CN117431209A - 通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法及作为骨关节炎药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法及作为骨关节炎药物的应用，涉及技术领域生物医药技术领域，方法包括：S1：人多能干细胞诱导形成神经嵴细胞；向人多能干细胞中加入特异性神经嵴细胞诱导分化培养基培养，并向特异性神经嵴细胞诱导分化培养基中加入YAP激活剂；S2：神经嵴细胞扩增培养；S3：扩增培养后的神经嵴细胞向间充质干细胞分化。本发明的间充质干细胞表达CD90、CD73和CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA‑DR。本发明的神经嵴细胞表达P75、SOX10和AP2，不表达PAX6和SOX1。本发明还公开了通过神经嵴细胞系制备的间充质干细胞作为骨关节炎药物的应用。
Description
技术领域
本发明属于干细胞生物学领域，涉及人诱导多能干细胞的谱系特异性分化，具体涉及一种通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法和药物应用。
背景技术
骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退化、滑膜炎、软骨下骨硬化和骨赘形成为特征的慢性退行性疾病。世界范围内，有15%的人口患有OA；伴随着老龄化和肥胖化的发生，65岁以上人群中有80%会罹患OA；由于关节软骨无血管、无神经和无淋巴，一旦发生OA，很难自行愈合，通常带来严重的疼痛感和活动能力限制，继而影响患者的生活质量和加重经济负担。在对OA的临床治疗中，早期预防主要采用适度运动、外用非甾体抗炎药、口服对乙酰氨基酚和关节内注射皮质类固醇或透明质酸，这些方法在预防OA晚期进展方面效果有限；而晚期治疗时除了传统的骨髓刺激法、骨软骨移植等方法之外，采用细胞（包括软骨细胞和间充质干细胞MSCs）治疗的方法也进入了临床应用视野。其中，MSCs因其具备独特的免疫调节功能和软骨分化潜力，近年来已受到领域内研究者和生物医药科技公司的广泛关注。
MSCs是一种专能干细胞，具有自我更新的能力和分化为骨、软骨和脂肪等成体组织细胞的潜能。MSCs最初发现于骨髓，随后在人体和动物体的羊膜、脂肪、脐带、胎盘、牙髓等组织中均有发现。因其具有独特的抗炎特性、免疫调节功能和分化成成体细胞的能力，在细胞治疗和组织再生等领域具有广泛的应用前景。但是，使用自体或异体来源的原代MSCs普遍存在一些问题：1）取材难度大，且提取的细胞数量有限；2）MSCs的扩增能力和分化潜力有限；3）MSCs制备过程不易质控（个体间和组织间均存在非常大的差异，无法预知）。这些缺点使得MSCs无法成为一种标准化和规模化的生产产品，很大程度的限制了MSCs治疗的稳定性和应用性。
因此，为了实现MSCs在临床上的应用，迫切需要解决MSCs的来源问题。除了在体提取（成体）MSCs外，使用多能干细胞（PSCs）诱导分化获得i-MSCs也是MSCs的重要来源。在体内，MSCs的发育来源途径主要包括发育早期的中胚层细胞系和外胚层神经嵴细胞（NCCs）系分化而来。为此，大量的研究仿生MSCs的发育途径，在体外将PSCs经中胚层细胞系或神经嵴细胞系逐步诱导分化得到MSCs。其中，经过神经嵴细胞系得到MSCs因获得的神经嵴细胞系具有自我更新能力和多潜能性（表型稳定），且最终诱导分化得到的MSC成软骨分化能力强，更易得到透明软骨表型的软骨细胞，而更加适宜于骨关节炎的治疗和软骨损伤的修复。
当前，基于神经嵴细胞系诱导PSCs分化得到MSCs过程的研究主要涉及关键的两步诱导培养，包括PSCs诱导分化成NCCs和NCCs诱导分化成MSCs。其中，PSCs诱导分化成NCCs细胞系的过程主要涉及到SMAD信号通路（抑制）和WNT信号通路（激活）的调控，通过当前的调控策略获得的NCCs往往纯度不高，需要经过流式细胞仪进行分选。
综上所述，虽然很多研究者已经研发出不少从hPSCs在体外分化成MSCs的方法，但现有的方法仍然不够成熟，比如需要使用血清等非特异性、随机性的成分将PSCs诱导成MSCs，还需要使用流式等技术筛选才能获得高纯度的细胞，因而分化效果不稳定、效率低、且时间长等问题；另外经由中胚层细胞系分化路径获得的MSCs则由于中胚层细胞系不易于存储，使得细胞最终产率较低，而经由神经嵴细胞系路径获得的MSCs由于神经嵴细胞自身的可扩增性和可存储性使得整个细胞生产过程可获得大量的二级细胞用于存储。
发明内容
本发明提供了一种从人多能干细胞（hPSCs）分化为MSCs的方法以及骨关节炎应用，
具体的，本发明采取的技术方案是：
本发明第一个方面提供了通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，包含以下步骤：
S1：人多能干细胞诱导形成神经嵴细胞：向人多能干细胞加入特异性神经嵴细胞诱导分化培养基培养，并向特异性神经嵴细胞诱导分化培养基中加入YAP激活剂；其中所述人多能干细胞为商业化人胚胎干细胞系或人诱导型多能干细胞；
S2：扩增培养该神经嵴细胞；
