KR101679082B1 - 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 화학적 및 유전적 조합 접근법 - Google Patents

유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 화학적 및 유전적 조합 접근법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포유동물 세포에서 만능성을 유도하는 소분자의 확인 및 용도, 및 만능성을 유도하는 다른 방법을 제공한다.

Description

유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 화학적 및 유전적 조합 접근법{COMBINED CHEMICAL AND GENETIC APPROACHES FOR GENERATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS}
관련 특허 출원에 대한 상호 참조
본원은 2008년 3월 17일자에 출원된 미국 가출원 제61/069,956호 및 2008년 10월 31일자에 출원된 미국 가출원 제61/197,986호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 이들은 각각 참조문헌으로 포함된다.
줄기 세포는 대개 전능 또는 만능으로 분류된다. 전능 줄기 세포는 전체로 분화능을 갖는다: 이는 신체에서 상이한 세포 유형 모두를 생성시킨다. 수정란 세포는 전능 줄기 세포의 일례이다. 만능 줄기 세포는 3개의 주요 배엽 또는 배아 그 자체로부터 유래하는 신체에서 임의의 세포 유형을 생성시킨다.
배아 줄기 세포(ESC)와 같은 만능 줄기 세포는 만능성, 즉 다양한 세포 유형으로 분화하는 능력을 유지하면서 신속히 증식한다. 배아 줄기 세포는 세포 이식 치료에 대한 유망한 공여 공급원이다. 그러나, 인간 ESC는 또한 인간 배아 사용 및 이질유전자 이식 후 거부 반응과 관련하여 윤리적 문제와 관련된다. 환자의 체세포로부터 직접 만능 줄기 세포를 생성시킴으로써 이러한 문제를 극복할 수 있다. 체세포 핵이 ESC와의 융합에 의해 배아 줄기 유사 상태를 획득한다는 것은 '만능 유도' 인자의 존재를 제시한다. 최근 선행 연구에 의하면 ESC에서 고도 발현되는 4개의 전사 인자(Oct-3/4, Sox2, KLF4 및 c-Myc)에 의한 마우스 섬유아세포로의 레트로바이러스 매개 형질감염에 의해 유도 만능 줄기(iPS) 세포를 생성된다는 것이 밝혀졌다. 문헌[Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006); Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-317 (2007); Wernig, M. et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448, 318-324 (2007); Maherali, N. et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell 1, 55-70 (2007); Meissner, A., Wernig, M. & Jaenisch, R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 25, 1177-1181 (2007); Takahashi, K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 (2007); Yu, J. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920 (2007); Nakagawa, M. et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008)] 참조. iPS 세포는 기형종 형성 및 키메라 기여에 의해 판단할 때 형태, 증식 및 만능에서 ESC와 유사하다.
마우스 및 인간 체세포 둘 다를 유도 만능 줄기(iPS) 세포로 재프로그래밍하는 데 있어서 한정된 유전자 조작, 즉 마우스 또는 인간 배아 줄기(ES) 세포에서 고도로 및/또는 특이적으로 발현된 몇몇 유전자의 바이러스 형질도입을 이용하는 것에 대한 최근 돌파구는 종래 인간 ES 세포와 관련된 논란 없이 다양한 용도(예를 들면, 세포 기반 치료법 또는 약물 발견)에 대해 환자 특이적 줄기 세포를 생성시킬 뿐만 아니라 후생적 역전 과정을 연구하기 위한 엄청난 기회를 열었다. iPS 세포 접근법의 궁극적인 임상 용도는 계통 특이적 세포 유형의 동종성 집단을 생성시키고 유전 조작 및 낮은 효율/느린 동역학의 현행 iPS 세포 단점과 관련된 위험을 제거하기 위해 인간 PS 세포의 유도 분화의 방법을 주로 요한다. 최근 연구에 의하면 이전에 필요한 4개의 유전자 중 1개인 cMyc은 iPS 세포를 생성하는 데 있어 과발현이 필요치 않은 것으로 밝혀졌다. 문헌[Nakagawa, M. et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008)] 참조. 그러나, cMyc의 부재 하에 또한 재프로그래밍 효율은 훨씬 더 느린 재프로그래밍 동역학과 함께 실질적으로 감소하였다.
본 발명은 포유동물 세포의 만능 줄기 세포로의 재프로그래밍 또는 역분화를 유도하는 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
(ａ) Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 1종 이상을 비만능 세포로 도입하여 형질감염된 세포를 생성하는 단계;
(ｂ) 상기 형질감염된 세포를 다양한 제제의 라이브러리와 접촉시키는 단계;
(ｃ) 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계; 및
(ｄ) 줄기 세포 특성 발생을 상기 라이브러리로부터 얻은 특정 제제와 서로 연관시켜, 세포의 만능 줄기 세포로의 역분화를 촉진하는 제제를 확인하는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단계 (ａ)는 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 1종 이상의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단계 (ａ)는 외인성 Oct 폴리펩티드, 외인성 Klf 폴리펩티드, 외인성 Myc 폴리펩티드 및 외인성 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 1종 이상을 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 특정 제제는 50 내지 1500 달톤이다.
몇몇 실시양태에서, 단계 (ａ)는 2종의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 상이한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질은 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 군의 나머지 구성원은 상기 비만능 세포로 도입되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 단계 (ａ)는 3종의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 상이한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질은 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 군의 나머지 구성원은 상기 비만능 세포로 도입되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 인간 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 비인간 포유동물 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 전구 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 전구 세포는 신경 전구 세포, 피부 전구 세포 또는 모낭 전구 세포이다.
몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드는 Oct4이고, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, 상기 Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, 상기 Sox 폴리펩티드는 Sox2이다.
또한, 본 발명은 만능 줄기 세포 특성을 갖는 포유동물 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
(ａ) 비만능 세포의 성장이 억제되고 만능 줄기 세포의 성장이 촉진되도록 세포를 MAPK/ERK 키나제(MEK) 억제제와 접촉시키는 단계; 및
(ｂ) 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
단계 (ａ) 전에, 상기 세포를 제제의 라이브러리와 접촉시키는 단계; 및
단계 (ｂ) 후에, 단계 (ｂ)의 결과에 기초하여 만능 줄기 세포를 유도하는 제제를 선별하는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 마우스, 개, 소, 돼지, 랫트 및 비인간 영장류 세포이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 MEK 억제제는 PD0325901이다.
또한, 본 발명은 포유동물 비만능 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
(ａ) Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드 중 1종 이상을 상기 비만능 세포로 도입하는 단계; 및
(ｂ) 상기 비만능 세포를 H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제와 접촉시켜, 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단계 (ａ)는 상기 비만능 세포를 Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로부터 선택되는 1종 이상의 외인성 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단계 (ａ)는
(ⅰ) 상기 비만능 세포를 Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로부터 선택되는 1종 이상의 외인성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(ⅱ) 이후, 상기 비만능 세포를 상기 외인성 폴리펩티드의 부재 하에 배양하는 단계
의 사이클 2회 이상(예를 들면, 2회, 3회, 4회, 5회 이상)을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단계 (ａ)는 Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계를 더 포함한다.
몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 및 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 도입 단계는 Klf 폴리펩티드 및 Oct 폴리펩티드의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 Myc 폴리펩티드 및/또는 Sox 폴리펩티드를 위한 발현 카세트는 상기 비만능 세포로 도입되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Oct 폴리펩티드는 Oct4이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 체세포이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 섬유아세포이다.
몇몇 실시양태에서, Myc 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 및 Klf 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 중 어느 것도 상기 비만능 세포로 도입되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 상기 도입 단계를 생체내에서 수행한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 도입 단계를 시험관내에서 수행한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
(ｃ) 만능 줄기 세포 특성을 나타내는 세포를 선별하는 단계
를 더 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 동물로부터 입수하고; 상기 유도 만능 줄기 세포는 원하는 세포 유형으로 분화된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 원하는 세포 유형을 상기 동물로 도입한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 동물은 인간이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 동물은 비인간 동물이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 선별된 세포는 Oct4의 발현을 위한 외인성 발현 카세트를 포함하지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 상기 제제는 H3K9 메틸화를 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 H3K9 메틸화를 억제하는 제제는 BIX01294이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 인간 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 마우스 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 비만능 세포는 전구 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 전구 세포는 신경 전구 세포이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 도입 단계는
Klf4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 벡터;
Sox2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현 카세트에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 벡터; 및
c-Myc을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 발현 카세트에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제3 벡터
를 도입하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스 벡터, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터이다.
또한, 본 발명은 포유동물 세포와, H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제의 혼합물로서, 상기 세포는 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Sox 폴리펩티드 및 Myc 폴리펩티드 중 적어도 1종 이상을 발현하고/하거나, 외인성 Oct 폴리펩티드, 외인성 Klf 폴리펩티드, 외인성 Sox 폴리펩티드 및 외인성 Myc 폴리펩티드 중 적어도 1종 이상과 접촉하고 있는 것인 혼합물을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 Klf 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 재조합 발현 카세트; Sox 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 발현 카세트; 및 Myc 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제3 재조합 발현 카세트를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 제제는 H3K9 메틸화를 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 H3K9 메틸화를 억제하는 제제는 BIX01294이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트를 포함하는 1종 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 혼합물은 상기 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터; 상기 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터; 및 상기 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 마우스 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 전구 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 전구 세포는 신경 전구 세포, 피부 전구 세포 또는 모낭 전구 세포이다.
몇몇 실시양태에서, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, Sox 폴리펩티드는 Sox2이다.
또한, 본 발명은 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 중 1종 이상을 내인성으로 발현하는 포유동물 세포로서, 상기 세포는 상기 군 중 1종 이상의 단백질을 내인성으로 발현하지 않고, 내인성으로 발현되지 않는 단백질은 상기 세포에 포함된 이종성 재조합 발현 카세트에 의해 코딩된 RNA로부터 발현되고, 상기 세포는 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드 각각을 내인성으로 또는 이종성으로 발현하고, 상기 이종성 발현 카세트로부터의 단백질의 발현에 의해 상기 세포가 비만능 세포로부터 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 또는 역분화되는 것인 포유동물 세포를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드는 Oct4이고, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, Sox 폴리펩티드는 Sox2이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 Sox 폴리펩티드 및 Myc 폴리펩티드를 내인성으로 발현하고, Oct 폴리펩티드 및 Klf 폴리펩티드를 이종성으로 발현한다. 몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드는 Oct4이고, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, Sox 폴리펩티드는 Sox2이다.
또한, 본 발명은 세포에서 Oct4 발현을 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 상기 세포를 H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제와 접촉시켜, 상기 세포에서 Oct4 발현을 유도하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 상기 접촉 단계 직전에 Oct4를 발현하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 상기 접촉된 세포는 만능 세포가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 상기 접촉 단계 후에 만능성으로 유도된다.
또한, 본 발명은 비만능 세포를 만능 세포로 유도하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 상기 비만능 세포를 만능성을 유도하는 1종 이상의 제제와 접촉시키고/시키거나 만능성을 유도하는 단백질을 발현하도록 발현 카세트를 상기 세포로 도입하는 단계로서, 상기 세포는 피더 세포(feeder cell) 상에서 배양되지 않고 상기 세포는 고체 배양 표면에 부착되는 것인 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계를 더 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 마트리겔, 세포외 기질(ECM) 또는 ECM 유사체, 라미닌, 피브로넥틴 및 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자 테터( molecular tether)에 의해 상기 고체 배양 표면에 부착된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 접촉 단계는
(ａ) Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 세포로 도입하는 단계; 및
(ｂ) 상기 세포를 H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제와 접촉시켜, 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 단계
를 포함한다.
또한, 본 발명은 포유동물 비만능 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
(ａ) 상기 세포를
H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제(BIX를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
L형 Ca 채널 효능제(BayK를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
cAMP 경로의 활성제(포스콜린을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제(RG108 또는 5-아자-C를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
핵 수용체 리간드(덱사메타손을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
GSK3 억제제(CHIR99021을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제(SB431542, A-83-01, 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-l,5-나프티리딘을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
HDAC 억제제(TSA, VPA, 나트륨 부티레이트, SAHA 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음); 및
erk 억제제
중 1종 이상(예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종 이상)과 접촉시켜, 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계를 더 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
(ａ) 상기 세포를
(ⅰ) H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제; 및
(ⅱ) L형 Ca 채널 효능제(BayK를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
cAMP 경로의 활성제(포스콜린을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제(RG108 또는 5-아자-C를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
핵 수용체 리간드(덱사메타손을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
GSK3 억제제(CHIR99021을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제(SB431542, A-83-01, 또는 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-l,5-나프티리딘을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음);
HDAC 억제제(TSA, VPA, 나트륨 부티레이트, SAHA 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음); 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제
와 접촉시키는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은
(ｂ) Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및/또는 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 단계
를 더 포함한다.
몇몇 실시양태에서, Klf4 및 Oct4를 상기 비만능 세포로 도입한다(임의로, Myc 및 Sox를 도입하지 않는다).
또한, 본 발명은 포유동물 세포와,
H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제;
L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
중 1종 이상(예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종 이상)의 혼합물을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 혼합물은
(ⅰ) H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제; 및
(ⅱ) L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 Oct 폴리펩티드의 발현을 위한 이종성 발현 카세트 및 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 이종성 발현 카세트를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 비만능 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 섬유아세포이다.
몇몇 실시양태에서, Myc 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 및 Klf 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 중 어느 것도 상기 비만능 세포로 도입하지 않는다.
또한, 본 발명은
H3K9 메틸화를 억제하는 제제; 및
L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
(ⅰ) H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제; 및
(ⅱ) L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제
를 포함하는 키트를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 키트는 포유동물 세포를 더 포함한다.
본 발명의 몇몇 실시양태는 바로 하기 청구항 형태로 기재되어 있다:
[1] 포유동물 비만능 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 방법으로서,
(ａ) Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드 중 1종 이상을 상기 비만능 세포로 도입하는 단계; 및
(ｂ) 상기 비만능 세포를 H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제와 접촉시켜, 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 단계
를 포함하는 제조 방법.
[2] [1]에 있어서, 단계 (ａ)는 상기 비만능 세포를 Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로부터 선택되는 1종 이상의 외인성 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
[3] [2]에 있어서, 단계 (ａ)는
(ⅰ) 상기 비만능 세포를 Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로부터 선택되는 1종 이상의 외인성 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
(ⅱ) 이후, 상기 비만능 세포를 상기 외인성 폴리펩티드의 부재 하에 배양하는 단계
의 사이클 2회 이상을 포함하는 것인 제조 방법.
[4] [1]에 있어서, 단계 (ａ)는 Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
[5] [1]에 있어서, Oct 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 및 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것인 제조 방법.
[6] [1]에 있어서, 상기 도입 단계는 Klf 폴리펩티드 및 Oct 폴리펩티드의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 Myc 폴리펩티드 및/또는 Sox 폴리펩티드를 위한 발현 카세트는 상기 비만능 세포로 도입하지 않는 것인 제조 방법.
[7] [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Oct 폴리펩티드는 Oct4인 제조 방법.
[8] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 체세포인 제조 방법.
[9] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 섬유아세포인 제조 방법.
[10] [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, Myc 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 및 Klf 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 중 어느 것도 상기 비만능 세포로 도입하지 않는 것인 제조 방법.
[11] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입 단계를 생체내에서 수행하는 것인 제조 방법.
[12] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입 단계를 시험관내에서 수행하는 것인 제조 방법.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서,
(ｃ) 만능 줄기 세포 특성을 나타내는 세포를 선별하는 단계
를 더 포함하는 제조 방법.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 동물로부터 입수하고;
상기 유도 만능 줄기 세포는 원하는 세포 유형으로 분화되는 것인 제조 방법.
[15] [14]에 있어서, 상기 원하는 세포 유형을 상기 동물로 도입하는 것인 제조 방법.
[16] [15]에 있어서, 상기 동물은 인간인 제조 방법.
[17] [15]에 있어서, 상기 동물은 비인간 동물인 제조 방법.
[18] [13]에 있어서, 상기 선별된 세포는 Oct4의 발현을 위한 외인성 발현 카세트를 포함하지 않는 것인 제조 방법.
[19] [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 있어서, 상기 제제는 H3K9 메틸화를 억제하는 것인 제조 방법.
[20] [19]에 있어서, 상기 H3K9 메틸화를 억제하는 제제는 BIX01294인 제조 방법.
[21] [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 인간 세포인 제조 방법.
[22] [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 마우스, 개, 소, 돼지, 랫트 및 비인간 영장류 세포인 제조 방법.
[23] [1] 내지 [22] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 전구 세포인 제조 방법.
[24] [23]에 있어서, 상기 전구 세포는 신경 전구 세포, 피부 전구 세포 또는 모낭 전구 세포인 제조 방법.
[25] [1] 또는 [4] 내지 [24] 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입 단계는
Klf4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현 카세트에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 벡터;
Sox2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현 카세트에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 벡터; 및
c-Myc을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제3 발현 카세트에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제3 벡터
를 도입하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
[26] [1] 또는 [4] 내지 [25] 중 어느 하나에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터인 제조 방법.
[27] 포유동물 세포의 만능 줄기 세포로의 재프로그래밍 또는 역분화를 유도하는 제제를 스크리닝하는 방법으로서,
(ａ) Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 1종 이상을 비만능 세포로 도입하여 형질감염된 세포를 생성하는 단계;
(ｂ) 상기 형질감염된 세포를 다양한 제제의 라이브러리와 접촉시키는 단계;
(ｃ) 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계; 및
(ｄ) 줄기 세포 특성 발생을 상기 라이브러리로부터 얻은 특정 제제와 서로 연관시켜, 세포의 만능 줄기 세포로의 역분화를 촉진하는 제제를 확인하는 단계
를 포함하는 스크리닝 방법.
[28] [27]에 있어서, 단계 (ａ)는 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 1종 이상의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하는 것인 스크리닝 방법.
[29] [27]에 있어서, 단계 (ａ)는 외인성 Oct 폴리펩티드, 외인성 Klf 폴리펩티드, 외인성 Myc 폴리펩티드 및 외인성 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 1종 이상을 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하는 것인 스크리닝 방법.
[30] [27] 내지 [29] 중 어느 하나에 있어서, 상기 특정 제제는 50 내지 1500 달톤인 스크리닝 방법.
[31] [27]에 있어서, 단계 (ａ)는 2종의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 상이한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질은 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 군의 나머지 구성원은 상기 비만능 세포로 도입하지 않는 것인 스크리닝 방법.
[32] [27]에 있어서, 단계 (ａ)는 3종의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 각각의 발현 카세트는 상이한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 단백질은 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 군의 나머지 구성원은 상기 비만능 세포로 도입하지 않는 것인 스크리닝 방법.
[33] [27] 내지 [32] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 인간 세포인 스크리닝 방법.
[34] [27] 내지 [33] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 비인간 포유동물 세포인 스크리닝 방법.
[35] [27] 내지 [34] 중 어느 하나에 있어서, 상기 비만능 세포는 전구 세포인 스크리닝 방법.
[36] [35]에 있어서, 상기 전구 세포는 신경 전구 세포, 피부 전구 세포 또는 모낭 전구 세포인 스크리닝 방법.
[37] [27] 내지 [36] 중 어느 하나에 있어서, Oct 폴리펩티드는 Oct4이고, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, Sox 폴리펩티드는 Sox2인 스크리닝 방법.
[38] 만능 줄기 세포 특성을 갖는 포유동물 세포를 스크리닝하는 방법으로서,
(ａ) 비만능 세포의 성장이 억제되고 만능 줄기 세포의 성장이 촉진되도록 세포를 MAPK/ERK 키나제(MEK) 억제제와 접촉시키는 단계; 및
(ｂ) 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계
를 포함하는 스크리닝 방법.
[39] [38]에 있어서,
단계 (ａ) 전에, 상기 세포를 제제의 라이브러리와 접촉시키는 단계; 및
단계 (ｂ) 후에, 단계 (ｂ)의 결과에 기초하여 만능 줄기 세포를 유도하는 제제를 선별하는 단계
를 포함하는 스크리닝 방법.
[40] [38] 또는 [39]에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 스크리닝 방법.
[41] [38] 또는 [39]에 있어서, 상기 세포는 마우스, 개, 소, 돼지, 랫트 및 비인간 영장류 세포인 스크리닝 방법.
[42] [38] 내지 [41] 중 어느 하나에 있어서, 상기 MEK 억제제는 PD0325901인 스크리닝 방법.
[43] 포유동물 세포와, H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제의 혼합물로서, 상기 세포는
Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Sox 폴리펩티드 및 Myc 폴리펩티드 중 적어도 1종 이상을 발현하고/하거나,
외인성 Oct 폴리펩티드, 외인성 Klf 폴리펩티드, 외인성 Sox 폴리펩티드 및 외인성 Myc 폴리펩티드 중 적어도 1종 이상과 접촉하고 있는 것인 혼합물.
[44] [43]에 있어서, 상기 세포는
Klf 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제1 재조합 발현 카세트;
Sox 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제2 재조합 발현 카세트; 및
Myc 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 제3 재조합 발현 카세트
를 포함하는 것인 혼합물.
[45] [43] 또는 [44]에 있어서, 상기 제제는 H3K9 메틸화를 억제하는 것인 혼합물.
[46] [45]에 있어서, 상기 H3K9 메틸화를 억제하는 제제는 BIX01294인 혼합물.
[47] [43] 내지 [46] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 제1 발현 카세트, 제2 발현 카세트 및 제3 발현 카세트를 포함하는 1종 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터를 포함하는 것인 혼합물.
[48] [47]에 있어서,
상기 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터;
상기 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터; 및
상기 제3 발현 카세트를 포함하는 제3 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 비바이러스성 플라스미드, 또는 에피솜 발현 벡터
를 포함하는 것인 혼합물.
[49] [43] 내지 [48] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 혼합물.
[50] [43] 내지 [48] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 마우스, 개, 소, 돼지, 랫트 및 비인간 영장류 세포인 혼합물.
[51] [43] 내지 [50] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 전구 세포를 포함하는 것인 혼합물.
[52] [51]에 있어서, 상기 전구 세포는 신경 전구 세포, 피부 전구 세포 또는 모낭 전구 세포인 혼합물.
[53] [43] 내지 [52] 중 어느 하나에 있어서, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, Sox 폴리펩티드는 Sox2인 혼합물.
[54] Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 중 1종 이상을 내인성으로 발현하는 포유동물 세포로서,
상기 세포는 상기 군 중 1종 이상의 단백질을 내인성으로 발현하지 않고, 내인성으로 발현되지 않는 단백질은 상기 세포에 포함된 이종성 재조합 발현 카세트에 의해 코딩된 RNA로부터 발현되고,
상기 세포는 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드 각각을 내인성으로 또는 이종성으로 발현하고,
상기 이종성 발현 카세트로부터의 단백질의 발현에 의해 상기 세포가 비만능 세포로부터 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 또는 역분화되는 것인 포유동물 세포.
[55] [54]에 있어서, Oct 폴리펩티드는 Oct4이고, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, Sox 폴리펩티드는 Sox2인 포유동물 세포.
[56] [54] 또는 [55]에 있어서, Sox 폴리펩티드 및 Myc 폴리펩티드를 내인성으로 발현하고, Oct 폴리펩티드 및 Klf 폴리펩티드를 이종성으로 발현하는 것인 포유동물 세포.
[57] [56]에 있어서, Oct 폴리펩티드는 Oct4이고, Klf 폴리펩티드는 Klf4이고, Myc 폴리펩티드는 c-Myc이고, Sox 폴리펩티드는 Sox2인 포유동물 세포.
[58] 세포에서 Oct4 발현을 유도하는 방법으로서,
상기 세포를 H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제와 접촉시켜, 상기 세포에서 Oct4 발현을 유도하는 단계
를 포함하는 유도 방법.
[59] [58]에 있어서, 상기 세포는 상기 접촉 단계 직전에 Oct4를 발현하지 않는 것인 유도 방법.
