CN115011553A - 一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及用途 - Google Patents
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- C12N2501/135—Platelet-derived growth factor [PDGF]
-
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Abstract
本发明公开了一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞及其制备方法，所述躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞由多能干细胞诱导，通过特定诱导培养液严格限定其分化路径，先后经历神经中胚层祖细胞和躯干神经嵴细胞阶段后得到。结果表明，本发明得到的由不同多能干细胞株诱导的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的基因表达谱(R2>0.93)不但高度相似，且相较于骨髓间充质干细胞具备更好的免疫调节能力及造血支持能力。因此，这种来源明确、异质性较低的全新MSC亚群，可能为MSC临床转化，特别是免疫治疗、支持造血干细胞移植等提供新的、高质量的细胞来源。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体地，涉及一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法及其用途。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)是目前最为常见的成体干细胞之一，最早发现于骨髓，主要参与形成骨髓造血微环境，支持造血等，具有自我更新、多向分化、旁分泌及免疫调节能力等特性，在组织工程应用以及细胞治疗等方面具有广阔的临床应用前景。2006年国际细胞治疗学会(ISCT)制定了MSC需满足的最低鉴定标准：(1)标准条件下培养时，细胞粘附于培养器皿，呈贴壁样生长；(2)细胞表面阳性标志物CD73、CD90及CD105表达率＞95％，阴性标志物CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR表达率＜2％；(3)体外分化能力，可分化为成骨细胞，软骨细胞以及脂肪细胞等。
MSC可以从多种成体组织如骨髓、脐带、脂肪等成功分离获取，众多研究表明MSC临床治疗的安全性及有效性。然而，MSC治疗仍然存在疗效不稳定的现象，而MSC异质性是导致这一现象的关键原因之一。研究显示，不同个体的骨髓来源的MSC表现出差异性的增殖和成骨分化潜能(Phinney DG,Kopen G,Righter W,et al.Donor variation in the growthproperties and osteogenic potential of human marrow stromal cells.J CellBiochem.1999Dec 1；75(3):424-36.)。即使同一个体不同组织来源分离获得的MSC也表现出不同的生物学特性，差异显著(Kern S,Eichler H,Stoeve J,et al.Comparativeanalysis of mesenchymal stem cells from bone marrow,umbilical cord blood,oradipose tissue.Stem Cells.2006May；24(5):1294-301；Hass R,Kasper C,
S,etal.Different populations and sources of human mesenchymal stem cells(MSC):Acomparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.Cell CommunSignal.2011May 14；9:12)。因此，MSC异质性问题便成为限制MSC临床转化、改善MSC治疗临床效果亟待解决的关键环节。
研究表明，从牙髓组织中分离获得的MSC发育起源于神经嵴细胞，脐带MSC则起源于滋养层细胞。这表明，从不同成体组织中分离获得的MSC其发育起源并不完全一致。此外，现有技术(Isern J,García-García A,Martín AM,et al.The neural crest is a sourceof mesenchymal stem cells with specialized hematopoietic stem cell nichefunction.Elife.2014Sep25；3:e03696.)证实骨髓中存在不同发育起源的MSC亚群且其生物学特性及功能各异，其中发育起源于神经嵴的MSC在支持造血方面表现出优势，而中胚层来源的MSC则相对表现出更好的成骨能力。因此，MSC的发育起源可能是导致MSC功能异质性的重要原因。
神经中胚层祖细胞(Neuromesodermal progenitors,NMP)定位于原结-原条边界(node-streak border,NSB)和尾侧外胚层(caudal lateral epiblast,CLE)，被认为是一类形成后段脊髓和及其邻近轴旁中胚层组织的起始祖细胞，具有神经和中胚层双向分化能力，共表达T+/SOX2+。此外，神经中胚层祖细胞在体内可以分化为躯干神经嵴干细胞，且有研究发现小鼠躯干神经嵴可以分化为骨髓MSC及躯干部分的软骨细胞和骨细胞，高度提示体内存在躯干神经嵴谱系的间充质干细胞。
中国专利公开了一种于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系、方法及应用，但是其诱导神经中胚层祖细胞时程为10天，其标志物T和SOX2共表达效率低，仅75.5％。其神经中胚层祖细胞的诱导效率明显不足。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中间充质干细胞异质性的问题，从细胞发育起源的角度出发，通过特定诱导分化流程来获得发育路径清晰的间充质干细胞，进而降低其异质性，改善其临床治疗效果。本发明提供一种由多能干细胞诱导的经神经中胚层祖细胞阶段的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞稳定、高效的制备方法，同时本发明诱导得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞，可以为间充质干细胞的临床转化提供新的、高质量的细胞来源。
本发明的第一个目的是提供一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
本发明的第二个目的是提供一种多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞的培养液。
本发明的第三个目的是提供一种神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞的培养液。
本发明的第四个目的是提供任一所述培养液在多能干细胞诱导躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种由多能干细胞诱导的经神经中胚层祖细胞阶段的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法。
本发明的第六个目的是提供任一所述制备方法制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