S3：扩增培养后的该神经嵴细胞向该间充质干细胞分化。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述间充质干细胞表达CD90、CD73和CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述间充质干细胞由表达P75和SOX10而不表达PAX6的神经嵴细胞诱导分化获得。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述S3之后还包括S4：将间充质干细胞扩增培养。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述S4之后还包括S5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述S1之前还包括步骤S0：人多能干细胞的培养。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述S1步骤为：将人多能干细胞的上清液吸除，加入所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基培养10天，并向所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基中依次加入如下信号通路调节剂：浓度为100nM-1μM 的BMP抑制剂0-2天，浓度为2μM-20μM 的Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一0-3天，浓度为1μM-5μM 的GSK-3抑制剂3-6天和浓度为2μM-20μM 的YAP激活剂6-10天；
所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基由以下成分组成：DMEM/F12培养基、浓度为64mg/L的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/L的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/L的转铁蛋白、浓度为543mg/L的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/L的胰岛素、浓度为100μg/L的成纤维生长因子2、浓度为2μg/L的转录生长因子β-3。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述步骤S2为：
将所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基吸除，加入神经嵴细胞扩增培养基进行扩增培养7天，并向扩增培养基中添加浓度为2-20ng/mL的bFGF、浓度为5-50ng/mL的EGF和浓度为2μM-20μM的如下三种抑制剂之一：Activin、Nodal和TGFb；在此期间神经嵴细胞使用冻存液进行冻存；
所述的神经嵴细胞扩增培养基由以下成分组成: DMEM/F12培养基、浓度为64mg/L的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/L的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/L的转铁蛋白、浓度为543mg/L的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/L的胰岛素、浓度为100μg/L的成纤维生长因子2、浓度为2μg/L的转录生长因子β-3；所述的冻存液包含二甲基亚砜和血清白蛋白。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，所述步骤S3为：
将神经嵴细胞扩增培养基吸除，加入特异性间充质干细胞分化培养基重悬，贴壁培养7天，诱导分化成间充质干细胞；
所述的特异性间充质干细胞分化培养基由以下成分组成：最小必须培养 ，5% 血清替代物，5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和 1% 抗生素。
如上所述通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法所获得的间充质干细胞作为骨关节炎药物的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：虽然很多研究者已经研发出不少从hPSCs在体外分化为MSCs的方法，但现有的方法还是不够成熟，比如需要使用血清等非特异性、随机性的成分将PSCs诱导成间充质干细胞，需要使用流式等技术筛选才能获得高纯度的细胞，因而分化效果不稳定、效率低、且时间长等问题；另外经由中胚层细胞系分化路径获得的MSCs由于中胚层细胞系不易于存储，使得细胞最终产率较低，而本发明制备细胞的方法分化途径明确，分化效率高，分化效果稳定；本发明的制备方法未使用含血清的培养体系和滋养层细胞，获得的细胞纯度高、数量大，且细胞可采用多级存储方式，因此适用于后续临床级细胞制剂的生产和应用；本发明解决了以下问题：
1）传统分化途径获得的MSCs效果不稳定、纯度低且产率低的问题；
2）传统分化途径获得的中间细胞系难以存储的问题；
3）传统分化途径获得的终细胞MSCs成软骨分化能力不足的问题；
4）经由神经嵴细胞系路径、在分化路径中增添调控Hippo/YAP机械传导信号通路的激活剂，由此获得的MSCs由于神经嵴细胞自身的可扩增性和可存储性使得整个细胞生产过程可获得大量的二级细胞存储。
附图说明
图1显示了本发明的一个实施案例的技术方案流程图。
图2显示了hiPSCs的多潜能性验证。
（A）hiPSCs多潜能蛋白表达情况（标尺200μm）；
（B）hiPSCs多潜能标志物经流式检测后的阳性表达百分比；
（C）hiPSCs在体外向内胚层、中胚层和外胚层诱导后的免疫荧光染色图片（标尺200μm）。
图3显示了采用RT-PCR对神经嵴细胞标志基因P75、SOX10和PAX6在第6天和第10天的表达情况（***p< 0.001）。
图4显示了BMP抑制剂对诱导分化形成神经嵴细胞标志物SOX10的影响（***p<0.001）。
