MX2010010165A

MX2010010165A - Procedimientos quimicos y geneticos combinados para generacion de celulas madre pluripotentes inducidas.

Info

Publication number: MX2010010165A
Application number: MX2010010165A
Authority: MX
Inventors: Sheng Ding; Yan Shi; Caroline Desponts
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2008-03-17
Filing date: 2009-03-17
Publication date: 2010-11-25
Also published as: SG10201808863UA; HK1209457A1; CN104694570B; JP2018104473A; SG10202103401QA; US20110110899A1; JP2021143194A; JP2016185172A; US9394524B2; US20130273536A1; US20180002671A1; KR20100124335A; US20180171303A1; EP2279243B1; EP2279243A2; IL208144B; JP6899792B2; WO2009117439A3; HK1151559A1; CN102027105B

Abstract

La presente invención provee la identificación y uso de moléculas pequeñas para inducir pluripotencia en células mamíferas, también como otros métodos para inducir pluripotencia.

Description

PROCEDIMIENTOS QUIMICOS Y GENETICOS COMBINADOS PARA GENERACION DE CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células madre son clasificadas frecuentemente como totipotentes o pluripotentes . Una célula madre totípotente tiene potencial de diferenciación que es total: Da surgimiento a todos los tipos diferentes de células en el cuerpo. Una célula de huevo fertilizada es un ejemplo de una célula madre totipotente. Las . células madre pluripotentes pueden surgimiento a cualquier tipo de célula en el cuerpo derivada de las tres capas de célula germinal principales o un embrión mismo. Las células madre, pluripotentes, · tales como células madre embriónicas (ESC) , proliferan rápidamente en . tanto que mantienen la pluripotencia, es decir, la habilidad para diferenciarse a varios tipos de células. Las células madre embriónicas son fuentes donadoras promisorias para terapia de transplante de células. Sin embargo, las ESC humanas también están asociadas con cuestiones éticas con respecto al uso de embriones humanos y reacciones de rechazo después del transplante alogénico. Puede ser posible superar esas cuestiones al generar células madre pluripotentes directamente de las células somáticas de un paciente. Aquellos núcleos de células somáticas adquieren un estatus semejante a madre embriónica mediante fusión con ESC sugiere la existencia de factores "inductores de pluripotencia". Estudios previos han mostrado recientemente que la transfección moderada por retrovirus con cuatro factores de transcripción (Oct 3/4, Sox2, KLF4 and c-Myc) , que son altamente expresados en ESC, a fibroblastos de ratón ha dado como resultado la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS) . Véase Takahashi, K. & Yamanaka, S. .Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K. , Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-317 (2007); Wernig, M. et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448, 318-324 (2007); Maherali, N. et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution . Cell Stem Cell 1, 55-70 (2007); Meissner, ?. , Wernig, M. & Jaenisch, R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nature BiotechnoL 25, 1177-1181 (2007 ) ; Takahashi, K.. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human, somatic cells. Science 318, 1917-1920 (2007); Nakagawa, M. et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts Nature BiotechnoL 26, 101-106 (2007); Wernig, . , Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. c- Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008). iPS son similares ESCs en morfología, prolifereación y pluripotencia, juzgadas por formación de teratoma y contribución de quimeras. Un adelanto reciente de usar manipulación genética definida, esto es, tranducción viral de pocos genes alta y/o específicamente expresados en células madre embriónicas de ratón o humanas (ES), en reprogramación tanto de células somáticas de ratón y humanas para inducir células madres pluripotentes (iPS) ha abierto tremendas oportunidades para generar células madre específicas del paciente para varias aplicaciones (por ejemplo, terapia a base de células o descubrimiento de fármacos) sin las controversias asociadas con las células ES humanas convencionales, también como para estudiar el proceso de inversión epigenético. La aplicación de clínica final de un procedimiento de célula iPS requeriría extensamente métodos de diferenciación directa de células de PS humanas para generar poblaciones homogéneas de tipos de células linaje-específicas, también como eliminar riesgos asociados con la deficiencia de células de iPS actuales de manipulación genética y baja eficiencia/cinética lenta. Estudios recientes han demostrado que uno de los cuatro genes previamente requeridos, cMyc, es indispensable para sobreexpresión en la generación de células de iPS. Véase, See, Nakagawa, . et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts Nature BiotechnoL 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008). Sin embargo, la eficiencia de reprogramación fue sustancialmente reducida con también una cinética de reprogramación mucho más lenta en ausencia de cMyc.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La . presente invención provee métodos para selección en cuanto ¦ a agentes que inducen la reprogramación o desdiferenciación de células mamiferas a células madre pluripotentes. En algunas modalidades, el método comprende: a) introducir por lo menos uno, pero no todos, de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de yc y un polipéptido de Sox a células no pluripotentes para ' generar células transíectadas ; b) poner en contacto las células transfectadas con una biblioteca de diferentes agentes; c) seleccionar las células contactadas en cuanto a características de célula madre pluripotente y d) correlacionar el desarrollo de características de célula madre con un agente particular de la biblioteca, identificando mediante esto un agenté que estimula la desdiferenciación de células a células madre pluripotentes.

En algunas modalidades, la etapa a} comprende introducir uno o más cassettes de expresión para expresión de por lo- menos uno pero no todos de, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes . En algunas, modalidades, la etapa a) comprende introducir por lo menos uno pero no todos de un polipéptido de Oct exógeno, un polipéptido de Klf exógeno, un polipéptido de Myc exógeno y un polipéptido de Sox exógeno a las células no pluripotentes. En algunas modalidades, el agente particular es de entre 50-1500 daltons. En algunas modalidades, la etapa a) comprende introducir dos cassettes de expresión a las células, en donde cada cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica una proteina diferente, en donde la protéina es seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y 1 un un polipéptido de Sox y los miembros restantes del grupo no son introducidos a las células. En algunas modalidades, la etapa a) comprende introducir tres cassettes de expresión a las células, en donde cada cassette de expresión comprende un polipéptido que codifica una proteina diferente, en donde la protéina es seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox y el miembro restante del grupo no es introducido a las células . En algunas modalidades, las células son células humanas. En algunas modalidades, las células son células mamiferas no humanas. En algunas modalidades, las células no pluripotentes son células progenitores . En algunas modalidades, las progenitoras son células progenitoras neurales, células progenitoras de piel o células progenitoras de -folículo velloso. En algunas modalidades, el polipéptido de Oct es 0ct4, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es C-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. La presente invención también provee métodos para selección de células mamiferas con características de célula madre pluripotente . En algunas modalidades, el método comprende: a) poner en contacto las células con un inhibidor de MAPK/ERK quinasa (MEK) , de tal manera que el crecimiento de las células no pluripotentes es inhibido y se promueve el crecimiento de células madre pluripotentes y b) seleccionar las células contactadas en cuanto a características de células madre pluripotentes. En algunas modalidades, el método comprende: poner en contacto las células con una bibli.oteca de agentes antes de la etapa a) y en seguida de la etapa b) , seleccionar un agente que induce la célula madre pluripotente en base a los resultados de la etapa b) . En algunas modalidades, las células son células humanas. En algunas modalidades, las células son células de ratón, perro, vaca, puerco, rata y células primate no humanas. En algunas modalidades, el inhibidor de MEK es PD0325901. La presente invención también provee métodos para producir células madre pluripotentes inducidas a partir de células no pluripotentes mamiferas. En algunas modalidades, el método comprende: a) introducir uno o más de un polipéptidó Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de . Myc y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes; b) poner en contacto las células con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, produciendo mediante esto células madre pluripotentes inducidas. En algunas modalidades, la etapa a) comprende poner en contacto las células no pluripotentes con uno o más polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de Klf, un polipéptido Oct, un polipéptido Myc y un polipéptido de Sox. En algunas modalidades, la etapa a) comprende por lo menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) ciclos de: i) poner en contacto las células no pluripoterites con uno o más polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y un polipéptido Sox; ii) seguido por cultivo de las células en ausencia de los polipéptidos exógenos. En algunas modalidades, la etapa a) comprende introducir uno o más cassettes de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y un un polipéptido de Sox . a las células no pluripotentes . En algunas modalidades, . el método comprende además seleccionar las células contactadas en cuanto a características de célula madre pluripotente . En algunas modalidades, un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Oct y un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Sox son ¦ introducidos a las células no pluripotentes . En algunas modalidades, la etapa de introducción comprende introducir a las células no pluripotentes uno o más cassettes de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf y un polipéptido de Oct, en donde un cassette de expresión para un polipéptido de Myc y/o un polipéptido Sox no es introducido a la células.

En algunas modalidades, el polipéptido de Klf es Klf4 y el polipéptido de Oct es 0ct4. En algunas modalidades, las células no pluripotentes son células somáticas. En algunas modalidades, las células no pluripotentes son células de fibroblasto. En algunas modalidades, ni un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Myc ni un cassette expresión para la expresión de un polipéptido de Klf son introducidos a las células no pluripotentes . En algunas modalidades, la etapa de introducción es efectuada in vivo. En algunas modalidades, la etapa de introducción es efectuada in vitro. En algunas modalidades, el método comprende además: c) seleccionar células que exhiben características de célula madre pluripotente . En algunas modalidades, las células no pluripotentes son obtenidas de un animal y las células madre pluripotentes inducidas son diferenciadas a un tipo de célula deseado. En algunas modalidades, el tipo de célula deseado es introducido al animal. En algunas modalidades, el animal es un humano. En algunas modalidades, el animal es un animal no humano. En algunas modalidades, las células seleccionadas no comprenden un cassette de expresión exógeno para la expresión de Oct4. En algunas modalidades, el agente inhibe la metilación de H3K9. En algunas modalidades, el agente que inhibe la metilación de H3K9 es BIX01294. En algunas modalidades, las células son células humanas. En algunas modalidades las células son células de ratón. En algunas modalidades, las células no pluripotentes son células progenitoras . En algunas modalidades, las células progenitoras son células progenitoras neurales. En algunas modalidades, la etapa de introducción comprende introducir un primer vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un primer cassette de expresión, el primer cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica Klf4; un segundo vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un segundo cassette de expresión, el : segundo cassette de expresión comprende un polipéptido que codifica Sox2 y un tercer vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un tercer cassette de expresión, el tercer cassette de expresión comprende un polipéptido que codifica c-Myc . En algunas modalidades, los vectores son retrovirales, lentivirales, vectores adenovirales, plásmido no viral estándar o vectores de expresión episomales.

La presente invención también comprende una mezcla de células mamiferas y un agente que inhibe la metilación de H3 9 o promueve la desmetilación de H3K9, en donde las células expresan por lo menos uno o más de un polipéptido de p.ct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Sox y un polipéptido de Myc y/o están en contacto con por lo menos uno o más de un polipéptido de Oct exógeno, un polipéptido de Klf exógeno, un polipéptido de Sox exógeno y un polipéptido de Myc exógeno. En algunas modalidades, las células comprenden un primero, segundo y tercer cassette de expresión recombinante, el primer cassette de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Klf, el segundo cassette de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Sox y el tercer cassette de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Myc. En algunas modalidades, el agente inhibe la metilación de H3K9. En algunas modalidades, el agente que inhibe la metilación de H3K9 es BIX01294. ' En algunas modalidades, las células comprenden uno o más vectores retrovirales , lentivirales, adenovirales, plásmido no viral o vector de expresión episomal, el uno o más vector retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal que comprende el primero, segundo y tercer cassette de expresión. En algunas modalidades, la mezcla comprende un primero, segundo y tercer vector de expresión retr-oviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal, el primer vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal que comprende el primer cassette de expresión; el segundo vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal que comprende el segundo cassette de expresión y el tercer vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal que comprende el tercer cassette de expresión. En algunas modalidades, las células son células humanas. En algunas modalidades, las células son células de ratón. En algunas modalidades, las células comprenden células progenitoras . En algunas modalidades, las células progenitoras son células progenitoras neurales, células progenitoras de piel o células progenitoras de folículo velloso. En algunas modalidades, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido Sox es Sox2. La presente invención también provee una(s) célula (s) mamífera(s) que expresa (n) endógenamente por lo menos una de una proteína seleccionada del grupo que consite de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox, en donde: la célula no expresa endógenamente por lo menos una proteína del grupo, en donde la proteína no expresada endógenamente es expresada de ARN codificado por un cassette de expresión recombinante heterólogo presente en la célula, en donde la célula expresa endógena o heterologamente cada uno del polipéptido de Oct, el polipéptido de Klf, el polipéptido de Myc y el polipéptido de Sox y la expresión de la proteína del cassette de expresión heterólogo da como resultado la reprogramación o desdiferenciación de la célula de una célula no pluripotente a una célula madre pluripotente . En algunas modalidades, el polipéptido de Oct es 0ct4, el polipéptido de Klf es Klf4, polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. En algunas modalidades, la célula expresa endógenamente un polipéptido de Sox 1 y un polipéptido de Myc y expresa heterologamente un polipéptido de Oct y un polipéptido de Klf. En algunas modalidades, el polipéptido de Oct es Oct4, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. La presente invención también provee métodos para inducir la expresión de 0ct4 en una célula. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto la célula con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, induciendo mediante esto la expresión de Oct4 en la célula. En algunas modalidades, la célula no expresa 0ct4 inmediatamente antes de la etapa de contacto. En algunas modalidades, las células que son contactadas son células no pluripotentes . En algunas modalidades, las células son inducidas a pluripotencia después de la etapa de contactol. La presente invención también provee métodos para inducir células no pluripotentes a células pluripotentes. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto las células no pluripotentes con uno o más agentes que 'inducen pluripotencia y/o introducir cassettes de expresión a las células para expresar proteínas que inducen pluripotencia, en donde las células no son cultivadas sobre células alimentadoras y las células son anexadas a una superficie de cultivo sólida. En algunas modalidades, el método comprende además seleccionar las células contactadas en cuanto a características de célula madre pluripotente . En algunas modalidades, las células son anexadas a la superficie de cultivo sólida por un sujetador molecular, el sujetador molecular es seleccionado del grupo que consiste de matrígel, una matriz extracelular (ECM) o análogo de ECM, laminina, fibronectina y colágeno. En algunas modalidades, la etapa de contacto comprende las etapas de: a) introducir uno o más cassettes de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes; b) poner en contacto las células con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, produciendo mediante esto células madre pluripotentes inducidas. La presente invención también provee métodos para producir células madre pluripotentes inducidas a partir de células no pluripotentes mamiferas. En algunas modalidades, el método comprende: a) poner en contacto las células con por lo menos uno (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o más) de: un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9 (en los que se incluyen pero no limitados a BIX) ; un agonista ¦ de canal de Ca tipo L (en el que se incluyen pero no limitados a BayK) ; un activador de la ruta de cAMP (en los que se incluyen pero no limitados a forskolina) ; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) (en los que se incluyen pero no limitados a RG108 o 5-aza-C) ; ligando de receptor nuclear (en los que se incluyen pero no limitados a dexametazona) ; un inhibidor de GSK3 (en los que se incluyen pero no limitados a CHIR99021) ; un inhibidor de MEK; un receptor de TGFß/inhibidor de ALK5 (en los, que se incluyen pero no limitados a SB431542, A-83-01, o 2-(3-(6-metilpidirin-2-il ) -lH-pirasol-4-il ) -1, 5-naftiridina) , un inhibidor de HDAC (en los que se incluyen pero no limitados a TSA, VPA, butirato de sodio, SAHA, etc.) y un inhibidor de Erk, produciendo mediante esto células madre pluripotentes inducidas. En algunas modalidades, el método comprende1 además seleccionar las células contactadas en cuanto a características de célula madre pluripotente . En algunas modalidades, el método comprende: a) poner en contacto las células con i) un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9 y ii) un. agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de canal de Ca tipo L (en los que se incluyen pero no limitados a BayK) ; un activador de la ruta de cAMP (en los que se incluyen pero no limitados o forskolina) ; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) , (en los que se incluyen pero no limitados a RG108 o 5-aza-C) ; un ligando de receptor nuclear (en los que se incluye pero no limitados a dexametasona) ; un inhibidor de G.SK3 (en los que se incluyen pero no limitados a CHIR99021); un inhibidor de MEK, un receptor de TGFp/ inhibidor de ALK5 (en los que se incluye pero no limitados a SB431542, A-83-01, o 2-(3-(6-metilpiridin-2-il) -lH-pirazol-4-il ) -1, 5-naftiridina) , un inhibidor de HDAC (en los que se incluyen pero no limitados a TSA, VPA, butirato de sodio, SAHA, etc.) y un inhibidor de ERK. En algunas modalidades, el método comprende además: b) introducir uno o más cassettes de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y/o un polipéptido Sox a las células no pluripotentes . En algunas modalidades, Klf4 y 0ct4 son introducidos a las células (y opcionalmente Myc y Sox no) . La presente invención también provee mezclas de células mamiferas y por lo menos uno (por ejemplo, 1, 2 , 3, 4 o más de) : un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, un agonista de canal Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMT; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un receptor de TGFß/inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. En algunas modalidades, la mezcla comprende: i) un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, y ii) un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de canal de calcio de tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF /inhibidor de ALK5, un inhibidor de HADC y un inhibidor de ERK. En algunas modalidades, las células comprenden un cassette de expresión heterólogo para la expresión de un polipéptido de Oct y un cassette de expresión heterólogo' para la expresión de un polipéptido de Sox. En algunas modalidades, las células son células no pluripotentes . En algunas modalidades, las células son células de fibroblasto. < En algunas modalidades, ni un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Myc ni un cassette de expresión para la expresión de "un polipéptido de Klf son introducidos a la células no pluripotentes . La presente invención también provee composiciones que comprenden un agente que inhibe la metilación de H3K.9 y un . agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP, un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF /inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC y un inhibidor de ERK. La presente invención también provee kits que comprenden: i) un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9 y ii) un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT); un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGFß/inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC y un inhibidor de ERK. En algunas modalidades, los kits comprenden además células mamiferas. Algunas modalidades de la invención son resumidas en el formato de reivindicaciones directamente a continuación. 1. Un método para producir células madre pluripotentes inducidas a partir de células no pluripotentes mamiferas, el método comprende: a) introuducir uno o más de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes; b) poner en contacto las células con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, produciendo . mediante eso células madre pluripotentes introducidas. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa a) poner en contacto las células, no pluripotentes con uno o más polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, polipéptido de Myc y un polipéptido' Sox . 3. El método de la reivindicación 2, en dónde la etapa a) comprende por lo menos dos ciclos de: i) poner en contacto las células no pluripotentes con uno o más polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y un polipéptido Sox; ii) seguido por cultivo de las células en ausencia de los polipéptidos exógenos. 4. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa a) comprende introducir uno o más cassettes de expresión a la expresión de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido Myc y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes . 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Oct y un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Sox son introducidos a la células no pluripotentes. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de introducción comprende introducir a las células no pluripotentes uno o más cassettes de expresión para la expresión de un polipéptido dé Klf y un polipéptido Oct, en donde un cassette de expresión para un polipéptido de Myc y/o un polipéptido de Sox no es introducido a las células. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el polipéptido de Klf es Klf4 y el polipéptido de Oct es 0ct4. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde las células no pluripotentes son células somáticas. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque las célula no pluripotentes son células de fibroblasto. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque ni un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Myc ni un cassette de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf son introducidos a las células no pluripotentes. 11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la etapa de introducción es efectuada in vivo. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la etapa de introducción es efectuada in vitro. 13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque comprende además: c) seleccionar células que exhiben características de células madre pluripotentes. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde las células no pluripotentes son obtenidas de un animal y las células madre pluripotentes introducidas son diferenciadas a un tipo de célula deseado. 15. El método de la reivindicación 14, en donde el tipo de célula deseada es introducida al animal. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el animal es un humano. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde el animal es un animal no humano. 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque las células seleccionadas no comprenden un cassette de expresión exógeno para la expresión de 0ct4. 19. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el agente inhibe la metilación de H3K9. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el agente que inhibe la metilación de H3K9 es BIX01294. 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en donde las células son células humanas. 22. El método de conformidad con cualquiera dé las reivindicaciones 1-20, en donde las células son células de ratón, perro, vaca, puerco, rata y células de primate no humano . 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en donde las células no pluripotentes son células progenitoras. 2 . El método, de conformidad con la reivindicación 23, en donde las células progenitoras son células progenitoras neurales, células progenitoras de la piel o células progenitoras de folículo velloso. . 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4-24, en donde la etapa de introducción comprende introducir: un primer vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un primer cassette de expresión, el primer cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica Klf4; un segundo vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un segundo cassette de expresión, el segundo cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica Sox2 y un tercer vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un tercer cassette de expresión, el tercer cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica c-Myc . 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 4-25, en donde los vectores son vectores retroviralés, lentivirales, adenovirales, plásmido no viral o vectores de expresión episomal. 27. Un método para selección de agentes que inducen la reprogramación o desdiferenciación de células mamiferas a células madre pluripotentes, el método comprende: a) introducir por lo menos uno, pero no todos' de, un polipéptido de Oct, un polipéptido Klf, un polipéptido de. yc y un polipéptido Sox a células no pluripotentes para .generar células transíectadas ; b) poner en contacto las células transíectadas con una biblioteca de diferentes agentes; c) seleccionar las células contactadas en cüanto a características de células madre pluripotentes y 1 d) correlacionar el desarrollo de características de células madre con un agente particular de la biblioteca, identificando mediante esto un agente que estimula la diferenciación de células a células madre pluripotentes. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la etapa a) comprende introducir uno1 · o más cassettes de expresión para la expresión de por lo menos uno pero no todos de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido Sox a las células ,no pluripotentes. . 29. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la etapa a) comprende introducir por lo menos uno pero no todos de un polipéptido de Oct exógeno, un polipéptido de Klf exógeno, un polipéptido de Myc exógeno y un polipéptido de Sox exógeno a las células no pluripotentes . • 30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, en donde el agente particular es desde 50-1500 daltons. 31. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la etapa a) comprende introducir dos cassettes de expresión a las células, en donde cada cassette de expresió comprende un polinucleótido que codifica una proteína diferente, en donde la proteína es seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox y los miembros restantes del grupo no son introducidos a las células. 32. El método de conformidad con la reivindicación 27, en donde la etapa a) comprende introducir fres cassettes de expresión a la célula, en donde cassette de expresión comprende un polinucleótido que codifica una proteína diferente, en donde la proteína es seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox y el miembro restante del grupo no es introducido a la célula. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-32, en donde las células son células humanas . - 3 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-33, caracterizado porque las células son células mamíferas no humanas. 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-34, caracterizado porque las células no pluripotentes son células progenitoras . 36.. El método de conformidad la reivindicación 35, caracterizado porque las células progenitoras son células progenitoras neurales, células progenitoras de piel o células progenitoras de folículo velloso. 37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-36, en donde el polipéptido de Oct és Oct4, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. 38. Un método para selección de células mamíferas con característica de célula madre pluripotente, el método está caracterizado porque comprende: a) poner en contacto las células con un inhibidor de MAPK/ERK quinasa (MEK) , de tal manera que el crecimiento de las células no pluripotentes es inhibido y se promueve el crecimiento de las células madre pluripotentes y b) seleccionar las células contactadas en cuanto a características de célula madre pluripotente. 39. El método de conformidad con la reivindicación 38, que comprende: poner en contacto las células con una biblioteca de agentes antes de la etapa a) y en seguida de la etapa b) seleccionar un agente que induce célula madre pluripotente en base los resultados, de la etapa b).. 40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-39, en donde las células son células humanas. 41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-39, en donde las células son células de ratón, perro, vaca, puerco, rata y células de primate no humano . 42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-41, en donde el inhibidor de ,??? es PD0325901. 43. Una mezcla de células martilieras y un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, en donde las células: expresan por lo menos uno o más de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Sox y un polipéptido de Myc y/o están en contacto con por lo menos uno o más de un polipéptido de Oct exógeno, un polipéptido de Klf exógeno, un polipéptido de Sox exógeno y un polipéptido de Myc exógeno . 44. La mezcla de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque las células comprenden un primero, segundo y tercer cassette de expresión recombinante, el primer cassette de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Klf, el segundo cassette de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Sox y el tercer cassette de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica a un polipéptido de Myc. 45. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-44, en donde el agente inhibe la metilación de H3K9. 46. El método de conformidad con la reivindicación 45, en donde el agente que inhibe la metilación de H3K9 es BIX0129 . '47. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-46, en donde la células comprenden uno o más de un vector retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal, el uno o más vectores de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal comprende el primero, segundo y tercer cassette de expresión. 48. La mezcla de conformidad con la reivindicación 47, que comprende un primero, segundo y tercer vector retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal, el primer vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal comprende el primer cassette de expresión; el segundo vector retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o vector de expresión episomal comprende .el segundo cassette de expresión y el tercer vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o episomal comprende el tercer cassette de expresión. 49. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-48, en donde las células son células humanas . 50. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-48, en donde las células son células de ratón, perro, vaca, puerco, rata y células de primate no humano . 51. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-50, en donde las células comprenden células progenitoras . 52. La mezcla de conformidad con la reivindicación 51, en donde las células progenitoras son células progenitoras neurales, células progenitoras de piel o células progenitoras de folículo piloso. 53. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-52, en donde el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es; Sox2. 5 . Una célula mamífera que expresa endógenamente por lo- menos una de . una proteína seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox, en donde: ; la célula no expresa endógenamente por lo meríos una proteína del grupo, en donde la proteína no expresada endógenamente es expresada del ARN codificado por un ca¡sete de expresión recombinante heterólogo presente en la célula,! la célula expresa endógena o heterologamente cada uno del polipéptido de Oct, el polipéptido de Klf, el polipéptido de ' Myc y el polipéptido de Sox y la expresión de la proteína del cásete de expresión heterólogo da como resultado la reprogramación o dediferenciación de la célula de una célula no pluripojtente a una célula madre pluripotente . 55. La célula de conformidad con la reivindicación 54, en donde el polipéptido de Oct es 0ct4, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipé tido de Sox es Sox2. ; 56. La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-55, caracterizada porque la célula ¡expresa endógenamente un polipéptido de Sox y un polipéptido de Myc y expresa heterologamente un polipéptido de Oct y un polipéptido de Klf. 57. La célula de conformidad con la reivindicación 56, en donde el polipéptido de Oct es 0ct4, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. 58. Un método para inducir la expresión de 0ct4 en una célula, el método comprende: poner en contacto la célula con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación dé. H3K9, induciendo mediante esto la expresión de 0ct4 en la célula. 59. El método de conformidad con la reivindicación 58, en donde la célula no expresa 0ct4 inmediatamente antes de la etapa de contacto. 60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58-59, en donde las células que son contactadas no son células pluripotentes . 61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58-59, en donde las células son inducidas a pluripotencia después e la etapa de contacto. 62. Un método para inducir células no pluripotentes a células pluripotentes, el método comprende: poner en contacto las células no pluripotentes con uno o más agentes que inducen pluripotencia y/o introducir casetes de expresión a las células para expresar proteínas que inducen pluripotencia, en donde las células no son cultivadas sobre células alimentadoras y las células son anexadas a una superficie de cultivo sólidas. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde las células son anexadas a una superficie de cultivo sólida mediante un sujetador molecular. El sujetador molecular es seleccionado del grupo que consiste de matrices, una matriz extracelular (ECM) o análogo de ECM, laminita, fibronectina y colágeno. 6 . El método de conformidad con la reivindicación 62, en donde la etapa de contacto comprende las etapas de la reivindicación 1 o reivindicaciones dependientes de la reivindicación 1. 65. Un método para producir células madre pluripotentes inducidas a partir de células no pluripotentes mamíferas, el método comprende: a) poner en contacto las células con por lo menos dos de : un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desnivelación de H3K9; un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un' inhibidor de ADN metiltransferasa; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GKS3; un inhibidor de MEK; un receptor de TGF /inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y ; un inhibidor de Erk, produciendo mediante esto células madre pluripotentes inducidas . , 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, en donde la etapa de contacto comprende: 1 a) poner en contacto las células con por lo me.nos dos de: 1 : i) un agente que inhibe la metilación de 'H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9 y ii) un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cA P; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de mek; · un receptor de TGFP/inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y - . un inhibidor de Erk.. 67. El método de conformidad con la reivindicación 65 o 66, que comprende además: b) introducir uno o más casetes de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y/o un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes . 68. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65-67, en donde Klf4 y 0ct4 es producido a las células . 69. Una mezcla de células mamíferas y por lo menos dos de un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un ihibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un receptor de TGF /inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor Erk. 70. La mezcla de conformidad con la reivindicación 69, en donde la mezcla comprende: 1. un agente que inhibe la metilación de H3 9 o promueve la desmetilación de H3K9 y ii. un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un inhibidor de receptor nuclear; , un inhibidor de GSK3; ¦ un inhibidor de MEK; un. receptor de TGF /inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 71. la mezcla de conformidad con las reivindicaciones 69-70, en donde las células comprenden un cásete de expresión heterólogo para la expresión de un polipéptido de Oct y un cásete de expresión heterólogo para la expresión : de un polipéptido de Sox. 72. La mezcla de conformidad con las reivindicaciones 69-71, caracterizado porque las células son células no pluripotentes. 73. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-72, en donde las células son células de fibroblasto. 74. La mezcla de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 69-73, en donde ningún cásete de expresión para la expresión de un polipéptido de Myc ni un cásete de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf son introducidos a las células no pluripotentes. 75. Una composición que comprende por lo menos dos de: un agente que inhibe la metilación de H3K9; un agonista de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT); un ligando del receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 76. La composición de conformidad con la reivindicación 75, que comprende: i . un agente que inhibe la metilación de H3K9 y ii. un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando del receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 77. Un kit que comprende por lo menos dos de: un agente que inhibe la metilación de H3K9; un agonista de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando del receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 78. Un kit de conformidad con la reivindicación 77, nde : i. un agente que inhibe la metilación de H3K9 y ii. un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando del receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor.de Erk. 79. El kit de conformidad con la reivindicación 77 o 78, que comprende además células mamíferas. Otr modalidades de la invención serán claras a partir de la lectura de toda la solicitud.