本发明的第七个目的是提供所述的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞在制备促进造血支持和/或抑制T细胞炎症因子TNF-α的药物的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明将多能干细胞通过限定诱导方法高效诱导为确定性神经中胚层祖细胞(Neuromesodermal progenitorcells,NMPs)后，经躯干神经嵴诱导培养液诱导培养、分选纯化，获得神经中胚层祖细胞来源的躯干神经嵴干细胞(Trunk Neural Crest，Trunk-NCs)。重新消化接种后更换为间充质干细胞培养液进行连续培养，检测间充质干细胞表型，即得躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk-NC-MSCs)。
本发明中所使用的“NMPs”是指神经中胚层祖细胞。
本发明中所使用的“Trunk-NCs”是指经躯干神经嵴诱导培养液诱导培养、分选纯化，获得的神经中胚层祖细胞来源的躯干神经嵴干细胞。
本发明中所使用的“Trunk-NC-MSCs”是指由多能干细胞诱导的经神经中胚层祖细胞阶段的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
本发明在前述工作基础上，通过制定一套标准化、可行性强的操作程序，提供了一种全新的MSC亚群—躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞，既可以为MSC的临床转化提供新的、高质量的细胞来源，也可以为研究躯干骨骼的发育及其相关疾病的发病机制研究提供理想的体外模型。
具体地，本发明将多能干细胞于包被了基质胶的培养板或培养皿上传代扩增，待其生长至诱导所需细胞量时，制成单细胞悬液贴壁后，用添加GSK-3抑制剂、FGF信号通路激动剂、TGFβ信号通路激动剂组合的培养液定向诱导0.5～3天，即得到神经中胚层祖细胞群体；随后改用躯干神经嵴诱导培养液定向诱导5～7天，将神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞群体；最后将上步中的躯干神经嵴细胞经流式分选纯化，并在间充质干细胞培养液持续传代培养2～8次，同时按照ISCT制定的MSC鉴定标准，进行MSC表面标志物检测及成脂成骨成软骨等分化能力鉴定，最终证实成功得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)。
因此本发明要求保护一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)，由多能干细胞依次诱导为神经中胚层祖细胞和躯干神经嵴细胞后得到的。
优选地，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎干细胞。
本发明还要求保护一种多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞的培养液，所述培养液为含有ROCK通路抑制剂和GSK-3抑制剂的基础培养液。
优选地，所述基础培养液为Essential 6TM培养液或DMEM-F12培养液。
更优选的，所述基础培养液为Essential 6TM培养液。
优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y27632或GSK429286A中的一种或两种。
更优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y27632。
优选地，所述GSK-3抑制剂为LY2090314、SB216763、CHIR-99021和CHIR-99021HCl中的一种或几种。
更优选地，所述GSK-3抑制剂为CHIR99021。
再优选地，所述培养液含有1～20μMY27632和1～20μM CHIR99021。
再更优选地，所述培养液含有1～10μMY27632和1～10μM CHIR99021。
进一步优选地，所述培养液含有10μMY27632和10μM CHIR99021。
最优选地，所述培养液为10μM CHIR99021、10μM Y27632的Essential 6TM培养液。
优选地，所述培养液还含有TGFβ和FGF信号激动剂。
更优选地，所述TGFβ信号通路激动剂为TGFβ1。
更优选地，所述FGF信号通路的激动剂为bFGF。
再优选地，所述培养液还含有1～100ng/ml TGFβ1和1～100ng/ml bFGF。
再更优选地，所述培养液还含有1～10ng/ml TGFβ1和1～20ng/ml bFGF。
进一步优选地，所述培养液还含有2ng/ml TGFβ1和20ng/ml bFGF。
最优选地，所述培养液为含有10μM CHIR99021、10μM Y27632、20ng/ml bFGF、2ng/ml TGFβ1的Essential 6TM培养液。
本发明也要求保护一种神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞的培养液，所述培养液为含有N2细胞培养添加剂、NEAA、Glutamax以及ROCK通路抑制剂、GSK-3抑制剂、TGFβ通路抑制剂、BMP通路抑制剂的基础培养液。
优选地，所述基础培养液为Essential 6TM培养液或DMEM-F12培养液。
更优选的，所述基础培养液为DMEM-F12培养液。
优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y27632或GSK429286A中的一种或两种。
更优选地，所述ROCK通路抑制剂为Y27632。
优选地，所述GSK-3抑制剂为LY2090314、SB216763、CHIR-99021和CHIR-99021HCl中的一种或几种。
更优选地，所述GSK-3抑制剂GSK-3抑制剂为CHIR99021。
优选地，所述TGFβ通路抑制剂为Dorsomorphin、SB431542、A83-01、TGFβ-IN-1、SB525334中的一种或几种。
更优选地，所述TGFβ通路抑制剂为SB431542。
优选地，所述BMP通路抑制剂为DMH1、LDN193189、LDN193189Tetrahydrochloride中的一种或几种。
更优选地，所述BMP通路抑制剂为DMH1。
再优选地，所述培养液含有1～20μM SB431542、1～20μM CHIR99021，1～10μMDMH1以及1～20μM Y-27632。
再更优选地，所述培养液含有1～10μM SB431542、1～10μM CHIR99021，1～5μMDMH1以及1～10μM Y-27632。
进一步优选地，所述培养液含有2μM SB431542、10μM CHIR99021、1μM DMH1以及10μM Y-27632。
进一步再优选地，所述培养液为还含有1～5％(V/V)N2细胞培养添加剂、1～5％(V/V)NEAA、1～5％(V/V)Glutamax的DMEM-F12培养液。
最优选地，所述培养液含有1％(V/V)N2细胞培养添加剂、1％(V/V)NEAA、1％(V/V)Glutamax、2μM SB431542、10μM CHIR99021、1μM DMH1以及10μM Y-27632的DMEM-F12培养液。
本发明要求保护任一所述培养液在多能干细胞诱导躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞中的应用。
优选地，由多能干细胞依次诱导为神经中胚层祖细胞和躯干神经嵴细胞后得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
优选地，所述多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞的培养液在神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞中的应用。
优选地，所述神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞的培养液在神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞中的应用。