图5显示了TGFb抑制剂对诱导分化形成神经嵴细胞标志物SOX10的影响（***p<0.001）。
图6显示了GSK-3抑制剂对诱导分化形成神经嵴细胞标志物SOX10的影响（***p<0.001）。
图7显示了YAP激活剂对诱导分化形成神经嵴细胞标志物SOX10的影响（***p<0.001）。
图8采用流式细胞仪检测i-MSCs的CD90+、CD73+、CD105+、CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-表型所占的比例。
图9显示了i-MSCs向成骨、软骨和脂肪分化的能力（标尺200μm）。
图10分别显示i-MSCs和脐带间充质干细胞（UC-MSCs）对T细胞增殖的抑制能力。
图11显示i-MSCs和UC-MSCs对大鼠骨关节炎的再生修复功效的比。
（A）注射1周后滑膜炎症评分（**p< 0.05）；
（B）注射4周后生成的糖胺聚糖合成量（**p< 0.05）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
下面结合附图和实施案例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施案例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中制备适应于骨关节炎使用的间充质干细胞i-MSCs的方法的流程图如图1所示，具体的，操作如下：
一、D-3 – D0：人多能干细胞的培养
将聚合度达到70-80%的未分化的人多能干细胞用细胞消化液消化成完全的单细
胞，以0.1-10104 cells/cm2重悬于3mL的多能干细胞维持培养基中，并接种在蛋白包被
的孔板上，置于37 °C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
细胞消化液可以使用Accutase（Thermo Fisher）或TrypLE（Thermo Fisher）或其他。
蛋白可以使用iMatrix（Thermo Fisher）或Vitronectin（Thermo Fisher）。
D-3 – D0实验操作细节及优化:
具体操作为：实验中所用的人多能干细胞经过严格的多能性验证（表达各种多能性标志物，并可在体外诱导分化成内、中和外胚层）。人多能干细胞在其维持培养基中正常培养，所用的培养基为Essential 8培养基（Gibco）或TeSR培养基（Stem cell）或其它类似培养基，所述的维持培养基由以下成分组成：DMEM/F12培养基（DMEM/F12）、左旋抗坏血酸（L-Ascorbic Acid,64mg/L）、亚硒酸钠（Sodium selenium,14μg/L）、转铁蛋白（Transferrin,10.7mg/L）、碳酸氢钠(Sodium bicarbonate,543mg/L)、胰岛素(Insulin,19.4mg/L)、成纤维生长因子2(FGF2,100μg/L)、转录生长因子β-3(TGF-b3,2μg/L)。
按上述方法培养人多能干细胞至70-80%聚合度时，使用Accutase或TrypLE消化成
完全的单细胞，以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加
入Rock抑制剂。将细胞悬液接种在iMatrix或Vitronectin包被的孔板上，置于37 °C，5%CO2
浓度，饱和湿度的培养箱内培养，每天换液。Rock抑制剂可以是Y-27632（R&D），浓度可以为
5-20μM；细胞密度可以为0.1-10104cells/cm2。
二、D0-10：人多能干细胞向神经嵴细胞分化
当状态良好未分化的人多能干细胞培养至汇合度70-80%的时候，将其维持培养基吸出，加入神经嵴细胞诱导培养基，并按照预先设计好的时间点依次向培养基中加入BMP抑制剂（0-2天）、Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一（0-3天）、GSK-3抑制剂（3-6天）和YAP激活剂（6-10天）。继续于37 °C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D0-D10实验操作细节及优化：
具体操作为：当人诱导多能干细胞培养至汇合度70-80%时，将人多能干细胞维持
培养基吸去，用1PBS （w/o Ca2+/Mg2+）洗一遍，加入Accutase或TrypLE消化液，置于37 °
C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内孵育3-8分钟，轻轻摇晃使得细胞脱离培养板底部。将细
胞悬液转入15 mL离心管中，1000 rpm，5分钟离心。吸去上清液，加入1 mL新鲜的神经嵴细
胞诱导培养基重悬细胞，轻柔吹打1-2次，将细胞计数后接种于Fibronectin(Gibco)/
iMatrix包被的孔板中，接种密度为0.1-1104cells/cm2。加入新鲜的神经嵴细胞诱导培
养基。在培养的10天中，特异性的神经嵴细胞诱导培养基中0-2天添加BMP抑制剂，0-3天添
加Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一，3-6天添加GSK-3抑制剂，6-10天添加YAP激活剂。
每天更换新鲜培养基，培养基使用量为0.2-0.4mL/cm2。所述的神经嵴细胞诱导培养基由以
下成分组成：DMEM/F12培养基（DMEM/F12）、左旋抗坏血酸（L-Ascorbic Acid,64mg/L）、亚硒
酸钠（Sodium selenium,14μg/L）、转铁蛋白（Transferrin,10.7mg/L）、碳酸氢钠(Sodium