[60] [58] 또는 [59]에 있어서, 상기 접촉된 세포는 만능 세포가 아닌 것인 유도 방법.
[61] [58] 또는 [59]에 있어서, 상기 세포는 상기 접촉 단계 후에 만능성으로 유도되는 것인 유도 방법.
[62] 비만능 세포를 만능 세포로 유도하는 방법으로서,
상기 비만능 세포를 만능성을 유도하는 1종 이상의 제제와 접촉시키고/시키거나 만능성을 유도하는 단백질을 발현하도록 발현 카세트를 상기 세포로 도입하는 단계로서, 상기 세포는 피더 세포 상에서 배양되지 않고 상기 세포는 고체 배양 표면에 부착되는 것인 단계
를 포함하는 유도 방법.
[63] [62]에 있어서, 상기 세포는 마트리겔, 세포외 기질(ECM) 또는 ECM 유사체, 라미닌, 피브로넥틴 및 콜라겐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자 테터에 의해 상기 고체 배양 표면에 부착되는 것인 유도 방법.
[64] [62]에 있어서, 상기 접촉 단계는 [1], 또는 [1]에 종속하는 것의 단계를 포함하는 것인 유도 방법.
[65] 포유동물 비만능 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 방법으로서,
(ａ) 상기 세포를
H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제;
L형 Ca 채널 효능제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
중 1종 이상과 접촉시켜, 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 단계
를 포함하는 제조 방법.
[66] [62]에 있어서, 상기 접촉 단계는
(ａ) 상기 세포를
(ⅰ) H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제; 및
(ⅱ) L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제
중 2종 이상과 접촉시키는 단계
를 포함하는 것인 제조 방법.
[67] [65] 또는 [66]에 있어서,
(ｂ) Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및/또는 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 상기 비만능 세포로 도입하는 단계
를 더 포함하는 제조 방법.
[68] [65] 내지 [67] 중 어느 하나에 있어서, Klf4 및 Oct4를 상기 비만능 세포로 도입하는 것인 제조 방법.
[69] 포유동물 세포와,
H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제;
L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
중 2종 이상의 혼합물.
[70] [69]에 있어서,
(ⅰ) H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제; 및
(ⅱ) L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제
를 포함하는 혼합물.
[71] [69] 또는 [70]에 있어서, 상기 세포는 Oct 폴리펩티드의 발현을 위한 이종성 발현 카세트 및 Sox 폴리펩티드의 발현을 위한 이종성 발현 카세트를 포함하는 것인 혼합물.
[72] [69] 내지 [71] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 비만능 세포인 혼합물.
[73] [69] 내지 [72] 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포인 혼합물.
[74] [69] 내지 [73] 중 어느 하나에 있어서, Myc 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 및 Klf 폴리펩티드의 발현을 위한 발현 카세트 중 어느 것도 상기 비만능 세포로 도입하지 않는 것인 혼합물.
[75] H3K9 메틸화를 억제하는 제제;
L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
중 2종 이상을 포함하는 조성물.
[76] [75]에 있어서,
(ⅰ) H3K9 메틸화를 억제하는 제제; 및
(ⅱ) L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제
를 포함하는 조성물.
[77] H3K9 메틸화를 억제하는 제제;
L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
중 2종 이상을 포함하는 키트.
[78] [77]에 있어서,
(ⅰ) H3K9 메틸화를 억제하는 제제; 및
(ⅱ) L형 Ca 채널 효능제;
cAMP 경로의 활성제;
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제;
핵 수용체 리간드;
GSK3 억제제;
MEK 억제제;
TGFβ 수용체/ALK5 억제제;
HDAC 억제제; 및
erk 억제제
로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제
를 포함하는 키트.
[79] 제77항 또는 제78에 있어서, 포유동물 세포를 더 포함하는 키트.
도 1. Oct4 / Klf4 바이러스 형질도입 및 BIX01294 처리에 의한 한정된 1차 신경 전구 세포로부터의 iPS 세포의 생성. BIX01294 처리 존재 또는 부재 하의 Oct4/Klf4/Sox2/c-Myc, Oct4/Klf4/Sox2 또는 Oct4/Klf4의 레트로바이러스 형질도입에 의한 3.5×1O4개의 1차 OG2 신경 전구 세포로부터 생성되는 GFP+ iPS 세포 콜로니의 수의 비교.
도 2. Klf4 / Sox2 /c- Myc 바이러스 형질도입 및 BIX01294 처리에 의한 1차 신경 전구 세포로부터의 iPS 세포의 생성. BIX01294 처리 존재 또는 부재 하의 Klf4/Sox2/c-Myc의 레트로바이러스 형질도입에 의한 3.5×104개의 1차 OG2 신경 전구 세포로부터 생성되는 GFP+ iPS 세포 콜로니의 수.
도 3. 1차 OG2 MEF 로부터의 OK2B iPSC 의 생성. 3개의 독립 실험에서 OG2-MEF로부터 유래하는 GFP+ 콜로니의 평균 수를 나타내는 막대 그래프. 이 그래프는 4개의 인자에 의해 형질도입된 OG2 MEF 세포(Oct4, Klf4, Sox2 및 cMyc; 4F); OK에 의해 형질도입된 OG2 MEF 세포(OK); OK에 의해 형질도입되고 1 μM BIX로 처리된 OG2 MEF 세포(OK+BIX); OK에 의해 형질도입되고 1 μM BIX + 2 μM BayK로 처리된 OG2 MEF 세포(OK+BIX+BayK); OK에 의해 형질도입되고 1 μM BIX + 0.04 μM RG108로 처리된 OG2 MEF 세포(OK+BIX+RG108)에 대한 데이터를 나타내고, n=3, 오차 막대는 엑셀로 계산된 표준 편차를 나타낸다.
도 4. OK2B iPSC 는 mESC 중 1종과 유사한 전사 프로파일을 갖는다. (A) OK2B iPSC의 RT-PCR 분석에 의하면 OK2B iPSC가 만능 mESC에 특이적인 유전자를 발현한다는 것이 나타난다. R1 mESC를 양성 대조군으로 사용하는 반면, OG2 MEF는 음성 대조군으로 사용하였다. GAPDH는 로딩 대조군(loading control)으로 사용하였다. (ｂ) 중아황산염 서열분석에 의하면 OK2B iPSC의 나노그 프로모터가 탈메틸화된다는 것이 밝혀지고, 이는 추가로 mESC에 특이적인 내인성 유전자의 재활성화를 제시한다. 이러한 분석에 대해 증폭된 나노그 프로모터의 구역에 사이토신을 도시적으로 기술하였다. 빈 원은 탈메틸화 사이토신을 나타내는 반면, 채운/흑색 원은 메틸화 사이토신을 나타낸다.
도 5. BIX , BayK 또는 둘 다의 조합에 의한 처리는 mES 세포의 증식을 증가시키지 않는다. DMSO(대조군), 2 μM BayK, 1 μM BIX 및 둘 다의 조합(BayK+BIX)에 의한 처리 후 R1 mES 세포 수를 나타내는 산란 그래프. n=3. 오차 막대는 엑셀에서 계산된 표준 편차를 나타낸다. 엑셀에서 t-test를 이용하여 계산된 DMSO와 비교하여 각각의 처리에 대해 유의차가 없었다.
도 6. 화합물 처리 후 Sox2 발현에 대한 RT - PCR 분석. OG2+/-/ROSA26+/-(OG2) MEF를 DMSO(대조군), 1 μM BIX, 2 μM BayK 및 둘 다의 조합으로 6 일 동안 처리하였다. 이후, Qiagen RNAeasy Mini 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다. 반정량적 PCR을 통해 Sox2 발현을 평가하였다. 0K2B iPSC p37 및 R1을 양성 대조군으로서 사용하고, GAPDH를 로딩 대조군으로 사용하였다.
"Oct 폴리펩티드"는 전사 인자의 8합체 패밀리의 임의의 천연 구성원, 또는 가장 가까운 연관 천연 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 이의 변이체, 또는 적어도 천연 패밀리 구성원의 DNA 결합 도메인을 포함하고, 임의로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Oct 폴리펩티드의 예로는 예를 들면 POU 도메인을 포함하는 Oct3/4(본원에 "Oct4"라 칭함)를 들 수 있다. 문헌[Ryan, A.K. & Rosenfeld, M.G. Genes Dev. 11, 1207-1225 (1997)] 참조. 몇몇 실시양태에서, 변이체는 천연 Oct 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대 상기 기재된 것과 비교하여 그 전체 서열에 걸쳐 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
"Klf 폴리펩티드"는 크루펠양 인자(Klf; Krppel-like factor), 초파리 배아 패턴 조절제 크루펠의 서열과 유사한 아미노산 서열을 포함하는 아연 손가락 단백질의 패밀리의 임의의 천연 구성원, 또는 가장 가까운 연관 천연 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 상기 천연 구성원의 변이체, 또는 적어도 천연 패밀리 구성원의 DNA 결합 도메인을 포함하고, 임의로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 문헌[Dang, D.T., Pevsner, J. & Yang, V.W.. Cell Biol. 32, 1103-1121 (2000)] 참조. Klf 패밀리 구성원의 예로는 예를 들면 Klf1, Klf4 및 Klf5를 들 수 있고, 이들 각각은 iPS 세포에서의 결과에 서로 대체할 수 있는 것으로 나타났다. 문헌[Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26: 101-106 (2007)] 참조. 몇몇 실시양태에서, 변이체는 천연 Klf 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대 상기 기재된 것과 비교하여 그 전체 서열에 걸쳐 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. Klf 폴리펩티드가 본원에 기재된 정도로, 이것을 Essrb로 대체할 수 있다. 따라서, 각각의 Klf 폴리펩티드의 경우 본원에 기재된 실시양태는 Klf4 폴리펩티드 대신에 Essrb의 사용에 대해 동일하게 기재된 것으로 의도된다.
"Myc 폴리펩티드"는 Myc 패밀리의 임의의 천연 구성원(예를 들면, 문헌[Adhikary, S. & Eilers, M. Nat. Rev. MoL Cell Biol. 6: 635-645 (2005)] 참조), 또는 가장 가까운 연관 천연 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 이의 변이체, 또는 적어도 천연 패밀리 구성원의 DNA 결합 도메인을 포함하고, 임의로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Myc 폴리펩티드의 예로는 예를 들면 c-Myc, N-Myc 및 L-Myc를 들 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 변이체는 천연 Myc 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대 상기 기재된 것과 비교하여 그 전체 서열에 걸쳐 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
"Sox 폴리펩티드"는 고이동도 군(HMG; high-mobility group) 도메인의 존재를 특징으로 하는 SRY 연관 HMG-box(Sox) 전사 인자의 임의의 천연 구성원, 또는 가장 가까운 연관 천연 패밀리 구성원과 비교하여 (적어도 50%, 80%, 또는 90% 활성 내에서) 유사한 전사 인자 활성을 유지하는 이의 변이체, 또는 적어도 천연 패밀리 구성원의 DNA 결합 도메인을 포함하고, 임의로 전사 활성화 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면, 문헌[Dang, D.T., et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 32:1103-1121 (2000)] 참조. Sox 폴리펩티드의 예로는 예를 들면 Sox1, Sox2, Sox3, Sox15 또는 Sox18을 들 수 있고, 이들 각각은 iPS 세포에서의 결과에 서로 대체할 수 있는 것으로 나타났다. 문헌[Nakagawa, et al., Nature Biotechnology 26:101-106 (2007)] 참조. 몇몇 실시양태에서, 변이체는 천연 Sox 폴리펩티드 패밀리 구성원, 예컨대 상기 기재된 것과 비교하여 그 전체 서열에 걸쳐 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는다.
"H3K9"는 히스톤 H3 리신 9를 의미한다. H3K9는 K9에서 디메틸화될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Kubicek, et al., Mol. Cell 473-481 (2007)] 참조.
용어 "만능" 또는 "만능성"은 적절한 조건 하에 3개의 배엽(내배엽, 중배엽, 및 외배엽) 모두로부터 유래한 세포 계통과 관련된 특성을 총체적으로 나타내는 세포 유형으로 분화할 수 있는 후대를 생성하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 만능 줄기 세포는 태아, 신생아 또는 성체 동물의 많은 또는 모두 조직에 기여할 수 있다. 세포 집단의 만능을 확립하기 위해 8 내지 12 주령 SCID 마우스에서 기형종을 형성하는 능력과 같은 표준 기술 허용 시험을 이용할 수 있지만, 또한 만능 세포를 검출하기 위해 다양한 만능 줄기 세포 특성의 확인을 이용할 수 있다.
"만능 줄기 세포 특성"은 만능 줄기 세포를 다른 세포와 구분시키는 세포의 특성을 의미한다. 적절한 조건 하에 3개의 배엽(내배엽, 중배엽, 및 외배엽) 모두로부터 유래한 세포 계통과 관련된 특성을 총체적으로 나타내는 세포 유형으로 분화할 수 있는 후대를 생성하는 능력은 만능 줄기 세포 특성이다. 또한, 분자 마커의 특정 조합의 발현 또는 비발현은 만능 줄기 세포 특성이다. 예를 들면, 인간 만능 줄기 세포는 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E, ALP, Sox2, E-카데린, UTF-1, Oct4, Rex1 및 나노그의 비제한적인 리스트로부터 선택된 마커의 적어도 몇몇, 임의로 전부를 발현한다. 또한, 만능 줄기 세포와 관련된 세포 유형은 만능 줄기 세포 특성이다.
용어 "라이브러리"는 당해 분야에서 이의 통상 용법에 따라 개별 구성원이 확인될 수 있는 방식으로 임의로 조직화 및/또는 분류된 분자 집단을 의미하기 위해 사용된다. 라이브러리는 조합 화합물 라이브러리, 천연물 라이브러리 및 펩티드 라이브러리를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"재조합" 폴리뉴클레오티드는 그 본래 상태가 아닌 폴리뉴클레오티드이고, 예를 들면 폴리뉴클레오티드는 자연에서 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 문맥상 자연에서 발견되지 않는, 예를 들면 전형적으로 자연에서 근접한 뉴클레오티드 서열로부터 분리된 것, 또는 전형적으로 근접하지 않은 인접한(또는 이웃한) 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들면, 해당 서열은 벡터로 클로닝될 수 있거나, 그렇지 않으면 1종 이상의 추가 핵산과 재조합될 수 있다.
"발현 카세트"는 프로모터를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 다른 조절 서열을 의미한다.
용어 "프로모터" 및 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 어레이를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 본원에서 사용되는 바대로, 프로모터는, 중합분해효소 Ⅱ형 프로모터의 경우, TATA 부재와 같은, 전사 출발 부위 근처에 필수적인 핵산 서열을 포함한다. 또한, 프로모터는 임의로 원위 증진자 또는 억제자 부재를 포함할 수 있고, 이들은 전사 출발 부위로부터 수천 개의 염기쌍으로 떨어져 위치할 수 있다. 프로모터로는 구성적 프로모터 및 유도성 프로모터를 들 수 있다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발생 조건 하에 활성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발생 조절 하에 활성인 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)와 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하고, 상기 발현 제어 서열은 제2 서열에 해당하는 핵산의 전사를 지시한다.
본원에서 사용된 "이종성 서열" 또는 "이종성 핵산"은 특정 숙주 세포에 외래인 공급원으로부터 유래하는 것, 또는 동일한 공급원으로부터 유래하는 경우, 그 본래 형태로부터 변형된 것이다. 따라서, 세포 내 이종성 발현 카세트는 예를 들면 염색체 DNA라기 보다 발현 벡터 유래의 뉴클레오티드 서열에 연결됨으로써, 이종성 프로모터에 연결됨으로써, 리포터 유전자 등에 연결됨으로써 특정 숙주 세포에 내인성이 아닌 발현 카세트이다.
용어 "제제" 또는 "시험 화합물"은 본원에 기재된 스크리닝 분석에 유용한 임의의 화합물을 의미한다. 제제는 예를 들면 유기 화합물(예를 들면, 소분자, 예컨대 약물), 폴리펩티드(예를 들면, 펩티드 또는 항체), 핵산(예를 들면, DNA, RNA, 이중 가닥, 단일 가닥의, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 RNA, 소형 억제 RNA, 마이크로 RNA, 리보자임 등), 올리고사카라이드, 지질일 수 있다. 일반적으로, 본 스크리닝 방법에서 사용되는 제제는 분자량이 10,000 달톤 미만, 예를 들면 8000, 6000, 4000, 2000 달톤 미만, 예를 들면 50-1500, 500-1500, 200-2000, 500-5000 달톤이다. 시험 화합물은 충분한 범위의 다양성을 제공하는 조합 또는 불규칙 라이브러리와 같은 시험 화합물의 라이브러리 형태일 수 있다. 시험 화합물은 임의로 융합 파트너, 예를 들면 표적 화합물, 구제 화합물(rescue compound), 이합체 화합물, 안정화 화합물, 주소화 화합물(addressable compound) 및 다른 기능 부분에 연결될 수 있다. 통상적으로, 예컨대 본원에 기재된 특정 조건 하에 만능성을 유도하는 능력과 같은 몇몇 바람직한 특성 또는 활성을 갖는 시험 화합물(소위 "주요 화합물")을 확인하고, 상기 주요 화합물의 변이체를 생성하고, 상기 변이체 화합물의 특성 및 활성을 평가함으로써 유용한 특성을 갖는 신규한 화학 집합체가 생성된다. 종종, 이러한 분석에 고속 스크리닝(HTS) 방법이 이용된다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태 중 어느 1종 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고, 기준 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 합성, 천연 및 비천연의 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 계통을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
달리 기재되지 않은 한, 특정 핵산 서열은 또한 명확히 기재된 서열뿐만 아니라 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들면, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열을 포함한다. 구체적으로, 1종 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환이 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994))].
발현 또는 활성의 "억제제", "활성제" 및 "조절제"는 리간드, 효능제, 길항제 및 이들의 동족체 및 모방체와 같은 기재된 표적 단백질(또는 코딩 폴리뉴클레오티드)의 발현 또는 활성에 대해 시험관내 및 생체내 분석을 이용하여 확인된 억제, 활성, 또는 조절 분자를 의미하기 위해 각각 사용된다. 용어 "조절제"로는 억제제 및 활성제를 들 수 있다. 억제제는 예를 들면 발현을 억제하거나, 자극 또는 프로테아제 억제 활성에 결합하거나, 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 기재된 표적 단백질의 활성을 감소시키거나, 막거나, 연기시키거나, 불활성화시키거나, 탈감작하거나, 하향 조절하는 길항제와 같은 제제이다. 활성제는 예를 들면 기재된 표적 단백질의 발현을 유도하거나, 활성화하거나, 활성화 또는 프로테아제 억제 활성에 결합하거나, 자극하거나, 증가시키거나, 개시시키거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 증대시키거나, 기재된 표적 단백질(또는 코딩 폴리뉴클레오티드)의 활성을 감작하거나, 상향 조절하는 효능제와 같은 제제이다. 조절제로는 천연 및 합성 리간드, 길항제 및 효능제(예를 들면, 소형 화학 분자, 항체 및 효능제 또는 길항제 중 어느 1종으로 작용하는 것 등)를 들 수 있다. 억제제 및 활성제에 대한 분석은 예를 들면 기재된 표적 단백질을 발현하는 세포에 추정되는 조절제 화합물을 적용시킨 후 상기 기재된 표적 단백질 활성에 미치는 기능 효과를 상기 기재된 바대로 측정하는 것을 포함한다. 효과의 정도를 검사하기 위해 잠재적 활성제, 억제제, 또는 조절제로 처리된 기재된 표적 단백질을 포함하는 시료 또는 분석을 대조군 시료와 비교한다. (조절제로 처리되지 않은) 대조군 시료는 100%의 상대 활성 값으로 정한다. 상기 대조군에 상대적인 활성 값이 약 80%, 임의로 50% 또는 25%, 10%, 5% 또는 1%일 때 기재된 표적 단백질의 억제가 달성된다. 상기 대조군에 상대적인 활성 값이 110%, 임의로 150%, 임의로 200, 300%, 400%, 500% 또는 1000-3000% 이상일 때 상기 기재된 표적 단백질의 활성화가 달성된다.
[발명의 상세한 설명]
Ⅰ. 서론
본 발명은 유도 만능 줄기 세포(iPS)를 유도하는 데 관여하는 전사 인자의 효과를 모방하기 위해 소분자를 사용할 수 있다는 놀라운 발견에 부분적으로 기초한다. 예를 들면, 본원에 자세히 기재된 바대로, Oct4는 히스톤 3 리신 9(H3K9)의 메틸화를 감소시키는 소분자에 의해 "대체"될 수 있다. 따라서, 예를 들면 G9a(H3K9에 대한 히스톤 메틸트랜스퍼라제)를 특이적으로 억제하는 소분자인 BIX01294는, Klf4, c-Myc 및 Sox2가 발현된 포유동물 세포와 접촉할 때, 만능 줄기 세포를 유도한다.
이러한 결과는 H3K9의 메틸화의 역할 및 및 세포 프로그래밍에서의 이의 관여와 관련하여 흥미로울 뿐만 아니라, 만능 줄기 세포의 유도에 필수적인 것으로 이전에 확인된 전사 인자를 대체하는 소분자가 확인될 수 있다는 것을 나타낸다. 이는 유도 만능 줄기 세포, 또는 후속 분화된 세포, iPS 세포 유래의 전구 세포의 환자로의 도입(또는 재도입)이 목표이고, 특히 중요하다. 4개의 iPS 전사 인자 중 몇몇(예를 들면, Oct4, Myc)이 공지된 발암성 활성을 가지므로, 이 인자를 다른 덜 발암성 또는 비발암성 분자로 대체하는 것이 유리할 수 있다. 또한, 형질전환(및 이에 따른 염색체로의 DNA 삽입의 잠재적 발암성 효과)을 요하지 않는 소분자에 의한 4개의 인자 중 몇몇 또는 각각의 인자의 대체는 추가로 iPS를 포함하는 요법의 가능한 암 부작용을 감소시키는 것을 도울 수 있다.
또한, 본 발명은 iPS 전사 인자의 적어도 몇몇이 내인성 또는 더 낮은 수준으로 발현되고 그럼에도 불구하고 만능인 유도 만능 세포를 제공한다. 본 발명은 Sox2를 내인성으로 발현하는 특정 세포가 오로지 Oct4 및 Klf4의 도입 및 이종성 발현에 의해 만능성으로 유도될 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다.
또한, 본원에 기재된 바대로, Sox 폴리펩티드(예를 들면, Sox2)를 내인성으로 또는 이종성으로 발현하지 않는 비만능 세포를 본 발명의 방법을 이용하여 만능성으로 유도할 수 있다. 예를 들면, H3K9 메틸화를 억제하는 제제와 또한 접촉하고, 또한 임의로 L형 칼슘 채널 효능제, cAMP 경로의 활성제, DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제, 핵 수용체 효능제, GSK3 억제제 또는 MEK 억제제 중 1종 이상과 접촉하는 비만능 세포(예를 들면, 섬유아세포)로의 오로지 Oct4 및 Klf4의 도입에 의해 만능성을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 GSK 억제제 및 HDAC 억제제; 또는 GSK 억제제 및 cAMP 경로 활성제; 또는 GSK 억제제 및 ALK5 억제제와 같은 제제의 조합(G9a 억제제 존재 및 부재 하)이 오로지 Oct4, 또는 Oct4/Sox2 또는 Sox2/Klf4를 이종성으로 발현하는 세포에서 만능성을 유도하는 데 효과적이라는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 세포와 제제의 혼합물로서, 상기 세포가 원래 만능 세포가 아니고(예를 들면, 비줄기 세포임), 임의로 이종성으로 또는 내인성으로 발현하거나, 그렇지 않으면 Oct4 및/또는 Klf4에 의해 온전하며, 제제(들)가 H3K9 메틸화를 억제하는 제제, L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 및/또는 erk 억제제 중 1종 이상인 혼합물을 제공한다.