本发明还要求保护一种由多能干细胞诱导的经神经中胚层祖细胞阶段的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1.将多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞：将多能干细胞消化成单细胞，之后接种于包被基质胶的培养板或培养皿中，利用任一所述的培养液，培养0.5～3天后，即得到神经中胚层祖细胞；
S2.将神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞：利用所述的培养液，培养上一步的产物5～7天后，即得到躯干神经嵴细胞；
S3.将躯干神经嵴细胞诱导为躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)：用间充质干细胞培养液持续传代培养培养上一步的产物3～4周，即得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
优选地，所述多能干细胞为诱导性多能干细胞或胚胎细胞。
优选地，步骤S1中，用Accutase消化细胞。
优选地，步骤S1中，多能干细胞解离成单细胞或细胞团块后，细胞接种数目为1×103～1×107/cm2。
更优选地，细胞接种数目为1×104～3×104/cm2。
优选地，所述基质胶为Matrigel或层粘连蛋白LN。
更优选地，用预冷的DMEM-F12按体积1：100的比例稀释Matrigel原液后，提前1～12h包被培养板或培养皿。
优选地，步骤S1中，诱导得到的神经中胚层祖细胞中T和SOX2双阳性细胞比例可达95％以上，无需进行分选纯化即可进行下一步诱导。
优选地，步骤S2中，诱导得到的躯干神经嵴细胞中SOX10和HOXC9双阳性细胞比例达50％以上，并通过流式分选神经嵴标记物p75/HNK1纯化后进行下一步诱导。
优选地，步骤S3中，即得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
优选地，步骤S3中，所述间充质干细胞培养液为STEMCELL Technologies的MSC培养液ACF、Ajinomoto的MSC培养液STEMFIT或MSC完全培养液，其中MSC完全培养液为含有1～10％(V/V)血清替代物KOSR、1～5％(V/V)NEAA、1～5％(V/V)ITS Supplement、1～10mM L-谷氨酸、0.1～10Mm的β-巯基乙醇、1～100ng/ml白血病抑制因子LIF、1～100ng/mL bFGF、1～100ng/mL EGF、0.1～10mg/ml人血小板衍生生长因子PDGFBB、0.1～10mg/ml维生素C的DMEM(L)培养液。
更优选地，步骤S3中，所述MSC完全培养液为含有5％(V/V)血清替代物KOSR、1％(V/V)NEAA、1％(V/V)ITS Supplement、5mM L-谷氨酸、1mM的β-巯基乙醇、1ng/ml白血病抑制因子LIF、2ng/mL bFGF、2ng/mL EGF、50ng/ml人血小板衍生生长因子PDGFBB、300ng/ml维生素C的DMEM(L)培养液。
优选地，步骤S3中，步骤S3中躯干神经嵴细胞在间充质干细胞培养液持续传代培养后，表达CD73、CD90、CD105的细胞达到98％以上，同时表达CD34、CD45的细胞少于2％时，即得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
以上任一所述制备方法得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞也属于本发明的保护范围。
所述的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞在制备促进造血支持和/或抑制T细胞炎症因子TNF-α的药物的应用，也属于本发明的保护范围。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过使用特定诱导培养液严格限定细胞分化路径得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞，与中胚层及神经嵴来源的间充质干细胞分化路径不同，其是由多能干细胞诱导经神经中胚层祖细胞阶段后得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk-NC-MSCs)。本发明中诱导神经中胚层祖细胞仅需5天，且T和SOX2共表达效率能达到95％以上，高于现有技术的诱导效率。同时，不同多能干细胞株诱导的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的基因表达谱(R2>0.93)不但高度相似，且相较于骨髓间充质干细胞(BMSCs)具备更好的免疫调节能力及造血支持能力。综上所述，本发明的诱导方法不但提高诱导效率且缩短诱导时间，整个诱导分化体系可操作性强、诱导分化程序标准化，可保证不同细胞株来源、不同批次间的细胞株间的基因表达谱相似性很高，诱导分化体系稳定且均质性较高。
另外，本发明得到的来源明确、异质性较低的全新MSC亚群，不但增殖能力旺盛，并且能够显著抑制T细胞炎症因子分泌，具备较好的免疫调节能力。同时，体内造血支持实验表明Trunk-NC-MSCs相较于BMSCs具备更好的造血支持能力。这种全新MSC亚群，可能为MSC临床转化，特别是临床免疫治疗、支持造血干细胞移植等提供新的、高质量的细胞来源，进一步推进MSC的临床转化工作。
附图说明
图1为实施例4中培养的人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)白光图(图1A)以及多能干细胞标志性表面分子SSEA4、TRA-1-81免疫荧光染色图(图1B)。
图2为实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)在实施例1培养液(E6+CHIR)和实施例2培养液(E6+CHIR+TGFβ1+bFGF)在两种不同神经中胚层祖细胞诱导培养液中分别诱导2天后得到的细胞形态图(图2A)，以及荧光定量PCR分别检测在两种不同神经中胚层祖细胞诱导培养液中诱导的细胞的神经中胚层祖细胞标志物T和Sox2的表达情况(图2B)，免疫荧光染色分别鉴定在两种不同神经中胚层祖细胞诱导培养液中诱导的细胞的神经中胚层祖细胞标志物T和Sox2表达量(图2C)。
图3为实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)来源神经中胚层祖细胞经诱导后，表达躯干神经嵴细胞标记物HOXC9和SOX10的免疫荧光染色图片。
图4为实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)来源躯干神经嵴细胞在间充质干细胞培养液(STEMCELL TechnologiesMSC培养液(ACF))中连续传代5次后的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)形态图(图4A)及细胞表面标记流式分析图(图4B、图4C、图4D、图4E、图4F)。
图5为实施例5利用实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)进行成骨、成脂成软骨分化后进行检测，其中细胞成骨分化后的茜素红S染色图(图5A)、成脂分化后的油红O染色图(图5B)、成软骨分化后的阿辛蓝染色图(图5C)。
图6为实施例6中利用CCK8实验对实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖情况比较图。
图7为实施例7利用实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)比较在共培养条件下，流式检测T细胞中炎症因子TNF-α的表达情况。
图8为实施例8利用实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别进行实时荧光定量PCR，检测造血支持基因(VCAM1、CXCL12、MCP1、KITLG、FLT3L、ANGPT1)表达情况(图8A)；以及克隆形成分析LTC-IC中分别形成的粒细胞和巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)的数量图(图8B)。
