KR20240066520A - 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 효율 증진 방법 - Google Patents
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- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
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Abstract
본 발명은 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 과정에서 형성되는 외배아 내배엽(extra-embryonic endoderm, XEN) 세포 집단의 균질성을 증가시킴으로써 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 효율을 현저히 증진시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 효율을 현저히 증진시킬 수 있다.
Description
본 발명은 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 과정에서 형성되는 외배아 내배엽(extra-embryonic endoderm, XEN) 세포 집단의 균질성을 증가시킴으로써 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 효율을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
유도만능 줄기세포는 이미 분화가 완료된 성체세포에서 만능성을 유도해 만들어진 줄기세포이며, 제작을 위해서는 외래 유전자를 세포 내로 도입하는 과정이 필요하다. 하지만 이 과정에서 외래 유전자가 숙주 유전자에 무작위로 삽입되어 돌연변이나 암을 발생시킬 가능성이 있어 세포치료제로 적용하기는 어려운 실정이다.
이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로 화학물질을 이용하는 것이 있다. 세포의 signaling pathway 조절자나 후성유전학적 조절자로 작용하는 화학물질을 이용하여 세포의 운명을 바꿔주는 것이다. 화학물질을 사용해 만능성을 유도하는 방법은 기존에 이용하던 바이러스를 사용한 방법보다 간단할 뿐 아니라, 화학물질의 가감이 용이하여 더욱 정밀한 조절이 가능하다는 장점을 가지므로 실험적 측면에서 기존의 방법보다 편리하다. 또한, 위에 언급하였던 외래 유전자 삽입 문제를 해결할 수 있으므로 세포 치료제로의 적용 가능성도 높다.
구체적으로, 마우스 배아 섬유아세포 (mouse embryonic fibroblasts; MEFs) 에서 7가지의 화학물질을 사용하여 화학적 유도만능줄기세포 (Chemically induced pluripotent stem cells; CiPSCs)를 만드는 연구가 2013년 Science에 소개되었다 [Hou, P. et al. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science 341, 651-654, doi:10.1126/science.1239278 (2013)]. 이후, 5개의 화학물질을 추가하여 동일한 연구의 효율을 높인 연구가 2015년 Cell지에 소개되었다 [Zhao, Y. et al. A XEN-like State Bridges Somatic Cells to Pluripotency during Chemical Reprogramming. Cell 163, 1678-1691, doi:10.1016/j.cell.2015.11.017 (2015)]. 그런데, 화학물질을 세포에 처리하여 CiPSCs를 제작하는 방법이 2015년 Cell지에 발표되었으나, 비교적 단순한 방법임에도 논문을 발표한 그룹 외의 연구자는 재현실험이 불가하였다.
본 발명자들은 CiPSCs의 제작 효율을 높이기 위한 방법에 대하여 연구 노력하던 중, CiPSCs 제작에 외배아 내배엽 (extra-embryonic endoderm, XEN) 세포의 확립이 필수적이라는 점에 착안하여 XEN 세포의 균질성을 증가시킨 경우 CiPSCs의 제작 효율을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 분화된 세포의 유도만능줄기세포(Chemically induced pluripotent stem cells; CiPSCs)로의 리프로그래밍 효율 증진 방법을 제공하는 데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 분화된 세포를 외배아 내배엽 (extra-embryonic endoderm, XEN) 세포 유도용 배지 조성물에서 배양하여 XEN 세포 (Chemically induced extraembryonic endoderm cells, CiXENs) 형성을 유도하는 단계; 및 (2) 상기 CiXENs를 적어도 4회 이상 계대배양하여 상기 CiXENs의 균질성을 증가시키는 단계;를 포함하는, 분화된 세포의 유도만능줄기세포 (Chemically induced pluripotent stem cells; CiPSCs)로의 리프로그래밍 효율 증진 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 분화된 세포는 마우스로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 분화된 세포는 섬유아세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 XEN 세포 유도용 배지 조성물은 bFGF; 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제; TGFβ 수용체 억제제; 사이클릭 AMP (cAMP) 효능제; 및 히스톤 메틸전이효소 (Histone Methyltransferase; HMTase) 억제제;를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 GSK 억제제는 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴] (CHIR99021)이고, 상기 TGFβ 수용체 억제제는 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘] (616452)이며; 상기 cAMP 효능제는 포스콜린 (Forskolin)이고, 상기 HMTase 억제제는 7-[5-데옥시-5-[[3-[[[[4-(1,1-디메틸에틸)페닐]아미노]카르보닐]아미노]프로필](1-메틸에틸)아미노]-β-D-리보푸라노실]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, 모노포름산 (EPZ004777)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 XEN 세포 유도용 배지 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 (Histone deacetylase; HDAC) 억제제, 모노아민산화효소 (monoamine oxidase, MAO) 억제제 및 레티노산 수용체 효능제 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 추가하여 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 HDAC 억제제는 발프로산 (Valproic acid; VPA)이고, 상기 MAO 억제제는 트라닐시프로민 (Tranylcypromine)이며, 상기 레티노산 수용체 효능제는 4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복사미도]벤조산 (AM580)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, (1) 단계의 배양은 10 내지 14일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 방법은 (3) 상기 (2) 단계에서 얻은 균질성이 증가된 CiXENs를 배양하여 CiPSCs로의 리프로그래밍을 촉진하는 단계;를 추가하여 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 배양은 (a) bFGF, GSK 억제제, 및 cAMP 효능제가 생략된 XEN 유도용 배지에서 배양하는 단계; (b) XEN 유도용 배지에서 배양하는 단계; (c) GSK 억제제, MEK 저해제 및 LIF (leukemia inhibitory factor)를 포함하는 CiPSC 유도용 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 MEK 저해제는 N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-이오도페닐)아미노]-벤즈아미드 (PD032901)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 배양은 4 내지 12일 동안 수행되고, 상기 (b) 단계의 배양은 4 내지 12일 동안 수행되며, 상기 (c) 단계의 배양은 8 내지 16일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 분화된 세포의 유도만능줄기세포로의 리프로그래밍 효율을 현저히 증진시킬 수 있다.