bicarbonate,543mg/L)、胰岛素(Insulin,19.4mg/L)、成纤维生长因子2(FGF2,100μg/L)、
转录生长因子β-3(TGF-b3,2μg/L)。
BMP抑制剂：抑制BMP信号通路的物质。可选择Noggin、LDN193189、Dorsomorphin等。本发明中使用的BMP抑制剂较佳为LDN193189。培养基中LDN193189(R&D)浓度没有特别限定，例如200nM，300nM，500nM，0.1μM，0.2μM，0.5μM，1μM，但不限于此。最佳为500nM。
Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一：抑制Activin、Nodal或TGFb信号通路的物质，可以选择SB431542、A83-01、LT580276等。本发明中使用的TGFb抑制剂较佳的为SB431542(R&D)。培养基中SB431542浓度没有特别限定，例如1μM，2μM，5μM，10μM，20μM，但不限于此。最佳为10μM。
GSK-3抑制剂：抑制GSK-3信号通路的物质。可以选择BIO、TWS119、CHIR99021。本发明中使用GSK-3抑制剂较佳为CHIR99021(R&D)。培养基中CHIR99021浓度没有特别限定，例如0.1μM，0.2μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM，5μM，10μM，但不限于此。最佳为3μM。
YAP激活剂：激活Hippo-YAP信号通路的物质。可以选择PY-60、GA-107和TT-10等。本发明中使用YAP激活剂为PY-60(Sigma)。培养基中PY-60浓度没有特别限定，例如1μM，2μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM，但不限于此。最佳为10μM。
D6和D10对所得的神经嵴细胞进行检测：
方法一：使用RT-PCR检测神经嵴细胞的指标以确定分化细胞的类型，证明所得的细胞为神经嵴细胞。其中P75、SOX10在D10明显高于D6，PAX6在D10明显低于D6。
方法二：使用免疫荧光染色检测神经嵴细胞的指标以确定分化细胞的类型，证明所得的细胞为神经嵴细胞。其中P75、SOX10在D10明显高于D6，PAX6在D10明显低于D6。
三、D10-D17: 神经嵴细胞的扩增培养
将上述D10的培养基吸除，加入新鲜的神经嵴细胞扩增培养基，并添加优化浓度的Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一、EGF和FGF，继续于37 °C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D10-D17实验操作细节及优化：
具体操作为：从培养箱中取出培养板，去除上清，加入新鲜的神经嵴细胞扩增培养基，并添加Activin、Nodal或TGFb信号通路抑制剂，EGF和bFGF。每天更换新鲜的培养基，培养基的使用量为0.2-0.4 mL/cm2。
Activin、Nodal或TGFb抑制剂：抑制Activin、Nodal或TGFb信号通路的物质，可以选择SB431542、A83-01、LT580276等。本发明中使用的Activin、Nodal或TGFb抑制剂较佳的为SB431542。培养基中SB431542浓度没有特别限定，例如1μM，2μM，5μM，10μM，20μM，50μM，100μM，但不限于此。最佳为10μM。
bFGF：本发明中bFGF的浓度没有特别限定，例如1ng/mL，2ng/mL，3ng/mL，4ng/mL，5ng/mL，6ng/mL，7ng/mL，8ng/mL，9ng/mL，10ng/mL，15ng/mL，20ng/mL，但不限于此。最佳为8ng/mL。
EGF：本发明中EGF的浓度没有特别限定，例如1ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，15ng/mL，20ng/mL，25ng/mL，30ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，但不限于此。最佳为20ng/mL。
四、D17-D24：神经嵴细胞向间充质干细胞分化
将上述D17的培养基吸除，加入新鲜的间充质干细胞分化培养基，继续于37°C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D17-D24实验操作细节及优化：
具体操作为：从培养箱中取出培养板，去除上清，加入新鲜的间充质干细胞分化培养基。每天更换新鲜的培养基，培养基的使用量为0.2-0.4mL/cm2。所述间充质干细胞培养基由以下成分组成：最小必须培养基（alpha-MEM ,aMEM)，5% 血清替代物（serumreplacement），5ng/mL碱性成纤维生长因子（bFGF）,和1% 抗生素（antibioticantimycotic）。
五、D24-D28：MSC的扩增培养
将上述D24的培养基吸除，加入新鲜的间充质干细胞维持培养基，继续于37°C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。
D24-D28实验操作细节及优化
具体操作为：从培养箱中取出培养板，去除上清，加入新鲜的间充质干细胞维持培养基。隔天更换新鲜的培养基，培养基的使用量为0.2-0.4mL/cm2。对MSCs进行传代培养至P3。
所得P3细胞进行检测：