图9为实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from PBMC-iPSC)在间充质干细胞培养液(STEMCELL TechnologiesMSC培养液(ACF))中传代5次后的细胞形态图。
图10为实施例10利用RNA-Seq检测并分析实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from PBMC-iPSC)与实施例4实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from HDF-iPSC)的基因表达谱分析图。
图11为实施例11利用实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom PBMC-iPSC)与人长骨骨髓中直接分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在免疫缺陷鼠体内形成的样品分别进行免疫荧光染色、HE染色图(图11A)以及相应的统计图(图11B)。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例中荧光定量PCR使用的引物见下表：
以下实施例中免疫荧光染色使用的抗体见下表：
以下实施例中流式检测使用的抗体见下表：
| Antigen | Label | Company | Cat.No. |
| Anti-human CD34 | PECY7 | BD Pharmingen | 560710 |
| Anti-human CD45 | PECY7 | BD Pharmingen | 557748 |
| Anti-human CD73 | FITC | BD Pharmingen | 561254 |
| Anti-human CD90 | APC | BD Pharmingen | 559869 |
| Anti-human CD105 | PE | Invitrogen | 12-1057-42 |
细胞免疫荧光染色的方法：将细胞克隆用4％多聚甲醛PFA固定后，PBS洗涤3次，随后用2％BSA封闭30分钟，PBS洗涤2次。加入一抗，4℃过夜，PBS洗涤3次，每次5分钟；加入二抗，室温孵育30～45分钟；PBS洗涤4次后，加入0.5μg/ml DAP I染色10分钟，去除DAPI后，用PBS洗涤三遍；完成染色后用封片剂封片，最后共聚焦上拍照。
荧光定量PCR的方法：将细胞用Accutase消化收集，PBS洗3次后，使用1ml RNAzol裂解细胞，提取总RNA后，使用定量反转录试剂盒(Qiagen)在10μl反应体系中反转录成cDNA。使用DyNAmo ColorFlash SYBR Green qPCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific)在LightCycler 480检测系统(进行荧光定量PCR检测。热循环条件为:95℃变性10s,60℃退火20s,72℃延伸30s，共45次循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCT法计算基因表达量。
细胞流式检测的方法：将细胞用Accutase消化，1100rpm离心4min后弃上清，用50ul PBS重悬细胞，用同型同源抗体(BD Pharmingen)作为阴性对照(同型对照)。在另外的管中分别加入流式抗体(CD34、CD45、CD73、CD90、CD105)染色20min，用PBS洗涤2次，每次5min，1100rpm离心4min后，弃上清，用200ul PBS重悬细胞后在流式细胞仪上机检测阳性细胞的比例。
实施例1一种多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞的培养液
含有10μM CHIR99021、10μMY27632的Essential 6TM培养液。
实施例2一种多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞的培养液
含有10μM CHIR99021、10μMY27632、20ng/ml bFGF、2ng/mlTGFβ1的Essential 6TM培养液。
实施例3一种神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞的培养液
含有1％(V/V)N2细胞培养添加剂、1％(V/V)NEAA、1％(V/V)Glutamax、2μMSB431542、10μM CHIR99021、1μM DMH1以及10μM Y-27632的DMEM-F12培养液。
实施例4人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)经神经中胚层祖细胞阶段向躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞诱导分化
一、人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)的培养及鉴定
1、实验方法
HDF-hiPSC指的是人皮肤成纤维细胞诱导的多能干细胞，由实验室利用诱导多能干细胞技术(iPSCs)构建获得。本实施例着重阐述在稳定建立的HDF-hiPSC细胞系基础上的进一步培养与分化操作。HDF-hiPSC细胞使用STEM CELL公司的mTeSR培养液进行大规模扩增，维持其未分化状态。同时，需要在培养液质上包被基质胶，其中基质胶选择Matrigel或层粘连蛋白LN。
具体的操作步骤如下：
(1)包被培养皿：冰上融解Matrigel并用预冷的DMEM-F12按体积1：100的比例稀释Matrigel原液后，加入孔板中室温包被过夜备用。或将层黏连蛋白LN用PBS按体积1:100稀释后，加入孔板中室温包被过夜，待用。
(2)复苏HDF-hiPSC：37℃水浴锅中快速解冻HDF-hiPSC细胞，转移至含有5mlmTeSR培养液的15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
(3)吸去包被的Matrigel，以2ml mTeSR重悬细胞，均匀接种细胞，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
(4)每天更换培养液一次，观察细胞维持未分化状态，继续培养直至HDF-hiPSC细胞克隆生长至80～90％的密度，进行传代。
(5)细胞传代：PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA，于37℃孵育4min，弃去EDTA，以PBS轻轻吹打细胞，收集细胞团块至15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
(6)弃去上清，利用1ml mTeSR重悬细胞，每孔100μl体积均匀地将细胞接种入事先铺有Matrigel的孔板中，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
(7)重复上述培养扩增步骤，以便获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
(8)将上步中扩增的HDF-hiPSC细胞克隆进行细胞免疫荧光检测，其中包括多能干细胞标志性表面分子SSEA4、TRA-1-81。
2、实验结果
图1为本实施例中培养的人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)白光图(图1A)以及多能干细胞标志性表面分子SSEA4、TRA-1-81免疫荧光染色图(图1B)；可见培养的HDF-hiPSC克隆紧实、平整，表达多能性干细胞标志性的表面分子SSEA4、TRA-1-81。其中选用层粘连蛋白LN包被细胞培养板，效果与Matrigel差不多，能维持多能干细胞的多能性，保持克隆形态。说明本实施例中用于诱导的HDF-hiPSC细胞确为多能干细胞。