도 1은 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 유도만능줄기세포(CiPSCs)로의 리프로그래밍 방법의 개략도이다.
도 2는 MEFs에서 외배아 내배엽 세포(Chemically induced extra-embryonic endoderm, CiXENs)를 형성하는 과정에서의 시간 경과에 따른 세포 형태를 나타내는 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 3은 MEFs 및 CiXENs에서의 XEN 세포 특이적 유전자의 발현량을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 CiXENs에서 발현되는 XEN 세포 특이적 단백질을 나타내는 면역 세포 화학 염색 결과이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 5는 CiXENs 형성 과정 중에 나타나는 mESC (마우스 배아 줄기 세포)-유사 세포 콜로니 (붉은색 화살표로 표시)를 나타내는 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 6a는 CiXENs의 계대횟수 (Passage)에 따른 XEN 세포 특이적 유전자의 발현량을 비교하여 나타내는 그래프이고, 도 6b는 10회 계대배양한 CiXENs (Passage 10)의 균질한 형태를 나타내는 이미지이며 (좌측 그림 스케일바: 100 ㎛, 우측 그림 스케일바: 50 ㎛), 도 6c는 8회 계대배양한 CiXENs (Passage 8)에서 발현되는 XEN 세포 특이적 단백질을 나타내는 면역 형광 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 7a는 균질한 CiXENs에서 CiPSCs을 유도하는 기간 동안의 시간 경과에 따른 세포 형태를 나타내는 이미지이고 (스케일바: 100 ㎛), 도 7b는 CiPSCs의 형태를 나타내는 이미지이며, 도 7c는 XEN 세포의 계대 횟수(Passage)에 따라 CiPSCs가 유도되는 확률을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 CiPSCs를 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)로 염색하여 나타낸 이미지이고 (스케일바: 100 ㎛), 도 8b는 CiPSCs에서 발현되는 만능성 특이적 유전자를 나타내는 이미지이며, 도 8c는 CiPSCs에서 발현되는 만능성 특이적 단백질의 면역 형광 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 9a는 CiPSCs의 외배엽 유사 세포 (α-actin), 중배엽 유사 세포 (MAP2) 및 내배엽 유사 세포 (AFP)로의 체외 분화를 나타내는 이미지이고 (스케일바: 100 ㎛), 도 9b는 CiPSCs의 외배엽 (신경관), 중배엽 (연골), 및 내배엽 (샘) 세포로의 체내 분화를 나타내는 이미지이다 (스케일바: 50 ㎛).
도 2는 MEFs에서 외배아 내배엽 세포(Chemically induced extra-embryonic endoderm, CiXENs)를 형성하는 과정에서의 시간 경과에 따른 세포 형태를 나타내는 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 3은 MEFs 및 CiXENs에서의 XEN 세포 특이적 유전자의 발현량을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 CiXENs에서 발현되는 XEN 세포 특이적 단백질을 나타내는 면역 세포 화학 염색 결과이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 5는 CiXENs 형성 과정 중에 나타나는 mESC (마우스 배아 줄기 세포)-유사 세포 콜로니 (붉은색 화살표로 표시)를 나타내는 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 6a는 CiXENs의 계대횟수 (Passage)에 따른 XEN 세포 특이적 유전자의 발현량을 비교하여 나타내는 그래프이고, 도 6b는 10회 계대배양한 CiXENs (Passage 10)의 균질한 형태를 나타내는 이미지이며 (좌측 그림 스케일바: 100 ㎛, 우측 그림 스케일바: 50 ㎛), 도 6c는 8회 계대배양한 CiXENs (Passage 8)에서 발현되는 XEN 세포 특이적 단백질을 나타내는 면역 형광 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 7a는 균질한 CiXENs에서 CiPSCs을 유도하는 기간 동안의 시간 경과에 따른 세포 형태를 나타내는 이미지이고 (스케일바: 100 ㎛), 도 7b는 CiPSCs의 형태를 나타내는 이미지이며, 도 7c는 XEN 세포의 계대 횟수(Passage)에 따라 CiPSCs가 유도되는 확률을 나타내는 그래프이다.
도 8a는 CiPSCs를 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)로 염색하여 나타낸 이미지이고 (스케일바: 100 ㎛), 도 8b는 CiPSCs에서 발현되는 만능성 특이적 유전자를 나타내는 이미지이며, 도 8c는 CiPSCs에서 발현되는 만능성 특이적 단백질의 면역 형광 이미지이다 (스케일바: 100 ㎛).
도 9a는 CiPSCs의 외배엽 유사 세포 (α-actin), 중배엽 유사 세포 (MAP2) 및 내배엽 유사 세포 (AFP)로의 체외 분화를 나타내는 이미지이고 (스케일바: 100 ㎛), 도 9b는 CiPSCs의 외배엽 (신경관), 중배엽 (연골), 및 내배엽 (샘) 세포로의 체내 분화를 나타내는 이미지이다 (스케일바: 50 ㎛).