BREVE DESCRPCION DE LAS FIGURAS Figura 1. Generación de células iPS a partir de células progenitoras neurales primarias definidas mediante transducción viral de Oct4/Klf y tratamiento de BIX01294. Una comparación del número de colonias de células GPS+iPS generadas a partir de 3.5xl04 células progenitoras neurales OG2 primarias mediante transducción retroviral de OCT4/Klf4/Sox2/c-Myc, Oct4/Klf4/Sox2 o OCT4/Klf4 con o sin tratamiento de BIX01294. Figura 2. Generación de células iPS a partir de células progenitoras neurales primarias mediante transducción viral de Klf4/Sox2/c-Myc y tratamiento de BIX01294. El número de colonias de células. GFP+iPS generadas a partir de 3.5xl04 células progenitoras neurales 0G2 primarias mediante transducción retroviral de Kl /Sox2/c-Myc con o sin tratamiento de BIX01294. Figura 3. Generación de OK2B iPSC a partir de OG2 MEF primarias . La gráfica de barras muestra el número promedio de colonias de GFP+ a partir de 0G2-MEF en tres experimentos independientes. Esta gráfica muestra datos para células; MEF 0G2 transducidas con cuatro factores (0ct4, Klf4, Sox2 y cMyc; 4F) ; transducidas con OK (OK) ; transducidas con OK y tratadas con BIX 1 µ (OK + BIX) ; transducidas con OK y tratadas con BIX 1 µ? + BayK 2 µ (OK + BIX + BayK) ; transducidas con OK y tratadas con BIX 1 µ? + RG108 0.04 µ? (OK + BIX + RG108), n = 3; la barra de error representa desviación estándar tal como es calculada con Excel. Figura 4. Las iPSC de OK2B tienen un perfil transcripcional simi lar al de mESC. (A) Análisis de RT-PCR de iPSC de OK2B indicado que expresan genes específicos a mESC pluripotentes . mESC Rl fueron usados como testigo positivo en tanto que MEF de OG2 fueron usados como testigo negativo. Se usó GADPH como control de carga. (B) La secuenciación con bisulfito reveló que el promotor nanog iPSC de OK2B es desmetilado, sugiriendo adicionalmente una reactivación de genes endógenos específicos a mESC. La ilustración esquemática de la citosina presente en la región del promotor de Nanog que fue ampliicaod para este análisis. El círculo abierto indica citosina desmetilada, mientras que el círculo relleno/negro indica citosina metilada. Figura 5. Tratamiento con BIX, BayK o una combinación de ambos no incrementa la proliferación de células mES . La gráfica de dispersión que muesrta el número de células, mES Rl después del tratamiento con DMSO (testigo), BayK 2 µ?, BIX 1 µ? y una combinación de ambos (BayK + BIX), n = 3. las 'barras de error representan desviación estándar tal como es calculada en Excel. No se obtuvo ninguna diferencia significativa para cada tratamiento en comparación con DMSO como se calculó utilizando la prueba t en Excel. Figura 6. Análisis de RT-PCR para la expresión de Sox2 después del tratamiento del compuesto . MEF de 0G2+ " /ROSA26+ " (0G2) fueron tratadas con DMSO (testigo), BIX 1 µ?, BayK 2 µ? y una combinación de ambos por 6 días. Luego,, el ARN fue extraído utilizando el Mini Kit de ÁRNeasy de Qiagen. La expresión de Sox2 fue determinada por medio de PCR semicuantitativa . iPSC de 0K2B p37 y Rl fueron usados como testigo positivo, GADPH como control de carga.

DEFINICIONES Un "polipéptido de Oct" se refiere a cualquiera de los miembros que se presentan de manera estable en la naturaleza de la familia de Octómero de factores de . transcripción o variantes de los mismos que mantienen la actividad del factor de transcripción, similar (dentro de por lo menos 50%, 80% o 90% de actividad) en comparación , con el miembro de familia que se presenta de manera estable en la naturaleza más estrechamente relacionado o polipéptidos que comprenden por lo menos el dominio de enlaces de ADN del miembro de familia que se presenta de manera estable : en la naturaleza y que comprende opcionalmente un dominio de activación transcripcional . Polipéptidos de Oct ejemplares incluyen, por ejemplo, Oct3/4 (referido en la presente como "Oct4") , que contiene el dominio de POU. Véase, Ryan, A. K. y Rosenfeld, M. G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997) . En algunas modalidades, las variantes tienen por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a través de toda la secuencia en comparación con un miembro de la familia del polipéptido de Oct que se presenta de manera estable en la naturaleza tal como aquellos enlistados anteriormente. Un "polipéptido de Klf" se refiere a cualquiera de los miembros que se presentan de manera estable en la naturaleza de la familia de factores semejantes a Krüppel (Klf) , proteínas de cinc-dedo que contienen secuencias de aminoácidos similares a aquellas del regulador del patrón embriónico de Drosophila de Krüppel o variantes de miembros que se presentan de manera estable en la naturaleza que mantienen actividad de factor de transducción similar (dentro de^ por lo menos 50%, 80% o 90% de actividad) en comparación con el miembro de familias que se presenta de manera estable en la naturaleza más estrechamente relacionado con polipéptidos que comprenden por lo menos en dominio de enlace de ADN del miembro de la familia que . se presenta de manera estable en la naturaleza y que comprende opcionalmente un dominio de activación transcripcional . Véase, Dang, D. T., Pevsner, J. y Yang, V. W. Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000) . Los miembros de la familia de Klf . ejemplares incluyen, por ejemplo, Klfl, Klf4 y Klf5, cada uno de los cuales han mostrado ser aptos de reemplazarse entre sí para dar como resultado células iPS. Véase, Nakagawa et al., Nature Biotechnology 26: 101-106.(2007). En algunas modalidades, las variantes tienen por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a través de toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia del polipéptido de Klf que se presenta de manera estable en la naturaleza tal como aquellos "enlistados anteriormente. A la extensión de un polipéptido de KLF descrito en la presente, puede ser reemplazado con un Essrb. Así, se pretende que para cada modalidad de polipéptido de Klf descrito en la presente es descrito igualmente para uso de Essrb en lugar del polipéptido de Klf4. Un "polipéptido de Myc" se refiere a cualquiera de los miembros que se presentan de manera estable en la naturaleza de la familia de Myc (véase por ejemplo, Adhikary, S. y Eilers, M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol . 6: 635-645 (2005)) o variantes de los mismos que mantienen actividad del factor de transcripción similar (dentro de por lo menos 50%, 80% p 90% de actividad) en comparación con el miembro de familia que se presenta de manera estable en la naturaleza más estrechamente relacionado o polipéptidos que comprenden por lo menos un dominio de enlace de ADN del miembro de la familia que se presenta de manera estable en la aturaleza y que comprende opcionalmente un dominio . de activación transcripcional . Polipéptidos de Myc ejemplares incluyen por ejemplo, c-Myc, N- yc y L-Myc. En algunas modalidades, las variantes tienehpor lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a través de toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia del polipéptido de Myc que se presenta de manera estable; en la naturaleza, tales como aquellos enlistados anteriormente:; Un "polipéptido de Sox" se refiere a cualquiera de los miembros que se presentan de manera estable ! !en la naturaleza de los factores de transcripción de HMG-bloqüe SRY-relacionados (Sox) ,' caracterizados por la presencia del dominio del grupo de alta movilidad (HMG) o variantes del mismo que mantienen actividad del factor de transcripción similar ; ('dentro de por lo menos 50%, 80% o 90% de actividad) en comparación con el miembro de familia que se presenta de manera estáble; en la naturaleza más estrechamente relacionado o polipéptidps que comprenden por lo menos el dominio de enlace de ADN del miembro de familia que se presenta de manera estable en la naturaleza y que comprende opcionalmente un ^ dominio de activación transcripcional . Véase, por ejemplo, Dang D.T., et al., tInt. J. Biochem. Cell Biol. 32: 1103-1121 (2000). Polipéptidos \ de Spx ejemplares incluyen, por ejemplo, Soxl, Sox2, Sox3, Sóxi5 o Soxl8, cada uno de los cuales han mostrado ser aptos de reemplazarse entre si para dar como resultado células iPIS . Véase, Nakagawa et al., Nature Biotechnology 26: 101-106 (2007) . En algunas modalidades, las variantes tienen por lo menos 90% de identidad de secuencia de aminoácidos a rtavés de toda su secuencia en comparación con un miembro de la familia del polipéptido de Sox que se presenta de manera estable en la naturaleza tales como aquellos enlistados anteriormente. "H3K9" se refiere a histona H3 lisina 9. H3K9 puede ser dimetilada en K9. Véase por ejemplo, Kubicek et al., Mol. Cell 473-481 (2007) . El término "pluripotente" o "pluripotencia" se refiere a células con la habilidad de dar surgimiento a progenie que puede sufrir diferenciación, bajo las condiciones apropiadas, a tipos de células que demuestran colectivamente características asociadas con linajes de células de todas las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo) . Las células madre pluripotentes pueden contribuir a muchos o todos los tejidos de un animal prenatal, postnatal o adulto. Una prueba aceptada en el arte, estándar, tal como la habilidad de formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad, puede ser usada para establecer ,1a pluripotencia de una población celular, sin embargo, la identificación de varias características de células madre pluripotentes pueden también ser usadas para detectar células pluripotentes. "Características de célula madre pluripotente" se refiere a características de una célula que distingu a las células madre pluripotentes de otras células. La habilidad para dar surgimiento a progenie que puede sufrir diferenciación, bajo las condiciones apropiadas, a tipos de células que demuestran colectivamente características asociadas con linajes de células de todas las tres capas, germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo) es una característica de célula madre pluripotente . La expresión o no expresión de ciertas combinaciones de marcadores celulares son también características de célula madre pluripotente. Por ejemplo, las células madre pluripotentes humanas expresan por lo menos algunos y opcionalmente todos los marcadores de la siguiente lista no limitante: SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-cadherina, UTF-1, Oct4, Rexl y Nanog. Las morfologías de célula asociadas con células madre pluripotentes son también características de células madre pluripotentes. El término "biblioteca" es usado de acuerdo con uso común en el arte para denotar una colección de moléculas, opcionalmente organizadas y/o catalogadas de tal manera que miembros individuales pueden ser identificados. Las bibliotecas pueden incluir pero no estar limitadas a bibliotecas químicas combinacionales, bibliotecas de productos naturales y bibliotecas de péptidos . Un polinucleótido "recombinante" es un polinucleótido que no está en su estado natural. Por ejemplo, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos no encontrada en la naturaleza o el polinucleótido está en un contexto diferente a aquel en el cual es encontrado naturalmente, por ejemplo, separado de secuencias de nucleótidos con los cuales comúnmente está en proximidad en la naturaleza o adyacente (o contiguo con) secuencias de nucleótidos con las cuales comúnmente no está en proximidad. Por ejemplo, la secuencia en cuestión puede ser clonada a un vector o de otra manera recom inada con uno o más ácidos nucleicos adicionales. "Cásete de expresión" se refiere a un polinucleótido que comprende un promotor u otra secuencia reguladora enlazada operativamente a una secuencia que codifica una proteína.; Los términos "promotor" y "secuencia de control de expresión" son usados en la presente para referirse a un arreglo de secuencias de control de ácidos nucleicos que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Como se usa en la presente, un promotor que dirige la secuencia de ácidos nucleicos necesaria cerca del sitio de inicio de transcripción, tal como, en el caso, un promotor de polimerasa tipo: II, un elemento de TATA. Un promotor tambiuén incluye opcionalmente elementos mejoradotes o represores distantes, que pueden estar ubicados como tal varios miles de pares de bases del sitio de inicio de transcripción. Los promotores incluyen promotores constitutivos e inducibles. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría . de condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. El término "enlazado operativamente" se refiere a un enlace funcional entre una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor o arreglo del sitio de enlace de factor de transcripción) y una segunda secuencia de ácidos nucleicos, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a ls segunda secuencia. Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo" como se usa en la presente, es uno que se ;origina i de una fuente extraña a la célula huésped particular o si es de la misma fuente, es modificado de su forma original. Asi, un cásete de expresión heterólogo en una célula es un cásete de expresión que no es endógeno a la célula huésped particular, por ejemplo, al ser enlazado a secuencias de nucleótidos de un vector de expresión 'en lugar del ADN cromosomal, que es enlazado a un promotor heterólogo, que es enlazado a ¡ un gen reportero, etc. Los términos "agente" o "compuesto de prueba" se refieren a cualquier compuesto útil en los análisis de selección descritos en la presente. Un a.gente puede ser por ejemplo, un compuesto orgánico (por ejemplo, una molécula pequeña tal como un fármaco) , un polipéptido (por ejemplo, un péptido o un anticuerpo) , un ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN, de doble hebra, de una sola hebra, un oligonucleótido, ARN antisentido, ARN inhibitorio pequeño, micro ARN, un ribozima, etc.), un oligosacárido, un lipido. Usualmente, los agentes usados en los métodos de selección presentes tienen un peso molecular de menos de 10,000 daltons, por ejemplo, menos de 8,000, 6,000, 4,000, 2,000 daltons, por ejemplo, entre 50-1500, 500-1500, 200-2000, 500-5000 daltons. El compuesto de prueba puede estar en forma de una biblioteca de compuestos de prueba, tal como una biblioteca combinatorial o aleatorizada que provee un intervalo de diversidad suficiente. Los compuestos de prueba son enlazados opcionalmente a un socio de fusión, por ejemplo, compuestos de apuntamiento, compuestos de rescate, compuestos de dimerización, compuestos estabilizantes, compuestos direccionables y otras porciones funcionales.

Convencionalmente, nuevas entidades químicas con propiedades útiles son generadas al identificar un compuesto de prueba (llamado un "compuesto delantero") con la' misma propiedad o actividad deseable, por ejemplo, habilidad para inducir pluripotencia bajo ciertas condiciones, tal como se describen en la presente, creando variantes del compuesto delantero y evaluando la propiedad de actividad de aquellos compuestos variantes. Frecuentemente, métodos de selección de alto rendimiento (HTS) son empleados para tal análisis. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" son usados intercambiablemente en la presente para referirse a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos ya sea en forma de una sola hebra o de doble hebra. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de cadena fundamental modificados, que son sintéticos, que se presentan de manera estable en la naturaleza y que no se presentan de manera estable en la naturaleza, que tienen propiedades de enlace similares como el ácido nucleico de referencia y que son metabolizados de una manera similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de tales análogos que incluyen, sin limitación, fósforotioatos, fosforamidatos , metilfosfonatos , fosfonatos quiral-metilo, 2-O-metilrribonucleótidos, ácidos péptido-nucleicos (PNA) . A no ser que se indique de otra manera, una secuencia de ácidos nucleicos particular también abarca variantes modificadas conservadoramente de los mismos (por ejemplo, sustituciones de codón degeneradas) y secuencias complementarias, también como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, sustituciones de codón degeneradas pueden ser obtenidas al generar secuencias en las cuales la tercera posición de uno o más codones (o todos) seleccionados es sustituida con residuos de ase mezclada y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al. J. Biol . Chem. 260: 2605-2608 (1985) ; Rossolini et al., Mol. Cell Probes 8: 91-98 (1994)). Los "inhibidores", "activadores" y "moduladores" de expresión o de afinidad son usados para referirse a moléculas inhibidoras, activantes o moduladoras, identificadas utilizando análisis in vitro e in vivo para expresión o actividad de una proteina objetivo descrita (o polinucleótido de codificación) , por ejemplo, ligandos, agonistas, antagonistas y sus homólogos y miméticos . El término "modulador" incluye inhibidores y activadores. Los inhibidores son agentes que, por ejemplo, inhiben la expresión o se enlazan para bloquear parcial o totalmente la estimulación o actividad de inhibidor de proteasa, disminuir, prevenir, retardar la activación, desactivar, desensibilizar o regular descendentemente la actividad de la proteina objetivo descrita, por ejemplo, antagonistas. Los activadores son agentes que, por ejemplo, inducen o activan la expresión de una proteina objetivo descrita o se enlazan para, estimular, incrementar, abrir, activar, facilitar, mejorar la activación o actividad de inhibidor de proteasa, sensibilizar o regular descendentemente la actividad de la proteina objetivo descrita (o polinucleótido de codificación), por ejemplo, agonistas. Los moduladores incluyen ligandos que se presentan de manera estable en la naturaleza sintéticos, antagonistas y agonistas (por ejemplo, moléculas químicas pequeñas, anticuerpos y los semejantes que evolucionan ya sea como agonistas o antagonistas) . ¦ Tales análisis para inhibidores y activadores incluyen, por ejemplo, aplicar compuestos moduladores supuestos a células que expresan la proteína objetivo descrita y luego determinar los efectos funcionales sobre la actividad de proteína objetivo descrita, como se describe anteriormente. Muestras o análisis que comprenden la proteina objetivo descrita que son tratadas con un activador potencial, inhibidor o modulador son comparadas con muestras testigo sin el inhibidor, activador o modulador para examinar la extensión del efecto. Se asigna a las muestras testigo (sin tratar con moduladores) un valor de actividad relativa de 100%. La inhibición de una proteina objetivo descrita es obtenida cuando el valor de actividad en relación con el testigo es aproximadamente 80%, opcionalmente 50%: o 25%, 10%, 5% o 1%. La activación de la proteina objetivo descrita es obtenida cuando el valor de actividad en relación con el de testigo es 110%, opcionalmente 150%, opcionalmente, 200%, 300%, 400%, 500% o 1000-3000% o más alta.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION I. INTRODUCCIÓN La presente invención está basada, en parte, en descubrimientos sorprendentes de que las moléculas pequeñas pueden ser usadas para imitar los efectos de los factores de transcripción involucrados en disparar células madre pluripotentes inducidas (iPS) . Por ejemplo, como se describe en detalle en la presente, en Oct4 puede ser "reemplazado" con una molécula pequeña que reduce la metilación de la histona 3 lisina 9 (H3K9) . Asi, por ejemplo BIX01294, una molécula pequeña que inhibe específicamente G9a (una histona metiltransferasa para H3 9) , cuando es puesta en contacto con una célula mamifera en la cual Klf4, c-Myc y Sox2 ha sido expresado, da como resultado inducción de células madre pluripotentes . Estos resultados son no solamente interesantes con respecto del papel de metilación de H3K9 y su implicación en la programación celular, sino que también muestra que las moléculas pequeñas pueden ser identificadas que reemplazan factores de transcripción previamente mostraron ser esenciales para inducción de células madre pluripotentes. Esto puede ser de particular interés en donde el objetivo es introducción (o reintroducción) de células madre pluripotentes inducidas o células subsecuentemente diferenciadas, tales como células progenitoras derivadas de las células iPS a un paciente. Ya que varios (por ejemplo 0ct4, Myc) de los cuatro factores de transcripción iPS tienen actividades oricogénicas conocidas, puede ser benéfico reemplazar estos factores con otras moléculas menos oncogénicas o no oncogénicas. Además, el reemplazó de algunos o cada uno de los cuatro factores con moléculas pequeñas que no requieren transformación (y asi los efectos oncogénicos potenciales de inserción de ADN al cromosoma) ayudará adicionalmente a reducir los posibles efectos secundarios de cáncer de terapias que involucran iPS. La presente invención también provee células pluripotentes en las cuales por lo menos algunos de los factores de transcripción de iPS son expresados a niveles endógenos o más bajos y no obstante son pluripotentes. Esta invención está basada, en parte, en el descubrimiento de que ciertas células que expresan endógenamente Sox2 pueden ser inducidas a pluripotencia mediante introducción y expresión heterologa de solamente 0ct4 y Klf4. Además, como se muestra en la presente, las células no pluripotentes que no expresan endógena o heterólogamente un polipéptido de Sox (por ejemplo Sox2) pueden ser inducidas a pluripotencia utilizando los métodos de la invención. Por ejemplo, la pluripotencia puede ser inducida mediante introducción de solamente Oct4 y Klf4 a células no pluripotentes (por ejemplo, células de fibroblastos) que también son puestas en contacto con un agente que inhibe la metilación de H3K9 y opcionalmente también puestas en contacto con por lo menos uno de un agonista de canal de calcio tipo L, un activador de la ruta de cAMP, uri inhibidor de ADN metiltransferasa (DN T) , un agonista de receptor nuclear, un inhibidor de GSK3 o un inhibidor de MEK. Los inventores también han encontrado que combinaciones de agentes tales como un inhibidor de GSK y un inhibidor de HDAC o un inhibidor de GSK y un activador de ruta de cAMP o un inhibidor de G$ y un inhibidor de ALK5 (con y sin un inhibidor de G9a) son efectivos para inducir pluripotencia en células que expresan heterólogamente Oct4 solo o Oct4/Sox2 o Sox2/ lf4. Así", la invención provee mezclas de células y agentes, en donde las células son inicialmente células no pluripotentes (por ejemplo, no son células madre) y opcionalmente expresan heteróloga o endógenamente o están de otra manera en contacto con 0c¡t4 y/o i Klf4 y en donde el (los) agente (s) es uno o más de un agente que inhibe la metilación de H3K9, un agonista de canal . de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF /inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC y/o un inhibidor de Erk. ¡ Como se discute adicionalmente más adelante; en la presente, la invención también provee nuevos métodos de selección en cuanto a células con características de1 célula madre pluripotente al cultivar células a ser seleccionadas con un inhibidor de MEK, un agente que inhibe la metilación de H3K9, un agonista de canal de calcio tipo L, un activado|r de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; ün ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGFß/inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de Erk. Inhibidores de MEK, por ejemplo, inhiben el- crecimiento de células sin iPS, en tanto que simultáneamente promueven el crecimiento y reprográmación estable de células de iPS, enriqueciendo mediante esto una mezcla de células particular por células con características de célula madre pluripotente .

