CN113811316A - 神经嵴细胞或角膜上皮细胞的纯化方法 - Google Patents

神经嵴细胞或角膜上皮细胞的纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供纯化神经嵴细胞或角膜上皮细胞的方法。

Description

神经嵴细胞或角膜上皮细胞的纯化方法
技术领域
本发明涉及神经嵴细胞的纯化方法等，详细地，涉及使用层粘连蛋白211的神经嵴细胞纯化方法等。此外，在另一方式中，本发明涉及使用层粘连蛋白332的角膜上皮细胞纯化方法等。
背景技术
近年来，正在大力开展通过建立iPS细胞进行细胞移植的新的疾病治疗方法。作为一种可适当用于细胞移植治疗的细胞，具有广泛的多分化能力、因此也被称为“第4胚层”的神经嵴细胞受到关注。
已经报道了多种用于制备神经嵴细胞的方法。例如，非专利文献1中公开了下述方法：在TGF-β信号抑制剂和Wnt信号活化剂等的存在下诱导iPS细胞的分化，制备含有神经嵴细胞的细胞群，使用细胞分选仪从该细胞群仅回收神经嵴细胞，对其进行扩大培养。此外，非专利文献2中公开了下述内容：在FGF2和TGFβ信号抑制剂等的存在下诱导ES细胞的分化，制备含有神经嵴细胞的细胞群，进一步将该细胞群在FGF2和TGF-β抑制剂的存在下在含有明胶的培养基中长时间培养，从而能够制备纯度较高的神经嵴细胞。
此外，在细胞移植治疗领域，角膜上皮细胞也是一种备受瞩目的细胞。角膜上皮细胞是构成角膜表面、具有作为保护角膜不受外界伤害的屏障的作用、向角膜中摄入氧的作用的细胞。角膜上皮细胞障碍多与视力下降相关，使患者的QOL显著下降。因此，对于构建用来高效制造用于治疗该障碍的可移植角膜上皮细胞的方法有很大的需求。
作为制备角膜上皮细胞的方法，例如报道了将多能干细胞在基质细胞或羊膜来源因子的存在下，在一定时间内用不含BMP的无血清培养基培养，从而诱导角膜上皮细胞的分化的方法(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特许第5759536号公报
非专利文献
非专利文献1：Fukuta M.等，PLoS One.2014年12月2日，9(12)：e112291。
非专利文献2：Serrano F.等，干细胞发育(Stem Cells Dev.)2019年1月15日，28(2)：81-100。
发明内容
发明所要解决的课题
使用非专利文献1和2公开的方法，能够制备神经嵴细胞。但这些方法仍然是存在问题的。例如，非专利文献1公开的方法中，必须有利用细胞分选仪回收神经嵴细胞的工序，但是，细胞分选仪的使用中存在例如分取目标细胞的收率、纯度、存活率、功能降低的问题、细胞分选仪的购买、维护花费大量费用等各种问题。此外，非专利文献2的方法中虽然没有使用细胞分选仪，但为了获得高纯度的神经嵴细胞，需要连续继代，其制备需要较长的时间，因而高效性存在问题。
此外，如果使用专利文献1公开的方法，能够制备角膜上皮细胞。但与上述神经嵴细胞的情况同样地，为了使用该方法获得高纯度的角膜上皮细胞，需要使用细胞分选仪等从含有诱导的角膜上皮细胞的细胞群筛选角膜上皮细胞的工序，高效性存在问题。
用于解决课题的方法
本发明人等对上述课题进行了深入研究，结果发现，通过以层粘连蛋白211为支架对含有神经嵴细胞的细胞群进行扩大培养，即使不使用细胞分选仪等对神经嵴细胞进行分拣，也能够对神经嵴细胞进行纯化。此外，本发明人等还发现，若使用本方法，与以往的纯化方法相比能够在极短的时间内对神经嵴细胞进行纯化。进一步，本发明人等还发现，通过以层粘连蛋白332为支架对含有超过一定比例的角膜上皮细胞的细胞群进行扩大培养，即使不使用细胞分选仪等对角膜上皮细胞进行分拣，也能够对角膜上皮细胞进行纯化，基于上述见解进一步进行研究，从而完成了本发明。即，本发明如下。
[1]一种纯化神经嵴细胞的方法，包括以下工序：
工序1)获得含有神经嵴细胞的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白211作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有神经嵴细胞的细胞群不经神经嵴细胞的分拣处理而用于工序2。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，工序2的培养时间为1～21天。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，含有神经嵴细胞的细胞群来源于多能干细胞。
[5]根据[4]所述的方法，多能干细胞为iPS细胞。
[6]一种生产经纯化的神经嵴细胞的方法，包括以下工序：
工序1)获得含有神经嵴细胞的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白211作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
[7]根据[6]所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有神经嵴细胞的细胞群不经神经嵴细胞的分拣处理而用于工序2。
[8]根据[6]或[7]所述的方法，工序2的培养时间为1～21天。
[9]根据[6]～[8]中任一项所述的方法，含有神经嵴细胞的细胞群来源于多能干细胞。
[10]根据[9]所述的方法，多能干细胞为iPS细胞。
[11]一种纯化角膜上皮细胞的方法，包括以下工序：
工序1)得到角膜上皮细胞的比例为25％以上的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白332作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
