CN110592007B - 一种间充质干细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种间充质干细胞及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于干细胞生物学领域，涉及人多能或多潜能干细胞的谱系特异性分化，具体涉及一种间充质干细胞及其制备方法和应用。所述制备间充质干细胞的方法，包括以下步骤：S1：人多能干细胞形成拟胚体；S2：拟胚体向中胚层细胞分化；S3：中胚层细胞向间充质干细胞分化。本发明的制备方法细胞分化途径明确，分化效率高，分化效果稳定，未使用含有血清的培养体系或滋养层细胞，获得的细胞群纯度高、数量大，因而适于后续临床级细胞制剂的生产和应用。

Description

一种间充质干细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于干细胞生物学领域，涉及人多能或多潜能干细胞的谱系特异性分化，具体涉及一种间充质干细胞及其制备方法和应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)大部分来源于发育早期的中胚层，具有自我更新的能力和分化为硬骨、软骨、脂肪等功能细胞的潜能，是一种专能干细胞。MSC最初发现于骨髓，除此之外，人体和动物体内的羊膜、脐带、脐血、胎盘、脂肪、牙髓等组织中均有MSC存在，其中脐带组织里的MSC含量最丰富，从脂肪组织也可获得大量MSC，骨髓组织MSC含量相对少，占骨髓内单核总数的1/104～1/105,而且随着年龄增长数量减少、增殖分化活性降低。MSC可以在体外连续传代培养和冷冻保存，同时维持其功能，在组织工程、细胞治疗、基因治疗、免疫调节等方面具有广泛的应用前景。
MSC具有较强的组织修复能力，这些细胞，在特定环境诱导下，可分化为硬骨细胞、软骨细胞，可以用来修复骨折、关节损伤等。MSC具有“归巢”特性，本身可表达大量的趋化因子和趋化因子受体(CCR4)，能够通过与炎症趋化因子和细胞因子的作用，迁移到炎症部位。MSC表达和分泌的多种细胞因子及粘附因子可促进炎症部位伤口愈合，如心脏损伤、肝脏损伤、脊髓损伤、糖尿病引起的难以愈合的伤口等。MSC也可以作为基因治疗的载体，表达特定的细胞因子作用于炎症部位伤口，加快伤口修复。MSC还具有较强的免疫调节作用以及低免疫原性，能有效地抑制免疫排斥反应和逃避免疫识别。
鉴于MSC的分化能力、免疫调节和抗炎等特性，MSC细胞治疗在再生医学领域中具有非常广泛的临床应用前景。目前，世界范围内基于MSC的临床试验就有975项，包括硬骨、软骨、心脏、神经系统、肺、肝脏、肠道、肾脏、皮肤等多种组织器官的损伤修复，在治疗自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)、器官移植后产生的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GvHD)等临床难治性疾病中也起到了重要的作用。目前美国、欧洲、日本、韩国等国家和地区的药品监管部门批准上市的干细胞药物共有12种，其中间充质干细胞药物10种。中国目前MSC的临床试验已注册的有205项，尚无获批MSC药物，但各机构提交的14种干细胞新药申请已被国家食药监局获批进入临床试验。
迄今为止，临床所用MSC来源主要分为自体来源(骨髓、脂肪组织等)和异体来源(脐带、胎盘等)两种。但是，使用自体或异体来源的原代MSC，普遍存在着一些问题：(1)难以取材(特别是骨髓)，提取获得的细胞数量有限；(2)保存期限较短；(3)随年龄增大，MSC的数量和扩增潜力显著降低，体外扩增更会加速MSC老化；(4)随年龄增大，MSC的分化潜力大幅衰退(取自年轻人的MSC易分化成软骨等细胞，而取自老年人的MSC分化倾向于脂肪细胞)；(5)制备过程不易质控(不同个体和同一个体不同组织器官部位来源的MSC差异非常大，无法预知)；(6)在某些自身免疫性疾病的病理条件下，患者自身的MSC是异常的，例如，系统性红斑狼疫患者的MSC增殖缓慢，形态异常，风湿性关节炎(rheumatic arthritis，RA)患者的骨髓来源MSC克隆增殖潜能大大降低，因此，用自体MSC移植治疗自身免疫性疾病效果不佳。这些缺点使原代MSC无法成为一种能够标准化、规模化生产的产品，在很大程度上导致了原代MSC疗效的不稳定性，使其在临床应用上受到很大的限制。因此，为了实现MSC在临床应用上的巨大前景，迫切需要解决MSC的来源问题。
除了成体来源，MSC也可以从多能干细胞分化获得，即为iMSC。人多能干细胞包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cell，hESC)和人诱导多能干细胞(human inducedpluripotent stem cell，hiPSC)。hESC和hiPSC可以在体外无限增殖并保持其分化为几乎所有成体功能细胞的潜能，是非常理想的在体外制备MSC的“种子”细胞。