方法一：使用流式细胞仪检测细胞表型，证明所得细胞的表型为：CD90+、CD73+、CD105+、CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-；其中三个阳性表面因子（CD90+、CD73+、CD105+）表达率达到96%以上，五个阴性表面因子（CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-）表达率低于2%。说明分化得到的MSCs纯度很高。
方法二：使用成骨、成软骨和成脂肪分化培养基诱导分化MSCs，证明所得细胞具有向成骨、成软骨和成脂肪分化的能力。
方法三：与T细胞共培养检测所得细胞具有免疫抑制能力。
此外，本发明还包括将神经嵴细胞冻存的步骤：可用于神经嵴细胞冻存液将神经嵴细胞冻存。
具体的，将培养基吸出，用1DPBS （w/o Ca2+/Mg2+）洗一遍，加入Accutase或
TrypLE消化液，置于37°C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内孵育5-10分钟，轻微晃动使得细
胞完全脱离培养皿底部。细胞悬液转入15mL离线管中，1000rpm，3分钟离心，吸去上清液，加
入1 mL神经嵴细胞冻存液，轻微吹打1-2次使细胞尽量分散成单细胞并计数，细胞数建议为
1-4106cells/管。
本发明神经嵴细胞冻存液的主要成分为DMSO和HAS。
冻存液中的DMSO浓度只要是能保护低温状态下神经嵴细胞的活率和分化效率没有特别的限定，例如为1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％、30％，但不限于此。优选浓度为10％。
冻存液中HSA浓度只要是能保护低温状态下运动神经前体细胞的活率和分化效率没有特别的限定，例如为1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、15％、20％、30％，但不限于此。优选浓度为10％。
在符合本领域常识的基础上，上述各优化条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明的关键点和欲保护点至少包括以下两点：
1）本发明关键的创新点在于所使用的小分子化合物的种类、浓度和加入时间等，使用分化更精准地控制人多能干细胞的分化方向，所得到的细胞纯度高，无需用流式筛选的方法来筛选细胞。
2）从多能干细胞分化为间充质干细胞的方法及分化/扩增培养基成分。
本发明的细胞分化路径是PSCs经神经嵴细胞系路径诱导分化得到i-MSCs，在分化路径中增添调控Hippo/YAP机械传导信号通路的激活剂，实现优化PSCs获得高质量的i-NCCs后，再获得高质量的i-MSCs，并应用于骨关节炎的治疗应用。神经嵴细胞具备很好的扩增能力和多潜能性，可作为二级细胞且最终获得的MSCs产量更大。在分化路径中增添调控Hippo/YAP机械传导信号通路的激活剂使得分化效率更高，得到的NCCs纯度更高，最终能得到纯度更高的MSCs。
实施例1：
通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，包含以下步骤：
S0：人多能干细胞的培养；
S1：人多能干细胞诱导形成神经嵴细胞；
S2：神经嵴细胞的扩增培养和储存；
S3：扩增培养后的神经嵴细胞向间充质干细胞分化。
具体的，流程图如图1所示，步骤如下：
（1）步骤S0：人多能干细胞培养（D-3—D0），第-3天至第0天：
所用的hPSCs经过严格的多能性验证：表达多能性标志物，并在免疫缺陷小鼠体内形成包含内胚层、中胚层和外胚层的畸胎瘤，具体数据见附图2。hPSCs在多能干细胞维持培养基中正常培养，所用的培养基为E8或TeSR或其它类似培养基。
待人多能干细胞培养至汇合度至70-80%时，使用Accutase或TrypLE消化成完全的
单细胞，以一定密度重悬于适量体积的多能干细胞维持培养基中，并向培养基中加入Rock
抑制剂。将细胞悬液接种在iMatrix或Vitronectin包被的孔板上，置于37 °C，5%CO2浓度，
饱和湿度的培养箱内培养3天，每天换液。Rock抑制剂可以是Y-27632，浓度可以为10μM；细
胞密度可以为0.1-10104cells/cm2。
（2）步骤S1：人多能干细胞诱导成神经嵴细胞（D0-D10），第0天至第10天：
当状态良好未分化的人诱导多能干细胞培养至汇合度70-80%的时候，将其维持培养基吸出，加入神经嵴细胞诱导培养基，并按照预先设计好的时间点依次向培养基中加入BMP抑制剂、Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一、GSK-3抑制剂和YAP激活剂。继续于37 °C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养10天。在这10天内，特异性的神经嵴细胞诱导培养基中0-2天添加BMP抑制剂，0-3天添加Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一，3-6天添加GSK-3抑制剂，6-10天添加YAP激活剂。每天更换新鲜培养基，培养基使用量为0.2-0.4 mL/cm2。BMP抑制剂是LDN193189，Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一是SB431542，GSK-3抑制剂是CHIR99021，YAP激活剂是PY-60。每天更换新鲜培养基，培养基使用量为0.2-0.4mL/cm2。