[12]根据[11]所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有角膜上皮细胞的细胞群不经角膜上皮细胞的分拣处理而用于工序2。
[13]根据[11]或[12]所述的方法，工序2的扩大培养中，作为支架使用的层粘连蛋白332的包被量为0.01μg/cm2以上且小于0.5μg/cm2。
[14]根据[11]～[13]中任一项所述的方法，含有角膜上皮细胞的细胞群来源于多能干细胞。
[15]根据[14]所述的方法，多能干细胞为iPS细胞。
[16]一种生产经纯化的角膜上皮细胞的方法，包括以下工序：
工序1)得到角膜上皮细胞的比例为25％以上的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白332作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
[17]根据[16]所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有角膜上皮细胞的细胞群不经角膜上皮细胞的分拣处理而用于工序2。
[18]根据[16]或[17]所述的方法，工序2的扩大培养中，作为支架使用的层粘连蛋白332的包被量为0.01μg/cm2以上且小于0.5μg/cm2。
[19]根据[16]～[18]中任一项所述的方法，含有角膜上皮细胞的细胞群来源于多能干细胞。
[20]根据[19]所述的方法，多能干细胞为iPS细胞。
发明效果
根据本发明，能够非常简便地且在短时间内由含有神经嵴细胞的细胞群纯化神经嵴细胞。此外，根据本发明，能够非常简便地且在短时间内制备高纯度神经嵴细胞。
进一步，根据本发明，能够非常简便地由含有角膜上皮细胞的细胞群纯化角膜上皮细胞。此外，根据本发明，能够非常简便地制备高纯度角膜上皮细胞。
具体实施方式
以下详细地对本发明进行说明。
1.神经嵴细胞的纯化方法
本发明提供一种纯化神经嵴细胞的方法(以下有时称为“本发明的纯化方法1”)，包括以下工序：
工序1)制备含有神经嵴细胞的细胞群的工序、和工序2)使用层粘连蛋白211作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
“神经嵴细胞(Neural Crest Cell，也被称为“NCC”)”的意思是，在脊椎动物的早期发育中，从表皮外胚层与神经板之间临时形成的称为神经堤的结构脱上皮化，从上皮向间质转变后被诱导为胚体内的各种部位的细胞。本说明书中的术语“神经嵴细胞”不仅包括从生物体采集的细胞，也包括多能干细胞来源的神经嵴细胞、对其进行继代而得的细胞。此外，本发明的纯化方法中，神经嵴细胞的来源没有特别限定，是任何脊椎动物的细胞均可，优选为哺乳动物来源的神经嵴细胞。作为该哺乳动物，可列举小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴和人，但不限定于此。
作为本发明的纯化方法1的工序1中制备含有神经嵴细胞的细胞群的方法，是含有生物体来源的神经嵴细胞的细胞群的情况下，可以通过从生物体中的神经堤来源的组织(例如骨髓、脊髓背根神经节、心脏、角膜、虹膜、牙髓和嗅粘膜等)中采集细胞群来制备。此外，是含有多能干细胞来源的神经嵴细胞的细胞群的情况下，如上所述，有多种公知的制备方法，作为一例，可例示在含有TGFβ抑制剂和GSK-3β抑制剂的培养液中对多能干细胞进行培养的方法。通过在含有TGFβ抑制剂和GSK-3β抑制剂的培养液中对iPS细胞进行分化诱导，iPS细胞向由眼睛的各种细胞系构成的具有多条纹区域(多帯状領域)的集落(self-formedectodermal autonomous multi-zone：SEAM，自形成外胚层自主多区)分化。SEAM中可含有神经嵴细胞。
由此得到的细胞群中是否含有神经嵴细胞可以通过本身公知的方法来确认TFAP2a、SOX9、SOX10、TWISTI、PAX3等神经嵴细胞特异性标记基因中1种以上的表达。此外，也可以使用CD271蛋白(也被称为“p75(NTR)”)等存在于神经嵴细胞的细胞表面的蛋白作为神经嵴细胞特异性标记。本发明的纯化方法1中使用的含有神经嵴细胞的细胞群优选来源于多能干细胞，更优选来源于iPS细胞。
此外，本发明中，多能干细胞是具有可分化成存在于生物体中的多种细胞的多能性、且兼具增殖能力的干细胞，包括本发明中使用的中间中胚层细胞诱导的任意细胞。多能干细胞没有特别限定，例如，包括胚胎干(ES)细胞、通过核移植得到的克隆胚来源的胚胎干(ntES)细胞、精子干细胞(GS细胞)、胚性生殖细胞(EG细胞)、人工多能干(iPS)细胞、培养成纤维细胞、骨髓干细胞来源的多能细胞(Muse细胞)等。从制造工序中可不对胚、卵子等进行破坏而获得的观点出发，优选的多能干细胞是iPS细胞，更优选为人iPS细胞。
iPS细胞的制造方法是本领域公知的，可通过向任意体细胞导入初始化因子来制造。这里，初始化因子可例示例如Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3或Glis1等基因或基因产物，这些初始化因子可以单独使用，也可以组合使用。作为初始化因子的组合，可例示WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D,等(2008)，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，26:795-797、Shi Y,等(2008)，细胞干细胞(Cell Stem Cell)，2:525-528、Eminli S,等(2008)，干细胞(Stem Cells).26:2467-2474、Huangfu D,等(2008)，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)26:1269-1275、Shi Y,等(2008)，细胞干细胞(Cell StemCell)，3，568-574、Zhao Y,等(2008)，细胞干细胞(Cell Stem Cell)，3:475-479、MarsonA，(2008)，细胞干细胞(Cell Stem Cell)，3，132-135、Feng B,等(2009)，自然细胞生物学(Nat.Cell Biol.)11:197-203、R.L.Judson等，(2009)，自然生物技术(Nat.Biotechnol.)