본 명세서에서, “화학적으로 유도된 만능줄기세포(CiPSCs)” 또는 “유도만능줄기세포”는 하나 이상의 형질감염된 유전자의 발현에 의해서가 아니라, 비-만능성 세포를 화학적 화합물과 접촉시킴으로써, 만능성 또는 다능성이 아닌 세포, 즉 분화된 세포로부터 유래된 만능줄기세포를 지칭한다.
본 명세서에서, "만능성" 또는 “다능성”은 다음 3가지 배엽 중 어느 것으로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 줄기세포를 지칭한다: 내배엽 (예를 들어, 내부 위 내벽, 위장관, 폐), 중배엽 (예를 들어, 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽 (예를 들어, 표피 조직 및 신경계). 용어 "비-만능성"은 세포가 상기 3가지 배엽 모두로 분화될 수 있는 잠재력을 지니지 않는다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "리프로그래밍(또는 재프로그래밍)"은 하나의 특이적 세포 유형이 또 다른 특이적 세포 유형으로 전환되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 비-만능성인 세포는 만능성 세포가 되도록 리프로그래밍될 수 있다. 화학적 화합물을 이용하여 비-만능성 세포를 만능성 세포가 되도록 재프로그래밍하는 경우, 이로써 생성되는 세포는 화학적으로 유도된 만능줄기세포이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 (1) 분화된 세포를 외배아 내배엽 (extra-embryonic endoderm, XEN) 세포 유도용 배지 조성물에서 배양하여 XEN 세포(Chemically induced extra-embryonic endoderm cells, CiXENs) 형성을 유도하는 단계; 및 (2) 상기 CiXENs를 적어도 4회 이상 계대배양하여 상기 CiXENs의 균질성을 증가시키는 단계;를 포함하는, 분화된 세포의 유도만능줄기세포(Chemically induced pluripotent stem cells; CiPSCs)로의 리프로그래밍 효율 증진 방법에 관한 것이다.
먼저, (1) 단계는 분화된 세포를 XEN 세포 유도용 배지 조성물에서 배양하여 XEN 세포(CiXENs) 형성을 유도하는 단계이다.
일 구체예에서, 상기 분화된 세포는 인간으로부터 유래된 것일 수 있고, 바람직하게는 섬유아세포일 수 있다.
상기 XEN 세포 유도용 배지 조성물은 bFGF; 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제; TGFβ 수용체 억제제; 사이클릭 AMP (cAMP) 효능제; 및 히스톤 메틸전이효소 (Histone Methyltransferase; HMTase) 억제제;를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 GSK 억제제는 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴] (CHIR99021)이고, 상기 TGFβ 수용체 억제제는 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘] (616452)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 TGFβ 수용체 억제제는 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘] (616452)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 cAMP 효능제는 포스콜린 (Forskolin)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 HMTase 억제제는 7-[5-데옥시-5-[[3-[[[[4-(1,1-디메틸에틸)페닐]아미노]카르보닐]아미노]프로필](1-메틸에틸)아미노]-β-D-리보푸라노실]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, 모노포름산 (EPZ004777)일 수 있다.
상기 XEN 세포 유도용 배지 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 (Histone deacetylase; HDAC) 억제제, 모노아민산화효소 (monoamine oxidase, MAO) 억제제 및 레티노산 수용체 효능제 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 추가하여 포함할 수 있고, 바람직하게는 히스톤 탈아세틸화효소 (Histone deacetylase; HDAC) 억제제, 모노아민산화효소 (monoamine oxidase, MAO) 억제제 및 레티노산 수용체 효능제를 모두 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 HDAC 억제제는 발프로산 (Valproic acid; VPA)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 MAO 억제제는 트라닐시프로민 (Tranylcypromine)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 레티노산 수용체 효능제는 4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복사미도]벤조산 (AM580)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (1) 단계의 배양은 10 내지 14일, 바람직하게는 11 내지 13일, 더욱 바람직하게는 12일 동안 수행될 수 있다.
분화된 세포를 상기 XEN 세포 유도용 배지 조성물에서 상기 기간 동안 배양하는 경우 XEN 세포(CiXENs)의 형성을 유도할 수 있고, 상기 배양 기간이 상기 하한치 미만인 경우에는 XEN 세포가 형성되지 않을 수 있으며, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 세포 수가 너무 많아져 cell culture plate well에 포화상태를 이루어 세포끼리 엉겨 붙어 배양액 교체하는 과정에서 세포 집단이 떨어져 나갈 우려가 있다.
다음으로, (2) 단계는 상기 CiXENs를 적어도 4회 이상 계대배양하여 상기 CiXENs의 균질성을 증가시키는 단계이다.
일 구체예에서, 상기 형성된 CiXENs를 적어도 4회 이상, 바람직하게는 4 내지 12회, 더욱 바람직하게는 4 내지 20회 계대배양할 수 있다. 상기 계대배양 횟수가 상기 하한치 미만인 경우에는 CiXENs의 균질성이 원하는 만큼 증가하지 않게 되어 이후 CiPSCs로의 리프로그래밍 제작 효율이 현저히 감소하게 된다.
한편, 상기 CiXENs의 계대배양 과정에서 마우스 배아 줄기세포 (mouse embryonic stem cell, mESC)와 유사한 콜로니 형태를 가지는 세포가 형성되는 경우에는 물리적으로 제거하는 것이 바람직하다.