二、人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)来源神经中胚层祖细胞(Neuromesodermal progenitors,NMP)的诱导
1、实验方法
(1)待细胞长至具有足够细胞量时，利用PBS洗涤细胞两次，加入0.5mM的EDTA于37℃孵育4min，镜下观察，使细胞解离成单细胞或小的细胞团块，吸去EDTA，以PBS轻轻吹打细胞，使细胞分散均匀。
(2)将细胞转移入15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
(3)以Essential 6TM培养液重悬细胞团，以1×104/cm2的细胞密度均匀地将细胞接种入事先包被好Matrigel的孔板或培养皿中，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
(4)培养第二天，更换为实施例1或实施例2的培养液分别进行培养，其中培养液中还添加了1％(V/V)青链霉素混合液。
(5)静置培养2天，期间每天换液一次。
(6)实施例1培养液(E6+CHIR)和实施例2培养液(E6+CHIR+TGFβ1+bFGF)制备得到的细胞同时通过实时荧光定量PCR及免疫荧光检测神经中胚层祖细胞标记物T、SOX2后，比较其诱导效率，并择效率更优者继续下一步诱导。
2、实验结果
图2为本实施例中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)在实施例1培养液(E6+CHIR)和实施例2培养液(E6+CHIR+TGFβ1+bFGF)在两种不同神经中胚层祖细胞诱导培养液中分别诱导2天后得到的细胞形态图(图2A)，以及荧光定量PCR分别检测在两种不同神经中胚层祖细胞诱导培养液中诱导的细胞的神经中胚层祖细胞标志物T和Sox2的表达情况(图2B)，免疫荧光染色分别鉴定在两种不同神经中胚层祖细胞诱导培养液中诱导的细胞的神经中胚层祖细胞标志物T和Sox2表达量(图2C)。
结果显示在实施例2培养液(E6+CHIR+TGFβ1+bFGF)处理2天后，其表达神经中胚层祖细胞标志T和Sox2阳性细胞不但数目多且比例接近95％。表明多能干细胞在另外包含TGFβ通路激动剂(TGFβ1)和FGF通路激动剂(bFGF)的实施例2培养液，相较于只有GSK3抑制剂(CHIR)的实施例1培养液，能更高效诱导神经中胚层祖细胞，其比例约95％以上。
三、人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)来源神经中胚层祖细胞向躯干神经嵴细胞诱导
1、实验方法
(1)待细胞鉴定为是神经中胚层祖细胞(NMPs)后，将培养液更换为实施例3的躯干神经嵴细胞的培养液，其中培养液还添加1％(V/V)青链霉素混合液。
(2)静置培养6天，期间隔天更换新鲜培养液。
(3)将得到的贴壁细胞进行免疫荧光染色，检测躯干神经嵴细胞标记物SOX10、HOXC9。
(4)进一步经流式分选p75/HNK1双阳性细胞，以纯化躯干神经嵴细胞。
2、实验结果
图3为本实施例中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)来源神经中胚层祖细胞经诱导后，表达躯干神经嵴细胞标记物SOX10和HOXC9的免疫荧光染色图片。结果显示共表达两种标记物的细胞比例接近50％，表明神经中胚层祖细胞诱导分化后可以获得躯干神经嵴细胞，并且将其经流式分选p75/HNK1双阳性后可获得纯化后的躯干神经嵴细胞。
四、HDF-hiPSC来源躯干神经嵴细胞向间充质干细胞的诱导分化及鉴定
1、实验方法
(1)将经流式分选纯化后的躯干神经嵴细胞培养液更换为间充质干细胞培养液(STEMCELL TechnologiesMSC培养液(ACF))，并于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养，每2～3d换液。其中间充质干细胞培养液可以替换为市售AjinomotoMSC培养液(STEMFIT)或MSC完全培养液(含有5％(V/V)血清替代物KOSR、1％(V/V)NEAA、1％(V/V)ITSSupplement、5mM L-谷氨酸、1mM的β-巯基乙醇、1ng/ml白血病抑制因子LIF、2ng/mL bFGF、2ng/mL EGF、50ng/ml人血小板衍生生长因子PDGFBB、300ng/ml维生素C的DMEM(L)培养液)，分别进行培养。
(2)细胞生长至80～90％融合后，利用STEM CELL公司的Animal Component-FreeCell Dissociation Kit消化传代，将细胞转移入15ml离心管中，300g离心5min收集细胞，弃上清后将细胞接种入培养皿中；同时取部分细胞检测CD34、CD45、CD73、CD90、CD105等细胞表面标志物表达情况。
(3)重复步骤2，直至表达CD73、CD90、CD105的细胞达到98％以上；表达CD34、CD45的细胞少于2％，即可得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)。
2、实验结果
图4为本实施例中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)来源躯干神经嵴细胞在间充质干细胞培养液(STEMCELL TechnologiesMSC培养液(ACF))中连续传代5次后的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)形态图(图4A)及细胞表面标记流式分析图(图4B、图4C、图4D、图4E、图4F)。
结果显示诱导得到的神经中胚层祖细胞来源躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)形态与骨髓间充质干细胞类似，表现为典型的纤维状；并且流式检测结果表明其表达间充质干细胞的表面标志CD73、CD90、CD105，不表达造血干细胞的表面标志CD34、CD45。表明本诱导培养方法能高效诱导得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。另外，不同间充质干细胞培养液，如市售AjinomotoMSC培养液(STEMFIT))或MSC完全培养液，与STEMCELL TechnologiesMSC培养液(ACF)均能高效诱导得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
实施例5躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)的成骨成脂成软骨诱导分化能力
一、实验方法
(1)成骨分化：待实施例4制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(TrunkNC-MSCs)生长密度达90％时，将培养液更换为成骨诱导分化培养液(DMEM(L)添加10％(V/V)FBS、10mMβ-glycerophosphate、50μg/ml维生素C及100nM的地塞米松)。每3天换液一次，诱导培养21天后进行茜素红染色。
(2)成脂分化：待实施例4制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(TrunkNC-MSCs)生长至完全融合时，将培养液换为成脂诱导分化培养液(DMEM(H)添加10％(V/V)FBS、100nM Indo、0.5mM IBMX、1mM地塞米松)。每3天换液一次，诱导培养21天后进行油红O染色。
(3)成软骨分化：用Accutase消化收集实施例4制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)，以2.0～3.0×105/15ml离心管的细胞量分接入15ml离心管中，300×g离心5min，弃上清，加入1ml软骨分化诱导培养液(H-DMEM添加10ng/ml重组人转化生长因子(recombinant human transforming growth factor-β3,TGF-β3)、100nM地塞米松、50μg/ml维生素C、1mM丙酮酸钠、40μg/ml脯氨酸及ITS Supplement、premix)，置于培养箱孵育培养。每3天换液一次，诱导培养21天后进行阿辛蓝染色。