II. INDUCCIÓN DE CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES A. EXPRESIÓN HETERÓLOGA/ENDÓGENA En algunas modalidades de la invención, las células no pluripotentes son identificadas que expresan endógenamente por lo menos una (y opcionalmente dos o tres) proteínas del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, polipéptido de Klf, un polipéptido de yc y un polipéptido de Sox. Las proteínas restantes (expresadas no endógenamente) del grupo pueden luego ser expresadas heterólogamente en las células y seleccionadas en cuanto a reprogramación y/o de diferenciación a células pluripotentes, opcionalmente en presencia de uno o más de un inhibidor de MEK, un agente que inhibe la metilación de H3K9, un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP un inhibidor de ADN metiltransferasa :(DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGFß/inhi idor de ALK5, Un inhibidor de HDAC y/o un inhibidor de Erk. Se cree que cualquier tipo de célula no pluripotente mamífera puede ser seleccionada en cuanto a expresión de proteína y subsecuentemente ser convertida a una célula pluripotente. En algunas modalidades, las células repartidas son células progenitoras aisladas. Células progenitores ejemplares incluyen pero no están limitadas a células progenitoras de endodermo, células progenitoras de mesodermo (por ejemplo, células progenitoras de músculo, células progenitoras de hueso, células progenitoras de sangre) y células progenitoras de ectodermo (células progenitoras de tejido epidérmico y células progenitoras neurales). Las células útiles para estos aspectos de la invención pueden ser fácilmente identificadas al seleccionar líneas celulares en cuanto a expresión de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido Myc y un polipéptido de Sox o al identificar células con metilación de promotor reducida (por ejemplo, mediante secuenciación de bisulfito de ADN) o identificación de células con un estado de histona modificado para determinar el estado de silenciamiento reducido de estos genes. Aquellos factores de transcripción que no son expresados endógenamente pueden luego ser expresados heterólogamente para inducir pluripotencia sin expresión heteróloga de aquellos factores ya expresados endógenamente. Como se muestra en los ejemplos, algunas células (por ejemplo, células progenitoras neurales y fibroblastos (datos no mostrados)) pueden ser inducidas a pluripotencia mediante expresión heteróloga de 0ct4 y Klf4 solamente. Esto demuestra que las proteínas de Sox y Myc y asimismo proteínas de Oct y Klf, no necesitan ser sobreexpresadas (por ejemplo, utilizando un vector viral de alta expresión) para obtener pluripotencia. En lugar de eso, algunas de esas proteínas pueden ser expresadas a niveles endógenos o aun niveles detectables más bajos y todavía ser elegibles para conversión a células píuripotentes mediante expresión heteróloga de otros miembros el grupo. Así, en algunas modalidades de la invención, las células son identificadas que expresan endógenamente un polipéptido de Sox y/o un polipéptido de Myc y un polipéptido Oct y/o un polipéptido de Klf es expresado heterologamente en la célula, induciendo mediante esto la conversión de la célula a una célula pluripotente . En algunas modalidades, las células son identificadas que expresan endógenamente un polipéptido de Oct y/o un polipéptido de Klf y/o un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox es expresado heterologamente en la célula, induciendo mediante esto la conversión de la célula; a una célula pluripotente. Opcionalmente, Optionally, Sall4 (Zhang et ah, Nat Cell Biol. 8(10) : 1114-23 (2006)) puede ser expresado en lugar de cualquiera o todos de Myc, Klf , and Sox2. La eficiencia de inducción a pluripotencia como se describe en la presente puede ser mejorada adicionalmente mediante inclusión en las células no píuripotentes de, por ejemplo uno o más de UTF1, SV40, TERT (ya sea mediante introducción de un carácter de expresión que codifica estos productos genéticos o al poner en contacto las células con las proteínas mismas) y/o al reducir la expresión de p53 (por ejemplo mediante siRNA) . Véase, por ejemplo Zhao, et al, Cell Stem Cell 3:475-479 (2008) .

B . PROTEÍNAS DE FACTOR DE FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Como . se detalla en la presente, un número de modalidades de la invención involucra la introducción de uno o más polipéptidos a las células, induciendo mediante esto pluripotencia en la célula. Como se discute anteriormente, la introducción de un polipéptido a una célula puede comprender introducción de un polinucleótido que comprende uno;' o más cassettes de expresión a una célula e inducir la expresión, introduciendo mediante esto los polipéptidos a la célula mediante transcripción y traducción del cassette de expresión. Alternativamente, se puede introducir un polipéptido exógeno (esto es, una proteina provista desde el exterior de la célula y/o que no es producida por la célula) a la célula mediante un número de métodos diferentes que no involucran introducción de un polinucleótido que codifica el polipéptido. Asi, para cualquier modalidad de la invención descrita en. la presente que se refiere ya sea a introducción de un polipéptido a una célula o introducción de un cassette de expresión que codifica un polipéptido a una célula, se debe entender que la presente invención también provee expresamente la introducción exógena del polipéptido como una proteina a la célula. Por consiguiente, en algunas modalidades, células no pluripotentes mamiferas son inducidas a pluripotencia mediante a) introducida exógenamente uno o más de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y/o un polipéptido Sox a las células no pluripotentes y opcionalmente b) poner en contacto las células con uno o más de un inhibidor de MEK, un agente que inhibe la metilación de H3K9, un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cA P; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de Erk, produciendo mediante esto células madre pluripotentes inducidas . , ¦ En algunas modalidades de la invención, las células i no pluripotentes son identificadas que expresan endógenamente por lo menos una (y opcionalmente, dos o tres) proteínas del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipépjt'ido de . Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox. Las proteínas restantes (expresadas no endógenamente) del ; grupo pueden luego ser introducidas exógenamente en las células y seleccionadas en cuanto a re-programación y/o desdiferen'ciación a células pluripotentes, opcionalmente en presencia de . uno o más de un inhibidor de MEK, un agente que inhibe la metlilación de H3K9, un agonista de canal de Ca tipo L, un activador; de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF /inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de Erk. I En algunas modalidades, las células son identificadas que expresan endógenamente un polipéptido de Sox y/o un polipéptido Myc y como una segunda etapa un polipéptido de Oct y un polipéptido de Klf es introducido exógenamente en la célula, induciendo mediante esto la conversión de la célula a una célula pluripotente . En algunas modalidades, las células son identificadas que expresan endógenamente un polipéptido de Oct y/o un polipéptido de Klf y/o un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox es introducido exógenamente en la célula, induciendo mediante esto la conversión de la célula a una célula pluripotente. La introducción exógena de un polipéptido a una célula puede ocurrir en cualquier diversidad de maneras1., Una o más proteínas pueden simplemente ser cultivadas en presencia de células objetivo bajo condiciones para permitir la introducción de las proteínas a la célula. En algunas modalidades, las proteínas exógenas comprenden el polipéptido de factor de transcripción de interés enlazado (por ejemplo, enlazado como una proteína de fusión o de otra manera enlazado covalente o no covalentemente) a un polipéptido que mejora la habilidad del factor de transcripción para entrar a la célula (y opcionalmente el núcleo celular) . Ejemplos de secuencia de polipéptidos que mejoran "el transporte a través de membranas incluyen pero no están limitados a la- proteína de transcripción de antenapédia de homoproteína de Drosophila (AntHD) (Joliot et al, New Biol. 3: 1121-34,1991 ; Joliot et al, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 88: 1864-8, 1991 ; Le Roux et al . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 9120-4,1993), la protein structural de virus de herpes simple VP22 (Elliott and Onare, Cell 88: 223-33,1997); la proteina TAT activadora transcripcional de HIV-I (Green and Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988 ; Frankel and Pabo, Cell 55: 1 289-1193, 1988) ; transportadores que mejoran la administración tal como se describe en la patente estadounidense número 6,730,293 (en la que se incluyen pero no limitados a una secuencia de péptidos que comprenden por lo menos 7-25 argininas continuas) y el péptido Penetratin™ 1 disponible comercialmente , y los vectores de péptido de Diatos ("DPVs") de la plataforma Vectocell® disponible de Daitos S.A. de Paris, Francia. Véase también WO/2005/08 158 y O/2007/123667 y transportadores adicionales descritos en las mismas. No solamente pueden esas proteínas pasar a través de la membrana del plasma, sino la anexión de otras proteínas tales como los factores de transcripción descritos en la presente es suficiente para estimular la absorción celular de estos complejos. En algunas modalidades, los polipéptidos de factor de transcripción descritos en la presente son introducidos exógenamente como parte de un liposoma o cocktail de lípido tal como Fugene6 y Lipofectamine disponibles comercialmente. En otra alternativa, las proteínas de factor de transcripción pueden ser microinyectadas o de otra manera" introducidas directamente a la célula objetivo. Como se discute en los ejemplos, los inventores han encontrado que la incubación de células con los polipéptidos de factor de transcripción de la invención por periodos extensos es tóxico para las células. Por consiguiente, la presente invención provee la incubación intermitente de células mamiferas no pluripotentes con uno o más de polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de' Myc y/o un polipéptido de Sox, con periodos intermedios de incubación de las células en ausencia de uno o más polipéptidos. En algunas modalidades, el ciclo de incubación con y sin los polipéptidos puede ser repetido por 2, 3, 4,' 5, 6 o más veces y es efectuado por duraciones de tiempo suficientes (esto es, las incubaciones con y sin proteína) para obtener el desarrollo de ¡células pluripotentes. Varios agentes (por ejemplo, inhibidor de MEK y/o inhibidor de GSK y/o inhibidor de TGF ) pueden ser incluidos para mejorar la eficiencia del método.

C. REEMPLAZO DE MOLÉCULA. PEQUEÑA DE FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN DE IPS En algunas modalidades de la invención, una célula expresa (endógena o heterólogamente) por lo menos una proteína seleccionada de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox (por ejemplo, por lo menos uno, dos o tres de éstos) y es puesto en contacto con por lo menos un agente, en donde el agente es suficiente para dar como resultado inducción de la célula a una célula madre pluripoterite en ausencia de la expresión de una o más de las proteínas no expresadas restantes, esto es, cualquier del polipéptido de Oct, el polipéptido de Klf, el polipéptido de Myc o el polipéptido de Sox no expresado en la célula. Como se muestra en los ejemplos, la puesta en contacto de la célula con ciertos agentes puede "complementar" o reemplazar lo que es entendido en general de otra manera como una expresión necesaria de una de estas proteínas para dar como resultado células pluripotentes . Al poner en contacto una célula con un agente que reemplaza funcionalmente la expresión de una de las proteínas enlistadas anteriormente, es posible generar células pluripotentes con expresión de todas las proteínas enlistadas anteriormente excepto la proteína reemplazada o complementada por el agente. Las proteínas restantes pueden ser expresadas endógenamente, heterologamente o en alguna combinación de las dos (por ejemplo, un polipéptido de Sox y Myt podría ser expresado endógenamente, un polipéptido de Klf podría ser expresado heterologamente y el polipéptido de Oct podría ser "reemplazado" por el lugar de poner en contacto las células con un agente complementario tal como un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación . de H3K9) . Además, las moléculas pequeñas pueden mejorar la eficiencia de un. proceso para generar células pluripotentes (por ejemplo, células iPS) . Por ejemplo, la eficiencia mejorada puede ser manifestada al acelerar el tiempo para generar tales células pluripotentes (por ejemplo, al acortar el tiempo para el desarrollo de células pluripotentes por al menos un1 día en comparación con un mismo proceso o proceso similar sin la molécula pequeña) . Alternativamente o en combinación, una molécula pequeña puede incrementar el número de células pluripotentes generadas mediante un proceso particular (por ejemplo, incrementar el número en un período de tiempo dado por al menos 10%, 50%, 100%, 200%, 500%, etc. en comparación con un mismo proceso o proceso similar sin la molécula pequeña) . Como se describe en los ejemplos, las células que expresan heterólogamente Klf , Sox2 y Myc pueden ser inducidas a pluripotencia al poner en contacto además las células con un agente que inhibe la metilación de H3K9 sin la expresión heteróloga de 0ct . Por supuesto,- se ha encontrado que la pluripotencia puede ser inducida al poner en contacto células no pluripotentes con un agente que inhibe la metilación de H3K9 e introducción ya sea de Oct 4 solo (por ejemplo, sin también introducir un vector para expresar un polipéptido de Myc, un polipéptido de Sox o un polipéptido de Lf) u Oct4 con Klf4. Las células que pueden ser inducidas a pluripotencia incluyen, pero no están limitadas a células progenitoras neurales y fibroblastos. Los agentes que inhiben la metilación de H3K9 incluyen agentes que inhiben metilasas (también conocidas como metil transferasas ) que apuntan a H3K9. Por ejemplo, la G9a histona metiltransferasa metila H3K9 y la inhibición de G9a histona metiltransferasa se sabe que reduce la metilación de H3K9. Véase, por ejemplo, Kubicek, et al, Mol. Cell 473-481 (2007). Un ejemplo de una G9a histona metiltransferasa útil de acuerdo con los métodos de la invención es BIX01294 (véase, por. ejemplo, Kubicek, et al., Mol Cell 473-481 (2007)), o; .sales, hidratos, isoformas, racematos, solvatos y formas de profármaco de los mismos. Bix01294 es mostrado a continuación: mutua* Los compuestos de Bix01294 de la presente invención también incluyen las sales, hidratos, solvatos y formas de profármaco. Bix01294 posee átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o dobles enlaces; los racematos, diastereómeros, isómeros geométricos e isómeros individuales se pretende que todos sean abarcados dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, el compuesto de la presente invención puede ser el isómero R o el isómero S, o una mezcla de los mismos. Además, el compuesto de la presente invención puede ser el isómero E o el isómero Z, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el agente que inhibe la metilación de H3K9 es un sustrato análogo de una histonai metil transferasa. El sustrato de un número de metil transferasas es S-adenosil-metionina (SAM) . Asi, en algunas modalidades, el agente que inhibe la metilación de H3K9 es un análogo á'e SAM. Análogos- de SAM ejemplares incluyen, pero no están limitados a, metiltio-adenosina (MTA) , sinefungina, y S-adenosil-homocisteina (SAH) . En otras modalidades, el agente que¡ inhibe la metilación de H3K9 no compite con SAM en una histonk, metil transferasa . ¦ , ; Las t células pluripotentes resultantes (,de la expresión heteróloga y/o "reemplazo" de molécula pequeña se pueden desarrollar a muchos o todos los tres tipos de' itejido mayores: endodermo (por ejemplo, revestimiento de intestino interior) , mesodermo (por ejemplo, músculo, hueso, sangre) , y ectodermo (por ejemplo, tejidos epidérmicos y sistema nervioso) , sin embargo, opcionalmente, pueden mostrar l restricciones en cuanto a su potencial de desarrolló (por ejemplo, pueden no formar tejido placental u otros tipos de células de un linaje definido) . Las células puede ser huirianas o no humanas (por ejemplo, primate, rata, ratón, conejo, bovino, perro, gato, puerco, etc.) .

En otras modalidades, BIX01294 u otros agentes que inhiben la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9 pueden ser usados para inducir pluripotencia en células que no eran previamente pluripotentes. En algunas modalidades, un agente que inhibe la metilación de H3K9 es usado para inducir la expresión de 0ct4 en células, o por lo menos alteraciones en la metilación de ADN de promotor de 0ct4 y/o metilación de histona para permitir la inducción de células a pluripotencia. Asi, en algunas modalidades, las células que no son inicialmente células pluripotentes son puestas en contacto con un agente que inhibe la metilación de H3K9 para inducir las células a volverse pluripotentes. Por supuesto, sin pretender limitar el alcance de la invención a un modo de acción particular, los inventores creen que el contacto de las células no pluripotentes con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9 mejorará cualquier1 método para inducir células a pluripotencia. Por ejemplo, el; agente que inhibe la metilación de H3K9 puede ser contactado con una célula no pluripotente e inducido a pluripotencia en un método que comprende poner en contacto las células no pluripotentes con un agente que inhibe la metilación de H3K9, opcionalmente también poniendo en contacto las células con uno o más de un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DN T) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF / inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk, en donde cada compuesto está incluido en una cantidad de suficiente para mejorar la eficiencia de inducción. En algunas modalidades como se describe en este párrafo, 0ct4 solamente, u Oct4/Klf4 o Sox2/Klf4 son además expresados heterólogamente en las células no pluripotentes dando como- resultado la inducción de pluripotencia enseguida de contacto con agentes como se describe en la presente. Los inventores también han encontrado que la combinación de un inhibidor de GSK y un inhibidor de HDAC, o un inhibidor de GSK y un activador de la ruta de cAMP^. o un inhibidor de GSK y un inhibidor de ALK5 pueden inducir a pluripotencia cualquiera de fibroblastos de ratón o humanos o queratinocitos que expresan cualquiera de: 0ct4 solo, Oc't4/Klf4 o Sox2/Klf4 (datos no mostrados) . En otras modalidades, una célula no pluripotente es inducida a pluripotencia en un método que comprende poner · en contacto las células no pluripdtentés con un inhibidor de GSK3, opcionalmente también poner en contacto las células con uno o más de un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF.p/ inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk, en donde compuesto está incluido en una cantidad suficiente para mejorar la eficiencia de inducción. En otras modalidades, una célula no p.luripotente es inducida a pluripotencia en un método que comprende poner en contacto las células no pluripotentes con un receptor de GF / inhibidor de ALK5 , opcionalmente también poniendo en contacto las células con uno o más de un agonista de canal Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT); un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk, en donde cada compuesto está incluido en una cantidad suficiente para mejorar la eficiencia de inducción. En otras modalidades, una célula no pluripotente es inducida a pluripotencia en uri método que comprende poner en contacto las células no pluripotentes con un inhibidor de HDAC, opcionalmente también poniendo en contacto . las células con uno o' más de un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF / inhibidor de ALK5, o un inhibidor de Erk, en donde cada compuesto está incluido en una cantidad suficiente para mejorar la eficiencia de inducción. En otras modalidades, una célula no pluripotente es inducida a pluripotencia en un método que comprende poner en contacto las células no pluripotentes con un inhibidor de MEK, opcionalmente también poniendo en contacto las células con uno o más de un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DN T) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un receptor de TGFp/inhibidor de AL 5, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk, en donde cada compuesto está incluido en una cantidad suficiente para mejorar la eficiencia de inducción. En otras modalidades, una célula no pluripotente es inducida a pluripotencia en un método que comprende poner en contacto las células no pluripotentes con dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o cada uno de un inhibidor de EK, un agonista de canal de Ca tipo L; un agente que inhibe la metilación de H3K9, un activador de la ruta de cA P; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un receptor de ? ¥ / inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk, en donde cada compuesto está incluido en una cantidad suficiente para mejorar la eficiencia de inducción. En algunas modalidades como se describe en este párrafo, 0ct4 solamente, u Oct4/Klf4 o Sox2/Klf4 son además expresados heterólogamente en las células no pluripotentes dando como resultado la inducción de pluripotencia enseguida del contacto con agentes como se describe en la presente. Agonistas de canal de calcio tipo L ejemplares incluyen pero no están limitados a, BayK8644 (véase, por ejemplo, Schramm, et al., Nature 303:535-537 (1983)), Deshidrodidemnina B (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 6,030,943), FPL 64176 (FPL) (véase, por ejemplo, Liwang, et al., Neuropharmacology 45:281-292 (2003)), S(+)-PN 202-791 (véase, por ejemplo, Kennedy, et al., Neuroscience 49:937-44 (1992)) y CGP 48506 (véase, por ejemplo, Chahine, et al., Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 81:135-141 (2003)). Activadores ejemplares de la ruta de cAMP incluyen, pero no están limitados a, forskolina (véase, por ejemplo, Liang, et al., Endocrinology 146: 4437-4444 (2005),), FSH (véase, Liang, supra) , milrinona (véase, Liang, supra) , cilostamida (véase, Liang, supra) , rolipram (véase, Liang, supra) , dbcAMP (véase, Liang, supra) y 8-Br-cAMP (véase, Liang, supra) . Inhibidores de ADN metiltransferasa (DNMT) ejemplares pueden incluir anticuerpos que se enlazan a variantes negativas dominantes de, y siARN y ácidos nucleicos antisentido que suprimen la expresión de DNMT. Inhibidores de DNMT incluyen, pero no están limitados a, RG108 (disponible, por ejemplo, de Sigma-Aldrich) , 5-aza-C (5-azacitidina o azacitidina) (véase, por ejemplo, Schermelleh, et al., Nature Methods 2:751-6 (2005)), 5-aza-2' -desoxicitidina (5-aza-CdR) (véase, por ejemplo, Zhu, Clinical Medicinal Chemistry 3(3) : 187-199 (2003)), decitabina (véase, por ejemplo, Gore, Nature Clinical Practice Oncology 2:S30-S35 (2005)), doxorubicina (véase, por ejemplo, Levenson, Molecular Pharmacology 71:635-637 (2007)), EGCG ( (-) -epigalocatequin-3-galato) (véase, por ejemplo, Fang, et al., Cáncer Research 63:7563-7570 (2003)), RG108 (véase, por ejemplo, Carninci, et al., WO2008/126932, incorporada en la presente por referencia) y zebularina (véase, Carninci, supra) . Ligandos e receptor nuclear ejemplares, esto es, agonistas, antagonistas, activadores y/o represores de receptores nucleares, pueden modular la expresión genética local o transcripción en el sitio de administración. Se' pueden usar agonistas de receptor nuclear (y también antagonistas de receptor nuclear) . En algunas modalidades, los receptores nucleares son co-reguladores de transcripción. La activación o inhibición de ciertos receptores nucleares regula estados epigenéticos de sitios genéticos específicos en do;ndé se enlazan. Los inventores han encontrado que dexametasona (por ejemplo, a 1 µ?, un agonista de receptor glucocorticoide ) , ciglitazona y Fmoc-Leu (ambos usado a 5 µ?) (un agonista de PPAR) , y bexaroteno (por ejemplo, a (3 µ?) (un antagonista de RXR) pueden mejorar la reprogramación celular. Ligandos de receptor nuclear representativos incluyen, pero no están limitados a, estradiol (por ejemplo, 17-beta estradiol) , ácido retinoico completamente . trans, ácido retinoico 13^cis, dexametasona, clobetasol, andrógenos, tiroxina, glitazonas de vitamina D3, troglitazona, pioglitazona, rosiglitazona, prostaglandinas y fibratos (por ejemplo, bezafibrato, ciprofibrato, gemfibrozil, fenofibrato y clofibrato) . Además, la actividad de ligandos endógenos (tales como las hormonas estradiol y testosterona) cuando se enlazan a sus receptores nucleares cognatos es normalmente para regular ascendentemente la expresión genética. Esta regulación ascendente o estimulación de expresión genética por el ligando puede ser denominada como una respuesta agonista. Los efectos agonistas de hormonas endógenas . pueden también ser imitados por 'ciertos ligandos sintéticos, por ejemplo, el receptor de 1 glucocortocoide fármaco antiinflamatorio dexametason ;. Los ligandos agonistas funcionan al inducir un conformación del receptor que favorece el enlace de co-activador . (Véase,, por ejemplo, WO08011093 A incorporado en la presenté por referencia) . Los inhibidores de GSK3 pueden incluir anticuerpos que se enlazan, a variantes negativas dominantes de, y siARN y ácidos nucleicos antisentido que apuntan' a GSK3. Ejemplos específicos de inhibidores de GSK3 incluyen pero i no están limitados a, Kenpaulona, l-Azakenpaulona, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418 (véase, por ejemplo, Gould, et al.;,' The International Journal of Neuropsychopharmacology 7:387-390 (2004)), CT 99021 (véase, por ejemplo, Wagman, Current Pharmaceutical Design 10: 1105-1137 (2004)), CT 20026 (¡véase, Wagman, supra) , SB216763 (véase, por ejemplo, Martin, ét al., Nature Immunology 6:111-184 (2005)), AR-A014418 (véase, por ejemplo, Noble, et al., PNAS 102:6990-6995 (2005)), litio (véase, por ejemplo, Gould, et al., Pharmacological Research 48: 49-53 (2003)), SB 415286 (véase, por ejemplo, Frame, et al., Biochemical Journal 359:1-16 (2001)) y TDZD-8 (véase, por ejemplo, Chin, et al., Molecular Brain Research, 137(1-2): 193-201 (2005) ) . Inhibidores de GSK3 ejemplares adicionales disponibles de Calbiochem (véase, por ejemplo, Dalton, et al., O2008/094597, incorporado en la presente por referencia) , incluyen pero no están limitados a ¦ BIO (2'Z,3'£)-6-bromoindirubin-3' -oxima (inhibidor de GSK3 IX); BIO-Acetoxima (2' Z, 3' E) -6-Bromoindirubin-3' -acetoxima (inhibidor de GSK3 X) ; (5-metil-lH-pirazol-3-il) - (2-fenilquinazolin-4-il ) amina (inhibidor de GSK3 XIII); complejo de piridocarbazol-ciclopentadienilrutenio (inhibidor de GSK3 XV); TDZD-8 4-bencil-2-metil-l, 2, 4-tiadiazolidin-3, 5-diona (inhibidor de GSK3beta I) ; 2-tio ( 3-yodobencil ) -5- ( 1-piridil ) - [ , 3 , 4 ] -oxadiazol (inhibidor de GSK3beta II); OTDZT 2 , 4-dibencil-5-oxotiadiazolidin-3-tiona (inhibidor de GSK3beta III) ; alfa-4-dibromoacetofenona (inhibidor de GSK3beta VII) ; AR-AO 14418 N- (4-metoxibencil) -N' - (5-nitro-l, 3-tiazol-2-il) urea (inhibidor de GSK-3beta VIII); 3- ( 1- ( 3-hidroxipropil ) -lH-pirrolo [2 , 3-b] piridin-3-il] -4-pirazin-2-il-pirrol-2 , 5-diona (inhibidor de GS -3beta XI); compuesto de pirrolopirimidina TWS1 19 (inhibidor de GSK3beta XII); L803 H-KEAPP APPQSpP-NH2 o su forma miristoilada (inhibidor de GSK3beta XIII); 2-cloro-l- (4, 5-dibromo-tiofen-2-il ) -etanona (inhibidor de GSK3beta VI); AR-A0144-18; SB216763; y SB415286. Residuos de GSK3b que interactúan con inhibidores han sido, identificados. Véase, por ejemplo, Bertrand et .al., J. Mol Biol. 333(2) : 393-407 (2003) . Los inhibidores de GSK3 pueden activar, por ejemplo, la ¡ruta de Wnt/ -catenina . Muchos de los genes corriente abajo de ß-catenina co-regulan la pluripotencia de redes genéticas. Por ejemplo, un inhibidor de GSK activa la expresión de cMyc también como mejora su estabilidad de proteina y actividad transcripcional . Asi, en algunas modalidades, los inhibidores de GSK3 pueden ser usados para estimular, la expresión del polipéptido de Myc endógeno en una célula, eliminando mediante esto la necesidad de expresión de Myc para inducir pluripotencia . Inhibidores de MEK pueden incluir ¦ anticuerpos a, variantes negativas dominantes de," y siARN y ácidos nucleicos antisentido que suprimen la expresión de MEK. Ejemplos específicos de inhibidores de MEK incluyen, pero no están limitados a PD0325901, (véase, por ejemplo, Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology: 4456-4462 (2004)), PD98059 (disponible de Cell Signaling Technology) , UO 126 (disponible de Cell Signaling Technology) , SL 327 (disponible, por ejemplo de Sigma-Aldrich) , ARRY-162 (disponible, por ejemplo de Array Biopharma) , PD184161 (véase, por ejemplo, Klein, et al., Neoplasia 8:1-8 (2006)), PD184352 (CI-1040) (véase, por ejemplo, Mattingly, et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316:456-465 (2006)), sunitinib (véase, por ejemplo, Voss, et al., US2008004287 incorporada en la presente por referencia) , sorafenib (véase, Voss supra) , Vandetanib (véase, Voss supra) , pazopanib (véase, por ejemplo, Voss supra), Axitinib (véase, Voss supra) y PTK787 (véase, Voss supra) . Actualmente, varios inhibidores de EK ' están sufriendo evaluaciones de pruebas clínicas. CI-1040 ha sido evaluado en pruebas clínicas Fase I y II para cáncer (véase, por ejemplo, Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22 (22) : 4456-4462 (2004)) . Otros inhibidores de MEK que son evaluados en pruebas clínicas incluyen PD 184352 (véase, por ejemplo, English, et al., Trends in Pharmaceutical Sciences^ 23(l) :40-45 (2002)), BAY 43-9006 (véase, por ejemplo, Chow, et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 4!6 : 72-78 (2001)), PD-325901 (también PD0325901) , GSK1120212, ARRY- 38162, RDEA119, AZD6244 (también ARRY-142886 o ARRY-886) , R05126766, XL518 y AZD8330 (también ARRY-704) . (Véase también información del Instituto Nacional Saludo ubicado en el world wide web en clinicaltrials.gov también como información del Instituto Nacional de Cáncer ubicado en el world wide web en cancer.gov/clinicaltrials. Los inhibidores de receptor beta de TGF (por ejemplo, ALK5) pueden incluir anticuerpos a, variantes negativas dominantes de, y ácidos nucleicos antisentido que suprimen la expresión de receptores de TGF beta (por ejemplo, ALK5) .