이후, 본 발명의 방법은 (3) 상기 (2) 단계에서 얻은 균질성이 증가된 CiXENs를 배양하여 CiPSCs로의 리프로그래밍을 촉진하는 단계;를 추가하여 포함한다.
상기 (3) 단계의 배양은 (a) bFGF, GSK 억제제, 및 cAMP 효능제 감손 (reduced) XEN 유도용 배지 조성물에서 배양하는 단계; (b) 상기 XEN 유도용 배지 조성물과 동일한 구성을 가진 제1 CiPSC 유도용 배지 조성물에서 배양하는 단계; 및 (c) GSK 억제제, MEK 저해제 및 LIF (leukemia inhibitory factor)를 포함하는 제2 CiPSC 유도용 배지 조성물에서 배양하는 단계;를 순차적으로 수행할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (a) 단계의 감손 XEN 유도용 배지 조성물은 XEN 유도용 배지 조성물에 비해 bFGF가 1/5~1/2 농도, 바람직하게는 1/4 농도, GSK 억제제가 1/5~1/2 농도, 바람직하게는 1/2 농도, 및 cAMP 효능제가 1/5~1/2 농도, 바람직하게는 1/5 농도로 감손된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (b) 단계의 제1 CiPSC 유도용 배지 조성물은 XEN 유도용 배지 조성물과 동일한 구성을 가지되, HMTase 억제제로서 EPZ004777 대신 SGC0946를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (c) 단계의 MEK 저해제는 N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-이오도페닐)아미노]-벤즈아미드 (PD032901)일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 (a) 단계의 배양은 3 내지 4일 동안, 바람직하게는 4일 동안 수행되고, 상기 (b) 단계의 배양은 10 내지 16일 동안, 바람직하게는 11 내지 14일 동안, 더욱 바람직하게는 11 내지 13일 동안, 더욱 바람직하게는 12일 동안 수행되며, 상기 (c) 단계의 배양은 4 내지 12일 동안, 바람직하게는 8 내지 12일 동안, 더욱 바람직하게는 10 내지 12일 동안 수행될 수 있다.
상기 각 단계의 배양일이 상기 범위일 때 세포가 가장 안정적으로 배양이 되어 다음 단계로의 진입이 수월해지며, 각 단계의 배양일이 상기 하한치 미만인 경우에는 세포 수가 다음 단계로 진입하기에 부족한 문제가 생길 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 세포 수가 너무 많아져 세포끼리 뭉치거나 떡지게 될 수 있으며, 배양액을 교체하는 과정에서 세포 집단이 떨어져나갈 우려가 있다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)의 배양 및 준비
MEFs을 MEF 배지 조성물이 구축된 젤라틴이 코팅된 배양 접시(5.0×104/3.8 cm2) 에 도말하였다. 이틀에 한번씩 배지 조성물을 교체하며 배양하였다. 배양 접시의 70~80% 정도로 세포가 자라면 배지 조성물을 걷어내고 DPBS로 헹궈준 뒤, 0.25% trypsin-EDTA를 넣어주고 37 ℃에서 2분간 처리하였다. Trypsin 불활성화를 위해 배지 조성물을 trypsin의 5배 만큼 넣어주었다. 부드러운 피펫팅으로 떨어진 세포를 수집하여 1500 rpm 으로 4분간 원심분리하였다.
상기 MEF 배지 조성물은 10% fetal bovine serum (FBS; Corning), 0.1 mM non-essential amino acids (NEAA; Gibco), and 1% penicillin-streptomycin (P/S; Welgene)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Welgene) 으로 구성되었다.
실시예 2: MEFs에서 CiXENs의 유도
상기 준비한 MEFs을 MEF 배지 조성물이 구축된 젤라틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 3.0×104/well로 도말하였다. 이튿날 (이 날을 0일로 한다), MEF 배지 조성물을 걷어내고 DPBS로 헹궈준 뒤, CiXEN 유도용 배지 조성물을 1 ml 넣어주었다. 5% CO2 및 37 ℃의 온도조건에서 세포를 배양하였으며, CiXEN 유도용 배지 조성물은 4일 마다 교체해 주었다 (도 2).
12일째 되는 날 CiXENs의 유도가 완료되었다.
상기 CiXEN 유도용 배지 조성물은 KnockOut Serum (Gibco) 10%, 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, Corning) 10%, GlutaMAX™ Supplement (Gibco) 1%, MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Gibco) 1%, 2-머캅토에탄올 (2-mercaptoethanol, Gibco) 0.055 mM, 페니실린-스트렙토마이신 (penicillin-streptomycin, Welgene) 1%, bFGF (Peprotech, USA) 100 ng/ml, 발프로산(Valproic Acid, Sigma-Aldrich) 0.5 mM, CHIR99021 (Biogems) 20 μm, 616452 (Tocris) 10 μm, 트라닐시프로민 (Tranylcypromine, Tocris) 5 μM, 포스콜린 (Forskolin, Enzo), 50 μM, AM580 (Tocris) 0.05 μM, EPZ004777 (Selleckchem) 5 μm을 포함하는 KnockOut DMEM (Gibco)으로 구성되었다.