D6和D10对所得的神经嵴细胞进行检测：使用RT-PCR检测神经嵴细胞的指标以确定分化细胞的类型，证明所得的细胞为神经嵴细胞。具体数据见附图3。其中P75和SOX10在D10明显高于D6，PAX6在D10明显低于D6。抽提RNA所使用的试剂盒是RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒，厂家为TIANGEN，货号是DP430；逆转录所用试剂盒是HiScriptÒReverse Transcriptase，厂家为Vazymebiotech，货号为R101-01/02；RT-PCR所用试剂盒是TransStart Top GreenqPCR SuperMix，厂家为Transgen，货号为AQ131。
（3）步骤S2：神经嵴细胞的扩增培养（D10-D17），第10天至第17天：
将上述D10的培养基吸除，加入新鲜的神经嵴细胞扩增培养基，并添加优化浓度的Activin/Nodal/TGFb抑制剂、EGF和FGF，继续于37 °C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养7天扩增。在这7天的培养过程中，神经嵴细胞的扩增培养基中添加Nodal信号通路抑制剂、EGF和bFGF。Nodal信号通路抑制剂是SB431542。每天更换新鲜的培养基，培养基的使用量为0.2-0.4mL/cm2。
（4）步骤S3：神经嵴细胞向间充质干细胞分化（D17-D24），第17天至第24天：
将上述D17的培养基吸除，加入新鲜的间充质干细胞分化培养基，继续于37 °C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养7天。每天更换新鲜的培养基，培养基的使用量为0.2-0.4 mL/cm2。当细胞汇合度达到70-80%时，用胰酶消化成单细胞，即获得P0代的i-MSCs。所获得的细胞用胰酶消化成单细胞，计数传代扩增，可继续传代扩增培养。
（5）步骤S4：MSCs的扩增培养
将上述D24的培养基吸除，加入新鲜的间充质干细胞维持培养基，继续于37°C，5%CO2浓度，饱和湿度的培养箱内培养。隔天更换新鲜的培养基，培养基的使用量为0.2-0.4mL/cm2。对MSCs进行传代培养至P3。
实施例2：
本实施例研究不同的BMP抑制剂LDN193189的浓度对实验结果的影响。LDN193189的浓度分别设置为200nM，500nM和1μM。结果如图4所示，当LDN193189浓度为500 nM时，多能干细胞诱导分化行程的神经嵴细胞表达SOX10最高。
因此，在我们的人多能干细胞向神经嵴分化的0-2天的诱导分化时，LDN193189对神经嵴细胞的形成起很大的作用。
实施例3：
本实施例研究不同的Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一SB431542的浓度对实验结果的影响。SB431542的浓度分别设置为1μM，5μM，10μM，20μM。结果如图5所示，当SB431542的浓度设置为10μM时，多能干细胞诱导分化行程的神经嵴细胞表达SOX10最高。
因此，在我们的人多能干细胞向神经嵴分化的0-3天的诱导分化时，SB431542对神经嵴细胞的形成起很大的作用。
实施例4：
本实施例研究不同的GSK-3抑制剂CHIR99021的浓度对实验结果的影响。CHIR99021的浓度分别设置为1μM，2μM，3μM，5μM。结果如图6所示，当CHIR99021的浓度设置为3μM时，多能干细胞诱导分化形成的神经嵴细胞表达SOX10最高。
因此，在我们的人多能干细胞向神经嵴分化的3-6天的诱导分化时，SB431542对神经嵴细胞的形成起很大的作用。
实施例5：
本实施例研究不同的YAP激活剂PY-60的浓度对实验结果的影响。PY-60的浓度分别设置为0μM，2μM，5μM，10μM，20μM。结果如图7所示，当添加一定量的PY-60时，多能干细胞诱导分化形成的神经嵴细胞均能高表达SOX10。其中，当PY-60的浓度设置为10μM时，多能干细胞诱导分化行程的神经嵴细胞表达SOX10最高。
因此，在我们的人多能干细胞向神经嵴分化的6-10天的诱导分化时，PY-60对神经嵴细胞的形成起很大的作用。
实施例6：
对实施例1中的P3代i-MSCs进行检测：
方法一：使用流式细胞仪检测细胞表型，证明所得细胞的表型为：CD90+、CD73+、CD105+、CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-；其中三个阳性表面因子（CD90+、CD73+、CD105+）表达率达到96%以上，五个阴性表面因子（CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-）表达率低于2%。具体数据见附图8。说明分化得到的MSCs纯度很高。
具体步骤如下：
（1）每次传代时，取细胞1105cells/管，共九管（按照每个样品检测8管，加一管
空白对照）加入到1.5mL流式洗涤液，200g离心3min，弃上清。
（2）加100μL的流式buffer，轻轻悬浮细胞。
（3）分别标记细胞编号及以下抗体类型与管身，CD73 / CD90 / CD105 / CD45 /HLA-DR / CD34 / CD14，空白管不加试剂，其余各管分别按试剂使用要求加入适当体积的抗体，轻弹管壁混匀。
（4）4°C避光孵育20-30分钟。
（5）避光孵育结束后，加入1mL的流式洗涤液，200 g离心3分钟，弃上清，加入500μLFACS buffer混匀，待上机。图8显示本发明获得的i-MSCs的三个细胞表面因子（CD73 /CD90 / CD105）都显示阳性，五个表面因子（CD CD79a / CD45 /HLA-DR / CD34 / CD14）都显示阴性，从而说明本实施例获得的i-MSCs具有间充质干细胞的特性。