与本发明最接近的专利有：专利CN105754936A公开了人诱导性多功能干细胞诱导为间充质干细胞的方法，专利CN106520687A公开了一种诱导多能干细胞向间充质干细胞分化的方法。上述专利中分化间充质干细胞时使用的培养基含FBS。FBS成分不明晰，批次间差异很大，很难用于临床级MSC的生产；用含FBS的培养基分化iPSC为MSC,整个细胞分化途径不清晰，随机性比较强；上述专利中整个分化过程在2D上进行，获得的细胞数量有限，不利于MSC的规模化生产。专利CN107574146A公开了由人类多能干细胞产生间充质干细胞的方法以及通过所述方法产生的间充质干细胞。此专利只是添加了各种利于MSC生长的因子来非特异性诱导成MSC，整个细胞分化途径不清晰。专利CN107937338A公开了一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法。此专利是用2D的方法进行诱导，获得的细胞数量有限，不利于MSC的规模化生产；只用到GSK3通路的抑制剂来诱导生成中胚层，中胚层至MSC的分化途径仍不明晰。
综上所述，虽然很多研究者已经研发出不少从hPSC在体外分化为MSC的方法，但现有的方法还是不够成熟，比如用血清和各种生长因子非特异性、随机性的诱导成间充质干细胞，需要用流式方法等技术筛选细胞才能得到纯度较高的细胞，因而分化效果不稳定、效率低、且时间长等问题；用2D的方法诱导出的细胞量比较少，满足不了临床应用的需求量。因此，亟需发明一种分化途径明确、快速、高效、简便且成本较低的多能干细胞分化为间充质干细胞的方法。
发明内容
本发明提供了一种从人多能干细胞(hPSC)分化为MSC的方法以及应用，且本发明的制备方法细胞分化途径明确，分化效率高，分化效果稳定，未使用含有血清的培养体系或滋养层细胞，获得的细胞群纯度高、数量大，因而适于后续临床级细胞制剂的生产和应用。本发明解决了以下问题：1)传统含血清的培养体系诱导分化出的MSC的效果不稳定且纯度不高；2)传统2D培养方法获得的MSC数量有限，而临床细胞需求量大。
具体的，本发明的技术方案如下：
本发明第一个方面公开了一种间充质干细胞，其表达CD90、CD73和CD105，不表达CD14、CD34、CD45、CD79α和HLA-DR。
本发明第二个方面公开了一种制备间充质干细胞的方法，包括以下步骤：
S1：人多能干细胞形成拟胚体；
S2：拟胚体向中胚层细胞分化；
S3：中胚层细胞向间充质干细胞分化。
优选的，在S1中，将hPSC用加入了Rock抑制剂的培养基重悬后悬浮培养，形成拟胚体。
在本发明的一些具体实施例中，所述培养基为E8培养基或TeSR培养基。
更优先的，所述Rock抑制剂是Y-27632，其浓度为10μM。
优选的，分化第0天，我们使用EDTA或Accutase消化hPSC，初始细胞密度应控制在(0.1～5)×106个细胞/T25，多能干细胞在培养基中培养8～32小时。
优选的，在S2中，将拟胚体用特异性分化培养基A重悬，悬浮培养2-3天；所述特异性分化培养基A内添加了GSK3β抑制剂。
优选的，在S3中，将中胚层细胞用特异性分化培养基B重悬，悬浮培养7-10天；所述特异性分化培养基B内添加了BMP4抑制剂、TGF-β抑制剂和SHH激动剂。
优选的，所述S3之后还包括S4：将间充质干细胞扩增培养。
优选的，所述S4之后还包括S5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
本发明第二个方面公开了一种间充质干细胞，其由上述的方法制备而得。
本发明第三个方面公开了一种细胞群，所述细胞群富集有上述的间充质干细胞。
本发明第四个方面公开了上述的间充质干细胞或上述的细胞群在制备细胞疗法药物中的应用。
在本发明的一具体实施例中，间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：
D-1～D0：拟胚体(EB)的形成
将状态良好保持未分化的、培养至聚合度70-90％的hPSC消化为单细胞悬液，以一定密度重悬于hPSC维持培养基中，置于37℃培养箱内的摇床上摇动培养过夜，形成大小和形态较为均一的EB。
D-1～D0实验操作细节
1)hPSC的培养
实验中所用的hPSC经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。hPSC在hPSC维持培养基中正常培养，所用的培养基为E8、TeSR或其它类似培养基。
2)EB的形成