실험예 1: MEFs에서 유도된 CiXENs의 특성 분석
상기 실시예 2에 의해 준비된 CiXENs의 특성 분석을 진행하였다
1-1: 실험방법
(1) Quantitative PCR 분석
총 RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 제조사의 지침에 따라 분리하고, 총 RNA 1 ㎍을 고용량 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA(complementary DNA)로 역전사 시켰다. Real-time PCR 시스템(Applied Biosystems)에서 XEN 세포 유전자 특이적 프라이머 (표 1)와 SYBR Green (Enzynomics)을 사용하여 정량적 PCR (qPCR)을 수행하였다.
qPCR 조건은 95 ℃에서 15 초간, 60 ℃에서 60 초간 40 사이클 실시되었다. 모든 반응은 3번씩 진행하였고 내인성 β-actin으로 정량화 하였다(도 3).
| 유전자 | 방향 | Primer sequence (5’ - 3’) | 서열번호 |
| Gata4 | Forward | AGG CAG AAA GCA AGG ACT AGG | 서열번호 1 |
| Reverse | CAG CAT CAA AGC AGA AAC CTC | 서열번호 2 | |
| Gata6 | Forward | AGT TTT CCG GCA GAG CAG TA | 서열번호 3 |
| Reverse | AGT CAA GGC CAT CCA CTG TC | 서열번호 4 | |
| Sall4 | Forward | ACA CCA GTT CCC TCA CTT CTT | 서열번호 5 |
| Reverse | TTG GAA AGC AGC ATA GCA ACT | 서열번호 6 | |
| Soxl7 | Forward | GGG ATG TGG CTT AGG CAG TA | 서열번호 7 |
| Reverse | CGA GCT CAC GAC GTT ATC AA | 서열번호 8 |
(2) 알칼리성 인산분해효소 염색 및 면역세포화학 분석
알칼리성 인산분해효소 (Alkaline phosphatase) 염색은 제조사의 지시에 따라 Leukocyte 알칼리성 인산분해효소 키트 (Stemgent, USA)를 사용하여 수행하였다.
면역세포화학 분석을 위해 CiXENs 세포를 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드 (Sigma-Aldrich)에 고정시킨 뒤, DPBS로 3회 세척하였다. 그 다음 0.5% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 1% 소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA) fraction Ⅴ (Sigma-Aldrich), 10% 소태아혈청을 포함하는 DPBS를 이용하여 실온에서 10분 동안 배양하였다. 배양한 세포를 DPBS로 세척한 후 1차 항체를 처리하여 4 ℃의 온도조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이튿날, 0.5%의 BSA를 포함하는 DPBS로 세척한 후 2차 항체를 처리하고 실온에서 1시간동안 배양하였다. DPBS로 세척한 후, 세포핵 (nuclei)을 DAPI (Sigma-Aldrich)로 염색하였다.
1-2: 실험 결과
MEFs을 특정 화학물질이 들어간 배양액에서 배양하여 CiXENs을 유도한 것이 qPCR 분석 및 면역세포화학분석에 의해 특징지어진다.
도 3은 상기 qPCR 분석결과로서, MEFs 및 CiXENs (MEFs를 CiXEN 유도용 배지 조성물에서 배양한 12일째 되는 날의 세포)에서의 XEN 세포 특이적 유전자의 발현량을 비교하여 나타내는 그래프이다.
도 3을 살펴보면, CiXENs의 경우 MEFs에 비하여 XEN 특이적 유전자인 Gata6, Gata4, Sall4, Sox17 발현이 월등히 높은 것을 확인할 수 있다.
도 4는 CiXENs에서 발현되는 XEN 세포 특이적 단백질을 나타내는 면역 세포 화학 염색 결과이다.
도 4를 살펴보면, 본 발명의 CiXENs에서 XEN 세포 특이적 단백질인 Gata4 및 Gata6이 발현된 것을 확인할 수 있다.
상기와 같은 결과는 MEFs을 CiXEN 유도용 배지 조성물로 배양함으로써 CiXENs로 분화가 되었음을 나타낸다. 하지만, 도 4를 참고하면 모든 세포에서 XEN 세포 특이적 단백질을 발현하지 않을 뿐 아니라, 그 발현 또한 균일하지 않음을 확인할 수 있다. 따라서, 1회의 CiXENs 유도 과정만으로는 모든 세포가 CiXENs이 되는 것은 아님을 알 수 있으며, 이 시기에는 CiXENs과 CiXENs이 아닌 세포가 섞여 있으므로 이 시기의 세포를 이질적인 (heterogeneous) CiXENs이라 하겠다.
실시예 3: CiXEN 세포의 균질성 증가
MEFs에서 12일 동안의 유도 과정을 마친, 계대횟수 (passage) 0의 CiXENs을 계대배양 해주었다.
먼저, CiXEN 유도용 배지 조성물을 제거하고 DPBS로 세척한 뒤, 0.25% trypsin-EDTA를 넣어주고 37 ℃에서 5분간 처리하였다. 이후, Trypsin 불활성화를 위해 CiXEN 유도용 배지 조성물을 trypsin의 2배 만큼 넣어주었다. 이후, 부드러운 피펫팅으로 세포를 수집하여 1500 rpm 으로 4분간 원심분리하였다.
준비한 계대 횟수 (passage) 0의 CiXENs를 CiXEN 유도용 배지 조성물이 구축된 젤라틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 5.0×104/well로 도말하였다. 5% CO2 및 37 ℃의 온도조건에서 세포를 배양하였으며, CiXEN 유도용 배지 조성물은 4일 마다 교체해 주었다.
12-웰 플레이트의 각 well에 세포가 90% 정도 차면 계대배양 해주었다. 한 번의 계대배양을 거칠 때마다 세포의 계대횟수 (passage)가 하나씩 올라간다.
4번 이상의 계대배양을 통해 균질한 CiXENs line을 확립하였다.