Inhibidores de receptor de TGF3/ALK5 ejemplares incluyen, pero no están limitados a SB431542 (véase, por ejemplo, Inman, et al., Molecular. Pharmacology 62(1) : 65-74 (2002)), A-83-01, también conocido como 3- ( 6-metil-2-piridinil ) -N-fenil-4- (4-quinolinil ) -lH pirazol-l-carbotioamida (véase, por ejemplo, Tojo, et al., Cáncer Science 96 (11) : 791-800 (2005), y disponible comercialmente de, por ejemplo, Toicris Bioscience) ; 2- ( 3- ( 6-metilpridin-2-il ) -lH-pirazol-4-il) -1 , 5-naftiridina, Wnt3a/BIO (véase, por ejemplo, Dalton, et al., WO2008/O94597 , incorporado en la presente por referencia) , B P4 (véase, Dalton, supra) , GW788388 (- { 4- [3- (piridin-2-il ) -lH-pirazol-4-il] piridin-2-il } -N- ( tetrahidro-2H-piran-4-il ) enzamida) (véase, por ejemplo, Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49 (7) :2210-2221 (2006)), SM16 (véase, por ejemplo, Suzuki, et al., Cáncer Research 67 ( 5 ) : 2351-2359 (2007)), IN-1130 (3-((5-( 6-metilpiridin-2-il) -4- (quinoxalin-6-il) -lH-imidazol-2-il) metil ) benzamida) (véase, por ejemplo, Kim, et al., Xenobiotica 38 (3) : 325-339 (2008)), GW6604 ( 2-fenil-4- ( 3-piridin-2-il-lH-pirazol-4-il) piridina) (véase, por ejemplo, de Gouville, et al., Drug News Perspective 19(2) : 85-90 (2006)), SB-505124 (2- (5-benzo [1, 3 ] dioxol-5-il-2-ter-butil-3H-imidazol-4-il ) -6-metilpiridina clorhidrato) (véase, por ejemplo, DaCosta, et al., Molecular Pharmacology 65 ( 3 ) : 744-752 (2004)) y derivados de pirimidina (véanse, por ejemplo, aquellos enlistados en Stiefl, et al., WO2008/006583, incorporada en la presente por referencia) . Además, en tanto que "un inhibidor de ALK5" no pretende abarcar inhibidores de cinasa no específicos, se debe entender que un "inhibidor de ALK5" abarca, inhibidores que inhiben ALK4 y/o ALK7 además de ALK5, tales como, por ejemplo, SB-431542 (véase, por ejemplo, Inman, et al., J Mol. Phamacol. 62(1) : 65-74 (2002) . Sin pretender limitar el alcance de la invención, se cree que los inhibidores de ALK5 afectan el proceso de conversión/transición de mesenquimal a epitelial (MET) . La ruta de TGF /activiha es un impulsor para la transición de epitelial . a mesenquimal (EMT) . Por consiguiente, la inhibición de la ruta de TGF /activina puede facilitar el proceso de MET (esto es, reprogramación) . En vista de los. datos en la presente que muestran el efecto de inhibir ALK5, se cree que la inhibición de la ruta de TGF /activina tendrá efectos similares. Así, cualquier inhibidor (por ejemplo, corriente arriba o corriente abajo) de la ruta de TGF /activina puede ser usado en combinación con, o en lugar de inhibidores de ALK5 como se describe en cada párrafo en la presente. Inhibidores de la ruta de TGF /activina ejemplares incluyen pero no están limitados a: inhibidores de receptor de TGF beta, inhibidores de fosforilación de SMAD 2/3, inhibidores de la interacción de SMAD 2/3 y SMAD 4, y activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7. Además, las clasificaciones descritas a. continuación son solamente por propósitos de organización y aquel de habilidad en el arte sabría que compuestos pueden afectar uno o más puntos dentro de una ruta, y así los compuestos pueden funcionar en más de una de las categorías definidas. Los inhibidores de receptor de TGF beta pueden incluir anticuerpos a, variantes negativas dominantes de y siARN o ácidos nucleicos antisentido que apuntan a receptores de TGF beta. Ejemplos específicos de inhibidores incluyen pero no están limitados a SU5416; clorhidrato de 2- (5-benzo [1,3] dioxol-5-il-2-ter-butil-3H-imidazol-4-il ) -6-metilpiridina ( SB-505124 ) ; lerdelimumb (CAT-152); metelimumab (CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; KÍ26894; SB-203580; SD-093; Gleevec; 3, 5, 7, 2' , 4' -pentahidroxiflavona (Morin) ; activin-M108A;¡ P144; TBR2-FC soluble; y células de tumor transíectadas antisentido que apuntan a receptores de TGF beta. (Véase, por ejemplo, rzesinski, et al., Clinical Cáncer Research 13 ( 18 ): 5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2) :329-337 (2005); y Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12:4393-4401 (2007) ) . Inhibidores de fosforilación de S AD 2/3 pueden incluir anticuerpos a, variantes negativas dominantes de y ácidos nucleicos antisentido que apuntan a SMAD2 o SMAD3. Ejemplos específicos de inhibidores incluyen PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; y 3, 5, 7, 2', '- pentahidroxiflavona (Morin) . (Véase, por ejemplo, Wrzesinski, supra; Kaminska, supra; Shimanuki, et al., Oncogene 26:3311-3320 (2007); y Kataoka, et al., EP1992360, incorporado en la presente por referencia) . Inhibidores de interacciones de SMAD 2/3 y smad4 pueden incluir anticuerpos a, variantes negativas dominantes de y ácidos nucleicos antisentido que apuntan a SMAD2, SMÁD3 y/o smad . Ejemplos específicos de inhibidores de las interacciones de SMAD 2/3 y' SMAD4 incluyen pero no están limitados a Trx-SARA, Trx-xFoxHlb y Trx-Lefl. (Véase, por ejemplo, Cui, et al., Oncogene 24:3864-3874 (2005) y Zhao, et al., Molecular Biology of the Cell, 17:3819- 3831 (2006)) . Activadores/agonistas de SMAD 6 y SMAD 7 incluyen pero no están limitados a anticuerpos a, variantes negativas dominantes de y ácidos nucleicos antisentido que apuntan a SMAD 6 o SMAD 7. Ejemplos específicos de inhibidores incluyen pero no están limitados a oligonucleótidos de PTO tales como smad7. (Véase, por ejemplo, Miyazono, et al., US6534476, y Steinbrecher, et al., US2005119203, ambas incorporadas en la presente por referencia) . Inhibidores de HDAC ejemplares pueden incluir anticuerpos que se enlazan a variantes negativas dominantes de, y siARN y ácidos nucleicos antisentido que apuntan a HDAC. Inhibidores de HDAC incluyen, pero no están limitados a, TSA ( tricostatina A) (véase, por ejemplo, Adcock, British Journal of Pharmacology 150:829-831 (2007)), VPA (ácido valproico) (véase, por ejemplo, Munster, et al., Journal of Clinical Oncology 25: 18S (2007) : 1065), butirato de sodio (NaBu) (véase, por ejemplo, Han, et al., Immunology Letters 108:143-150 (2007)), SAHA (ácido suberoilanilida hidroxámico o vorinostat) (véase, por ejemplo, Kelly, et al., Nature Clinical Practice Oncology 2:150-157 (2005)), fenilbutirato de sodio (véase, por ejemplo, Gore, et al., Cáncer Research 66:6361-6369 (2006)), depsipeptido (FR901228, FK228) (véase, por ejemplo, Zhu, et al., Current Medicinal Chemistry 3(3) : 187-199 (2003)), trapoxina (TPX) (véase, por ejemplo, Furumai, et al., PNAS 98(l) :87-92 (2001)), péptido 1 que contiene ácido hidroxámico cíclico (CHAP1) (véase, Furumai supra) , MS-275 (véase, por ejemplo, Carninci, et al., O2008/126932, incorporado en la presente por referencia) ) , LBH589 (véase, por ejemplo, Goh, et al., WO2008/1087 1 incorporado en la presente por referencia) y PXD101 (véase, Goh, supra) . En general a nivel global, las células pluripotentes tienen más acetilación de histoná y las células diferenciadas tienen menos acetilación de histona. La acetilación de histona está también involucrada en la regulación de histona y metilación de ADN. En algunas modalidades, los inhibidores de HDAC facilitan la activación de genes de pluripotencia silenciada. Inhibidores de ERK ejemplares incluyen PD98059 (véase, por ejemplo, Zhu, et al., Oncogene 23:4984-4992 (2004)), U0126 (véase, Zhu, supra) , FR 180204 (véase, por ejemplo, Ohori, Drug News Perspective 21 (5):245-250 (2008)), sunitinib (véase, por ejemplo, Ma, et al., US2008004287 incorporado en la presente por referencia) , sorafenib (véase, , Ma, supra) , Vandetanib (véase, Ma, supra) , pazopanib (véase, Ma, supra), Axitinib (véase, Ma, supra) y PTK787 (véase, Ma, supra) . Una vez que los casets de expresión han sido introducidos a las células y/o las células han sido puestas en contacto con uno o más agentes, las células pueden opcionalmente ser seleccionadas en cuanto a características de células madre pluripotentes, identificando mediante esto aquellas células en una mezcla que son pluripotentes ¦. Tales células pueden por ejemplo ser aisladas de las otras células y usadas adicionalmente como sea apropiado.

III. Células No Pluripotentes Como se usa en la presente, "células no pluripotentes" se refiere a células mamíferas que no son células pluripotentes. Ejemplos de tales células incluyen células diferenciadas, también como células progenitoras . Ejemplos de células diferenciadas incluyen, pero no están limitados a células de un tejido seleccionado de médula ósea, piel, músculo esqueletal, tejido graso y sangre periférica. Tipos de células ejemplares incluyen, pero no están limitados a, fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos y células T. En algunas modalidades, en donde un individuo va a ser tratado con las células pluripotentes resultantes, las propias células no pluripotentes del individuo son usadas para generar células pluripotentes de acuerdo con los métodos de la invención . Las células pueden ser de, por ejemplo, mamíferos humanos o no humanos. Mamíferos no humanos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, ratones, ratas, gatos, perros, conejos, conejillos de indias, hámsters, ovejas, puercos, caballos y bovinos.

IV. Transformación La presente invención depende de técnicas de rutina en el campo de genética recombinante. Textos básicos que revelan los métodos generales de uso en la invención incluyen Sambrook et al.. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory manual (1990); y Current Protocolos in Molecular Biology (Ausubel et al., eds . , 1994)). En algunas modalidades, la especie de célula y proteína ser expresada es la misma. Por ejemplo, si se usa una célula de ratón, un ortólogo de ratón es introducido a la célula. Si se usa una célula humana, se introduce un ortólogo humano a la célula. Se apreciará que en donde dos o más proteínas van a ser expresadas en una célula, uno o múltiples casets de expresión pueden ser usados. Por ejemplo, en donde un caset de expresión va a expresar múltiples polipéptidos , se puede usar un aset de expresión policistrónico. ¦ A. Vectores plásmido En ciertas modalidades, un vector de plásmido es contemplado para uso para transformar una célula huésped. En general, vectores de plásmido que contienen secuencias de replicón y control que son derivados de especies compatibles con la célula huésped son usados en relación coni ' estos huéspedes. El vector puede portar un sitio de replicación, también como especies de marcación que son aptas de proveer selección fenotípica en células transformadas.

B. Vectores virales La habilidad de ciertos virus para infectar células o entrar células vía endocitosis moderada por receptor, jy para integrarse al genoma de célula huésped y expresar genes v'irales estable y eficientemente los ha hecho candidatos atractivos para la transferencia de ácidos nucleicos extraños a células (por ejemplo, células mamíferas) . Ejemplos no limitantes de vectores de virus que pueden ser usados para administrar Un ácido nucleico de la presente invención son. descritos •posteriormente en la presente. i . Vectores adenovirales Un método particular para administración del ácido nucleico involucra el uso de un vector de expresión de adenovirus. Aunque se sabe que los vectores de adenovirus tienen baja capacidad para integración a ADN genómico, este elemento es contrarrestado por la alta eficiencia de transferencia genética proporcionada por estos vectores. "Vector de expresión de adenovirus" se propone incluir aquellos constructos que contienen secuencias de adenovirus suficientes para (a) soportar el empaque del constructo y (b) expresar finalmente un constructo tejido o célula-especifico que ha sido clonado en el mismo. El conocimiento de la organización genética o adenovirus, un virus de ADN de doble hebra de ~36 kb, lineal, permite la sustitución de piezas grandes de > ADN adenoviral con secuencias extrañas de hasta 7 kb (Grunháus et í al., Seminar in Virology, 200 ( 2 ) : 535-546 , 1992)) . | ; ii. Vectores AAV El ácido nucleico puede ser introducido a la ! célula utilizando transfección auxiliada por adenovirus . ' Eficiencias de transfección incrementadas han sido reportadas en sistemas ? : de células utilizando sistemas adenovirus acoplados (Kelleher y Vos, Biotechniques, 17(6) : 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Nati Acad Sci USA, 89 ( 13 ) : 6094-6098 , 1992; Curiel, Nat jmmun, 13 (2-3) : 141-64, 1994.) . El virus adeno-asociado (AAV) es un sistema de vector atractivo ya que tiene una alta frecuencia de integración y puede infectar células no divisoras, haciéndolo asi útil para la administración de genes a células mamiferas, por ejemplo, en cultivo de tejido (Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992) o in vivo. Detalles concernientes con la generación y uso de vectores de rAAV son descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5,139,941 y 4,797,368, cada una incorporada en la presente por referencia. iii . Vectores retrovirales Los retrovirus tienen promesa como vectores de administración genética debido a su habilidad para integrar sus genes al genoma huésped, transfiriendo una gran cantidad de material genético extraño, infectando un amplio espectro de especies y tipos de células y de ser empacado en lineas celulares especiales (Miller et al., Am. J. Clin. Oncol, 15 (3) .216-221, 1992) . Con el fin de construir un vector retrovector, un ácido nucleico (por ejemplo, uno que codifica el igen de interés) es insertado al genoma viral en el lugar de ciertas secuencias virales para producir un virus que es defectuoso de replicación. Para proveer viriones, una linea celular de empaque que contiene los genes gag, pol y env pero sin el LTR y componentes de empaque es construida (Mann et al.,, Cell, 33:153-159, 1983) . Cuando un plásmido recombinante que contiene a cADN, junto con la secuencia de LTR y empaque retrovirales es introducido a una linea de célula especial (por ejemplo, mediante precipitación de fosfato de calcio por ejemplo) , la secuencia de empaque permite que el transcripto de ARN del plásmido recombinante sea empacado a partículas virales, que son luego secretadas al medio de cultivo (Nicolás y Rubibstein, In: Vectores: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodríguez y Denhardt, eds . , Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nueva York: Plenum Press, pp . 149-188, 1986; Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983) . Luego, el medio que contiene los retrovirus recombinantes es recolectado, opcionalmente concentrado y usado para la transferencia genética. Los vectores retrovirales son aptos de infectar una amplia variedad de tipos de células. Sin embargo, la integración y expresión estable involucra comúnmente la división de células huésped (Paskind et al., Virology, 67:242-248, 1975) . Los lentivirus son retrovirus complejos que, además de los genes retrovirales comunes gag, pol y env, contienen otros genes con función reguladora o estructural. Los vectores lentivirales son bien conocidos en el arte (véase, por ejemplo, Naldini et al., Science, 272 (5259) : 263- 267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15 (9) : 871-875, 1997; Blomer et al., J Virol, 71 (9) : 6641-6649, 1997; patentes estadounidenses Nos. 6,013,516 y 5,994,136) . Algunos ejemplos de lentivirus incluyen los virus de inmunodeficiencia humana: HIV-I, HIV-2 y el virus de inmunodeficiencia simio: SIV. Vectores lentivirales han sido generados al atenuar múltiplemente los genes de virulencia de HIV, por ejemplo, los genes env, vif, vpr, vpu y nef son cancelados haciendo el vector biológicamente seguro. Los vectores lentivirales recombinantes son aptos de infectar células que no se dividen y pueden ser usados tanto para la transferencia genética in vivo como ex vivo y expresión de secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, lentivirus recombinantes aptos de infectar una célula que no se divide, en donde una célula huésped apropiada es transfectada con dos o más vectores que portan las funciones de empaque, es decir gag, pol y env, también como rev y tat son descritos en la patente estadounidense No. 5,994,136, incorporada en la presente por referencia. Se puede apuntar el virus recombinante mediante enlace de la proteína de envolvente con un anticuerpo o un ligando particular para apuntamiento a un receptor de un tipo de célula particular. Al ins.ertar una secuencia (que incluye una región reguladora) de interés al vector viral, junto con otro gen que codifica el ligando para un receptor sobre una célula objetivo específica, por ejemplo, el vector es ahora objetivo-específico. iv. Administración Utilizando Virus Modificados Un ácido nucleico a ser administrado puede ser alojado dentro un virus infeccioso que ha sido diseñado para expresar un ligando de enlace especifico. La partícula de virus se enlazará así específicamente a los receptores cognatos de la célula objetivo y entregará el contenido a la célula. Un nuevo procedimiento diseñado para permitir apuntamiento específico de vectores de retrovirus fue desarrollado basado en la modificación química de un retrovirus mediante la adición química de residuos de lactosa a la envolvente viral. Esta modificación puede permitir la infección específica de hepatocitos vía receptores de sialoglicoproteína . Otro procedimiento para el apuntamiento de retrovirus recombinantes fue diseñado en el cual anticuerpos biotinilados contra una proteína de envolvente retroviral y contra un receptor de célula específico fueron usados. Los anticuerpos fueron acoplados vía los componentes de biotina utilizando estreptavidina (Roux et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 86:9079-9083, 1989). Utilizando anticuerpos contra antígenos de clase I y clase II complejos de histocompatibilidad mayor, demostraron la infección de una variedad de células humanas que llevan aquellos antígenos de superficie con un virus ecotrópico < in vitro (Roux et al., 1989).