按上述方法培养hPSC至70-90％聚合度时进行拟胚体形成实验。具体操作为：使用EDTA或accutase将hPSC消化为完全的单细胞悬液，重悬于hPSC维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂。将此细胞悬液置于37℃培养箱内的3D摇床上摇动培养，摇床的转速为10-100rpm；此步骤摇动培养的时间为8～32小时；培养结束时，获得大小和形态较为均一的EB。例如使用T25培养瓶时，Rock抑制剂是Y-27632，浓度为10μM；细胞密度为0.1×106-5×106/mL；摇床的转速为10-20rpm；培养的时间为8～32小时。
D0-D2：EB向中胚层分化
将上述D0的EB重悬于特异性分化培养基A中，并向培养基中加入优化浓度的GSK3β抑制剂，置于37℃培养箱内的摇床上摇动培养2天。
D0-D2实验操作细节及优化
从培养箱内取出装有D0的EB的培养瓶，倾斜培养瓶使EB沉于底部，去除上清，加入新鲜的分化培养基，并添加小分子GSK3β抑制剂。GSK3β抑制剂是NP031112、TWS119、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314或CHIR99021等。例如当使用T25培养瓶进行培养时，GSK3β抑制剂是CHIR99021。
D2对所得中胚层进行检测：
方法一：使用RT-QPCR检测中胚层的指标以确定分化细胞的类型，证明所得细胞为中胚层细胞。
其中，T/MIXL1是第一天最高表达，并第二天开始表达量减弱，TBX6/PDGFRα第二天比第一天表达量更多。抽提RNA所用的试剂盒是RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit，厂家为TIANGEN，货号是DP430；逆转录所用试剂盒是Reverse Transcriptase，厂家为Vazyme，货号是R223-01；RT-QPCR所用试剂盒是TransStart Top Green qPCR SuperMix，厂家为Transgen，货号是AQ131。
D2-D10：EB经轴旁中胚层(paraxial mesoderm)、体节(somite)、生骨节(Sclerotome)向MSC分化
将上述D2的EB重悬于特异性分化培养基B中，并向培养基中加入BMP4抑制剂、TGF-β抑制剂、SHH激动剂；继续于37℃培养箱内的摇床上摇动培养8天，诱导中胚层向轴旁中胚层(paraxial mesoderm)、体节(somite)、生骨节(Sclerotome)分化，最终获得MSC。
D2-D10实验操作细节及优化
从培养箱内取出装有D2EB的培养瓶，倾斜培养瓶使EB沉于底部，去除上清，加入新鲜的间充质干细胞特异性分化培养基B，并向培养基中BMP4抑制剂、TGF-β抑制剂、SHH激动剂；BMP4抑制剂可以是dorsomorphin、noggin、LDN-193189、follistatin、chordin、gremlin等；TGF-β抑制剂可以是A-83-01、GW6604、LY2157299、LY550410、L Y5 73636、LY580276、NPC-30345、SB-431542和SB-505124等；SHH激动剂可以是SHH重组蛋白、Purmorphamine、SAG等。例如当使用T25培养瓶进行培养时，BMP4抑制剂是LDN-193189，TGF-β抑制剂是SB-431542，SHH激动剂是SHH重组蛋白。
D10～D14：MSC的扩增培养
将上述D10的EB用2D的方法直接接种于培养瓶或皿，培养基为MSC维持培养基，继续于37℃培养箱内培养，培养至聚合度70-90％，用胰酶消化得到单细胞，即为P0代MSC，计数传代扩增，可继续传代扩增培养。
D10～D14：实验操作细节及优化
从培养箱内取出装有D10EB的培养瓶，倾斜培养瓶使EB沉于底部，去除上清，取20ul左右EB，直接接种到培养瓶。接种后第一天开始就有很多细胞从EB爬出，细胞形态为梭形，与原代MSC非常相似，进行传代至P3代。
所得P3代细胞进行检测：
方法一：使用流式细胞仪检测细胞表型，证明所得细胞的表型为：CD90+、CD73+、CD105+、CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-；其中三个阳性表面因子(CD90+、CD73+、CD105+)表达率达到95％以上，五个阴性表面因子(CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-)表达率要低于2％。说明分化所得的MSCs纯度很高。
其中，流式的抗体信息如下：CD90-FITC，BD，#555595；CD73-APC，BD，#560847；CD105，Biolegend，#822508；CD14，BD，#301804；CD34，BD，#343604；CD45，BD，#304006；CD79a，BD，#333152；HLA-DR，BD，#307604。