二、实验结果
图5为本实施例利用实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-hiPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)进行成骨、成脂成软骨分化后进行检测，其中细胞成骨分化后的茜素红S染色图(图5A)、成脂分化后的油红O染色图(图5B)、成软骨分化后的阿辛蓝染色图(图5C)。
结果显示实施例4中制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)成骨分化后茜素红S染色呈现深红色，表明其已成功诱导为骨细胞，生成丰富的钙盐沉积；成脂分化后油红O染色明显呈现橘红色或鲜红色，表明其已成功分化脂肪细胞，且有脂滴形成；成软骨分化后阿辛蓝染色显示呈紫蓝色，表明已成功诱导为软骨细胞，且生成丰富的软骨基质。上述结果表明本发明方法诱导得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)具有三系分化能力。
对照例1骨髓间充质干细胞(BMSCs)的制备及培养方法
本实施例的目的在于说明本发明后续实施例中使用的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离、制备及培养方法。
其中使用密度梯度离心法分离人长骨骨髓中的间充质干细胞；使用间充质干细胞培养液(STEMCELL TechnologiesMSC培养液(ACF))对骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行扩增培养。其中间充质干细胞培养液还可以选择市售的AjinomotoMSC培养液(STEMFIT)，或MSC完全培养液(含有5％(V/V)血清替代物KOSR、1％(V/V)NEAA、1％(V/V)ITS Supplement、5mML-谷氨酸、1mM的β-巯基乙醇、1ng/ml白血病抑制因子LIF、2ng/mL bFGF、2ng/mL EGF、50ng/ml人血小板衍生生长因子PDGFBB、300ng/ml维生素C的DMEM(L)培养液)。
具体的操作步骤如下：
(1)将5mL的人骨髓液，用等体积PBS稀释混匀，室温下1500rpm离心10分钟；
(2)弃去脂肪层后将剩余的骨髓液沿离心管壁缓慢加到等体积Ficoll分离液(1.077g/mL)上面，室温2500rpm离心30分钟后；吸取分离液中界面为白膜状层的单个核细胞，用40ml PBS混悬后，室温1500rpm离心10分钟；
(3)弃上清，并用50ml PBS重复洗涤2次。
(4)用间充质干细胞培养液重悬细胞，进行扩增培养，以2×105/mL的细胞密度，接种于底面积为25cm2培养瓶中置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
(5)于3天后首次换液，弃去悬浮细胞后，之后每2～3天换液一次。期间每日镜下观察细胞形态及生长变化，14天后培养瓶中基本无悬浮细胞，所有细胞呈纤维状贴壁生长，且细胞状态良好。
(6)待细胞生长达80％～90％融合时，用Accutase进行消化，按1：3比例进行传代培养，并将细胞用于后续实验。
实施例6躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)的增殖速度
一、实验方法
(1)CCK8检测增殖速度：将实施例4中得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别用Accutase细胞消化液消化成单细胞后，将两种细胞分别取1000个细胞种到96孔板中，每种细胞种7块96孔板。随后每种细胞每天取一块96孔板利用CCK-8试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖速度。具体步骤，是弃去旧培养液后，在各自的新鲜培养液中加入10％的CCK-8，在37℃的孵箱中孵育2h后，用酶标仪检测波长在450nm处的吸光度。
二、实验结果
图6为本实施例中利用CCK8实验对实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的增殖情况比较图。结果表明，相对于对照例1中人长骨骨髓中直接分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)，实施例4中诱导得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)450nm处的吸光度更高，其具有更强的增殖能力。
实施例7躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)在体外对T细胞炎症因子TNF-α分泌的影响
一、实验方法
(1)接种间充质干细胞：常规消化实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞，分别利用STEM CELL无血清培养液重悬细胞，制成4×104/cm2的悬液铺至24孔板中过夜；
(2)流式分选CD3+T细胞：用含有10％(V/V)FBS的1640培养液重悬分选得到的CD3+T细胞沉淀；
(3)按1×104/cm2的细胞密度将上一步中CD3+T细胞接种至事先铺好MSC的24孔板中，并放置于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置共培养3天；
(4)3天后，提前6h加入刺激剂进行预处理，6h后将共培养上清中的CD3+T细胞收集入15ml离心管，500g离心10min收集细胞进行下一步处理；
(5)使用100μl PBS将细胞沉淀重悬后，加入100μl 4％PFA，室温固定15min，500g离心10min收集细胞进行下一步处理；
(6)加入100μl 0.2％皂苷进行穿透，同时加入适量的TNF-α抗体进行标记染色，室温30min；随后利用PBS洗涤抗体标记后的细胞3次，随后以300μl PBS重悬细胞沉淀，流式检测仪上机检测TNF-α的表达情况。
二、实验结果
图7是实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)比较在共培养条件下，流式检测T细胞中炎症因子TNF-α的表达情况。
结果显示躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)能显著抑制T细胞炎症因子TNF-α的表达，使其比例降至17.3％。相较与骨髓间充质干细胞(BMSCs)抑制T细胞炎症因子TNF-α表达降至25.1％的比例来说，能够更显著地抑制T细胞炎症因子TNF-α的表达。表明躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)具有较强的抑制T细胞炎症因子分泌作用。
实施例8躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外造血支持能力比较
一、实验方法
(1)造血支持基因检测：使用RNAzol提取实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)的总RNA后，分别将其逆转录成cDNA后，荧光定量PCR比较其造血支持基因(VCAM1、CXCL12、MCP1、KITLG、FLT3L和ANGPT1)表达情况。