，27:459-461、Lyssiotis CA,等(2009)，美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A).106:8912-8917、Kim JB,等(2009)，自然(Nature).461:649-643、Ichida JK,等(2009)，细胞干细胞(Cell Stem Cell).5:491-503、Heng JC,等(2010)，细胞干细胞(Cell StemCell).6:167-74、Han J,等(2010)，自然(Nature).463:1096-100、Mali P,等(2010)，干细胞(Stem Cells).28:713-720、Maekawa M,等(2011)，自然(Nature).474:225-9.中记载的组合。
体细胞中，非限定性地，胎儿(幼崽)的体细胞、新生儿(幼仔)的体细胞和成熟的健康或疾病性体细胞都包括在内，此外，初代培养细胞、继代细胞和株化细胞都包括在内。具体地，体细胞可例示例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)、(2)组织前体细胞、(3)血液细胞(外周血细胞、脐带血细胞等)、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰细胞(胰外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞等已分化的细胞等。
作为采集体细胞的来源的哺乳动物没有特别限定，优选为人。
含有神经嵴细胞的细胞群中，神经嵴细胞的比例可根据采集的组织、分化诱导条件的不同而有很大变化。本发明的纯化方法1的一个方式中，含有神经嵴细胞的细胞群中神经嵴细胞的比例例如可以为1～95％、1～90％、1～85％、1～80％、1～75％、1～70％、1～65％、1～60％、1～55％、1～50％、1～45％、1～40％、1～35％、1～30％、1～25％、1～20％、1～15％或1～10％，但不限于此。此外，另一方式中，含有神经嵴细胞的细胞群中神经嵴细胞的比例例如可以为25～95％、25～90％、25～85％、25～80％、25～75％、25～70％、25～65％、25～60％、25～55％、25～50％、25～45％、25～40％或25～35％，但不限于此。此外，另一方式中，含有神经嵴细胞的细胞群中神经嵴细胞的比例例如可以为50～95％、50～90％、50～85％、50～80％、50～75％、50～70％、50～65％或50～60％，但不限于此。此外，另一方式中，含有神经嵴细胞的细胞群中神经嵴细胞的比例例如可以为75～95％、75～90％或75～85％，但不限于此。
这里，本发明的纯化方法1中，“纯化”的意思是，将工序1中制备的含有神经嵴细胞的细胞群用于工序2，结果，细胞群中神经嵴细胞的比例比工序1中制备的时刻的比例高。一个方式中，通过本发明的纯化方法1纯化后的细胞群中神经嵴细胞的比例为90～100％、91～100％、92～100％、93～100％、94～100％、95～100％、96～100％、97～100％、98～100％、99～100％或100％，但不限于此。
本发明的纯化方法1的工序1中制备的含有神经嵴细胞的细胞群也可以根据需要用于力学分散处理、用胶原酶、胰蛋白酶等酶进行的分散处理和/或用EDTA等螯合剂进行的分散处理等，形成单细胞的状态。此外，使细胞群单细胞化时，出于抑制细胞死亡的目的，可以添加ROCK抑制剂。ROCK抑制剂只要能抑制Rho-激酶(ROCK)的功能即可，没有特别限制，可列举例如Y-27632、Fasudil/HA1077、H-1152、Wf-536和它们的衍生物等。此外，作为ROCK抑制剂，也可以使用其他公知的低分子化合物(例如参照美国专利申请公开第2005/0209261号、美国专利申请公开第2005/0192304号、美国专利申请公开第2004/0014755号、美国专利申请公开第2004/0002508号、美国专利申请公开第2004/0002507号、美国专利申请公开第2003/0125344号、美国专利申请公开第2003/0087919号和国际公开第2003/062227号、国际公开第2003/059913号、国际公开第2003/062225号、国际公开第2002/076976号、国际公开第2004/039796号)。
工序1中制备的细胞群可以在经神经嵴细胞的分拣处理后用于工序2，优选不经神经嵴细胞的分拣处理而用于工序2。此外，作为神经嵴细胞的分拣处理，可列举例如利用使用荧光标记的CD271特异性抗体的细胞分选仪进行的分拣、利用结合有CD271特异性抗体的磁珠进行的分拣和利用CD271特异性抗体固化的亲和柱进行的分拣等分拣处理，但不限于此。
本发明的纯化方法1的工序2中，将工序1中得到的细胞群用于扩大培养。此外，本说明书中的“扩大培养”的概念包括使期望的细胞维持和/或增殖的培养，可优选为使期望的细胞增殖的培养。
本发明的纯化方法1中，目的是神经嵴细胞的纯化，因而作为培养条件，可使用适合神经嵴细胞的维持和/或增殖的条件。
就用于对神经嵴细胞进行扩大培养的培养条件而言，只要神经嵴细胞可扩大培养即可，没有特别限制，可以使用本身公知的培养条件。作为一例，可例示在含有TGFβ抑制剂、EGF(epidermal growth factor；表皮生长因子)和FGF2(fibroblast growth factor 2；成纤维细胞生长因子2)的培养液中培养的方法。