方法二：使用硬骨、软骨、脂肪分化培养基分化细胞，证明所得细胞具有向硬骨、软骨、脂肪分化的能力。
方法三：与T细胞共培养检测所得细胞具有免疫抑制能力。
上述特异性分化培养基A成分如下表1所示：
表1
序号 成分 终浓度
1 IMDM 50％
2 Ham`s F12 nutrient mix 50％
3 Glutamax(L-谷氨酰胺) 1×
4 NEAA(非必需氨基酸) 0-15mM
5 Na Ascorbic acid(抗坏血酸钠盐) 1-100μg/ml
6 CD lipid concentrate(脂质) 0.01-1％
7 Monothioglycerol(二羟基丙硫醇) 1-500uM
8 Sodium selenium(亚硒酸钠) 1-10ng/ml
9 Holo-transferrin(人转铁蛋白) 1-200μg/ml
10 Insulin(胰岛素) 0-20μg/ml
上述特异性分化培养基B成分如下表2所示：
表2
序号 成分 终浓度
1 IMDM 50％
2 Ham`s F12 nutrient mix 50％
3 Serum replacement(血清替代物) 1-5％
4 Glutamax(L-谷氨酰胺) 1×
5 Na Ascorbic acid(抗坏血酸钠盐) 1-100μg/ml
6 Insulin(胰岛素) 0-20μg/ml
7 Transferrin(人转铁蛋白) 1-200μg/ml
8 Ethanolamine(乙醇胺) 1-50uM
9 Putrescine 2HCl(腐胺) 1-50uM
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明的关键点和欲保护点至少包括以下两点：
1)本发明关键的创新点在于所使用的小分子化合物的种类、浓度和加入时间等，使分化更精准地控制人多能干细胞的分化方向，所得到的细胞纯度高，无需用流式筛选的方法来筛选细胞。
2)从多能干细胞分化间充质干细胞的方法及分化/扩增培养基成分。
专利CN105754936A和CN106520687A中的方法均可以从诱导多能干细胞(iPSC)分化得到间充质干细胞，但是与本发明的方法有很大的区别：第一，上述专利中分化间充质干细胞时使用的培养基含FBS。FBS成分不明晰，批次间差异很大，很难用于临床级MSC的生产；而我们的整个制备过程中使用了不含FBS的成分明晰的培养基，易于临床级MSC的生产。第二，上述专利中用含FBS的培养基分化iPSC为MSC，整个细胞分化途径不清晰，随机性比较强；而我们的细胞分化途径清晰，用相关小分子将多能干细胞特异性的诱导成中胚层、轴旁中胚层(paraxial mesoderm)、体节(somite)、生骨节(Sclerotome)，最终得到MSC。第三，上述专利中整个分化过程在2D上进行，获得的细胞数量有限，不利于MSC的规模化生产；而我们的制备方法是在悬浮的3D环境中将多能干细胞转变为EB，在分化条件中形成MSC后，再用2D的方法进行扩增培养，使得分化效率更高，且产量更大。
专利CN107574146A与我们本申请的方法相似之处为均使用了3D培养方法，从ESC形成EB，过程为悬浮培养。但其与我们的方法仍存在较大区别：第一：上述专利中的方法都是添加各种利于MSC生长的因子来非特异性诱导成MSC，而我们的方法是将多能干细胞特异性的诱导成轴旁中胚层(paraxial mesoderm)、体节(somite)、生骨节(Sclerotome)，最终得到MSC。这样的诱导方法细胞分化途径清晰，使分化出来的MSC纯度更高，并且性质更稳定。第二，上述专利诱导分化的时间较长，需要30天以上才能得到MSC，而按我们特异性分化方法，第14天就能得到成熟的MSC，因此分化时间缩短，效率提高。
专利CN107937338A与本发明的相同之处都是使用CHIR99021来抑制GSK3信号通路先诱导形成中胚层，并最终得到CD73+CD90+CD34-CD45-的MSC。但上述专利与我们的方法仍存在较大的不同：第一，上述的方法中诱导分化的方法是用2D的方法进行诱导分化，而我们的制备方法是在悬浮的3D环境中将多能干细胞转变为EB，在分化条件中形成MSC后，再用2D的方法进行扩增培养，最终得到成熟的MSC，使得诱导效率更高，且产量更大；第二，上述方法中只用到GSK3通路的抑制剂，但我们的分化过程中还用TGFβ通路抑制剂、BMP4通路抑制剂、SHH激动剂等组合，使细胞的分化途径更为精确，得到更加特异性的MSC。
综上所述，虽然很多研究者已经研发出不少从hPSC在体外分化为MSC的方法，但现有的方法还是不够成熟，比如用血清和各种生长因子非特异性、随机性的诱导成间充质干细胞，需要用流式方法等技术筛选细胞才能得到纯度较高的细胞，因而分化效果不稳定、效率低、且时间长等问题；用2D的方法诱导出的细胞量比较少，满足不了临床应用的需求量。