한편, CiXENs를 배양하는 과정에서 형성되는 마우스 배아 줄기세포 (mouse embryonic stem cell, mESC)와 유사한 콜로니 형태를 가지는 세포 (도 5)는 물리적으로 제거하였다.
실험예 2: 균질성이 증가된 CiXENs의 특성 분석
상기 실시예 3에 의해 균질성이 증가된 CiXENs의 특성을 실험예 1과 같은 방법으로 분석하여 도 6에 나타내었다.
도 6a는 qPCR 분석결과로서, CiXENs의 계대횟수 (Passage)에 따른 XEN 세포 특이적 유전자의 발현량을 비교하여 나타내는 그래프이고, 도 6b는 10회 계대배양한 CiXENs (Passage 10)의 균질한 형태를 나타내는 이미지이며, 도 6c는 8회 계대배양한 CiXENs (Passage 8)에서 발현되는 XEN 세포 특이적 단백질을 나타내는 면역 형광 이미지이다.
도 6a을 살펴보면, CiXENs의 계대횟수 (Passage)에 따라 달라지는 XEN 특이적 유전자의 발현을 볼 수 있다. 특히, 계대횟수 (passage) 4 이상의 CiXENs (P4, P9, P12, P16 및 P18)의 경우 MEFs 및 계대횟수 (passage) 1의 CiXENs에 비해 XEN 특이적 유전자의 발현량이 현저히 높은 것을 확인할 수 있다. 또한, 계대횟수 4회의 CiXENs (P4)와, 계대횟수 9회 이상의 CiXENs의 XEN 특이적 유전자 발현량에 유의적인 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있다.
또한, 도 6b에서는 세포의 형태가 균일한 것을 볼 수 있으며, 도 6c에서는 도 4와는 달리 대부분의 세포에서 XEN 특이적 단백질이 균일하게 발현되는 것을 확인할 수 있다.
상기와 같은 결과는, 1회의 유도 과정을 거친 이질적인 CiXENs이 계대배양을 하며 더욱 오랜 기간 동안 화학물질에 의해 특정화 되며 균질한 CiXENs이 된 것을 나타낸다.
실시예 4: 균질한 (homogeneous) CiXEN cell 에서 CiPSCs의 유도
계대횟수 (Passage) 4 이상의 균질한 CiXENs을 CiXEN 유도용 배지 조성물이 구축된 젤라틴이 코팅된 12-웰 플레이트에 5.0×104/well로 도말하였다.
이튿날 (이 날을 1일로 한다), CiXEN 유도용 배지 조성물을 제거하고 DPBS로 세척한 뒤 감손 (reduced) CiXEN 유도용 배지 조성물로 교체하였다.
상기 감손 (reduced) CiXEN 유도용 배지 조성물은 bFGF, CHIR99021, 및 Forskolin을 제외한 모든 구성물을 CiXENs 유도용 배지 조성물과 동일하게 한 것으로, CiXENs 유도용 배지 조성물에서 bFGF은 100 ng/ml에서 25 ng/ml로 (1/4 농도), CHIR99021은 20 μm에서 10 μm로 (1/2 농도), Forskolin은 50 μm에서 10 μm로 (1/5 농도) 농도를 감소시킨 것이다.
4일째 되는 날, 제1 CiPSC 유도용 배지 조성물로 교체해주고 16일째 되는 날에는 제2 CiPSC 유도용 배지 조성물로 교체해준 뒤, 28일까지 배양하였다. 상기 유도 기간 동안 5% CO2 및 37 ℃의 온도조건에서 세포를 배양하였으며, 배양액은 4일 마다 교체해 주었다.
상기 제1 CiPSC 유도용 배지 조성물은 KnockOut Serum; 10%, 소태아혈청 10%, GlutaMAX™ Supplement 1%, MEM Non-Essential Amino Acids Solution 1%, bFGF 25 ng/ml, 발프로산 0.5 mM, CHIR99021 10 μm, 616452 10 μm, 트라닐시프로민 5 μM, 포스콜린 10 μM, AM580 0.05 μM, SGC0946 (Selleckchem) 5 μm, 5-aza-dC (Enzo) 0.5μm 을 포함하는 KnockOut DMEM (Gibco) 으로 구성되었다. 상기 제1 CiPSC 유도용 배지 조성물은 2-머캅토에탄올 및 페니실린-스트렙토마이신이 생략되고, HMTase 억제제로서 EPZ004777 대신 SGC0946를 포함하는 것과 SGC0946, 5-aza-dC가 추가되는 것을 제외하고는 XEN 유도용 배지 조성물과 동일한 구성이다.
상기 제2 CiPSC 유도용 배지 조성물은 N2 supplement 100X, B27 supplement 50X, GlutaMAX™ Supplement 1%, MEM Non-Essential Amino Acids Solution 1%, 2-머캅토에탄올 0.055 mM, 페니실린-스트렙토마이신 1%, CHIR99021 10 μm, PD0325901 (Tocris) 1 μm, LIF 1000 U/ml을 포함하는 DMEM/F12 (Corning) 50%와 Neurobasal (Gibco) 50% 로 구성되었다.
실험예 3: 균질한 CiXENs에서 유도된 CiPSCs의 특성 분석
상기 실시예 4에 따라 유도된 CiPSCs의 특성을 분석하였다.