其中，流式的抗体信息如下：CD90-FITC，Abcam，ab25672；CD73-APC，Abcam，ab155378；CD105，Abcam，ab2529；CD14，Abcam，ab133503；CD34，Abcam，ab81289；CD45，Abcam，ab40763；CD79a，Abcam，ab187269；HLA-DR，Abcam，ab136320。
实施例7：
对实施例1中所得P3代间充质干细胞进行检测：
方法二：使用成骨、成软骨和成脂肪分化培养基分化细胞，证明所得细胞具有向骨、软骨和脂肪分化的能力，所得结果如图9所示。
具体实验步骤如下：
（1）成骨分化鉴定
a.按照合适的接种密度将所获得的i-MSCs接种到细胞培养板上，加入适量的已预热的新鲜的MSCs培养基；置于37 °C，5%CO2浓度，饱和适度培养箱的培养箱内培养。
b.i-MSCs均匀铺展生长，在培养汇合度达到80%左右后，将培养板上的培养基吸弃，开始更换为成骨诱导分户培养基，具体的所述成骨诱导分化培养的方法为：在含有10%FBS和1%GlutaMAX Supplement（GlutaMAX添加剂）的a-MEM培养基中添加Ascorbic Acid（L-抗坏血酸）、b-glycerophosphate（b-甘油磷酸钠）和Dexamethasone（地塞米松）培养21天，在光镜下观察。正常分化过程中，可以看到细胞会逐步变细长；
c．在21天后，成骨分化的i-MSCs使用纯水洗涤后，加入合适体积的茜素红（Alizarin red）染色液，避光孵育30分钟，然后吸除多余染液，每孔再加入适当体积的生理盐水或DPBS浸润，显微镜下观察，拍照。
（2）成软骨分化鉴定
a. 按照合适的接种密度将所获得的i-MSCs接种到细胞培养板上，加入适量的已预热的新鲜的MSCs培养基；置于37 °C，5%CO2浓度，饱和适度培养箱的培养箱内培养。
b. i-MSCs均匀铺展生长，在培养汇合度达到90%左右后，将培养板上的培养基吸
弃，开始更换为成软骨诱导分户培养基，具体的所述成骨诱导分化培养的方法为：在含有
10%FBS的DMEM高糖培养基中添加Ascorbic Acid（L-抗坏血酸）、Dexamethasone（地塞米松）
ITS+Primixtissueculturesupplements（ITS+Premix组织培养添加剂）、TGFb1等进行培养，
调节细胞密度为1106/mL；
c．取标记好的15mL离心管，每管分装装500μL细胞悬液(每管最终的细胞为0.5×106个)，旋松管盖后，再放入细胞培养箱中，每三天全换液一次，持续培养到28天。
d．在28天后，将细胞球切片后用阿尔辛蓝（Alcianblue）染色并拍照。
3）成脂肪分化鉴定
a.按照合适的接种密度将所获得的i-MSCs接种到细胞培养板上，加入适量的已预热的新鲜的MSCs培养基；置于37°C，5%CO2浓度，饱和适度培养箱的培养箱内培养。
b.i-MSCs均匀铺展生长，在培养汇合度达到90%左右后，将培养板上的培养基吸弃，开始更换为成脂肪诱导分户培养基，具体的所述成脂肪诱导分化培养的方法为：在含有10%FBS的DMEM高糖培养基中添加：IBMX、Dexamethasone和Indomethacin（吲哚美辛）培养21天，在光镜下观察。正常分化过程中，可以看到细胞会逐步变宽变短；
c．在21天后，成脂肪分化的i-MSCs使用纯水洗涤后，加入合适体积的油红O（OilRed O）染色液，避光孵育30分钟，然后吸除多余染液，每孔再加入适当体积的生理盐水或DPBS浸润，显微镜下观察，拍照。
实施案例8：
对实施例1中所得P3代间充质干细胞进行研究，发现其与T细胞共培养检测具有免疫抑制能力。本实施例中T细胞和脐带间充质干细胞（UC-MSCs）为商业化T细胞系和UC-MSCs细胞系。
具体步骤如下：
（1）培养UC-MSCs和实施例1获得的i-MSCs至汇合度达到90％以上，直接于旧培养基中添加5μg/mL丝裂霉素C，37 °C孵育2h。
（2）2h后吸弃旧培养基，用DPBS洗两遍，正常消化细胞(用Accutase消化3-5min)，200g离心3min收集细胞沉淀。
（3）去除上清后，适量加DPBS至细胞沉淀中，吹散细胞沉淀，取500μL细胞悬液于vi-cell细胞计数仪上计数。
（4）TPA（T Cell Proliferation Assay）培养基（RPMI+10％FBS+GlutaMAX）接种步骤3里计数的两组细胞浓度至5×105细胞/孔到六孔板，第二天待细胞贴壁后，继续下一步实验。
（5）将激活后4天的PBMC（用含CD3/CD28抗体、100IU/mL IL-2的T细胞培养基激活）转移至15mL离心管中，200g离心3min去除含蛋白成分的培养基，再加入5mL DPBS洗一遍，同时取细胞悬液，1:10稀释后取500μL于vi-cell细胞计数仪计数，离心收集细胞沉淀；
（6）用DPBS重悬PBMC至1-3×106个/mL，留取足够数量的PBMC做阴性对照，其余加入终浓度为5μM的CFSE，混匀后37 °C孵育10 min。
（7）加入等体积TPA medium终止CFSE反应（CFSE染色成功后PBMC沉淀应为亮黄色），200g离心3min弃去上清，加入10mL DPBS重悬细胞，取细胞悬液计数，离心收集细胞沉淀。
（8）用TPA medium重悬PBMC至2 .5×105/管细胞备用，染色后的各组细胞，按5×105细胞/孔的量在步骤4）接种MSCs的六孔板里接种与MSCs共培养，用TPA medium调整每孔终体积为4mL。
（9）共培养4天后，用荧光显微镜拍摄细胞照片，记录照片中的T细胞数量。图10显示单独培养T细胞扩增正常，但与UC-MSCs和本发明所获得的i-MSCs共培养的T细胞无法正常扩增，证明了这两种细胞具有免疫抑制作用，且i-MSCs具有和UC-MSCs相近的免疫抑制作用。