发明提供了一种从多能干细胞快速、高效获得间充质干细胞的方法，具有以下有益效果：
第一，分化过程中通过小分子化合物的联合使用精确控制分化通路，实现了稳定、高效的分化，最终获得成熟MSC；获得的MSC表达的表面因子为CD90+、CD73+、CD105+、CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-，贴壁生长，并具有向硬骨、软骨、脂肪分化的能力。不需要额外的流式筛选技术来筛选细胞。
第二，原代MSC由于个体和来源不同而特性有差异，且同样批次的细胞数量有限，因而其治疗效果也会大大不同，但用我们分化方法制备出来的iMSC是从多能干细胞以特定分化方向进行精确诱导的，因此批次间比较稳定，为以后应用于临床打下好基础。
第三，整个分化过程中我们未使用含有血清的培养体系或滋养层细胞，适于后续临床级细胞制剂的生产；
第四，本方法采用拟胚体悬浮培养的方法，可获得同一批次的大量细胞，适用于规模化细胞制剂的生产和临床应用。
附图说明
图1显示了本发明一个实施例的技术方案流程图。
图2显示了ROCK抑制剂对EB形成的影响。
图3显示了本发明一个实施例中从hPSC形成拟胚体(第2天和第10天)。
图4显示不同CHIR99021浓度对EB形成和P0细胞的影响。
图5采用RT-QPCR对中胚层的标志物T/MIXL1/TBX6/PDGFR进行检测(相比于第一天)。
图6显示了本发明一个实施例中从拟胚体爬出来的细胞。
图7采用流式细胞仪检测iMSC的CD90+、CD73+、CD105+、CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-表型所占的比例。
图8显示了iMSC向硬骨、软骨、脂肪分化的能力。
图9分别显示iMSC和脐带间充质干细胞(ucMSC)免疫抑制能力的鉴定。
图10显示ucMSC和iMSC对薄型子宫内膜小鼠修复效果的比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
一种制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：人多能干细胞形成拟胚体；
S2：拟胚体向中胚层细胞分化；
S3：中胚层细胞向间充质干细胞分化。
具体的，流程图如图1所示，步骤如下：
(1)人多能干细胞形成拟胚体(D-1～D0)
实验中所用的hPSC经过严格的多能性验证(表达各种多能性标志物，并可在免疫缺陷小鼠体内形成包含内、中、外三个胚层的畸胎瘤)。hPSC在hPSC维持培养基中正常培养，所用的培养基为E8或TeSR或其它类似培养基。
该实施例中人多能干细胞通过专利CN 108085299A公开的方法进行制备。
待人多能干细胞培养至汇合度为70-90％，使用EDTA或accutase将hPSC消化为完全的单细胞悬液，重悬于hPSC维持培养基中，并向培养基中加入Rock抑制剂。将此细胞悬液置于37℃培养箱内的3D摇床上摇动培养，摇床的转速为10-100rpm；此步骤摇动培养的时间为8～32小时；培养结束时，获得大小和形态较为均一的EB。
人多能干细胞使用T25培养瓶培养，Rock抑制剂是Y-27632，浓度为10μM；细胞密度可以为0.1×106-5×106/mL；摇床的转速为10-20rpm；培养的时间为8～32小时。
(2)拟胚体向中胚层细胞分化(D0-D2)
将上述D0的EB重悬于特异性分化培养基中，并向培养基中加入优化浓度的GSK3β抑制剂，置于37℃培养箱内的摇床上摇动培养2天。
实验操作细节及优化如下：
从培养箱内取出装有D0EB的培养瓶，倾斜培养瓶使EB沉于底部，去除上清，加入新鲜的分化培养基，并添加小分子GSK3β抑制剂。GSK3β抑制剂是CHIR99021。
D2对所得中胚层进行检测：
方法一：使用RT-QPCR检测中胚层的指标以确定分化细胞的类型，证明所得细胞为中胚层细胞。具体数据见附图5。
其中，T/MIXL1是第一天最高表达，并第二天开始表达量减弱，TBX6/PDGFRa第二天比第一天表达量更多。抽提RNA所用的试剂盒是RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit，厂家为TIANGEN，货号是DP430；逆转录所用试剂盒是Reverse Transcriptase，厂家为Vazyme，货号是R223-01；RT-QPCR所用试剂盒是TransStart Top Green qPCR SuperMix，厂家为Transgen，货号是AQ131。
(3)中胚层细胞向间充质干细胞分化(D2-D10)：EB经轴旁中胚层(paraxialmesoderm)、体节(somite)、生骨节(Sclerotome)向MSC分化