또한, 하기 추가로 기재된 바대로, 본 발명은 MEK 억제제, H3K9 메틸화를 억제하는 제제, L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제에 의해 스크링하고자 하는 세포를 배양함으로써 만능 줄기 세포 특성을 갖는 세포를 스크리닝하는 신규한 방법을 제공한다. MEK 억제제는 예를 들면 비iPS 세포의 성장을 억제함과 동시에 iPS 세포의 성장 및 안정한 재프로그래밍을 촉진하여, 특정 세포 혼합물에 만능 줄기 세포 특성을 갖는 세포가 농후하게 한다.
Ⅱ. 만능 줄기 세포의 유도
Ａ. 이종성 /내인성 발현
본 발명의 몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상(및 임의로, 2종 또는 3종)의 단백질을 내인성으로 발현하는 비만능 세포가 확인된다. 그러면, 상기 군으로부터 선택되는 (내인성으로 발현하지 않는) 나머지 단백질은 상기 세포에서 이종성으로 발현될 수 있고, 임의로 MEK 억제제, H3K9 메틸화를 억제하는 제제, L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 및/또는 erk 억제제 중 1종 이상의 존재 하에 만능 세포로의 재프로그래밍 및/또는 역분화에 대해 스크리닝할 수 있다.
단백질 발현에 대해 임의의 유형의 포유동물 비만능 세포를 스크리닝할 수 있고, 이후 만능 세포로 전환할 수 있는 것으로 생각된다. 몇몇 실시양태에서, 출발 세포는 분리된 전구 세포이다. 전구 세포의 예로는 내배엽 전구 세포, 중배엽 전구 세포(예를 들면, 근육 전구 세포, 골 전구 세포, 혈액 전구 세포) 및 외배엽 전구 세포(예를 들면, 상피 조직 전구 세포 및 신경 전구 세포)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 발현에 대해 세포주를 스크리닝함으로써, 또는 프로모터 메틸화 감소를 갖는 세포를 (예를 들면, DNA 중아황산염 서열분석에 의해) 확인하거나, 변형 히스톤 상태를 갖는 세포를 확인하여 상기 유전자의 침묵 상태 감소를 측정함으로써 본 발명의 이러한 양태에 유용한 세포를 용이하게 확인할 수 있다. 그러면, 내인성으로 발현하지 않는 전사 인자를 이종성으로 발현하여 이미 내인성으로 발현된 인자의 이종성 발현 없이 만능성을 유도할 수 있다.
실시예에 기재된 바대로, 몇몇 세포(예를 들면, 신경 전구 세포 및 섬유아세포(데이터는 도시하지 않음))를 오로지 Oct4 및 Klf4의 이종성 발현에 의해 만능성으로 유도할 수 있다. 이는 만능을 달성하기 위해 Sox 및 Myc 단백질, 및 마찬가지로 Oct 및 Klf 단백질 모두를 (예를 들면, 고발현 바이러스 벡터를 사용하여) 과발현할 필요가 없다는 것을 입증한다. 대신에, 상기 단백질들 중 몇몇을 내인성 또는 훨씬 더 낮은 검출가능한 수준으로 발현할 수 있고, 상기 군 중 다른 구성원의 이종성 발현에 의해 만능 세포로 전환할 수 있다. 따라서, 본 발명의 몇몇 실시양태에서, Sox 폴리펩티드 및/또는 Myc 폴리펩티드를 내인성으로 발현하는 세포가 확인되고, Oct 폴리펩티드 및 Klf 폴리펩티드는 세포에서 이종성으로 발현됨으로써 상기 세포의 만능 세포로의 전환을 유도할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드 및/또는 Klf 폴리펩티드를 내인성으로 발현하는 세포가 확인되고/되거나 Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드가 세포에서 이종성으로 발현됨으로써 상기 세포의 만능 세포로의 전환을 유도할 수 있다. 임의로, Myc, Klf4 및 Sox2 중 임의의 것 또는 모두를 대신하여 Sall4(Zhang et al, Nat Cell Biol. 8(10): 1114-23 (2006))를 발현할 수 있다.
예를 들면, UTF1, SV40, TERT 중 1종 이상을 비만능 세포에 포함시켜(이 유전자 제품을 코딩하는 발현 카세트를 도입함으로써, 또는 상기 세포와 상기 단백질 그 자체를 접촉시킴으로써) 및/또는 (예를 들면, siRNA에 의해) p53의 발현을 감소시켜 본원에 기재된 만능 유도의 효율을 더 증대시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[Zhao, et al., Cell Stem Cell 3: 475-479(2008)] 참조.
Ｂ. 전사 인자 단백질
본원에 기재된 바대로, 본 발명의 여러 실시양태는 1종 이상의 폴리펩티드를 세포로 도입하여, 그 세포에서 만능성을 유도하는 단계를 포함한다. 상기 기재된 바대로, 폴리펩티드의 세포로의 도입은 1종 이상의 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포로 도입하고 발현을 유도함으로써, 상기 발현 카세트로부터의 전사 및 번역에 의해 상기 폴리펩티드를 상기 세포로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입을 포함하지 않는 많은 여러 방법에 의해 외인성 폴리펩티드(즉, 세포 외부로부터 제공되고/되거나 세포에 의해 제조되지 않는 단백질)를 상기 세포로 도입할 수 있다.
따라서, 폴리펩티드의 세포로의 도입, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트의 세포로의 도입과 관련하여 본원에 기재된 본 발명의 임의의 실시양태의 경우, 본 발명이 또한 단백질로서의 폴리펩티드의 상기 세포로의 외인성 도입을 명확히 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, (ａ) Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및/또는 Sox 폴리펩티드 중 1종 이상을 비만능 세포로 외인성으로 도입함으로써; 임의로 (ｂ) 상기 세포를 MEK 억제제, H3K9 메틸화를 억제하는 제제, L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상과 접촉시켜, 유도 만능 줄기 세포를 제조함으로써 포유동물 비만능 세포를 만능성으로 유도할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 1종 이상(임의로, 2종 또는 3종)의 단백질을 내인성으로 발현하는 비만능 세포가 확인된다. 그러면, 상기 군으로부터 선택되는 (내인성으로 발현하지 않는) 나머지 단백질은 상기 세포에서 외인성으로 발현될 수 있고, 임의로 MEK 억제제, H3K9 메틸화를 억제하는 제제, L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 및/또는 erk 억제제 중 1종 이상의 존재 하에 만능 세포로의 재프로그래밍 및/또는 역분화에 대해 스크리닝할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, Sox 폴리펩티드 및/또는 Myc 폴리펩티드를 내인성으로 발현하는 세포가 확인되고, 제2 단계로서 Oct 폴리펩티드 및 Klf 폴리펩티드를 상기 세포로 외인성으로 도입하여, 상기 세포의 만능 세포로의 전환을 유도할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Oct 폴리펩티드 및/또는 Klf 폴리펩티드 및/또는 Myc 폴리펩티드를 내인성으로 발현하는 세포가 확인되고, Sox 폴리펩티드를 상기 세포로 외인성으로 도입하여, 상기 세포의 만능 세포로의 전환을 유도할 수 있다.
폴리펩티드의 세포로의 외인성 도입은 여러 방식으로 발생할 수 있다. 1종 이상의 단백질의 상기 세포로의 도입을 허용하는 조건 하에 표적 세포의 존재 하에 상기 단백질을 단순히 배양할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 외인성 단백질은 세포(및 임의로 세포 핵)에 진입하는 전사 인자의 능력을 증대시키는 폴리펩티드에 연결된 (예를 들면, 융합 단백질로서 연결되거나, 그렇지 않으면 공유로 또는 비공유로 연결된) 관심 있는 전사 인자 폴리펩티드를 포함한다.
막을 통한 수송을 증대시키는 폴리펩티드 서열의 예로는 초파리 동형 단백질 안테나페디아 전사 단백질(AntHD)(Joliot et al, New Biol. 3: 1121-34,1991; Joliot et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 1864-8,1991; Le Roux et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 9120-4,1993), 단순 헤르페스 바이러스 구조 단백질 VP22(Elliott and O'Hare, Cell 88: 223-33,1997); HIV-1 전사 활성제 TAT 단백질(Green and Loewenstein, Cell 55: 1179-1188, 1988; Frankel and Pabo, Cell 55: 1289-1193, 1988); 예컨대, US 특허 제6,730,293호에 기재된 전달 향상 운반체(적어도 7개 내지 25개의 연속 아르기닌을 포함하는 펩티드 서열을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음); 및 상업적으로 구입 가능한 Penetratin™ 1 펩티드, 및 Daitos S.A.(프랑스 파리 소재)로부터 구입 가능한 Vectocell® 플랫폼의 Diatos Peptide Vectors("DPV")를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, WO/2005/084158 및 WO/2007/123667 및 이들 문헌에 기재된 추가 운반체를 참조한다. 상기 단백질은 원형질막을 통해 통과할 수 있을 뿐만 아니라, 본원에 기재된 전사 인자와 같은 다른 단백질의 부착은 상기 복합체의 세포 흡수를 자극하기에 충분하다.
몇몇 실시양태에서, 본원에 기재된 전사 인자 폴리펩티드를 리포솜, 또는 지질 칵테일, 예컨대 상업적으로 구입 가능한 Fugene6 및 리포펙타민(Lipofectamine)의 일부로서 외인성으로 도입한다. 다른 별법에서, 상기 전사 인자 단백질을 미량주사할 수 있거나, 그렇지 않으면 표적 세포로 직접 도입할 수 있다.
실시예에 기재된 바대로, 본 발명자들은 연장 기간 동안 본 발명의 전사 인자 폴리펩티드에 의한 세포의 항온처리는 세포에 독성을 나타낸다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명은 Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및/또는 Sox 폴리펩티드 중 1종 이상에 의한 비만능 포유동물 세포의 간헐적 항온처리를 제공하고, 1종 이상의 폴리펩티드의 부재 하에 세포의 항온처리의 기간이 개재된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 폴리펩티드 존재 및 부재 하의 항온처리 사이클을 2회, 3회, 4회, 5회, 6회 이상 반복할 수 있고, 충분한 시간(즉, 단백질 존재 및 부재 하의 항온처리) 동안 수행하여 만능 세포의 발생을 달성할 수 있다. 상기 방법의 효율을 증대시키기 위해 다양한 제제(예를 들면, MEK 억제제 및/또는 GSK 억제제 및/또는 TGF베타 억제제)가 포함될 수 있다.
Ｃ. iPS 전사 인자의 소분자 대체
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 세포는 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드로부터 선택되는 1종 이상(예를 들면, 1종, 2종, 또는 3종 이상)의 단백질을 (내인성으로 또는 이종성으로) 발현하고 1종 이상의 제제와 접촉하고, 상기 제제는 나머지 발현되지 않은 단백질 중 1종 이상, 즉 상기 세포에서 발현되지 않은 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드, 또는 Sox 폴리펩티드 중 어느 1종의 발현의 부재 하에 상기 세포를 만능 줄기 세포로 유도하기에 충분하다.
실시예에 기재된 바대로, 상기 세포를 특정 제제와 접촉시키는 것은 일반적으로 달리 상기 단백질 중 1종의 필수적인 발현으로 이해되는 것을 "보완" 또는 대체하여 만능 세포를 생성할 수 있다. 상기 기재된 단백질 중 1종의 발현을 기능적으로 대체하는 제제를 세포와 접촉시킴으로써, 상기 제제에 의해 대체 또는 보완된 단백질을 제외하고 상기 기재된 단백질 모두가 발현되는 만능 세포를 생성할 수 있다. 나머지 단백질은 내인성으로, 이종성으로, 또는 몇몇 2종 조합으로 발현할 수 있다(예를 들면, 상기 세포를 H3K9의 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 제제와 같은 상보적 제제와 접촉시키는 대신에 Sox 및 Myc 폴리펩티드를 내인성으로 발현시킬 수 있고, Klf 폴리펩티드를 이종성으로 발현시킬 수 있고, Oct 폴리펩티드를 "대체"할 수 있다).
또한, 소분자는 만능 세포(예를 들면, iPS 세포)를 생성하는 과정의 효율을 증대시킬 수 있다. 예를 들면, 상기 만능 세포 생성 시간이 가속화되는 것으로 (예를 들면, 소분자가 없는 유사한 또는 동일한 과정과 비교하여 만능 세포의 발생 시간을 적어도 1 일 감축시킴으로써) 효율 증대가 입증될 수 있다. 대안적으로, 또는 조합으로, (예를 들면, 소정 시간에 소분자가 없는 유사한 또는 동일한 과정과 비교하여 특정 과정에 의해 생성되는 만능 세포의 수를 적어도 10%, 50%, 100%, 200%, 500% 등으로 감소시킴으로써) 소분자는 그 수를 증가시킬 수 있다.
실시예에 기재된 바대로, Klf4, Sox2 및 Myc를 이종성으로 발현하는 세포를 Oct4의 이종성 발현 없이 H3K9 메틸화를 억제하는 제제와 추가로 접촉시킴으로써 상기 세포를 만능성으로 유도할 수 있다. 실제로, 비만능 세포를 H3K9 메틸화 및 오로지 Oct4(예를 들면, 또한 Myc 폴리펩티드, Sox 폴리펩티드, 또는 Klf 폴리펩티드를 발현하기 위한 벡터를 도입하지 않고) 또는 Klf4와 함께 Oct4의 도입을 억제하는 제제를 접촉시킴으로써 만능성을 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 만능성으로 유도될 수 있는 세포로는 신경 전구 세포 및 섬유아세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. H3K9 메틸화를 억제하는 제제로는 H3K9를 표적으로 하는 메틸라제(또한 메틸 트랜스퍼라제로도 공지됨)를 억제하는 제제를 들 수 있다. 예를 들면, G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제는 H3K9를 메틸화하고 G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 억제는 H3K9의 메틸화를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 문헌[Kubicek, ef al, Mol. Cell 473-481 (2007)] 참조. 본 발명의 방법에 따라 유용한 G9a 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 예로는 BIX01294(예를 들면, 문헌[Kubicek, et al., Mol. Cell 473-481 (2007)] 참조), 또는 이의 염, 수화물, 이소폼, 라세미체, 용매화물 및 전구체 형태를 들 수 있다. BixO1294는 하기 도시하였다:
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BIXO1294
또한, 본 발명의 BixO1294 화합물은 염, 수화물, 용매화물 및 전구체 형태를 포함한다. BixO1294는 비대칭 탄소 원자(광학 중심) 또는 이중 결합을 보유하고; 라세미체, 부분입체이성체, 기하 이성체 및 개별 이성체는 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 R 이성체 또는 S 이성체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 E 이성체 또는 Z 이성체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, H3K9 메틸화를 억제하는 제제는 히스톤 메틸 트랜스퍼라제의 기질 유사체이다. 다수의 메틸 트랜스퍼라제의 기질은 S-아데노실-메티오닌(SAM)이다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, H3K9 메틸화를 억제하는 제제는 SAM 유사체이다. SAM 유사체의 예로는 메틸티오-아데노신(MTA), 시네펀진(sinefungin), 및 S-아데노실-호모시스테인(SAH)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 실시양태에서, H3K9 메틸화를 억제하는 제제는 히스톤 메틸 트랜스퍼라제에 대해 SAM과 경쟁하지 않는다.
(이종성 발현 및/또는 소분자 "대체"로부터) 생성된 만능 세포는 내배엽(예를 들면, 내부 위장관 내층), 중배엽(예를 들면, 근육, 골, 혈액), 및 외배엽(예를 들면, 상피 조직 및 신경계)의 3개의 주요 조직 형태의 많은 또는 모든 형태로 발생할 수 있지만, 임의로, 그 발생 잠재력에 제한을 나타낼 수 있다(예를 들면, 이것은 태반 조직, 또는 한정된 계통의 다른 세포 유형을 형성하지 않을 수 있다). 상기 세포는 인간 또는 비인간(예를 들면, 영장류, 랫트, 마우스, 랫트, 소, 개, 고양이, 돼지 등)일 수 있다.
다른 실시양태에서, 이전에 만능이 아니었던 세포에서 만능성을 유도하기 위해 BIX01294, 또는 H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 다른 제제를 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포에서 Oct4 발현, 또는 적어도 Oct4 프로모터 DNA 메틸화 및/또는 히스톤 메틸화의 변경을 유도하여 세포를 만능성으로 유도하기 위해 H3K9 메틸화를 억제하는 제제를 사용한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 원래 만능 세포가 아닌 세포를 H3K9 메틸화를 억제하는 제제와 접촉시켜 상기 세포가 만능이 되도록 유도한다. 실제로, 본 발명을 특정 작용 방식으로 제한하고자 의도함이 없이, 본 발명자들은 비만능 세포를 H3K9 메틸화를 억제하거나, 또는 H3K9 탈메틸화를 촉진하는 다른 제제를 접촉시키는 것은 세포를 만능성으로 유도하는 임의의 방법을 개선한다고 생각한다. 예를 들면, 비만능 세포를 H3K9 메틸화를 억제하는 제제와 접촉시는 단계, 또한 임의로 상기 세포를 L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에서 H3K9 메틸화를 억제하는 제제를 비만능 세포와 접촉시켜 만능성으로 유도할 수 있고, 각각의 화합물은 유도 효율을 증대시키기에 충분한 양으로 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 이 문장에 기재된 바대로, 오로지 Oct4, 또는 Oct4/Klf4, 또는 Sox2/Klf4를 비만능 세포로 이종성으로 더 발현시켜 본원에 기재된 제제와 접촉 후 만능성을 유도할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 GSK 억제제 및 HDAC 억제제, 또는 GSK 억제제 및 cAMP 경로 활성제, 또는 GSK 억제제 및 ALK5 억제제의 조합이 오로지 Oct4, Oct4/Klf4 또는 Sox2/Klf4(데이터 기재 안 함) 중 어느 하나를 발현하는 마우스 또는 인간 섬유아세포 또는 케라틴 세포 중 어느 하나를 만능성으로 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 다른 실시양태에서, 비만능 세포를 GSK3 억제제와 접촉시는 단계, 또한 임의로 상기 세포를 L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에서 비만능 세포를 만능성으로 유도하고, 각각의 화합물은 유도 효율을 증대시키기에 충분한 양으로 포함된다. 다른 실시양태에서, 비만능 세포를 TGFβ 수용체/ALK5 억제제와 접촉시는 단계, 또한 임의로 상기 세포를 L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에서 비만능 세포를 만능성으로 유도하고, 각각의 화합물은 유도 효율을 증대시키기에 충분한 양으로 포함된다. 다른 실시양태에서, 비만능 세포를 HDAC 억제제와 접촉시는 단계, 또한 임의로 상기 세포를 L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, 또는 erk 억제제 중 1종 이상과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에서 비만능 세포를 만능성으로 유도하고, 각각의 화합물은 유도 효율을 증대시키기에 충분한 양으로 포함된다. 다른 실시양태에서, 비만능 세포를 MEK 억제제와 접촉시는 단계, 또한 임의로 상기 세포를 L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 억제제 중 1종 이상과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에서 비만능 세포를 만능성으로 유도하고, 각각의 화합물은 유도 효율을 증대시키기에 충분한 양으로 포함된다. 다른 실시양태에서, 비만능 세포를 MEK 억제제, L형 Ca 채널 효능제; H3K9 메틸화를 억제하는 제제, cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 2종, 3종, 4종, 5종, 6종, 7종, 8종, 9종 또는 각각과 접촉시키는 단계를 또한 포함하는 방법에서 비만능 세포를 만능성으로 유도하고, 각각의 화합물은 유도 효율을 증대시키기에 충분한 양으로 포함된다. 몇몇 실시양태에서, 이 문장에 기재된 바대로, 오로지 Oct4, 또는 Oct4/Klf4, 또는 Sox2/Klf4를 비만능 세포로 이종성으로 더 발현시켜 본원에 기재된 바대로 제제와 접촉 후 만능성을 유도할 수 있다.
L형 칼슘 채널 효능제의 예로는 BayK8644(예를 들면, 문헌[Schramm, et al., Nature 303: 535-537 (1983)] 참조), 데하이드로디뎀닌 B(예를 들면, US 특허 제6,030,943호 참조), FPL 64176(FPL)(예를 들면, 문헌[Liwang, et al., Neuropharmacology 45: 281-292 (2003)] 참조), S(+)-PN 202-791(예를 들면, 문헌[Kennedy, et al., Neuroscience 49: 937-44 (1992)] 참조) 및 CGP 48506(예를 들면, 문헌[Chahine, et al., Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 81: 135-141 (2003)] 참조)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
cAMP 경로의 활성제의 예로는 포스콜린(예를 들면, 문헌[Liang, et al., Endocrinology 146: 4437-4444 (2005)] 참조), FSH(상기 Liang 문헌 참조), 밀리논(상기 Liang 문헌 참조), 실로스타미드(상기 Liang 문헌 참조), 롤리프람(상기 Liang 문헌 참조), dbcAMP(상기 Liang 문헌 참조) 및 8-Br-cAMP(상기 Liang 문헌 참조)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제의 예로는 DNMT에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이의 발현을 억제하는 siRNA 및 안티센스 핵산을 들 수 있다. DNMT 억제제로는 RG108(예를 들면, Sigma-Aldrich로부터 구입 가능), 5-아자-C(5-아자시티딘 또는 아자시티딘)(예를 들면, 문헌[Schermelleh, et al., Nature Methods 2: 751-6 (2005)] 참조), 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-아자-CdR)(예를 들면, 문헌[Zhu, Clinical Medicinal Chemistry 3(3): 187-199 (2003)] 참조), 데시타빈(예를 들면, 문헌[Gore, Nature Clinical Practice Oncology 2: S30-S35 (2005)] 참조), 독소루빈(예를 들면, 문헌[Levenson, Molecular Pharmacology 71: 635-637 (2007)] 참조), EGCG((-)-에피갈로카테킨-3-갈레이트)(예를 들면, 문헌[Fang, et al., Cancer Research 63: 7563-7570 (2003)] 참조), RG108(예를 들면, WO2008/126932(Carninci, et al.) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨) 및 제불라린(상기 Carninci 문헌 참조)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 핵 수용체 리간드, 즉, 핵 수용체의 효능제, 길항제, 활성제 및/또는 억제자는 전달 부위에서 국소 유전자 발현 또는 전사를 조절할 수 있다. 핵 수용체 효능제(및 또한 핵 수용체 길항제)를 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 핵 수용체는 전사의 보조 조절제이다. 특정 핵 수용체의 활성화 또는 억제는 이것이 결합하는 특정 유전자좌의 후성적 상태를 조절한다. 본 발명자들은 덱사메타손(예를 들면, 1 μM에서, 글루코고르티코이드 수용체 효능제), 시클리타존 및 Fmoc-Leu(둘 다 5 μM에서 사용됨)(PPAR 효능제), 및 벡사로텐(예를 들면, 3 μM에서)(RXR 길항제)가 세포 재프로그래밍을 개선할 수 있다는 것을 발견하였다. 대표적인 핵 수용체 리간드로는 에스트라디올(예를 들면, 17-베타 에스트라디올), 올-트랜스(all-trans) 레티노산, 13-시스 레티노산, 덱사메타손, 클로베타솔, 안드로겐, 티록신, 비타민 D3 글리타존, 트로글리타존, 피오글리타존, 로지글리타존, 프로스타글란딘 및 피브레이트(예를 들면, 베자피브레이트, 시프로피브레이트, 겜피브로질, 페노피브레이트 및 클로피브레이트)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 내인성 리간드(예컨대, 호르몬 에스타라디올 및 테스토스테론)의 활성은 그 동족 핵 수용체에 결합할 때 통상 유전자 발현을 상향 조절하는 것이다. 리간드에 의한 이러한 유전자 발현의 상향 조절 또는 자극을 효능제 반응이라 칭할 수 있다. 또한, 특정 합성 리간드, 예를 들면 글루코코르티코이드 수용체 소염 약물 덱사메타손에 의해 내인성 호르몬의 효능제 효과를 모방할 수 있다. 활성 보조인자(coactivator) 결합을 선호하는 수용체의 배열을 유도함으로써 효능제 리간드는 작용한다(예를 들면, WO08011093 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨).