实施例9：
本实施例研究UC-MSCs和实施例1得到的i-MSCs对大鼠骨关节炎修复效果评估。具体包括以下步骤：
为评估实施例1所获得i-MSCs对于骨关节炎的修复功能性，与UC-MSCs进行修复功能对比实验。每只大鼠切除双侧卵巢，模拟雌激素缺乏导致的骨关节炎动物模型。然后用UC-MSCs（1×108/只）和实施例1获得的i-MSCs（1×108/只）关节腔注射法注射到大鼠骨关节腔内，分别在1和4周后解剖大鼠，检测大鼠关节腔内炎症情况和蛋白聚糖（GAG）的含量。图11显示UC-MSCs和实施案例1获得的i-MSCs都有抗炎症作用和促蛋白聚糖合成的功能，说明i-MSCs具有治疗骨关节炎的功效，且其能力与UC-MSCs相当。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (10)
1.通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于,包含以下步骤：
S1：人多能干细胞诱导形成神经嵴细胞：向人多能干细胞加入特异性神经嵴细胞诱导分化培养基培养，并向特异性神经嵴细胞诱导分化培养基中加入YAP激活剂；其中所述人多能干细胞为商业化人胚胎干细胞系或人诱导型多能干细胞；
S2：扩增培养该神经嵴细胞；
S3：扩增培养后的该神经嵴细胞向该间充质干细胞分化。
2.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞表达CD90、CD73和CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR。
3.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞由表达P75和SOX10而不表达PAX6的神经嵴细胞诱导分化获得。
4.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S3之后还包括S4：将间充质干细胞扩增培养。
5.根据权利要求4所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S4之后还包括S5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
6.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S1之前还包括步骤S0：人多能干细胞的培养。
7.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述S1步骤为：将人多能干细胞的上清液吸除，加入所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基培养10天，并向所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基中依次加入如下信号通路调节剂：浓度为100nM-1μM 的BMP抑制剂0-2天，浓度为2μM-20μM 的Activin、Nodal、TGFb三种抑制剂之一0-3天，浓度为1μM-5μM 的GSK-3抑制剂3-6天和浓度为2μM-20μM 的YAP激活剂6-10天；
所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基由以下成分组成：DMEM/F12培养基、浓度为64mg/L的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/L的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/L的转铁蛋白、浓度为543mg/L的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/L的胰岛素、浓度为100μg/L的成纤维生长因子2、浓度为2μg/L的转录生长因子β-3。
8.根据权利要求2所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S2为：
将所述特异性神经嵴细胞诱导分化培养基吸除，加入神经嵴细胞扩增培养基进行扩增培养7天，并向扩增培养基中添加浓度为2-20ng/mL的bFGF、浓度为5-50ng/mL的EGF和浓度为2μM-20μM的如下三种抑制剂之一：Activin、Nodal和TGFb；在此期间神经嵴细胞使用冻存液进行冻存；
所述的神经嵴细胞扩增培养基由以下成分组成: DMEM/F12培养基、浓度为64mg/L的左旋抗坏血酸、浓度为14μg/L的亚硒酸钠、浓度为10.7mg/L的转铁蛋白、浓度为543mg/L的碳酸氢钠、浓度为19.4mg/L的胰岛素、浓度为100μg/L的成纤维生长因子2、浓度为2μg/L的转录生长因子β-3；所述的冻存液包含二甲基亚砜和血清白蛋白。
9.根据权利要求1所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述步骤S3为：
将神经嵴细胞扩增培养基吸除，加入特异性间充质干细胞分化培养基重悬，贴壁培养7天，诱导分化成间充质干细胞；
所述的特异性间充质干细胞分化培养基由以下成分组成：最小必须培养 ，5% 血清替代物，5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和 1% 抗生素。
10.根据权利要求1至9中的任意一项所述的通过神经嵴细胞系制备间充质干细胞的方法所获得的间充质干细胞作为骨关节炎药物的应用。
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