神经嵴细胞的扩大培养中使用的培养基可以以动物细胞培养中使用的培养基为基础培养基进行制备。作为基础培养基，例如包括IMDM培养基、Medium199培养基、Eagle'sMinimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modified Eagle'sMedium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、StemPro34(invi trogen)、RPMI-base medium、StemFit(注册商标)AK03N培养基和它们的混合培养基等。本工序中，优选使用StemFit(注册商标)AK03N培养基。培养基中可以含有血清，或者也可以无血清。根据需要，培养基例如可以含有白蛋白、转铁蛋白、Knockout SerumReplacement(KSR)(ES细胞培养时的FBS血清替代物)、N2添加剂(Invitrogen)、B27添加剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇(2ME)、硫代甘油等中1种以上的血清替代物，也可含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等中1种以上的物质。
本发明中，TGFβ抑制剂是抑制TGFβ与受体的结合而继续向SMAD进行信号传导的物质，是抑制与作为受体的ALK家族的结合的物质、或抑制ALK家族进行的SMAD磷酸化的物质即可，没有特别限制。本发明中，TGFβ抑制剂例如可例示Lefty-1(作为NCBI登录号，可例示小鼠：NM_010094、人：NM_020997)、SB431542、SB202190(以上R.K.Lindemann等，Mol.Cancer，2003，2:20)、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO2009/146408)和它们的衍生物等。神经嵴细胞的扩大培养中使用的TGFβ抑制剂可优选为SB431542。
培养液中SB431542等TGFβ抑制剂的浓度只要是抑制ALK5的浓度即可，没有特别限制，优选为1nM～50μM，例如为1nM、10nM、50nM、100nM、500nM、750nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、40μM、50μM，但不限于此。更优选为10μM。
此外，培养基中的EGF浓度优选为1ng/ml～100ng/ml，例如为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml，但不限于此。更优选为20ng/ml。
此外，培养基中的FGF2浓度优选为1ng/ml～100ng/ml，例如为1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml，但不限于此。更优选为20ng/ml。
此外，培养基中还可以添加除了上述成分以外的成分，只要可实现神经嵴细胞的扩大培养即可。
工序2中神经嵴细胞的扩大培养是黏附培养和悬浮培养中任一种均可，优选通过黏附培养来进行。
本发明的纯化方法1的特征在于，为了实现神经嵴细胞的纯化而使用层粘连蛋白211。
层粘连蛋白是作为基底膜的主要构成分子的糖蛋白。已知层粘连蛋白与细胞黏附、细胞增殖、转移、分化等各种细胞功能相关。层粘连蛋白是由具有α、β和γ亚基链各一条的异源三聚体构成的。目前已知存在5种α亚基链(α1、α2、α3、α4、α5)、3种β亚基链(β1、β2、β3)和3种γ亚基链(γ1、γ2、γ3)，通过这些亚基链的组合，目前在人中确认到15种层粘连蛋白同源异构体的存在。本发明的纯化方法中使用的层粘连蛋白211是由亚基链α2链、β1链、γ1链构成的层粘连蛋白。层粘连蛋白的来源优选与神经嵴细胞的来源生物一致(例如，使用人来源的神经嵴细胞的情况下，优选使用人来源的层粘连蛋白211)。此外，关于层粘连蛋白，已知仅由整联蛋白结合位点构成的层粘连蛋白E8片段比全长层粘连蛋白的细胞黏附活性更强(参照Miyazaki T.等，Nat Commun.2012；3:1236)，但本发明的纯化方法中使用的层粘连蛋白211不是片段而是层粘连蛋白211全长蛋白。层粘连蛋白211可以使用本身公知的基因重组技术来制备，也可以使用市售产品。
工序2中，在悬浮培养中对细胞群进行扩大培养的情况下，可以将层粘连蛋白211添加在培养基中，以能够使悬浮的细胞以此为支架。悬浮培养可以通过本身公知的方法来实施。作为一例，可列举使用旋转瓶等一边对培养基进行搅拌一边在悬浮培养中在添加有层粘连蛋白211的培养基中对细胞群进行扩大培养的方法。或者，也可以通过将具有通过添加在培养基中而使细胞悬浮的效果的多糖类(例如甲基纤维素、黄原胶、结冷胶等)与层粘连蛋白211并用，在悬浮培养中对细胞群进行扩大培养。添加层粘连蛋白的浓度等可以在考虑细胞群的接种密度、并用的多糖类浓度等各种条件的基础上适当设定。此外，本说明书中，悬浮培养的意思是，以细胞不在培养容器表面进行细胞黏附的方式进行的培养方法。悬浮培养可以伴随物理搅拌，也可以不伴随物理搅拌。此外，培养的细胞可以在培养基中均匀分散，也可以不均匀分散。
工序2中，在黏附培养中对细胞群进行扩大培养的情况下，用层粘连蛋白211包被培养容器表面。层粘连蛋白211的包被量只要可获得本发明的期望的效果即可，没有特别限制，可以使用通常推荐的包被量。作为一例，层粘连蛋白211的包被量为0.1ng/cm2～1000ng/cm2，优选为0.5ng/cm2～500ng/cm2，更优选为1ng/cm2～250ng/cm2，进一步优选为2ng/cm2～100ng/cm2，但不限于此。