(2)体外长时程共培养(Long-Term Culture Initiating Cell Assays，LTC-IC)：将实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)用Accutase消化后，以90％的密度预接种到24孔板上，培养过夜；第二天在培养液中加入0.5mg/ml丝裂霉素C分别处理这两种细胞，3小时后，弃去含有丝裂霉素C的培养液，用PBS洗涤3次，换成新鲜的培养液，得到丝裂霉素C处理后的Trunk NC-MSCs和BMSCs。随后，将分选得到的CD34+HSC(细胞)按每孔1000个细胞接种到丝裂霉素C处理后的Trunk NC-MSCs和BMSCs中，用StemSpanTm CD34+扩增培养液(Stem Cell Technologies)进行培养，期间每两天进行半换液。共培养35天后，从共培养系统的上清液中分离出的10000个细胞接种在甲基纤维素(Stem Cell Technologies)板中，并在37℃和5％CO2中孵育14天后，对形成的菌落进行拍照、计数和分析。
二、实验结果
图8为实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)与对照例1中人长骨骨髓中分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别进行实时荧光定量PCR，检测造血支持基因(VCAM1、CXCL12、MCP1、KITLG、FLT3L、ANGPT1)表达情况(图8A)；以及克隆形成分析LTC-IC中分别形成的粒细胞和巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)的数量图(图8B)。
结果显示，荧光定量PCR检测到人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC)相较于BMSCs表达更多的造血支持基因(VCAM1、CXCL12、MCP1、KITLG、FLT3L、ANGPT1)，且具有统计学差异。CFU分析也表明Trunk NC-MSCsfrom HDF-iPSC产生了更多数量的粒细胞和巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)。表明的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)相较于BMSCs在体外表达更高的造血支持基因，能更好的促造血干细胞体外克隆形成及增殖，其体外造血支持能力更强。
实施例9外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)经神经中胚层祖细胞阶段向躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞诱导分化
一、实验方法
1、外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)的培养及鉴定
PBMC-iPSC指的是外周血单个核细胞诱导的多能干细胞，由实验室利用诱导多能干细胞技术(iPSCs)构建获得。本发明着重阐述在稳定培养PBMC-hiPSC细胞系基础上的培养分化操作步骤。PBMC-hiPSC细胞同样使用STEM CELL公司的mTeSR培养液进行大规模扩增，维持其未分化状态。同时，需要在培养液质上包被基质胶，可以选择Matrigel亦或是层粘连蛋白LN等。
具体的操作步骤如下：
(1)包被培养皿：冰上融解Matrigel并用预冷的DMEM-F12按体积1：100的比例稀释Matrigel原液后，加入孔板中室温包被过夜备用。
(2)复苏PBMC-hiPSC：37℃水浴锅中快速解冻PBMC-hiPSC细胞，转移至含有5mlmTeSR培养液的15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
(3)吸去包被的Matrigel，以2ml mTeSR重悬细胞，均匀接种细胞，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
(4)每天更换培养液一次，观察细胞维持未分化状态，继续培养直至PBMC-hiPSC细胞克隆生长至80-90％的密度，进行传代。
(5)细胞传代：PBS洗涤细胞两次，加入1ml 0.5mM的EDTA，于37℃孵育5min，弃去EDTA，以PBS轻轻吹打细胞，收集细胞团块至15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
(6)弃去上清，利用1ml mTeSR重悬细胞，以每孔100μl体积均匀地将将PBMC-hiPSC细胞接种入事先铺有Matrigel的孔板中，放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置贴壁培养。
(7)重复上述培养扩增步骤，以便获取足够的细胞量进行下一步的分化诱导。
(8)将上步中扩增的PBMC-hiPSC细胞克隆进行细胞免疫荧光检测，其中包括多能干细胞标志性表面分子SSEA4、TRA-1-81。
2、外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)向神经中胚层祖细胞(Neuromesodermal progenitors,NMP)诱导分化
(1)待细胞长至密度为80％时，利用PBS洗涤细胞两次，加入1ml 0.5mM的EDTA于37℃孵育5min，镜下观察，使细胞解离成单细胞或小的细胞团块，吸去EDTA，以PBS轻轻吹打细胞，使细胞分散均匀。
(2)将细胞转移入15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。
(3)以Essential 6TM培养液重悬细胞团，均匀地将细胞接种入事先包被好Matrigel的孔板或培养皿中。放入37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养。
(4)培养第二天，更换为实施例2培养液(E6+CHIR+TGFβ1+bFGF)进行培养，其中培养液还添加1％(V/V)青链霉素混合液。
(5)静置培养2天，期间每天换液一次。
(6)两组培养液诱导得到的细胞同时通过实时荧光定量PCR及免疫荧光检测神经中胚层祖细胞标记物T、SOX2后，择效率更优者继续下一步诱导。
3、外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)来源神经中胚层祖细胞向躯干神经嵴细胞诱导分化
(1)待细胞鉴定为是神经中胚层祖细胞后，将培养液更换为实施例3的躯干神经嵴细胞的培养液。
(2)静置培养6天，期间隔天更换新鲜培养液。
(3)将得到的贴壁细胞进行躯干神经嵴细胞标记物的检测。
(4)进一步经流式分选p75/HNK1双阳性细胞，纯化躯干神经嵴细胞。
4、躯干神经嵴细胞向间充质干细胞的诱导分化及鉴定
(1)将经流式分选纯化后的躯干神经嵴细胞培养液更换为间充质干细胞培养液(同实施例4)，并于37℃、5％CO2和95％湿度的培养箱中静置培养，每2天换液。
(2)细胞生长至80～90％融合后，利用Accutase进行消化传代，将细胞转移入15ml离心管中，300g离心5min收集细胞。之后将细胞接种入细胞培养皿中；同时取部分细胞检测CD34、CD45、CD73、CD90、CD105等细胞表面标志物表达情况。
(3)重复步骤(2)，直至表达CD73、CD90、CD105的细胞达到98％以上；表达CD34、CD45的细胞少于2％，即可得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)。
二、实验结果
图9为本实施例中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from PBMC-iPSC)在间充质干细胞培养液(STEMCELL TechnologiesMSC培养液(ACF))中传代5次后的细胞形态图。表明PBMC-iPSC诱导得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom PBMC-iPSC)贴壁生长，且形态与骨髓间充质干细胞类似，表现为典型的纤维状。
实施例10躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)的异质性分析
一、实验方法
