誘導を示す。内部細胞塊の機械的な単離およびラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス上に蒔いてから４日後に、１日に６つの胚盤胞の内部細胞塊から成長する、形態学的に典型的なヒト胚性幹細胞を示す。

予想外に、細胞培養系および方法は、６つの胚のうち３つの胚（５０％）において安定したｈＥＳ細胞系を生じ、誘導率は、標準的な方法のそれよりも高かった。

ラミニン−５２１／Ｅ−カドヘリンマトリックス、およびｒＨＳＡをさらに有する、十分に化学的に特定されかつ異種由来成分不含環境を有するＴｅＳＲ２培地の使用は、新しいｈＥＳ細胞系の誘導において同様の結果をもたらした。

上記に開示されるものの変形物ならびに他の特徴および機能またはその代替物は、他の多くの様々な系または適用に組み合わせられてもよいことが十分に理解される。様々な現在予知されていないまたは予期されていない代替物、改変、変更、または改善は、続いて当業者によって成されてもよく、これらも以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

Claims (9)

1. 多能性幹細胞を維持するためのシステムであって、該システムは：
   ０．５ｎｇ／ｍｌ〜３．５ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む細胞培養培地；および
   該幹細胞に支持体を提供するための、ラミニン−５２１を含む基質
   を含み、該基質は、ラミニン−５１１を欠いている、システム。
2. 前記基質がカドヘリンも含む、請求項１に記載のシステム。
3. 前記細胞培養培地が、少なくとも１つのさらなる成長因子、少なくとも１つの微量ミネラルおよび少なくとも１つの脂質をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
4. 前記細胞培養培地が、少なくとも１つの微量ミネラルをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
5. 前記細胞培養培地が、少なくとも１つの脂質をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
6. 前記細胞培養培地が、少なくとも１つの無機塩、少なくとも１つの微量ミネラル、少なくとも１つのエネルギー基質、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのアミノ酸および少なくとも１つのビタミンをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
7. 前記細胞培養培地が、（１）アルブミン、（２）インスリンもしくはインスリン代替物、または（３）トランスフェリンもしくはトランスフェリン代替物のうちのいずれか１つを含まない、請求項１に記載のシステム。
8. 前記細胞培養培地が、アルブミン、インスリン、塩化リチウム、ＧＡＢＡ、ＴＧＦベータ１、ピペコリン酸、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液およびＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
9. 前記細胞培養培地が、少なくとも１つのさらなる成長因子、少なくとも１つの微量ミネラルおよび少なくとも１つの脂質をさらに含む、請求項１に記載のシステム。