3-1: 실험방법
(1) 알칼리성 인산분해효소 염색 (AP 염색)
Stemgent® AP Staining Kit II (Stemgent)를 이용하여 CiPSCs 내의 알칼리성 인산분해효소 (Alkaline phosphatase)를 염색해 주었다. 키트의 Solution A 0.5 ml와 solution B 0.5 ml를 섞은 뒤 2분 뒤에 solution C 0.5 ml를 넣어주어 AP 기질 용액을 만들었다. 준비된 세포의 배양액을 제거하고 DPBS로 세척한 뒤, 고정화 용액을 넣고 실온에서 3분간 배양하였다. 고정화 용액을 제거하고 DPBS로 2회 세척한 뒤 AP 기질 용액을 넣어주고 실온에서 5~15분간 배양하였다. AP 기질 용액을 제거하고 DPBS로 2회 세척한 뒤 DPBS를 넣어주었다.
(2) RT-PCR 분석
총 RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen)을 이용하여 분리하고, 총 RNA 1 ㎍을 고용량 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)로 cDNA(complementary DNA)로 역전사 시킨 뒤, PCR 증폭은 유전자 특이적 프라이머 (표 2)와 SYBR Green (Enzynomics)을 이용하여 수행하였다. PCR 조건은 94 ℃에서 30 초간, 50 내지 65 ℃에서 30 초간 및 72 ℃에서 30 초간 32 사이클 실시되었다. RT-PCR 산물은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 분석하였다.
| 유전자 | 방향 | Primer sequence (5’ - 3’) | 서열번호 |
| Oct4 | Forward | CTG AGG GCC AGG CAG GAG CAC GAG | 서열번호 9 |
| Reverse | CTG TAG GGA GGG CTT CGG GCA CTT | 서열번호 10 | |
| Manog | Forward | AGG GTC TGC TAC TGA GAT TCT CTG | 서열번호 11 |
| Reverse | CAA CCA CTG GTT TTT CTG CCA CCG | 서열번호 12 | |
| Cripto | Forward | ATG GAC GCA ACT GTG AAC ATG ATG TTC GCA | 서열번호 13 |
| Reverse | CTT TGA GGT CCT GGT CCA TCA CGT GAC CAT | 서열번호 14 | |
| FGF4 | Forward | CAG CGA GGC GTG GTG AGC ATC TTC GGA | 서열번호 15 |
| Reverse | CTT CTT GGT CCG CCC GTT CTT ACT GAG | 서열번호 16 | |
| Rex1 | Forward | CAC CAT CCG GGA TGA AAG TGA GAT | 서열번호 17 |
| Reverse | ACC AGA AAA TGT CGC TTT AGT TTC | 서열번호 18 | |
| Utf1 | Forward | CTC AAG GAC AAA CTC CGA GAC T | 서열번호 19 |
| Reverse | AGA CTT CGT CGT GGA AGA ACT G | 서열번호 20 | |
| Esg1 | Forward | ATA AGC TTG ATC TCG TCT TCC | 서열번호 21 |
| Reverse | CTT GCT AGG ATG TAA CAA AGC | 서열번호 22 | |
| β-actin | Forward | CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA GC | 서열번호 23 |
| Reverse | ATC TGC TGG AAG GTG GAC AGT GAG | 서열번호 24 | |
| mGFP | Forward | ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC | 서열번호 25 |
| Reverse | AAG CGA TGC CCT TCA GCT C | 서열번호 26 |
(3) CiPSCs의 체외 분화
수집한 CiPSCs를 배아체 형성을 위해 mESC 배지 조성물에 1.0×103/30 μl 농도로 현탁시켰다. 세포배양 접시를 준비하고 배양 접시 뚜껑에 30 μl의 현탁액 방울을 만들어주었다. 조심히 뚜껑을 뒤집어 배양 접시를 닫고 현탁액 방울이 뚜껑에 맺힌 상태로 5% CO2 및 37 ℃의 온도조건에서 5일 동안 배양하였다. 배아체가 형성되면 젤라틴으로 코팅된 4-웰 플레이트로 옮겨 MEF 배지 조성물로 14일 동안 배양하였다.
(4) CiPSCs의 체내 기형종 형성 및 분화
수집한 CiPSCs를 mESC 배지 조성물과 matrigel (Corning)을 1:1(100 μl/100 μl)로 혼합한 혼합액에 현탁시킨 후 상기 CiPSCs 현탁액을 면역 결핍 ICR 마우스에 피하 주사하였다. 3주 뒤, 형성된 기형종을 외과적으로 절개한 후 4% 파라포름알데히드로 고정하고 파라핀에 포매한 후 H&E Staining Kit (Abcam)을 이용하여 염색하였다.
3-2: 실험결과
CiPSCs에서의 만능성 특이적 유전자인 Oct4의 발현을 확인하기 위해, Oct4의 발현을 GFP 형광으로 볼 수 있는 Oct4-GFP reporter MEFs을 사용하였다 (도 7).
도 7a는 균질한 CiXENs에서 CiPSCs을 유도하는 기간 동안의 시간 경과에 따른 세포 형태를 나타내는 이미지이고, 도 7b는 CiPSCs의 형태를 나타내는 이미지이며, 도 7c는 CiXENs의 계대 횟수 (Passage)에 따라 CiPSCs가 유도되는 확률을 나타내는 그래프이다.
도 7a를 살펴보면, 균질한 CiXENs가 만능성을 가지는 CiPSCs로 유도되어 GFP를 발현하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 7b를 살펴보면, 상기 유도된 CiPSCs를 분리하여 배양한 결과 안정적으로 증식하며 형태를 유지하는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 7c를 살펴보면, 계대횟수 (Passage) 4 미만의 이질적인 CiXENs로부터는 CiPSCs가 유도되지 않았으나, 계대횟수 (Passage) 4 이상의 균질한 CiXENs로부터는 약 30%의 확률로 CiPSCs가 유도되는 것을 확인할 수 있다. 즉, CiXENs의 균질성이 CiPSC를 유도하는 데 중요한 요소이며, 계대횟수 4 이상의 CiXEN으로부터 CiPSC를 유도해야만 성공적인 리프로그래밍을 달성할 수 있음을 알 수 있다.