GSK3의 억제제로는 GSK3에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이를 표적으로 하는 siRNA 및 안티센스 핵산을 들 수 있다. GSK3 억제제의 특정 예로는 켄파울론(Kenpaullone), 1-아자켄파울론, CHIR99021, CHIR98014, AR-A014418(예를 들면, 문헌[Gould, et al., The International Journal of Neuropsychopharmacology 7: 387-390 (2004)] 참조), CT 99021(예를 들면, 문헌[Wagman, Current Pharmaceutical Design 10: 1105-1137 (2004)] 참조), CT 20026(상기 Wagman 문헌 참조), SB216763(예를 들면, 문헌[Martin, et al., Nature Immunology 6: 111-184 (2005)] 참조), AR-A014418(예를 들면, 문헌[Noble, et al., PNAS 102: 6990-6995 (2005)] 참조), 리튬(예를 들면, 문헌[Gould, et al., Pharmacological Research 48: 49-53 (2003)] 참조), SB 415286(예를 들면, 문헌[Frame, et al., Biochemical Journal 359: 1-16 (2001)] 참조) 및 TDZD-8(예를 들면, 문헌[Chin, et al., Molecular Brain Research, 137(1-2): 193-201 (2005)] 참조)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 칼바이오켐(Calbiochem)으로부터 구입 가능한 추가의 예시적인 GSK3 억제제(예를 들면, WO2008/094597(Dalton, et al.) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨)로는 BIO(2'Z,3'￡)-6-브로모인디루빈-3'-옥심(GSK3 억제제 IX); BIO-아세톡심(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-아세톡심(GSK3 억제제 X); (5-메틸-1H-피라졸-3-일)-(2-페닐퀴나졸린-4-일)아민(GSK3 억제제 XIII); 피리도카바졸-시클로펜다디에닐루테늄 착제(GSK3 억제제 XV); TDZD-8 4-벤질-2-메틸-1,2,4-티아디아졸리딘-3,5-디온(GSK3β 억제제 I); 2-티오(3-요오도벤질)-5-(1-피리딜)-[1,3,4]-옥사디아졸(GSK3β 억제제 II); OTDZT 2,4-디벤질-5-옥소티아디아졸리딘-3-티온(GSK3β 억제제 III); 알파-4-디브로모아세토페논(GSK3β 억제제 VII); AR-AO 14418 N-(4-메톡시벤질)-N'-(5-니트로-1,3-티아졸-2-일)우레아(GSK3β 억제제 VIII); 3-(1-(3-히드록시프로필)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일]-4-피라진-2-일-피롤-2,5-디온(GSK3β 억제제 XI); TWSl 19 피롤로피리미딘 화합물(GSK3β 억제제 XII); L803 H-KEAPP APPQSpP-NH2 또는 이의 미리스토일화 형태(GSK3β 억제제 XIII); 2-클로로-1-(4,5-디브로모-티오펜-2-일)-에타논(GSK3β 억제제 VI); AR-AO144-18; SB216763; 및 SB415286을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 억제제와 상호작용하는 GSK3b의 잔기가 확인되었다. 예를 들면, 문헌[Bertrand et al., J. MoI Biol. 333(2): 393-407 (2003)] 참조. GSK3 억제제는 예를 들면 Wnt/β-카테닌 경로를 활성화할 수 있다. 많은 β-카테닌 다운스트림 유전자는 만능성 유전자 네트워크를 보조 조절한다. 예를 들면, GSK 억제제는 cMyc 발현을 활성화할 뿐만 아니라, 이의 단백질 안정성 및 전사 활성을 증대시킨다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, GSK3 억제제를 사용하여 세포에서 내인성 Myc 폴리펩티드 발현을 자극함으로써 Myc 발현이 만능성을 유도해야 하는 필요성을 제거할 수 있다.
MEK의 억제제로는 MEK에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이의 발현을 억제하는 siRNA 및 안티센스 핵산을 들 수 있다. MEK 억제제의 특정 예로는 PD0325901(예를 들면, 문헌[Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22: 4456-4462 (2004)] 참조), PD98059(예를 들면, Cell Signaling Technology로부터 구입 가능), U0126(예를 들면, Cell Signaling Technology로부터 구입 가능), SL327(예를 들면, Sigma-Aldrich로부터 구입 가능), ARRY-162(예를 들면, Array Biopharma로부터 구입 가능), PD184161(예를 들면, 문헌[Klein, et al., Neoplasia 8: 1-8 (2006)] 참조), PD184352(CI-1040)(예를 들면, 문헌[Mattingly, et al., The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316: 456-465 (2006)] 참조), 수니티닙(예를 들면, US2008004287(Voss, et al) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨), 소라페닙(상기 Voss 문헌 참조), 반데타닙(상기 Voss 문헌 참조), 파조파닙(상기 Voss 문헌 참조), 악시티닙(상기 Voss 문헌 참조) 및 PTK787 을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
현재, 몇몇 MEK 억제제에 임상 실험 평가가 이루어지고 있다. CI-1040은 암에 대해 1상 및 2상 임상 실험에서 평가되고 있다(예를 들면, 문헌[Rinehart, et al., Journal of Clinical Oncology 22(22): 4456-4462 (2004)] 참조). 임상 실험에서 평가되고 있는 다른 MEK 억제제로는 PD184352(예를 들면, 문헌[English, et al., Trends in Pharmaceutical Sciences 23(1): 40-45 (2002)] 참조), BAY 43-9006(예를 들면, 문헌[Chow, et al., Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 46: 72-78 (2001)] 참조), PD-325901(또한 PD0325901), GSK1120212, ARRY-438162, RDEA119, AZD6244(또한 ARRY-142886 또는 ARRY-886), RO5126766, XL518 및 AZD8330(또한 ARRY-704)을 들 수 있다. 예를 들면, 미국 국립 보건원의 웹 사이트(www.clinicaltrials.gov) 및 미국 국립 암 연구소의 웹 사이트(www.cancer.gov/clinicaltrials)로부터의 정보를 참조한다.
TGFβ 수용체(예를 들면, ALK5) 억제제로는 TGFβ 수용체(예를 들면, ALK5)에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이의 발현을 억제하는 안티센스 핵산을 들 수 있다. TGFβ 수용체/ALK5 억제제의 예로는 SB431542(예를 들면, 문헌[Inman, et al., Molecular Pharmacology 62(1) :65-74 (2002)] 참조), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카르보티오아미드(예를 들면, 문헌[Tojo, et al., Cancer Science 96(11): 791-800 (2005)] 참조)로도 공지되고 예를 들면 Toicris Bioscience로부터 상업적으로 구입 가능한 A-83-01; 2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘, Wnt3a/BIO(예를 들면, WO2008/094597(Dalton, et al.) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨), BMP4(상기 Dalton 문헌 참조), GW788388(-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]피리딘-2-일}-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)벤즈아미드)(예를 들면, 문헌[Gellibert, et al., Journal of Medicinal Chemistry 49(7): 2210-2221 (2006)] 참조), SM16(예를 들면, 문헌[Suzuki, et al., Cancer Research 67(5): 2351-2359 (2007)] 참조), IN-1130(3-((5-(6-메틸피리딘-2-일)-4-(퀴녹살린-6-일)-1H-이미다졸-2-일)메틸)벤즈아미드)(예를 들면, 문헌[Kim, et al., Xenobiotica 38(3): 325-339 (2008)] 참조), GW6604(2-페닐-4-(3-피리딘-2-일-1H-피라졸-4-일)피리딘)(예를 들면, 문헌[de Gouville, et al., Drug News Perspective 19(2): 85-90 (2006)] 참조), SB-505124(2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드)(예를 들면, 문헌[DaCosta, et al., Molecular Pharmacology 65(3): 744-752 (2004)] 참조) 및 피리미딘 유도체(예를 들면, WO2008/006583(Stiefl, et al.)에 기재된 것 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, "ALK5 억제제"가 비특이적 키나제 억제제를 포함하는 것으로 의도되지 않지만, "ALK5 억제제"는 예를 들면 SB-431542와 같은 ALK5 이외에 ALK4 및/또는 ALK7를 억제하는 억제제를 포함하는 것으로 이해되어야 한다(예를 들면, 문헌[Inman, et al.,J Mol. Phamacol. 62(1): 65-74 (2002)] 참조). 본 발명의 범위를 제한하고자 의도함이 없이, ALK5 억제제는 중간엽의 상피 전환/이행(MET) 과정에 영향을 미치는 것으로 생각된다. TGFβ/액티빈 경로는 상피의 중간엽 이행(EMT)에 대한 구동자이다. 따라서, TGFβ/액티빈 경로를 억제하는 것은 MET 과정(즉, 재프로그래밍)을 촉진할 수 있다.
ALK5를 억제하는 효과를 나타내는 본원의 데이터의 관점에서, TGFβ/액티빈 경로의 억제는 유사한 효과를 미치는 것으로 생각된다. 따라서, 본원의 각 문단에 기재된 바대로 ALK5 억제제와 조합하여 또는 이것 대신에 TGFβ/액티빈 경로의 임의의 억제제(예를 들면, 상향 스트림 또는 하향 스트림)를 사용할 수 있다. TGFβ/액티빈 경로 억제제의 예로는 TGFβ 수용체 억제제, SMAD 2/3 포스포릴화의 억제제, SMAD 2/3 및 SMAD 4의 상호작용의 억제제, 및 SMAD 6 및 SMAD 7의 활성제/효능제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, 이하 기재된 분류는 단지 분류의 목적이고, 당업자는 화합물이 경로 내 하나 이상의 지점에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 화합물이 한정된 카테고리 중 하나 이상에서 작용할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
TGFβ 수용체 억제제로는 TGFβ 수용체에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이를 표적으로 하는 siRNA 또는 안티센스 핵산을 들 수 있다. 억제제의 구체적인 예로는 SU5416; 2-(5-벤조[1,3]디옥솔-5-일-2-tert-부틸-3H-이미다졸-4-일)-6-메틸피리딘 하이드로클로라이드(SB-505124); 레르델리뭅(lerdelimumb)(CAT-152); 메텔리뭅(metelimumab)(CAT-192); GC-1008; ID11; AP-12009; AP-11014; LY550410; LY580276; LY364947; LY2109761; SB-505124; SB-431542; SD-208; SM16; NPC-30345; Ki26894; SB-203580; SD-093; 글리벡; 3,5,7,2',4'-펜타히드록시피아본(Morin); 액티빈-M108A; P144; 가용성 TBR2-Fc; 및 TGFβ 수용체를 표적으로 하는 안티센스 형질감염된 종양 세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다(예를 들면, 문헌[Wrzesinski, et al., Clinical Cancer Research 13(18): 5262-5270 (2007); Kaminska, et al., Acta Biochimica Polonica 52(2): 329-337 (2005); 및 Chang, et al., Frontiers in Bioscience 12: 4393-4401 (2007)] 참조).
SMAD 2/3 포스포릴화의 억제제로는 SMAD2 또는 SMAD3에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 들 수 있다. 억제제의 구체적인 예로는 PD169316; SB203580; SB-431542; LY364947; A77-01; 및 3,5,7,2',4'-펜타히드록시플라본(Morin)을 들 수 있다(예를 들면, 상기 Wrzesinski 문헌; 상기 Kaminska 문헌; 문헌[Shimanuki, et al., Oncogene 26: 3311-3320 (2007)]; 및 EP1992360(Kataoka, et al.) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨).
SMAD 2/3 및 smad4의 상호작용의 억제제로는 SMAD2, SMAD3 및/또는 smad4에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 들 수 있다. SMAD 2/3 및 SMAD4의 상호작용의 억제제의 구체적인 예로는 Trx-SARA, Trx-xFoxH1b 및 Trx-Lef1을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다(예를 들면, [Cui, et al., Oncogene 24: 3864-3874 (2005) 및 Zhao, et al., Molecular Biology of the Cell, 17: 3819-3831 (2006)] 참조).
SMAD 6 및 SMAD 7의 활성제/효능제로는 SMAD 6 또는 SMAD 7에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이를 표적으로 하는 안티센스 핵산을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 억제제의 구체적인 예로는 smad7-as PTO-올리고뉴클레오티드를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다(예를 들면, US6534476(Miyazono, et al.) 및 US2005119203(Steinbrecher, et al.) 참조, 둘 다 본원에 참조문헌으로 포함됨).
예시적인 HDAC 억제제로는 HDAC에 결합하는 항체, 이의 우성 음성 변이체 및 이를 표적으로 하는 siRNA 또는 안티센스 핵산을 들 수 있다. HDAC 억제제의 구체적인 예로는 TSA(트리코스타틴 A)(예를 들면, 문헌[Adcock, British Journal of Pharmacology 150: 829-831 (2007)] 참조), VPA(발프로산)(예를 들면, 문헌[Munster, et al., Journal of Clinical Oncology 25: 18S (2007): 1065] 참조), 나트륨 부티레이트(NaBu)(예를 들면, 문헌[Han, et al., Immunology Letters 108: 143-150 (2007)] 참조), SAHA(수베로일아닐리드 히드록사민산 또는 보리노스타트)(예를 들면, 문헌[Kelly, et al., Nature Clinical Practice Oncology 2: 150-157 (2005)] 참조), 나트륨 페닐부티레이트(예를 들면, 문헌[Gore, et al., Cancer Research 66: 6361-6369 (2006)] 참조), 뎁시펩티드(FR901228, FK228)(예를 들면, 문헌[Zhu, et al., Current Medicinal Chemistry 3(3): 187-199 (2003)] 참조), 트라폭신(TPX)(예를 들면, 문헌[Furumai, et al., PNAS 98(1): 87-92 (2001)] 참조), 환형 히드록사민산 함유 펩티드 1(CHAP1)(상기 Furumai 문헌 참조), MS-275(예를 들면, WO2008/126932(Carninci, et al.) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨), LBH589(예를 들면, WO2008/108741(Goh, et al.) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨) 및 PXD101(상기 Goh 문헌 참조)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일반적으로 전반적 수준에서, 만능 세포는 더 많은 히스톤 아세틸화를 갖고, 분화 세포는 더 적은 히스톤 아세틸화를 갖는다. 또한, 히스톤 아세틸화는 히스톤 및 DNA 메틸화 조절에 관여한다. 몇몇 실시양태에서, HDAC 억제제는 침묵 만능성 유전자의 활성화를 촉진한다.
ERK 억제제의 예로는 PD98059(예를 들면, 문헌[Zhu, et al., Oncogene 23: 4984-4992 (2004)] 참조), UO126(상기 Zhu 문헌 참조), FR 180204(예를 들면, 문헌[Ohori, Drug News Perspective 21(5): 245-250 (2008)] 참조), 수니티닙(예를 들면, US2008004287(Ma, et al.) 참조, 본원에 참조문헌으로 포함됨), 소라페닙(상기 Ma 문헌 참조), 반데타닙(상기 Ma 문헌 참조), 파조파닙(상기 Ma 문헌 참조), 악시티닙(상기 Ma 문헌 참조) 및 PTK787(상기 Ma 문헌 참조)을 들 수 있다.
일단 발현 카세트가 세포로 도입되고/되거나 세포가 1종 이상의 제제와 접촉하면, 임의로 만능 줄기 세포의 특성에 대해 그 세포를 스크리닝하여, 혼합물 중에 만능인 세포를 확인할 수 있다. 예를 들면, 상기 세포를 다른 세포로부터 분리하고 적절한 경우 추가로 사용할 수 있다.
Ⅲ. 비만능 세포
본원에서 사용된 "비만능 세포"는 만능 세포가 아닌 포유동물 세포를 의미한다. 이러한 세포의 예로는 분화 세포 및 전구 세포를 들 수 있다. 분화 세포의 예로는 골수, 피부, 골격근, 지방 조직 및 말초 혈액으로부터 선택되는 조직 유래의 세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 세포 유형의 예로는 섬유아세포, 간 세포, 근아 세포, 뉴런, 골아 세포, 파골 세포 및 T-세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
객체를 생성된 만능 세포로 치료하고자 하는 몇몇 실시양태에서, 상기 객체 자신의 비만능 세포를 사용하여 본 발명의 방법에 따른 만능 세포를 생성할 수 있다.
예를 들면, 인간 또는 비인간 포유동물로부터 세포가 유래일 수 있다. 비인간 포유동물의 예로는 마우스, 랫트, 고양이, 개, 래빗, 기니아 돼지, 햄스터, 양, 돼지, 말 및 소를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
Ⅳ. 형질전환
본 발명은 재조합 유전학 분야에서 일상적 기법에 의존한다. 본 발명에서 사용되는 일반 방법을 개시하는 기본서로는 문헌[Sambrook et al.. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al, eds., 1994))]을 들 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 발현하고자 하는 단백질 및 세포의 종은 동일하다. 예를 들면, 마우스 세포를 사용하는 경우, 마우스 상동 유전자를 상기 세포로 도입한다. 인간 세포를 사용하는 경우, 인간 상동 유전자를 상기 세포로 도입한다.
2종 이상의 단백질을 세포에서 발현하고자 할 때, 1종 또는 다수의 발현 카세트를 사용할 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들면, 1종의 발현 카세트가 다수의 폴리펩티드를 발현할 때, 다시스트론성 발현 카세트를 사용할 수 있다.
Ａ. 플라스미드 벡터
특정 실시양태에서, 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용하기 위해 플라스미드 벡터를 생각할 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포와 화합성인 종 유래의 제어 서열 및 레플리콘을 함유하는 플라스미드 벡터를 상기 숙주와 관련하여 사용한다. 상기 벡터는 레플리콘 부위를 보유할 뿐만 아니라, 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 서열을 만들 수 있다.
Ｂ. 바이러스 벡터
특정 바이러스가 세포를 감염시키거나 또는 수용체 매개 내포작용을 통해 세포에 진입하는 능력, 및 숙주 세포 게놈으로 통합되고 바이러스 유전자를 안정하게 및 효율적으로 발현하는 능력은 해당 바이러스를 외래 핵산을 세포(예를 들면, 포유동물 세포)로 운반하기 위한 매력적인 후보자로 만든다. 본 발명의 핵산을 전달하기 위해 사용할 수 있는 바이러스 벡터의 비제한적인 예는 하기 기재되어 있다.
ⅰ. 아데노바이러스 벡터
핵산의 전달을 위한 특정 방법은 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. 아데노바이러스 벡터가 게놈 DNA로의 통합에 대한 낮은 능력을 갖는 것으로 알려져 있지만, 이러한 특징은 이 벡터에 의해 제공되는 유전자 운반의 높은 효율에 의해 균형잡힌다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (ａ) 작제물의 팩키징을 보조하기에 그리고 (ｂ) 조직 또는 세포 내에 클로닝되는 조직 또는 세포 특이적 작제물을 궁극적으로 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함한다는 것을 의미한다. 유전자 구성 또는 아데노바이러스, 약 36 kb, 선형 이중 가닥 DNA 바이러스의 지식으로 7 kb 이하의 외래 서열을 갖는 아데노바이러스 DNA의 다수의 치환이 가능하다(Grunhaus et al., Seminar in Virology, 200(2): 535-546, (1992)).
ⅱ. AAV 벡터
아데노바이러스 보조 형질감염을 이용하여 핵산을 세포로 도입할 수 있다. 아데노바이러스 커플링 시스템을 이용하는 세포 시스템에서 형질감염 효율 증가가 보고되었다(Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6): 1110-7, 1994; Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13): 6094-6098, 1992; Curiel, Nat Immun, 13(2-3): 141-64, 1994). 아데노 보조 바이러스(AAV)는 높은 통합 빈도를 갖고 비분할 세포를 감염시켜, 예를 들면 조직 배양(Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129, 1992)에서 또는 생체내에서 포유동물 세포로의 유전자의 전달이 유용하게 만드므로 매력적인 벡터 시스템이다. rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 자세한 사항은 미국 특허 제5,139,941호 및 제4,797,368호(각각은 본원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재되어 있다.
ⅲ. 레트로바이러스 벡터
레트로바이러스는 그 유전자를 숙주 게놈으로 통합시켜 다량의 외래 유전자 물질을 운반함으로써 특수 세포주에서 팩키징되는 광범위 스펙트럼의 종 및 세포 유형을 감염시키는 그 능력으로 인해 유전자 전달 벡터로서 유망하다(Miller et al., Am. J. Clin. Oncol, 15(3): 216-221, 1992).
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 복제 결함인 바이러스를 제조하기 위한 특정 바이러스 서열 대신에 핵산(예를 들면, 관심 있는 유전자를 코딩하는 핵산)을 바이러스 게놈으로 삽입한다. 비리온을 제조하기 위해, 팩키징 성분 및 LTR을 함유하지 않지만 gag, pol, 및 env 유전자를 함유하는 팩키징 세포주를 작제한다(Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983). cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 레트로바이러스 LTR 및 팩키징 서열과 함께 (예를 들면, 인산칼슘 침강 등에 의해) 특수 세포주로 도입될 때, 팩키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사가 바이러스 입자로 팩키징되게 하여, 이후 이는 배양 배지로 분비된다(Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986; Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983). 이후, 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 운반에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 전형적으로 숙주 세포의 분할을 수반한다(Paskind et al., Virology, 67:242-248, 1975).
렌티바이러스는 복잡한 레트로바이러스이고, 이는 통상의 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 이외에, 조절 또는 구조 기능을 갖는 다른 유전자를 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 당해 분야에서 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Naldini et al., Science, 272 (5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9): 871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9): 6641-6649, 1997]; 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호 참조). 렌티바이러스의 몇몇 예로는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 유인원 면역결핍 바이러스: SIV를 들 수 있다. HIV 병독성 유전자의 약화를 증대시킴으로써 렌티바이러스 벡터를 생성하고, 예를 들면 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef는 벡터는 결손되어 생물학적으로 안정하게 만든다.
재조합 렌티바이러스 벡터는 비분할 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 생체외 유전자 운반 및 핵산 서열의 발현 둘 다에 사용할 수 있다. 예를 들면, 적합한 숙주 세포가 팩키징 기능을 보유하는 2종 이상의 벡터, 즉 gag, pol 및 env, 및 rev 및 tat에 의해 형질감염되고, 비분할 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스가 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조문헌으로 포함된다. 특정 세포 유형의 수용체를 표적으로 하기 위한 특정 리간드 또는 항체와 봉합 단백질을 연결함으로써 재조합 바이러스를 표적으로 할 수 있다. 특이적 표적 세포에 대한 수용체에 대해 리간드를 코딩하는 다른 유전자와 함께, 관심 있는 서열(조절 구역 포함)을 바이러스 벡터로 삽입함으로써, 예를 들면 상기 벡터는 이제 표적 특이적이다.
ⅳ. 변형 바이러스를 이용한 전달
특이적 결합 리간드를 발현하도록 조작된 감염성 바이러스 내에서 전달하고자 하는 핵산을 하우징할 수 있다. 따라서, 바이러스 입자는 표적 세포의 동족 수용체에 특이적으로 결합하고 내용물을 상기 세포로 전달할 것이다. 락토스 잔기의 바이러스 봉합체로의 화학 첨가에 의한 레트로바이러스의 화학 변형에 기초하여 레트로바이러스 벡터의 특이적 표적화를 허용하도록 설계된 신규한 접근법이 개발되었다. 상기 화학 변형은 시알로당단백질 수용체를 통한 간 세포의 특이적 감염을 허용할 수 있다.
레트로바이러스 봉합체 단백질에 대한 및 특이적 세포 수용체에 대한 바이오티닐화 항체가 사용되는 재조합 레트로바이러스를 표적화하는 다른 접근법을 설계한다. 스트렙타비딘을 사용함으로써 비오틴 성분을 통해 상기 항체를 커플링한다(Roux et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86: 9079-9083, 1989). 주조직 접합성 복합체 I형 및 II형 항원에 대한 항체를 사용함으로써, 시험관내 자기 지향성(ecotropic) 바이러스에 의해 상기 표면 항원을 뚫는 각종 인간 세포의 감염을 입증하였다(Roux et al., 1989).