将上述D2的EB重悬于MSC特异性分化培养基中，并向培养基中BMP4抑制剂、TGF-β抑制剂、SHH激动剂；继续于37℃培养箱内的摇床上摇动培养8天，诱导中胚层向轴旁中胚层(paraxial mesoderm)、体节(somite)、生骨节(Sclerotome)分化，最终获得iMSC。
具体实验操作细节及优化如下：
从培养箱内取出装有D2EB的培养瓶，倾斜培养瓶使EB沉于底部，去除上清，加入新鲜的间充质干细胞特异性分化培养基，并向培养基中BMP4抑制剂、TGF-β抑制剂、SHH激动剂。采用T25培养瓶进行培养，BMP4抑制剂是LDN-193189，TGF-β抑制剂是SB-431542，SHH激动剂是SHH重组蛋白。
(4)iMSC的培养(D10-D14)
将上述培养第10天得到的细胞用2D的方法直接接种于培养瓶或皿，培养基为MSC维持培养基，继续于37℃培养箱内培养至汇合度为70-90％，用胰酶消化成单细胞，即获得P0代的iMSC。所获得的细胞用胰酶消化成单细胞，计数传代扩增，可继续传代扩增培养。
具体实验操作细节及优化如下
从培养箱内取出装有D10EB的培养瓶，倾斜培养瓶使EB沉于底部，去除上清，取20ul左右EB，直接接种到培养瓶。接种后第一天开始就有很多细胞从EB爬出，细胞形态为梭形。具体形态如图6。
本实施例中分化第2天和分化第10天得到的EB形态图如图3所示。
实施例2
本实施例研究2D培养和3D培养分别对获得的iMSC数量的影响。本实施例中的2D培养与实施例1的唯一不同为：整个诱导过程采用2D培养。
实验结果如表3所示：
表3
Figure BDA0002206874780000101
从表3可以得出，用3D分化方法，细胞从EB爬出来长满后可以得到约为起始细胞10～15倍细胞量的iMSC，这一方法比以同样数量的hPSC用2D方法分化而得到的细胞数量高出一倍，且所使用的培养基的用量是其1/4。因此，优先使用3D培养进行iMSC的规模化生产。
实施例3
本实施例研究不同的Rock抑制剂浓度对实验结果的影响。ROCK抑制剂浓度分别设置为2.5、5和10μM。结果如图2所示，当ROCK抑制剂的浓度为2.5和5μM时，多能干细胞形成的EB很小，且形态不均一；在ROCK抑制剂的浓度为10μM时，形成的EB很圆，且形态均一。
因此，在我们分化方法的前8～32小时内，ROCK抑制剂的浓度对EB的形成起很大的作用。
实施例4
本实施例研究不同浓度的CHIR99021对实验结果的影响。
当使用T25培养瓶进行EB分化时，其它条件方法如实施例1所述，对CHIR99021的浓度进行梯度优化，即在day0分别使用5μM，8μM和10μM的CHIR99021处理细胞，将获得的细胞进行传代和扩增，并测定细胞的表面因子的表达。
结果如图4所示，不同浓度的CHIR99021不仅会影响EB的大小和形态，而且也会对从EB爬出来的细胞量有明显影响。
可见，CHIR99021的优化会提高分化效率及维持iMSC的CD90维持时间。在CHIR99021浓度为8～10μM时，最终获得的iMSC数量多、纯度高，且可以维持CD90的高表达量。
实施例5
对实施例1中所得P3代iMSC进行检测：
使用流式细胞仪检测细胞表型，证明所得细胞的表型为：CD90+、CD73+、CD105+、CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-和HLA-DR-；其中三个阳性表面因子(CD90+、CD73+、CD105+)表达率达到95％以上，五个阴性表面因子(CD14-、CD34-、CD45-、CD79a-、HLA-DR-)表达率要低于2％。说明分化所得的iMSC纯度很高。具体数据见附图7。
具体步骤如下：
1)每次传代时，取细胞1×105cells/管，共九管(按照每个样品检测8管，加一管空白对照)加入到1.5ml离心管中，加1ml流式洗涤液，200g离心3min，弃上清。
2)加100ul的流式buffer,轻轻悬浮细胞。
3)分别标记细胞编号及以下抗体类型于管身，CD73\CD90\CD105\CD79a\CD45\HLA-DR\CD34\CD14，空白管不加试剂，其余各管分别按试剂使用要求加入适当体积的抗体，轻弹管壁混匀。
4)4℃避光孵育20-30分钟。
5)避光孵育结束后，加1ml的流式洗涤液，200g离心3min，弃上清，加入500uL FACSbuffer混匀，待上机。图7显示本发明获得的iMSC的三个细胞表面因子(CD73\CD90\CD105)都显示阳性，五个表面因子(CD79a\CD45\HLA-DR\CD34\CD14)都显示阴性，从而说明本实施例获得的iMSC具有间充质干细胞的特性。