此外，工序2中的培养时间可根据培养条件、培养方法、细胞群所含神经嵴细胞的比例等的不同而变动，可在较短时间内实现神经嵴细胞的纯化。作为培养时间的一例，为1～21天、1～20天、1～19天、1～18天、1～17天、1～16天、1～15天、1～14天、1～13天、1～12天、1～11天、1～10天、1～9天、1～8天、1～7天、1～6天、1～5天、1～4天或1～3天，但不限于此。
作为工序2中的培养温度，只要能够培养神经嵴细胞即可，没有特别限制，为30～40℃，优选约为37℃。此外，作为工序2中培养时的CO2浓度，只要能够培养神经嵴细胞即可，没有特别限制，为2～5％，优选约为5％。
2.神经嵴细胞的生产方法
本发明还提供一种生产纯化的神经嵴细胞的方法(以下有时称为“本发明的生产方法1”)，包括以下工序：
工序1)制备含有神经嵴细胞的细胞群的工序、和工序2)使用层粘连蛋白211作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
本发明生产方法中的各种条件与本发明的纯化方法1是同样的。
3.角膜上皮细胞的纯化方法
本发明提供一种纯化角膜上皮细胞的方法(以下有时称为“本发明的纯化方法2”)，包括以下工序：
工序1)得到角膜上皮细胞的比例为25％以上的细胞群的工序、和工序2)使用层粘连蛋白332作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
“角膜上皮细胞(corneal epithelial cell，也被称为“CEC”)是构成角膜最外侧的角膜上皮层的细胞。角膜上皮细胞来源于表皮外胚层。本说明书中的术语“角膜上皮细胞”不仅包括从生物体采集的细胞，而且包括多能干细胞来源的角膜上皮细胞、对其进行继代而得的细胞。此外，本发明的纯化方法2中，角膜上皮细胞的来源没有特别限制，可以是任何脊椎动物的细胞，优选为哺乳动物来源的角膜上皮细胞。作为该哺乳动物，可列举小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、猫、狗、绵羊、猪、牛、马、山羊、猴和人，但不限于此。
此外，本说明书中的术语“角膜上皮细胞”是可包括角膜上皮干细胞和/或角膜上皮前体细胞的概念。
作为本发明的纯化方法2的工序1中制备含有角膜上皮细胞的细胞群的方法，是生物体来源的含有角膜上皮细胞的细胞群的情况下，可以通过从角膜上皮层采集细胞群来制备。此外，是含有多能干细胞来源的角膜上皮细胞的细胞群的情况下，如上所述，可采用公知的制备方法。作为一例，可例示例如本申请实施例中给出的方法、在基质细胞或羊膜来源因子的存在下在一定时间内用不含BMP的无血清培养基对多能干细胞进行培养的方法。通过这些方法，多能干细胞(例如iPS细胞)向SEAM分化。SEAM可含有角膜上皮细胞。
由此得到的细胞群中是否含有角膜上皮细胞可以通过本身公知的方法确认PAX-6、Cytokeratin 12或Cytokeratin 3等角膜上皮细胞特异性标记基因中1个以上的表达。本发明的纯化方法2中使用的含有角膜上皮细胞的细胞群优选来源于多能干细胞，更优选来源于iPS细胞。此外，本发明中的“多能干细胞”如上所述。
含有角膜上皮细胞的细胞群可由于采集的组织、分化诱导条件的不同而角膜上皮细胞的比例大幅变化。本发明的纯化方法2的一个方式中，含有角膜上皮细胞的细胞群中角膜上皮细胞的比例例如可以为1～95％、1～90％、1～85％、1～80％、1～75％、1～70％、1～65％、1～60％、1～55％、1～50％、1～45％、1～40％、1～35％、1～30％、1～25％、1～20％、1～15％或1～10％，但不限于此。此外，另一方式中，含有角膜上皮细胞的细胞群中角膜上皮细胞的比例例如可以为25～95％、25～90％、25～85％、25～80％、25～75％、25～70％、25～65％、25～60％、25～55％、25～50％、25～45％、25～40％或25～35％，但不限于此。此外，另一方式中，含有角膜上皮细胞的细胞群中角膜上皮细胞的比例例如可以为50～95％、50～90％、50～85％、50～80％、50～75％、50～70％、50～65％或50～60％，但不限于此。此外，另一方式中，含有角膜上皮细胞的细胞群中角膜上皮细胞的比例例如可以为75～95％、75～90％或75～85％，但不限于此。
角膜上皮细胞的比例小于25％的细胞群可以通过进行角膜上皮细胞的分拣处理使其角膜上皮细胞的比例为25％以上。角膜上皮细胞的分拣处理可以通过本身公知的方法来进行。作为一例，可列举对在角膜上皮细胞的表面特异性表达的标记进行确认、选择表达该标记的细胞的方法，但不限于此。
本发明的纯化方法2中，通过以层粘连蛋白332为支架对角膜上皮细胞的比例为25％以上的细胞群进行扩大培养，能够对角膜上皮细胞进行纯化。细胞群中角膜上皮细胞的比例通常为25％以上、优选为30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，但不限于此。
本发明的纯化方法2中，“纯化”的意思是，将工序1中制备的含有角膜上皮细胞的细胞群用于工序2，结果，细胞群中角膜上皮细胞的比例比工序1中制备的时刻的比例高。一个方式中，通过本发明的纯化方法2纯化后的细胞群中角膜上皮细胞的比例为90～100％、91～100％、92～100％、93～100％、94～100％、95～100％、96～100％、97～100％、98～100％、99～100％或100％，但不限于此。
本发明的纯化方法2的工序1中制备的含有角膜上皮细胞的细胞群可以根据需要用于力学分散处理、用胶原酶、胰蛋白酶等酶进行的分散处理、和/或用EDTA等螯合剂进行的分散处理等，制成单细胞的状态。此外，在使细胞群单细胞化时，可以出于抑制细胞死亡的目的而添加ROCK抑制剂。ROCK抑制剂如上所述。