Ｃ. 벡터 전달 및 세포 형질전환
본 발명에 의해 사용하기 위한 세포, 조직 또는 유기체의 형질전환을 위한 핵산 전달에 적합한 방법은 실질적으로 핵산(예를 들면, DNA)이 세포, 조직 또는 유기체로 도입될 수 있는 임의의 방법을 포함하는 것으로 생각되고, 이는 본원에 기재된 바와 같거나, 또는 당업자가 알고 있는 바와 같다. 상기 방법은 예컨대 임의로 Fugene6(Roche) 또는 리포펙시아민(Lipofecyamine)(Invitrogen)에 의한 생체외 형질감염(Wilson et al., Science, 244: 1344-1346, 1989, Nabel and Baltimore, Nature 326: 711-713, 1987); 미량주사(Harland and Weintraub, J. Cell Biol., 101: 1094-1099, 1985; 미국 특허 제5,789,215호, 본원에 참조문헌으로 포함됨)를 비롯한 주사(미국 특허 제5,994,624호, 제5,981,274호, 제5,945,100호, 제5,780,448호, 제5,736,524호, 제5,702,932호, 제5,656,610호, 제5,589,466호 및 제5,580,859, 각각은 본원에 참조문헌으로 포함됨); 전기천공(미국 특허 제5,384,253호, 본원에 참조문헌으로 포함됨; 문헌[Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718, 1986; Potter et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81. 7161-7165, 1984]); 인산칼슘 침강(Graham and Van Der Eb, Virology, 52: 456-467, 1973; Chen and Okayama, Mol. Cell Biol., 7(8): 2745-2752, 1987; Rippe et al., Mol. Cell Biol, 10: 689-695, 1990); DEAE-덱스트란에 이어 폴리에틸렌 글리콜 사용(Gopal, Mol. Cell Biol, 5: 1188-1190, 1985); 직접 음 로딩(direct sonic loading)(Fechheimer et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 84: 8463-8467, 1987); 리포솜 매개 형질감염(Nicolau and Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190, 1982; Fraley et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 76: 3348-3352, 1979; Nicolau et al., Methods Enzymol, 149:157-176, 1987; Wong et al., Gene, 10:87-94, 1980; Kaneda et al., Science, 243: 375-378, 1989; Kato et al., J Biol Chem., 266: 3361-3364, 1991) 및 수용체 매개 형질감염(Wu and Wu, Biochemistry, 27: 887-892, 1988; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 262: 4429-4432, 1987); 각각은 본원에 참조문헌으로 포함됨); 및 상기 방법의 임의의 조합에 의한 DNA의 직접 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
Ⅴ. 세포 배양
당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 만능성으로 유도하고자 하는 세포를 배양할 수 있다. 일반 가이드라인은 예를 들면 문헌[Maherali, et al., Cell Stem Cell 3: 595-605(2008)]에서 확인할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 피더 세포와 접촉시켜 상기 세포를 배양한다. 피더 세포의 예로는 섬유아세포, 예를 들면 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 세포를 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 피더 세포 상에서 세포를 배양하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 피더 세포의 부재 하에 상기 세포를 배양한다. 예를 들면, 분자 테터를 통해, 예를 들면 고체 배양 표면(예를 들면, 배양판)에 직접 세포를 부착시킬 수 있다. 본 발명자들은 만능성으로 유도되는 세포를 배양하는 것은, 피더 세포 상에서 배양되고 그외 동일 처리된 세포의 효율과 비교하여 세포를 고체 배양 표면에 직접 부착시킬 때 만능성으로의 유도 효율이 더 높다(즉, 더 많은 비율의 세포가 만능성을 달성함)는 것을 발견하였다. 분자 테터의 예로는 마트리겔, 세포외 기질(ECM), ECM 유사체, 라미닌, 피브로넥틴, 또는 콜라겐을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 그러나, 당업자는 이것이 비제한적인 목록이고 표면에 부착시키기 위해 다른 분자를 사용할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다. 테터를 고체 표면으로 초기 부착시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
이 "배양" 섹션에서 사용되는 바대로, "만능성으로 유도하고자 하는 세포"는 본원에 기재된 방법을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 당해 분야에서의 임의의 방법에 의해 유도한다.
Ⅵ. 만능 세포의 사용
본 발명은 예방학적 또는 치료학적 용도를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는 줄기 세포 기술의 추가 연구 및 개발을 허용한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 세포(만능 세포 또는 원하는 세포 운명에 따라 분화하도록 유도되는 세포 중 어느 1종)를 기관, 조직, 또는 세포 유형의 재생을 필요로 하는 개체를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는 이를 필요로 하는 객체에게 도입한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 원래 객체로부터 입수하고; 본원에 기재된 바대로 만능성으로 유도하고, 임의로 (예를 들면, 특정 원하는 전구 세포로) 분화하도록 유도되고 그 후 객체에게 다시 이식한다. 몇몇 실시양태에서, 객체로의 형질도입 전에 상기 세포를 유전적으로 변형한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 생성된 만능 세포를 이후 도입하여, 예를 들면 조혈(줄기/선조) 세포, 신경(줄기/선조) 세포(및 임의로, 더 분화된 세포, 예컨대 아형 특이적 뉴런, 올리고수지상 세포 등), 췌장 세포(예를 들면, 내분비 전구 세포 또는 췌장 호르몬 발현 세포), 간 세포, 심혈관(줄기/선조) 세포(예를 들면, 심장 근육 세포, 내피 세포, 평활근 세포), 망막 세포 등을 형성한다.
원하는 세포 유형으로 만능 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 각종 방법이 공지되어 있다. 다양한 세포 운명으로 줄기 세포의 분화를 유도하기 위한 방법을 기술하는 최근 특허 공보의 비제한적인 목록으로는 미국 특허 공보 제2007/0281355호; 제2007/0269412호; 제2007/0264709호; 제2007/0259423호; 제2007/0254359호; 제2007/0196919호; 제2007/0172946호; 제2007/0141703호; 제2007/0134215호를 들 수 있다.
특정 손상 조직으로 본 발명의 만능 세포의 도입 및 임의로 표적화에 의해 각종 질환을 완화할 수 있다. 조직 손상으로부터 발생하는 질환의 예로는 신경 퇴행 질환, 뇌경색, 폐쇄성 혈관 질환, 심근경색, 심부전, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 기관지염, 간질성 폐 질환, 천식, B형 간염(간 손상), C형 간염(간 손상), 알콜 간염(간 손상), 간경변(간 손상), 간부전(간 손상), 췌장염, 당뇨병, 크론씨병, 염증성 대장염, IgA 사구체 신염, 사구체 신염, 신부전, 욕창, 화상, 봉합 상처, 열상, 절상, 교상, 피부염, 반흔성 켈로이드, 켈로이드, 당뇨병성 궤양, 동맥성 궤양 및 정맥성 궤양을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 폴리펩티드(예를 들면, Klf 폴리펩티드, Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드 중 1종 이상)는 그 자체가 치료제 단독으로, 또는 본원에 기재된 바대로 조합으로 유용하다. 예를 들면, 폴리펩티드, 또는 이의 조합은 조직 손상을 감소시키는 데 유용하고 따라서 조직 손상을 치료, 완화 또는 예방하기 위해 투여할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 내부 기관에 조직 손상을 갖는 위험을 갖거나, 또는 그러한 위험에 있는 객체에게 본 발명의 화합물을 투여한다. 내부 기관으로는 뇌, 췌장, 간, 장, 폐, 신장, 또는 심장, 화상 또는 절상 등에 의한 상처를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 허혈 후 재관류에서 경색 크기를 감소시키는 데 효과적이다. 따라서, 뇌졸중을 앓을 위험에 있는, 앓고 있는 또는 앓았던 객체에게 본 발명의 단백질을 투여할 수 있다. 유사하게, 심장마비 또는 심장 손상을 앓을 위험에 있는, 앓고 있는 또는 앓았던 객체에게 본 발명의 단백질을 투여할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 제제(예를 들면, H3K9 메틸화를 억제하는 제제; L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제)는 치료제 단독으로, 또는 본원에 기재된 바의 서로의 조합으로 유용하다. 예를 들면, 상기 제제, 또는 이의 조합은 조직 손상을 감소시키는 데 유용하고 따라서 조직 손상을 치료, 완화 또는 예방하기 위해 투여할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 제제를 내부 기관에 조직 손상을 갖는 위험을 갖거나, 또는 그러한 위험에 있는 객체에게 본 발명의 화합물을 투여한다. 내부 기관으로는 뇌, 췌장, 간, 장, 폐, 신장, 또는 심장, 화상 또는 절상 등에 의한 상처를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 제제는 허혈 후 재관류에서 경색 크기를 감소시키는 데 효과적이다. 따라서, 뇌졸중을 앓을 위험에 있는, 앓고 있는 또는 앓았던 객체에게 본 발명의 제제를 투여할 수 있다. 유사하게, 심장마비 또는 심장 손상을 앓을 위험에 있는, 앓고 있는 또는 앓았던 객체에게 본 발명의 제제를 투여할 수 있다.
또한, 본원에 기재된 활성 화합물은 이의 염, 수화물, 용매화물 및 전구체 형태를 포함한다. 또한, 본 발명의 화합물은 이의 이성체 및 대사체를 포함한다. 본 발명의 특정 화합물은 비대칭 탄소 원자(광학 중심) 또는 이중 결합을 보유하고; 라세미체, 부분입체이성체, 기하 이성체 및 개별 이성체는 모두 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 예를 들면, 본 발명의 화합물은 R 이성체 또는 S 이성체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 E 이성체 또는 Z 이성체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 산성 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 염기에 의해 형성된 염, 즉 양이온성 염, 예컨대 알칼리염 및 알칼리 토금속염, 예컨대 나트륨염, 리튬염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염 및 암모늄염, 예컨대 암모늄염, 트리메틸-암모늄염, 디에틸암모늄염 및 트리스-(히드록시메틸)-메틸-암모늄염이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 염산염을 제공한다. 다른 실시양태에서, 상기 화합물은 엘립티신 염산염이다.
유사하게 산 부가염, 예컨대 광산, 유기 카르복실산 및 유기 설폰산, 예를 들면 염산, 메탄설폰산, 말레산의 산 부가염은 염기성 기, 예컨대 피리딜이 그 구조의 일부를 구성하는 한 또한 가능하다.
염을 염기 또는 산과 접촉시키고 통상의 방식으로 모 화합물을 분리시킴으로써 상기 화합물의 중성 형태를 재발생시킬 수 있다. 상기 화합물의 모 형태는 극성 용매 중의 용해도와 같은 몇몇 물리적 특성에서 다양한 염 형태가 다를 수 있지만, 본 발명의 목적상 상기 염은 상기 화합물의 모 형태와 동등하다.
당업자에게 공지된 각종 방법에 의해 본 발명의 화합물을 제조할 수 있다(문헌[Comprehensive Organic Transformations Richard C. Larock, 1989] 참조). 당업자는 화합물을 제조하는 다른 방법이 본 발명에서 유용하다는 것을 이해할 것이다.
약품을 도입하는 데 통상 사용되는 임의의 경로로 본원에 기재된 세포 또는 화합물을 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 부분적으로 투여하고자 하는 특정 조성물 및 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 약학적으로 허용되는 담체를 결정한다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 각종 다양한 적합한 제형이 있다(예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985)] 참조).
투여에 적합한 제형은 수성 및 비수성 용액, 등장성 무균 용액을 포함하고, 이는 항산화제, 완충액, 세균 발육 저지제, 및 제형을 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있고, 수성 및 비수성 무균 현탁액은 현탁제, 가용화제, 점증제, 안정화제 및 보존제를 함유할 수 있다. 본 발명의 실행시, 예를 들면 경구로, 비강으로, 국소로, 정맥내로, 복막으로, 척추강내로 또는 눈으로(예를 들면, 점안액 또는 주사에 의해) 조성물을 투여할 수 있다. 화합물의 제형은 단일 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기, 예컨대 앰플 및 바이알로 준비될 수 있다. 이미 기재된 종류의 무균 산제, 과립제 및 정제로부터 용액 및 현탁액을 제조할 수 있다. 또한, 제조 음식 또는 약물의 일부로서 조절제를 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 환자에게 투여되는 용량은 시간이 지남에 따라 피험체에서 유리한 반응을 유도하기에, 즉 상기 피험체의 병증을 완화하기에 충분해야 한다. 임의의 환자에 대한 최적 용량 수준은 이용되는 특정 조절제의 효능, 환자의 성별, 체중, 물리적 활성 및 식이, 및 다른 약물과의 가능한 조합을 비롯한 각종 인자에 따라 달라질 것이다. 또한, 특정 피험체에서 특정 화합물 또는 벡터의 투여에 수반하는 임의의 부작용의 존재 여부, 성질 및 정도에 의해 용량 크기를 결정할 것이다. 단일 용량 또는 분할 용량을 통해 투여를 수행할 수 있다.
Ⅶ. 만능 줄기 세포 발생을 유도하는 제제에 대한 스크리닝
본 발명은 4개의 iPS 전사 인자(즉, Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드) 중 1종을 "대체"할 수 있거나, 또는 대안적으로 세포를 만능 세포로 재프로그래밍하기 위해(Nakagawa, M. et al. Nature Biotechnol. 26, 101-106 (2007); Wernig, M., Meissner, A., Cassady, J. P. & Jaenisch, R. Cell Stem Cell 2, 10-12 (2008)) 또는 대안적으로 만능성으로의 유도 효율을 증대시키기 위해 Myc가 필요치 않은 세포에서 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드 또는 Sox 폴리펩티드를 대체할 수 있는 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 1종 이상의 발현을 위한 1종 이상의 발현 카세트를 비만능 세포로 도입하여 형질감염된 세포를 생성하는 단계; 이후 상기 형질감염된 세포를 다양한 제제의 라이브러리와 접촉시키는 단계; 만능 줄기 세포 특성에 대해 상기 접촉된 세포를 스크리닝하는 단계; 및 줄기 세포 특성 발생을 상기 라이브러리로부터 얻은 특정 제제와 서로 연관시켜, 세포의 만능 줄기 세포로의 역분화를 촉진하는 제제를 확인하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 H3K9 메틸화를 억제하는 제제; L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상, 및 소분자 또는 다른 제제의 라이브러리의 1종 이상의 구성원과 접촉시켜 상기 세포의 만능으로의 유도를 유도 또는 증대시키는 라이브러리 구성원을 확인한다. 따라서, 본 발명은 비만능 세포와, H3K9 메틸화를 억제하는 제제; L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGF β 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상(예를 들면, 1종, 2종, 3종, 4종, 5종 이상)의 혼합물을 제공한다.
상기 라이브러리 내 제제는 임의의 소형 화합물, 또는 생물학적 집합체, 예컨대 단백질, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 전형적으로, 시험 제제는 소형 화학 분자 및 펩티드일 수 있다. 필수적으로, 수성 또는 유기(특히 DMSO계) 용액 중에 용해될 수 있는 화합물이 대부분 종종 사용되지만, 본 발명의 분석에서 임의의 화합물을 잠재 제제로서 사용할 수 있다. 분석 단계를 자동화하고 분석에 임의의 편리한 공급원으로부터 얻은 화합물을 제공함으로써 대형 화합물 라이브러리를 스크리닝하도록 상기 분석을 설계하고, 이는 전형적으로 병렬로(예를 들면, 로봇 분석에서 미량 역가 플레이트에서 미량 역가 포맷으로) 수행한다. Sigma(미국 미조리주 세인트 루이스 소재), Aldrich(미국 미조리주 세인트 루이스 소재), Sigma-Aldrich(미국 미조리주 세인트 루이스 소재), Fluka Chemika-Biochemica Analytika(스위스 부흐 소재) 등을 비롯한 화합물의 많은 공급업자가 있는 것으로 이해된다.
몇몇 실시양태에서, 고속 스크리닝 방법은 (iPS 단백질 중 1종을 대체하는 것으로 강력히 작용하는) 다수의 잠재적 iPS 대체 제제를 함유하는 화합물 또는 펩티드 조합 라이브러리를 제공하는 것을 수반한다. 이후, 이러한 "조합 화합물 라이브러리"를 본원에 기재된 바대로 1종 이상의 분석에서 스크리닝하여 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 몇몇을 발현하는 세포에서 원하는 특징적인 활성을 나타내는, 즉 예컨대 만능 줄기 세포 특성을 유도하는 상기 라이브러리 구성원(특정 화학 종 또는 하위 부류)을 확인한다.
조합 화합물 라이브러리는 다수의 화학 "빌딩 블록", 예컨대 시약을 배합함으로써 화학 합성 또는 생물 합성 중 어느 하나에 의해 생성되는 다양한 화합물 집단이다. 예를 들면, 소정 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물 내 아미노산의 수)에 대해 모든 가능한 방식으로 화학 빌딩 블록(아미노산)의 세트를 조합함으로써 선형 조합 화합물 라이브러리, 예컨대 폴리펩티드 라이브러리를 형성한다. 화학 빌딩 블록의 조합 혼합을 통해 수백만 개의 화합물을 합성할 수 있다.
조합 화합물 라이브러리의 제법 및 스크리닝은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 조합 화합물 라이브러리로는 펩티드 라이브러리 (예를 들면, 미국 특허 제5,010,175호, 문헌[Furka, Int. J. Pept. Prof. Res. 37: 487-493(1991); Houghton et al, Nature 354:84-88 (1991)] 참조)를 들 수 있다. 또한, 다양한 화합물 라이브러리를 생성시키기 위한 다른 화학물질을 사용할 수 있다. 이러한 화학물질로는 펩토이드(예를 들면, PCT 공보 WO 제91/19735호), 코딩된 펩티드(예를 들면, PCT 공보 WO 제93/20242호), 불규칙 바이오-올리고머(예를 들면, PCT 공보 WO 제92/00091호), 벤조디아제핀(예를 들면, 미국 특허 제5,288,514호), 다이버소머(diversomer), 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(Hobbs et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)), 비닐족 폴리펩티드(Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568 (1992)), 포도당 비계를 갖는 비펩티드 펩티도미메틱(peptidomimetic)(Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218 (1992)), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 신테제(Chen et al, J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661 (1994)), 올리고카르바메이트(Cho et al, Science, 261: 1303 (1993)), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell et al, J. Org. Chem. 59: 658 (1994)), 핵산 라이브러리(상기 Ausubel, Berger 및 Sambrook 문헌 모두 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(예를 들면, 미국 특허 제5,539,083호 참조), 항체 라이브러리(예를 들면, 문헌[Vaughn et al, Nature Biotechnology, 14(3): 309-314 (1996)] 및 PCT/US96/10287 참조), 탄수화물 라이브러리(예를 들면, 문헌[Liang et al, Science, 274: 1520-1522 (1996)] 및 미국 특허 제5,593,853호 참조), 소형 유기 분자 라이브러리(예를 들면, 벤조디아제핀, 문헌[Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993)]; 이소프레노이드, 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리딘, 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 제5,506,337호; 벤조디아제핀, 제5,288,514호 등 참조)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
조합 라이브러리를 제조하기 위한 장치는 상업적으로 구입 가능하다(예를 들면, 문헌[357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA] 참조). 또한, 다수의 조합 라이브러리는 그 자체가 상업적으로 구입 가능하다(예를 들면, 문헌[ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD] 등 참조).
이후, 예를 들면 1종 이상의 만능 줄기 세포 특성에 대해 스크리닝함으로써 만능 세포의 발생에 대한 스크리닝에 상기 제제와 접촉되고, 임의로 Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 전부는 아니지만 이들 중 몇몇(예를 들면, Oct 폴리펩티드, Klf 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드 및 Sox 폴리펩티드의 1종, 2종 또는 3종의 조합)을 발현하는 세포를 사용할 수 있다. 선별 가능한 또는 그렇지 않으면 확인 가능한 마커에 작동가능하게 연결된 만능 줄기 세포(임의로, 그러나 다른 세포는 아님)에서 활성화되는 것으로 공지된 프로모터 부재를 포함하는 발현 카세트에 의해 선별하고자 하는 세포를 형질전환시킴으로써 초기 스크리닝을 설계한다. 예를 들면, 검출가능한 마커, 예컨대 GFP 또는 다른 리포터 시스템을 사용할 수 있다. 만능 세포에서 활성화되는 것으로 공지된 프로모터 부재의 예로는 Oct4, 나노그, SSEA1 및 ALP 프로모터 서열을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또한, (예를 들면, 면역형광 등에 의해) 나노그, SSEA1 및 ALP를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는 당해 분야에 공지된 다른 만능 세포 마커의 발현에 대해 세포를 스크리닝할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포 유형을 조사한다.
몇몇 실시양태에서, MAPK/ERK 키나제(MEK) 억제제의 존재 하에 상기 세포를 배양한다. 본 발명자들은 MEK 억제제의 존재에 의해 비만능 세포의 성장 억제 및 만능 줄기 세포의 성장 자극 둘 다를 발생한다는 것을 발견하였다. 따라서, 이러한 효과는 스크리닝의 "신호"를 확대하고, 만능 줄기 세포로의 세포의 재프로그래밍을 유도하는 제제의 더 효과적이고 민감한 검출을 허용한다. PD0325901(예를 들면, 문헌[Thompson, et al., Current Opinion in Pharmacology 5(4): 350-356 (2005)]); MEK 억제제 U0126(Promega), ARRY-886(AZD6244)(Array Biopharma); PD98059(Cell Signaling Technology); 및 아미노-티오-아크릴로니트릴(US 특허 제6,703,420호)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는 각종 다양한 MEK 억제제가 공지되어 있다. 다른 MEK 억제제는 무엇보다도 예를 들면 미국 특허 제6,696,440호 및 WO 제04/045617호에 기재되어 있다.
Ⅷ. 세포 혼합물
본원에 기재된 바대로, 본 발명은 H3K9 메틸화를 억제하는 제제; L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 갖는 혼합물에서 비만능 세포를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 화합물은 만능 유도 효율을 유도 또는 증대시키기에 충분한 농도로 상기 혼합물 중에 존재한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 상기 화합물은 적어도 0.1 nM, 예를 들면 적어도 1, 10, 100, 1000, 10000, 또는 100000 nM, 예를 들면 0.1 nM 내지 100000 nM, 예를 들면 1 nM 내지 10000 nM, 예를 들면 10 nM 내지 10000 nM의 농도로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 혼합물은 합성 용기(예를 들면, 시험관, 페트리 접시 등) 내에 존재한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 (동물의 일부가 아닌) 분리 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포를 동물(인간 또는 비인간)로부터 분리하고, 용기 내 배치하고, 본원에 기재된 1종 이상의 화합물과 접촉시킨다. 이후, 상기 세포를 배양하고, 임의로 특정 세포 유형 또는 계통이 되도록 상기 세포를 자극한 후, 임의로 동일한 또는 상이한 동물로 삽입할 수 있다.
본원에 기재된 바대로, 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 Oct 폴리펩티드, Myc 폴리펩티드, Sox 폴리펩티드 및 Klf 폴리펩티드 중 적어도 1종 이상의 이종성 발현을 위한 발현 카세트를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 Oct, Myc, Sox of Klf 폴리펩티드 중 어느 1종을 발현하는 발현 카세트를 포함하지 않는다. 예를 들면, 본원에 기재된 스크리닝 방법에서 이러한 발현 카세트를 갖는 또는 갖지 않는 세포가 유용하다.