(1)样品准备：收取实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from PBMC-iPSC)及实施例4实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from HDF-iPSC)，按QIAGEN公司生产的RNA提取试剂盒的操作步骤提取其总RNA，并评价其总RNA的完整性；
(2)建库：利用Illumina提供的试剂，按照相应的操作步骤，从总RNA中分离纯化mRNA并将其逆转录成cDNA，随后将修饰后的cDNA片段进行PCR扩增，纯化和富集，从而建立cDNA文库。
(3)测序并分析：利用建立的cDNA文库，通过GA高通量测序仪(Illumina，SanDiego，USA)进行RNA测序检测并分析相关基因表达谱。
二、实验结果
图10为本实施例利用RNA-Seq检测并分析实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from PBMC-iPSC)与实施例4实施例4中人皮肤成纤维细胞诱导多能干细胞(HDF-iPSC)制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs from HDF-iPSC)的基因表达谱分析图。
结果显示，本发明中实施例9制备得到的Trunk NC-MSCs from PBMC-iPSC和实施例4制备得到的Trunk NC-MSCs from HDF-iPSC，两者表达谱相似性很高(R2＞0.93)，表明本发明诱导分化体系稳定，不同细胞株诱导的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(TrunkNC-MSCs)基因表达谱相似性较高，均质性较高。
实施例11躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞(Trunk NC-MSCs)与骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体内造血支持能力比较
一、实验方法
(1)样品准备：选用实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom PBMC-iPSC)作为Trunk NC-MSCs组，选用对照例1中人长骨骨髓中直接分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为BMSCs组。两组细胞分别制成2×107cells/ml细胞悬，各吸取50μl细胞悬液充分混合预先用50μl成软骨诱导液浸泡过夜的30mg羟基磷灰石支撑材料，稍松管盖，置于37℃，5％CO2，95％湿度孵箱中进行孵育约2小时后一起包埋入裸鼠皮下。
(2)体内移植：利用1％戊巴比妥按每只免疫缺陷鼠50mg/kg使用量进行腹腔麻醉，共计5只。待麻醉成功后，碘酒消毒皮肤表面，在最上方颈左侧部位用剪刀剪出长约1cm的伤口，用分离钳钝性分离伤口，向伤口左侧进行加深，将BMSCs组细胞与材料一起分次送入颈左侧，之后对伤口进行缝合，消毒。而后同样在背部尾右侧重复进行上述操作，将Trunk NC-MSCs组细胞与材料一起种至背部尾部位，缝合伤口后，消毒伤口，待其清醒后，放入鼠笼。在每日观察小鼠状态，常规饲养8周。
(3)收取样品：8周后，收取标本固定、脱钙、免疫荧光染色CD45以及HE染色后，统计其血岛形成数目与CD45染色阳性造血干细胞数目。
二、实验结果
图11为本实施例利用实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom PBMC-iPSC)与人长骨骨髓中直接分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在免疫缺陷鼠体内形成的样品分别进行免疫荧光染色、HE染色图(图11A)以及相应的统计图(图11B)。
结果显示，实施例9中外周血单个核细胞来源诱导多能干细胞(PBMC-iPSC)制备得到的躯干神经嵴细胞来源间充质干细胞(Trunk NC-MSCsfrom PBMC-iPSC)相较于人长骨骨髓中直接分离得到的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在免疫缺陷鼠皮下移植部位支持更多的血岛形成以及CD45阳性造血干细胞数目，且具有统计学差异。表明本发明诱导的Trunk NC-MSCsformPBMC-iPSC相较人长骨骨髓中直接分离得到的BMSCs，具有更强的造血支持能力。同时表明实施例9制备Trunk NC-MSCs from PBMC-iPSC得到的与实施例4制备得到的TrunkNC-MSCs from HDF-iPSC不但有高度相似的基因表达谱，与人长骨骨髓中直接分离得到的BMSCs相比还有更强的造血支持能力。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞，其特征在于，由多能干细胞，先后经历神经中胚层祖细胞和躯干神经嵴细胞阶段后诱导得到。
2.一种多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞的培养液，其特征在于，所述培养液为含有ROCK通路抑制剂和GSK-3抑制剂的基础培养液。
3.根据权利要求2所述的培养液，其特征在于，所述培养液还含有FGF通路的激动剂和TGFβ信号激活剂的基础培养液。
4.一种神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞的培养液，其特征在于，所述培养液为含有N2细胞培养添加剂、NEAA、Glutamax以及ROCK通路抑制剂、TGFβ通路抑制剂、GSK-3抑制剂、BMP通路抑制剂的基础培养液。
5.权利要求2到4任一所述培养液在多能干细胞诱导躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞中的应用。
6.一种由多能干细胞诱导的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.将多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞：将多能干细胞消化成单细胞，之后接种于包被基质胶的培养板或培养皿中，利用权利要求2到3任一所述的培养液，培养0.5～3天后，即得到神经中胚层祖细胞；
S2.将神经中胚层祖细胞诱导为躯干神经嵴细胞：利用权利要求4所述的培养液，培养上一步的产物5～7天后，即得到躯干神经嵴细胞；
S3.将躯干神经嵴细胞诱导为躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞：用间充质干细胞培养液持续传代培养上一步的产物3～4周至即得到躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述间充质干细胞培养液为STEMCELL Technologies的MSC培养液ACF、Ajinomoto的MSC培养液STEMFIT或MSC完全培养液，其中MSC完全培养液为含有1～10％(V/V)血清替代物KOSR、1～5％(V/V)NEAA、1～5％(V/V)ITS Supplement、1～10mM L-谷氨酸、0.1～10Mm的β-巯基乙醇、1～100ng/ml白血病抑制因子LIF、1～100ng/mL bFGF、1～100ng/mL EGF、0.1～10mg/ml人血小板衍生生长因子PDGFBB、0.1～10mg/ml维生素C的DMEM(L)培养液。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，诱导得到的躯干神经嵴细胞中通过流式分选神经嵴标记物p75/HNK1纯化后进行下一步诱导。
9.权利要求6到8任一所述制备方法制备得到的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞。
10.权利要求9所述的躯干神经嵴来源骨髓间充质干细胞在制备促进造血支持和/或抑制T细胞炎症因子TNF-α的药物的应用。
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