C. Administración de Vector y Transformación de Célula Métodos apropiados para la administración , de ácido nucleico para transformación de una célula, un tejido o un organismo para uso con la presente invención se cree que incluyen virtualmente cualquier método mediante el qüal un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) pueden ser introducidos! a una célula, un tejido o un organismo, como se describe ;en la presente o como seria conocido para aquel de habilidad ordinaria en el arte. Tales métodos incluyen, pero no : están limitados a, administración directa de ADN tal como mediante i transfección ex vivo (Wilson et al., Science, 244 : 134;4;-1346, 1989, Nabel y Baltimore, Nature 326:711-713, 1987), opcionalmente con Fucogene6 (Roche) o Lipofeciamina ( Invitrogen) , mediante inyección (patentes estadounidenses Nos. 5,994,624, 5,981,274, 5,945,100, 5,780,448, 5,736,524, 5,702,932, 5,656,610, 5,589,466 y 5,580,859, cada una incorporada en la presente por referencia) , en los qué ge incluyen microinyección (Harland y Weintraub, J. Cell Biol. , 101: 1094-1099', 1985; patente estadounidense No. 5,789,215, incorporada en la presente por referencia); mediante electroporación (patente estadounidense No. 5,38|4,253, incorporada en la presente por referencia; Tur-Kaspa ét al., I Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81.7161-7165, 1984); mediante precipitación de fosfato de calcio (Graham y Van Der Eb, Viro'iogy, 52:456-467, 1973; Chen y Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8) :2745- 2752, 1987; Rippe et al., Mol.- Cell Biol, 10:689-695, 1990); al usar D.EAE-dextrana seguida por polietilenglicol (Gopal, Mol. Cell Biol, 5:1188-1190, 1985); mediante carga sónica directa (Fechheimer et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 84:8463-8467, 1987); mediante transfección moderada por liposoma (Nicolau y Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 76:3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol, 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, i 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243:375-378, 1989; Kato et al., J Biol Chem. , 266:3361-3364, 1991) y transfección moderada por receptor (Wu y Wu, Biochemistry, 27:887-892, 1988; Wü y Wu, J. Biol. Chem., 262:4429-4432, 1987); cada una incorporada en la presente por referencia) ; y cualquier combinación de tales métodos .

V. Cultivo de células Las células a ser inducidas a pluripotencia pueden ser cultivadas de acuerdo con cualquier método conocido en el arte. Principios generales pueden ser encontrados en, por ejemplo, Maherali, et al., Cell Stem Cell 3:595-605 (2008). En algunas modalidades, las células son cultivadas en contacto con células alimentadoras. Células alimentadoras ejemplares incluyen, pero no están limitadas a células de fibroblasto, por ejemplo, célula de fibroblasto embriónico de ratón ( EF) . Métodos de cultivo de células sobre células alimentadoras son conocidos en el arte. En algunas modalidades, las células son cultivadas en ausencia de células alimentadoras. Las células, por ejemplo, pueden ser anexadas directamente a una superficie de cultivo sólida (por ejemplo, una placa de cultivo) , por ejemplo, vía un sujetador molecular. Los inventores han encontrado que el cultivo de células inducidas a pluripotencia tienen una eficiencia de inducción mucho mayor a pluripotencia (esto es, una porción mayor de células obtienen pluripotencia) cuando las células son anexadas directamente a la superficie de cultivo sólida en comparación con la eficiencia de células tratadas idénticamente de otra manera que son cultivadas sobre células alimentadoras. Sujetadores moleculares ejemplares incluyen pero no están limitados a matrigel, una matriz extracelular (ECM) , análogo de ECM, laminina, fibronectina o colágeno. Aquellos de habilidad en el arte reconocerán sin embargo que esta es una lista no limitante y que otras moléculas pueden ser usadas para anexar células a una superficie sólida. Métodos para anexión inicial de .los sujetadores a la superficie sólida son conocidos en el arte. Como se usa en esta sección de "cultivo", "células a ser inducidas a pluripotencia" son inducidas mediante cualquier método en el arte, en los que se incluyen, pero no limitados a los métodos descritos en esta solicitud.

VI . Usos para células pluripotentes La presente invención permite el estudio y desarrollo adicional de tecnología de célula madre, en los que se incluye pero no limitados a usos profilácticos o terapéutico^. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células de la invención (ya sea células pluripotentes o células inducidas a diferenciarse a lo largo de un destino celular deseado) son introducidas a individuos en necesidad de las mismas, en los que se incluyen pero no limitados a, individuos en necesidad de regeneración de un tipo de órgano, tejido o célula. En algunas modalidades, las células son obtenidas originalmente ¡en una biopsia de un individuo; inducidas a pluripotencia como se describe en la presente, inducidas opcionalmente a diferenciarse (por ejemplo a una célula progenitora deseada particular) y luego trasplantada de regreso al individuo. En algunas modalidades, . las células son modificadas genéticamente antes de su introducción al individuo. En algunas modalidades, las células pluripotentes generadas de acuerdo con los métodos de la invención son inducidas subsecuentemente a formar, por ejemplo, células ' hematopoyéticas (madre/progenitor), células neurales (madre/progenitor) (y opcionalmente, células más diferenciadas, tales como neuronas específicas de sub-tipo, oligodendrocitos, etc.), células pancreáticas (por ejemplo, célula progenitora endocrina o células que expresan hormona pancreática) , hepatocitos, células cardiovasculares (madre/progenitora) (por ejemplo, cardiomiocitos, células endoteliales, células de músculo liso) , células retínales, etc. Una variedad de métodos son conocidos para inducir diferenciación de células madre pluripotentes a tipos de células deseados. Una lista no limitante de publicaciones de patente recientes que describen métodos para inducir diferenciación de células madre a varios destinos celulares se dan a continuación: publicación de patente estadounidense No. 2007/0281355; 2007/0269412; 2007/0264709; 2007/0259423; 2007/0254359; 2007/0196919; 2007/0172946; 2007/0141703; 2007/0134215. Una variedad de enfermedades pueden ser mejoradas mediante introducción y opcionalmente apuntamiento de células pluripotentes de la invención a un tejido lesionado particular. Ejemplos de enfermedad resultantes de lesión de tejido incluyen, pero no están limitadas a, enfermedad de neurodegeneración, infarto cerebral, enfermedad vascular obstructiva, infarto al miocardio, insuficiencia cardiaca, enfermedad de pulmón obstructivo crónico, enfisema pulmonar, bronquitis, enfermedad pulmonar intersticial, asma, hepatitis B (daño del hígado) , hepatitis C (daño del hígado) , hepatitis alcohólica (daño del hígado) , cirrosis hepática (daño del hígado) , insuficiencia hepática (daño del hígado) , pancreatitis, diabetes mellitus, enfermedad de Crohn, colitis inflamatoria, glomerulonefritis de IgA, ' glomerulonefritis , insuficiencia renal, decubitus, quemadura, herida' sutural, laceración, herida con incisión, herida de mordida, dermatitis, queloide cicatricial, queloide, úlcera diabética, úlcera arterial y úlcera venosa. Los polipéptidos descritos en la presente (por ejemplo, uno o más de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc,, y un polipéptido de Sox) son en si mismos agentes terapéuticos solos o en combinación como se describe en la presente. Por ejemplo, los polipéptidos o combinaciones de los mismos, son útiles para reducir daños de tejidos y asi pueden ser administrados para tratar, mejorar o impedir daños de tejido. En algunas modalidades, un compuesto de la invención es administrado a un individuo que tiene o "está en riesgo de tener daño de tejido a un órgano interno. Los órganos internos incluyen, pero no están limitados a, cerebro, páncreas, hígado, intestino, pulmón, riñon o corazón, herida, por ejemplo, mediante quemadura o corte. Por ejemplo, en algunas modalidades, los compuestos de la invención son efectivos para reducir el tamaño de infarto en reperfusión enseguida de isquemia. Así, una proteína de la invención puede ser administrada a individuos en riesgo de tener, que tienen o que han tenido un accidente cerebrovascular . Similarmente, una proteína de la invención puede ser administrada a individuos en riesgo de tener, que tienen o que han tenido un ataque al corazón o daño cardiaco. Los agentes descritos en la presente (por ejemplo, un agente que inhibe la metilación de H3K9; un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cA P; un inhibidor de ADN metiltransferasa ( DNMT ) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un inhibidor de receptor de TGF /ALK5, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk) son también agentes terapéuticos útiles solos o en combinación con entre sí como se describe en la presente. Por ejemplo, los agentes o combinaciones de los mismos, son útiles para reducir daños al tejido y así pueden ser administrados para tratar, mejorar o impedir daños al tejido. En algunas modalidades, un agenté de la invención es administrado a un individuo que tiene o está en riesgo de tener daño al tejido a un órgano interno. Órganos internos incluyen, pero no están limitados a, cerebro, páncreas, hígado, intestino, pulmón, riñon o corazón, heridas, por ejemplo mediante quemadura o corte. Por ejemplo, en algunas modalidades, los agentes de la invención son efectivos para reducir el tamaño de infarto en reperfusión enseguida de isquemia. Así, un agente de la invención puede ser administrado a individuos en riesgo de tener, que tienen o que han tenido un accidente cerebrovascular . Similarmente, un agente de la invención puede ser administrado a individuos en riesgo de tener, qué tienen o que han tenido un ataque al corazón o daño cardiaco.

Los compuestos activos descritos en la presente también incluyen las sales, hidratos,- solvatos y formas de profármaco de los mismos. Los compuestos de la presente invención también incluyen los isómeros y metabolitos de los mismos. Ciertos compuestos de la presente invención poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o dobles enlaces; los racematos, diastereómeros , isómeros geométricos y isómeros individuales se pretende que todos estén abarcados dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, el compuesto de la presente invención puede ser el isómero R o el isómero S o una mezcla de los mismos. Además, el compuesto de la presente invención puede ser el isómero E o el isómero Z, o una combinación de los mismos. Sales aceptables farmacéuticamente de los compuestos ácidos de la presente invención son sales formadas con bases, es decir sales catiónicas tales como sales de metales alcalinos y metales alcalinotérreos, tales como sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, también como sales de amonio, tales como sales de amonio, trimetil-amonio, dietilamonio y tris-(hidroximetil.) -metil-amonio . En algunas modalidades, la presente invención provee la sal de clorhidrato. Ert otras modalidades, el compuesto es clorhidrato de elipticina. 1 Similarmente, sales de adición de ácido, tales como de ácidos minerales, ácidos carboxilicos orgánicos y sulfónicos orgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido metansulfónico, ácido maleico, son también posiblemente provistos como un grupo básico, tales como piridilo, constituye parte de la estructura. Las formas neutras de los compuestos pueden ser regeneradas al poner en contacto la sal con una base o ácido y aislar el compuesto original de manera convencional.' El forma original del compuesto puede diferir de las varias formas de sal en ciertas propiedades físicas, tales como solubilidad en solventes polares, pero de otra manera las sales son equivalentes a la forma original del compuesto para los propósitos de la presente invención. Los compuestos de la presente invención pueden ser fabricados mediante una variedad de métodos conocidos para aquel de habilidad en el arte (véase Comprehensíve Qrganíc Transformations Richard C. Larock, 1989). Aquel de habilidad en el arte apreciará que otros métodos de fabricación de los compuestos son útiles en la presente invención. La administración de células o compuestos descritos en la presente es por cualquiera de las rutas usadas normalmente para introducir farmacéuticos. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender un pprtador aceptable farmacéuticamente. Portadores aceptables farmacéuticamente son determinados en parte por la composición particular que es administrada, también como por el método particular Usado para administrar la composición. Así, hay una amplia variedad de formulaciones apropiadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención (véase, por ejemplo. Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985)) . Formulaciones apropiadas para administración incluyen soluciones acuosas y no acuosas, soluciones estériles isotónicas, que pueden contener antioxidantes, soluciones reguladoras del pH, bacteriostáticos y solutos que vuelven la formulación isotónica y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservadores. En la práctica de esta invención, las composiciones pueden ser administradas, por ejemplo, oral, nasal, tópica, intravenosa, intraperitoneal , intratecalmente o al ojo (por ejemplo, mediante colirio o inyección) . Las formulaciones de compuestos pueden ser presentadas en recipientes sellados de dosis unitaria o de multidosis, tales como ampolletas y frascos. Soluciones y suspensiones pueden ser preparadas a partir de polvos, gránulos y tabletas de la clase previamente descrita. Los moduladores pueden también ser administrados como parte de un alimento o fármaco preparado. La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para inducir una respuesta benéfica en el sujeto con el paso del tiempo, esto es, para mejorar una condición del sujeto. El nivel de dosis óptimo para cualquier paciente dependerá de una variedad de factores en los que se incluyen la eficacia del modulador especifico empleado, la edad, peso corporal, actividad física y dieta del paciente, y en una combinación posible con otro fármaco. El tamaño de la dosis también será determinado por la existencia, naturaleza y extensión de cualesquier efectos secundarios adversos que acompañan la administración de un compuesto o vector particular en un sujeto particular. La administración se puede llevar a cabo via una sola dosis o dosis divididas.

VII . Selección en cuanto a agentes que inducen desarrollo de célula madre pluripotente La presente invención provee métodos de selección en cuanto a agentes que pueden "reemplazar" uno de los cuatro factores de transcripción de iPS (esto es, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc, y un polipéptido de Sox) , o alternativamente pueden reemplazar un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf o un polipéptido de Sox en células en donde Myc no es necesario para reprogramar células a células pluripotentés (Nakagawa, M. et al. Natu're Biotechnol. 26, 101-106 (2007); ernig, M . , Meissner, A,, Cassady, J. P. & Jaenisch, R. Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008)) o alternativamente mejorar la eficiencia de inducción a pluripotencia . ' En algunas modalidades, los métodos comprenden introducir uno o más casets de expresión para la expresión de por lo menos uno de, pero no todo de, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc, y un polipéptido de Sox , a células no pluripotentes para generar células transíectadas ; subsecuentemente poner en contacto las células transfectadas con una biblioteca de agentes diferentes; seleccionar las células contactadas en cuanto a características de célula madre pluripotente; y correlacionar el desarrollo de características de célula madre con un agente particular de la biblioteca, identificando mediante esto un agente que estimula la diferenciación de células a células madre pluripotentes. En algunas modalidades, las células son contactadas con por lo menos uno de un agente que inhibe la metilación de H3K9; un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cA P; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor, de MEK, un inhibidor de receptor de TGF /ALK5, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk también como uno o más miembros de una molécula pequeña u otra biblioteca de agente para identificar un miembro de la biblioteca que induce o mejora la inducción de células a pluripotencia . Así, mezclas de células no pluripotentes y por lo menos uno (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más de) un agente que inhibe la metilación de H3K9; un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un inhibidor de receptor de TGFp/ALK5, un inhibidor de HDAC; o un inhibidor de Erk son provistos en la presente invención. Los agentes en la biblioteca pueden ser cualquier compuesto químico pequeño o una entidad biológica, tal como una proteína, azúcar, ácido nucleico o lípido. Comúnmente, los agentes de prueba serán moléculas químicas pequeñas y péptidos. Esencialmente cualquier compuesto químico puede ser usado como agente potencial en los análisis de la invención, aunque más frecuentemente los compuestos que pueden ser disueltos en soluciones acuosas u orgánicas (especialmente a base dé DMSO) son usadas. Los análisis están diseñados para seleccionar grandes bibliotecas químicas al automatizar las etapas de análisis y proveer compuestos de cualquier fuente conveniente a los análisis, que se lleva a cabo comúnmente en paralelo (por ejemplo, en formatos de microtítulo sobre placas de microtítulo en análisis robóticos). Se apreciará que hay muchos proveedores de compuestos químicos, en los que se incluyen Sigma (St. Louis, MO) , Aldrich (St. Louis, MO) , Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) , Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza) y los seme antes . En algunas modalidades, los métodos de selección de alto rendimiento involucran proveer una biblioteca química o de péptidos combinatorial que contiene un gran número de agentes de reemplazo de iPS potenciales (que actúan potencialmente para reemplazar una de las proteínas de iPS) . Tales "bibliotecas químicas combinatoriales" son luego seleccionadas en uno o más análisis, como se describe en la presente, para identificar aquellos miembros de biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que muestran una actividad característica deseadá, esto es, tal como inducir características de ' célula madre pluripotentes en células que prestan algunos, pero no todos de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox. Una biblioteca química combinatorial es una conexión de diversos compuestos químicos ,· generados ya sea mediante síntesis química o síntesis biológica al combinar un número de "bloques de construcción" químicos tales como reactivos. Por ejemplo, una biblioteca química combinatorial lineal tal como una biblioteca de polipéptidos es formada al combinar un conjunto de bloques de construcción químicos (aminoácidos) en cada manera posible para una longitud de compuestos dada (esto es, el número de aminoácidos en un compüesto de polipéptido) . Millones de compuestos químicos pueden ser sintetizados por medio de tal mezcla combinatorial de bloques de construcción químicos. La preparación y selección de bibliotecas químicas combinatoriales es bien conocida para aquellos de habilidad en el arte. Tales bibliotecas químicas combinatoriales incluyen pero no están limitada a bibliotecas de péptidos (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 5,010,175, Furia, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991) y Houghton et al., Nature 354: 84-88 (1991)) . Otras químicas para generar bibliotecas de diversidad química pueden también ser usadas. Tales químicas incluyen pero no están limitadas a: peptoides (por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 91/19735) , péptidos complicados (por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 93/20242), bio-oli!gómeros aleatorios (por ejemplo, Publicación de PCT No. WO 92/0,0091), benzodiacepinas (por ejemplo, patente estadounidense No. 5, 288, 514), diversómeros tales como idantoína, benzodiapjepinas y dipéptidos (Hobbs et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: i ¡ 6909-6913 (1993)), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., J. AMER . Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), peptidomiméticos no peptidales con andamio de glucosa (Hirschmann et al., J¡. AMER. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), síntesis orgánica análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen et al., Ji AMER. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), oligocarbamatos (Cho ét al,., Science 261: 1303 (1993)) y/o peptidilfosfonatos (Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658 (1994)), bibliotecas de : ácidos nucleicos (véase Ausubel, Berger y Sambrook, todo supra) , bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (véase por ejemplo, patente estadounidense No. 5,539,083), biblioteca^ ¦ de anticuerpos (véase, por ejemplo, Vaughn et 'al., Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996) y , PCT/US96/10287) , bibliotecas de carbohidratos (véase, por ejemplo, Liang et al., Science 274: 1520-1522 (1996) y patente estadounidense No. 5,593,853), bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (véase, por ejemplo, benzodiazepines, Baum C y EN, 18 de enero, página 33 (1993); isoprenoides, patente estadounidense No. 5,569,588; tiazodilidonas y metatiazanona, patente estadounidense No. 5,549,974; pirrolidinas , patente estadounidense No. 5,525,735 y 5,519,134; compuestos de morfolino, patente estadounidense No. 5,506,337; benzodiacepinas, patente estadounidense No. 5,288,514 y los semejantes) . Dispositivos para la preparación de bibliotecas combinatoriales están disponibles comercialmente (véase por ejemplo, 357 MPS; 390 PS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Fostér City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA) . Además, numerosas bibliotecas combinatoriales están en si mismas disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D . Pharmaceuticals, Exton, PA, Market Biosciences, Columbia, MD, etc.) . Las células contactadas con los agentes y que expresan adicionalmente algunos pero no todos de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox (por ejemplo, combinaciones de uno, dos o tres de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox) , pueden luego ser seleccionados por el desarrollo de células pluripotentes, por ejemplo, mediante selección en cuanto a una o más características de células madre pluripotentes. Las selecciones iniciales pueden ser diseñadas al transformar las células al ser seleccionadas con un cásete de expresión que comprende elementos de promotor conocidos para ser activados en células madre pluripotentes (opcionalmente, pero no otras células) enlazadas operativamente a un marcador seleccionable o de otra manera identificable . Por ejemplo, se puede usar urt marcador aceptable tal como GFP u otro sistema de reportero. Elementos de promotor ejemplares conocidos para ser activados en células pluripotentes incluyen pero no están limitados a 0ct4, Nanog, SSEA1 y secuencias de promotor de ALP. Las células pueden también ser seleccionadas en cuanto a expresión de otros marcadores de células pluripotentes (por ejemplo, mediante inmunofluorescencia, etc.) como son conocidos e;n el arte, en los que se incluyen pero no limitados a Nanog, SSEA1 y ALP. En algunas modalidades, se examina la morfología celular. En algunas modalidades, las células son cultivadas en presencia de un inhibidor de MAPK/ERK cinasa (MEK) . Los inventores han encontrado que la presencia de un inhibidor de MEK da como resultado tanto la inhibición del crecimiento de células no pluripotentes y estimulación del crecimiento de células madre pluripotentes. Este efecto por consiguiente, amplifica la "señal" de la selección y permite la detección más eficiente y sensible de agentes que inducen la reprogramación de las células a células madre pluripotentes . Una amplia variedad de inhibidores de MEK son conocidos, en los que se incluyen pero no limitados a PD0325901 (véase, por ejemplo, Thompson, et al., Current Opinión in Pharmacology 5(4) : 350-356 (2005)); inhibidor de MÉK U0126 (Promega) , ARRY886 AZD6244) (Array Biopharma) ; PD98059 (Cell Signaling Technology) y amino-tio-acrilonitrilos (patente estadounidense No. 6,703¡, 420) . Otros inhibidores de MEK son descritos por ejemplo, en la patente estadounidense No. 6,696,440 y WO 04/045617, entre otros .