비만능 세포의 예로는 골수, 피부, 골격근, 지방 조직 및 말초 혈액으로부터 선택되는 조직으로부터 얻은 세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는 본원에 기재된 것을 들 수 있다. 예시적인 세포 유형으로는 섬유아세포, 간 세포, 근아 세포, 뉴런, 골아 세포, 파골 세포 및 T-세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 H3K9 메틸화를 억제하는 제제(BIX-01294를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음)와 L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGF β 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상으로부터 선택되는 화합물의 (세포를 갖거나 또는 갖지 않는) 혼합물을 제공한다. 몇몇 실시양태(이를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음)에서, 상기 제제 및 기재된 1종 이상의 화합물은 상기 기재된 농도로 존재한다. 이러한 혼합물은 예를 들면 세포에서 만능 유도를 위한 "프리믹스"로서 유용하다.
Ⅸ. 키트
또한, 본 발명은 예를 들면 세포에서 만능 유도 효율을 유도 또는 증대시키기 위해 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 H3K9 메틸화를 억제하는 제제; L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 키트는 H3K9 메틸화를 억제하는 제제(BIX-01294를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않음) 및 L형 Ca 채널 효능제; cAMP 경로의 활성제; DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제제; 핵 수용체 리간드; GSK3 억제제; MEK 억제제, TGFβ 수용체/ALK5 억제제, HDAC 억제제; 또는 erk 억제제 중 1종 이상으로부터 선택되는 (H3K9 메틸화를 억제하는 제제와 분리된 또는 혼합된) 제2 화합물을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 키트는 비만능 세포를 더 포함한다. 비만능 세포의 예로는 골수, 피부, 골격근, 지방 조직 및 말초 혈액으로부터 선택되는 조직으로부터 얻은 세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는 본원에 기재된 것을 들 수 있다. 세포 유형의 예로는 섬유아세포, 간 세포, 근아 세포, 뉴런, 골아 세포, 파골 세포 및 T-세포를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1
발암성 전사 인자(예를 들면, cMyc 및 Oct4(Hochedlinger, K. et al, Cell 121, 465-477 (2005))의 바이러스 형질도입을 대체하고 재프로그래밍 효율을 증대시킬 수 있는 조건을 확인하기 위해, 본 발명자들은 2가지 접근법의 조합을 이용하고자 하였고: 1종의 접근법은 특정 접근 가능한 성체 전구 세포가 더 효율적으로 및/또는 더 적은 유전 조작으로 재프로그래밍될 수 있도록 상기 전구 세포가 만능성을 유도하기에 필요한 유전자 중 몇몇을 특정 수준으로 내인성으로 발현하고/발현하거나, 상기 유전자의 유전자좌가 덜 침묵할 수 있다는 개념에 기초하여 한정된 전구 세포 유형을 검사하는 것이고; 다른 접근법은 특이적 전사 인자의 바이러스 통합을 대체하고/하거나 재프로그래밍 과정을 촉진할 수 있는 소분자를 스크리닝하는 것이다.
상이한 조직으로부터 얻을 수 있는 다양한 성체 줄기/전구 세포 중에서, 본 발명자들은 초기에 다음의 이유로 신경 전구 세포에 미치는 효과에 집중하였다: (ⅰ) 다양한 줄기/전구 세포 유형을 함유할 수 있는 이종성 1차 섬유아세포 배양(예를 들면, MEF)과 대조적으로, 신경 전구 세포는 상대적으로 한정된 세포 집단이고, 화학적으로 한정된 조건 하에 클로닝으로 확대될 수 있고, (ⅱ) 신경 전구 세포는 특이적 Sox 유전자(예를 들면, Sox1 또는 Sox2)를 내인성으로 발현하고, 이것이 과발현보다 더 낮은 수준에 있더라도, iPS 세포를 제조하기에 충분할 것이며, (ⅲ) 신경 전구 세포 또는 Sox 유전자를 발현하는 세포를 다른 조직으로부터 분리시키고(Fernandes, K. J. L. et al., Nature Cell Biology 6, 1082-1093 (2004); Seaberg, R. M. et al., Nature Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004)) 시험관내 확대시킬 수 있다. 따라서, 한정된 신경 전구 세포는 재프로그래밍 과정/메커니즘에서 상기 문제점을 해소하는 훌륭한 모델 시스템을 나타낸다. 고속 스크리닝에서 사용할 수 있는 신경 전구 세포의 비제한적이고, 고도로 재현 가능하며 한정된 공급원을 확립하기 위해, 본 발명자들은 Oct4 조절 부재의 제어 하에 GFP-IRES-Puro/GiP 리포터를 함유하는 상기 mESC 유래 신경 전구 세포를 사용할 것을 선택하였는데, 왜냐하면 mESC가 다량으로 배양될 수 있고 신경 전구 세포의 동종성 집단으로의 이의 분화가 또한 한정할 뿐만 아니라(Conti, L. et al., PLoS Biol. 3, e283 (2005)), 검증된 리포터 활성(Ying, Q. L. et al., Nature 416, 545-548 (2002))이 손쉬운 분석 검출을 촉진할 수 있기 때문이다.
혈청 및 다른 성장 인자/사이토카인의 부재 하에 화학적으로 한정된 배지/CDM 조건에서 젤라틴 위의 단층에서 배양된 Oct4-GiP mESC를 낮은 세포 밀도로 8 일 동안 분화시킨 후, 뉴로스피어(neurosphere)를 형성시키고 이후 6회 계대/24 일에 걸쳐 단층에서 bFGF 및 EGF의 10 ng/ml가 보충된 신경 세포 확대 배지에서 단일 세포로 연속 계대함으로써 잘 확립된 프로토콜을 이용하여 상기 리포터 신경 전구 세포를 제조하였다. 얻어진 신경 전구 세포는 세포 유형 및 신경 마커 발현에 의해 동종성이었고, GFP 음성 및 퓨로마이신 감수성인 것으로 확인되었다. 종래 mESC 성장 배지에서 단층으로 평판 배양된 상기 신경 전구 세포를 4개의 인자 중 4개, 3개, 또는 2개의 조합에 의해 형질도입한 후, 형질도입된 세포를 통상적인 6웰 포맷으로 소형의 공지된 약물 집단으로부터 얻은 각각의 소분자로 처리하였다. 추가 10 일 동안 화합물 처리 및 배양을 계속한 후 퓨로마이신을 첨가하였다. 녹색 및 퓨로마이신 저항 콜로니를 14 일에 계수하였다. 음성 대조군으로서 오직 4개의 - 유전자 형질도입된 신경 세포와 비교하여, 해당 유전자보다 녹색 콜로니를 더 제조하는 화합물 조건 - 유일한 조건을 1차 힛(hit)으로 뽑았다. 이러한 1차 힛 조건을 추가로 확인하기 위해, 본 발명자들은 OG2+/-/ROSA26+/- 형질전환 마우스 태아 뇌로부터 유래하고 bFGF 및 EGF의 10 ng/ml로 상기와 동일한 신경 CDM 조건 하에 단층으로 확대되는 (Oct4-GFP 리포터를 함유하는) 마우스 CNS 신경 전구 세포(Do, J. T. et al., Stem Cells 25, 1013-1020 (2007))의 차후 계대를 사용하는 것을 선택하였다. 정확히 비만능 조직 유래의 상기 세포는 상기 스크리닝 시스템에서 ES 세포의 어떠한 오염의 문제도 없었고, 모두 적절한 대조군으로 거의 일어날 것 같지 않았다. 퓨로마이신을 사용하지 않고 녹색 콜로니를 골라내고 나노그, SSEA1 및 ALP의 염색을 특징으로 한다는 점을 제외하고는 OG2 신경 전구 세포를 사용하여 유사한 배양 조건 및 재프로그래밍 분석을 수행하였다. 본 발명자들은 12-14 일에서 확인될 수 있는 녹색 콜로니의 거의 모두가 형태 및 전형적 만능성 마커 발현에 의해 전통적인 mESC로부터 구별 불가능한 장기간 안정한 iPS 세포로 확대될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 처음에 태아 신경 전구 세포를 사용하여 재확인할 수 있는 2가지 신규한 조건에 미치는 특징 효과에 집중하였다. 특정 관련 재프로그래밍 유전자의 내인성 발현을 갖는 특정 조직 특이적 전구 세포가 iPS 세포를 제조하는 덜 외인성 유전 조작을 요할 수 있다고 가정된 것처럼, 본 발명자들은 함께 오로지 Oct4 및 Klf4의 바이러스 형질도입은 10-14 일에 신경 전구 세포로부터 iPS 세포를 제조하기에 충분하다는 것을 발견하였다. 상기 재프로그래밍 효율(3.5×1O4개의 세포당 1-2개의 GFP 콜로니)이 추가 Sox2 및 cMyc 바이러스 형질도입(3.5×1O4개의 세포당 8-10개의 GFP 콜로니)(도 1)에서의 조건보다 낮지만, 오직 2개의 유전자(Oct4 및 Klf4)에 의한 재프로그래밍 동역학이 본래 4개의 유전자에 의한 것보다 유의적으로 낮지 않다는 것은 흥미롭다. 이는 MEF로부터 iPS 세포를 제조하는 데 있어 cMyc를 생략하는 것은 배아 섬유아세포가 cMyc를 내인성으로 발현하더라도 cMyc 과발현을 갖는 조건에서보다 유의적으로 낮다(예를 들면, 추가 2 주)는 최근 관찰과 대조적이다. 가장 흥미롭게도, 본 발명자들은 G9a(H3K9me2에 대한 히스톤 메틸트랜스퍼라제)를 특이적으로 억제하는 소분자, BIX01294(Kubicek, S. et al., Molecular Cell 25, 473-481 (2007))가 재프로그래밍 효율을 모두 4개의 인자의 바이러스 형질도입을 사용하는 것의 수준 이상으로 유의적으로 증대시킬 수 있지만, 재프로그래밍의 동역학을 유의적으로 감소시키지 않는다는 것을 발견하였다. 재프로그래밍 사건은 전형적으로 iPS 세포 콜로니를 확인하는 능력에 의해 분석하고, 이는 세포 배양, 세포 확인 및/또는 선별의 방법, 및 유입 세포 유형, 수, 및 재프로그래밍 효율 및 동역학을 비롯한 많은 인자에 의해 영향을 받는다. 결과적으로, 재프로그래밍에 대한 임의의 소정 유전자에 대한 요건은 그 특정 설정에 상대적이고 주로 재프로그래밍 효율/동역학에 따라 달라진다. 이와 관련하여, 상기 단일 소분자, BIX01294는 cMyc 및 Sox2의 바이러스 형질도입을 기능상 상당 정도로 대체하였다.
OG2 신경 전구 세포가 Oct4/Klf4 레트로바이러스에 의해 형질도입되고 BIX01294로 처리된 12 일 후 GFP+ iPS 세포 콜로니가 쉽게 나타났다. 14 일에 Oct4-Klf4 바이러스 형질도입 및 BIX01294 처리로부터 제조된 iPS 세포는 연속 BIX01294 처리의 요건 없이 LIF의 존재 하에 MEF 피더 세포 상에서 종래 mESC 배양 조건에서 용이하게 확대될 수 있었다. Oct4/Klf4 바이러스 형질도입 및 BIX01294 처리에 의해 제조된 iPS 세포는 연속 BIX01294 처리 없이 mESC 성장 배지에서 MEF 피더 상에서 장기간 자기 증식(self-renew)할 수 있었다. 이것은 치밀화 및 반구형 콜로니로 성장하였다. 이 iPS 세포는 특징적인 mESC-콜로니 형태를 유지하고, 면역 세포 화학, 조직 염색 및 RT-PCR 분석에 의해 Oct4, 나노그, SSEA1 및 ALP를 비롯한 mESC와 유사한 수준으로 통상적 만능성 마커를 동종으로 발현하였다. 또한, 10회에 걸쳐 연속 계대될 수 있는 상기 iPS 세포는 표준 배상체 또는 유도 분화 방법 하에 특징적인 뉴런(βⅢ-투불린), 박동 심장 근육 세포(심장 트로포닌) 및 췌장 또는 간 세포(Pdx1 또는 알부민), 3가지 1차 배엽의 유도체로 효과적으로 분화할 수 있었다. 그리고 더 중요하게는, 상기 iPS 세포는 8-세포기 배아와의 응집 후 배반포의 ICM로 효과적으로 통합되어, 응집된 배아가 마우스로 이식된 후 높은 등급 키메라 현상을 발생시키고, 생체내 생식선에 기여할 수 있었다. 이러한 시험관내 및 생체내 규명은 Oct4 및 Klf4 바이러스 형질도입과 동시의 BIX01294 처리에 의해 제조되는 iPS 세포가 형태적으로, 기능적으로 및 통상적 만능성 마커 발현에 의해 본래 4개의 인자 iPS 세포 및 전형적 mESC로부터 구별가능하지 않다는 것을 확인시켜 준다.
하나의 문제점은 내인성 또는 외인성과 무관하게 Oct4, Sox2, Klf4 및 cMy의 발현이 iPS 세포를 생성시키기 위한 전제 조건인가이다. 흥미롭게도, 섬유아세포로부터 인간 iPS 세포를 생성하는 데 대한 최근 재프로그래밍 연구에 의하면 Klf4 및 cMyc의 외인성 발현이 나노그 및 Lin28과 기능적으로 상호교환 가능한 것으로 나타났지만, Oct4 및 Sox2의 발현은 모두 공개된 iPS 세포 연구로부터 아직까지 필요한 것으로 보인다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 Oct4 발현의 부재 하에 Klf4, Sox2, 및 cMyc의 바이러스 형질도입과 동시의 BIX01294 처리는 iPS 세포(도 2)를 생성할 수 있지만, 상기 3개의 인자/KSM 단독의 바이러스 형질도입은 본 분석 조건 하에 어떠한 iPS 세포 콜로니도 제조하지 못한다는 것을 발견하였다. 유사하게, 상기 KSM-BIX01294 제조 iPS 세포는 안정하게 확대되고 BIX01294 없이 계대에 걸쳐 종래 mESC 성장 조건에서 MEF 피더 상에서 장기간 자기 증식할 수 있고, 특징적인 mESC-콜로니 형태를 유지하고, ALP, Oct4, 나노그 및 SSEA1을 비롯한 통상적 만능성 마커를 동종으로 발현하고, 시험관내 3가지 배엽으로 세포를 분화할 수 있었다. Oct4 발현의 부재 하에 재프로그래밍 효율은 비교적 낮다는 것에 유의해야 한다.
마지막으로, 본 발명자들은 MEK의 특정 소분자 억제제, PD0325901을 재프로그래밍의 후기(예를 들면, Oct4-GFP 활성화 후)에 적용하는 것은 iPS 세포를 생성하기 위한 훌륭한 선별 전략으로 작용할 수 있다는 것을 관찰하였다. 재프로그래밍의 매우 낮은 효율로 인해, 유전 변형 체세포주를 사용하여 만능성 마커의 조절 부재의 제어 하에 있는 리포터(예를 들면, Neo/Puro 또는 GFP)를 사용하여 iPS 세포는 전형적으로 선별하거나, 또는 세포 유형에 기초하여 수동으로 골라낸다. 유전 비변형 세포에 적용 가능한 후자 방법이 iPS 세포의 궁극적인 임상 용도에 더 적합하지만, 이는 전형적으로 수회 계대에 걸쳐 많은 콜로니의 선별 및 번식을 요하는 훨씬 더 지루하고 덜 신뢰가 가는 기법이고, 이의 적은 비율만이 진정한 iPS 세포가 효과적으로 될 것이다. 이는 부분적으로 유사하게 보이는 콜로니의 대부분이 부분적으로 재프로그래밍된 세포 및/또는 단순히 형질전환된 세포일 수 있고, 이것이 신속히 성장하고 iPS 세포의 성장 및 재프로그래밍을 방해할 수 있기 때문이다. 그 결과, 유전 비변형 세포에 대한 대안적인 선별 전략을 갖는 것이 매우 바람직할 것이다. 본 발명자들은 PD0325901이 비iPS 세포의 성장을 억제하지만, 이는 iPS 세포의 성장 및 안정한 재프로그래밍을 효과적으로 촉진하여, iPS 세포의 더 크고 더 많은 동종성 콜로니를 발생시킨다는 것을 발견하였다. 이러한 관찰은 부분적으로 체세포의 세포 주기 진행에 MEK 활성이 필요한 메커니즘으로 인한 것일 수 있고, MEK의 성장 및 억제에 대한 제한의 mESC 결핍은 또한 (iPS 세포 상태의 추가 안정화에 기여하는) mESC의 분화를 억제한다.
여기 제시된 결과는 여러 중요한 함축 내용을 갖는다. (1) (조직 특이적 선조) 체세포에 의한 재프로그래밍에 필요한 중요한 유전자의 (과발현보다) 더 낮은 내인성 발현 수준은 iPS 세포를 생성하는 바이러스 형질도입을 통한 해당 외인성 유전자 발현을 대체하기에 충분할 수 있다. 이는 내인성 조직 특이성 및/또는 생체외 배양 조작을 통해 특정 관련 재프로그래밍 유전자를 내인성으로 발현하는 실질적으로 접근 가능한 세포를 이용함으로써 더 적은 유전 조작을 이용하여 체세포로부터 iPS 세포를 생성하는 대안적인 전략을 시사한다. (2) 이는 특정 전사 인자(들)의 바이러스 형질도입을 기능적으로 대체하거나, 재프로그래밍 효율을 증대시키거나, 또는 iPS 세포를 생성하는 데 있어 선별 조건으로서 작용하는 합리적으로 설계된 세포 기반 스크리닝으로부터 소분자가 확인될 수 있다는 원리 증명 입증이다. 특정 유전 조작을 대체하기 위한 상기 약리학적 접근법은 실질적으로 암유전자(예를 들면, cMyc 및 Oct4)의 삽입 및 삽입 돌연변이와 관련된 위험을 감소시킬 뿐만 아니라, 한정된 소분자에 의해 정확히 조절되고 고도로 효율적인 재프로그래밍 과정을 가능케 하는 가능성을 연다. 이는 재프로그래밍의 분자 메커니즘을 연구하는데 특히 중요하고, 현재 이의 매우 낮은 효율 및 느린 동역학으로 인해 매우 다루기 힘들다. (3) iPS 세포를 제조하는 데 기능 획득 접근법과 비교하여, 상기 특정 소분자 억제제의 매우 효과적인 용도는 특정 유전자의 기능 손실이 iPS 세포를 생산하는 데 있어 적어도 동등하게 중요하고 효과적일 수 있다는 것을 제시한다. 더 중요하게는, BIX01294의 기능은 iPS 세포를 생산하는 데 있어 특정 후성적 메커니즘/표적을 한정한다. 즉, G9a 매개 H3K9me2를 억제한다. 이는 억압적 H3K9 메틸화가 분화 동안 Oct4 불활성화와 관련되고(Feldman, N. et al, Nature Cell Biology 8, 188-194(2006)), 히스톤 리신 메틸화가 견고하더라도 역동적이고 HMTase 및 리신 데메틸라제에 의해 조절된다는 선형 발견과 일치한다. BIX01294는 후성적 균형을 Oct4의 침묵 상태로부터 활성 전사로 이동시키는 것을 촉진하도록 작용할 수 있다. (4) iPS 세포의 손쉬운 선별을 위해 MEK 억제제를 사용하는 것으로 예시되는 것처럼, 소분자에 의해 체세포와 ESC 사이의 차이를 이용하는 것은 iPS 세포를 선별하기 위한 대안적인/매력적인 전략을 나타낸다. 마지막으로, iPS 세포를 생성하는 것의 개선된 접근법 및 우수한 기계론적 이해를 위해 본원에 기재된 전략 및 소분자가 더 강구될 수 있고, (나머지 형질도입된 전사 인자의 기능을 대체하고 재프로그래밍을 개선할 수 있는) 추가 소분자 및 비유전 방법(예를 들면, 단백질 형질도입)과 조합되어 궁극적으로 iPS 세포의 생성을 임의의 유전 변형 없이 완전히 화학적으로 한정된 조건에서 고효율으로 허용될 수 있는 것으로 고안된다.
방법
신경 전구 세포 배양. 콘티(Conti) 등이 보고한 프로토콜(Conti, L. et al., PLoS Biol. 3, e283 (2005))에 따라 mESC 또는 마우스 태아 뇌로부터 신경 전구 세포가 유래할 수 있다. 간단하게, 신경 유도 배지(50% DMEM/F12 기본 배지, 50% 신경 기본 배지, 0.5X N2, 0.5X B27, IX 글루타맥스, 50 ㎍/ml BSA) 중에 mESC를 1×1O4개의 세포/c㎡로 0.1% 젤라틴 코팅된 접시로 평판 배양하고 7-8 일 동안 분화시켰다. 이후, 형성된 신경 로제트(rosette)를 단일 세포로 트립신 처리하고 Ultra-Low Attachment 접시(Corning)로 다시 평판 배양하여 신경 전구 세포 확대 배지(DMEM/F12, IX N2, 10 ng/ml bFGF, 10 ㎍/ml EGF, 50 ㎍/ml BSA) 중에 뉴로스피어를 형성하였다. 3 일 후, 현탁액 뉴로스피어 중에 젤라틴 코팅된 접시에 다시 부착시키고 4-6 일 동안 더 분화시킨 후, 단일 세포에서 더 계대시키고 5-6회 계대를 위해 신경 전구 세포 확대 배지 중에 젤라틴 코팅된 접시에서 단층으로 성장시켰다.
12.5 내지 16.5 dpc ROSA26/OG2 이형접합 태아의 뇌로부터 얻은 뉴로스피어를 이미 기재된 바대로(Do, J. T. et al., Stem Cells 25, 1013-1020 (2007)) 생성하였다. 간단하게, 피질을 절개하고, 효소로 분리시키고, 70 ㎛ 나일론 메쉬(Falcon; Franklin Lakes, NJ)를 통해 통과시켰다. 신경 세포를 0.5× HBSS 중의 0.9 M 수크로스 중에 750 g에서 10 분 동안 및 EBSS 용액 중의 4% BSA 중에 200 g에서 7 분 동안 원심분리에 의해 더 정제하였다. 상기 세포를 현탁액 중에 더 배양하여 뉴로스피어를 형성하고 이후 상기 기재된 바대로 신경 전구 세포 확대 배지 중에 젤라틴 코팅된 접시로 단층으로 연속 계대하였다. 막스 플랑크 재단(Max Planck Society, 독일)의 체제의 동물 보호 가이드라인에 따라 동물 실험을 승인받고 수행하였다.
레트로바이러스 형질도입. Oct4, Klf4, Sox2 및 c-Myc에 대한 쥐과 cDNA를 pMSC V 레트로바이러스 벡터로 클로닝하고 서열분석에 의해 검증하였다. Addgene로부터 pMX 기반 레트로바이러스 벡터를 얻었다. 2-3에 기재된 바대로 바이러스 제조 및 형질도입을 수행하였다.
신경 전구 세포로부터의 iPS 세포 유도. 신경 전구 세포 확대 배지 내에서 마트리겔(1:50, BD Biosciences) 코팅된 6웰 플레이트에 mESC 유도 또는 1차 OG2 마우스 신경 전구 세포를 3.5×104개의 세포/웰로 평판 배양하였다. 1 일 후, 밤새 동안 상기 세포를 레트로바이러스에 의해 형질도입하고, 상기 배지를 BIX01294(0.5-1 μM) 존재 또는 부재 하에 mESC 성장 배지[DMEM, 5% FBS, 10% KSR, 1× 비필수 아미노산(Gibco), 2 mM L-글루타민(Gibco), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Gibco) 및 103 단위/ml LIF(Chemicon)]로 교체하였다. 9-14 일 후 GFP 양성 iPS 세포 콜로니가 나타났고, 골라내고 mESC 성장 배지에서 MEF 피더 세포 상에서 확대하였다.