工序1中制备的细胞群可以在用于角膜上皮细胞的分拣处理后再用于工序2，优选不经角膜上皮细胞的分拣处理用于工序2。
本发明的纯化方法2的工序2中，将工序1中得到的细胞群用于扩大培养。此外，本说明书中，“扩大培养”的意思如上所述。
本发明的纯化方法2中，目的是角膜上皮细胞的纯化，因而作为培养条件，可使用适合角膜上皮细胞的维持和/或增殖的条件。
用于对角膜上皮细胞进行扩大培养的培养条件只要可扩大培养角膜上皮细胞即可，没有特别限制，可以使用本身公知的培养条件。作为一例，可例示在含有KGF(Keratinocyte growth factor；角质细胞生长因子)和Rho激酶抑制剂的培养液中培养的方法。
角膜上皮细胞的扩大培养中使用的培养基可以以动物细胞的培养中使用的培养基为基础培养基进行制备。作为基础培养基，例如包括IMDM培养基、Medium199培养基、Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM)培养基、αMEM培养基、Dulbecco's modifiedEagle's Medium(DMEM)培养基、Ham's F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer's培养基、StemPro34(invitrogen)、RPMI-base medium、StemFit(注册商标)AK03N培养基和它们的混合培养基等。本工序中，优选使用StemFit(注册商标)AK03N培养基。培养基中可以含有血清，或者也可以无血清。根据需要，培养基例如可以含有白蛋白、转铁蛋白、Knockout SerumReplacement(KSR)(ES细胞培养时的FBS血清替代物)、N2添加剂(Invitrogen)、B27添加剂(Invitrogen)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇(2ME)、硫代甘油等中1种以上的血清替代物，也可以含有脂质、氨基酸、L-谷氨酰胺、Glutamax(Invitrogen)、非必需氨基酸、维生素、增殖因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等中1种以上的物质。
培养液中的KGF浓度只要是可使角膜上皮细胞增殖的浓度即可，没有特别限制，优选为0.1～200ng/mL，例如为0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL、200ng/mL，但不限于此。更优选为20ng/mL。
此外，只要可实现角膜上皮细胞的扩大培养，培养基中也可以添加除了上述成分以外的成分。
工序2中角膜上皮细胞的扩大培养是黏附培养和悬浮培养中任一种均可，优选通过黏附培养来进行。
本发明的纯化方法2的特征在于，为了实现角膜上皮细胞的纯化，使用层粘连蛋白332作为支架材料。
本发明的纯化方法2中使用的层粘连蛋白332不是片段而是层粘连蛋白332全长蛋白。层粘连蛋白332可以使用本身公知的基因重组技术来制备，也可以使用市售产品。
工序2中，在悬浮培养中对细胞群进行扩大培养时，可以将层粘连蛋白332添加在培养基中，以能够使悬浮的细胞以此为支架。悬浮培养的方法和条件如上所述。
工序2中，在黏附培养中对细胞群进行扩大培养时，用层粘连蛋白332包被培养容器表面。层粘连蛋白332的包被量只要可获得本发明期望的效果即可，没有特别限制，可以使用通常推荐的包被量。作为一例，层粘连蛋白332的包被量为0.01μg/cm2以上且小于0.5μg/cm2，优选为0.05μg/cm2以上且小于0.4μg/cm2，更优选为0.05μg/cm2以上且小于0.3μg/cm2，进一步优选为0.05μg/cm2以上且小于0.25μg/cm2，但不限于此。
此外，工序2中的培养时间可根据培养条件、培养方法、细胞群所含角膜上皮细胞的比例等的改变而变动，因此可以适当设定。作为培养时间的一例，为1～50天、1～40天、1～30天、1～20天、1～17天、1～16天、1～15天、1～14天、1～13天、1～12天、1～11天、1～10天、1～9天、1～8天、1～7天、1～6天、1～5天、1～4天或1～3天，但不限于此。
作为工序2中的培养温度，只要可培养角膜上皮细胞即可，没有特别限制，为30～40℃，优选约为37℃。此外，作为工序2中培养时的CO2浓度，只要可培养角膜上皮细胞即可，没有特别限制，为2～5％，优选约为5％。
4.角膜上皮细胞的生产方法
本发明还提供一种生产纯化的角膜上皮细胞的方法(以下有时称为“本发明的生产方法2”)，包括以下工序：
工序1)得到角膜上皮细胞的比例为25％以上的细胞群的工序、和工序2)使用层粘连蛋白332作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
本发明的生产方法2中各种条件与本发明的纯化方法2是同样的。
以下的实施例中，进一步具体地对本发明进行说明，但本发明不受这些例子的任何限制。
实施例
[试验例1]层粘连蛋白211对iPS细胞培养的支架功能的评价
(材料与方法)
iPS细胞株使用201B7(iPS portal)。将该细胞接种于用层粘连蛋白511-E8片段(iMatrix511、Nippi:0.26～6.58μg/cm2)或层粘连蛋白211(Biolamina:0.05～6.58μg/cm2)包被的24孔板，2300细胞/孔，在StemFit(注册商标)AK03N(味之素(株))培养基中，在37℃、5％CO2下培养5天，对细胞黏附和集落形成进行评价。此外，细胞黏附通过在培养第5天时在显微镜下进行观察来评价。此外，细胞增殖通过在培养第0天和第5天时在显微镜下进行观察、确定各时刻的集落形成、对它们进行比较来评价。将结果示于表1。
[表1]
Figure BDA0003350679560000171