VIII. Mezclas de células Como se discute en la presente, la presente invención provee células no pluripotentes en una mezcla con uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de un agente que inhibe la metilación de H3K9; un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; ün inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGFp/inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de Erk. En algunas modalidades, el compuesto está en la mezca a una concentración suficiente para inducir o mejorar la eficiencia de induccióna pluripotencia . Por ejemplo, en algunas modalidades, los compuestos están en una concentración de por lo menos 0.1 nM, por ejemplo, por lo menos 1, .10, 1000, 10000 o 100000 nM, por ejemplo, entre 0.1 nM y 100000 nM, por ejemplo, entre 1 nM y 10000 nM, por ejemplo, entre 10 nM y 10000 nM. En algunas modalidades, las mezclas están en un recipiente sintético (por ejemplo, un tubo de ensayo, caja Petri, etc.). Asi, en algunas modalidades, las células son células aisladas (no parte de un animal) . En algunas modalidades, las células son aisladas de un animal (humano o no humano) , colocadas en un recipiente, puestas en contacto con uno o más compuestos como se describen en la presente. Las células pueden ser subsecuentemente cultivadas y opcionalmente insertadas de regreso al mismo animal o un animal diferente, opcionalmente después- que las células han sido estimuladas para convertirse en un tipo o linaje de célula particular. Como se explica en la presente, en algunas modalidades, las células comprenden un cásete de expresión para a expresión heteróloga de por lo menos uno o más de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc, un polipéptido de Sox y un polipéptido de lf. En algunas modalidades, las células no incluyen un cásete ' de expresión para expresar cualquiera de los polipéptidos de Oct, Myc, Sox o Klf. Las células con o sin tales casetes de expresión son útiles, por ejemplo, en los métodos de selección como se describe en la presente. Ejemplos de células no pluripotentes incluyen aquellas descritas en la presente, en las que se incluyen pero no limitadas a células de un tejido seleccionado de médula ósea, piel, músculo esqueletal, tejido graso y sangre periférica. Tipos de células ejemplares incluyen pero no están limitados a fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos y células T. La presente invención también provee mezclas (con u opcionalmente sin células) de un agente que inhibe la metilación de H3K9 (en los que se incluyen pero no limitados a BIX-01294) con un compuesto seleccionado de por lo menos uno de un agonista de canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un inhibidor de receptor TGFp/inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de Erk. En algunas modalidades se incluyen el agente y por lo menos un compuesto enlistado anteriormente se encuentra a una concentración como se- describe anteriormente. Tales mezclas son útiles, por ejemplo, como "premezclas" para inducción de pluripotencia enm células, IX. Kits La presente invención también provee kits, por ejemplo, para el uso en inducción o mejorar la eficiencia de inducción de pluripotencia en células. Tales kits pueden comprender uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de un agente que inhibe la metilación de H3 9; un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de la cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un receptor de de ALK5, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de Erk. En algunas modalidades, los kits comprenden 'un agente que inhibe la metilación de H3K9 (en los que se incluyen pero no limitados a BIX-01294) y un segundo compuesto (separado o mezclado con un agente que inhibe la metilación de H3K9) seleccionado de por lo menos uno dé un agonista del canal de Ca tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK, un receptor de TGF /inhibidor de ALK5, un inhibidor de HDAC o un inhibidor de Erk. En algunas modalidades, los kits comprenden además células no pluripotentes . Ejemplos de células no pluripotentes incluyen aquellas descritas en la presente, en las que se incluyen pero no limitadas a células de un tejido seleccionado de médula ósea, piel, músculo esqueletal, tejido graso y sangre periférica. Tipos de células ejemplares incluyen pero no están limitados a fibroblastos, hepatocitos, mioblastos, neuronas, osteoblastos, osteoclastos y células T.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Hacia la identificación de condiciones que pueden reemplazar la transducción viral de factores de transducción oncogénicos (por ejemplo, cMyc y 0ct4 (Hochedlinger, K. et al., Cell 121, 465-477 (2005)) y mejorar la eficiencia de reprogramación, que buscó aprovechar la combinación de dos I procedimientos: uno fue examinar un tipo de célula progeitora definida en base a la idea de que ciertas células progenitoras adultas accesibles pueden expresar endógenamente a cierto nivel algunos de genes requeridos para inducir pluripotencia y/o los sitios de estos genes pueden ser menos silenciados, de tal manera que tales células progenitoras podrían ser reprogramadas más eficientemente y/o con menos manipulaciones genéticas; el otro procedimiento fue seleccionar ' moléculas pequeñas que pueden ser aptas de reemplazar la integración viral del factor de transcripción especifico y/o promover el proceso de reprogramación. Entre varias células madre/progenitoras adultas que son accesibles en diferentes tejidos, se enfocaron inicialmente los esfuerzos en células progenitoras neurales por las siguientes razones: (i) En contraste con el cultivo de fibroblasto primario heterogéneo (por ejemplo, MEF) qué puede contener varios tipos de células madre/progenitoras, las células progenitoras neurales son una población' relativamente definida de células y pueden ser expandidas de manera clonal bajo condiciones químicamente definidas. (ii) Las células progenitoras neurales expresan endógenamente genes de Sox (por ejemplo, Soxl o Sox2), que, .aunque está a un nivel más bajo que la sobreexpresión, podría ser suficiente para generar células iPS. (iii) Células progenitoras neurales o células que expresan el gen de Sox pueden ser aisladas de otros tejidos (Fernández, K. J. L. et al., Nature Cell Biology 6, 1082-1093 (2004); Seaberg, R. . et al., Nature Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004)) y expandidas in vitro. Por consiguiente, las células progenitoras neurales definidas representan un sistema ; modelo excelente para tratar las cuestiones anteriores en el proceso/mecanismo de reprogramación. Para establecer una fuente ilimitada, altamente reproducible y definida de pélulas progenitoras neurales que pueden ser usadas en selección de alto rendimiento, se escogió usar células progenitoras neurales derivadas de mESC que contienen un reportero de GFP-IRES-Puro/GiP reportero bajo el control de elementos regulatorios de 0ct4, puesto que mESC pueden ser cultivados en gran cantidad y su diferenciación a una población homogénea a células progenitoras neurales es bien definida (Conti, L. et al., PLoS Biol. 3, e283 (2005)), también como la actividad de reportero validada (Ying, Q. L. et al., Nature 416, 545-548 (2002)) puede facilitar' la detección de análisis fácil. Las células progenitoras neurales reportero fueron generadas utilizando un protocolo bien establecido mediante diferenciación de los mES'C de 0ct4-GiP cultivadas en monocapa sobre gelatina en un medio químicamente definido/condición de CDM en ausencia de suero y otros factores de crecimiento/citoquina a baja densidad celular por ocho días, seguido de la formación de neurófero y subsecuente paso serial en células individuales en medio de expansión celular neural complementado con 10 ng/ml de bFGF y EGF en monocapa durante seis pasos/24 días. Las células proenitoras neurales resultantes fueron homogéneas por morfología celular y expresión de marcador neural y fueron confirmadas por ser GFP negativas y sensibles a puromicina. Tales células progenitoras neurales depositadas en monocapa en medio de cultivo mESC convencional fueron transducidas con combinaciones de cuatro, tres o dos de los cuatro factores, seguido por tratamiento de las células transducidas con moléculas pequeñas individuales de una colección de fármacos conocidá pequeña en un formato de seis cavidades típico. El tratamiento compuesto y cultivo fueron proseguidos por diez días adicionales antes de que se agregara puromicina. El número de colonias verdes y resistentes a puromicina fue contado en el día 14. En comparación con las células neurales transducidas a solamente cuatro genes como testigo positivo, las condiciones del compuesto que generaron más colonias verdes que las condiciones de un gen solamente correspondiente fueron proyectadas como aciertos primarios.

Para confirmar adicionalmente estas condiciones de acierto primario, se escogió usar un último pasaje de células progenitoras neurales de CNS de ratón (Do, J. et al., Stem Cells 25, 1013-1020 (2007)) que fueron derivadas de cerebro fetal de ratones transgénicos de OG2+ ~/ROSA26+ " (que contienen un reportero de Oct4-GFP) y expandidas en monocapa bajo la ? misma condición de CDM neural como el anterior con 10 ng/ml de bFGF y EGF. Tales células verdaderamente de un tejido no pluripotente estarían desprovistas de preocupaciones de cualquier célula de ES contaminante en el sistema de selección anterior, que es aunque altamente improbable con todos los controles apropiados. Condiciones de cultivo y análisis de reprogramación similares fueron efectuados utilizando las células progenitoras neurales 0G2 excepto que no se usó puromicina y las colonias verdes fueron proyectadas y caracterizadas mediante teñido de Nanog, SSEA1 y ALP.Se encontró que casi todas las colonias verdes que pueden ser indicadas en el día 12-14 pueden ser expandidas a células de iPS estables a largo plazo que son indistinguibles de las mESC clásicas por morfología y expresión del marcador de pluripotencia típicos. Se enfocaron en primer lugar- los esfuerzos de caracterización en dos nuevas condiciones que podrían ser reconfirmadas utilizando las células progenitoras neurales fetales. Justo como se tenía la hipótesis de que ciertas células progenitoras tejido-especificas con expresión endógena de ciertos genes de reprogramación relevantes pueden requerir menos manipulación genética exógena para generar células iPS; se encontró que la transducción viral de solamente 0ct4 y Klf4 con untamente es suficiente para generar células iPS a partir de células progenitoras neurales en 10-14 días. En' tanto que tal eficiencia de reprogramación (1-2 colonias de GFP por 3.5 x •104 células) es más baja que las condiciones con Sox2 adicional y transducción viral de cMyc (8-10 colonias de GFP por 3.5 x 104 células) (Figura 1), es interesante que la cinética de reprogramación por los dos genes solamente (0ct4 y Klf4) no es significativamente más lenta que aquella por los cuatro genes originales. Esto es en contraste con las observaciones recientes que la omisión de cMyc para generar células de iPS a partir de MEF es significativamente más lenta (esto es, 2 semanas adicionales) que la condición que tiene sobreexpresión de'cMyc aún los fibroblastos embriónicos expresan endógenamente cMyc. Más interesantemente, se encontró que una molécula pequeña, BIX01294 (Kubicek, S. et al., Molecular Cell 25, 473-. 481 (2007)) que inhibe específicamente G9a (una histona metiltransferasa para H3K9me2), puede mejorar significativamente la eficiencia de reprogramación a o más alto que el nivel de usar transducción viral de todos los cuatro factores, en tanto que no acortó significativamente la cinética de reprogramación. El evento de reprogramación es analizado comúnmente por la habilidad de identificar las colonias de células iPS, que es influenciada por muchos factores, en los que se incluyen los métodos de cultivo celular, identificación y/o selección de células, también como el tipo de células de entrada, número y eficiencia en cinética de reprogramación. Consecuentemente, un recubrimiento para cualquier gen dado para reprogramación es concerniente con el ajuste específico y depende extensamente de la eficiencia/cinética de reprogramación. A este respecto, esta molécula pequeña individual, BIX01294, reemplazó funcionalmente la transducción viral de cMyc y Sox2 a una gran extensión. Las colonias de células GFP + iPS aparecieron fácilmente 12 días después que las células progenitoras neurales de 0G2 fueron transducidas con retrovirus Oct4/Klf4 y tratadas con BIX01294. El día 14, las células iPS generadas de la transducción viral de Oct4-Klf4 y tratamiento con BIX01294 pueden ser fácilmente expandidas en la condición de cultivo de mESC convencional sobre células alimentadoras de MEF en presencia de LIF sin el requerimiento de un tratamiento de BIX01294 proseguidos. Las células de iPS generadas mediante transducción viral de Oct4/Klf4 y tratamiento con BIX01294 se pueden autorenovar a largo plazo sobre alimentadores de MEF en el medio de cultivo de mESC sin el tratamiento de BIX01294 proseguido. Crecen como colonias compactas y con domo. Estas células de iPS mantienen la morfología de colonias de mESC características, expresan homogéneamente marcadores de pluripotencia típicos en nivel comparable como mESC, en los que se incluyen 0ct4, Nanog, SSEA1 y ALP mediante inmunohistoquímica, histoteñido y análisis de RT-PCR. Además, tales células de iPS, que se han hecho pasar serialmenté en 10 pasajes, se pueden diferenciar efectivamente en neuronas características (ß???-tubulina) , cardiomiocitos de latido (troponina cardiaca) y células pancreáticas o hepáticas (Pdxl o Albúmina) , derivados de las tres capas germinales primarias bajo métodos de cuerpo de embrión estándar o métodos de diferenciación directos. Además, más importantemente, tales células de iPS se pueden incorporar eficientemente al ICM de un blastocito después de agregación con un embrión de 8 células, conducen a un quimerismo de alto grado después que los embriones agregados fueron trasplantados en ratones y contribuyen a la línea germinal in vivo. Estas caracterizaciones in vitro e in vivo confirman que las células de iPS generadas mediante transduccion viral de Oct4 y Klf4 con tratamientos de BIX01294 simultáneos son morfológica, funcional y mediante expresión de marcador de pluripotencia · típicos indistinguibles de las células de iPS de cuatro factores adicionales de los mESC clásicos. Una condición es que si la expresión de 0ct4, Sox2, Klf4 y cMyc, sin consideración de si es endógeno o exógenamente, sería un prerrequisito para generar células iPS.

Interesantemente, estudios de reprogramación recientes en la generación de células de iPS humanas a partir de fibroblastos han demostrado que en tanto la expresión exógena de Klf4 y cMyc son funcionalmente intercambiables con Nanog y Lin28, la expresión de 0ct4 y Sox2 parece ser requerida ya que hasta ahora de todos los estudios de células de iPS publicados. Interesantemente, se enconrtó que la transducción viral de Klf4, Sox2 y cMyc con tratamiento de BIX01294 simultáneo en ausencia de expresión de 0ct4 puede también generar células iPS (Figura 2) mientras que la transducción viral de tales tres factores/ SM solos falló para producir ninguna colonia de células de iPS bajo condiciones de nuestro análisis. Similarmente, tales células de iPS generadas por células KS -BIX01294 pueden ser expandidas establemente y autorrenovadas a largo plazo sobre alimentadores de MEF en las condiciones de cultivo de mESC convencionales en pasos sin BIX01294, mantienen las morfologías de mESC características, expresan homogéneamente marcadores de pluripotencia típicos, en los que se incluyen ALP, 0ct4, Nanog y SSEA1 y se diferencian a células en las tres capas germinales in vitro. Se debe notar que la eficiencia de reprogramación en ausencia de expresión de Oct4 I es relativamente baja. Finalmente, se observó que la aplicación de un inhibidor de molécula pequeña específico de MEK, PD0325901, a una etapa posterior de la reprogramación (por ejemplo, después de la activación de Oct4-GFP) puede servir como una estrategia de selección excelente para generar células iPS. Debido a la eficiencia de reprogramación muy baja, las células de iPS son seleccionadas comúnmente al utilizar el reportero (por ejemplo, Neo/Puro o GFP) que está bajo el control de los elementos regulatorios de un marcador de pluripotencia que utiliza1 lineas de células somáticas modificadas genéticamente o proyectadas manualmente en base a la morfología celular. En tanto que el i último método aplicable a las células sin modificar genéticamente es mejor apropiado para la aplicación técnica final de células de iPS, es mucho más tedioso y una técnica menos confiable que requiere comúnmente proyección y propagación en varios pasos de muchas columnas, solamente una fracción pequeña de la cual se convertiría en células de iPS verdaderas eficientemente. Esto es parcialmente debido a que el porcentaje es grande de colonias que se miran similarmente pueden ser células parcialmente reprogramadas y/o simplemente células transformadas, que crecen rápidamente y 1 pueden interferir con el crecimiento y reprogramación de células de iPS. Consecuentemente, al tener una estrategia de selección alternativa para células sin modificar ' genéticamente sería altamente deseable. Se encontró que PD0325901 inhibe el crecimiento de células sin iPS en tanto que promueve efectivamente el crecimiento y reprogramación estable de células de iPS, conduciendo a colonias más grandes y más homogéneas de células de iPS. Esta observación podría ser parcialmente debida al mecanismo que la actividad de MEK es requerido para el avance del ciclo celular de células somáticas, en tanto que los mESC carecen de tal restricción para el crecimiento y la inhibición de MEK también inhiben la diferenciación de mESC ' (contribuyendo a la estabilización adicional del estado de célula de iPS) . Los resultados presentados en la presente tienen un número de implicaciones importantes. (1) El nivel de expresión endógeno más bajo (que la sobreexpresión) de genes críticos requeridos para la reprogramación de células somáticas (progenitor tejido-específica) puede ser suficiente para reemplazar la expresión genética endógena correspondiente vía transducción viral para generar células de iPS. Esto apunta a una estrategia alternativa de generar células de iPS a partir células somáticas utilizando menos manipulación genética al aprovechar células prácticamente accesibles que expresan endógenamente ciertos genes de reprogramación relevantes vía una especificidad de tejido intrínseca y/o manipulación de cultivo ex vivo. (2) Esta es una demostración de prueba de principio de que las moléculas pequeas pueden ser identificadas ' a partir de selecciones a base de células diseñados racionalmente para reemplazar funcionalmente la transducción viral de ciertos factores de transcripción, mejorar la eficiencia de reprogramación o servir como condición de selección para generar células de iPS. No solamente puede tal procedimiento farmacológico reemplazar la manipulación genética especifica que reduce sustancialmente riesgos asociados con la inserción de oncógenos (por ejemplo, cMyc y 0ct4) y mutagénesis insercional, si no que también abre la posibilidad de permitir un proceso de reprogramación controlado de manera precisa y altamente eficiente por moléculas pequeñas definidas. Esto es especialmente interesante para estudiar el mecanismo molecular de reprogramación, que actualmente es extensamente intratable debido a su eficiencia muy baja y cinética lenta. (3) En contraste con el procedimiento de ganancia de función para generar células de iPS, el uso altamente efectivo de aquellos inhibidores de molécula pequeña específicos sugiere ¡que la pérdida de función de genes específicos puede por lo menos ser igualmente importante y efectivo para generar células de iPS. Más importantemente, la función de BIX01294 define un mecanismo/objetivo epigenético específico, esto es, inhibición de H3 9me2 moderado por G9a para generar células de iPS. Este es consistente con el hallazgo previo . de que la metilación de H3K9 represiva está asociada con la inactivación de 0ct4 durante la diferenciación (Feldman, N. et al., Nature Cell Biology 8, 188-194 (2006)) y metilación de histona lisina, aunque robusta, es dinámica y regulada por HMTasas y lisina desmetilasas . BIX01294 puede funcionar para facilitar el desplazamiento del equilibrio epigenético de un estado silenciado de 0ct4 a una transcripción activa. (4) Ejemplificado por usar el inhibidor de EK para la selección fácil de células de iPS, el aprovechamiento de las diferencias entre células somáticas y ESC por moléculas pequeñas representa una estrategia alternativa/atractiva para seleccionar células de iPS. Finalmente, es concebible que las estrategias y moléculas pequeñas reportadas en la presente puedan ser exploradas adicionalmente por procedimientos mejorados y entendimiento mecánico mejor para generar células iPS y combinado con moléculas pequeñas adicionales (que puedan reemplazar la función de factores de transcripción transducidos restantes y mejorar la reprogramación) también como otros métodos no genéticos (por ejemplo, transducción de proteina) para permitir, finalmente la generación de células de iPS en alta eficiencia en una condición completamente definida químicamente sin ninguna modificación genética.

Métodos Cultivo de célula progenitora neural. Células progenitoras neurales fueron derivadas de mESC o cerebros fetales de ratón de acuerdo con el protocolo reportado por Conti et al. (Conti, L. et al., PLoS Biol. 3, e283 (2005)). Brevemente, mESC fueron depositadas en un plato recubierto con gelatina al 0.1% a 1 x 104 células/cm2 en el medio de inducción neural (DMEM al 50%/medio basal F12, medio neurobasal al 50%, 0.5 x N2, 0.5 x B27, Glutamax IX, 50 ug/ml de BSA) y diferenciadas por 7-8 días. Las rosetas neurales formadas fueron luego tripsinizadas a células individuales y redepositadas a un disco de Anexión Ultra-Low (Corning) para formar neuroesferas en el medio de expansión de célula progenitora neural (DMEM/F12, N2 IX, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de EGF, 50 ug/ml de BSA) . Después de tres días en suspensión, las neuroesferas fueron reanexadas a un disco recubierto de gelatina y diferenciadas adicionalmente por 4-6 días antes de gue hicieran pasar adicionalmente en células individuales y cultivadas en monocapas en discos recubiertos de gelatina en el medio de expansión de célula progenitora neural por más de 5-6 pasos . . · Las neuroesferas de cerebros de fetos heterócigos ROSA26/OG2 de 12.5 a 16.5 dpc fueron generados como se describe previamente (Do, J. T. et al., Stem Cells 25, 1013-1020 (2007)) . Brevemente, la corteza fue disectada, disociada enzimáticamente y se hizo pasar a través de una malla de náilon de 70 mieras (Falcon; Franklin Lakes, NJ) . Las células neurales fueron purificadas adicionalmente mediante centrifugación en sacarosa 0.9 M en HBSS 0.5x a 750 g durante 10 minutos y en BSA al 4% en solución de EBSS a 200 g por 7 minutos. Tales células fueron cultivadas adicionalmente en suspensión para formar neuroesferas y subsecuentemente se hicieron pasar serialmente en monocapas sobre discos recubiertos con gelatina en el medio de expansión de célula progenitora neural como se describe anteriormente. Los experimentos en animales fueron aprobados y efectuados de acuerdo con las Directrices de Protección Animal del Gobierno de la Sociedad Max Planck, Alemania. Transducción de retrovirus . Los cADN murinos para 0ct4, Klf4, Sox2 y c-Myc fueron clonados al vector retroviral pMSCV y verificados mediante secuenciación . Los vectores retrovirales a base de pMX fueron obtenidos de Addgene . La producción de transducción de virus se efectuaron como se describe en 2-3. Inducción de célula de iPS a partir de células progenitoras neurales . Células progenitoras neurales de ratón 0G2 mESC derivadas o primarias fueron depositadas sobre placas de seis cavidades recubiertas con Matrigel (1:50, BD Biosciences) a 3.5 x 104 células/cavidad en el medio de expansión de célula progenitora neural. Después de un dia, estas células fueron transducidas con retrovirus de la noche a la mañana y el medio fue cambiado al medio de cultivo de mESC [DMEM, FBS al 5%, KSR al 10%/ aminoácidos no esenciales lx (Gibco), L-glutaminá 2 mM (Gibco) , ß-mercaptoetanol 0.1 mM (Gibco) y 103 unidades/ml de LIF (Chemicon) ] con o sin BIX01294 (0.5-1 µ?) . Las colonias de células de iPS GFP-po^sitivás aparecieron después de 9-14 días y fueron proyectadas y expandidas en células alimentadas con MEF con el medio de cultivo de mESC.

Análisis de caracterización. El teñido de ALP fue efectuado como se instruye por el Kit de Detección de Fosfatasa Alcalina (Chemicon) . Las células se fijaron en paraformaldehido al 4%, lavadas tres veces por PBS y luego incubadas en PBS que contiene Tritón X-100 al 0.3% (Sigma) y suero de burro normal al 10% (Jackson ImmunoResearch) por 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron luego incubadas con anticuerpo primario durante toda la noche a 4o C: anticuerpo anti-Oct4 de ratón, anticuerpo anti-SSEAl de ratón (1:200, Santa Cruz), anticuerpo anti-Sox2 de conejo (1:200, Chemicon), anticuerpo anti-Nanog de conejo (AbCam) , anti-Pdxl de conejo (1:200, del Doctor C. Wright) , anticuerpo anti-pIII-tubulina (1:500, Covance) , troponina T anticardiaca de ratón (1:200, . DSHB) , anticuerpo anti-albúmina de conejo (DAKO) . Después del lavado, las células fueron incubadas adicionalmente con anticuerpos secundarios: IgG anti-ratón de burro Alexa Fluro 555 o IgG anti-conejo de burro Alexa Fluro 555 (1:500, Invitrogen) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los núcleos fueron detectados mediante teñido de DXAPI (Sigma) . Las imágenes fueron capturadas mediante el dispositivo de TE2000-U de ¡Nikon. Agregación de células de iPS con embriones de zona libre. Las células de iPS fueron agregadas con embriones de etaa de ocho células post-compactadas desnudas para obtener quimeras de agregados. Los embriones de ocho células (B6C3F1) lavados de hembras a 2.5 dpc fueron cultivadas en microgotas en medio de KSO (FCS al 10%) bajo -aceite mineral. Grupos de células de iPS (10-20 células) después de tratamiento breve de tripsina fueron escogidas y transferidas a microgotas que contienen embriones de ocho células de zona libre. Los embriones de ocho células agregados con células de iPS fueron cultivados durante toda la noche a 17° C, C02 al 5%. Los blastocistos agregados desarrollados de la etapa de' ocho células fueron transferidos a un cuerno uterino de un receptor pseudoembarazado de 2.5 dpc.

Ejemplo 2 Células somáticas pueden ser inducidas a células madre pluripotentes (iPSC) con una combinación de cuatro factores de transcripción, Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc o Oct4/Sox2/Nanog/LIN28. Esto provee una plataforma habilitadora para obtener células especificas del paciente para varias aplicaciones terapéuticas y de investigación. Sin embargo, varios problemas permanecen por este procedimiento para ser terapéuticamente relevantes debido a deficiencias asociadas con eficiencia e integración de genoma viral. Como se explica anteriormente, células progenitoras neurales (NPC) translúcidas con Oct4/Klf4 pueden ser reprogramadas a iPSC. Sin embargo, las NPC expresan Sox2 endógenamente, facilitando posiblemente la reprogramación en ausencia de Sox2 exógeno. En este estudio, se identificó una combinación de moléculas pequeñas, BIX01294 y BAyK8644, que permite la reprogramación de fibroblastos embriónicos de ratón transducidos de Oct4/Klf4 que no expresan endógenamente los factores esenciales para reprogramación. Este estudio demuestra que las moléculas pequeñas identificadas por medio de una selección fenotipica pueden compensar la transducción viral de factores críticos tales como Sox2 y mejorar la eficiencia de reprogramación. Este ejemplo tiene como objetivo determinar si. las moléculas pequeñas pueden reemplazar una transducción viral específica para obtener iPSC a partir de un linaje celular general, en el cual ninguno de los TF considerados esenciales para reprogramación, 0ct4, Sox2 y Klf4 son expresados. De aquí, se usaron fibroblastos embriónicos de ratón (MEF) . El hallazgo de una molécula pequeña que pudiera reemplazar uno de estos TF en la inducción de reprogramación de MEF podría conducir a la identificación de rutas generales involucradas en este proceso. Tal estrategia química podría ser más propensa para aplicación terapéutica. Consecuentemente, se seleccionó una colección de fármacos conocidos para identificar' moléculas pequeñas que pueden permitir la generación de iPSC a partir de MEF transducidos con OK y así, podrían compensar la carencia de sobreexpresión de Sox2. Por medio de las diferentes selecciones efectuadas se identificó que una combinación de BIX con Bayk8644 (Bayk) , un agonista de calcio de canal L (Schramm, M. et al, Nature, 303:535-537 (1983)) fue uno de los más efectivos. Bayk fue de interés debido a que ejerce su efecto corriente arriba en rutas de señalización celular y no provoca directamente modificaciones epigenéticas . Es probable que este tipo de molécula, tal como Bayk o activadores de la ruta de señalización de Wnt (Marson, A. et al., Cell Stem Cell, 3:132-135 (2008)), pueda ser aprovechada para inducir reprogramación de una manera más específica que las moléculas que actúan directamente a nivel epigenético provocando modificación de ADN o histona. Algunos de estos modificadores epigenéticos ya han mostrado facilitar el proceso de reprogramación, tal como BIX (Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008)),' ácido valproico (Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol, 26:795-797 (2008)) y 5' azacitidina (Mikkelsen, T. et al., Nature, 454:49-55 (2008) ) . Este estudio presente demuestra que moléculas pequeñas identificadas por medio de una selección fenotipica puede ser usada para compensar efectivamente la transducción viral de otro TF de iPSC crítico, Sox, que no es expresado endógenamente en fibroblastos. Además, destaca la contribución importante de que las selecciones de molécula pequeña que inevitablemente hacen el descubrimiento de nuevos objetivos moleculares en mecanismos involucrados en procesos biológicos complicados tales como reprogramación.