특징 분석. 알칼리성 포스파타제 검출 키트(Chemicon)에 의해 지시된 바대로 ALP 염색을 수행하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드 중에 고정시키고, PBS로 3회 세척하고, 이후 0.3% TritonX-100(Sigma) 및 10% 일반 당나귀 혈청(Jackson ImmunoResearch)을 함유하는 PBS 중에 실온에서 30 분 동안 항온처리하였다. 이후, 상기 세포를 밤새 4℃에서 1차 항체: 마우스 항-Oct4 항체, 마우스 항-SSEA1 항체(1:200, Santa Cruz), 래빗 항-Sox2 항체(1:200, Chemicon), 래빗 항-나노그 항체(AbCam), 래빗 항-Pdx1(1:200, Dr. C. Wright로부터 입수), 마우스 항-βⅢ-투불린 항체(1:500, Covance), 마우스 항-심장 트로포닌 T(1:200, DSHB), 래빗 항-알부민 항체(DAKO)로 항온처리하였다. 세척 후, 상기 세포를 실온에서 30 분 동안 2차 항체: Alexa Fluro555 당나귀 항-마우스 IgG 또는 Alexa Fluro555 당나귀 항-래빗 IgG(1:500, Invitrogen)로 더 항온처리하였다. DAPI(Sigma) 염색에 의해 핵을 관찰하였다. Nikon TE2000-U에 의해 이미지를 얻었다.
투명대 제거 배아에 의한 iPS 세포의 응집. iPS 세포를 파열된 후-치밀화 8-세포기 배아와 응집하여 응집 키메라를 얻었다. 2.5 dpc에서의 암컷으로부터 풍부한 8-세포기 배아(B6C3F1)를 광유 하에 KSOM 배지(10% FCS)의 미세액적 중에 배양하였다. 짧은 트립신 처리 후 iPS 세포(10-20개의 세포) 덩어리를 선택하고 투명대 제거(zona-free) 8-세포기 배아를 함유하는 미세액적으로 옮겼다. iPS 세포로 응집된 8-세포기 배아를 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 8-세포기로부터 발생한 응집된 배반포를 2.5 dpc 가임신 수혜자의 1종의 자궁각으로 옮겼다.
실시예 2
4개의 전사 인자, Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 또는 Oct4/Sox2/나노그/LIN28의 조합으로 체세포를 만능 줄기 세포(iPSC)로 유도할 수 있었다. 이는 플랫폼이 다양한 치료학적 및 연구 분야에 대해 환자 특이적 세포를 얻도록 하였다. 그러나, 이러한 접근법이 효율 및 바이러스 게놈 통합과 관련된 단점으로 인해 치료학적으로 연관되게 하는 몇몇 문제점은 여전히 존재하였다. 상기 기재된 바대로, Oct4/Klf4에 의해 형질도입된 신경 전구 세포(NPC)를 iPSC로 재프로그래밍할 수 있었다. 그러나, NPC는 Sox2를 내인성으로 발현하고, 아마도 외인성 Sox2의 부재 하에 재프로그래밍을 촉진할 것이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 재프로그래밍에 필수적인 인자를 내인성으로 발현하지 않는, Oct4/Klf4 형질도입된 마우스 배아 섬유아세포의 재프로그래밍이 가능하게 하는, 소분자 조합, BIX-01294 및 BayK8644를 확인하였다. 본 연구는 표현형 스크리닝을 통해 확인된 소분자가 중요한 인자, 예컨대 Sox2의 바이러스 형질도입을 보상할 수 있고, 재프로그래밍 효율을 증대시킬 수 있다는 것을 입증한다.
본 실시예는 소분자가 특정 바이러스 형질도입을 대체하여 일반적인 세포 계통로부터 iPSC를 얻을 수 있는지를 평가하는 것이고, Sox2 및 Klf4의 재프로그래밍에 필수적인 것으로 생각된 TF 중 어떤 것도 발현되지 않았다. 여기서, 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 사용하였다. 소분자가 MEF 재프로그래밍의 유도에서 상기 TF 중 어느 하나를 대체한다는 발견은 상기 과정에 연관된 일반적인 경로를 확인시킬 것이다. 치료 분야에 대해 이러한 화학적 전력을 수정할 수 있을 것이다. 그 결과, 본 발명자들은 공지 약물 집단을 스크리닝하여 OK에 의해 형질도입된 MEF로부터 iPSC의 생성이 가능케 하는 소분자를 확인하였고, 따라서 Sox2 과발현의 결여에 대해 보상하였다. 상이한 스크리닝이 수행되었지만, 본 발명자들은 BFX와 Bayk8644(BayK)의 조합, L-채널 칼슘 효능제(Schramm, M. et al, Nature, 303: 535-537 (1983))가 가장 효과적인 것 중 하나라는 것을 확인하였다. Bayk는 중요한 데, 왜냐하면 이것은 세포 신호 경로 업스트림에서 그 효과를 발휘하고, 후성적 변경을 직접 일으키지 않기 때문이다. 이러한 분자 유형, 예컨대 Wnt 신호 경로의 BayK 또는 활성제(Marson, A. et al., Cell Stem Cell, 3:132-135 (2008))는 DNA 또는 히스톤 변경을 야기하는 후성적 수준에서 직접 작용하는 분자보다 더욱 특정한 방식으로 재프로그래밍을 유도하기 위해 이용할 수 있을 것이다. 상기 후성적 변경제의 몇몇은 이미 재프로그래밍 과정, 예컨대 BFX(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2:525-528 (2008)), 발프로산(Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol, 26: 795-797 (2008)) 및 5'-아자시티딘(Mikkelsen, T. et al., Nature, 454:49-55 (2008))을 촉진하는 것으로 밝혀졌다.
본 연구는 표현형 스크리닝을 통해 확인된 소분자를 다른 중요한 iPSC TF, Sox2의 바이러스 형질도입을 효과적으로 보상하기 위해 사용할 수 있고, 이는 섬유아세포에서 내인성으로 발현되지 않는다는 것을 입증한다. 또한, 이는 소분자 스크리닝이 결국 복잡한 생물학적 과정, 예컨대 재프로그래밍에 연관된 신규한 분자 표적 및 메커니즘을 발견하게 한다는 중요한 기여를 강조한다.
결과
오직 2개의 TF 에 의해 형질도입될 때 표현형 스크리닝은 MEF 재프로그래밍을 가능케 하는 소분자를 발견할 수 있다.
초기 스크리닝에 129개의 마우스의 E13-14 배아 유래의 비변형 MEF를 사용하였다. 6웰 플레이트의 3.5×1O4개의 세포/웰로 마트리겔 상에서 MEF를 평판 배양하고 오로지 OK(Oct4 및 Klf4를 발현하는 레트로바이러스 벡터)에 의해 형질도입하였다. 14-21 일 내에, 특징적인 배아 줄기 세포(ESC) 콜로니 형태를 갖는 콜로니의 출현에 대해 처리된 세포를 평가하고 만능성 마커 알칼리성 포스파타제(ALP)에 대해 양성이었다. 상기 OK 형질도입된 세포는 아주 적은 소형 비-치밀화 콜로니를 생성시켰고, 이는 ALP 발현에 약하게 양성이었다. 상기 콜로니는 초기에 바이러스 형질도입 21 일 후 나타났고 확대하기 어려웠다. 따라서, 상기 분석 시스템은 활성을 유도하는 원하는 재프로그래밍을 갖는 소분자의 확인에 대한 깨끗한 배경을 제공하였다. 상기 시스템을 이용하여, 대략 2000개의 공지 소분자의 라이브러리(하기 실험 절차 참조)로부터 얻은 화합물을 스크리닝하고, 이것이 처리 후 14-21 일 내에 ALP에 강하게 양성인 ESC 콜로니의 출현을 유도할 때 힛으로 확인하였다. 이러한 이미지 기반 방법은 동종성 리포터 기반 분석과 비교하여 재프로그래밍의 더 정확한 평가를 제공하였다. BIX는 높은 ALP 발현을 갖는 1-2개 이상의 치밀화 ESC양 콜로니의 재현 가능한 유도로 가장 강한 효과를 갖는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 MEF가 OK 바이러스 형질도입 후 BIX로 처리될 때, 대략 14-21 일 내에 강한 ALP 발현을 갖는 치밀화 콜로니를 용이하게 검출할 수 있다는 것을 관찰하였다. 상기 세포는 또한 나노그, Oct4 및 SSEA-I 발현에 대해 양성이었다. 3가지 필수 재프로그래밍 유전자 중 어떤 것도 내인성으로 발현하지 않는 더욱 일반적인 세포 유형이 얻어지면서, 상기 결과는 BIX가 G9a HMTase의 활성 및 억제를 유도하는 강한 재프로그래밍을 갖는다는 선행 관찰을 검증시키고 재프로그래밍을 촉진할 수 있다(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)). 그러나, OK에 의해 형질도입되고 BIX로 처리된 MEF에서 재프로그래밍 효율은 MEF의 4개의 인자 유도 재프로그래밍 또는 OK/BIX NPC 재프로그래밍과 비교하여 약 2개의 콜로니/3.5×1O4개의 세포로 여전히 낮았다(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)). 따라서, 본 발명자들은 OK 바이러스 형질도입 후 기본 배지에 BIX가 첨가됨을 제외하곤 유사한 프로토콜을 사용하여 제2 스크리닝을 수행하였다. 이는 재프로그래밍 효율을 더 증대시키는 신규한 소분자를 확인하기 위한 더 허용 가능한 플랫폼을 제공하였다. 더 중요하게는, 상기 제2 스크리닝은 더욱 특정한 방식으로, 예를 들면 히스톤 또는 DNA 변경 효소라기보다 단일 형질도입 경로에 작용함으로써 재프로그래밍에 영향을 미치는 소분자의 발견을 촉진하였다. 상기 제2 스크리닝에서, 본 발명자들은 다시 대략 2000개의 공지 소분자의 라이브러리(실험 절차 참조)를 분석하였고, BIX와 상승작용 방식으로 작용하여 스크리닝의 기준에 기초한 재프로그래밍을 개선하는 2개의 화합물을 확인하였다. 하나의 예는 RG108, DNA 메틸트랜스퍼라제(DMNT) 억제제(Brueckner, B. et al., Cancer Res, 65: 6305-6311 (2005))이고, 이는 BIX의 존재 하에 OK 형질도입된 MEF의 재프로그래밍을 증대시켰다(도 3). 그러나, BIX와 유사하게, RG108은 일반적인 후성적 수준에서 상기 세포에 영향을 미치는 것으로 알려졌고, 다른 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제, 5-아자시티딘은 이미 재프로그래밍을 증대시키는 것으로 밝혀졌다(Mikkelsen, T.S. et al., Nature, 454: 49-55 (2008)). 따라서, 본 연구에서 RG108에 더 주력하지 않았다. 대신에, 본 발명자들은 제2 스크리닝에서 확인된 다른 소분자, BayK, an L-칼슘 채널 효능제에 대한 표현형 및 기능 규명에 집중하였다. 공지 DNA/히스톤 변경제를 별도로 하고 스크리닝에서 가장 강한 효과를 나타냈던 상기 소분자는 BIX의 부재 하에 OK 형질도입된 MEF에서 관찰 가능한 재프로그래밍 활성을 갖지 않았고 세포 신호 형질도입 수준이라기보다 후성적 수준으로 직접 상기 세포에 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에 추가로 연구하였다. 따라서, BayK는 재프로그래밍 과정에서 더욱 특별한 역할을 담당할 것이다. 129개의 MEF가 빈 레트로바이러스(음성 대조군)에 의해 형질도입될 때; 콜로니가 관찰되지 않았다. 129개의 MEF가 소분자 없이 OK에 의해 형질도입될 때; 약한 ALP 발현을 갖는 적은 소수의 편평 콜로니가 존재하였다. 129개의 MEF를 OK에 의해 형질도입하고 BIX/BayK로 처리한 14-21 일 후에 ESC양 iPSC 콜로니가 관찰되었다; 상기 ESC양 콜로니는 강한 ALP 발현을 나타냈다. OK 형질도입된 MEF를 BayK와 조합하여 BIX로 처리할 때, OK 형질도입되고 BIX 단독으로 처리된 MEF(약 2개의 콜로니)에 비해 mESC 형태를 아주 닮은 ALP+ 콜로니의 수의 유의적 증가(약 7개의 콜로니)가 관찰되었다. 상기 1차 iPSC 콜로니의 추가 규명으로 이것이 면역 형광법에서 측정된 바대로 전형적 만능성 마커, 예컨대 Oct4, Sox2, 나노그 및 SSEA1에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다.
OK 에 의해 형질도입되고 BIX / BayK 로 처리된 MEF 로부터 얻은 iPSC 는 mESC 의 만능성을 가졌다.
OK 형질도입 및 BIX/BayK 처리가 MEF가 iPSC가 되도록 유도할 수 있다는 것을 추가로 확인하고 규명하기 위해, 본 발명자들은 Oct4-GFP 리포터를 함유하는 0G2+/-/ROSA26+/-(0G2) 형질전환 마우스 유래의 1차 MEF를 사용하였다(Do, J.T. and Scholer, H.R., Stem Cells, 22:941-949 (2004)). 일단 재프로그래밍되면, 상기 세포를 이후 편리하게 사용하여 키메라 및 생식선 역량을 평가하였다. 129개의 MEF와 유사하게, OK에 의해 형질도입된 OG2 MEF는 BayK/BIX(OK2B iPSC)의 조합으로 처리될 때 iPSC를 생성할 것이다(도 3). 처음에 바이러스 형질도입 및 화합물 처리 후 14-21 일에 GFP+ iPSC 콜로니를 검출할 수 있었다. OG2 MEF를 OK에 의해 형질도입하고 어떠한 화합물로도 처리하지 않을 때, 3.5×104개의 세포당 평균 0.5±0.7개의 콜로니로 소수의 소형 콜로니만이 나타났다. 상기 콜로니는 계대하기 어려웠고 따라서 추가로 더 연구하지 않았다. OK 형질도입된 0G2 MEF의 BIX만으로의 처리는 OK 단독과 비교하여 3.5×104개의 세포당 2.5±0.7개의 콜로니로 용이하게 및 재현 가능하게 재프로그래밍이 가능하게 하였다. OK에 의해 형질도입된 0G2 MEF를 BIX(2 μM)와 BayK(2 μM)의 조합으로 처리할 때 재프로그래밍 효율이 추가로 유의적으로 증가하였고, 이때 3.5×104개의 세포당 7.7±1.5개의 콜로니가 관찰되었다(도 3). BIX의 부재 하에 OK 형질도입된 OG2 MEF를 BayK 단독으로 처리하면 상기 OK 형질도입된 MEF 대조군보다 재프로그래밍 효율을 증가시키지 않았다(데이터 기재 안 함).
OK2B 콜로니를 골라내고 20회 초과의 계대에 대해 소분자의 부재 하에 종래 mESC 성장 조건에서 조사된 MEF 피더 세포 상에서 연속 확대시켰다. 염색 및/또는 RT-PCR(도 4A)에 의해 상기 GFP+ OK2B iPSC가 ALP, 나노그, Sox2, Oct4, SSEA1, c-Myc, eRas, Esgl, Ecat1 및 Fgf4를 비롯한 전형적 만능성 마커를 발현하다는 것이 나타났다. 또한, RT-PCR 분석에 의해 OK2B iPSC가 내인성 Oct4 및 Klf4를 발현한다는 것이 입증되었다(도 4A). 나노그 프로모터의 중아황산염 게놈 서열분석에 의해 이것이 mESC 대조군(R1)과 유사하게 OK2B iPSC에서 탈메틸화되지만, MEF의 나노그 프로모터가 과메틸화된다는 것을 나타났다(도 4B). 상기 결과는 추가로 상기 OK2B iPSC에서 줄기 세포 전사 프로그램의 재활성화를 제시한다. 또한, 전사체 분석에 의해 OK2B iPSC의 발현 프로파일이 0.96의 피어슨(Pearson) 상관 값으로 mESC 중 하나와 매우 유사하지만, 군집 분석에서 예시한 바대로 0.84의 피어슨 상관 값으로 MEF의 프로파일과는 유의적으로 다르다는 것을 나타낸다.
OK2B 전사체와 mES 세포 및 MEF 세포를 비교시, 전사체 분석을 수행하였다. Qiagen RNAeasy Mini 키트를 사용하여 OK2B iPS 세포로부터 13회 계대에서 RNA를 추출하였다. GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Arrays(Affymetrix)를 이용하여 polyA RNA로부터 OK2B iPSC에 대한 RNA 발현 데이터를 만들었다. Gene Expression Omnibus(GEO) 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)로부터 MEF 세포 및 mES 세포에 대한 발현 데이터를 얻었다. mES 세포 데이터 등록 번호: GSM 198062. GSM198063, 및 GSM198064. MEF 세포 데이터 등록 번호: GSM198070 및 GSM 198072. dChip(http://biosunl.harvard.edu/complab/dchip/; Distance metric correlation(Pearson); 연결 방법: 센트로이드(centroid); 유전자 정렬: 군집 결집성에 의함)을 사용하여 사전작업(Pre-processing), 정규화(GC-RMA) 및 계층적 군집분석을 수행하였다. 0K2B iPSC 대 MEF 세포에 대한 p 값: 0.84; OK2B iPSC 대 mES 세포에 대한 p 값: 0.96. 피어슨 상관 시험을 이용하여 p 값을 얻었다.
0 K2B iPSC 는 3가지 배엽 모두로부터 세포로 분화하였고 생식선 전이에 기여하였다.
OK2B iPSC는 현탁액 중의 배상체(EB)를 효과적으로 형성하였고, 이는 내배엽 세포(알부민 및 Pdx1), 중배엽 세포/심근육 세포(CT3) 및 외배엽 세포/뉴런(βⅢ-투불린, Tuj1), 3가지 1차 배엽의 유도체로 분화하였다. 또한, 0K2B iPSC는 8-세포기 배아에 의한 응집 이후 배반포의 내부 세포 질량으로 효과적으로 통합되고, 응집된 배아가 가임신 마우스로 이식된 후 생체내 생식선 기여로 키메라를 생성시켰다. 또한, 암컷 CD1 야생형 마우스를 상기 배반포로부터 얻은 하나의 성체 수컷 후대와 짝짓기시키면 LacZ+ 후대를 생성시켰고, 이들 중 3개는 Oct4-GFP+ 생식소를 나타냈고, 이로써 상기 iPSC가 생식선 전이에 기여한다는 것을 추가 입증되었다. 상기 시험관내 및 생체내 규명에 의해 오직 2개의 유전자, OK, 및 BIX/BayK 처리와의 조합으로 레트로바이러스 형질도입이 MEF를 iPSC로 재프로그래밍하기에 충분하다는 것을 확인되었고, 이는 표현형으로 및 기능적으로 전형적 mESC와 유사하였다.
논의
본원에 제시된 상기 연구는 특정 TF(들)의 바이러스 형질도입을 기능적으로 대체하고 MEF와 같은 일반적인 세포 유형으로부터 iPSC를 생성하는 데 있어 재프로그래밍 효율을 증대시키기 위해 합리적으로 설계된 표현형 스크리닝으로부터 소분자가 확인될 수 있다는 원리 증명 입증이다. iPSC의 생성에 대한 상기 화학적 접근법(표적/과정의 더 정확한 및 일시적 제어를 제공)은 또한 해로운 검출 곤란 삽입 게놈 변경을 도입할 수 있는 암유전자에 의한 유전 조작에 대해 유리할 수 있다. 궁극적으로 계통 제한 세포를 완전히 화학적으로 한정된 조건에서 만능 또는 다중분화능 상태로 재프로그래밍할 수 있는 추가 소분자를 발견하기 위해 유사한 전략을 사용하였다. 원래 BIX가 확인되었고 G9a HMTase에 대한 특이적 억제제로서 규명하였다(Kubicek, S. et al., Mol Cell, 25: 473-481 (2007)). G9a 표적 유전자에서 H3K9me2 수준을 감소시키는 것으로 나타났다(Feldman, N. et al., Nat Cell Biol, 8: 188-194 (2006)). 흥미롭게도, G9a에 의해 매개되는 히스톤 H3K9 메틸화 및 이질 염색질은 배아 유전자, 예컨대 Oct4 및 Rex1의 후성적 침묵에 대해 고도 특이적 메커니즘을 나타냈다(Feldman, N. et al., Nat Cell Biol, 8: 188-194 (2006)). 또한, G9a의 넉다운(knock-down)이 성체 신경 세포의 융합 기반 재프로그래밍을 보조할 수 있다는 것이 또한 증명되었다(Ma, D.K. et al., Stem Cells, 26: 2131-2141 (2008)). 따라서, 본 발명자들은 이미 BIX가 OK 또는 Klf4/Sox2/c-Myc 중 어느 하나에 의해 형질도입된 NPC로부터 iPSC의 생성을 촉진할 수 있다는 것이 적합하다는 것을 관찰하였고(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), 이것이 Sox2 또는 Oct4의 외인성 발현을 보상할 수 있다는 것을 제시한다. 그러나, NPC는 이미 유의적 수준의 Sox2를 발현하고, 이는 상기 세포가 상기 기재된 조건에서 재프로그래밍에 더 적합하게 할 수 있을 것이다. 이러한 최근 연구는 MEF의 재프로그래밍을 가능하게 할 수 있고, 재프로그래밍에 필요한 것으로 생각되는 TF 중 어떤 것도 발현하지 않는 소분자를 확인하는 것을 목표로 한다. 본 발명자들이 NPC 및 MEF 스크리닝 둘 다에서 BIX를 확인하고, 상기 분자가 체세포로부터 iPSC의 생성을 가능하게 하고 증대시키는 데 역할을 한다는 것을 추가로 확인한 것은 행운이었다. BIX의 규명된 작용 메커니즘을 고려하면, 본 연구는 아마도 약리학적 억제를 통한 기능 손실이 필수 iPSC 재프로그래밍 유전자의 기능 획득을 보상하기에 충분한 분자 표적을 확인한 것이었다. 이는 추가로 특이적 후성적 과정, G9a 매개 H3K9me2의 억제를 iPSC 생성으로 기계적으로 연결하였다. BIX는 후성적 균형을 만능성 유전자의 침묵 상태로부터 활성 전사 상태로 이동시키는 것을 촉진하도록 작용할 수 있다. 명확히, BIX와 상이한 표적 및 작용 메커니즘을 갖는 다른 염색질 변형 소분자, 예컨대 RG108과의 조합은 훌륭한 재프로그래밍에 이용될 것이다. 반면, 특이적 L형 칼슘 채널 효능제(Schramm, M. et al., Nature, 303: 535-537 (1983))로서 규명된 활성을 갖는 BayK가 재프로그래밍 효율을 증대시킨다는 관찰은 흥미롭다. L형 칼슘 채널은 상이한 조직에서의 세포내 과정, 예컨대 혈압 조절, 평활근 수축, 인슐린 분비, 심장 발생 등을 매개하는 것으로 알려져 있다(Tosti, E., Reprod Biol Endocrinol, 4:26 (2006)). 또한, BayK를 비롯한 상이한 효능제에 의한 L형 칼슘 채널의 활성화는 CREB 활성화를 통한 세포내 신호, 근소포체 Ca2+ 방출 및 cAMP 활성 변경을 유도하는 것으로 나타났다. 더욱 특히, 몇몇 보고서는 칼슘이 mES 세포 증식의 제어에서 중요한 역할을 할 것이라는 것을 제시한다(Heo, J.S. et al., Am J Physiol Cell Physiol, 290: C123-133 (2006)). 그러나, 발명자의 손으로, 2 μM BayK 단독 또는 1 μM BIX와의 조합에 의한 mES 세포의 처리는 증식을 변경시키지 못했다(도 5). 또한, 2 μM BayK 단독 또는 1 μM BIX와의 조합에 의한 OG2 MEF의 처리는 SOX2 발현을 유도하지 못했다(도 6). 말할 필요도 없이, 재프로그래밍 과정에 영향을 미치는 정확한 메커니즘을 분석하기 위해 더 많은 노력이 수행될 필요가 있다. 그러나, 이미 재프로그래밍으로 연결되지 않은 신호 경로에서 활성을 갖는 소분자가 그 효율을 현저히 증가시킬 수 있다는 발견은 흥미롭다. 아직까지, Wnt3 단백질(Marson, A. et al., Cell Stem Cell, 3: 132-135 (2008))을 별도로 하고, 이는 염색질 변경제에 직접 영향을 미치지 않고 재프로그래밍에 영향을 나타내는 상기 유형의 첫번째 소분자이다. 현재까지 다른 소분자의 대부분이 재프로그래밍에 영향을 미치는 것으로 발견되면서, 세포: 즉, BIX(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), 발프로산(Huangfu, D. et al., Nat Biotechnol, 26: 795-797 (2008)) 및 5'-아자시티딘(Mikkelsen, T.S. et al, Nature, 454: 49-55 (2008))의 후성적 상태를 직접 변경시키는 것으로 보인다. 중요하게는, BayK는 궁극적으로 분자를 생체내 재프로그래밍 및/또는 재생에 치료학적으로 관련시키는 것이 바람직할 수 있는 몇몇 중요한 특성을 갖는 것으로 보인다. 그 자체로 행동/재프로그래밍하지 않지만, 그 효과를 발휘하기 위해 BIX의 존재를 필요로 한다는 사실은 아마도 손상에 의해 야기된, 이미 재프로그래밍을 겪은 세포가 그 효과에 더 적합할 것이라는 것을 제시한다. 이는 본 발명자들이 직접 후성적 변경제가 그러한 것처럼 궁극적으로 건강한 세포에 전신으로 영향을 미치는 일 없이 더욱 특정한 방식으로 표적 세포를 재프로그래밍하도록 하였다.