如表1所示，使用层粘连蛋白511－E8片段作为支架时，不管包被量如何，均显示出良好的细胞黏附和集落形成。另一方面，使用层粘连蛋白211作为支架时，不管包被量如何，与阴性对象(non-coat)同样地，均未发现细胞黏附和集落形成。
[实施例1]由iPS细胞制作神经嵴细胞
(材料与方法)
1.由iPS细胞向神经嵴细胞的分化诱导
iPS细胞株使用201B7(iPS portal)。在用层粘连蛋白511-E8片段(iMatrix511，Nippi)包被的6孔板上接种iPS细胞，6500细胞/孔，在StemFit(注册商标)AK03N(味之素(株))培养基中，在37℃、5％CO2下培养5天。接下来，在StemFit AK03N(A液+B液)中添加有SB431542(Stemgent，Inc.，10μM)和CHIR99021(Wako，0.3μM(条件1)或0.9μM(条件2))的培养基中，在37℃、5％CO2下进行14天向神经嵴细胞的分化诱导。诱导结束时，使用FACS确定CD271蛋白高表达细胞的比例，从而算出神经嵴细胞的比例。而且，通过RT-PCR法研究神经嵴细胞标记的基因表达情况。此外，将RT-PCR法中使用的引物示于下文。
Figure BDA0003350679560000181
(使用βactin作为参考基因(Hs01101944_s1、4331182))
2.神经嵴细胞的选择性增殖
使用TrypLE Select(Thermo Fisher)使上述1.中制备的含有神经嵴细胞的细胞群(SEAM)单细胞化。将单细胞化的细胞群接种在用各种支架材料包被的6孔板上，在适合神经嵴细胞的扩大培养的培养条件下培养。更具体地，用在StemFit AK03N(A液+B液)中添加有SB431542(10μM)、Epithelium growth factor(Sigma Chemical、20ng/mL)和StemFitAK03N C液(味之素(株)，0.08％)的培养基，在37℃、5％CO2下培养9～10天。培养9～10天后，在汇合度约为90％的时刻，通过与上述1.同样的方法，确定用各支架材料培养的细胞群中神经嵴细胞的比例和神经嵴细胞基因标记的表达情况。
支架材料使用以下材料。
(1)层粘连蛋白511-E8片段(Nippi，31.3ng/cm2和312.5ng/cm2)
(2)层粘连蛋白211(Biolamina，6.3ng/cm2和62.5ng/cm2)
(3)Vitronectin(Life Technologies，31.3ng/cm2和312.5ng/cm2)
(4)Fibronectin(Sigma Chemical，1562.5ng/cm2和3125.0ng/cm2)
此外，(1)～(3)的各支架材料通过直接悬浮在培养基中而包被在6孔板表面上。(4)的支架材料通过溶解在1mL的PBS(-)中并添加在孔中、室温下静置1小时而包被在6孔板表面上。
将结果示于表2和3。
[表2]
Figure BDA0003350679560000191
[表3]
Figure BDA0003350679560000192
如表2所示，如果使用层粘连蛋白211作为支架对由iPS细胞分化的含有神经嵴细胞的细胞群进行扩大培养，则不管用于扩大培养的细胞群中神经嵴细胞的比例、层粘连蛋白211在培养容器表面的包被量如何，都能够使该细胞群的神经嵴细胞的比例显著提高。
[实施例2]细胞增殖试验
回收实施例1中通过使用各支架材料对分化诱导条件2的细胞群进行扩大培养(9天)得到的纯化的神经嵴细胞，再次接种在用各支架材料包被的6孔板上，在实施例1的纯化工序中所用培养条件下进一步培养5天。在培养5天后的时刻，使用TrypLE Select使细胞单细胞化，计测细胞数。将结果示于表4。
[表4]
Figure BDA0003350679560000201
如表4所示，使用层粘连蛋白211作为支架纯化的神经嵴细胞的细胞增殖活性良好。如上述表2所示，结合使用层粘连蛋白211作为支架纯化的神经嵴细胞具有非常高的纯度考虑，提示在高纯度神经嵴细胞的生产中，极为优选使用层粘连蛋白211扩大培养。
[试验例2]层粘连蛋白332对iPS细胞培养的支架功能的评价
(材料与方法)
将作为iPS细胞株的201B7(iPS portal)接种于包被了Laminin511-E8片段(iMatrix511，Nippi:0.05～5.00μg/cm2)或Laminin332(Biolamina：0.05～5.00μg/cm2)的12孔板，2500细胞/孔，培养5天，对细胞黏附和增殖进行评价。将接种第二天至培养第5天的细胞黏附和培养第5天的细胞增殖结果示于表5。
[表5]
Figure BDA0003350679560000211
如表5所示，Laminin511-E8片段中，不管以何种包被量，iPS细胞均黏附、增殖。而Laminin332中，以0.50μg/cm2以上的包被量，iPS细胞黏附、增殖。
[实施例3]由iPS细胞制作角膜上皮细胞
(材料与方法)
1.由iPS细胞诱导角膜上皮细胞
iPS细胞株使用201B7(iPS portal)。在用Laminin511-E8片段(iMatrix511，Nippi:0.25、0.50或5.00μg/cm2)或Laminin332(Biolamina:0.5或5.00μg/cm2)包被的12孔板上接种iPS细胞，2500细胞/孔，在StemFit(注册商标)AK03N培养基中，在37℃、5％CO2下培养5天。接下来，将培养基替换为在StemFit AK03N(A液+B液)中添加了SB431542(Stemgent，Inc.，10μM)和CHIR99021(Wako，0.6μM)的培养基，在37℃、5％CO2下进行15天角膜上皮细胞的分化诱导。关于角膜上皮细胞的分化诱导率，用FACS对作为角膜上皮细胞标记的PAX-6和Cytokeratin12蛋白表达细胞的比例进行评价。将诱导结束时得到的角膜上皮细胞的比例示于表6。
[表6]