Resultados La selección fenotipica conduce al descubrimiento de moléculas pequeñas que permiten la reprogramación de MEF cuando son transducidas con solamente dos TF MEF sin modificar derivados de embriones E13-14 de los 129 ratones fueron usados para la selección inicial. Los MEF fueron depositados sobre matrigel a 3.5xl04 células/cavidad de una placa de 6 cavidades y transducidos con OK (vectores retrovirales que expresan 0ct4 y Klf4) solo. En el transcurso de 14-21 días, las células tratadas fueron determinadas en cuanto a la presión de colonias que tenían la morfología de colonia dé células madre embriónica característica (ESC) y fueron positivas en cuanto al marcador de pluripotencia fosfatasa alcalina (ALP) . Tales células O -transducidas generaron solamente unas pocas colonias no compactas péqueñas que fueron débilmente positivas para expresión de ALP. Estas colonias aparecieron inicialmente en el transcurso de 21 días después de transducción viral y fueron difíciles de expandir.

Por consiguiente, tal sistema de análisis ofreció un fondo limpio para la identificación de moléculas pequeñas que tienen actividad que induce reprogramación deseable. Utilizando este sistema, compuestos de una biblioteca de alrededor dé 2000 moléculas pequeñas conocidas (véanse procedimientos experimentales a continuación) fueron seleccionadas y fueron identificadas como aciertos cuando indujeron la aparición de colonias de ESC que fueron fuertemente positivas para ALP en el transcurso de 14-21 días después del tratamiento! Este método a base de imagen proporcionó una determinación más exacta de reprogramación en comparación con análisis a base de reportero homogéneo. BIX pareció obtener el efecto más fuerte con inducción reproducible de más de una-dos colonias semejantes a ESC compactas con alta expresión de ALP. Se observó que cuando los MEF fueron tratados con BIX después de la transducción viral de OK, colonias compactas con fuerte expresión de ALP podrían ser detectadas fácilmente en aproximadamente 14-21 días. Estas células fueron también positivas en cuanto a la .expresión de Nanog, Oct4 y SSEA-1. Este resultado, obtenido con un tipo de célula más general, que no expresa endógenamente ninguno de los tres genes de reprogramación esenciales valida además nuestra observación . previa de que BIX tiene fuerte actividad de inducción de reprogramación y activación de la H Tasa 60a puede facilitar la reprogramación (Shi, Y. et al., Cell Stein Cell, 2:525-528 (2008)). Sin embargo, la eficiencia de reprogramación en MEF transducidos con OK y tratados con BIX fue todavía baja, alrededor de dos colonias/3.5xl04 células, en comparación con la reprogramación inducida por cuatro factores de MEF o la reprogramación de OK/BIX NPC- (Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008)). Por consiguiente, se llevó a cabo una segunda selección utilizando un protocolo similar, pero en donde BIX fue agregado al medio basal después de la transducción viral de OK. Esto proporcionó una plataforma más permisiva para identificar nuevas moléculas pequeñas que podría mejorar adicionalmente la eficiencia de reprogramación. Más importantemente, esta segunda selección podría facilitar el descubrimiento de moléculas pequeñas que impactan la reprogramación de una manera más específica, por ejemplo, al actuar sobre rutas de transducción de señal en lugar dé sobre enzimas modificadoras de histona o ADN . En esta segunda selección, otra vez se determinó la biblioteca de alrededor de 2000 moléculas pequeñas conocidas (véanse procedimientos experimentales) y se confirmaron dos compuestos que fueron aptos de actuar de manera sinergística con BIX para mejorar la reprogramación en base a los criterios de la selección. Un ejemplo es RG108, un inhibidor de ADN metiltransferasa (Brueckner, B. et al., Cáncer Res, 65:6305-6311 (2005)) que mejoró la reprogramación de MEF transducido con OK en presencia de BIX (Figura 3). Sin embargo, similarmente a BIX, se sabe que RG108 impacta las células a un nivel epigenético general1 y otro inhibidor de ADN metiltransferas , 5-azacitidina ya ha mostrado mejorar la reprogramación (Mikkelsen, T. S. et al., Nature, 454:49-55 (2008)). Por consiguiente, RG108 no fue proseguido adicionalmente para este estudio. En lugar de eso, se enfocó nuestra caracterización fenotípica y funcional en otra molécula pequeña que fue identificada en la segunda selección, BayK, un agonista de canal de calcio L. Esta molécula pequeña, que mostró el efecto más fuerte en la selección aparte de los modificadores de ADN/histona conocidos, fue estudiada adicionalmente debido a que no tiene ninguna actividad de reprogramación observable en MEF OK-transducidos en ausencia de BIX y no se sabe que impacte las células directamente a nivel epigenético, sino más bien a nivel de transducción de señal de célula. Por consiguiente BayK podría jugar un papel más específico en el proceso de reprogramación. Cuando 129 MEF fueron transducidos con retrovirus vacíos (testigo negativo) ; no se observaron colonias. Cuando 129 MEF fueron transducidos con OK' sin moléculas pequeñas; pocas colonias aplanadas pequeñas con débil expresión de ALP se presentaron. Colonias de iPSC semejantes a ESC fueron observadas 14-21 días desp és de que 129 MEF fueron transducidos con OK y tratados con BIX/BayK; estas colonias semejantes a ESC exhibieron fuerte expresión de ALP. Cuando MEF OK-transducidos fueron tratados con BIX en combinación con BayK, un incremento significativo en el número de colonias de ALP+ que se asemejan estrechamente a la morfología de mESC podrían ser observadas (~7 colonias) en comparación con MEF OK-transducidos tratados con BIX solamente (~2 colonias) . La caracterización adicional de estas colonias de iPSC primarias demostró que fueron positivas para marcadores de pluripotencia típicos tales como 0ct4, Sox2, Nanog y SSEA1 como se determina mediante inmunofluorescencia .

IPSC obtenidas a partir de MEF transducidos con OK y tratados con BIX/BayK tienen propiedades de pluripotencia características de mESC Para confirmar y caracterizar adicionalmente .que la transduccion de OK y tratamiento de BIX/BayK puede inducir los MEF a convertirse en iPSC, se usaron MEF primarios derivados de ratones transgénicos 0G2+ ~/ROSA26+ " (0G2) que contienen un reportero de 0ct4-GFP (Do, · J.T. and Scholer, H:R., Stem Cells, 22:941-949 (2004)). Una vez reprogramadas , estas células podrían luego ser usadas para determinar convenientemente competencia de quimera y línea germinal. Similarmente a los MEF 129, MEF de 0G2 transducidos con OK podrían generar iPSC cuando son tratados con una combinación de BayK/BIX (0K2B iPSCs) (Figura 3) . Colonias de iPSC GFP+ podrían ser detectadas primero en- el día 14-21 después de transduccion viral y tratamiento del compuesto. Cuando los MEF de 0G2 fueron transducidos con OK y no tratados con ningún compuesto, solamente unas pocas colonias pequeñas aparecieron por un promedio de 0.5 ± 0.7 colonias por 3.5xl04 células. Estas colonias fueron difíciles al paso y por consiguiente no fueron estudiadas adicionalmente. El tratamiento de MEF de OG2 0K-transducidos con BIX solo permitió rápida y reproduciblemente la reprogramación en comparación con OK solo, con 2.5 ± 0.7 colonias por 3.5xl04 células. Hubo una mejora significativa adicional en la eficiencia de reprogramac'ión cuando los MEF de 0G2 transducidos con OK fueron tratados con la combinación de BIX (2 µ?) y BayK (2 µ?) , en donde se observaron 7.7 ± 1.5 colonias por 3.5xl04 células (Figura 3) . El tratamiento de MEF de 0G2 OK-transducidos con BayK soló en ausencia de BIX, no incrementó la eficiencia de reprogramación por encima del testigo de MEF OK-transducido (datos no mostrados) . Las colonias de 0K2B fueron proyectadas y expandidas previamente sobre células' alimentadoras de MEF irradiadas en las condiciones de cultivo de mESC convencionales en ausencia de moléculas pequeñas por más de 20 pasos. El teñido y/o T-PCR (Figura 4A). mostró que estas iPSC de 0K2B GFP+ expresan marcadores de pluripotencia típicos, en los que se incluyen ALP, Nanog, Sox2, Oct4, SSEA1, c-Myc, eRas, Esgl, Ecatl, and Fgf4. El análisis de RT-PCR también demostró que las iPSC de OK32B expresaron 0ct4 y Klf4 endógeno (Figura 4A) . Los análisis de secuenciación genómica de bisulfito del promotor de Nanog revelaron que es desmetilado en iPSC de OK2B similarmente al testigo de -mESC (Rl), en tanto que el promotor de Nanog1 de MEF fue hipermetilado (Figura 4B) . Este resultado sugiere adicionalmente una reactivación del programa de transcripción de célula madre en estas iPSC de OK2B. Además, el análisis de transcriptoma demostró el perfil de expresión de iPSC de 0K2B es extensamente similar al de los mESC con · un valor de correlación de Pearson de 0.96, en tanto que es significativamente diferente al perfil de MEF con un valor de correlación de Pearson de 0.84 tal como es ejemplificado en el análisis de agrupamiento . Por comparación de transcriptoma de 0K2B con células de mES y células de MEF, el análisis de transcriptoma sé llevó a cabo. El ARN fue extraído de células de iPS OK2B en el paso 13 utilizando el mini kit de RNAeasy de Qiagen. Datos de expresión de ARN para iPSC OK2B fueron generados a partir de poli ARN A utilizando arreglos de GeneChip Mouse Genome 430 2.0 i Arrays (Affymetrix) . Los datos de expresión para células MEF y células mES fueron obtenidos del sitio web de Gene Expression Omnibus (GEO http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/. Números de registro de datos de células mES: GSM 198062. GSM198063, y GSM198064. Número de regristo de datos de células de MEF: GSM198070 y GSM 198072. El pre-procesamiento, normalización (GC-RMA) y agrupamiento jerárquico fueron efectuados utilizando dChip (http://biosunl.harvard.edu/complab/dchip/; (Distance metric xorrelation (Pearson); linkage method: centroid; gene ordering: by cluster tightness) . Valor p para iPSC de 0K2B contra células MEF: 0.84; iPSC de OK2B contra células mES: 0.96. Valores p fueron obtenidos utilizando una prueba de correlación de Pearson.

Las iPSC de 0K2B se diferencian a células de todas las capas tres germinales y contribuyen a la transmisión de; linea germinal . Las iPSC de 0K2B podrían eficientemente formar cuerpos embriónicos (EB) en suspensión, que se podrían diferenciar a células endodérmicas (Albumin and Pdxl, células mesodérmicas/células de músculo cardiaco (CT3) y células ectodérmicas/neuronas ( ???-tubulin, Tujl), derivados de las tres capas germinales primarias. Además, las iPSC de 0K2B podrían incorporar eficientemente a la masa celular interna de blastocistos en seguida de la agregación por un embrión de 8 células y conducir a quimerismo con contribución de línea general in vivo después que los embriones agregados fueron transplantados a ratones pseudo-embarazados . Además, el apareamiento de una progenie macho adulta obtenida de estos blastocistos con un ratón tipo silvestre CD1 hembra condujo a la producción de progenie LacZ+, tres de los cuales mostraron gónadas de 0ct4-GFP+ validando adicionalmente que estas iPSC podrían contribuir a la transmisión de línea germinal. Estas caracterizaciones in vitro e in vivo confirman la transducción retroviral con solamente dos genes, OK y en conjunción con tratamiento de BIX/BayK son suficientes para reprogramar los EF a iPSC, que son fenotípicamente y funcionalmente similares a las mESC clásicas.

Discusión Los estudios presentados en la presente proveen una demostración de prueba de principio de que las moléculas pequeñas pueden ser identificadas de selecciones fenotipicas diseñadas racionalmente para reemplazar funcionalmente la transducción viral de ciertos TF también como mejorar la eficiencia de reprogramación en la generación de iPSC a partir de un tipo de célula general, como MEF. Tal procedimiento químico para la generación de iPSC, ofrece un control más preciso y temporal del objetivo/proceso sería más ventajoso con respecto a la manipulación genética con oncógenos que puede también introducir alteraciones genómicas intersionales peligrosas difíciles de detectar. Estrategias similares son usadas para encontrar moléculas pequeñas adicionales que pueden permitir finalmente la reprogramación de células linaje- ' restringidas a estado pluripotente o multipotente en una condición completamente detenida químicamente. BlX fue originalmente identificado y caracterizado como inhibidor específico para HMTasa G9a (Kubicek, S. et al., Mol Cell, 25:473-481 (2007)) . Ha mostrado reducir los niveles de H3K9me2 a genes objetivo G9a (Feldman, N. et al., Nat Cell Biol, 8: 188-194 (2006)) . Interesantemente, la metilación de H3K9 de histona moderada por G9a y la heterocromatinización representan un mecanismo altamente específico para silenciamiento epigenético de genes embriónicos tales como Oct4 and Rexl (Feldman, N . et al., Nat Cell Biol, 8: 188-194 (2006)). Además, también se demostró que el bloqueo de G9a. puede ayudar en la reprogramación a base de fusión de células neuronales adultas (Ma, D.K. et al., Stem Cells, 26:2131-2141 (2008)).' Es por consiguiente comprensible que se observó previamente que BIX puede facilitar la generación de iPSC a partir de NPc ya sea con OK o Klf4/Sox2/c-Myc (Shi, Y. et al., Cell Stem1 Cell, 2:525-528 (2008)), sugiriendo que pueden compesar la expresión exógena de Sox2 o Oct4. Sin embargo, NPC ya expresan niveles significativos de Sox2, lo que podría provocar que¡ estas células sean más susceptibles a reprogramación en las condiciones mencionadas anteriormente. El estudio presente tuvo como objetivo identificar moléculas pequeñas que pueden permitir la reprogramación de MEF que no expresan ninguno de los TF considerados necesarios para reprogramación. Fue fortuito que se identificó BIX en ambas de las selecciones de NPC y MEF y se confirmó adicionalmente que esta molécula tiene un papel al aplicar y mejorar la generación de iPSC a pa tir de células somáticas. Dado el mecanismo de acción caracterizado de BIX, los estudios identificaron potencialmente un 'objetivo molecular cuya pérdida de función vía inhibición farmacológica es suficiente para compensar la ganancia de función de un gen de reprogramación de iPSC esencial. Enlaza mecánicamente además un proceso epigenético específico, inhibición de H3K9me2 G9a-moderado, a la generación de iPSC. BIX pueden funcionar para facilitar el desplazamiento del equilibrio epigenético desde un estado silenciado de genes de pluripotencia a un estado de transcripción activo. Obviamente, la combinación de BIX con otras moléculas pequeñas modificadoras de cromatina, que tienen diferentes objetivos y mecanismos de acción, tales como RG108, podrían ser aprovechadas para una mejor reprogramación. Por otra parte, nuestra observación de que BayK con una actividad caracterizada como agonista de canal de calcio tipo L específico (Schramm, M. et al., Nature, 303:535-537. (1983)), mejora la eficiencia de reprogramación es intrigante. Se sabe que los canales de calcio tipo L moderan procesos intracelulares en diferentes tejidos tales como regulación de presión sanguínea, contractividad de músculo liso, secreción de insulina, desarrollo cardiaco, etc. (Tosti, E., Repród Biol Endocrinol, 4:26 (2006)). Además, la activación de canales de calcio tipo L por diferentes agonistas, en los que se incluyen BayK han mostrado inducir señalización celular por medio de activación de CREB, liberación de Ca2+ de retículo sarcoplásmico y cambio en actividad de cAMP. Más importantemente, algunos reporteros sugieren que el calcio podría actuar un papel en el control de proliferación de células de mES (Heo, J.S. et al., Am J Physiol Cell Physiol, 290:C123-133 (2006)) . Sin embargo, en nuestras manos, el tratamiento de células mES con BayK 2µ? solo o en combinación con BIX ?µ? no condujo a un cambio en proliferación (Figura 5) . Además, el tratamiento de MEF de 0G2 con BayK 2µ? o en combinación con BIX ?µ? no induce la expresión de Sox2 (Figura 6) . Obviamente, más trabajo necesita ser efectuado para disectar el mecanismo preciso mediante el cual BayK impacta el proceso de reprogramación. Sin embargo, es interesante encontrar que una molécula pequeña con actividad en rutas de señalización que no ha sido enlazada previamente a reprogramación puede mejorar significativamente su eficiencia. Hasta ahora, si la primera molécula pequeña de este tipo, aparte de la proteina de Wnt3 protein (Marson, A. et al., Cell Stem Cell, 3:132-135 (2008)), muestra un efecto en la reprogramación sin actuar directamente sobre modificadores de cromatina. Ya que, a la fecha, la mayoría de las otras moléculas pequeñas encontradas que impactan la reprogramación parecen modificar directamente el estatus epigenético de la célula: esto es, BIX (Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008)) , ácido valproico (Huangfu, D. - et al., Nat Biotechnol, 26:795-797 (2008)) y 5 ' azacytidina (Mikkelsen, T.S. et al, Nature, 454:49-55 (2008)). Importantemente, BayK parace tener varias características importantes que serían finalmente deseables para una molécula terapéuticamente relevante para la reprogramación in vivo y/o regeneración. El hecho de que no actúa/reprograma por sí mismo, sino que necesita la presencia de BIX pára ejercer su efecto sugiere que las células que ya están sufriendo una forma de reprogramación, quizás provocada por lesión, podría ser más susceptible a este efecto. Esto podría permitir reprogramar finalmente la célula objetivo de una manera más específica, sin impactar células saludables sistémicamente, como los modificadores epigenéticos directos podrían. · En resumen, se han identificado condiciones de molécula pequeña definida, esto es BIX en combinaciones de BIX/BayK o BIX/RG108, que pueden permitir mejorar la reprogramación de fibroblastos a iPSC en conjunción con la transduccion de solamente de dos TF: 0ct4 y Klf4. Este estudio confirma adicionalmente la utilidad de un procedimiento de selección fenotípico para identificar moléculas pequeñas que pueden compensar efectivamente la transduccion de un TF de iPSC esencial, tal como Sox2 en este estudio y Oct4 como se reporta previamente (Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008)). Finalmente, las selecciones de molécula pequeña fenotípicos pueden conducir a la identificación de una molécula pequeña que se convertirá en herramientas poderosas para proveernos con nuevas revelaciones al proceso de reprogramación y pueden finalmente ser útiles para la biología de células madre in vivo y terapia.

Procedimientos experimentales Derivación de MEF MEF 129S2/SvPasCrlf o ROSA26+ "/OG2+/" fueron derivados de acuerdo con el protocolo reportado en el sitio web del Instituto de Investigación WiCell: "Introduction to human embryonic stem cell culture methods". Los experimentos en animales se efectuaron con las directrices de protección de animales del Instituto Max Planck para Investigación Biomolecular, Alemania.

Transducción de re ro irus y compuestos Vectores rétrovirales a base de pMX para 0ct4 > Klf4, c-Myc and Sox2 de ratón fueron obtenidos de Addgene (Cambridge, MA) . La producción viral y proceso de transducción se efectuó como se describe (Takahashi, K. et al., Cell, 131:861-872 (2007)). La síntesis y plena caracterización del compuesto BIX-01294 fue como se describe previamente (Kubicek, S. et al., Mol Cell, 25 ' :473-481 (2007)) y Bayk8644 fue comprado de EMD/Calbiochem Biochemical (San Diego, CA) .

Selección en cuanto a la generación de iPSC a partir de MFE Para las selecciones primarias y* secundarias, se uso una colección de compuestos conocidos. Esta colección estaba compuesta de aproximadamente 2000 moléculas bioactivas conocidas que están disponibles comercialmente, en los que se incluyen fármacos aprobados por la FDA, inhibidores y activadores conocidos de enzimas caracterizadas (en las que se incluyen de colección de LOPAC de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) , Biblioteca Activa Conocida de BIOMOL (Plymouth Meeting, PA) y compuestos conocidos no traslapantes de EMD Calbiochem (San Diego, CA) ) . : Los MEF primarios 129S2/SvPasCrlf (selección primaria) o ROSA26+ ~ 70G2+ _ (selección secundaria) fueron depositados sobre discos recubiertos con atrigel (1:50; BD Biosciences, Bedford, MA) a una densidad de 3.5 x 104 células por cavidad de una placa de 6 cavidades. Veinticuatro horas más tarde, estas células fueron transducidas durante toda noche con retrovirus definidos a 37°C, 5% de C02. Doce a catorce horas más tarde, el medio sobre las células transducidas fue cambiado al medio de mESC [DMEM de bloqueo, ES al 10$-FBS cualificado, reemplazo de suero de bloqueo al 10%, 1, Glutamax al 1%, aminoá.cidos no esenciales al 1%, penicilina/estreptomicina, ß-mercaptoetanol 0.1 mM, 1% de EmbryoMax ESC nucleósidos calificados (Millipore, Temecula, CA) , y 103 U/ml de LIF (Millipore)] (todos los productos fueron de Invitrogen, Carlsbad, CA, excepto donde se menciona) . En el mismo día, moléculas pequeñas individuales de nuestra colección de fármacos conocidos fueron agregadas a las células a un intervalo de entre 0.5 y 2 µ?. El tratamiento del compuesto fue procedido por 10-14 días; las células fueron fijadas y teñidas en el día 14-21 utilizando un kit de detección de ALP estándar (Millipore) . Para la segunda selección, se agregó BIX : ?µ? al medio de mESc un día después de la transduccion. Cinco días más tarde, además de BIX ?µ?, la molécula pequeña individual de la colección de fármacos conocida fue agregada a cada cavidad a un intervalo de entre 0.5 y 2 µ . El medio de ESC de ratón con moléculas pequeñas definidas fue renovado cada 3 días hasta que se observaron colonias con una morfología similar a las : mESC, que fue usualmente de entre 14-21 días después 'de la transducción . Además de los compuestos confirmados cómo se indica en el texto, aciertos primarios de la segunda selección sinergística que no fueron seguidos adicionalmente también incluyen PD173074, reversina, -5' azacitidina, pluripo ina y dexametasona . Estudios de caracterización adicionales y reproducciones se llevaron a cabo ya sea sobre! MEF 129S2/SvPasCrlf primarios o ROSA26+/~ 70G2+/". Cuando se usaron MEF de ROSA26+ " 70G2+/", las colonias de iPSC podrían también ser identificadas por medio de expresión de GFP, con márcador de expresión de Oct4. Una vez que las colonias de iPSC : fueron identificadas, fueron proyectadas para expansión sobre células limitadoras de MEF en el medio de mESC. Algunas colonias fueron expandidas en presencia del inhibidor de MEK, PD0325901 a una concentración de 0.5-2µ? para confirmar adicionalmente su pluripotencialidad .

Análisis de inmunocitoquimica e inmunofluorescencia Se llevó a cabo teñido de ALP de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit de detección de fosfatase alcalina (Millipore) . Para el análisi? de inmunofluorescencia, las células se fijaron en paraformaldehido al 4% 15 minutes a temperatura ambiente (RT) y lavadas con PBS. at room temperature and washed with PBS. Luego fueron incubadas en solución reguladora d bloqueo (BB) [0.3% Tritón X-100 (Sigma-Aldrich) , suero' de burro normal al 10% normal ( Jacksón ImmunoResearch Laboratories Inc) en PBS (Invitrogen) 30 min a temperatura ambiente. Luego fueron incubadas con anticuerpo primario durante toda la noche a 4°C en BB. Después de esto, las células fueron lavadas con PBS e incubadas con anticuerpo secundario en BB por 45-60 min a temperatura ambiente. Lps anticuerpos primarios fueron anti-Oct4 de ratón (1 :200) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) , anti-SSEAl de ratón (1 :200) (Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-Nanog de conejo (1:500) (Abeam Inc., Cambridge, MA) , anti-Sox2 de ratón (1:200) (Millipore), anti-Pdxl de conejo (1 :200) (una amable donación del doctor C. right) , anti-pilltubulina de ratón Tubulin (Tujl) (1:500) (Covance Research Products Inc., Denver, PA) , troponina T anti-cardiaca de ratón (CT3) (1:200) (Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa, Io a City, IA) , anti-albúmina de conejo (DAKO) . Los anticuerpos secundarios fueron IgG de anti-ratón o conejo de burro Alexa Fluor555 (1.500) (Invitrogen) . Los núcleos fueron detectados mediante teñido de DAPI (Sigma-Aldrich)' staining. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio EXFO Nikon Eclipse TE2000-U/X- cite 120 con una cámara fotométrica CoolSnap HQ2 •camera .