요약하면, 본 발명자들은 한정된 소분자 조건을 확인하였고, 즉, BIX 및 BIX/BayK, 또는 BIX/RG108의 조합은 단지 2개의 TF: Oct4 및 Klf4의 형질도입과 함께 섬유아세포의 iPSC의 재프로그래밍을 가능하게 하고 증가시킬 수 있다. 본 연구는 필수 iPSC TF, 예컨대 본 연구에서의 Sox2 또는 이미 보고된 바의 Oct4의 바이러스 형질도입을 효과적으로 보상할 수 있는 소분자를 확인하는 데 있어 표현형 스크리닝 접근법의 유용성을 추가로 확인시켜 주었다(Shi, Y. et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)). 궁극적으로, 표현형 소분자 스크리닝은 재프로그래밍 과정에의 신규한 관점을 본 발명자들에게 제공하는 데 있어 강력한 도구가 될 수 있는 소분자를 확인할 수 있게 하고, 궁극적으로 생체내 줄기 세포 생물학 및 치료에 유용할 수 있다.
실험 절차
MEF 유도
WiCeIl Research Institute 웹사이트("Introduction to human embryonic stem cell culture methods"에서의 프로토콜에 따라 129S2/SvPasCrlf 또는 ROSA26+/-/OG2+/- MEF를 유도하였다. 막스 플랑크 재단의 체제의 동물 보호 가이드라인에 따라 동물 실험을 수행하였다.
레트로바이러스 형질도입 및 화합물
Addgene(미국 마이애미주 캠브리지 소재)로부터 마우스 Oct4, Klf4, c-Myc 및 Sox2에 대한 pMX계 레트로바이러스 벡터를 얻었다. 기재된 바대로 바이러스 제조 및 형질도입 과정을 수행하였다(Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)). 화합물 BIX-01294의 합성 및 완전 규명은 이미 기재되어 있고(Kubicek, S. et al., Mol Cell, 25: 473-481 (2007)), EMD/CalbiochemBiochemical(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)로부터 Bayk8644를 구입하였다.
MEF 로부터의 iPSC 생성에 대한 스크리닝
1차 및 2차 스크리닝의 경우, 공지 화합물 집단을 사용하였다. 상기 집단은 FDA 승인 약물, 규명된 효소의 공지 억제제 및 활성제[Sigma-Aldrich(미국 미조리주 세이트 루이스 소재)로부터 얻은 LOPAC 집단, BIOMOL(미국 펜실베니아주 플라이마우스 미팅 소재)로부터 얻은 공지 생활성 라이브러리 및 EMD Calbiochem(미국 샌프란시스코 샌 디에고 소재)로부터 얻은 비중첩 공지 화합물을 포함]를 비롯하여 상업적으로 구입 가능한 거의 2000개의 공지 생활성 분자로 이루어졌다.
6웰 플레이트의 웰당 3.5×104개의 세포의 밀도로 마트리겔(1:50; BD Biosciences(미국 마이애미주 베드포드 소재)) 코팅된 접시로 1차 129S2/SvPasCrlf(1차 스크리닝) 또는 ROSA26+/-/OG2+/-(2차 스크리닝) MEF를 평판 배양하였다. 24 시간 후, 상기 세포를 37℃, 5% CO2에서 한정된 레트로바이러스에 의해 밤새 형질도입하였다. 12 내지 14 시간 후, 형질도입된 세포에서의 배지를 mESC 배지[넛아웃 DMEM, 10% ES qualified FBS, 10% 넛아웃 혈청 대체물, 1% 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 1% EmbryoMax ESC Qualified Nucleosides(미국 캘리포니아주 테메큘라 밀리포어 소재) 및 103 U/ml LIF(밀리포어)](제품 모두는 언급된 것 외에는 Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스버그 소재)으로부터 얻었다)로 교환하였다. 동일자에, 공지 약물 집단으로부터 각각의 소분자를 0.5 내지 2 μM 범위로 상기 세포에 첨가하였다. 10-14 일 동안 화합물 처리를 계속하였다; 상기 세포를 고정시키고 표준 ALP 검출 키트(밀리포어)를 사용하여 14-21 일에 염색하였다. 제2 스크리닝의 경우, 형질도입 1 일 후 mESC 배지에 1 μM BIX를 첨가하였다. 5 일 후, 1 μM BIX 이외에, 공지 약물 집단으로부터 각각의 소분자를 0.5 내지 2 μM 범위로 각각의 웰에 첨가하였다. mESC에 유사한 형태를 갖는 콜로니가 관찰될 때까지(이는 일반적으로 형질도입 14-21 일 후임) 한정된 소분자를 갖는 마우스 ESC 배지를 매 3 일 마다 교체하였다. 본원에 기재된 확인된 화합물 이외에, 추가로 추적 관리되지 않은 제2 상승제(synergist) 스크리닝으로부터의 1차 힛은 또한 PD173074, 리버신, 5'-아자시티딘, 플루리포틴 및 덱사메타손을 포함하였다. 1차 129S2/SvPasCrlf 또는 ROSA26+/-/OG2+/- MEF 중 어느 하나에서 추가 규명 연구 및 반복을 수행하였다. ROSA26+/-/OG2+/- MEF를 사용할 때, iPSC 콜로니가 또한 Oct4 발현의 마커로서 GFP 발현을 통해 확인되었다. 일단 iPSC 콜로니가 확인되면, 이것을 mESC 배지에서 MEF 피더 세포 상에서의 확대에 대해 골라낸다. 몇몇 콜로니를 0.5-2 μM의 농도에서 MEK 억제제, PD0325901의 존재 하에 확대시켜 그 만능성을 추가로 확인하였다.
면역 세포 화학 및 면역 형광법 분석
알칼리성 포스파타제 검출 키트(밀리포어)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 ALP 염색을 수행하였다. 면역 형광법 분석의 경우, 세포를 파라포름알데하이드 중에 실온(RT)에서 15 분 동안 고정시키고 PBS로 세척하였다. 이후, 상기 세포를 차단 완충액(BB)[PBS(Invitrogen) 중의 0.3% Triton X-100(Sigma-Aldrich), 10% 일반 당나귀 혈청(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc)] 중에 실온에서 30 동안 항온처리하였다. 이후, 상기 세포를 1차 항체로 BB 중에 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고 제2 항체로 BB 중에 실온에서 45-60 분 동안 항온처리하였다. 1차 항체는 마우스 항-Oct4(1:200)(Santa Cruz Biotechnology, Inc., 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재), 마우스 항-SSEA1(1:200)(Santa Cruz Biotechnology Inc.), 래빗 항-나노그(1:500)(Abeam Inc., 미국 마이애미주 캠브리지 소재), 마우스 항-Sox2(1:200)(밀리포어), 래빗 항-Pdx1(1:200)(Dr. C. Wright로부터 확보), 마우스 항-βⅢ- 투불린(Tujl)(1:500)(Covance Research Products Inc., 미국 펜실베니아주 덴버 소재), 마우스 항-심장 트로포닌 T(CT3)(1:200)(미국 아이오와주 아이오와 시티에 소재하는 아이오와 대학의 Developmental Studies Hybridoma Bank), 래빗 항-알부민(DAKO)이었다. 제2 항체는 Alexa Fluor555 당나귀 항-마우스 또는 래빗 IgG(1:500)(Invitrogen)이었다. DAPI(Sigma-Aldrich) 염색에 의해 핵을 검출하였다. 측광 CoolSnap HQ2 카메라가 달린 Nikon Eclipse TE2000-U/X-cite 120 EXFO 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다.
RT - PCR 분석
RNeasy Plus Mini 키트를 QIAshredder와 조합하여 사용하여 iPSC 및 대조군 세포주로부터 RNA를 추출하였다. iScriptTMcDNA 합성 키트(BioRad, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)를 사용하여 RNA를 cDNA로 전환하였다. 이미 공개된 프라이머(Takahashi, K. et al, Cell, 131: 861-872 (2007); Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)) 및 Platinum PCR SuperMix(Invitrogen)를 사용하여 Mastercycler ep gradient PCR 기계(Eppendorf)에서 특정 유전자의 증폭을 수행하였다.
메틸화 분석
Non Organic DNA 분리 키트(밀리포어)를 사용하여 R1, OG2 MEF 및 OK iPSC(10회 계대) 세포로부터 DNA를 분리하였다. 이후, EZ DNA Methylation-Gold KitTM(Zymo Research Corp., 미국 캘리포니아주 오렌지 소재)으로 중아황산염 서열분석을 위해 DNA를 처리하였다. 이후, 처리된 DNA를 사용하여 관심 있는 서열을 증폭시켰다. 프로모터 분획 증폭에 사용된 프라이머는 이미 공개된 것이었다(Blelloch, R. et al., Stem Cells, 24: 2007-2013 (2006)). 서열분석(Invitrogen)을 위해 TOPO TA 클로닝 키트를 사용하여 얻어진 분획을 클로닝하고 서열분석을 수행하였다.
투명대 제거 배아에 의한 iPSC 의 응집
iPS 세포를 파열된 후-치밀화 8-세포기 배아로 응집하여 응집 키메라를 얻었다. 2.5 dpc에서의 암컷으로부터 풍부한 8-세포기 배아(B6C3F1)를 광유 하에 KSOM 배지(10% FCS)의 미세액적 중에 배양하였다. 짧은 트립신 처리 후 iPS 세포(10-20개의 세포) 덩어리를 선택하고 투명대 제거 8-세포기 배아를 함유하는 미세액적으로 옮겼다. iPS 세포로 응집된 8-세포기 배아를 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양하였다. 8-세포기로부터 발생한 응집된 배반포를 2.5 dpc 가임신 수혜자의 1종의 자궁각으로 옮겼다. 하나의 성체 수컷 키메라를 암컷 CD1 야생형 마우스와 짝짓기하였다. X-gal 염색은 키메라 마우스 및 야생형 마우스의 이러한 자연 짝짓기로부터 얻은 6개의 F1 배아가 생식선 전이에 의해 생성된다는 것을 나타낸다.
통계 분석
엑셀에서 표준 t-test를 이용하여 막대 그래프 및 통계 분석을 수행하였다.
마이크로어레이 분석
젤라틴(미국 캘리포니아주 테메큘라 밀리포어 소재)에서 완전 mES 세포 배지에서 2 일 동안 [넛아웃 DMEM, 10% ES qualified FBS, 10% 넛아웃 혈청 대체물, 1% 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신, 0.1 mM β-머캅토에탄올, 1% EmbryoMax ESC Qualified Nucleoside(밀리포어) 및 103 U/ml LIF(밀리포어)](제품 모두는 언급된 것 외에는 Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스버그 소재)으로부터 얻었다) OK2B iPSC를 성장시켰다. 이후, RNAeasy Mini 키트(Qiagen, 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 2개의 웰로부터 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 시료를 증폭시키고 MessageAmp II-Biotin Enhanced Kit(Ambion, 미국 텍사스주 오스틴 소재)를 사용하여 표지하였다. 이후, 증폭된 표지 시료를 마우스 게놈 430 2.0 어레이(Affymetrix)로 하이브리드화하고 계층적 군집분석을 사용하고 유전자패턴(world wide web(broad.mit.edu/ 암/software/))을 이용하여 분석을 수행하였다(Pearson, 로그 변환, 열-중앙 값).
증식 분석
완전 mES 세포 배지에서 2×1O5개의 세포/웰의 밀도로 젤라틴 코팅된 6웰 플레이트에 mES R1 세포를 평판 배양하였다. 세포 부착시, 대략 12 시간에, 상기 세포를 DMSO, 1 μM BIX, 2 μM BayK, 및 둘 다의 조합으로 3중으로 처리하였다. 15, 24 및 48 시간에, 트립신을 사용하여 상기 세포를 탈착시키고, 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. 죽은 세포 제거에 트립신 블루(Sigma-Aldrich, 미국 미조리주 세인트 루이스 소재)를 사용하였다.
화합물 처리 후 SOX2 발현의 평가
웰당 3.4×104개의 세포의 밀도로 6웰 플레이트에 OG2+/-/ROSA26+/- MEF를 평판 배양하였다. 익일에, 상기 세포를 DMSO, 1 μM BIX, 2 μM BayK, 및 둘 다의 조합으로 3중으로 6 일 동안 처리하였다. 상기 배지를 3 일에 교체하였다. RNAeasy Mini Kit(Quiagen)를 사용하여 각각의 웰로부터 RNA를 분리하였다. iScript™cDNA Synthesis Kit(BioRad, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재)를 사용하여 RNA의 역전사를 수행하였다. 이미 공개된 프라이머(Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc 2, 3081-3089; Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676)를 사용하여 Mastercycler® ep gradient PCR 기계(Eppendorf)에서 Platinum PCR SuperMix(Invitrogen)로 내인성 Sox2의 증폭을 수행하였다.
실시예 3
본 실시예는 포유동물 세포의 전사 인자 단백질과의 항온처리가 만능성을 유도하기에 충분하다는 것을 입증하는 것이다.
유전자 작제 :
이. 콜라이에서 고수준 단백질 발현을 얻기 위해, 처음에 모든 4개의 인간 TF 유전자 코돈 구역을 최적화하고(G A Gutman and G W Hatfield (1989). PNAS. vol. 86.pp:3699-3703), DNA 올리고 기반/PCR 유전자 어셈블리 기술(Danilo R Casimiro, Peter E Wright & H Jane Dyson. (1997). Structure. Vol.5. pp: 1407- 1412.)을 이용하여 전장을 합성하였다. 폴리-아르기닌 태그: ESGGGGSPGRRRRRRRRRRR을 설계에서 각각의 단백질 C 말단에 첨가하였다(Gump JM, Dowdy SF. (2007) Trends MoI Med. 2007 Oct; 13(10): 443-8). 마지막 DNA 단편을 Ndel 및 Xhol 부위 옆에 배치하고, 단백질 발현을 위해 pET41 발현 벡터 Ndel-Xhol 부위로 삽입하였다. DNA 서열로 각각의 플라스미드를 검증하고, 이후 재조합 단백질 제조을 위해 자동 유도 배지를 사용하여 밤새 BL21 시작 경쟁 세포로 형질전환하였다(Studier FW, (2005) Protein Expr Purif. 41(1). Pp: 207-234.).
단백질 제조
에스체리치아 콜라이 BL21(DE3) 세포를 pET-Oct4-PTD("PTD"는 단백질 형질도입 도메인을 의미), pET-Sox2-PTD, pET-Klf4-PTD 및 pET-c-Myc-PTD로 각각 형질전환하고, 자동 유도 방법을 이용하여 단백질 발현을 수행하였다(Studier F. W., Protein Expression and Purification, 41 (2005) 207-234). 봉입체를 가용화시키고 상기 단백질을 기재된 바대로 재폴딩하였다(LaFe vre BM, Wu S. & Lin X. Molecular Cancer Therapeutics 7, 1420-1429, 2008년 6월 일. doi: 10.1158/1535-7163; Medynski D., Tuan M., Liu, W., Wu, S. & Lin, X. Protein Expression and Purification Vol. 52, 395-402, 2007년 4월; Hou W., Medynski D., Wu, S., Lin, X. & Li, LY. Clinical Cancer Research Vol. 11, 5595-5602, 1, 2005년 8월 1일).
간단하게, 발현 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이를 카나마이신을 함유하는 Luria-Bertani Broth 1.0 L 리터에 접종하고, A600nm =0.6에서 500 μmol/L IPTG에 의해 유도하고, 37℃에서 3 시간 동안 교반하였다. 상기 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 펠렛을 냉동 및 해동 주기로 처리하였다. 방출된 봉입체를 20 mmol/L 트리스, 100 mmol/L NaCl, 1% TritonX-100을 함유하는 완충액(pH 8.0)으로 강하게 세척하고, 8 mol/L 우레아, 0.1 mol/L 트리스, 1 mmol/L 글리신, 1 mmol/L EDTA, 10 mmol/L b-머캅토에탄올, 10 mmol/L DTT, 1 mmol/L 환원 글루타티온, 0.1 mmol/L 산화 글루타티온을 함유하는 완충액(pH 10) 중에 A280 nm = 2.0으로 용해시켰다. 가용화된 봉입체를 기재된 바대로 신속 희석 방법에 따라 재폴딩하였다(Lin XL, Lin YZ, Tang J., Methods Enzymol 1994. 241. 195-224; Lin X, Koelsh G., Wu.S, Downs D, Dashti A. Tang J. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97. 1556-1560; Kim YT. Downs D. Wu S, et al. Eur J Biochem 2002. 269: 5669-77; Michelle LaFevre-Bernt, Shili Wu, and Xinli Lin. (2008). Molecular Cancer Therapeutics. 7: pp: 1420-1429). 상기 재폴딩된 단백질을 N2 한외여과에 의해 농축시키고 Sephacryl S 300을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 각각의 단백질 제제 중의 내독소 농도는 100 EU/mg 미만이었다. 대부분의 재폴딩 단백질 시료는 > 1.5 mg/ml 이상의 용해도를 가졌다.
접선 유동 여과를 이용하여 재폴딩된 단백질을 농축시키고, Superdex-200 컬럼(XK26×850 mm, GE, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 갖는 크기 배제 크로마토그래피로 정제하고, SDS-PAGE를 사용하여 확인하였다.
Oct4/Sox2/Klf4 또는 Oct4/Sox2/Klf4/Myc(모든 단백질은 상기 기재된 바대로 폴리-Arg 함유) 중 어느 하나의 8 ㎍/ml가 보충된 mESC 배지 중에 마우스 섬유아세포를 6-8 시간 동안 성장시키고, 세척하고, 상기 기재된 전사 인자 없이 mESC 배지 중에 2-3 일 동안 항온처리하였다. 이를 (4-12 시간, 1-3 일) 수회(1회, 2회, 3회, 4회 이상) 반복하고, 이후 상기 세포를 2 주 동안 mESC 중에 배양하였다. 이 기간 후, 콜로니 형태 및 마커 발현에 의해 배양물이 만능 세포를 함유하는지를 결정하였다(데이터 기재 안 함). 유의할 것은 전사 인자를 갖는 상기 세포의 일정한 항온처리(즉, 단백질 없이 1-3 일 기간 제외))는 상기 세포에 독성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 필요한 것은 아니지만, 상기 세포를 MEK 억제제(PD0325901) 및/또는 GSK 억제제(CHIR99021) 및/또는 TGF베타 억제제(SB431542)로 종종 항온처리하고 상기 제제의 존재는 만능 세포의 발생의 효율 및 속도를 증가시켰다.
상기 실시예가 제공되어 본 발명을 설명하지만, 그 범위를 한정하지는 않는다. 당업자라면, 본 발명의 다른 변형을 용이하게 알 것이고, 다른 변형은 첨부된 특허청구범위에 포함된다. 본원에 인용된 모두 공보, 데이터베이스, 유전자은행(Genbank) 서열, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조문헌으로 포함된다.

Claims (79)

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  6. 비만능 포유동물 세포로부터 유도 만능 줄기 세포를 제조하는 시험관내 또는 생체외 방법으로서,
    (a) 상기 비만능 포유동물 세포로, i) Oct4 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Sox2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트로서, 상기 폴리펩티드들은 동일하거나 상이한 발현 카세트 내에 존재하는 것인 발현 카세트; 또는 ii) 외인성 Oct4 폴리펩티드, 외인성 Sox2 폴리펩티드, 및 외인성 Klf4 폴리펩티드를 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 비만능 포유동물 세포를 글리코겐 신타제 키나제 3(GSK3) 억제제, MAPK/ERK 키나제(MEK) 억제제, 및 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 수용체/액티빈 수용체-유사 키나제(ALK5) 억제제와 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단계 (a)는 비만능 포유동물 세포를 외인성 폴리펩티드와 접촉시키는 사이클 2회 이상을 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 비만능 포유동물 세포는 체세포인 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 체세포는 섬유아 세포인 것인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 비만능 포유동물 세포는 전구 세포인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 전구 세포는 신경 전구 세포, 피부 전구 세포 또는 모낭 전구 세포인 것인 방법.
  12. 제6항에 있어서, TGFβ 수용체/ALK5 억제제는 SB431542 및 A-83-01로 이루어진 군에서 선택되고; GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함하며; MEK 억제제는 PD0325901을 포함하는 것인 방법.
  13. 제6항에 있어서, 유도 만능 줄기 세포는 원하는 세포 유형으로 분화되는 것인 방법.
  14. (a) 포유동물 체세포, 전구 세포, 또는 비만능 줄기 세포; 및
    (b) GSK3 억제제, MEK 억제제, 및 TGFβ 수용체/ALK5 억제제
    를 포함하는 시험관내 또는 생체외 혼합물로서,
    상기 포유동물 체세포, 전구 세포, 또는 비만능 줄기 세포에, i) Oct4 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Sox2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트로서, 상기 폴리펩티드들은 동일하거나 상이한 발현 카세트 내에 존재하는 것인 발현 카세트; 또는 ii) 외인성 Oct4 폴리펩티드, 외인성 Sox2 폴리펩티드, 및 외인성 Klf4 폴리펩티드가 도입된 것인 혼합물.
  15. 제14항에 있어서, 세포는 인간 세포인 것인 혼합물.
  16. 제14항에 있어서, 체세포는 섬유아 세포인 것인 혼합물.
  17. 제14항에 있어서, 세포는 전구 세포인 것인 혼합물.
  18. 제17항에 있어서, 전구 세포는 신경 전구 세포, 피부 전구 세포 또는 모낭 전구 세포인 것인 혼합물.
  19. 제14항에 있어서, TGFβ 수용체/ALK5 억제제는 SB431542 및 A-83-01로 이루어진 군에서 선택되고; GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함하며; MEK 억제제는 PD0325901을 포함하는 것인 혼합물.
  20. (a) GSK3 억제제, MEK 억제제, 및 TGFβ 수용체/ALK5 억제제; 및
    (b) i) Oct4 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Klf4 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Sox2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 카세트로서, 상기 폴리펩티드들은 동일하거나 상이한 발현 카세트 내에 존재하는 것인 발현 카세트; 또는 ii) 외인성 Oct4 폴리펩티드, 외인성 Sox2 폴리펩티드, 및 외인성 Klf4 폴리펩티드
    를 포함하는 배지 조성물.
  21. 제20항에 있어서, TGFβ 수용체/ALK5 억제제는 SB431542 및 A-83-01로 이루어진 군에서 선택되고; GSK3 억제제는 CHIR99021을 포함하며; MEK 억제제는 PD0325901을 포함하는 것인 배지 조성물.
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