Figure BDA0003350679560000221
2.角膜上皮细胞的选择性增殖
使用TrypLE Select(Thermo Fisher)使上述1.中制备的含有角膜上皮细胞的细胞群(SEAM)单细胞化。将单细胞化的细胞群接种在用0.06μg/cm2浓度的Laminin332包被的6孔板上，2×105细胞/孔，在适合角膜上皮细胞的扩大培养的培养条件下培养。更具体地，在StemFit AK03N(A液+B液)中添加了Keratinocyte growth factor(Peprotech，20ng/mL)和Y-27632(Wako，10μM)的培养基中，在37℃、5％CO2下培养。纯化培养1次继代时角膜上皮细胞的比例与上述1.同样地，通过利用FACS对作为角膜上皮细胞标记的PAX-6和Cytokeratin12蛋白表达细胞的比例进行评价来确定。将结果示于表7。
[表7]
Figure BDA0003350679560000231
纯化培养1次继代时，诱导结束时的PAX-6和Cytokeratin12阳性细胞(即CEC)的比例小于25％的条件下，细胞未充分生长。但诱导结束时的PAX-6和Cytokeratin12阳性细胞比例为25％以上的条件下，全部条件下PAX-6和Cytokeratin12阳性细胞比例均提高。
产业可利用性
根据本发明，能够简便地且在非常短的时间内由含有神经嵴细胞的细胞群纯化神经嵴细胞。此外，根据本发明，能够简便地且在非常短的时间内生产高纯度神经嵴细胞。进一步，根据本发明，能够简便地由含有角膜上皮细胞的细胞群纯化角膜上皮细胞。此外，根据本发明，能够简便地生产高纯度角膜上皮细胞。因此，本发明例如在再生医疗领域中是极为有用的。
本申请以在日本提交的特愿2019－091988(申请日：2019年5月15日)和特愿2019－186280(申请日：2019年10月9日)为基础，其内容全部包括在本说明书中。

Claims (20)

1.一种纯化神经嵴细胞的方法，包括以下工序：
工序1)获得含有神经嵴细胞的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白211作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有神经嵴细胞的细胞群不经神经嵴细胞的分拣处理而用于工序2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，工序2的培养时间为1～21天。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，含有神经嵴细胞的细胞群来源于多能干细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，多能干细胞为iPS细胞。
6.一种生产经纯化的神经嵴细胞的方法，包括以下工序：
工序1)获得含有神经嵴细胞的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白211作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有神经嵴细胞的细胞群不经神经嵴细胞的分拣处理而用于工序2。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，工序2的培养时间为1～21天。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其中，含有神经嵴细胞的细胞群来源于多能干细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，多能干细胞为iPS细胞。
11.一种纯化角膜上皮细胞的方法，包括以下工序：
工序1)得到角膜上皮细胞的比例为25％以上的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白332作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有角膜上皮细胞的细胞群不经角膜上皮细胞的分拣处理而用于工序2。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，工序2的扩大培养中，作为支架使用的层粘连蛋白332的包被量为0.01μg/cm2以上且小于0.5μg/cm2。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的方法，其中，含有角膜上皮细胞的细胞群来源于多能干细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，多能干细胞为iPS细胞。
16.一种生产经纯化的角膜上皮细胞的方法，包括以下工序：
工序1)得到角膜上皮细胞的比例为25％以上的细胞群的工序，和
工序2)使用层粘连蛋白332作为支架对工序1中得到的细胞群进行扩大培养的工序。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，工序1中得到的含有角膜上皮细胞的细胞群不经角膜上皮细胞的分拣处理而用于工序2。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其中，工序2的扩大培养中，作为支架使用的层粘连蛋白332的包被量为0.01μg/cm2以上且小于0.5μg/cm2。
19.根据权利要求16～18中任一项所述的方法，其中，含有角膜上皮细胞的细胞群来源于多能干细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，多能干细胞为iPS细胞。
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