Análisis de RT-PCR El ARN fue extraído del las iPSC y líneas celulares testigo utilizando el ' mini kit RNeasy Plus en combinación con el dispositivo QIAshredder. El ARN fue convertidoa cADN utilizando el kit de síntesis iScriptTMcDNA (BioRad, Hercules, i CA) . La amplificación de genes específicos se hizo utilizando secadores publicados previamente (Takahashi, K. et al, Cell, 131:861-872 (2007); Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126:663-676 (2006)) y Platinum PCR SuperMix ( Invitrogen), 'sobre una máquina de PCR de gradiente de ep de Mastercycler (Eppendorf) . Amplification of specific genes was done using primers previously published (Takahashi, K. et al, ; Cell, 131:861-872 (2007); Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126:663-676 (2006)) and Platinum PCR SuperMix (Invitrogen) on a Mastercycler ep gradient PCR machine (Eppendorf) .

Análisis de metilación El ADN de células Rl, 0G2 MEFs and OK iPSCs (paso 10) fue aislado utilizando el kit de aislamiento de ADN no orgánico (Millipore) . El ADN fue luego tratado para secuenciación de bisulfito coñ el kit de metilación-oro de ADN de EZ™ (Zymo Research Corp., Orange, CA) . El ADN tratado fue luego usado para amplificar las secuencias de interés. Los sebadores usados para la amplificación de fragmentos de promotor fueron cómo se publicó previamente. (Blelloch, R. et al., Stem Cells, 24:2007-2013 (2006) ) . Los fragmentos resultantes fueron clonados utilizando el kit de clonación de TA TOPO para secuenciación (Invitrogen) y se realizó la secuenciación.

Agregación de iPSC con embriones de zona libre Las iPSC fueron agregadas con embriones de etapas de 8 células post-compactadas desnudas para obtener quimeras de agregados. Los embriones de ocho células (B6C3F1 ) fueron lavadas de hembras a 2.5 dpc y cultivadas en medio de microgotas de medio de medio de KSO (10% FCS) bajo aceite mineral. Grupos de iPSC (10-20 células) después de tratamiento breve de tripsina fueron escogidas y transferidas a micirogotas que contienen embriones de ocho células de zona libre. Los embriones de ocho células agregados con iPSC fueron cultivados durante toda la noche a 37 °C, 5% de C02. Los blastócistos agregados que se desarrollaron de la etapa de otras células fueron transferidos a un cuerno uterino de un receptor pseudoembarazado de 2.5 dpc. Una quimera macho adulta fue apareada con un ratón tipo silvestre CD1 hembra. El teñido de X-gal demostró que 6 embriones de Fl obtenidos de este apareamiento natural de ratón quimérico y ratón tipo silvestre fueron generados mediante transmisión de linea germinal.

Análisis estadístico Gráficas de barras y análisis estadísticos fueron efectuados utilizando una prueba t estándar en Excel.

Análisis de microarreglo La iPSC de 0K2B fueron cultivadas en medios de células de mES completos sobre gelatina (Millipore, Temecula, CA) por dos días (D E de bloqueo, ES al 10%-FBS calificado, reemplazo de suero de bloqueo al 10%, glutamax al 1%, 1% de aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina, ß-mercaptoetanol 0.1 mM, 1% de nucleósidos EmbryoMax ESC (Millipore) y 103 U/ml de LIF (Millipore) (todos los productos fueron de Invitrogen, Carlsbad, CA, excepto en donde se menciona) . El ARN de cavidad es duplicada fue luego aislado utilizando el minikit de RNAesasy (Qiagen, Valencia, CA) . Muestras de ARN total fueron amplificadas y marcadas utilizando el kit mejorado de MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit (Ambion, Austin, TX) . Las muestras marcadas amplificadas fueron luego hibridizadas a arreglos de genoma de ratón 430 2.0 (Affymetrix) y el análisis fue efectuado utilizando agrupamiento jerárquico (Pearson, logaritmo-trans ormada, valores hilara-centrado) utilizando GenePattern (world wide web at : broad.mit.edu/ cáncer/software/) .

Análisis de proliferación Células Rl de mES fueron depositadas sobre places de seis cavidades recubiertas de gelatina a una densidad de 2xl05/ Cavidad en un medio de células de mES completo. Después de anexión celular, aproximadamente 12 horas, las células fueron tratadas ya sea con DMSO, 1 µ? BIX, 2 µ BayK y una combinación de ambos por triplicado. A 15, 24 y 48 horas, las células fueron desprendidas utilizando tripsina y contadas utilizando un hemocitómetro . Se usó azul de Tryptan ( Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) para exclusión de células muertas.

Determinación de expresión de SOX2 después del tratamiento del compuesto Los MTF de 0G2+ "/ROSA26+ " fueron depositados sobre una placa de 6 cavidades a una densidad de 3.4xl04 células por cavidad. En el día siguiente, las células fueron tratadas con DMSO, 1 ¦ µ? BIX, 2 µ? BayK, y una combinación de ambos por triplicado durante seis días. El medio fue robado en el ¡ día 3. El ARN de cada cavidad fue luego aislado utilizando el minikit RNAeasy (Quiagen) . Se efectuó la transcripción inversa del ARN utilizando el kit de síntesis de cADN de iScript™ (BioRad, Hercules, CA) . La amplificación del Sox2 endógeno se hizo utilizando cebadores publicados previamente (Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., and Yamanaka, S. (2007). La inducción de células madre pluripotentes de cultivo de fibroblastos Nat Protoc 2, 3081-3089; Takahashi, K. , and Yamanaka, S. (2006). La inducción de células madre pluripotentes de cultivos de fibroblasto embriónico y adulto de ratón por factores definidos. 126, 663-676) con Platinum PC.R SuperMix (Invitrogen) sobre una máquina de PCR de grandiente de ep astercycler® (Eppendorf) .

Ejemplo 3 Este ejemplo demuestra que la incubación de células mamiferas con proteínas de factor de transcripción es suficiente para inducir pluripotencia .

Construcción del gen: Con el fin de obtener la expresión de protein de alto nivel en E. coli, todas las cuatro regiones de codón de gen de TF humano fueron optimizadas primero (G A Gutman and G W Hatfield (1989). PNAS . vol . 86. pp : 3699-3703) , and full-length synthesized using DNA oligo based / PCR gene assembling technology (Danilo R Casimiro, Peter E Wright & H Jane Dyson. (1997). Structure. Vol .5. pp: 1407- 1412.). El marcador de poli-arginina: ESGGGGSPGRRRRRRRRRRR fue agregado a cada proteína C-terminal en diseño (Gump JM, Dowdy SF. (2007) Trends Mol Med. 2007 Oct; 13 ( 10 ) : 443-8 ) . El fragment de AND fue flanqueado con el sitio Ndel y Xhol e insertado a los sitios Ndel-Xhol del vector de pET41 para la expresión de proteína.

Cada plásmido fue verificado con secuencia' de ADN, luego transformado a células competentes de inicio de BL21 para la producción de proteina recombinante utilizando el medio de autoinducción durante toda la noche (Studier FW, (2005) Protein Expr Purif. 41(1) . Pp: 207-234.) .

Preparación de proteina Células BL21(DE3) de Escherichia coli fueron transformadas con pET-0ct4-PTD pET-Sox2-PTD, pET-Klf -PTD, and pET-c-Myc-PTD y la expresión de proteínas se hizo utilizando el método de autoinducción (Studier. F. W., Protein Expression and Purification, 41 (2005) 207-234.) . Los cuerpos de inclusión fueron solubilizados y las proteínas fueron replegadas cómo se describe (LaFe vre BM, Wu S. & Lin X. Molecular Cáncer Therapeutics 7, 1420-1429, June 1, 2008. doi: 10.1158/1535-7163; Medynski D., Tuan M . , Liu, W., Wu, S. & Lin, X. Protein Expression and Purification Vol . 52, 395-402, April 2007; Hou 'W., Medynski D., Wu, S., Lin, X. & Li, LY. Clinical , Cáncer Research Vol. 11, 5595-5602, August 1, 2005) . Brevemente, E. coli que contiene un plásmido de expresión fue inoculado a 1.0 litros de caldo de Luria-Bertani que contiene canamicina, inducido con 500umol/L IPTG at A600nm =0.6, y agitado durante 3 horas a 37°C. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación y la pelotilla sometida a ciclos de congelación y deshielo. Los cuerpos de inclusión revelados fueron lavados extensamente con una solución reguladora de pH que contiene tris 20mmol/L, NaCl 100mmol/L, TritonX-100 1% (pH 8.0) y disueltos en una solución reguladora de pH que contiene urea 8 mol/L, tris 0.1 mol/L, glicina 1 mmol/L, . EDTA 1 mmol/L, ß-mercaptoetanol 10 mmol/L, DTT 10 mmol/L, glutationa reducida 1 mmol/L, glutaitiona oxidada 0.1 mmol/L (pH 10) con A280 nm = 2.0. Los cuerpos de inclusión solubilizados fueron replegados con un método de dilución rápida como se describe (Lin XL, Lin YZ, Tang J., Methods Enzymol 1994. 241. 195-224; Lin X, Koelsh G., Wu.S, Downs D, Dashti A. Tang J. Proc Nati Acad Sci USA. 2000; 97. 1556 -1560; Kim YT . Downs D. Wu S, et al. Eur J Biochem 2002. 269: 5669 -77; ichelle LaFevre-Bernt, Shili Wu, and Xinli Lin. (2008) . Molecular Cáncer Therapeutics . 7: pp: 1420- 1429) . La protein replegada fue concentrada por N2 ultrafiltración y purificada mediante cromatografía de exclusión de tamaño utilizando Sephacryl S 300. La concentración de endotoxina en cada preparación de proteína fue menos de 100EU/ mg. La mayoría de las muestras de proteína de proteínas replegadas tienen solubilidad de por lo menos > 1.5mg/ml. Las proteínas replegadas fueron concentradas utilizando filtración de flujo tangencial, purificadas utilizando cromatografía de exclusión de tamaño con una columna Superdex-200 (XK26x850-mm, GE, Piscataway, NJ) y confirmadas utilizando SDS-PAGE.

Fibroblastos de ratón fueron cultivados en un medio de mESC complementado con 8 µg/ml ya sea de · 0ct /Sox2/Klf4 o Oct4/Sox2/Klf4/Myc (todas las proteínas comprenden poli-ARG como se describe anteriormente) durante6-8 horas, lavados e incubados por 2-3 días en medio de mESC sin los, factores de transcripción enlistados anteriormente. Esto (4-12 horas con 1-3 días sin) fue repetido un número de. veces (1, 2, 3, 4 o más) y luego las células fueron cultivadas en mESC por dos semanas. Al final de este período, se determinó que los cultivos contienen células plúripotentes mediante morfología de colonia y expresión de marcador (datos no mostrados) . Notablemente, se encontró que la incubación constante de las células con los factores de transcripción (esto es, sin el período de 1†-3 días sin la proteína) fue tóxica para las células. En tanto que no era necesario, las células fueron algunas veces incubadas con inhibidor de MEK (PD0325901) y/o inhibidor de GSK (CHIR99021) y/o inhibidor de TGFp (SB431542) y la presencia de estos agentes mejoró la eficiencia y velocidad de desarrolló de células plúripotentes. Los ejemplos anteriores son provistos para ilustrar la invención pero no limitar su alcance. Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para aquel de habilidad ordinaria en el arte y son abarcadas por las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, bases de datos, secuencias de GenBank, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para producir células madre pluripotentes inducidas a partir de células no pluripotentes mamíferas, el método está caracterizado porque comprende: a) poner en contacto las células con por lo menos uno de: 1 un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3 9; un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk, produciendo mediante esto células madre pluripotentes inducidas. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de contacto comprende: a) poner en contacto las células con por lo menos dos de: i. un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9 y ii. un agente seleccionado del grupo que consi$te de: un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque comprende además: ! b) introducir uno o más casetes de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Óct, un polipéptido de Myc y/o un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes . 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque Klf4 y 0ct4 son introducidos a las células. 5. Un método para producir células madre pluripotentes inducidas a partir de células no pluripotentes mamiferas., el método está caracterizado porque comprende : a) introducir o modificar la expresión de uno o más de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes; b) poner en contacto las células con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, produciendo mediante esto células madre pluripotentés inducidas . 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa a) comprende poner en contacto las células no pluripotentés con uno o más polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la etapa a) comprende por lo menos dos ciclos de : i. poner en contacto las células no pluripotentés con uno o más polipéptidos exógenos seleccionados de un polipéptido de Klf, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox; ii . seguido por cultivo de las células en ausencia de los polipéptidos exógenos. 8. El método de conformidad . con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa a) comprende introducir uno o más casetes de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf, un polipéptido · de Oct, un polipéptido de Myo y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentés. 9. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque un cásete de expresión para la expresión de un polipéptido de Oct y ' un cásete de expresión de un polipéptido de Sox son introducidos a las células no pluripotentes . 10. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa de introducción comprende introducir a las células no pluripotentes uno o más casétes de expresión para la expresión de un polipéptido de KLF y un polipéptido de Oct, en donde un cásete de expresión para un polipéptido de Myc y/o un polipéptido de Sox no es introducido a las células. 11. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido de Klf es Klf4 y el polipéptido de Oct es Oct . 12. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células no pluripotentes son células somáticas. 13. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células no pluripotentes son células de fibroblasto. 14. El método de conformidad con la reivindicación 5 caracterizado porque ni un cásete de expresión para la expresión de un polipéptido de Myc ni un cásete de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf son introducidos a las células no pluripotentes. 15. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa de introducción es efectuada in vivo. 16. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa de introducción es efectuada in vitro. 17. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende además: v) seleccionar células que exhiben características, de célula madre pluripotente . 18. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células no pluripotentes son obtenidas de un animal y las células madre pluripotentes inducidas son diferenciadas a un tipo de célula deseado. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el ' tipo de célula deseado es introducido al animal. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el animal es un humano.. 21. El método de' conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el animal es un animal no humano. 22. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque las células seleccionadas no comprenden un cásete de expresión exógeno para la expresión de Oct4. 23. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el agente inhibe la metilación de H3K9. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente que inhibe la metilación de H3K9 es BIX01294. 25. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células son células humanas. 26. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células son células de ratón, perro, vaca, puerco, rata y células de primate no humano. 27. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque las células no pluripotentes son células progenitoras . 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las células progenitoras son células progenitoras neurales, células progenitoras de piel o células progenitoras de folículo piloso. 29. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la etapa de introducción comprende introducir: un primer vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un primer cásete de expresión, el primer cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica Klf4; un segundo vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un segundo cásete de expresión, el segundo cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica Sox2 y un tercer vector que comprende un promotor enlazado operativamente a un tercer cásete de expresión, el tercer cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica cMyc . 30. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque los vectores son vectores retrovirales , lentivirales, adenovirales , de plásmido no viral o episomales. 31. Un método para seleccionar en cuanto a agentes que inducen la reprogramación o desdiferenciación de células martilieras a células madre pluripotentes, el método está caracterizado porque comprende: a) introducir por lo menos uno de, pero no todos de, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox a · células no pluripotentes para generar células transfectadas ; b) poner en contacto las células transfectadas con una biblioteca de diferentes agentes; c) seleccionar las células contactadas en quanto a características de célula madre pluripotente y correlacionar el desarrollo de características de célula madre con un agente particular de la biblioteca, identificando mediante esto un agente que estimula la desdiferenciación de células a células madre pluripotentes . 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etapa a) comprende introducir uno o más casetes de expresión para la expresión de por lo mertos uno, pero no todos de, un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox a las células no pluripotentes. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etapa a) comprende introducir por lo menos uno, pero no todos de, un polipéptido de Oct exógeno, un polipéptido de Klf exógeno, un polipéptido de Myc exógeno y un polipéptido de Sox exógeno a las células no pluripotentes. 3 . El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el agente particular es de entre 50-1500 daltons. , 35. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etapa a) comprende introdupir dos casetes de expresión a las células, en donde cada cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica una proteína diferente, en donde la proteína es seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox y los miembros restantes del grupo no son introducidos a las células. ; 36. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la etapa a) comprende ntroducir tres casetes de expresión a las células, en donde cada cásete de expresión comprende un polinucleótido que codifica una proteína diferente, en donde la proteína es seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox y el niiembro restante del grupo es introducido a las células. 37. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque las células son células humanas. 38. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque las células son células mamíferas no humanas. 39. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque las células no pluripotentes son células progenitoras . 40. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque las células progenitoras son ¡células progenitoras neurales, células progenitoras de piel o ¡células progenitoras de folículo piloso. ! 41. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el polipéptido de Oct es Oet4', el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. 42. Un método de selección en cuanto a ,células mamíferas con características de célula madre pluripotente, el método está caracterizado porque comprende: a) poner en contacto las células con un inhibidor de MAPK/ERK cinasa ( EK) , de tal manera que el crecimiento de las células no pluripotentes es inhibido y se promueve el crecimiento de células madre pluripotentes y b) seleccionar las células contactadas en cuanto a características de célula madre pluripotente. 43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado .porque comprende: poner en contacto las células con una biblioteca de agentes antes de la etapa a) y en seguida de la etapa b) , seleccionar un agente que induce características de célula madre pluripotente en base al resultado de la etapa b) . 44. El método de conformidad con la reivindicación I 42, caracterizado porque las células son células humanas. 45. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque las células son células de : ratón, perro, vaca, puerco, rata y primate no humano. , 46. El método de conformidad con la reivindicación 42', caracterizado porque el inhibidor de MEK es PD0325901. 47. Una mezcla de células mamíferas y un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, caracterizado -porque las células: expresan por lo menos uno o más de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Sox ; y un polipéptido de Myc y/o están en contacto con por lo menos uno o más de un polipéptido de Oct exógeno, un polipéptido de Klf exógeno, un polipéptido de Sox exógeno y un polipéptido de Myc exógeho. 48. La mezcla de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque las células comprenden un primero, segundo y tercer cásete de expresión recombinante, ¡ el primer cásete .de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Klf, ! el segundo cásete de expresión comprende un promotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polipéptido de Sox y | el tercer cásete de expresión comprende un p!romotor enlazado operativamente a un polinucleótido que codifica un polinucleótido de Myc. 49. La mezcla de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el agente inhibe la metilacióh de H3K9. · ; 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el agente que inhibe la metilación de H3K9 es BIX01294. 51. La mezcla de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque las células comprenden uno o más de un vector retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no yiral o vector de expresión episomal, el uno o más vectores retrovirales, lentivirales , adenovirales, de plásmido no viral o vector de expresión episomal comprenden el primero, segundo y tercer cásete de expresión. 52. La mezcla de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque comprende un primero, segundo y tercer vector de expresión retroviral, lentiviral, aderidviral, plásmido no viral o episomal, el primer vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o episomal comprende el primer cásete de expresión; el segundo vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, plásmido no viral o episomal comprende el segundo cásete de expresión y el tercer vector de expresión retroviral, lentiviral, adenoviral, de plásmido no viral o episomal comprende el tercer cásete de expresión. 53. La mezcla de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque las células son células humanas. 54. La mezcla de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque las células son células de ratón, perro, vaca, puerco, rata y células de primate no humano. 55. La mezcla de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque las células comprenden células progenitoras . 56. La mezcla de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada porque las células progenitores son células progenitoras neurales, células progenitoras neurales, células progenitoras de la piel o células progenitoras de folículo piloso. 57. la mezcla de conformidad con la reivindicación · 47, caracterizada porque el polipéptido de Klf es KÍf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sbx2.. 58. Una célula mamífera que expresa endógenamente por lo menos una de una proteína seleccionada del grupo que consiste de un polipéptido de Oct, un polipéptido de Klf, un polipéptido de Myc y un polipéptido de Sox, : en donde: la célula no expresa endógenamente por lo menos una proteína del grupo, en donde la proteína no expresada endógenamente es expresada a partir de ARN codificado ; por un cásete de expresión recombinante heterólogo presente en la célula, la célula que expresa endógena o heterologament!e cada uno del polipéptido de Oct, el polipéptido de Kl|f, el polipéptido de Myc y el polipéptido de Sox y la expresión de la proteína a partir del cásete de expresión heterólogo resulta en la reprogramación o desdiferenciación de la célula a partir de una célula no pluripotente a una célula madre pluripotente . 59. La célula de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque el polipéptido de Oct es 0ct4, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. 60. La célula de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada . porque la célula expresa endógenamente un polipéptido de Sox y un polipéptido de Myc y expresa heterólogamente un polipéptido de Oct y un polipéptido de Klf. 61. La célula de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque el polipéptido de Oct es 0ct4, el polipéptido de Klf es Klf4, el polipéptido de Myc es c-Myc y el polipéptido de Sox es Sox2. 62. Un método para inducir la expresión de Oct4 en una célula, el método está caracterizado porque comprendé: poner en contacto la célula con un agente que inhibe la metilación de H3K9 o promueve la desmetilación 1 dé H3K9, induciendo mediante esto la expresión de 0ct4 en la célula. 63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado . porque la célula no expresa Oct4 inmediatamente antes de la etapa de contacto. 64. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque las células que son contactadas son células no pluripotentes . 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque las células son inducidas a pluripotencia después de la etapa de contacto. 66. Un método para inducir células no pluripotentes a células pluripotentes, el método está caracterizado ; porque comprende: poner en contacto las células no pluripotentes con uno o más agentes que inducen pluripotencia y/o introducir cásete de expresión a las células para expresar proteínas que inducen pluripotencia, en donde las células no son cultivadas sobre células alimentadoras y las células son anexadas a una superficie de cultivo sólida. 67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque las células son anexadas1 a la superficie de cultivo sólida mediante un sujetador molecular, el sujetador molecular es seleccionado del grupo que consiste de matrigel, una matriz extracelular (ECM) o análogo de ECM, laminina, fibronectina y colágeno. 68. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado porque la etapa de contacto comprende las etapas de la reivindicación 5 o las reivindicaciones i ; dependientes de la reivindicación 5. ¦ 69. Una mezcla de células mamíferas y por lo menos dos de : un agente que inhibe la mutilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT); un ligando de receptor nuclear; un inhibi'dor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGF /ALK5; un inhibidor de HDAC y un. inhibidor de Erk. ¦ ; ; ¦ 70. La mezcla de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque la mezcla comprende: i. un agente que inhibe la mutilación de H3K9 o •promueve la desmetilación de H3K9 y ii. un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGF /ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 71. La mezcla de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada porque las células comprenden un cassette de expresión heterólogo para la expresión de un polipéptido de Oct y un cassette de expresión heterólogo , para la expresión de un polipéptido de Sox. 72. La mezcla de conformidad con la reivindicación 69, " caracterizada porque las células son células no pluripotentes . 73. La mezcla de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada .porque las células son células de fibroblasto. 1 74. La mezcla de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada porque ni un cásete de expresión para la expresión de un polipéptido de Myc ni un cásete de expresión para la expresión de un polipéptido de Klf son introducidos a las células no pluripotentes. 75. Una composición, caracterizada porque comprende por lo menos dos de: un agente que inhibe la mutilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT); un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGFP/ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 76. La composición de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque comprende: i. un agente que inhibe la mutilación de ?3?9 o promueve la desmetilación de H3K9 y ii. un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGFp/ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 77. Un kit, caracterizado porque comprende por lo menos dos de: un agente que inhibe la mutilación de H3K9 o promueve la desmetilación de H3K9, un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGF /ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 78. El kit de conformidad con la reivindicación 77 caracterizado porque comprende: i. un agente que inhibe la mutilación de H3K9 promueve la desmetilación de H3K9 y ii. un agente seleccionado del grupo que consiste de: un agonista de canal de calcio tipo L; un activador de la ruta de cAMP; un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) ; un ligando de receptor nuclear; un inhibidor de GSK3; un inhibidor de MEK; un inhibidor del receptor de TGFP/ALK5; un inhibidor de HDAC y un inhibidor de Erk. 79. El kit de conformidad con la reivindicación 77 caracterizado porque comprende además células mamiferas.