其中，流式的抗体信息如下：CD90-FITC，BD，#555595；CD73-APC，BD，#560847；CD105，Biolegend，#822508；CD14，BD，#301804；CD34，BD，#343604；CD45，BD，#304006；CD79a，BD，#333152；HLA-DR，BD，#307604。
实施例5
对实施例1中所得P3代间充质干细胞进行检测：
使用硬骨、软骨、脂肪分化培养基分化细胞，证明所得细胞具有向硬骨、软骨、脂肪分化的能力，图像结果见附图8(其中上面三组图的显微镜放大倍数为100×，下面三组图的放大倍数为400×)。
具体实验步骤如下：
1)硬骨分化鉴定
1-1)按照合适的接种密度将细胞接种到细胞培养容器中，加入适量的已预热的新鲜的iMSC培养基；水平十字摇匀三次，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次，培养；
1-2)iMSC均匀铺展生长，在培养汇合度达到90％左右后，将容器中的培养基吸弃，开始更换为硬骨分化诱导培养基、具体的，所述硬骨分化诱导培养制备方法为：在含有20％的FBS(胎牛血清)和1％的GlutaMAXSupplement(GlutaMAX添加剂)的Alpha-MEM培养基中添加Ascorbic Acid(L-抗坏血酸)和β-glycerophosphate(β-甘油磷酸钠)，记为day 0，每三天全换液一次，持续培养到day21，在光镜下观察拍照。正常分化过程中，可以看到细胞会逐步变细长；
1-3)Day21后，硬骨分化的iMSC使用纯水洗涤后，加入合适体积的茜素红工作液，避光室温孵育20-60分钟，然后吸弃多余染液，每孔再加入适当体积的生理盐水或DPBS浸润，显微镜下观察，拍照。
2)软骨分化鉴定
2-1)在倒置显微镜下观察细胞生长状况，细胞的融合度达到95％左右。取Accutase消化离心后的细胞，使用软骨分化培养基重悬，所述软骨分化培养的制备方法为：DMEM-高糖培养基中添加Ascorbic Acid(L-抗坏血酸)，Dexamethasone(地塞米松)，ITS+Premix tissue culture supplements(ITS+Premix组织培养添加剂)，TGFb1和Sodiumpyruvate(丙酮酸钠)，调节细胞密度为1×106/mL。
2-2)取标记好的15mL离心管，每管分装500μL细胞悬液(每管最终的细胞为0.5×106个)，旋松管盖后，再放入细胞培养箱中，每三天全换液一次，持续培养到day28。
2-3)成软骨分化28天的细胞球切片后，用阿尔新蓝(alcian blue)染色并拍照。
3)成脂分化鉴定
3-1)按照合适的接种密度将细胞接种到细胞培养容器中，加入适量的已预热的新鲜的iMSC培养基；水平十字摇匀三次，置于37℃，5％CO2浓度，饱和湿度的培养箱中，再次水平十字摇匀三次，培养；
3-2)iMSC均匀铺展生长，在培养汇合度达到90％左右后，将容器中的培养基吸弃，开始更换为成脂分化诱导培养基，所述成脂分化诱导培养基的配制方法为：在含有10％的FBS的DMEM-高糖培养基中添加：IBMX、Dexamethasone(地塞米松)和Indomethacin(吲哚美辛)，记为day 0，每三天全换液一次，持续培养到day21，在光镜下观察拍照。正常分化过程中，可以看到细胞会逐步变宽变短，高倍镜下可以看到细胞内有很多圆形的脂肪粒；
3-3)Day21后，成脂分化的iMSC使用生理盐水或DPBS洗涤后，再用60％异丙醇液清洗一下细胞，以防止生理盐水或DPBS残留，进而导致染色液析出；
3-4)在分化组和对照组中加入合适体积的油红工作液，避光室温孵育20-60分钟，然后吸弃多余染液；生理盐水或DPBS洗涤至未见背景色，每孔再加入适当体积的生理盐水或DPBS浸润，显微镜下观察，拍照。
实施例6
对实施例1中所得P3代间充质干细胞进行研究，发现其与T细胞共培养检测所得细胞具有免疫抑制能力。本实施例中T细胞和脐带间充质干细胞采用常规方法获得。
具体实验步骤如下：
1.培养ucMSC(脐带间充质干细胞)和实施例1获得的iMSC至汇合度达到90％以上,直接于旧培养基中添加5μg/ml丝裂霉素C，37℃孵育2h。
2.2h后吸弃旧培养基，用DPBS洗两遍，正常消化细胞(用Accutase消化3-5min)，200g离心3min收集细胞沉淀。
3.去除上清后，适量加DPBS至细胞沉淀中，吹散细胞沉淀(轻柔操作)，取500μL细胞悬液于vi-cell细胞计数仪上计数。
4.用TPA(T Cell Proliferation Assay)培养基(RPMI+10％FBS+GlutaMAX)接种步骤3里计数的两组细胞浓度至5×105细胞/孔到六孔板，第二天待细胞贴壁后，继续下一步实验。