도 8a는 CiPSCs를 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)로 염색하여 나타낸 이미지이고, 도 8b는 CiPSCs에서 발현되는 만능성 특이적 유전자를 나타내는 이미지이며, 도 8c는 CiPSCs에서 발현되는 만능성 특이적 단백질의 면역 형광 이미지이다.
도 8a를 살펴보면, 유도만능 줄기세포가 가지는 만능성의 초기 표지자인 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)가 염색이 되어 분홍빛을 띄는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 8b를 살펴보면, MEFs에서는 발현되지 않는 만능성 특이적 유전자가 CiPSCs에서 mESC와 유사한 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있고, 도 8c를 살펴보면, 본 발명의 CiPSCs에서 만능성 특이적 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있다.
도 9a는 CiPSCs의 외배엽 유사 세포 (α-actin), 중배엽 유사 세포 (MAP2) 및 내배엽 유사 세포 (AFP)로의 체외 분화를 나타내는 이미지이고, 도 9b는 CiPSCs의 외배엽 (신경관), 중배엽 (연골), 및 내배엽 (샘) 세포로의 체내 분화를 나타내는 이미지이다.
도 9a를 살펴보면, 본 발명의 CiPSCs는 체외에서 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 모두 분화되는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 9b를 살펴보면, 본 발명의 CiPSCs가 체내에서도 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 모두 분화되는 것을 확인할 수 있다.
상기한 결과들은, CiPSCs는 이질적인 CiXENs에서는 유도가 불가하며, 계대횟수 (passage) 4 이상의 균질한 CiXENs에서 유도가 가능함을 알 수 있다. 균질한 CiXENs에서 유도된 CiPSCs는 만능성 특이적 유전자 및 단백질을 발현하고 모든 계통으로 분화할 수 있는 것으로 보아 줄기세포의 특성을 가지고 있음이 확인되었다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (12)
- (1) 분화된 세포를 외배아 내배엽 (extra-embryonic endoderm, XEN) 세포 유도용 배지 조성물에서 배양하여 XEN 세포 (Chemically induced extraembryonic endoderm cells, CiXENs) 형성을 유도하는 단계; 및
(2) 상기 CiXENs를 적어도 4회 이상 계대배양하여 상기 CiXENs의 균질성을 증가시키는 단계;를 포함하는, 분화된 세포의 유도만능줄기세포 (Chemically induced pluripotent stem cells; CiPSCs)로의 리프로그래밍 효율 증진 방법. - 제1항에 있어서,
상기 분화된 세포는 마우스로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 분화된 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 XEN 세포 유도용 배지 조성물은 bFGF; 글리코겐 합성효소 키나제 (GSK) 억제제; TGFβ 수용체 억제제; 사이클릭 AMP (cAMP) 효능제; 및 히스톤 메틸전이효소 (Histone Methyltransferase; HMTase) 억제제;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 GSK 억제제는 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카르보니트릴] (CHIR99021)이고, 상기 TGFβ 수용체 억제제는 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘] (616452)이며; 상기 cAMP 효능제는 포스콜린 (Forskolin)이고, 상기 HMTase 억제제는 7-[5-데옥시-5-[[3-[[[[4-(1,1-디메틸에틸)페닐]아미노]카르보닐]아미노]프로필](1-메틸에틸)아미노]-β-D-리보푸라노실]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민, 모노포름산 (EPZ004777)인 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 XEN 세포 유도용 배지 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 (Histone deacetylase; HDAC) 억제제, 모노아민산화효소 (monoamine oxidase, MAO) 억제제 및 레티노산 수용체 효능제 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 추가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제6항에 있어서,
상기 HDAC 억제제는 발프로산 (Valproic acid; VPA)이고, 상기 MAO 억제제는 트라닐시프로민 (Tranylcypromine)이며, 상기 레티노산 수용체 효능제는 4-[(5,6,7,8-테트라히드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카르복사미도]벤조산 (AM580)인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
(1) 단계의 배양은 10 내지 14일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
상기 방법은 (3) 상기 (2) 단계에서 얻은 균질성이 증가된 CiXENs를 배양하여 CiPSCs로의 리프로그래밍을 촉진하는 단계;를 추가하여 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 배양은 (a) bFGF, GSK 억제제, 및 cAMP 효능제 감손 (reduced) XEN 유도용 배지 조성물에서 배양하는 단계; (b) 상기 XEN 유도용 배지 조성물과 동일한 구성을 가진 제1 CiPSC 유도용 배지 조성물에서 배양하는 단계; 및 (c) GSK 억제제, MEK 저해제 및 LIF (leukemia inhibitory factor)를 포함하는 제2 CiPSC 유도용 배지 조성물에서 배양하는 단계;를 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 MEK 저해제는 N-[(2R)-2,3-디히드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-이오도페닐)아미노]-벤즈아미드 (PD032901)인 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서,
상기 (a) 단계의 배양은 3 내지 4일 동안 수행되고, 상기 (b) 단계의 배양은 10 내지 16일 동안 수행되며, 상기 (c) 단계의 배양은 4 내지 12일 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240066520A true KR20240066520A (ko) | 2024-05-16 |
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