5.将激活后4天的PBMC(用含CD3/CD28抗体、100IU/mL IL-2的T细胞培养基激活)转移至15ml离心管中，200g离心3min去除含蛋白成分的培养基，再加入5ml DPBS洗一遍，同时取细胞悬液，1:10稀释后取500μL于vi-cell计数，离心收集细胞沉淀；
6.用DPBS重悬PBMC至1-3×106个/ml，留取足够数量的PBMC做阴性对照，其余加入终浓度为5μM的CFSE，混匀后37℃孵育10min。
7.加入等体积TPA medium终止CFSE反应(CFSE染色成功后PBMC沉淀应为亮黄色)，200g离心3min弃去上清，加入10ml DPBS重悬细胞，取细胞悬液计数，离心收集细胞沉淀。
8.用TPA medium重悬PBMC至2.5×105/管细胞备用，染色后的各组细胞，按5×105细胞/孔的量在步骤4接种MSC的六孔板里接种与MSC共培养，用TPA medium调整每孔终体积为4mL。
9.共培养4天后，用荧光显微镜拍摄细胞照片，然后收集每孔PBMC，CD3抗体标记后进行流式检测(比较每组CD3+CFSE-细胞比例)。
10.收集每孔PBMC至1.5ml离心管中，200g离心2min收集细胞沉淀。
11.再各加入500μl FACS buffer洗涤一次，200g离心2min后各加入50μl左右FACSbuffer重悬细胞沉淀，除阴性管、CFSE单标管，其余各加入0.5μl CD3抗体，4℃孵育30min；
12. 30min后各加入500μl FACS buffer洗涤一次，200g离心2min收集细胞沉淀，每管加入100μl FACS buffer重悬细胞沉淀，做流式分析。图9显示单独培养T细胞扩增正常，但与ucMSC和本发明所获得的iMSC共培养的T细胞无法正常扩增，证明了这两种细胞具有免疫抑制作用，且iMSC具有和原代MSC相近的免疫抑制作用。
实施例7
本实施例研究ucMSC和实施例1得到的iMSC对薄型小鼠子宫内膜修复效果评估。具体包括以下步骤：
为评估实施例1所获得的iMSC对于薄型子宫内膜的修复功能性，与ucMSC进行修复功能的对比试验。每只小鼠用300～500ul的95％乙醇注射到一侧子宫内十秒，诱导小鼠子宫变薄，然后用ucMSC(5×105/只)和实施例1获得的iMSC(5×105/只)尾静脉注射法注射到小鼠体内，一周后解剖小鼠，子宫做组织切片，检测子宫内膜厚度，对MSC的治疗作用进行评估。图10显示ucMSC和实施例1获得的iMSC都有对薄型子宫的修复功能，且修复功能相近。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种采用无血清方法制备间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：人多能干细胞形成拟胚体；
S2：拟胚体向中胚层细胞分化；
S3：中胚层细胞向间充质干细胞分化；
在S1中，将人多能干细胞用加入了Rock抑制剂的培养基重悬后悬浮培养，形成拟胚体，所述Rock抑制剂的浓度为10μM；
在S2中，将拟胚体用特异性分化培养基A重悬，悬浮培养2-3天；所述特异性分化培养基A内添加了GSK3β抑制剂，所述GSK3β抑制剂的浓度为8-10μM；
所述特异性分化培养基A由以下成分组成：IMDM 终浓度50%，Ham`s F12 nutrient mix终浓度50%，1× Glutamax，0-15 mM NEAA，1-100 μg/ml Na Ascorbic acid，0.01-1% CDlipid concentrate，1-500 μM Monothioglycerol，1-10 ng/ml Sodium selenium，1-200μg/ml Holo-transferrin，0-20 μg/ml Insulin；
在S3中，将中胚层细胞用特异性分化培养基B重悬，悬浮培养7-10天；所述特异性分化培养基B内添加了BMP4抑制剂、TGF-β抑制剂和SHH激动剂；
所述特异性分化培养基B由以下成分组成：IMDM 终浓度50%，Ham`s F12 nutrient mix终浓度50%，1-5% Serum replacement，1× Glutamax，1-100μg/ml Na Ascorbic acid，0-20 μg/ml Insulin，1-200 μg/ml Transferrin，1-50 μM Ethanolamine，1-50 μMPutrescine 2HCl。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S3之后还包括S4：将间充质干细胞扩增培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S4之后还包括S5：将扩增培养得到的间充质干细胞进行鉴定。
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